RU2846726C1 - Варианты собачьих антител - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: модифицированный IgG, обладающий свойствами повышенной аффинности связывания с неонатальным рецептором Fc (FcRn) и содержащий константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, и слитая молекула, обладающая свойствами повышенной аффинности связывания с FcRn, содержащая модифицированный IgG по п. 1, слитый с гетерологичным белком. Также раскрыты фармацевтическая композиция и набор, предназначенные для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови собаки и их применение. Изобретение используется для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови собаки. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 15 табл., 13 ил., 8 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет относительно предварительной заявки на патент США №63/084241, поданной 28 сентября 2020 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Данное изобретение в целом относится к вариантам собачьих антител и их применению. В частности, данное изобретение относится к мутации в константной области Fc собачьего антитела для улучшения его периода полужизни.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Собачьи моноклональные антитела (мАт) IgG разрабатываются в качестве эффективных терапевтических агентов в ветеринарной медицине. Несколько лет назад были идентифицированы и охарактеризованы четыре подкласса собачьих IgG (Bergeron et al., 2014, Vet Immunol ImmunopathoL, vol. 157 (1-2), pages 31-41). Однако было проделано не так много работы по продлению периода полужизни собачьих IgG.

[0004] Посредством механизма рециркуляции неонатальный рецептор Fc (FcRn) продлевает период полужизни IgG в рН-зависимом взаимодействии с областью его кристаллизующегося фрагмента (Fc). В частности, область Fc, охватывающая границу раздела доменов СН2 и СН3, взаимодействует с FcRn на поверхности клеток, регулируя гомеостаз IgG. Данному взаимодействию способствует кислотное взаимодействие после пиноцитоза IgG, и, таким образом, IgG защищен от деградации. Подвергшийся эндоцитозу IgG затем рециркулирует обратно на поверхность клетки и высвобождается в кровоток при щелочном рН, тем самым поддерживая достаточное количество IgG в сыворотке крови для надлежащего функционирования. Соответственно, фармакокинетический профиль IgG зависит от структурных и функциональных свойств их областей Fc.

[0005] Собачий FcRn связывают три подкласса собачьих IgG, которые сравнивали с аналогами IgG человека. Период полужизни собачьих IgG еще предстоит полностью изучить, поскольку без какой-либо экспериментальной поддержки нельзя ожидать или предсказать, будут ли они точно совпадать с IgG человека.

[0006] Увеличенный период полужизни IgG обеспечивает возможность менее частого введения дозы и (или) введение более низкой дозы антитела - лекарственного препарата, что, в свою очередь, сокращает количество визитов к ветеринару, улучшает комплаентность пациентов и снижает зависящую от концентрации цитотоксичность / нежелательные явления.

[0007] Соответственно, существует потребность в идентификации мутаций в константных областях Fc для улучшения периода полужизни.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Данное изобретение относится к мутантным собачьим IgG, которые обеспечивают более высокую аффинность к FcRn и более длительный период полужизни по сравнению с собачьими IgG дикого типа. В частности, авторы данного изобретения обнаружили, что замещение аминокислотного остатка аспарагина (Asn или N) в положении 434 другой аминокислотой удивительно и неожиданно повысило аффинность к FcRn и, таким образом, увеличило период полужизни IgG.

[0009] В одном аспекте данного изобретения представлен модифицированный IgG, содержащий: константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. В иллюстративном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение аспарагина в положении 434 гистидином.

[00010] В другом аспекте данного изобретения представлен полипептид, содержащий: константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату.

[00011] В еще одном аспекте данного изобретения представлены антитело или молекула содержащие: константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату.

[00012] В дополнительном аспекте данного изобретения представлен способ получения или производства антитела или молекулы, включающий в себя: обеспечение наличия вектора или клетки-хозяина, содержащих константный домен собачьего IgG, при этом указанный константный домен собачьего IgG содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату.

[00013] В другом аспекте данного изобретения представлен способ увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови собаки, включающий в себя: введение указанной собаке терапевтически эффективного количества антитела, содержащего константный домен собачьего IgG, при этом указанный константный домен собачьего IgG содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. В иллюстративном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело увеличивает период полужизни на около 30 суток.

[00014] В другом аспекте данного изобретения представлен способ поддержания терапевтического уровня антитела в сыворотке крови собаки, включающий в себя: введение указанной собаке терапевтически эффективного количества антитела, содержащего константный домен собачьего IgG, при этом указанный константный домен собачьего IgG содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. В иллюстративном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело поддерживает терапевтический уровень указанного антитела в сыворотке крови указанной собаки на протяжении периода, варьирующегося от около 1 месяца до около 7 месяцев.

[00015] Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из следующих графических материалов. Тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, указывающие на предпочтительные варианты осуществления данного изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в духе и объеме данного изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники из данного подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[00016] Данный патент или заявка на патент содержит по меньшей мере одно цветное изображение. Копии данного патента или данной патентной публикации с цветным (-и) изображением(-ями) будут предоставлены уполномоченной патентной организацией по запросу и после уплаты необходимой пошлины.

[00017] На фиг. 1 показана доменная структура IgG. В домене СН3 произведена мутация Fc N434H для увеличения периода полужизни IgG путем повышения аффинности к FcRn при рН 6.

[00018] На фиг. 2А показаны аминокислотные последовательности собачьего IgGB, имеющего N434H, и собачьего IgGB дикого типа (ДТ).

[00019] На фиг. 2В показано выравнивание аминокислотных последовательностей IgGl дикого типа (ДТ) человека, собачьего IgGA ДТ, собачьего IgGB ДТ, собачьего IgGC ДТ и собачьего IgGD ДТ. Аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. Аминокислотные остатки СН1, шарнира, СН2 и СН3 выделены красным, фиолетовым, синим и зеленым, соответственно.

[00020] На фиг. 2С показаны нуклеотидные последовательности IgGB 65 ДТ.

[00021] На фиг. 3 показаны индивидуальные концентрации мАт1 IgG ДТ в сыворотке крови у 4 собак - 2 самцов (01, самец; 02, самец) и 2 самок (03, самка; 04, самка) - после однократной инъекции дозы в 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 56 суток.

[00022] На фиг. 4 показаны индивидуальные концентрации мАт1 IgG N434H в сыворотке крови у 4 собак - 2 самцов (17, самец; 18, самец) и 2 самок (19, самка; 20, самка) - после однократной инъекции дозы в 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 56 суток.

[00023] На фиг. 5 показаны индивидуальные концентрации мАт2 IgG ДТ в сыворотке крови у 8 собак - 4 самцов (Н03433, Н03434, Н03435, Н03436) и 4 самок (Н03453, Н03454, Н03455, Н03456) - после трех инъекций (п/к, п/к, в/в) дозой по 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 98 суток.

