RU2846737C2 - Анти-нектин-4 антитело, конъюгат лекарственного средства, и способ его получения, и его применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и применимо в медицине. Изобретение раскрывает конъюгат нового специфичного к нектину-4 антитела с цитотоксическим средством (MMAE). Изобретение может быть использовано при терапии различных нектин-4-положительных злокачественных новообразований, в частности для направленной доставки цитотоксического агента к указанным опухолям. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 12 ил., 13 табл., 11 пр.

Description

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности к антителу против белка нектин-4 и его конъюгату, а также к применению антитела и конъюгата для лечения опухолей.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Нектин-4 (молекула клеточной адгезии нектин 4), также известный как PVRL4 (полиовирус- рецептор-подобный 4), представляет собой мембранный белок типа I, который является членом семейства факторов клеточной адгезии (нектин), который специфически экспрессируется в эмбрионе и плацента, это семейство представляет собой группу Ca²⁺ независимых иммуноглобулиноподобных трансмембранных молекул клеточной адгезии, состоящую из четырех членов (от нектина-1 до нектина-4). Члены от нектина-1 до нектина-3 широко экспрессируются в нормальных тканях взрослых. Белок нектин-4 не может быть обнаружен в тканях здоровых взрослых (включая ткани молочной железы), но он сверхэкспрессируется в различных тканях рака (молочной железы, легких, яичников и т.д.) и обнаруживается в 62% случаев трижды негативного рака молочной железы.

Исследования показали, что сверхэкспрессия нектина-4 при прогрессировании рака может способствовать внутриопухолевому ангиогенезу и способствовать росту опухоли. Кроме того, сигнальный путь PI3K/AKT участвует в стимулировании пролиферации раковых клеток, опосредованной нектином-4. Кроме того, сверхэкспрессия нектина-4 связана с плохим прогнозом рака легких, молочной железы и яичников. Нектин-4 взаимодействует с белком афадином (белком, связывающим актиновые филаменты) с образованием комплекса и в конечном итоге улучшает выживаемость клеток и предотвращает апоптоз через сигнальный путь PI3K-AKT, высокая экспрессия нектина-4 является фактором риска метастазирования в лимфатические узлы у пациентов, страдающих папиллярной карциномой щитовидной железы (PTC), истощение нектина-4 может эффективно ингибировать пролиферацию и инвазию двух клеточных линий PTC (т.е. клеточных линий рака щитовидной железы человека TPC1 и KTC-1) и индуцировать апоптоз in vitro, сверхэкспрессия нектина-4 в тканях рака пищевода человека тесно связана с размером опухоли, глубиной опухолевой инвазии и плохим прогнозом для пациентов. Вмешательство в экспрессию нектина-4 в клеточных линиях рака пищевода показывает, что повышенная экспрессия нектина-4 может значительно способствовать жизнеспособности клеток, миграции, инвазии и образованию опухоли.

Рак мочевого пузыря представляет собой злокачественную опухоль, которая возникает на слизистой оболочке мочевого пузыря, большая часть которой представляет собой переходноклеточный рак. Чаще всего он поражает боковые и задние стенки мочевого пузыря, затем треугольник и верхушку, что может происходить полицентрично. Рак мочевого пузыря является наиболее распространенной опухолью мочевыделительной системы и чаще встречается у мужчин. Согласно данным, опубликованным Национальным онкологическим центром в 2019 году, рак мочевого пузыря занимает седьмое место среди онкологических заболеваний у мужчин с уровнем заболеваемости 8,83 на 100000, и в последние годы тенденция к росту становится более очевидной. Существуют различия в заболеваемости раком мочевого пузыря по регионам, расе и полу, и он может возникать во всех возрастных группах. Высокая заболеваемость наблюдается в возрасте от 50 до 70 лет, причем уровень заболеваемости постепенно увеличивается с возрастом.

Рак мочевого пузыря клинически классифицируется как мышечно-неинвазивный рак мочевого пузыря (NMIBC) и мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (MIBC) или метастатические опухоли. Уротелиальная (переходная) карцинома представляет собой распространенный тип рака мочевого пузыря, на долю которого приходится приблизительно 90% всех случаев. Метастатический рак мочевого пузыря обычно связан с плохим прогнозом: 5-летняя выживаемость составляет всего 15% для пациентов, страдающих раком мочевого пузыря IV стадии. Для NMIBC и MIBC трансуретральная резекция опухоли мочевого пузыря (TURBT) является стандартной терапией с местной внутрипузырной химиотерапией с последующей иммунотерапией (с использованием бациллы Кальметта-Герена (BCG)) в качестве адъювантной терапии. Химиотерапия уже стала способом лечения рака первого выбора за последние несколько десятилетий. Чаще всего применяют терапию на основе платины.

Рак молочной железы по-прежнему остается самой распространенной опухолью у женщин в мире. Заболеваемость раком молочной железы в мире увеличивается на 0,2–8% каждый год. У приблизительно 1,4 миллиона человек диагностирован рак молочной железы, при этом ежегодно от этого заболевания умирают приблизительно 0,5 миллиона человек. Рак молочной железы является основной причиной смертности среди женщин в возрасте 40-55 лет. С конца 1970-х годов заболеваемость раком молочной железы занимает первое место среди злокачественных опухолей у женщин во всем мире. По данным Американского онкологического общества, ежегодно в США регистрируют приблизительно 200 000 новых случаев рака молочной железы с уровнем заболеваемости 116/100 000. Хотя Китай является регионом с низкой заболеваемостью раком молочной железы у женщин, заболеваемость раком молочной железы значительно возросла в последние годы. За последние 10 лет заболеваемость раком молочной железы в крупных городах Китая выросла на 37%, а уровень смертности увеличился на 38,9%. В частности, Шанхай, Пекин, Тяньцзинь и прибрежные районы являются районами высокой заболеваемости раком молочной железы в Китае, на которые уже приходится первое место по заболеваемости злокачественными опухолями у женщин.

В настоящее время противоопухолевые лекарственные препараты в мире в основном ориентированы на лекарственные моноклональные антитела, и моноклональные антитела являются крупнейшей подотраслью в области биофармацевтики. Данные показывают, что в 2016 году на лекарственные средства на основе моноклональных антител приходилось 43% от общей доли рынка биологических препаратов. Хотя терапия моноклональными антителами обладает высокой специфичностью к мишеням и низким уровнем побочных эффектов, ее эффективность относительно ограничена при использовании отдельно. Поэтому большинство лекарственных средств на основе моноклональных антител применяют в комбинации с химиотерапией, а основным способом повышения эффективности моноклональных антител являются конъюгаты антитела и лекарственного средства. Конъюгаты антитела и лекарственного средства относятся к новому классу противораковых биореактивных препаратов, которые состоят из трех частей: антитела, лекарственного средства и соединяющего их линкера. После того, как моноклональное антитело связывается с лекарственным средством, конъюгат антитело-лекарственное средство использует свойство нацеливания моноклонального антитела для специфического распознавания рецептора на поверхности раковой клетки, связывания с рецептором, а затем проникновения в клетку и предотвращения размножения раковых клеток, и уничтожают раковые клетки, используя протеазы внутри клеток для высвобождения лекарственного средства. Технология конъюгации антитела и лекарственного средства объединяет низкомолекулярные лекарственные средства с биологическими белками и обладает преимуществами обоих, что значительно повышает эффективность лекарственного средства и снижает токсические и побочные эффекты, что делает ее терапевтическим продуктом нового поколения.

В настоящее время в мире не существует химического лекарственного средства, и всего 6 биологических препаратов, нацеленных на нектин-4. Среди них есть только один одобренный конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), нацеленный на нектин-4, который представляет собой лекарственное средство ADC, нацеленное на нектин-4, совместно разработанное компанией Agensys, Япония (дочерняя компания Astellas) и компанией Seattle Genetics, США. Оно было ускоренно одобрено FDA 19 декабря 2019 года. Торговое наименование Padcev, показания: местно-распространенная или метастатическая уротелиальная карцинома. Соответствующие клинические данные показали, что: ORR составляет 44%, CR составляет 12%, и медианная DOR составляет 7,6 месяцев, у 46% пациентов, принимавших Padcev, наблюдали серьезные побочные реакции, наиболее частыми серьезными побочными реакциями (≥3%) были инфекция мочевыводящих путей (6%), целлюлит (5%), фебрильная нейтропения (4%), диарея (4%), сепсис (3%), острое повреждение почек (3%). %), одышка (3%) и сыпь (3%), фатальные побочные реакции наблюдали у 3,2% пациентов, включая острую дыхательную недостаточность (0,8%), аспирационный пневмонит (0,8%), заболевания сердца (0,8%) и сепсис (0,8%).

Видно, что побочные реакции Padcev являются относительно серьезными. На основании статуса исследования мишени нектин-4, пациенты все еще имеют неудовлетворенные терапевтические потребности в соответствующих конъюгатах антитела и лекарственного средства, и существует острая потребность в эффективных, имеющих низкие побочные эффекты и доступных противоопухолевых нацеленных лекарственных средствах, которые могут принести пользу большинству пациентов, страдающих опухолью.

Разработка ADC является очень сложной задачей. Правильный выбор мишеней, оптимизация и улучшение лекарственных средств, а также выбор подходящих линкеров для повышения эффективности и безопасности лекарственных средств ADC представляют собой сложные моменты в разработке лекарственных средств ADC. Разработка лекарственных средств ADC должна основываться на всестороннем рассмотрении антител, линкеров и лекарственных средств как единого целого, для уточнения показаний к опухолям и мишеней лекарственных средств, а также для полного и тщательного изучения механизма действия лекарственных средств ADC, чтобы, наконец, реализовать эффективные уничтожение лекарственных средств ADC на опухолевых клетках при одновременном улучшении качества жизни пациентов.

Следует подчеркнуть, что один из ключей к успеху ADC состоит в подборе подходящих антител для доставки лекарственных средств к опухолевым клеткам при условии сохранения активности лекарственного средства. Антитела, используемые для получения ADC, должны обладать определенными характеристиками. Они не только должны специфически связываться с антиген-положительными клетками в опухолях, но также комплексы антиген-антитело должны быть способны опосредовать интернализацию ADC. При скрининге антител следует учитывать по меньшей мере следующие три фактора: специфическое связывание, интернализация и клеточная локализация антитела после интернализации, и не существует четкой связи между аффинностью антитела и скоростью интернализации (Laurent Ducry, Antibody Drug Conjugates, Science Press, pp. 36-37 Page). Следовательно, будучи высокоточным «устройством локализации», антитела могут специфически связываться с клетками-мишенями и эффективно опосредовать «эндоцитоз» и их локализацию, которые имеют решающее значение для специфичности и токсичности конъюгатов антитела и лекарственного средства.

