RU2846734C1 - ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus atrophaeus AD22 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ СОИ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм эндофитных бактерий Bacillus atrophaeus AD22, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства 13.06.2023 г. под номером RCAM 06418, в качестве средства для повышения продуктивности растений сои и их защиты от фитопатогенных грибов. Изобретение позволяет повысить продуктивность растений сои и защитить их от фитопатогенных грибов. 4 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма эндофитных бактерий Bacillus atrophaeus AD22 в качестве средства для повышения продуктивности растений сои и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.

В современном растениеводстве потери урожая из-за вредителей и болезней могут быть весьма существенными. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО), при учете общего влияния болезней, вредителей и сорняков, ущерб продукции земледелия до сбора урожая может составлять от 25 до 40%, наиболее значительный вред наносят грибные фитопатогены. На сегодняшний день приоритетной задачей сельского хозяйства является защита растений от грибных болезней с помощью химических и биологических средств защиты.

Однако использование химических пестицидов уменьшается из-за растущего негативного отношения к ним со стороны потребителей, вызванного возможными неблагоприятными последствиями для людей и отрицательным воздействием на почву.

В настоящее время известно множество микробиологических препаратов для сельского хозяйства различного назначения: ростостимулирующих, а также подавляющих развитие фитопатогенных бактерий и грибов.

Известен патент РФ №2495119 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8a в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов» с приоритетом от 29.11.2012., МПК C12N 1/20, C12R 1/125, A01N 63/00, опубликовано 10.10.2013 г.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму Bacillus subtilis 8A, который депонирован под номером RCAM 00876 в коллекции ГНУ ВНИСХМ Россельхозакадемии. Штамм Bacillus subtilis 8A обладает высокой фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов и бактерицидной активностью против фитопатогенных бактерий, а также ростостимулирующей активностью по отношению к различным сельскохозяйственным культурам. Штамм может найти применение в сельском хозяйстве в качестве эффективного средства для повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.

Известен патент РФ №2551968 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus pumilus A 1.5, в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами» с приоритетом 01.08.2013 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/07, опубл. 10.02.2015 г.

Штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5 обладает фунгицидной и бактерицидной активностью против фитопатогенных бактерий, депонирован в коллекции ГНУ ВНИСХМ Россельхозакадемии под номером RCAM02057 и может быть использован в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фито-патогенными микроорганизмами, а также расширяет ассортимент средств, защищающих растения от фитопатогенных микроорганизмов.

Известен патент РФ №2626543 на изобретение «Штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus, способ стимуляции роста и защиты растений от болезней и применение штамма бактерий Paenibacillus mucilaginosus в качестве удобрения и агента биологического контроля (противопатогенного средства) в профилактике и/или лечении заболевания растений» с приоритетом 09.11.2015 г., МПК C12N 1/20, C05F 11/08, опубл. 16.05.2017 г.

Описана группа изобретений на базе штамма Paenibacillus mucilaginosus, стимулирующего рост растений и обладающего повышенной способностью к синтезу бактерицинов с широким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12259. Применение штамма Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-12259 в качестве удобрения для сельскохозяйственных культур и для профилактики и лечения грибкового заболевания растений. Предложен способ стимуляции роста и защиты растений от грибковых болезней, предусматривающий предпосевную обработку почвы, семян растений, посевов суспензией культуры клеток штамма Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-12259 в концентрации не менее 120 млн спор/мл. Изобретения обеспечивают повышение урожайности с/х культур и их устойчивости к грибковым заболеваниям.

Известен патент РФ №2701500 на изобретение «Штамм спорообразующих бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным действием против фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания овощных растений, биологический препарат на его основе» с приоритетом 28.09.2018 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/07, опубликовано 26.09.2019 г.