[00024] На фиг. 6 показаны индивидуальные концентрации мАт2 IgG N434H в сыворотке крови у 8 собак 4 самцов (Н03433, Н03434, Н03435, Н03436) и 4 самок (Н03453, Н03454, Н03455 и Н03456) - после трех инъекций (п/к, п/к, в/в) дозой по 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 98 суток.

[00025] На фиг. 7 показаны профили ZTS-00008183 в сыворотке крови у собак после подкожного введения однократной дозы в 4 мг/кг. Цвета обозначают различные идентификационные номера животных.

[00026] На фиг. 8 показаны средние профили ZTS-00008183 в сыворотке крови у собак после подкожного введения однократной дозы в 4 мг/кг.

[00027] На фиг. 9 представлен график средних значений наименьших квадратов по видам воздействия по моментам времени (3-5 месяцев). Уровни альфа: сутки 84=0,07085, сутки 112=0,04575, сутки 140=0,04352.

[00028] На фиг. 10 представлен график средних значений наименьших квадратов и процентов изменения по видам воздействия по моментам времени (3-5 месяцев). % изменения средних значений = 100 × [среднее значение (В01) - среднее значение (В02) / среднее значение (В01)].

[00029] На фиг. 11 представлены диаграммы размаха оценок зуда для всех моментов времени. В01=плацебо, 0 мг/кг; В02=ZTS-00008183, 4 мг/кг.

[00030] На фиг. 12 представлен график оценок зуда в виде средних арифметических значений по видам воздействия для всех моментов времени. Планки погрешностей отображают стандартную ошибку.

[00031] На фиг. 13 представлен график оценок зуда в виде средних арифметических значений и процентов изменения по видам воздействия для всех моментов времени. % изменения средних значений = 100 × [среднее значение (В01) - среднее значение (B0X) / среднее значение (В01)], где X=2, 3.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[00032] SEQ ID NO.: 1 представляет собой аминокислотную последовательность константного домена мутантного собачьего IgGB, имеющего мутацию N434H;

[00033] SEQ ID NO.: 2 представляет собой аминокислотную последовательность константного домена собачьего IgGB дикого типа;

[00034] SEQ ID NO.: 3 представляет собой кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность константного домена собачьего IgG дикого типа (IgGB_65_ДТ);

[00035] SEQ ID NO.: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность константного домена собачьего IgGB дикого типа;

[00036] SEQ ID NO.: 5 представляет собой аминокислотную последовательность домена CH1 IgGB, положения 118-215;

[00037] SEQ ID NO.: 6 представляет собой аминокислотную последовательность шарнирного домена IgGB, положения 217-230;

[00038] SEQ ID NO.: 7 представляет собой аминокислотную последовательность домена СН2 IgGB дикого типа, положения 231-340;

[00039] SEQ ID NO.: 8 представляет собой аминокислотную последовательность домена СН3 IgGB дикого типа, положения 341-447;

[00040] SEQ ID NO.: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность домена CH1 IgGB;

[00041] SEQ ID NO.: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность шарнирного домена IgGB;

[00042] SEQ ID NO.: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность домена СН2 IgGB дикого типа;

[00043] SEQ ID NO.: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность домена СН3 IgGB дикого типа;

[00044] SEQ ID NO: 13 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 11E12-VH-CDR1;

[00045] SEQ ID NO: 14 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 34D03-VH-CDR1;

[00046] SEQ ID NO: 15 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 11E12-VH-CDR2;

[00047] SEQ ID NO: 16 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 34D03-VH-CDR2;

[00048] SEQ ID NO: 17 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 11E12-VH-CDR3;

[00049] SEQ ID NO: 18 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 34D03-VH-CDR3;

[00050] SEQ ID NO: 19 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 11E12-VL-CDR1;

[00051] SEQ ID NO: 20 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 34D03-VL-CDR1;

[00052] SEQ ID NO: 21 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 11E12-VL-CDR2;

[00053] SEQ ID NO: 22 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 34D03-VL-CDR2;

[00054] SEQ ID NO: 23 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 11E12-VL-CDR3;

[00055] SEQ ID NO: 24 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как 34D03-VL-CDR3;

[00056] SEQ ID NO: 25 представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-11E12-VL;

[00057] SEQ ID NO: 26 представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11Е12-VL-cUn-FW2;

[00058] SEQ ID NO: 27 представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11Е12-VL-cUn-13;

[00059] SEQ ID NO: 28 представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-34D03-VL;

[00060] SEQ ID NO: 29 представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-34D03-VL-998-1;

[00061] SEQ ID NO: 30 представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-11E12-VH;

[00062] SEQ ID NO: 31 представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11Е12-VH-415-1;

[00063] SEQ ID NO: 32 представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-34D03-VH;

[00064] SEQ ID NO: 33 представляет собой последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-34D03-VH-568-1;

[00065] SEQ ID NO: 34 представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую учетному номеру C7G0W1 в GenBank, что соответствует полноразмерному белку ИЛ-31 собаки.

[00066] SEQ ID NO: 35 представляет собой нуклеотидную последовательность, соответствующую учетному номеру C7G0W1 в GenBank, что соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерный белок ИЛ-31 собаки.

[00067] SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-11E12-VL;

[00068] SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-11E12-VH;

[00069] SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-34D03-VL;

[00070] SEQ ID NO: 39 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как MU-34D03-VH;

[00071] SEQ ID NO: 40 представляет собой аминокислотную последовательность собачьей константной области тяжелой цепи дикого типа, обозначаемую в данном документе как НС-64 (учетный номер в GenBank: AF354264);

[00072] SEQ ID NO: 41 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность собачьей константной области тяжелой цепи дикого типа, обозначаемую в данном документе как НС-64 (учетный номер в GenBank: AF354264);

[00073] SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность собачьей константной области тяжелой цепи дикого типа, обозначаемую в данном документе как НС-65 (учетный номер в GenBank: AF354265);

[00074] SEQ ID NO: 43 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность собачьей константной области тяжелой цепи дикого типа, обозначаемую в данном документе как НС-65 (учетный номер в GenBank: AF354265);

[00075] SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность собачьей константной области легкой цепи, обозначаемую в данном документе как каппа (учетный номер в GenBank: ХР_532962);

[00076] SEQ ID NO: 45 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность собачьей константной области легкой цепи, обозначаемую в данном как каппа (учетный номер в GenBank: ХР_532962);

[00077] SEQ ID NO: 46 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-34D03-VL-998-1;

[00078] SEQ ID NO: 47 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-34D03-VH-568-1;

[00079] SEQ ID NO: 48 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11E12-VL-cUn-FW2;

[00080] SEQ ID NO: 49 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11E12-VH-415-1;

[00081] SEQ ID NO: 50 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11Е12-VL-cUn-13;

[00082] SEQ ID NO: 51 представляет собой последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11E12_VL_cUn_1;

[00083] SEQ ID NO: 52 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемую в данном документе как CAN-11Е12-VL-cUn-1;

[00084] SEQ ID NO: 53 соответствует аминокислотной последовательности конструкции полноразмерного ИЛ-31 собаки для экспрессии в Е. coli;