На основании недостатков предшествующего уровня техники, авторы настоящего изобретения стремились решить задачу нестабильной конъюгации между линкером существующего лекарственного средства и низкомолекулярными лекарственными средствами, и использовали NH₂-(CH₂-CH₂-O)₃-CH₂-C(=O)-Val-Cit в качестве линкера. Гуманизированное антитело связывается с низкомолекулярным лекарственным средством (например: MMAE) через линкер посредством ферментативно-опосредованного сайт-направленного связывания, и полученное лекарственное средство ADC оказывает сильное уничтожающее действие на опухолевые клетки с высокой экспрессией нектин-4, особенно на рак молочной железы, рак мочевого пузыря и другие опухоли. В частности, прежде всего, согласно результатам эксперимента по эндоцитозу, конъюгат анти-нектин-4 антитела и лекарственного средства, полученный в соответствии с настоящим изобретением, обладает лучшим эффектом эндоцитоза, чем контрольное лекарственное средство Padcev, и может одновременно достигать специфического связывания, эффективной интернализации и точной локализации в клетках. Специфичность конъюгата антитела и лекарственного средства повышается, а его токсичность снижается. Во-вторых, эксперименты in vivo показывают, что внутривенное введение конъюгата антитела и лекарственного средства голым мышам с нектин-4-положительными ксенотрансплантатными опухолями приводит к ингибированию роста опухоли, а значительный терапевтический эффект может наблюдаться при однократном внутривенном введении даже низкой дозы 1 мг/кг, его общий терапевтический эффект значительно лучше, чем у контрольного препарата Padcev. Наконец, второе введение Padcev в дозе 6 мг/кг в токсикологическом эксперименте на обезьянах привело к серьезным побочным реакциям и летальному исходу. Напротив, конъюгат антитела и лекарственного средства, полученный согласно настоящему изобретению, практически не вызывает побочных реакций при двух введениях в высокой дозе 9 мг/кг, имеет более широкий период терапевтического окна и обладает лучшей лекарственной способностью. Таким образом, конъюгаты антитела и лекарственного средства, представленные в настоящей заявке, позволили достичь неожиданных технических результатов.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к антителу и его функциональному фрагменту (например, антигенсвязывающему фрагменту), а также конъюгату антитела и лекарственного средства (ADC), которые связываются с белком нектин-4 и/или белком или фрагментом полипептида нектина-4.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к антителу или его функциональному фрагменту, способному специфически связывать нектин-4, причем антитело содержит тяжелую цепь (цепи) и легкую цепь (цепи), где

(i) тяжелая цепь содержит три области CDR, где аминокислотная последовательность по меньшей мере одной из областей CDR имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, 2 или 3, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80% (предпочтительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичность последовательности с ними, и/или

(ii) легкая цепь содержит три области CDR, где аминокислотная последовательность по меньшей мере одной из областей CDR имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, 5 или 6, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80% (предпочтительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичности последовательности с ними.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит тяжелую цепь (цепи) и легкую цепь (цепи), где

(i) тяжелая цепь содержит три области CDR, которые представляют собой область CDR1, область CDR2 и область CDR3, соответственно, причем указанные область CDR1, область CDR2 и область CDR3 имеют аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и/или

(ii) легкая цепь содержит три области CDR, которые представляют собой область CDR1, область CDR2 и область CDR3, соответственно, причем указанные область CDR1, область CDR2 и область CDR3 имеют аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представляет собой аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO.9, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80% (предпочтительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичности последовательности с ней, и последовательность вариабельной области легкой цепи выбрана из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO.10-12, или последовательности, имеющей по меньшей мере 80% (предпочтительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичности последовательности с ней.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению являются выделенными.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению представляют собой гуманизированное антитело, предпочтительно полностью человеческое антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело согласно настоящему изобретению представляет собой биспецифическое антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению имеют активность ADCC.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению имеют активность CDC.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению специфически связываются с нектин-4 и по существу не связываются с нектин-1, нектин-2 или нектин-3.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению включают: диантитело, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab)'_2, scFv, dsFv и однодоменное антитело. Белок scFv представляет собой слитый белок, в котором вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина связаны через линкер, в dsFv цистеин вводится в определенный сайт в консервативных каркасных областях VH и VL, тем самым вводя структуру dsFv, стабилизированную дисульфидной связью.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению представляют собой IgM, IgD, IgG, IgA или IgE, где антитело IgG имеет 4 подтипа: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, предпочтительно антитело IgG1.

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность константной области тяжелой цепи антитела представляет собой:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO.16).

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность константной области легкой цепи антитела представляет собой:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.17).

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению можно применять для лечения или профилактики рака, где рак характеризуется сверхэкспрессией нектин-4.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент, обладающие способностью связываться с нектином-4, связываются с нативным эпитопом нектина-4, присутствующим на поверхности живых клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент, обладающие способностью связываться с нектином-4, связываются с внеклеточным доменом нектина-4. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент, обладающие способностью связываться с нектином-4, связываются с первым внеклеточным доменом нектина-4. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент, обладающие способностью связываться с нектином-4, связываются с доменом 1-147aa нектина-4. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент, обладающие способностью связываться с нектином-4, связываются с доменом 32-142аа нектина-4.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитело согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к комбинации выделенных полинуклеотидов, содержащей полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела или его функционального фрагмента согласно настоящему изобретению, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела или его функционального фрагмента согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид согласно настоящему изобретению или комбинацию полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, где полинуклеотид функционально связан с регуляторной последовательностью, которая обеспечивает экспрессию полипептида, кодируемого им, в клетке-хозяине или в бесклеточной системе экспрессии.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку-хозяин, эукариотическую клетку-хозяин или бактериофаг. Прокариотической клеткой-хозяином может быть Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces или Proteus mirabilis и т.п. Эукариотической клеткой-хозяином могут быть грибы, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces и Trichoderma, клетка насекомых, такая как травяная совка, растительная клетка, такая как табак, клетки млекопитающих, т.е. клетка BHK, клетка CHO, клетка COS, клетка миеломы и т.п. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка-хозяин согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой клетку млекопитающего, более предпочтительно клетку BHK, клетку CHO, клетку NSO или клетку COS.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к конъюгату антитела и лекарственного средства, содержащему антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению, конъюгированные с одним или несколькими лекарственными средствами, предпочтительно лекарственными средствами являются цитотоксические лекарственные средства (такие как антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, алкалоиды), усилители иммунитета или радиоизотопы. Более предпочтительно лекарственное средство выбрано из производных ауристатина, производных майтанзиноида (таких как ансамитоцин или мертанзин, доластатин и его производные), аналогов камптотецина, ингибиторов ДНК-топоизомеразы I и их производных. Наиболее предпочтительно лекарственное средство выбрано из MMAE (монометилауристатин E) и MMAF (монометилауристатин F).

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или его функциональный фрагмент, обладающие способностью связываться с нектином-4, ковалентно связаны с фрагментом лекарственного средства через линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер является расщепляемым во внутриклеточных условиях. Согласно одному варианту осуществления линкер является гидролизуемым при значении pH менее 5,5. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер является расщепляемым внутриклеточными протеазами. Согласно одному варианту осуществления линкер представляет собой расщепляемый катепсином линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит дипептид или тетрапептид. Согласно некоторым вариантам осуществления дипептид представляет собой валин (Val)-цитруллин (Cit). Согласно некоторым вариантам осуществления антитело связано с линкером через цистеинсульфгидрильную группу антитела. Согласно одному варианту осуществления антитело связано с линкером через аминогруппу антитела, в частности, аминогруппу остатка глутамина.

Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства согласно настоящему изобретению имеет следующую общую формулу: Ab-(L-U)n, где Ab представляет собой моноклональное антитело, нацеленное на нектин-4, L представляет собой линкер, выбранный из NH₂-(CH₂-CH₂-O)m-CH₂-C(=O)-Val-Cit, NH₂-(CH₂-CH₂-O)m-CH₂-C(=O)-Val-Cit-pABC, mc-Val-Cit-pABC, Val-Cit-pABC, Val-Cit-pAB или Val-Cit, U представляет собой лекарственное средство, выбранное из DM1, DM4, MMAE, MMAF, DXD и SN38, и m представляет собой число (CH₂-CH₂-O), которое представляет собой целое число от 1 до 8, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, более предпочтительно представляет собой 3, 4, 5 или 6, наиболее предпочтительно 3, n представляет собой соотношение лекарственного средства и антитела DAR, которое представляет собой целое число от 1 до 8, предпочтительно 2, 4, 6 или 8, более предпочтительно 2 или 4, наиболее предпочтительно 2. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления n представляет собой десятичное число 1 до 8. Полное название mc-Val-Cit-pABC представляет собой малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-аминокарбамат, и полное название Val-Cit-pAB представляет собой валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату антитела и лекарственного средства (ADC), способному специфически связываться с нектин-4, где антитело или его функциональный фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO.9, и последовательность вариабельной области легкой цепи выбрана из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO.10-12.

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его функционального фрагмента представляет собой аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO.9, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с ней, и последовательность вариабельной области легкой цепи выбрана из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO.10-12, или последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с ней.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему легкую цепь антитела или его функционального фрагмента и/или тяжелую цепь антитела или его функционального фрагмента, или кодирующему антитело или его функциональный фрагмент.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид, функционально связанный с регуляторной последовательностью, которая обеспечивает экспрессию полипептида, кодируемого им, в клетке-хозяине или в бесклеточной системе экспрессии.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор-экспрессии.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитела и лекарственного средства согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к медицинскому препарату, содержащему конъюгат антитела и лекарственного средства согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления медицинский препарат находится в форме набора, содержащего контейнер, содержащий конъюгат антитела и лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам осуществления медицинский препарат дополнительно содержит печатные инструкции по применению препарата в способе лечения или профилактики рака, в частности рака, характеризующегося экспрессией нектин-4.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к конъюгату антитела и лекарственного средства для эффективного лечения и/или профилактики опухоли, связанной с клеткой, экспрессирующей нектин-4.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению вышеупомянутого конъюгата антитела и лекарственного средства и антипролиферативного средства для получения лекарственного средства для лечения опухоли.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеупомянутый конъюгат антитела и лекарственного средства и антипролиферативное средство.