Группа изобретений включает спорообразующий штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11443 и биопрепарат на его основе. Указанный штамм обладает фунгицидным действием против фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания овощных растений. Препарат на основе данного штамма включает культуральную жидкость как комплекс спор, вегетативных клеток и продуктов метаболизма и носитель в виде гранул микрокаолина или микродиатомита в соотношении по объему от 1:3 до 1:5. Описываемый штамм и биологический препарат на его основе обладают высокой фунгицидной активностью широкого спектра действия.

Известен патент РФ №2625977 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 для получения биопрепарата комплексного действия для защиты с/х растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности» с приоритетом 10.06.2016 г., МПК C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/07, опубл. 20.07.2017 г.

Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12464. Штамм может быть использован для создания биопрепарата комплексного действия для использования в растениеводстве, в т. ч. при ведении органического земледелия, позволяет повысить урожайность с/х культур.

Известен патент РФ №2099947 на изобретение «Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней» с приоритетом от 15.11.1996 г. на имя Института Микробиологии и вирусологии НАН Украины (UA) и Научно-производственного объединения «Башкирское» (RU), МПК A01N 63/00; C12N 1/20; C12R 1:125, опубл. 27.12.1997 г. (прототип).

Основой биопрепарата «Фитоспорин» является штамм бактерий Bacillus subtilis 26Д с концентрацией клеток 10⁹-10¹⁰ на 1 мл физраствора в количестве 92-98 об.% и наполнитель в количестве 2-8 об.%. При этом штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, позволяет использовать его для защиты разных видов с/х, декоративных, древесных растений.

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве средства повышения продуктивности растений сои и их защиты от фитопатогенных грибов.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства повышения продуктивности растений сои и их защиты от фитопатогенных грибов в сельском хозяйстве используется штамм эндофитных бактерий Bacillus atrophaeus AD22, который был выделен из ризосферной почвы чечевицы Омска и депонирован 13.06.2023 г. в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства под номером RCAM 06418. Справка о депонировании прилагается.

Штамм бактерий Bacillus atrophaeus AD22, характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки бактерий имеют форму правильных прямых палочек размером 3-10 мкм в длину и 0,25-1,0 мкм в диаметре с закругленными концами.

Штамм образует споры эллипсоидной формы размером (1-2) 1 мкм, расположенные в центре клетки.

Штамм положительно окрашивается по Граму.

Штамм растет в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхательный.

Среда культивирования: манитно-дрожжевой агар.

Культивирование в течение 48 часов. На питательном агаре штамм образует сухие колонии кремового цвета, темнеющие со временем, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний около 10 мм. Оптимальная температура для роста 28°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7. Рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0.

В качестве единственного источника углерода штамм использует мальтозу, лактозу, глюкозу, сахарозу, крахмал, сорбит маннит.

Штамм способен расти при 45°С и 5% растворе NaCl.

Было выявлено и экспериментально установлено, что штамм эндофитных бактерий Bacillus atrophaeus AD22 обладает фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов Fusarium graminearum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides у бактеризованных растений.

Для оценки антагонистической активности штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 был проведен комплекс исследований в отношении фитопатогенных грибов, осуществленный по следующе методике.

На отдельные чашки Петри с агаризованной маннитно-дрожжевой средой (Yap S.F. and S.T. Lim. Response of Rhizobium Sp UMKL-20 to sodium- chloride stress // Arch. Microbiol. - 1983. - №135. - 224-228 р.) газоном высевалась по 0,1 мл культуры исследуемого гриба фитопатогена, а именно: Fusarium graminearum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides. По прошествии часа после посева фитопатогена в каждой чашке Петри на поверхности агара с помощью пробочного сверла делали отверстие, в которое помещали по 0,1 мл культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 с титром ≈10⁷ КоЕ/мл.

Для сравнительной оценки фунгицидной активности исследуемого штамма по описанной выше методике в другие чашки Петри помещали по 0,1 мл культуральной жидкости штамма - прототипа Bacillus subtilis 26Д - продуцента биопрепарата Фитоспорин.