[00085] SEQ ID NO: 54 соответствует нуклеотидной последовательности

конструкции полноразмерного ИЛ-31 собаки для экспрессии в Е. coli;

[00086] SEQ ID NO: 55 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против фактора роста нервов (ФРН, англ. «NGF») антитела, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00087] SEQ ID NO: 56 представляет собой аминокислотную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00088] SEQ ID NO: 57 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00089] SEQ ID NO: 58 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00090] SEQ ID NO: 59 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00091] SEQ ID NO: 60 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00092] SEQ ID NO: 61 представляет собой аминокислотную последовательность, кодирующую последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00093] SEQ ID NO: 62 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00094] SEQ ID NO: 63 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00095] SEQ ID NO: 64 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ФРН, обозначаемого в данном документе как ZTS-841;

[00096] SEQ ID NO: 65 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного домена СН3 IgGB, положения 341-447;

[00097] SEQ ID NO: 66 представляет собой аминокислотную последовательность мутантной области внутри домена СН3 IgGB;

[00098] SEQ ID NO: 67 представляет собой нуклеотидную последовательность легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемого в данном документе как ZTS-00008183;

[00099] SEQ ID NO: 68 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемого в данном документе как ZTS-00008183;

[000100] SEQ ID NO: 69 представляет собой нуклеотидную последовательность тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемого в данном документе как ZTS-00008183;

[000101] SEQ ID NO: 70 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ИЛ-31, обозначаемого в данном документе как ZTS-00008183;

[000102] SEQ ID NO: 71 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против трансформирующего фактора роста (ТФР, англ. «TGF»)-β1,3 антитела, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000103] SEQ ID NO: 72 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000104] SEQ ID NO: 73 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000105] SEQ ID NO: 74 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000106] SEQ ID NO: 75 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000107] SEQ ID NO: 76 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000108] SEQ ID NO: 77 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000109] SEQ ID NO: 78 представляет собой нуклеотидную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000110] SEQ ID NO: 79 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000111] SEQ ID NO: 80 представляет собой нуклеотидную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-426;

[000112] SEQ ID NO: 81 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000113]SEQ ID NO: 82 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000114]SEQ ID NO: 83 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000115] SEQ ID NO: 84 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000116] SEQ ID NO: 85 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000117] SEQ ID NO: 86 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000118] SEQ ID NO: 87 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000119] SEQ ID NO: 88 представляет собой нуклеотидную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501.

[000120] SEQ ID NO: 89 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000121] SEQ ID NO: 90 представляет собой нуклеотидную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1, обозначаемого в данном документе как ZTS-501;

[000122] SEQ ID NO: 91 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000123] SEQ ID NO: 92 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000124] SEQ ID NO: 93 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000125] SEQ ID NO: 94 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000126] SEQ ID NO: 95 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000127] SEQ ID NO: 96 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000128] SEQ ID NO: 97 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000129] SEQ ID NO: 98 представляет собой нуклеотидную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000130] SEQ ID NO: 99 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000131] SEQ ID NO: 100 представляет собой нуклеотидную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-4155;

[000132] SEQ ID NO: 101 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000133] SEQ ID NO: 102 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000134] SEQ ID NO: 103 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000135] SEQ ID NO: 104 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000136] SEQ ID NO: 105 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000137] SEQ ID NO: 106 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000138] SEQ ID NO: 107 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000139] SEQ ID NO: 108 представляет собой нуклеотидную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000140] SEQ ID NO: 109 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000141] SEQ ID NO: 110 представляет собой нуклеотидную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-122;

[000142]SEQ ID NO: 111 представляет собой CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000143] SEQ ID NO: 112 представляет собой CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000144] SEQ ID NO: 113 представляет собой CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000145] SEQ ID NO: 114 представляет собой CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000146] SEQ ID NO: 115 представляет собой CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000147] SEQ ID NO: 116 представляет собой CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000148] SEQ ID NO: 117 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000149] SEQ ID NO: 118 представляет собой нуклеотидную последовательность тяжелой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000150] SEQ ID NO: 119 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207;

[000151] SEQ ID NO: 120 представляет собой нуклеотидную последовательность легкой цепи антитела против ТФР-β1,2,3, обозначаемого в данном документе как ZTS-207.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[000152] Данное изобретение можно легче понять, обратившись к следующему подробному описанию, которое является частью данного документа. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретными продуктами, способами, условиями или параметрами, описанными и (или) показанными в данном документе, и что терминология, употребляемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления данного изобретения в качестве примера и не предназначена для ограничения заявленного изобретения.

[000153] Если в данном документе не определено иное, научные и технические термины, употребляемые в связи с данной заявкой, имеют значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области техники. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают в себя множественное число, а термины во множественном числе включают в себя единственное число.

[000154] Как указано выше и по всему тексту данного документа, следующие термины и сокращения, если не указано иное, следует понимать как имеющие следующие значения.

Определения

[000155] В данном документе формы единственного числа включают в себя ссылку на множественное число, и ссылка на конкретное числовое значение включает в себя по меньшей мере указанное конкретное значение, если контекст явно не указывает на иное. Следовательно, например, ссылка на «молекулу» или «соединение» является ссылкой на одну или большее число таких молекул или соединений и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и так далее. При употреблении в контексте данного документа термин «множество» означает больше чем один. При указании диапазона, другой вариант осуществления данного изобретения включает в себя интервал от одного конкретного значения и (или) до другого конкретного значения. Подобным образом, когда значения указаны как приблизительные величины с использованием предшествующего слова «около», следует понимать, что конкретное значение образует другой вариант осуществления данного изобретения. Все диапазоны являются включающими и могут комбинироваться.

[000156] В описании и формуле данного изобретения нумерация аминокислотных остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина соответствует индексу ЕС, как по Кабату - как в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). «Индекс EC, как по Кабату» относится к нумерации остатков в антителе IgG и отражен в данном документе на фиг. 2.

[000157] Термин «выделенная», когда он употребляется по отношению к нуклеиновой кислоте, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в своем природном источнике. Выделенная нуклеиновая кислота пребывает в форме или в окружении, которые отличны от тех, в которых она встречается в природе. Следовательно, молекулы выделенной нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в естественных клетках. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют закодированный в них полипептид, когда, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты находится в плазмиде или в хромосомном расположении, отличном от расположения в естественных клетках. Выделенная нуклеиновая кислота может присутствовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Когда молекула выделенной нуклеиновой кислоты предназначена для использования в экспрессии белка, соответствующий олигонуклеотид или полинуклеотид будет содержать, как минимум, смысловую или кодирующую цепь, но может содержать как смысловую, так и антисмысловую цепи (т.е. может быть двухцепочечным).