Согласно определенным вариантам осуществления антипролиферативное средство также может представлять собой антитело, конъюгат антитела и лекарственного средства или слитый белок.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к способу лечения опухоли у субъекта, предусматривающему введение субъекту конъюгата антитела и лекарственного средства, или фармацевтической композиции, или медицинского препарата.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение также относится к способу лечения опухоли у субъекта, предусматривающему введение субъекту эффективного количества конъюгата антитела и лекарственного средства, или фармацевтической композиции, или медицинского препарата и облучения.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение также относится к способу лечения опухоли у субъекта, предусматривающему введение субъекту эффективного количества конъюгата антитела и лекарственного средства, или фармацевтической композиции, или медицинского препарата и антипролиферативного средства.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к вышеупомянутому антителу, конъюгату антитела и лекарственного средства и фармацевтической композиции для применения для лечения опухоли, предпочтительно нектин-4-положительной опухоли.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли (включая рак), как описано выше, включают без ограничения гематологические опухоли или солидные опухоли.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли (включая рак), описанные выше, представляют собой гематологические опухоли, предпочтительно лимфому или лейкоз, включая без ограничения миелому, В-клеточную лимфому, мантийноклеточную лимфому, неходжкинскую В-клеточную лимфому, неходжкинскую Т-клеточную лимфому, кожную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому, множественную миелому, индолентную неходжкинскую лимфому, плазмоцитому, хронический лимфоцитарный лейкоз, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому и фолликулярную лимфому. Согласно некоторым вариантам осуществления гематологические опухоли являются рецидивирующими или рефрактерными.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли (включая рак), описанные выше, представляют собой солидные опухоли, включая без ограничения опухоли дыхательной системы, опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли мочевыделительной системы, опухоли мужских органов, опухоли женских органов, рак кожи, опухоли эндотелиальных клеток, опухоли головного мозга, опухоли нервной системы и опухоли эндокринных органов.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли дыхательной системы включают без ограничения рак легких, носоглотки и гортани.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли желудочно-кишечного тракта включают без ограничения рак пищевода, рак желудка, колоректальный рак, рак печени, рак поджелудочной железы и рак желчных протоков.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли мочевыделительной системы включают без ограничения рак почки, рак почечной лоханки и рак мочеточника, рак мочевого пузыря и рак уретры.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли мужских органов включают без ограничения рак полового члена, рак предстательной железы или рак яичек.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли женских органов включают без ограничения рак молочной железы, рак вульвы, рак влагалища, рак шейки матки, рак эндометрия или рак яичников.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли нервной системы включают без ограничения астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, медуллобластому и менингиому.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли головного мозга включают без ограничения глиому, нейроцитому, микробоподобную стромальную опухоль, мезенхимальную опухоль, эпителиальную опухоль, тератому и опухоль шишковидной железы.

Согласно некоторым вариантам осуществления рак кожи включает без ограничения меланому кожи или немеланомный рак кожи.

Согласно некоторым вариантам осуществления опухоли представляют собой солидные опухоли, включая без ограничения рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, опухоли грудной клетки, рак эндометрия, плоскоклеточный рак пищевода, рак желудка, опухоль головы, рак поджелудочной железы, рак желчных протоков, колоректальный рак, рак глаза, плоскоклеточный рак головы и шеи, уротелиальный рак, рак почки, рак печени, рак лимфатических узлов, рак легких, рак полости рта, рак шеи, рак яичников, рак предстательной железы, рак яичка, рак гортани и рак матки, меланому, рак слюнной железы, фибросаркому, саркому мягких тканей и остеосаркому. Согласно некоторым вариантам осуществления вышеуказанные виды рака являются рецидивирующими или рефрактерными.

Согласно некоторым вариантам осуществления рак молочной железы включает протоковую карциному, дольковую карциному, медуллярную карциному, глиальную карциному, тубулярную карциному, воспалительный рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы (TNBC).

Согласно некоторым вариантам осуществления рак яичника включает эпителиальные опухоли яичника, такие как аденокарциномы яичника, и аденокарциномы, которые мигрируют из яичника в брюшную полость.

Согласно некоторым вариантам осуществления лейкоз включает острый миелоидный лейкоз (AML), острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелолейкоз, волосатоклеточный лейкоз, миелодисплазию, миелодиспластическое заболевание, NK-клеточный лейкоз (например, бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль), острый миелолейкоз (AML), хронический миелолейкоз (CML), мастоцитоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), множественную миелому (MM) и миелодиспластический синдром (MDS).

Согласно некоторым вариантам осуществления рак поджелудочной железы представляет собой ацинарно-клеточную аденокарциному поджелудочной железы, аденокарциному дуктальных клеток поджелудочной железы или рак поджелудочной железы IV стадии.

Согласно некоторым вариантам осуществления рак легкого включает немелкоклеточный рак легких (NSCLC) и мелкоклеточный рак легких (SCLC), согласно некоторым вариантам осуществления немелкоклеточный рак легких (NSCLC) включает без ограничения плоскоклеточную карциному, аденокарциному, крупноклеточную карциному, согласно некоторым вариантам осуществления рак легкого является рецидивирующим, согласно некоторым вариантам осуществления рак легкого представляет собой рецидивирующий плоскоклеточный рак легких или (распространенный) плоскоклеточный рак легких IV стадии.

Согласно некоторым вариантам осуществления рак предстательной железы представляет собой метастатический кастрат-резистентный рак предстательной железы (mCRPC).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схематическая диаграмма структуры белка нектин-4.

Фиг. 2. Схематическая диаграмма структуры нектин-4-ADC (SWY2001-Ab1-LND1002),

При этом LND1002 представляет собой часть линкера (линкер) + молекулу лекарственного средства (лекарственное средство), а кружок представляет собой линкер в L&D, связанный с амидной связью антитела. ADC нектина-4, показанный на этом чертеже, представляет собой сайт-специфический конъюгат антитела и лекарственного средства, и каждая молекула состоит из 1 моноклонального антитела против нектина-4, связанного с 1 молекулой производного MMAE при аминокислоте Q295 каждой тяжелой цепи (нумерация по Kabat) через линкер (NH₂–(CH₂-CH₂-O)₃-CH₂-C(=O)-Val-Cit). Связь между антителом и линкером представляет собой стабильную амидную связь (изопептидную связь), и среднее соотношение молекулы лекарственного средства и антитела (DAR) составляет 2,0.

Фиг. 3. Схематическая диаграмма структуры нектин-4-ADC (SWY2001-Ab1-VC MMAE).

Фиг. 4. Карта pcDNA3.1.

Фиг. 5. Карта DSC гуманизированного антитела SWY2001-Ab1.

Фиг. 6. Карта идентификации скорости модификации нектин-4 ADC (SWY2001-Ab1-LND1002).

Фиг. 7 A. Карта идентификации значений SWY2001-Ab1-LND1002 DAR.

Фиг. 7 B. Карта идентификации значений SWY2001-Ab1-VC-MMAE DAR.

Фиг. 8. Эксперимент по эффекту эндоцитоза SWY2001-Ab1-LND1002 в клетке SK-BR-3.

Фиг. 9. Эксперимент по эффекту эндоцитоза SWY2001-Ab1-LND1002 в клетках T47D.

Фиг. 10. In vivo ингибирующее действие SWY2001-Ab1-LND1002 на мышиную PC3-нектин-4-стабильно трансформированную опухоль.

Необходимо отметить: mpk = мг/кг

Фиг. 11. In vivo эксперимент по ингибированию SWY2001-Ab1-LND1002 на мышиной опухоли MDA-MB-468.

Фиг. 12. In vivo эксперимент по ингибированию SWY2001-Ab1-LND1002 на мышиной опухоли HT-1376.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое понимается специалистом в данной области техники. Специалисты могут найти определения и термины в данной области техники со ссылкой Current Protocols в Molecular Biology (Ausubel). Аббревиатуры аминокислотных остатков представляют собой стандартные трехбуквенные и/или однобуквенные коды, используемые в данной области техники для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.

Несмотря на числовые диапазоны и аппроксимации параметров, как изложено в широком объеме настоящего изобретения, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, сообщаются настолько точно, насколько это возможно. Однако любые числовые значения по своей сути содержат определенные ошибки, которые обязательно возникают из-за стандартного отклонения, обнаруженного в соответствующих измерениях. Кроме того, следует понимать, что все диапазоны, раскрытые в настоящем документе, охватывают любые и все включенные в них поддиапазоны. Например, указанный диапазон «от 1 до 10» следует рассматривать как включающий все без исключения поддиапазоны между минимальным значением 1 и максимальным значением 10 включительно, то есть все поддиапазоны, начинающиеся с минимального значения от 1 или выше, например, от 1 до 6,1, и поддиапазоны, заканчивающиеся максимальным значением от 10 или меньше, например, от 5,5 до 10. Кроме того, любой ссылочный источник, указываемый «включенным в настоящий документ», следует понимать как включенный во всей своей полноте.

В контексте настоящего изобретения термины «фармацевтическая композиция», «комбинированное лекарственное средство» и «комбинация лекарственного средства» используются взаимозаменяемо и относятся по меньшей мере к одному лекарственному средству и необязательно к фармацевтически приемлемому носителю или комбинации наполнителей. Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция включает комбинации, разделенные во времени и/или пространстве, при условии, что они действуют вместе для решения задачи настоящего изобретения. Например, компоненты, содержащиеся в фармацевтической композиции (например, антитело, молекула нуклеиновой кислоты, комбинация молекул нуклеиновой кислоты и/или конъюгаты согласно настоящему изобретению) можно вводить субъекту вместе или по отдельности. Когда компоненты, содержащиеся в фармацевтической композиции, вводят субъекту по отдельности, эти компоненты можно вводить субъекту одновременно или последовательно. Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду, буферный водный раствор, изотонический солевой раствор, такой как PBS (солевой раствор с фосфатным буфером), глюкозу, маннит, декстрозу, лактозу, крахмал, стеарат магния, целлюлозу, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновую кислоту, этанол или полиалкиленгликоли, такие как полипропиленгликоль, триглицериды и т.д. Тип используемого фармацевтически приемлемого носителя зависит, среди прочего, от того, составлена ли композиция согласно настоящему изобретению для перорального, назального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать в качестве добавок смачивающие агенты, эмульгаторы или буферные вещества.

Фармацевтическую композицию, вакцину или фармацевтический препарат согласно настоящему изобретению можно вводить любым подходящим путем, например, перорально, назально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно.

«Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество», используемые в настоящем документе, относятся к дозе, достаточной для проявления благоприятного эффекта у субъекта, которому ее вводят. Фактическое вводимое количество, а также скорость и продолжительность введения будут зависеть от индивидуального состояния и тяжести субъекта, подлежащего лечению. Назначение лечения (например, решение по дозе и т.д.) в конечном итоге является компетенцией врачей общей практики и других врачей и зависит от их решений, обычно принимая во внимание заболевание, подлежащее лечению, состояние отдельного пациента, сайт доставки, способ введения и другие известные факторы.

В контексте настоящего изобретения «субъект» относится к млекопитающим, таким как человек, но может также представлять собой других животных, таких как дикие животные (например, цапли, аисты, журавли и т. д.), домашние животные (например, утки, гуси и т.д.) или экспериментальные животные (например, горилла, обезьяна, крыса, мышь, кролик, морская свинка, сурок, суслик и т.д.).

Термин «антитело» относится к целому антителу и его функциональному фрагменту. «Полноразмерное антитело» относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные дисульфидной связью. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области VH и VL также можно подразделить на области высокой вариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающимися с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающие домены, которые взаимодействуют с антигенами. Константная область антитела опосредует связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Химерное или гуманизированное антитело также охватывается антителом согласно настоящему изобретению, CDR которого кодируются посредством IMGT.

Для синтеза генов легкой и тяжелой цепи антитела можно использовать традиционные методы генной инженерии. Например, метод, раскрытый Chen Jianjun et al. (Chen Jianjun et al, Journal of Cellular and Molecular Immunology, 1997, Issue 3).