После этого все чашки Петри выдерживали в термостате при температуре 28°С в течение 7 суток, после чего замеряли размеры зон подавления роста гриба-фитопатогена. Результаты опыта представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Влияние штаммов Bacillus atrophaeus AD22 и Bacillus subtilis 26Д на степень подавления роста грибов - фитопатогенов

Фитопатогенные грибы	Размеры зон подавления, мм
	при воздействии штамма Bacillus atrophaeus AD22	при воздействии штамма Bacillus subtilis 26Д
Alternaria alternate	36,20±1,99	22,50±2,30
Fusarium graminearum	32,05±5,31	25,9±4,21
Cladosporium cladosporioides	39,9±1,14	38,4±1,36

Из представленных в Таблице 1 результатов видно, что при одинаковых условиях опыта зоны подавления грибов-фитопатогенов у штамма Bacillus atrophaeus AD22 больше, чем у штамма - прототипа Bacillus subtilis 26Д, из чего следует, что заявленный штамм бактерий Bacillus atrophaeus AD22 проявляет большую антагонистическую активность по отношению к исследуемым грибам-фитопатогенам: Fusarium graminearum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, по сравнению со штаммом Bacillus subtilis 26Д (продуцентом биопрепарата Фитоспорин), что делает его перспективной основой в составе биопрепаратов для борьбы с грибными фитопатогенами.

Для анализа ростостимулирующих свойств штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 по отношению к сое проводили следующий опыт.

Семена сои сорта «Эн Аргента» перед проращиванием промывали в проточной водопроводной воде, а затем подвергали стерилизации в 70% растворе этилового спирта (C₂H₅OH) в течение 1 минуты, после чего промывали водопроводной водой 4 раза. После этого семена сои помещали в стерильные чашки Петри и инокулировали исследуемыми культурами: культуральной жидкостью штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 и культуральной жидкостью штамма бактерий Bacillus subtilis 26Д (прототип), разведенной до титра 10⁷ КоЕ/мл, с расчетом 10 мл/кг семян (в контроле - без обработки). Затем семена выдерживали в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге в термостате при температуре (28-30)°С. На 1-е, 2-е, 3-и и 7-е сутки подсчитывали количество проросших семян сои и измеряли длину проростков, причем проросшими считали семена, ростки которых были больше или равны размерам семени.

Данные, отражающие долю проросших семян сои сорта «Эн Аргента» в зависимости от варианта их обработки представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Влияние штаммов Bacillus atrophaeus AD22 и Bacillus subtilis 26Д на скорость прорастания семян сои сорта «Эн Аргента»

Вариант обработки семян сои	Доля проросших семян, %
	1-е сутки	2-е сутки	3-и сутки	7-е сутки
Контроль (без обротки)	22	35	49	60
Штамм Bacillus subtilis 26Д (прототип)	21	39	50	61
Штамм Bacillus atrophaeus AD22	19	40	54	65

Из данных, приведенных в Таблице 2 видно, что обработка семян сои бактериальными суспензиями несколько ускоряет процесс их прорастания на 3-и и 7-е сутки. Так у семян, обработанных штаммом Bacillus atrophaeus AD22, проявляется повышение их всхожести по сравнению с необработанными семенами (контролем) на 3-и сутки на 10,2% и на 7-е сутки на 8,3%. При этом штамм бактерий Bacillus atrophaeus AD22 сильнее влияет на процесс прорастания семян сои по сравнению со штаммом Bacillus subtilis 26Д, увеличив долю проросших семян на 3-и сутки на 8% и на 7-е сутки на 6,5%. Влияние штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 на скорость прорастания семян сои является положительным его свойством, так как более ранняя всхожесть семян может дать растению преимущество в использовании почвенных ресурсов.