[000158] Молекула нуклеиновой кислоты является «функционально связанной» или «функционально ассоциированной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он влияет на транскрипцию данной последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он расположен так, чтобы облегчить ее трансляцию. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc, функционально связана с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный белок (т.е. белок или его функциональный фрагмент, которые если существуют в природе, то не содержат область Fc), если она расположена так, что экспрессируемый слитый белок содержит указанные гетерологичный белок или его функциональный фрагмент, примыкающие либо в положении 5', либо в положении 3' к указанному вариантному полипептиду области Fc; указанный гетерологичный белок может непосредственно примыкать к указанному вариантному полипептиду области Fc или может быть отделен от него линкерной последовательностью любых длины и состава. Подобным образом, молекула полипептида (употребляется в данном документе как синоним термина «белок») является «функционально связанной» или «функционально ассоциированной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другим полипептидом.

[000159] При употреблении в контексте данного документа термин «функциональный фрагмент», употребляемый по отношению к полипептиду или белку (например, вариантной области Fc или моноклональному антителу), относится к фрагментам такого белка, которые сохраняют по меньшей мере одну функцию указанного полноразмерного полипептида. Размер фрагментов может варьировать от шести аминокислот до всей аминокислотной последовательности полноразмерного полипептида минус одна аминокислота. Функциональный фрагмент полипептида вариантной области Fc согласно данному изобретению сохраняет по меньшей мере одно «аминокислотное замещение», как определено в данном документе. Функциональный фрагмент полипептида вариантной области Fc сохраняет по меньшей мере одну известную в данной области техники функцию, связанную с областью Fc (например, АЗКЦ, КЗЦ, связывание с рецептором Fc, связывание с Clq, подавление рецепторов клеточной поверхности или может, например, увеличивать период полужизни in vivo или in vitro полипептида, с которым он функционально ассоциирован).

[000160] Термин «очищенный» или «очистка» относится к существенному удалению из образца по меньшей мере одного загрязняющего вещества. Например, антигенспецифическое антитело может быть очищено путем полного или существенного удаления (по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% или больше, предпочтительно - по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99%) по меньшей мере одного загрязняющего белка, не являющегося иммуноглобулином; оно также может быть очищено путем удаления белка иммуноглобулина, который не связывается с тем же антигеном. Удаление белков, не являющихся иммуноглобулинами, и (или) удаление иммуноглобулинов, которые не связывают конкретный антиген, приводит к повышению процентного содержания антигенспецифических иммуноглобулинов в данном образце. В другом примере полипептид (например, иммуноглобулин), экспрессируемый в бактериальных клетках-хозяевах, очищают путем полного или существенного удаления белков клеток-хозяев; следовательно, процентное содержание указанного полипептида в данном образце повышается.

[000161] Термин «нативный» при употреблении по отношению к полипептиду (например, к области Fc), употребляется в данном документе, чтобы указать, что данный полипептид имеет аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности полипептида, обычно встречающегося в природе, или его встречающегося в природе полиморфизма. Нативный полипептид (например, нативная область Fc) может быть получен рекомбинантным способом или может быть выделен из природного источника.

[000162] Термин «вектор экспрессии» при употреблении в контексте данного документа относятся к рекомбинантной молекуле ДНК, содержащей желаемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии данной функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине.

[000163] При употреблении в контексте данного документа термин «клетка-хозяин» относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, бактериальные клетки, такие как Е. coli, клетки СНО, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки амфибий, клетки растений, клетки рыб и клетки насекомых), независимо от того, находятся ли они in vitro, in situ или in vivo.

[000164] При употреблении в контексте данного документа термин «область Fc» относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. «Область Fc» может представлять собой нативную последовательность области Fc или вариантную область Fc. Хотя общепринятые границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, область Fc тяжелой цепи собачьего IgG обычно определяется как простирающаяся, например, от аминокислотного остатка в положении 231 до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения варианты содержат только части области Fc и могут включать в себя или не включать в себя карбоксильный конец. Область Fc иммуноглобулина, как правило, содержит два константных домена - СН2 и СН3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения представлены варианты, имеющие один или большее число константных доменов. В других вариантах осуществления данного изобретения представлены варианты без таких константных доменов (или только с частями таких константных доменов).

[000165] «Домен СН2» области Fc собачьего IgG, как правило, простирается, например, примерно от аминокислоты 231 до примерно аминокислоты 340 (см. фиг. 2В). Домен СН2 уникален тем, что он не связан тесно с другим доменом. Две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами СН2 интактной нативной молекулы IgG.

[000166] «Домен СН3» области Fc собачьего IgG, как правило, представляет собой участок остатков, находящийся в С-концевом положении относительно домена СН2 в области Fc, простирающейся, например, примерно от аминокислотного остатка 341 до примерно аминокислотного остатка 447 (см. фиг. 2В).

[000167] «Функциональная область Fc» обладает «эффекторной функцией» нативной последовательности области Fc. По меньшей мере однаэффекторная функция полипептида, содержащего вариант области Fc согласно данному изобретению, может быть усилена или снижена по сравнению с полипептидом, содержащим нативную область Fc или родительскую область данного варианта Fc. Примеры эффекторных функций включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: связывание Clq; комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ, англ. «CDC»); связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ, англ. «ADCC»); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора - ВКР, англ. «BCR») и т.д. Такие эффекторные функции могут требовать того, чтобы область Fc была функционально связана со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с использованием различных анализов (например, анализ связывания Fc, анализы АЗКЦ, анализы КЗЦ, деплеция целевых клеток из образцов цельной или фракционированной крови и т.д.).

[000168] «Нативная последовательность области Fc» или «область Fc дикого типа» относятся к аминокислотной последовательности, которая идентична аминокислотной последовательности области Fc, обычно встречающейся в природе. Иллюстративные нативные последовательности собачьих областей Fc показаны на фиг. 2 и включают в себя нативную последовательность области Fc собачьего IgGB_65.

[000169] «Вариант области Fc» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности области Fc (или ее фрагмента) по меньшей мере одним «аминокислотным замещением», как определено в данном документе. В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения указанный вариант области Fc имеет по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с нативной последовательностью области Fc или по сравнению с областью Fc родительского полипептида, предпочтительно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замещений в нативной последовательности области Fc или в области Fc родительского полипептида. В альтернативном варианте осуществления данного изобретения вариант области Fc может быть сгенерирован в соответствии с описанными в данном документе способами, и указанный вариант области Fc может быть слит с гетерологичным полипептидом по выбору, таким как вариабельный домен антитела или полипептид, не являющийся антителом, например, связывающий домен рецептора или лиганда.

[000170] При употреблении в контексте данного документа термин «производное» в контексте полипептидов относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, которая была изменена введением замещения аминокислотного остатка. Термин «производное» при употреблении в контексте данного документа также относится к полипептиду, который был модифицирован путем ковалентного присоединения к данному полипептиду молекулы любого типа. Например, но не в порядке ограничения, антитело может быть модифицировано, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пэгилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными / блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Производный полипептид может быть получен путем химических модификаций с использованием методик, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производный полипептид обладает функцией, которая сходна или идентична функции полипептида, из которого он был получен. Следует понимать, что полипептид, содержащий вариант области Fc согласно данному изобретению, может представлять собой производное, как определено в данном документе, предпочтительно дериватизация происходит внутри области Fc.