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, которое может содержать области CDR, происходящие из человеческого антитела, и другие части молекулы антитела, происходящие из одного (или нескольких) человеческих антител. Кроме того, некоторые остатки сегментов основной цепи (называемых FR) могут быть модифицированы, чтобы сохранить аффинность связывания. Гуманизированные антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению можно получить способами, известными специалистам в данной области техники.

Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором последовательности вариабельной области принадлежат одному виду, а последовательности константной области принадлежат другому виду, например, антителу, в котором последовательности вариабельной области происходят из мышиного антитела, а последовательности константной области происходят из человеческого антитела. Химерное антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно получить с использованием методов генетической рекомбинации. Например, химерное антитело можно получить путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательности, кодирующие вариабельные области нечеловеческого, особенно мышиного моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, и последовательности, кодирующие константные области человеческого антитела. Химерное антитело согласно настоящему изобретению, кодируемое таким рекомбинантным геном, будет представлять собой, например, мышиное-человеческое химерное антитело, специфичность которого определяется вариабельными областями, происходящими из мышиной ДНК, и его изотип определяется константными областями, происходящими из человеческой ДНК.

Термин «моноклональное антитело» относится к препарату молекул антител, имеющих единый молекулярный состав. Композиция моноклональных антител демонстрирует единственную специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу.

Термин «биспецифическое антитело» означает способность связывать два антигена или эпитопа соответственно и включает легкую и тяжелую цепи антитела, которое специфически связывает первый антиген, и легкую и тяжелую цепи антитела, которое специфически связывает второй антиген.

В контексте настоящего изобретения «функциональный фрагмент», в частности, относится к фрагменту антитела, такому как Fv, scFv (sc относится к одноцепочечному), Fab, F(ab')_2, Fab', фрагменту scFv-Fc или диателу, или к любому фрагменту, который должен иметь увеличенный период полужизни посредством химических модификаций, таких как добавление поли(алкилен)гликолей, таких как полиэтиленгликоль («пегилирование, ПЭГилирование») (называемых ПЭГилированным фрагментом Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')2-ПЭГ или Fab'- ПЭГ) («ПЭГ» представляет собой полиэтиленгликоль), или путем включения в липосому. Фрагмент обладает активностью связывания нектина-4. Предпочтительно функциональный фрагмент состоит из или содержит частичную последовательность тяжелой или легкой вариабельной цепи антитела, из которого он получен, причем частичная последовательность достаточна для сохранения той же специфичности связывания, что и антитело, из которого она получена, и достаточной аффинности. Такой функциональный фрагмент будет содержать минимум 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 смежных аминокислот последовательности антитела, из которой он получен.

В общем, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно использовать технологию, описанную, среди прочего, в справочнике "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988), или технологию, описанную Kohler and Milstein для получения из гибридомных клеток (Nature, 256 : 495-497, 1975).

В контексте настоящего изобретения термин «конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC)» или «конъюгат» обычно относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, связанному с другим агентом, таким как химиотерапевтический агент, токсин, иммунотерапевтический агент, зонд для визуализации и т.д. Связью может быть ковалентная связь или нековалентное взаимодействие, например, посредством электростатической силы. Для образования конъюгата антитела и лекарственного средства можно использовать различные линкеры, известные в данной области техники и описанные в настоящем документе. Кроме того, конъюгат антитела и лекарственного средства может быть представлен в виде слитого белка, который можно экспрессировать из полинуклеотида, кодирующего иммуноконъюгат. В контексте настоящего изобретения термин «слитый белок» относится к белку, полученному путем связывания двух или более генов или фрагментов генов, которые первоначально кодируют отдельные белки, включая пептиды и полипептиды. Трансляция слитого гена приводит к образованию одного белка с функциональными свойствами каждого исходного белка.

В «конъюгате» два или более соединения связаны друг с другом. Согласно определенным вариантам осуществления в конъюгате сохраняются по меньшей мере некоторые свойства каждого соединения. Связывание может быть достигнуто посредством ковалентных или нековалентных связей. Предпочтительно соединения конъюгата связаны ковалентными связями. Различные соединения конъюгата могут быть непосредственно связаны друг с другом посредством одной или нескольких ковалентных связей между атомами соединений. Альтернативно, соединения могут быть связаны друг с другом химическими фрагментами, такими как линкерные молекулы, где линкеры ковалентно присоединены к атомам соединений. Если конъюгат состоит из более чем двух соединений, соединения могут быть связаны, например, в цепную конформацию, при этом одно соединение связано со следующим, или нескольких соединений, каждое из которых связано с центральным соединением.

Цитотоксическое лекарственное средство, описанное в настоящем документе, конкретно относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает экспрессионную активность клеток, функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Примеры включают без ограничения производные ауристатина (например, MMAE, MMAF), хлортетрациклин, майтанзиноид и их производные (DM0, DM1, DM2, DM3, DM4 и т.д.), рицин, комбрестатин, ансамитоцин, калихеамицин, дуокармицин, доластатин и их производные, ингибиторы ДНК-топоизомеразы и их производные (например: этопозид, тенипозид, Dxd, SN38), аманитин, cc1065 и его аналоги, митомицин С, камптотецин (CPT) и его аналоги, винкристин, винбластин, колхицин, митоксантрон, актиномицины, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas, абрин, гелонин, микрономицин и т.д.

Термин «усилитель иммунитета» относится к веществу, которое может активировать неспецифический иммунитет и усиливать иммунный ответ организма, например: агонист TLR, агонист STING.

Радиоизотопы включают без ограничения: At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹² или Bi²¹³, P³², Pb²¹²,Lu.

Термин «линкер» относится к структурному элементу соединения, который обеспечивает связывание двух соединений через один структурный элемент соединения и один или несколько других структурных элементов того же соединения. Линкер может представлять собой нерасщепляемый линкер. Подходящие нерасщепляемые линкеры включают без ограничения: NH₂-R-X, NH₂NH-R-X и NH₂-O-R-X, где R представляет собой алкильную или полиэтиленгликолевую группу (также известную как ПЭГ), где X представляет собой активный фрагмент. Группа полиэтиленгликоля или группа ПЭГ может иметь общую формулу -(CH₂CH₂O)_n, где n представляет собой целое число по меньшей мере 1. Согласно некоторым вариантам осуществления n представляет собой любое из 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 или 24.

Расщепляемые линкеры включают без ограничения Lys-Phe-X, Lys-Val-Cit-PABC-X, NH₂-(CH₂CH₂O)_n-Val-Cit-pABC-X и NH₂-(CH₂CH₂O)n-(Val-Cit-PABC-X)₂, где X представляет собой активный фрагмент, а n представляет собой целое число по меньшей мере 1 (например, любое из 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 , 20 или 24). PABC относится к п-аминобензилоксикарбонилу.

Исключительно в качестве примера, линкер может быть выбран из: NH₂-(CH₂-CH₂-O)m-CH₂-C(=O)-Val-Cit, NH₂-(CH₂-CH₂-O)m-CH₂-C(=O)-Val-Cit-pABC, mc-Val-Cit-pABC, Val-Cit-pABC или Val-Cit, где m представляет собой количество (CH₂-CH₂-O), которое представляет собой целое число от 1 до 8, а именно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.

Термин «эндогенный глютамин» относится к консервативному остатку глутамина (Q295) в положении 295 тяжелой цепи полноразмерного антитела IgG человеческого изотипа, который находится в непосредственной близости от сайта N-гликозилирования (N297).

Средства и экспериментальные материалы:

Таблица 1. Средства и экспериментальные материалы

Средство	Производитель	Номер по каталогу
Человеческий белок нектин-4, His-метка	ACRO	NE4-H52H3
Белок нектин-4 яванских макак, His-метка	ACRO	NE4-C52H4
Мышиный белок нектин-4, His-метка	ACRO	NE4-M52H3
Рекомбинантный крысиный белок нектин-4, His-метка, CF	R&D systems	9997-N4-050
SK-BR-3	ATCC	HTB-30™
293T-нектин – 4	Kyinno Bio	выполнено по заказу
PC3-нектин – 4	Kyinno Bio	выполнено по заказу
HT1376	iCell	iCell-h077

Пример 1. Получение антитела и гуманизация

Мышиные антитела к нектин-4 получали согласно WO2022051591A2. Кратко, стадии были следующими.

Животных (мышей BALB/c) иммунизировали слитым белком нектин-4-His человека в адъюванте (адъювант Фрейнда) путем внутрибрюшинной инъекции. Животным вводили каждые 2 недели для непрерывной стимуляции до тех пор, пока не развивались соответствующие титры. Кровь собирали у животных после каждой повторной иммунизации и титр определяли с помощью ELISA и FACS. Через 4 дня после последней иммунизации получали селезенки животных с соответствующим титром и готовили одноклеточную суспензию. Клетки сливали с клетками мышиной миеломы SP2/0 с помощью электрослияния. Слитые клетки ресуспендировали в среде, содержащей агенты селекции гибридомных клеток тимидин, гипоксантин и аминоптерин (НАТ), а затем высевали в 96-луночные планшеты для культивирования.

После 7-10 дней инкубации собирали культуральный супернатант, и клоны, которые могли связаться с белком нектин-4 человека, выявляли и проверяли с помощью ELISA или FACS, и проверяли, связаны ли они с белком нектин-4 мыши. Клетки гибридомы продолжали культивировать после добавления свежей среды, содержащей HAT. Через два дня культуральный супернатант положительных клонов, прошедших скрининг в первом раунде, собирали и затем тестировали на функциональную активность антител. После этого отобранные положительные клоны дополнительно субклонировали. После успешного субклонирования эти антитела очищали обычными методами очистки антител и секвенировали вариабельные области антител для некоторых клонов, которые отвечали требованиям.

Мышиные антитела к нектин-4, полученные после иммунизации и скрининга животных, гуманизировали. Работу по гуманизации завершали с помощью GenScript и получали три гуманизированных антитела SWY2001-Ab1, SWY2001-Ab2 и SWY2001-Ab3. Их последовательности показаны в таблице 2. Стадии гуманизации были следующими:

1.1 Экспрессия и очистка химерных антител

Вариабельные области химерных антител (химерные антитела были модифицированы на основе мышиных антител, а константные области были выбраны из человеческого IgG1) вставляли в вектор pcDNA3.4 (IgG1, каппа) для конструирования полной тяжелой цепи и плазмид легкой цепи. Плазмиды затем трансфицировали в клетки HEK293, супернатант собирали и очищали с помощью магнитных шариков с белком А с получением полноразмерных антител. Раствор заменили на PBS путем диализа и обессоливания. Концентрацию и чистоту антител определяли с помощью OD280 и гель-электрофореза в SDS-PAGE, соответственно. Затем их аффинность обнаруживали с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

1.2 Обнаружение активности связывания и аффинности химерных антител

Обнаружение аффинности химерных антител в основном проводили с помощью прибора Biacore с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Метод обнаружения: Чип белка А использовали для связывания связывающихся антител путем захвата Fc-фрагментов антител, а антиген использовали в качестве мобильной фазы для обнаружения. Полученные данные обнаружения адаптировали с помощью программного обеспечения, поставляемого с прибором, для определения соответствующей константы ассоциации (ka) и константы диссоциации (pk) и расчета соответствующей константы равновесия (KD).