Данные, отражающие влияние штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 и штамма бактерий Bacillus subtilis 26Д (прототип) на длину проростков семян сои сорта «Эн Аргента» на 3-и и 7-е сутки в зависимости от их обработки культуральной жидкостью соответствующего штамма бактерий, разведенной до титра 10⁷ КоЕ/мл, с расчетом 10 мл/кг семян (в контроле - без обработки), представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Влияние штаммов Bacillus atrophaeus AD22 и Bacillus subtilis 26Д на длину проростков семян сои сорта «Эн Аргента»

Вариант обработки семян сои	Длина проростков, мм
	3-и сутки	7-е сутки
Контроль (без обротки)	16,89±7,80	65,56±18,63
Штамм Bacillus subtilis 26Д (прототип)	17,45±9,27	73,53±18,45
Штамм Bacillus atrophaeus AD22	23,18±7,66	73,89±15,23

Из данных, приведенных в Таблице 3, следует, что обработка семян сои бактериальными суспензиями увеличивает длину проростков в сравнении с контролем как на 3-и, так и на 7-е сутки.

Так у семян, обработанных штаммом Bacillus atrophaeus AD22, длина проростков увеличилась по сравнению с необработанными семенами (контролем) на 3-и сутки на 37,2% и на 7-е сутки на 12,7%. Причем штамм бактерий Bacillus atrophaeus AD22 сильнее влияет на удлинение проростков семян сои по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 26Д, увеличив длину проростков семян на 3-и сутки на 32,8% и на 7-е сутки на 0,5%.

То есть обработка семян сои штаммом бактерий Bacillus atrophaeus AD22 способствует более быстрому удлинению проростков семян сои на 3-и сутки, что является положительным его свойством, так как более быстрый рост проростков как и более ранняя всхожесть семян может дать растению преимущество в использовании почвенных ресурсов.

Для проведения вегетационных опытов по оценке эффективности препарата штамма Bacillus atrophaeus AD22 был получен соответствующий жидкий биопрепарат по следующей методике:

Для получения маточной культуры штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 использовали жидкую питательную среду, следующего состава: крахмал - 10 г/л; дрожжевой экстракт - 1 г/л; К₂НРО₄ - 0,5 г/л; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2 г/л; NaCl - 0,1 г/л. Значение рН смеси 7,0.

Полученную жидкую питательную среду разлили в 750-мл качалочные колбы по 200 мл и стерилизовали при 1 атм 30 минут. Затем провели инокуляцию питательной среды в колбах стерильно микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром (состав среды указан выше), содержащим чистую культуру Bacillus atrophaeus AD22. После этого колбы поместили на качалку (120 об/мин) и культивировали в течение 72 часов при температуре 28°С. Таким образом, в колбах была получена маточная культура Bacillus atrophaeus AD22 с титром бактерий около 15⋅10⁸ КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике до 1 месяца при температуре 4-6°С для последующего засева в бутылях или ферментерах.

Рабочая культура

Для промышленного культивирования штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 рабочую культуру получали в бутылях или ферментерах на аналогичной указанной выше среде. Норма инокуляции маточной культурой 2-5%, продолжительность культивирования - 72 часов при температуре 28-30°С.

Оценку эффективности препарата на основе штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22, полученного указанным выше способом, на растения сои сорта «ОАК Пруденс» проводили в микрополевом опыте летом 2023 года в Воронежской области. Для сравнения был использован препарат Фитоспорин на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 26Д.

В процессе проведения опыта было оценено влияние биопрепаратов на основе штаммов Bacillus atrophaeus AD22 и Bacillus subtilis 26Д, а также способов обработки ими семян и растений сои сорта «ОАК Пруденс» на урожайность культуры.

Полевой опыт был заложен в пятикратной повторности методом расщепленных делянок и включал следующие варианты:

По составу раствора для обработок

1.1 - контроль (водопроводная вода);

1.2 - препарат Bacillus subtilis 26Д;

1.3 - препарат Bacillus atrophaeus AD22.