[000171] «По существу собачьего происхождения» при употреблении в контексте данного документа в отношении полипептида (например, области Fc или моноклонального антитела), означает, что данный полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, или еще более предпочтительно - по меньшей мере на 95%, 95%, 97%, 98% или на 99% гомологична нативному собачьему аминополипептиду.

[000172] Термины «рецептор Fc» и «FcR» употребляются для описания рецептора, который связывается с участком Fc (например, с участком Fc антитела). Предпочтительный FcR представляет собой FcR с природной последовательностью. Более того, предпочтительный FcR представляет собой тот, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов Fc гамма RI, Fc гамма RII, Fc гамма RIII, включая аллельные варианты и формы данных рецепторов после альтернативного сплайсинга. Другой предпочтительный FcR включает в себя неонатальный рецептор - FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976); и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)). В данном документе термин «FcR» охватывает и другие FcR, включительно с теми, которые будут идентифицированы в будущем.

[000173] Фраза «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность», или «АЗКЦ», относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют рецепторы FcR (например, клетки естественные киллеры («NK-клетки»), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на целевой клетке и впоследствии вызывают лизис данных целевых клеток. Первичные клетки, опосредующие АЗКЦ, - NK-клетки, экспрессируют только Fc гамма RIII, тогда как моноциты экспрессируют Fc гамма RI, Fc гамма RII и Fc гамма RIII.

[000174] При употреблении в контексте данного документа фраза «эффекторные клетки» относится к лейкоцитам (предпочтительно собачьим), которые экспрессируют один или большее число рецепторов FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, данные клетки экспрессируют по меньшей мере Fc гамма RIII и выполняют эффекторную функцию АЗКЦ. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют АЗКЦ, включают в себя моноклональные клетки периферической крови (МКПК, англ. «РВМС»), NK-клетки, моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника (например, из крови или из МКПК).

[000175] Вариант полипептида с «измененной» аффинностью связывания с FcRn представляет собой полипептид, который имеет либо повышенную (т.е. увеличенную, большую или более высокую), либо сниженную (т.е. уменьшенную, меньшую или более низкую) аффинность связывания с FcRn по сравнению с родительским полипептидом данного варианта или с полипептидом, содержащим нативную область Fc, при измерении при рН 6,0. Вариант полипептида, который проявляет повышенное связывание или повышенную аффинность связывания с FcRn, связывает FcRn с более высокой аффинностью, чем родительский полипептид. Вариант полипептида, который проявляет сниженное связывание или сниженную аффинность связывания с FcRn, связывает FcRn с более низкой аффинностью, чем его родительский полипептид. Такие варианты, которые демонстрируют сниженное связывание с FcRn, могут обладать незначительным или вообще не иметь заметного связывания с FcRn, например, 0-20% связывания с FcRn, по сравнению с родительским полипептидом. Вариант полипептида, который связывает FcRn с «повышенной аффинностью» по сравнению с его родительским полипептидом, представляет собой тот, который связывает FcRn с более высокой аффинностью связывания, чем родительский полипептид, когда количества указанного варианта полипептида и указанного родительского полипептида в анализе связывания по существу одинаковы, и все другие условия идентичны. Например, вариант полипептида с повышенной аффинностью связывания с FcRn может демонстрировать от около 1,10-кратного до около 100-кратного (более типично - от около 1,2-кратного до около 50-кратного) повышения аффинности связывания с FcRn по сравнению с родительским полипептидом, при этом аффинность связывания с FcRn определяют, например, в анализе способом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА, англ. «ELISA») или другим способом, доступным рядовому специалисту в данной области техники.

[000176] При употреблении в контексте данного документа термин «аминокислотное замещение» относится к замене по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка в данной аминокислотной последовательности другим, отличным от него «замещающим» аминокислотным остатком. Замещающий остаток или остатки могут быть «встречающимися в природе замещающими аминокислотными остатками» (т.е. кодируемыми генетическим кодом) и выбранными из: аланина (Ala); аргинина (Arg); аспарагина (Asn); аспарагиновой кислоты (Asp); цистеина (Cys); глутамина (Gln); глутаминовой кислоты (Glu); глицина (Gly); гистидина (His); изолейцина (Ile); лейцина (Leu); лизина (Lys); метионина (Met); фенилаланина (Phe); пролина (Pro); серина (Ser); треонина (Thr); триптофана (Тгр); тирозина (Tyr); и валина (Val). Замещение одним или большим числом не встречающихся в природе аминокислотных остатков также охватывается определением аминокислотного замещения, указанным в данном документе. «Не встречающийся в природе аминокислотный остаток» относится к остатку, отличному от перечисленных выше встречающихся в природе аминокислотных остатков, который способен ковалентно связывать соседний (-е) аминокислотный (-е) остаток (остатки) в полипептидной цепи. Примеры не встречающихся в природе аминокислотных остатков включают в себя норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как те, которые описаны в работе Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991).

[000177] Термин «сигнал анализа» относится к выходному сигналу любого способа выявления белок-белковых взаимодействий, включительно с, но не ограничиваясь ими, измерениями абсорбции в колориметрических анализах, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализа могут включать в себя ТИФА, сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или другие способы. Изменение «сигнала анализа» может отражать изменение жизнеспособности клеток и (или) изменение кинетического показателя скорости обратной реакции, кинетического показателя скорости прямой реакции или обоих показателей. «Более высокий сигнал анализа» относится к измеренному выходному числу, которое больше, чем другое число (например, вариант может иметь более высокое (большее) измеренное число в анализе ТИФА по сравнению с родительским полипептидом). «Более низкий» сигнал анализа относится к измеренному выходному числу, которое меньше, чем другое число (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное число в анализе ТИФА по сравнению с родительским полипептидом).

[000178] Термин «аффинность связывания» относится к константе равновесной диссоциации (выраженной в единицах концентрации), связанной с каждым взаимодействием связывания рецептора Fc с Fc. Аффинность связывания напрямую связана с кинетической константой скорости обратной реакции (как правило, указывается в единицах обратного времени, например, секунды^-1), деленной на кинетическую константу скорости прямой реакции (как правило, указывается в единицах концентрации на единицу времени, например, моль/секунда). В общем, невозможно однозначно утверждать, вызваны ли изменения констант равновесной диссоциации различиями в скоростях прямой реакции, обратной реакции или и тем, и другим, если каждый из данных параметров не определен экспериментально (например, с помощью измерений по технологии BIACORE или SAPIDYNE).

[000179] При употреблении в контексте данного документа термин «шарнирная область» относится к участку из аминокислот в собачьем IgG, простирающемуся, например, от положения 216 до положения 230 собачьего IgG. Шарнирные области других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG путем размещения остатков цистеина, образующих дисульфидные связи между тяжелыми цепями (S-S), в одних и тех же положениях.