1.3 Дизайн обратной мутации гуманизированных антител

Обратные мутации и их комбинации осуществляли во многих аминокислотных участках во внутренних областях ядра структур легкой и тяжелой цепей гуманизированных антител. Соответствующие гены легкой и тяжелой цепи синтезировали с помощью GenScript.

1.4 Продукция и ранжирование аффинности гуманизированных антител с обратной мутацией

После получения плазмид тяжелой цепи и легкой цепи, соответствующие легкую и тяжелую цепи объединяли, спаривали, трансфицировали и экспрессировали в системе объемом 4 мл. После получения экспрессионного супернатанта использовали технологию SPR для обнаружения и ранжирования супернатанта по аффинности: чип белка А использовали для захвата антител в супернатанте путем захвата Fc-фрагментов антител, и антитела иммобилизовали на сенсорном чипе. Аналитический антиген использовали в качестве мобильной фазы. Регенерацию поверхности проводили перед инъекцией другого супернатанта антител, и процесс повторяли до тех пор, пока не были проанализированы все антитела. Экспериментальные данные аппроксимировали моделью взаимодействия 1:1 с использованием программного обеспечения для анализа Biacore. Получали скорости связывания-диссоциации антител и аффинности антител ранжировали по константе скорости диссоциации (pk). По результатам ранжирования в качестве антител-кандидатов выбирали 3 лучших клона с наибольшей аффинностью, и с помощью вышеуказанных стадий получали три гуманизированных антитела, которые были названы: SWY2001-Ab1, SWY2001-Ab2 и SWY2001-Ab3.

1.5 Конструирование, экспрессия и определение аффинности антител-кандидатов

Гены трех антител-кандидатов вставляли в вектор pcDNA3.4 (IgG1, каппа) соответственно для конструирования полных плазмид антитела тяжелой цепи и легкой цепи. Затем плазмиды легкой и тяжелой цепей совместно трансфицировали в клетки Expi293F, супернатант собирали и очищали с помощью магнитных шариков с белком А с получением полноразмерных антител. Раствор заменяли PBS путем диализа и обессоливания, а концентрации и чистоту антител определяли с помощью OD280 и гель-электрофореза в SDS-PAGE соответственно. Затем их аффинность обнаруживали с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Таблица 2. Релевантные последовательности согласно настоящему изобретению

Антитело	информация о последовательности
CDR антитела	тяжелая цепь CDR1：GYTFTSYY SEQ ID NO.1 CDR2：IYPGNVNT SEQ ID NO.2 CDR3：ARGIYYFDY SEQ ID NO.3 легкая цепь CDR1：QSVNND SEQ ID NO.4 CDR2：YAS SEQ ID NO.5 CDR3：HQDYSSPFT SEQ ID NO.6
мышиное антитело	VH тяжелой цепи QVQLQQSGPVLVKPGASVRISCKASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNVNTKYNENFRDKATLTADKSSSTSYMQLSSLTSEDSAVYFCARGIYYFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO.7 VL легкой цепи IIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQEKPGQSPKLLIYYASNRDTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHQDYSSPFTFGSGTKLEIK SEQ ID NO.8
гуманизированное антитело SWY2001-Ab1	SWY2001-Ab1-VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNVNTKYNENFRDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO.9 SWY2001-Ab1-VC IIQMTQSPKFLSASVGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRDTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCHQDYSSPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO.10
гуманизированное антитело SWY2001-Ab2	SWY2001-Ab2-VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNVNTKYNENFRDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO.9 SWY2001-Ab2-VC AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYFCHQDYSSPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO.11
гуманизированное антитело SWY2001-Ab3	SWY2001-Ab3-VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNVNTKYNENFRDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO.9 SWY2001-Ab3-VC AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCHQDYSSPFTFGGGTKVEIK SEQ ID NO.12
Констант-ные области	HC ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO.16) LC RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.17)

Пример 2. Конструирование вектора экспрессии и экспрессия гуманизированного антитела

Последовательности ДНК тяжелой и легкой цепей гуманизированных антител к нектину-4 синтезировали компанией Biointron, Taizhou, и вектор-экспрессии pcDNA3.1 приобретали у Biointron, Taizhou (см. фиг. 4). Кратко, стадии были следующими:

Дизайн и синтез тяжелой цепи:

Синтетическая тяжелая цепь получила название нектин-4-HC. Сайт эндонуклеазы HindIII вводили на 5'-конце, сайт эндонуклеазы EcoRI вводили на 3'-конце, а последовательность Козака и последовательность сигнального пептида (19 аминокислот) MELGLCWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO:14) вводили после сайта эндонуклеазы HindIII на 5'-конце. Кассета экспрессии тяжелой цепи была разработана как:

HindIII-последовательность Козака-сигнальный пептид-нектин-4-HC-стоп-кодон-EcoRI

Дизайн и синтез легкой цепи:

Синтетическая легкая цепь была названа нектин-4-LC. В ходе синтеза на 5'-конце легкой цепи вводили сайт эндонуклеазы HindIII, на 3'-конце вводили сайт эндонуклеазы EcoRI, а также последовательность Козака и последовательность сигнального пептида (22 аминокислоты): MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC (SEQ ID NO:15) вводили после сайта эндонуклеазы HindIII на 5'-конце. Кассета экспрессии легкой цепи была разработана как:

HindIII-последовательность Козака-сигнальный пептид-нектин-4-LC-стоп-кодон-EcoRI

2) Конструирование рекомбинантных плазмид

Продукт ПЦР-амплификации нектин-4-HC и плазмидный вектор pcDNA3.1 подвергали двойному расщеплению HindIII/EcoRI, лигированию и трансформации, и положительные клоны подвергали скринингу с помощью маркера устойчивости к Amp+, чтобы подтвердить, что был получен правильный вектор экспрессии рекомбинантной тяжелой цепи. Продукт ПЦР-амплификации нектин-4-LC и плазмидный вектор pcDNA3.1 подвергали двойному расщеплению HindIII/EcoRI, лигированию и трансформации, и положительные клоны подвергали скринингу с помощью маркера устойчивости к Amp+ с получением правильного вектора экспрессии рекомбинантной легкой цепи.

В этом эксперименте экспрессию гуманизированных антител осуществляли путем временной трансфекции клеток HEK293. Клетки HEK293 помещали в шейкер-инкубатор с 5% CO₂ и инкубировали при 37 ℃ и 120 оборотах в минуту при постоянной температуре и встряхивании. Клетки культивировали до плотности 2,0×10⁶ клеток/мл и добавляли плазмиды тяжелой цепи и легкой цепи антитела в соотношении 0,5 мг HC и 0,5 мг LC на литр клеток. Сначала смешивали KPM (буфер для трансфекции) и стерильные плазмиды. Затем брали еще одну центрифужную пробирку, в которой смешивали KPM и ТА-293 реагент для трансфекции. Реагент для трансфекции медленно добавляли к смеси KPM, содержащей плазмиды. Приготовленный комплекс плазмида-вектор осторожно хорошо перемешивали и после отстаивания в течение 10 мин добавляли к клеткам комплекс плазмида-вектор. Усилитель экспрессии клеточного белка и питательные добавки для временной трансфекции добавляли через 24 часа, и клетки собирали на день 6 после трансфекции и очищали.

Метод капиллярного изоэлектрофокусирования (cIEF): готовили 4,3 М мочевины, 3М клеевой раствор мочевина-cIEF, раствор cIEF MIX. Тестируемый продукт разбавляли до 5 мг/мл. Отбирали 234 мкл раствора cIEF MIX, смешивали с 10 мкл образца и полностью перемешивали. Отбирали 200 мкл смеси и переносили во внутреннюю канюлю для обнаружения.

Метод определения вариации размера моноклональных антител (CE-SDS): получение невосстанавливающего образца: отбирали 100 мкг тестируемого раствора и добавляли буфер для образца SDS до 95 мкл. Затем добавляли 5 мкл 250 мМ раствора йодацетамида и хорошо перемешивали. Эталонный раствор готовили аналогичным образом. Получение восстанавливающего образца: отбирали 100 мкг тестируемого раствора и добавляли буфер для образца SDS до 95 мкл. Затем добавляли 5 мкл 2-меркаптоэтанола и хорошо перемешивали. Смешанный образец инкубировали при 70 ± 2 ℃ в течение 10 минут, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали при 6000 оборотов в минуту в течение 1 минуты. 80 мкл супернатанта переносили пипеткой в пробирку для образца для немедленного анализа. Данные испытаний физических и химических свойств являются следующими.

Таблица 3. Экспрессия и физико-химические свойства гуманизированного антитела к нектину-4

Клон	Количество экспрессии (мг/л)	SEC			cIEF			CE (NR)	R CE-SDS
		агрега-ция	основной пик	фрагмент	кислотный пик	основной пик	основный пик	основ-ной пик	LC+HC
SWY2001-Ab1	200,3	ND	100	ND	16,12	68,95	14,93	94,193	99,443
SWY2001-Ab2	120,3	0,003	99,997	ND	9,97	54,94	35,09	92,769	98,499
SWY2001-Ab3	185,6	ND	100	ND	31,33	53,89	14,78	92,651	98,825

Можно увидеть, что экспрессия гуманизированных антител, полученных согласно настоящему изобретению, является относительно высокой. Временная экспрессия общего антитела составляла 50-100 мг/л, а экспрессия трех гуманизированных антител согласно настоящему изобретению превышала 100 мг/л. Более того, экспрессия SWY 2001-Ab1 достигала 200 мг/л. В то же время для определения чистоты использовали несколько методов. Чистота согласно SEC-HPLC составляла более 99%, а чистота согласно CD-SDS в условиях восстановления составляла более 98%, все соответствовало требованиям дальнейших экспериментов.

Пример 3. DSC-обнаружение гуманизированных антител к нектин-4

В этом эксперименте для определения стабильности гуманизированных антител к нектину-4 использовали дифференциальный сканирующий калориметр. Параметры эксперимента были следующими. Концентрация антитела составляла 1 мг/мл, а объем загрузки составлял 325 мкл. Результаты эксперимента показаны на фиг. 5. Конкретные значения параметров DSC были следующими.

Таблица 4. Значения параметров для DSC

Категория параметра	значение параметра
начальная температура сканирования (℃)	20
температура окончания сканирования (℃)	90
скорость сканирования (℃/ч)	60
очистка между образцами	14% Decon90, вода
режим обратной связи по сигналу	нет
версия программного обеспечения для анализа	1,40

Из результатов на фиг. 5 видно, что антитела, полученные согласно настоящему изобретению, обладают хорошей стабильностью.

Пример 4. Аффинное и обнаружение между видами гуманизированных антител к нектину-4

В этом эксперименте Fortebio использовали для определения аффинности гуманизированных антител к нектину-4 к белку нектин-4 человека. После того как белок нектин-4 инкубировали с образцом анти-нектина-4 антитела, значение сигнала определяли посредством Fortebio для анализа аффинности в отношение человеческого нектина-4. Результаты эксперимента показаны в таблице 5 и показывают, что аффинность трех гуманизированных антител к белку нектина-4 человека существенно не снизилась после завершения гуманизации. Химерные антитела создавали на основе антител мышиного происхождения, а константная область происходит из человеческого IgG1.