По методу бактеризации (обработки) растений:

2.1 - обработка семян 10% р-ром препарата в норме 10 л/т;

2.2 - опрыскивание вегетирующих растений в фазе бутонизации-

цветения 1% р-ром биопрепарата в норме 100 л/га;

2.3 - комбинированная обработка семян и вегетирующих растений.

Почва опытного участка-черноземовидная, по составу среднесуглинистая, пахотный слой - 20 см, содержание гумуса около 3,5%. Культура предшествующая - соя, выращиваемая без внесения удобрений.

Семена сои высевали в норме 600 тыс. всхожих семян на 1 га с шириной междурядий 20 см. Обработка семян биопрепаратами была произведена непосредственно перед посевом, а опрыскивание вегетирующих растений было осуществлено в период бутонизации-цветения.

Учет урожая производили по делянкам в бункерном весе с последующим взвешиванием зерна и высушиванием. В результате исследований были получены следующие данные, приведенные в Таблице 4.

Таблица 4. Влияние биопрепаратов на основе штаммов Bacillus atrophaeus AD22 и Bacillus subtilis 26Д, а также способов обработки ими на урожайность сои сорта «ОАК Пруденс»

Состав для обработки	Метод обработки	Урожайность, т/га	Прибавка к контролю, т/га (%)
Контроль (вода)	Инокуляция семян	1,42	-
	Опрыскивание по вегетации	1,40	-
	Комбинированный	1,41	-
Препарат Фитоспорин (штамм Bacillus subtilis 26Д прототип)	Инокуляция семян	1,56	0,14 (9,9%)
	Опрыскивание по вегетации	1,52	0,12 (8,6%)
	Комбинированный	1,62	0,21 (14,9%)
Биопрепарат на основе штамма Bacillus atrophaeus AD22)	Инокуляция семян	1,64	0,22 (15,5%)
	Опрыскивание по вегетации	1,54	0,13 (9,3%)
	Комбинированный	1,70	0,29 (20,6%)

Приведенные в Таблице 4 результаты опыта показали, что применение биопрепаратов в отношении сои сорта «ОАК Пруденс» на основе штаммов Bacillus subtilis 26Д и Bacillus atrophaeus AD22 в виде обработки семян перед посевом, опрыскивания вегетирующих растений, а также комбинировано при обработке семян и вегетирующих растений, повысило урожайность этой культуры сои.

При этом урожайность растений, обработанных препаратами на основе штаммов Bacillus subtilis 26Д и Bacillus atrophaeus AD22 по семенам повысилась на 9,9% и 15,5% соответственно, при обработке препаратами по листу урожайность повысилась на 8,6% и 9,3% соответственно, а при комбинированной обработке биопрепаратами урожайность повысилась на 14,9% и 20,6% соответственно.

Причем применение полученного указанным выше способом препарата на основе штамма бактерий Bacillus atrophaeus AD22 посредством инокуляции семян и комбинированной обработки по семенам и по листу обеспечивает более существенные прибавки урожайности сои сорта «ОАК Пруденс» (на 8%), по сравнению с применением препарат Фитоспорин - продуцентом штамма Bacillus subtilis 26Д - прототипа.

Таким образом, экспериментально доказано, что новый штамм бактерий Bacillus atrophaeus AD22 положительно влияет на скорость прорастания семян сои, способствует более быстрому удлинению проростков семян, что дает растениям сои преимущество в использовании почвенных ресурсов.

Также экспериментально показано, что что применение биопрепарата на основе штамма Bacillus atrophaeus AD22 при любом методе обработки повышает урожайность культуры сои, причем более эффективно, чем при таких же методах обработки препаратом Фитоспорин на основе штамма-прототипа Bacillus subtilis 26Д.

Кроме того, экспериментально подтверждено, что новый штамм бактерий Bacillus atrophaeus AD22 обладает фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов.

Claims (1)

1. Штамм эндофитных бактерий Bacillus atrophaeus AD22, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства 13.06.2023 г. под номером RCAM 06418, в качестве средства для повышения продуктивности растений сои и их защиты от фитопатогенных грибов.