[000180] «Clq» представляет собой полипептид, который включает в себя сайт связывания для области Fc иммуноглобулина. Clq вместе с двумя сериновыми протеазами, Olr и Cls, образует комплекс Cl - первый компонент пути КЗЦ.

[000181] При употреблении в контексте данного документа термин «антитело», употребляемый взаимозаменяемо с термином «иммуноглобулин», или «Ig», употребляется в наиболее широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (включительно с полноразмерными моноклональными антителами), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность или функциональную активность. Одноцепочечные антитела и химерные, собачьи или канинизированные антитела, а также химерные или CDR-привитые одноцепочечные антитела и тому подобное, содержащие части, полученные из разных видов, также охватываются данным изобретением и термином «антитело». Различные части таких антител могут быть соединены вместе химическим путем с помощью обычных методик, синтетическим путем или могут быть получены в виде непрерывного белка с использованием способов генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную или канинизированную цепь, могут быть экспрессированы для получения непрерывного белка. См., например, патент США №4816567; патент США №4816397; WO 86/01533; патент США №5225539; и патенты США №5585089 и №5698762. См. также работу Newman, R. et al. BioTechnology, 10: 1455-1460, 1993, касательно приматизированного антитела и Ladner et al., патент США №4946778 и Bird, R.Е. et al., Science, 242: 423-426, 1988, касательно одноцепочечных антител. Следует понимать, что все формы антител, содержащих область Fc (или ее часть), охватываются в данном документе термином «антитело». Кроме того, антитело может быть помечено выявляемой меткой, иммобилизовано на твердой фазе и (или) конъюгировано с гетерологичным соединением (например, ферментом или токсином) в соответствии со способами, известными в данной области техники.

[000182] При употреблении в контексте данного документа термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя, но не ограничиваются ими, линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; пептиды Fc или Fc', Fab и фрагменты Fab, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антитела предпочтительно сохраняют по меньшей мере часть шарнира и, необязательно, область СН1 тяжелой цепи IgG. В других предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения фрагменты антитела содержат по меньшей мере часть области СН2 или всю область СН2.

[000183] При употреблении в контексте данного документа термин «функциональный фрагмент», когда он употребляется в отношении моноклонального антитела, предназначен для обозначения части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может представлять собой, например, антигенсвязывающую активность или специфичность, рецепторсвязывающую активность или специфичность, эффекторную функциональную активность и тому подобное. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают в себя, например, индивидуальные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как VL, VH и Fd; моновалентные фрагменты, такие как Fv, Fab и Fab'; бивалентные фрагменты, такие как F(ab')2; одноцепочечный Fv (scFv); и фрагменты Fc. Данные термины описаны, например, в работах Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178: 497-515 (1989); и в работе Day, E. D., Advanced Immuno chemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990). Термин «функциональный фрагмент» предназначен как включающий в себя, например, фрагменты, полученные протеазным расщеплением или восстановлением моноклонального антитела и способами рекомбинантной ДНК, известными специалистам в данной области техники.

[000184] При употреблении в контексте данного документа термин «фрагмент» относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 или больше смежных аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности другого полипептида. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения фрагмент полипептида сохраняет по меньшей мере одну функцию полноразмерного полипептида.

[000185] При употреблении в контексте данного документа термин «химерное антитело» включает в себя моновалентные, бивалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепью. Бивалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами тяжелая цепь - легкая цепь, связанными посредством по меньшей мере одного дисульфидного мостика. Химерная тяжелая цепь антитела для применения у собак содержит антигеневязывающую область, полученную из тяжелой цепи несобачьего антитела, которая связана с по меньшей мере частью константной области собачьей тяжелой цепи, такой как СН1 или СН2. Химерная легкая цепь антитела для применения у собак содержит антигенсвязывающую область, полученную из легкой цепи несобачьего антитела, связанную с по меньшей мере частью константной области собачьей легкой цепи (CL). Антитела, фрагменты или производные, имеющие химерные тяжелые цепи и легкие цепи с одинаковой или различной специфичностью связывания вариабельной области, можно также получить путем соответствующего объединения индивидуальных полипептидных цепей в соответствии с известными стадиями способа. При таком подходе организмы-хозяева, экспрессирующие химерные тяжелые цепи, культивируют отдельно от организмов-хозяев, экспрессирующих химерные легкие цепи, и цепи иммуноглобулина отдельно выделяют и затем объединяют.В качестве альтернативы, указанные организмы-хозяева могут быть совместно культивированы, и цепям дают возможность спонтанно ассоциироваться в культуральной среде с последующим извлечением собранного иммуноглобулина или фрагмента, либо как тяжелая, так и легкая цепи могут быть экспрессированы в одной и той же клетке-хозяине. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США №6284471; №5807715; №4816567; и №4816397).

[000186] При употреблении в контексте данного документа «канинизированные» формы несобачьих (например, мышиных) антител (т.е. канинизированные антитела) представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из несобачьего иммуноглобулина, или не содержат такую последовательность. По большей части канинизированные антитела представляют собой собачьи иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента замещены остатками из гипервариабельной области вида, отличного от собаки (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющими желаемые специфичность, аффинность и объем связывания. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) собачьего иммуноглобулина замещены соответствующими остатками из вида, отличного от собаки. Кроме того, канинизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации, как правило, выполняют для дальнейшего улучшения характеристик антитела. Как правило, канинизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли (области CDR) соответствуют таковым из иммуноглобулина из вида, отличного от собаки, и все или по существу все остатки FR представляют собой таковые из последовательности собачьего иммуноглобулина. Канинизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило - часть константной области собачьего иммуноглобулина.

[000187] При употреблении в контексте данного документа термин «иммуноадгезин» обозначает антителоподобные молекулы, которые объединяют домен связывания гетерологичного белка «адгезина» (например, рецептора, лиганда или фермента) с константным доменом иммуноглобулина. По своей структуре иммуноадгезины содержат слияние аминокислотной последовательности адгезина с желаемой специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (антигенсвязывающего сайта) антитела (т.е. является «гетерологичной»), с последовательностью константного домена иммуноглобулина.

[000188] При употреблении в контексте данного документа термин «лигандсвязывающий домен» относится к любому нативному рецептору или любой его области или производному, сохраняющим по меньшей мере качественную лиганд связывающую способность соответствующего нативного рецептора. В определенных вариантах осуществления данного изобретения указанный рецептор получен из полипептида клеточной поверхности, имеющего внеклеточный домен, который гомологичен представителю суперсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются представителями суперсемейства иммуноглобулинов, но, тем не менее, конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы цитокинов, и, в частности, рецепторы с активностью тирозинкиназы (рецепторные тирозинкиназы), представителей суперсемейств рецепторов гемопоэтина и фактора роста нервов, и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, L- и Р-селектины).