Таблица 5. Аффинность анти-нектин-4 антител в отношение человеческого белка нектин-4

ID образца	KD (М)	kon(1/Мс)	kdis(1/с)	Полный R^2
химерное антитело	2,80E-09	6,46E+05	1,81E-03	0,9974
SWY2001- Ab1	5,92E-09	7,56E+05	4,47E-03	0,9909
SWY2001- Ab2	5,51E-09	7,52E+05	4,14E-03	0,9939
SWY2001- Ab3	5,08E-09	8,36E+05	4,25E-03	0,9937

Аффинность гуманизированных анти-нектин-4 антител в отношение белков нектина-4 разных видов определяли с помощью ELISA. Белки нектина-4 разных видов (нектин-4 человека, нектин-4 яванского макака, нектин-4 крысы, нектин-4 мыши) инкубировали с образцами гуманизированных антител к нектин-4 различных концентраций, а затем инкубировали со вторичным антителом, которое связывает IgG (козье анти-человеческий IgG (H+L) перекрестно-адсорбированное вторичное антитело. Значения сигналов различных концентраций обнаруживали с помощью ELISA для анализа аффинности образцов в отношение белков нектина-4 разных видов. Результаты эксперимента показаны на Таблица 6, где показано, что гуманизированные антитела к нектину-4 обладают хорошей аффинностью в отношение белков нектина-4 человека, крысы и яванского макака.

Таблица 6. Межвидовая перекрестная реактивность гуманизированных анти-нектин-4 антител

EC50 образца	Человек нг/мл	Яванская макака нг/мл	Крыса нг/мл	Мышь нг/мл
PADCEV	0,877	0,968	1,01	82,4
SWY2001- Ab1	1,21	0,647	0,857	674000
SWY2001- Ab2	1,13	0,646	0,726	1050000
SWY2001- Ab3	1,02	0,832	0,942	2210000

Пример 5. Получение конъюгата анти-нектин-4 антитела и лекарственного средства

1. Ферментативное связывание SWY2001-Ab1-LND1002:

LND1002 (растворенный в DMSO в концентрации 1 г: 5 мл, структура показана на фиг. 2), 10-кратный реакционный буфер, анти-нектин-4 антитело, мТгаза (трансглутаминаза, которая катализирует трансглутаминазную реакцию на mTgase глутамина вблизи N-гликозилирования и может специфически катализировать трансглутаминазную реакцию при нумерации по Kabat Q295) и 20% H₂O последовательно добавляли в пробирку EP, запечатывали и перемешивали, а затем помещали при 30 ℃. Время реакции не превышало 72 часов. Когда степень связывания составляла 95%, реакцию прекращали и немедленно очищали. Условия реакции были следующими.

Таблица 7. Система реакции связывания SWY2001-Ab1-LND1002

партия	Mab-MMAE
масштаб реакции	10 мг
Концентрация антител	10 мг/мл
Молярное соотношение лекарственного средства и антитела	30:1
mTgase	0,6 мг/мл
Буфер	50 мМ Tris-OAc + 2 мМ EDTA + 0,02% PS20 pH 8,0
Условия реакции	30℃ 72 ч
DAR	2,039

По результатам экспериментов было подтверждено, что каталитический сайт трансглутаминазы антитела согласно настоящему изобретению находится в положении Q 295 рядом с сайтом N-гликозилирования.

Использованная последовательность трансглутаминазы была следующей (SEQ ID NO: 13):

DSDERVTPPAEPLDRMPDPYRPSYGRAETIVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFAFFDEDKYKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKDSFDEAKGFQRARDVASVMNKALENAHDEGAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKDRNGGNHDPSKMKAVIYSKHFWSGQDRSGSSDKRKYGDPEAFRPDRGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGESFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSDGYSDFDRGAYVVTFVPKSWNTAPDKVTQGWP

2. Химическое связывание SWY2001-Ab1-VC-MMAE:

Антитело подвергали замене буфера PBS, содержащего 5 мМ EDTA, pH=6,0, с доведением концентрации антитела до 10 мг/мл. Добавляли 3 молярных эквивалента восстанавливающего агента TCEP и 1/50 объема 1 М дикалийгидрофосфата в соответствии с количественной концентрацией вещества антитела (SWY2001-Ab1). Реакционную смесь нагревали на водяной бане при 37 ℃ в течение 1 часа, затем добавляли 6 молярных эквивалентов MC-VC-pABC-MMAE и 80 мкл DMSO на объем 1 мл. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли 12 мольных эквивалентов L-цистеина, реакцию останавливали через 20 мин, и конечный продукт образовывался. Антитело было связано с линкером-лекарством через сульфгидрильную группу в его межцепочечном цистеине. Структура показана на фиг. 3.

Пример 6. Анализ и идентификация физических и химических свойств SWY2001-Ab1-ADC

1. Идентификация скорости модификации ферментативно связанного SWY2001-Ab1-LND1002

Экспериментальные стадии:

1) Обработка образца: раствор модификации SWY2001-Ab1-LND1002 в течение 72 часов обрабатывали 50 мМ ацетата аммония, 20 мМ DTT, 55 мМ Tris-HCl буфером в течение 30 минут при 30 ℃ ± 2 ℃ и центрифугировали при 12 000 оборотов в минуту в течение 5 минут.

2) Загрузка: 10 мкл (30 мкг) супентатанта отбирали и добавляли в хроматографическую колонку (waters xbridge C4, 3,5 мкм, 4,6 мм*250 мм)

3) Элюирование: Подвижная фаза. Раствор представлял собой 0,1% водный раствор ТФУ. Раствор подвижной фазы B представлял собой 0,1% раствор ацетонитрила. Соотношение подвижной фазы раствор А: раствор B доводили на 0, 5, 8, 15, 20, 22, 25, 30 мин соответственно до 9:1, 7:3, 6,5:3,5, 6:4, 5,5:4,5, 5:5, 1:9, элюирование 9:1. Скорость потока контролировали на уровне 0,8 мл/мин, температура колонки составляла 60 ℃, а длина волны обнаружения составляла 280/254 нм.

Результаты эксперимента представлены на фиг. 6, где показано, что степень модификации реакции SWY2001-Ab1-LND1002 за 72 часа составила 96,32%.

2. Обнаружение значения DAR для SWY2001-Ab1-ADC

Экспериментальные стадии:

Обращенно-фазовую хроматографию (RP-HPLC) использовали для определения коэффициента связывания лекарственного средства с антителом, значения DAR продукта, согласно "Chinese Pharmacopoeia" 2020 Edition, Part Four, 0512 High Performance Liquid Chromatography.

Экспериментальное оборудование: высокоэффективный жидкостный хроматограф Agilent 1260

Колонка: PLRP-S 1000A, 5 мкм, 50*2,1 мм

Подвижная фаза: Подвижная фаза А: 0,1% (об./об.) водный раствор

Подвижная фаза B: 0,1% (об./об.) TFA в ацетонитриле

Метод обнаружения был следующим:

Скорость потока 0,25 мл/мин.

Длина волны обнаружения 280 нм

Объем инъекции 10 мкл

Температура печи колонки 80℃

Процедура градиентного элюирования заключалась в следующем:

время (мин)	раствор A подвижной фазы (%)	раствор B подвижной фазы (%)
0	73	27
3	73	27
8	65	35
25	57	43
26	5	95
31	5	95
31,5	73	27
40	73	27

Результаты экспериментов анализировали с использованием метода нормализации площади.

Результаты расчета были следующими:

Результаты эксперимента показаны на фиг. 7 (фиг. 7A и фиг. 7B) и в таблице 8.

Таблица 8. Значения DAR для SWY2001-Ab1-ADC

Название образца	SWY2001- Ab1-LND1002	SWY2001- Ab1-VC - MMAE
DAR	2,039	4,176

Пример 7. Эндоцитоз SWY2001-Ab1-LND1002

Экспериментальные стадии:

Клетки SK-BR-3 и клетки T47D (клетки рака молочной железы человека) собирали и ресуспендировали в культуральной среде. Ресуспендированные клетки-мишени несколько раз осторожно вдували в суспензию отдельных клеток и определяли жизнеспособность клеток и количество клеток окрашиванием трипановым синим. Плотность клеток доводили до 1×10⁵ клеток/мл. Клетки высевали в конфокальную 96-луночный планшет для культивирования клеток из расчета 100 мкл/лунку, и количество клеток, высеянных в каждую лунку, составляло 1×10⁴. ADC, меченные Zenon™ pHrodo™ iFL, добавляли на 96-луночный планшет с конечной концентрацией 2 мкг/мл, который затем помещали в инкубатор с температурой 37°C и 5% CO₂ для непрерывной инкубации в течение 24 часов. Все изображения наблюдали и фиксировали с помощью 20-кратного объектива лазерного конфокального микроскопа.

Результаты эксперимента показаны на фиг. 8 и 9. SWY2001-Ab1-LND1002 эндоцитозировался в клетки и локализовался в лизосомах с кислой средой, причем скорость его эндоцитоза была значительно выше, чем у препарата PADCEV. Что касается конъюгатов антитела и лекарственного средства, то, как правило, когда скорость эндоцитоза высока и лекарственное средство обладает сильной способностью проникать в опухолевые клетки, оно может лучше выделять токсины и быстрее проявлять эффект. Следовательно, способность конъюгата антитела и лекарственного средства, полученного согласно настоящему изобретению, проникать в опухолевые клетки значительно лучше, чем у PADCEV.

Пример 8. Ингибирующее действие SWY2001-Ab1-LND1002 на рост различных клеток in vitro

Экспериментальные стадии:

Клетки-мишени собирали и ресуспендировали в суспензию отдельных клеток. Жизнеспособность клеток и количество клеток определяли окрашиванием трипановым синим. Плотность клеток доводили до 1×10⁵ клеток/мл. Клетки добавляли в 96-луночный черный планшет для культивирования клеток с плоским дном по 100 мкл на лунку. Разбавленный тестируемый продукт добавляли из расчета 20 мкл/лунку в 96-луночный черный плоскодонный планшет для культивирования клеток, засеянный клетками, который затем помещали в клеточный инкубатор (37°C, 5% CO₂) и инкубировали в течение 66±3 часа. Добавляли раствор резазурина натрия (0,03%) по 20 мкл на лунку и проводили реакцию в течение 3-4 часов при 37 ℃. Величину флуоресценции считывали с помощью микропланшет-ридера при 550/610 н. Prism или использовали аналогичное программное обеспечение для построения графиков для построения графика и соответствия половинной ингибирующей концентрации (IC50) эталонного стандарта и образца. Выходной параметр C был IC₅₀ в нг/мл.

Результаты экспериментов показаны в таблице 9 и показывают, что SWY2001-Ab1-LND1002 может ингибировать рост раковых клеток 293T-нектин-4, SK-BR-3 и PC3-нектин-4 in vitro. Данные по уничтожению стабильного трансформированного штамма 293T-нектин-4 in vitro показали, что SWY2001-Ab1-LND1002 был немного лучше, чем PADECV. Данные по уничтожению SK-BR-3 in vitro показали, что ингибирование SWY2001-Ab1-LND1002 было в 4 раза выше, чем у PADCEV. Данные по уничтожению PC3-нектин-4 in vitro показали, что SWY2001-Ab1-LND1002 существенно не отличается от PADCEV.

Таблица 9. In vitro ингибирующие эффекты SWY2001-Ab1-LND1002 на некоторые раковые клетки

Клетка	SWY2001- Ab1-LND1002 (IC50 нг/мл)	PADCEV (IC50 нг/мл)
293T-нектин - 4	2,6789	3,8262
SK-BR-3	334,62	1487,85
PC3-нектин-4	40,14	34,15

Пример 9. In vivo эффективность SWY2001-Ab1-LND1002

1. Эксперимент по эффективности лекарственного средства в отношение ингибирования рака предстательной железы in vivo

В этом эксперименте самкам мышей NUNU соответствующего возраста инокулировали стабильно трансформированные клетки PC3-нектин-4 (модель голой мыши, трансплантированная раком предстательной железы человека, имеющая высокую экспрессию нектина-4). Когда объем опухоли вырастал приблизительно до 190 мм³ (19 дней после инокуляции), отбирали 42 животных с хорошим ростом опухоли и поровну разделяли на 6 групп в зависимости от объема опухоли (Д0), т.е. контрольную группу носителя, группу нектин-4-mab 1 мг/кг, группу PADCEV 1 мг/кг, группы SWY2001-Ab1-LND1002 0,5, 1 и 2 мг/кг, по 7 мышей в каждой группе. После введения мышей взвешивали и записывали данные. Измеряя диаметр опухоли в разное время после введения, динамически наблюдали рост опухоли. На день 17 (17-й день после введения) эксперимент завершился. После того как мышей удушали углекислым газом, опухоли извлекали и взвешивали.

В условиях эксперимента (см. фиг. 10) SWY2001-Ab1-LND1002 мог ингибировать рост опухоли зависимым от дозы образом (P <0,05). При дозе 1 мг/кг коэффициент ингибирования опухоли SWY2001-Ab1-LND1002 был значительно лучше, чем у PADCEV (58,3% против 39,0%). Коэффициенты ингибирования массы опухоли в группах нектин-4-mab 1 мг/кг, PADCEV 1 мг/кг, SWY2001-Ab1-LND1002 0,5, 1 и 2 мг/кг составили 28,2%, 39,0%, 22,1%, 58,3% и 79,4%, соответственно.

2. Эксперимент по эффективности лекарственного средства для подавления рака молочной железы in vivo

В этом эксперименте голым мышам инокулировали клетки MDA-MB-468 для создания ксенотрансплантатов MDA-MB-468 на модели голых мышей рака молочной железы человека. Когда объем опухоли вырастал приблизительно до 100 мм³ (Д25 после инокуляции), отбирали 16 животных с хорошим ростом опухоли и разделяли их на 3 группы в зависимости от объема опухоли (D0): 8 в контрольной группе носителя и по 4 в каждой из остальных экспериментальных групп, которым внутривенно вводили 0,9% раствор хлорида натрия (0,9% INJ NS (физиологический раствор), контрольная группа с носителем) и препараты PADCEV и SWY2001-Ab1-LND1002 по 3 мг/кг (однократное введение), соответственно. После введения мышей взвешивали и записывали данные. Измеряя диаметр опухоли в разное время после введения, динамически наблюдали рост опухоли. В конце теста (D29) мышей удушали углекислым газом, опухоли извлекали и взвешивали.

Результаты эксперимента показаны на фиг. 11. В экспериментальных условиях коэффициенты ингибирования группы PADCEV 3 мг/кг и группы SWY2001-Ab1-LND1002 3 мг/кг составляли 72,3% и 66,3%, соответственно. По сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, рост опухоли был значительно ингибирован (P<0,001).

3. Эксперимент по эффективности лекарственного средства для ингибирования рака мочевого пузыря in vivo. В этом эксперименте самкам мышей NUNU соответствующего возраста инокулировали клетки HT-1376, каждой из которых инокулировали 5×10⁶ клеток. Когда объем опухоли вырастал приблизительно до 100 мм³ (Д21 после инокуляции), отбирали 12 животных с хорошим ростом опухоли и равномерно разделяли на 3 группы в зависимости от объема опухоли (Д0). А: 4 мыши в контрольной группе носителя, которым вводили 0,9% раствор хлорида натрия (0,9% INJ NS (физиологический раствор), контрольная группа носителя), B: 4 мыши в экспериментальной группе PADCEV, PADCEV 3 мг/кг (однократное введение), C: 4 мыши в экспериментальной группе SWY2001-Ab1-LND1002, которым вводили 3 мг/кг (однократное введение). Мышей взвешивали после введения и записывали данные. Измеряя диаметр опухоли в разное время после введения, динамически наблюдали рост опухоли. В конце теста (D22) мышей удушали углекислым газом, опухоли извлекали и взвешивали.

Результаты эксперимента показаны на фиг. 12. В экспериментальных условиях коэффициент ингибирования опухоли PADCEV в дозе 3 мг/кг и SWY2001-Ab1-LND1002 в дозе 3 мг/кг составлял 42,1% и 49,4%, соответственно. По сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, группа, получавшая нектин-4-ADC в дозе 3 мг/кг (однократное введение), могла значительно ингибировать рост опухоли. По сравнению с группой положительного контроля PADCEV в дозе 3 мг/кг (однократное введение), коэффициент ингибирования опухоли был значительно улучшен в группе SWY2001-Ab1-LND1002 в дозе 3 мг/кг.

Пример 10. Исследование с целью оценки безопасности SWY2001-Ab1-ADC

10.1 Исследование, сравнивающее эффект сочетания SWY2001-Ab1-VC-MMAE с химическим методом

В этом эксперименте отбирали 6 самцов яванских макак соответствующего возраста, и токсическую реакцию наблюдали при внутривенной инъекции эталонного продукта и тестируемого продукта SWY2001-Ab1-ADC. Схема введения доз тестируемого продукта SWY2001-Ab1-LND1002 (DAR2) и эталонного продукта SWY2001-Ab1-VC-MMAE (DAR4) показана в таблице ниже. Продукты вводили внутривенно один раз в неделю в течение 2 недель. После второй дозы за субъектами наблюдали в течение 7 дней (общее наблюдение два раза в день и тщательное наблюдение один раз в день). Изменения массы тела наблюдали на Д1 (день 1) до введения, на Д7 и Д14 после введения, а также определяли гематологические и биохимические показатели крови.

Таблица 10. Протокол дизайна эксперимента по токсичности

группа	Доза (мг/кг/день)	Концентрация (мг/кг)	Количество животных
контрольная группа	6	5	2
Группа низкой дозы тестируемого продукта	6	5	2
Группа высокой дозы тестируемого продукта	9	5	2

Экспериментальные результаты показаны в следующей таблице.

Таблица 11. Результаты исследования токсичности

Наблюдаемые показатели	Сток-раствор эталонного продукта SWY2001-Ab1-VC-MMAE (DAR4), 6 мг/кг	Сток-раствор тестируемого продукта SWY2001-Ab1-LND1002 (DAR2)
		6 мг/кг	9/12 мг/кг (Доза скорректирована до 12 мг/кг для третьей дозы)
Клиническое наблюдение	№ 9861: Левая задняя лапа изъязвлена от Д8 (на Д9 площадь изъязвления увеличилась), левая задняя конечность слегка опухла от коленного сустава до голеностопного сустава, участки вокруг глаз обесцвечены, передние конечности десквамированы. D15, сильная слабость левой задней конечности, изъязвления во многих частях конечностей, шелушение по всему телу, изменение цвета вокруг рта, носа и лица. №9862: Левая задняя конечность изъязвлена от D8 (область изъязвления со временем увеличивалась), стул был желтым и жидким. D15: Левая задняя конечность животного была слегка опухшей ниже коленного сустава, середина хвоста была изъязвлена, животное было слегка истощено. Умеренная слабость конечностей наблюдалась приблизительно через 4 часа после введения. Д16 (после 3-й дозы) обнаружена смерть. При грубом анатомическом наблюдении наблюдали меньший размер тимуса.	№9863: Д11- красные глазницы, D14 - у животного имелось пять язв в голеностопном суставе левой задней конечности. №9864: Д11- красные глазницы.	№9865: Д15-Д16 - красные глазницы, шелушение обеих задних конечностей, общее шелушение в месте введения. №9866: Д9 - покраснение вокруг обоих глаз. Д15-Д16 шелушение обеих задних конечностей, общее шелушение в месте введения.
увеличение веса	№9861: Д14-Д10 увеличение на 0,72% №9862: Д14-Д10 снижение на 6,6%	№9863: Д14-Д10 снижение на 2,5% №9864: Д14-Д10 снижение на 3,6%	№9865: Д14-Д10 увеличение на 5% №9866: Д14-Д10 снижение на 3,8%
офтальмологические обследования	№9861: Д19 – веки обоих глаз опухли, слизистая оболочка век покраснела.	Животным не вводили 3-ю дозу и не проводили офтальмологического обследования.	Д19 - у обоих животных не было обнаружено никаких отклонений от нормы.

Вышеуказанные экспериментальные результаты показали, что в целом, согласно клиническим наблюдениям, токсичность для кожи и глаз эталонного продукта была более тяжелой, чем токсичность тестируемого продукта в той же дозе. В частности, для тестируемого продукта SWY2001-Ab1-LND1002 при высокой дозе (9 мг/кг) наблюдали только легкую токсичность для глаз (покраснение вокруг обоих глаз). Напротив, при низкой дозе 6 мг/кг в контрольной группе наблюдали не только симптомы глазной токсичности, но также наблюдали изъязвления на левой задней лапе, небольшую опухлость от коленного сустава до голеностопного сустава левой задней конечности, изменение цвета вокруг обоих глаз, шелушение обеих передних конечностей и другие серьезные токсические реакции и даже серьезные побочные реакции, такие как смерть животных после третьей дозы. Даже если дозу тестируемого препарата в третьей дозе доводили до 12 мг/кг (значительно выше, чем доза эталонного препарата, 6 мг/кг), никаких отклонений от нормы не было обнаружено у обоих животных, а безопасность была значительно выше, чем у эталонного продукта.

10.2 Эксперимент по исследованию безопасности на яванских макаках по сравнению с PADCEV (коммерчески доступный)

В эксперименте использовали 10 яванских макак, половину составляли самцы и половину составляли самки, которых случайным образом разделяли на 5 групп по 2 животных в каждой группе. Первой группе давали коммерческий контрольный продукт в дозе 6 мг/кг (PADCEV®), а группам со второй по пятую вводили тестируемый продукт SWY2001-Ab1-LND1002 посредством внутривенной инфузии. Объем введения составлял 10 мл/кг, скорость инфузии составляла 0,5 мл/кг/мин. Доза, концентрация, частота и цикл лечения каждой группы животных показаны в следующей таблице.