[000189] При употреблении в контексте данного документа термин «рецепторсвязывающий домен» относится к любому нативному лиганду рецептора, включительно, например, с молекулами клеточной адгезии, или любой области или производному указанного нативного лиганда, сохраняющим по меньшей мере качественную рецепторсвязывающую способность соответствующего нативного лиганда.

[000190] При употреблении в контексте данного документа термин «выделенный» полипептид представляет собой полипептид, который был идентифицирован и отделен от и (или) выделен из компонента его естественной среды. Загрязняющие компоненты его естественной среды представляют собой материалы, которые будут мешать диагностическому или терапевтическому применению данного полипептида и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения выделенный полипептид очищают (1) до содержания полипептидов, составляющего больше чем 95% по массе, как определено методом Лоури, и предпочтительно - больше чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до однородности с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ, англ. «SDS-PAGE») в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания синим кумасси или серебром. Выделенный полипептид включает в себя полипептид in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественной среды такого полипептида не будет присутствовать. Как правило, однако, выделенный полипептид получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

[000191] При употреблении в контексте данного документа термины «нарушение» и «заболевание» употребляются взаимозаменяемо для обозначения любого состояния, которое улучшилось бы от лечения вариантом полипептида (полипептидом, содержащим вариант области Fc согласно данному изобретению), включая хронические и острые нарушения или заболевания (например, патологические состояния, которые предрасполагают пациента к конкретному нарушению).

[000192] При употреблении в контексте данного документа термин «рецептор» относится к полипептиду, способному связывать по меньшей мере один лиганд. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор поверхности клетки или растворимый рецептор, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и (или) мембранный якорь). Рецептор, подлежащий оценке в анализе, описанном в данном документе, может представлять собой интактный рецептор или его фрагмент, или его производное (например, слитый белок, содержащий связывающий домен рецептора, слитый с одним или большим числом гетерологичных полипептидов). Более того, рецептор, подлежащий оценке на предмет его связывающих свойств, может присутствовать в клетке или быть выделен и необязательно нанесен на планшет для анализа или на какую-либо другую твердую фазу, или может непосредственно быть помечен и использован в качестве зонда.

IgG собачьих дикого типа

[000193] Собачьи IgG хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, вработе Bergeron et al., 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol. 157(1-2), pages 31-41. В одном варианте осуществления данного изобретения собачий IgG представляет собой IgG_A. В другом варианте осуществления данного изобретения собачий IgG представляет собой IgG_B. В еще одном варианте осуществления данного изобретения собачий IgG представляет собой IgG_C. В дополнительном варианте осуществления данного изобретения собачий IgG представляет собой IgG_D. В конкретном варианте осуществления данного изобретения собачий IgG представляет собой IgG_B_65.

[000194] Аминокислотные и нуклеотидные последовательности IgG_A, IgG_B, IgG_C и IgG_D также хорошо известны в данной области техники.

[000195] В одном примере IgG согласно данному изобретению содержит константный домен, например, домены CH1, СН2 или СН3, или их комбинацию. В другом примере константный домен согласно данному изобретению содержит область Fc, включающую в себя, например, домены СН2 или СН3, или их комбинацию.

[000196] В конкретном примере указанный константный домен дикого типа содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO.: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный константный домен дикого типа IgG представляет собой гомолог, вариант, изомер или функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO.: 2, но без какой-либо мутации в положении 434. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления данного изобретения.

[000197] Константные домены IgG также включают в себя полипептиды с аминокислотными последовательностями, по существу сходными с аминокислотной последовательностью указанных тяжелой и (или) легкой цепей. По существу та же аминокислотная последовательность определена в данном документе как последовательность, которая по меньшей мере на 70%, на 75%, на 80%, на 85%, на 90%, на 95% или на 99% идентична сравниваемой аминокислотной последовательности, как определено способом поиска FASTA в соответствии с работой Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988).

[000198] Данное изобретение также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют IgG или их фрагменты, описанные в данном документе. В одном варианте осуществления данного изобретения указанные нуклеиновые кислоты могут кодировать тяжелую цепь антитела, содержащую, например, области CH1, СН2, СН3 или их комбинацию. В другом варианте осуществления данного изобретения указанные нуклеиновые кислоты могут кодировать тяжелую цепь антитела, содержащую, например, любую из областей VH или ее часть, или любую из областей CDR VH, включительно с любыми их вариантами. Данное изобретение также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют легкую цепь антитела, содержащую, например, любую из областей CL или ее часть, любую из областей VL или ее часть, или любую из областей CDR VL, включительно с любыми их вариантами. В определенных вариантах осуществления данного изобретения указанная нуклеиновая кислота кодирует как тяжелую, так и легкую цепи, или их части.

[000199] Аминокислотная последовательность константного домена дикого типа, указанная в SEQ ID NO.: 2, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 4.

Модифицированные собачьи IgG

[000200] Авторы данного изобретения обнаружили, что замещение аминокислотного остатка аспарагина (Asn или N) в положении 434 другой аминокислотой удивительно и неожиданно повысило аффинность к FcRn и увеличило период полужизни IgG. Термин «положение 434» при употреблении в контексте данного документа относится к положению, пронумерованному в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[000201] Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения представлен модифицированный IgG, содержащий: константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. Аспарагин в положении 434 может быть замещен любой другой аминокислотой. Например, аспарагин в положении 434 может быть замещен гистидином (т.е. N434H), серином (т.е. N434S), аланином (т.е. N434A), фенилаланином (т.е. N434F), глицином (т.е. N434G), изолейцином (т.е. N434I), лизином (т.е. N434K), лейцином (т.е. N434L), метионином (т.е. N434M), глутамином (т.е. N434Q), аргинином (т.е. N434R), треонином (т.е. N434T), валином (т.е. N434V), триптофаном (т.е. N434W), тирозином (т.е. N434Y), цистеином (т.е. N434C), аспарагиновой кислотой (т.е. N434D), глутаминовой кислотой (т.е. N434E) или пролином (т.е. N434P). В конкретном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение гистидином (например, N434H).

[000202] В конкретном примере мутантный константный домен согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO.: 1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный мутантный константный домен IgG представляет собой гомолог, вариант, изомер или функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO.: 1, но с мутацией в положении 434. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления данного изобретения.

[000203] Аминокислотная последовательность мутантного константного домена, указанная в SEQ ID NO.: 1, кодируется соответствующей ей мутантной последовательностью нуклеиновой кислоты, например, мутантной формой последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO.: 4. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения кодон нуклеиновой кислоты, соответствующий положению 434 мутантной формы, содержит САС или CAT.

[000204] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения мутантный константный домен согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO.: 65 или 66. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный мутантный константный домен IgG представляет собой гомолог, вариант, изомер или функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO.: 65 или 66, но с мутацией в положении 434. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления данного изобретения.