Таблица 12. Протокол планирования эксперимента по токсичности

Группа	Тестируемый продукт/ контрольный продукт	доза (мг/кг)	концентрация (мг/мл)	Частота и цикл введения
1	коммерческий контрольный продукт	6	0,6	Введение дозы один раз в неделю, всего 5 доз (D1, D8, D15, D22, D29)
2	Тестируемый продукт	6	0,6
3	Тестируемый продукт	12	1,2
4	Тестируемый продукт	18	1,8
5a	Тестируемый продукт	15/18	1,5/1,8	Введение дозы один раз каждые 2 недели, всего 3 дозы (D1, D15, D29)

a: Начиная с дня 15 (Д15), дозу корректировали до 18 мг/кг

При одинаковой дозе (6 мг/кг) тестируемый продукт и коммерческий контрольный продукт имеют в основном одинаковые признаки токсичности, включая кожные аномалии, количество лейкоцитов и дифференциальное число, показатели, связанные с эритроцитами (RBC, HGB, HCT). Аномалии AST, ALT, PLT и FIB, аномальная гистопатология роговицы. У коммерческого контрольного продукта наблюдали аномальные симптомы раньше, чем у тестируемого продукта (Д7 по сравнению с Д14), а также более тяжелую кожную токсичность (шелушение или изъязвление).

Данные FDA по коммерческому контрольному продукту показали, что в ходе 4-недельного испытания долгосрочной токсичности на яванских макак с повторным введением 1, 3 и 6 мг/кг коммерческого контрольного продукта вводили еженедельно, при этом 3 животных умерли на ранней стадии теста (D11). Основная токсичность включала поражения кожи, токсичность в отношение костного мозга и легкую гепатотоксичность, и все животные в дозе 6 мг/кг были исключены из исследования после второй дозы (Д8) из-за признаков тяжелой токсичности.

Видно, что тестируемый продукт в той же дозе имел меньший риск токсичности, чем коммерческий контрольный продукт PADCEV®.

На основании приведенных выше экспериментальных результатов видно, что общий эффект конъюгата антитела и лекарственного средства, полученный согласно настоящему изобретению, значительно лучше, чем у PADCEV при эндоцитозе, экспериментах по ингибированию опухолевых клеток in vitro и экспериментах по эффективности ингибирования опухолей in vivo (рак предстательной железы, рак молочной железы и рак мочевого пузыря). В частности, предварительный тест по оценке безопасности показывает, что конъюгат антитела и лекарственного средства, полученный согласно настоящему изобретению, имеет более широкий терапевтический диапазон, меньше побочных эффектов и не имеет очевидных побочных реакций, таких как кожная токсичность и глазная токсичность.

Пример 11. Тест на стабильность SWY2001 -Ab1-LND1002

Эксперимент по стабильности в плазме

Стабильность SWY2001-Ab1-LND1002 и MMAE в плазме крыс SD, яванского макака и человека определяли путем инкубации плазмы in vitro при 37 ℃. Кроме того, PBST выбирали в качестве группы отрицательного контроля для проверки надежности всей тест-системы. Среди них инкубационный образец каждой группы инкубации собирали через 0 часов, 24 часа, 48 часов (Д2), 72 часа (Д3), 96 часов (Д4), 168 часов (Д7) и 336 часов (Д14), соответственно. Концентрацию MMAE в плазме различных видов и PBST определяли методом LC-MS/MS. Результаты среднего процента образования MMAE после инкубации SWY2001-Ab1-LND1002 в плазме различных видов и PBST показаны в Таблице 12.

Таблица 13. Средний процент образования (%)MMAE в плазме различных видов

Инкубированное вещество	Вид	Концентрация инкубации, мкМ	Средний процент образования (%)MMAE
ADC			Время инкубации (ч)
			0	24	48	72	96	168	336
	человек	0,02	0,00	0,00	0,10	0,13	0,21	0,47	0,82
		0,2	0,00	0,05	0,10	0,16	0,22	0,43	0,93
		2	0,00	0,05	0,10	0,17	0,22	0,48	1,00
	Яванская макака	0,02	0,00	0,00	0,11	0,19	0,24	0,44	0,72
		0,2	0,00	0,06	0,11	0,19	0,26	0,47	0,72
		2	0,00	0,05	0,12	0,19	0,26	0,52	0,75
	rat	0,02	0,00	0,06	0,14	0,22	0,29	0,45	0,97
		0,2	0,00	0,07	0,15	0,24	0,30	0,55	1,20
		2	0,00	0,07	0,14	0,23	0,40	0,74	1,04
	PBST	0,02	0,00	0,00	0,00	0,14	0,10	0,18	0,20
		0,2	0,00	0,03	0,05	0,08	0,10	0,18	0,24
		2	0,00	0,02	0,05	0,08	0,11	0,18	0,25

Результаты эксперимента показали, что в пределах тестируемого диапазона концентраций после инкубации трех концентраций конъюгатов антитела и лекарственного средства в плазме человека, обезьяны и крысы в течение 336 часов количество продуцированной малой молекулы MMAE составляло приблизительно 1% от его теоретического количества, подтверждая, что она имеет хорошую стабильность.

Приведенные выше описания относятся только к предпочтительным вариантам осуществления, которые служат только примерами и не ограничивают комбинацию признаков, необходимых для реализации настоящего изобретения. Предоставленные заголовки не предназначены для ограничения различных вариантов осуществления настоящего изобретения. Такие термины, как «содержащий», «содержит» и «включающий», не предназначены для ограничения. Кроме того, отсутствие цифрового модификатора включает множественное число, и «или» означает «и/или», если не указано иное. Если в настоящем документе не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники.

Все публикации и патенты, упомянутые в настоящей заявке, включены в настоящий документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и композиций настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано с точки зрения конкретных предпочтительных вариантов осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение не должно чрезмерно ограничиваться этими вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в соответствующей области техники, предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="FPCH22160178.sequence listing.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-20">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>202110999986.8</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2021-08-27</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="en">CSPC MEGALITH BIOPHARMACEUTICAL CO

LTD</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="en">Anti-Nectin-4 antibody, drug

conjugate and preparation method therefor and use

thereof</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>17</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GYTFTSYY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IYPGNVNT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ARGIYYFDY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QSVNND</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length/>

<INSDSeq_moltype/>

<INSDSeq_division/>

<INSDSeq_sequence>000</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>HQDYSSPFT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>116</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..116</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QVQLQQSGPVLVKPGASVRISCKASGYTFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIG

WIYPGNVNTKYNENFRDKATLTADKSSSTSYMQLSSLTSEDSAVYFCARGIYYFDYWGQGTTLTVSS</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQEKPGQSPKLLIY

YASNRDTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCHQDYSSPFTFGSGTKLEIK</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>116</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..116</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q21">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQRLEWMG

WIYPGNVNTKYNENFRDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYYFDYWGQGTLVTVSS</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IIQMTQSPKFLSASVGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQQKPGQSPKLLIY

YASNRDTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCHQDYSSPFTFGGGTKVEIK</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQQKPGKAPKLLIY

YASNRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYFCHQDYSSPFTFGGGTKVEIK</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVNNDVAWYQQKPGKAPKLLIY

YASNRDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCHQDYSSPFTFGGGTKVEIK</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>331</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..331</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>DSDERVTPPAEPLDRMPDPYRPSYGRAETIVNNYIRKWQQVYSHRDGRK

QQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFAFFDEDKYKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKDSFDE

AKGFQRARDVASVMNKALENAHDEGAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKDRNGGNHD

PSKMKAVIYSKHFWSGQDRSGSSDKRKYGDPEAFRPDRGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGESFVNFDYGWF

GAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSDGYSDFDRGAYVVTFVPKSWNTAPDKVTQG

WP</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q27">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MELGLCWVFLVAILEGVQC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>330</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..330</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q29">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL

TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD

IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

K</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS

GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_se

quence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (21)

1. Конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), способный специфически связываться с нектин-4,

где антитело или его функциональный фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи,

где конъюгат имеет структуру Ab-(L-U)_n,

где Ab представляет собой антитело или его функциональный фрагмент,

L представляет собой линкер, выбранный из NH₂-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-C(=O)-Val-Cit, NH₂-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-C(=O)-Val-Cit-pABC, mc-Val-Cit-pABC, mc-Val-Cit, Val-Cit-pABC, Val-Cit-pAB и Val-Cit,

где m представляет собой целое число от 1 до 8,

U представляет собой лекарственное средство монометилауристатин E (ММАЕ), и

n представляет собой целое число от 1 до 8,

где последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR1, включающий SEQ ID NO:1, CDR2, включающий SEQ ID NO:2, и CDR3, включающий SEQ ID NO:3, и последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR1, включающий SEQ ID NO:4, CDR2, включающий SEQ ID NO:5, и CDR3, включающий SEQ ID NO:6.

2. Конъюгат антитела и лекарственного средства по п. 1, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его функционального фрагмента представляет собой аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с ней, и последовательность вариабельной области легкой цепи выбрана из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:10-12, или последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с ней.

3. Конъюгат антитела и лекарственного средства по п. 1 или 2, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

4. Конъюгат антитела и лекарственного средства по любому из пп. 1-3, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

5. Конъюгат антитела и лекарственного средства по п. 1, где линкер связан с антителом или его функциональным фрагментом через тиоловую группу или аминогруппу, и линкер выбран из mc-Val-Cit-pABC, mc-Val-Cit, NH₂-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-C(=O)-Val-Cit и NH₂-(CH₂-CH₂-O)_m-CH₂-C(=O)-Val-Cit-pABC, где m представляет собой целое число от 1 до 8.

6. Конъюгат антитела и лекарственного средства по любому из пп. 1-5, где антитело или его функциональный фрагмент представляют собой моноклональное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело, наиболее предпочтительно полностью человеческое антитело.

7. Конъюгат антитела и лекарственного средства по любому из пп. 1-6, где антитело или его функциональный фрагмент имеют изотип IgG, предпочтительно антитело IgG1.

8. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нектин-4-положительной опухоли, содержащая эффективное количество конъюгата антитела и лекарственного средства по любому из пп. 1-7.

9. Применение конъюгата антитела и лекарственного средства по любому из пп. 1-7 или фармацевтической композиции по п. 8 для лечения или профилактики нектин-4-положительной опухоли.

10. Применение по п. 9, где опухоль представляет собой нектин-4-положительную солидную опухоль, предпочтительно выбранную из рака предстательной железы, рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака легких, рака яичников, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи и рака желчного пузыря, особенно предпочтительно указанная опухоль представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легких, рак яичников, наиболее предпочтительно рак предстательной железы, рак молочной железы или рак мочевого пузыря.

11. Фармацевтическая композиция по п. 8, дополнительно содержащая антипролиферативное средство.

12. Применение по п.9 или 10, где конъюгат антитела и лекарственного средства комбинируется с облучением.

13. Применение по п. 9 или 10, где конъюгат антитела и лекарственного средства комбинируется с антипролиферативным средством.