[000205] Аминокислотная последовательность мутантного константного домена, указанная в SEQ ID NO.: 65 или 66, кодируется соответствующей ей мутантной нуклеотидной последовательностью.

[000206] В одном аспекте данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению обеспечивает период полужизни, варьирующийся от около 10 суток до около 35 суток. В одном варианте осуществления данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению обеспечивает период полужизни, составляющий около 10, 12, 15, 17, 19, 20, 23, 26, 28, 30, 33 или 35 суток. В конкретном варианте осуществления данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению обеспечивает период полужизни, составляющий больше чем 30 суток.

[000207] В одном аспекте данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению поддерживает терапевтический уровень в сыворотке крови на протяжении периода времени, варьирующегося от около 1 месяца до около 7 месяцев. В одном варианте осуществления данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению поддерживает терапевтический уровень в сыворотке крови на протяжении около 7, 14, 28, 56, 84, 112, 140, 168 или 210 суток. В конкретном варианте осуществления данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению поддерживает терапевтический уровень в сыворотке крови на протяжении больше чем 3 месяцев.

Способы получения молекул антител, представленных в данном изобретении

[000208] Способы получения молекул антител хорошо известны в данной области техники и полностью описаны в патентах США №8394925; №8088376; №8546543; №10336818; и №9803023, и в заявке на патент США №20060067930, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей полноте. Могут применяться любые подходящие способ, процесс или технология, известные специалисту в данной области техники. Молекулу антитела, имеющую вариант области Fc согласно данному изобретению, можно получить в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный вариант области Fc может быть слит с гетерологичный полипептидом по выбору, таким как вариабельный домен антитела или связывающий домен рецептора или лиганда.

[000209] С появлением способов молекулярной биологии и рекомбинантных технологий специалист в данной области техники может получить антитело и антителоподобные молекулы рекомбинантными средствами и, таким образом, генерировать последовательности генов, которые кодируют специфические аминокислотные последовательности, обнаруживаемые в полипептидной структуре антител. Такие антитела можно получать либо путем клонирования последовательностей генов, кодирующих полипептидные цепи указанных антител, либо путем прямого синтеза указанных полипептидных цепей со сборкой синтезированных цепей с образованием активных тетрамерных (H2L2) структур, обладающих аффинностью к специфическим эпитопам и антигенным детерминантам. Это позволило получить готовые антитела, имеющие последовательности, характерные для нейтрализующих антител из разных видов и источников.

[000210] Независимо от источника антител или способов их рекомбинантного получения, или способов их синтеза, in vitro или in vivo, с использованием трансгенных животных, больших клеточных культур лабораторного или коммерческого размера, с использованием трансгенных растений или путем прямого химического синтеза, в котором не используются живые организмы ни на одной стадии процесса, все антитела имеют сходную общую 3-мерную структуру. Данную структуру часто обозначают как H2L2, что относится к тому факту, что антитела обычно содержат две легкие (L) аминокислотные цепи и 2 тяжелые (Н) аминокислотные цепи. Обе цепи имеют участки, способные взаимодействовать со структурно комплементарной антигенной мишенью. Области, взаимодействующие с указанной мишенью, называются «вариабельными» областями, или «V»-областями, и характеризуются отличиями в аминокислотной последовательности от антител с различной антигенной специфичностью. Вариабельные участки цепи Н и цепи L содержат аминокислотные последовательности, способные специфически связываться с антигенными мишенями.

[000211] При употреблении в контексте данного документа термин «антигенсвязывающая область» относится к той части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с антигеном и придают антителу его специфичность и аффинность к данному антигену. Антигенсвязывающая область антитела включает в себя «каркасные» аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков. Внутри вариабельных областей цепей Н и L, которые обеспечивают антигенсвязывающие области, находятся последовательности меньшего размера, получившие название «гипервариабельных» вследствие их крайней вариабельности между антителами различной специфичности. Такие гипервариабельные области также упоминаются как «области, определяющие комплементарность», или области «CDR». С областями CDR связана основная специфичность антитела к конкретной антигенной детерминантной структуре.

[000212] CDR представляют собой несмежные участки аминокислот в вариабельных областях, но, независимо от вида, было обнаружено, что позиционные местоположения этих критических аминокислотных последовательностей в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей имеют сходные местоположения в аминокислотных последовательностях вариабельных цепей. Вариабельные тяжелые и легкие цепи всех антител имеют по три области CDR, каждая из которых не смежна с другими. У всех видов млекопитающих пептиды антител содержат константные (т.е. высококонсервативные) и вариабельные области, и внутри последних содержатся CDR и так называемые «каркасные области», состоящие из аминокислотных последовательностей внутри вариабельной области тяжелой или легкой цепей, но за пределами CDR.

[000213] В данном изобретении дополнительно представлен вектор, включающий в себя по меньшей мере одну из нуклеиновых кислот, описанных выше. Поскольку генетический код является вырожденным, для кодирования конкретной аминокислоты может использоваться больше чем один кодон. Используя генетический код, можно идентифицировать одну или большее число различных нуклеотидных последовательностей, каждая из которых была бы способна кодировать данную аминокислоту. Вероятность того, что конкретный олигонуклеотид фактически будет составлять действительную кодирующую последовательность, можно оценить путем рассмотрения аномальных отношений спаривания оснований и частоты, с которой конкретный кодон действительно используется (для кодирования конкретной аминокислоты) в эукариотических или прокариотических клетках, экспрессирующих антитело или его часть. Такие «правила использования кодонов» описаны в работе Lathe, et al., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Применяя «правила использования кодонов» согласно Lathe, можно идентифицировать единственную нуклеотидную последовательность или набор нуклеотидных последовательностей, которые содержат теоретическую «наиболее вероятную» нуклеотидную последовательность, способную кодировать последовательности собачьих IgG. Также предполагается, что области, кодирующие антитела для применения в данном изобретении, также можно получить путем изменения существующих генов антител с использованием стандартных методик молекулярной биологии, которые приводят к вариантам антител и пептидов, описанных в данном документе. Такие варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, делеции, добавления и замещения в аминокислотной последовательности антител или пептидов.

[000214] Например, одним из классов замещений являются консервативные аминокислотные замещения. Такие замещения представляют собой замещения, которые заменяют данную аминокислоту в пептиде собачьего антитела другой аминокислотой со сходными характеристиками. Как правило, консервативными замещениями считаются замещения одна на другую между алифатическими аминокислотами Ala, Val, Leu и Ile; замещение гидроксильных остатков Ser и Thr, замещение кислотных остатков Asp и Glu, замещение между амидными остатками Asn и Gln, замещение основных остатков Lys и Arg, замещения между ароматическими остатками Phe, Tyr, и тому подобное. Указания относительно того, какие изменения аминокислот, вероятно, будут фенотипически незаметными, содержатся в работе Bowie et al., 247 Science 1306-10 (1990).

[000215] Варианты собачьих антител и пептидов могут быть полностью функциональными или у них может отсутствовать одна или большее число из функций. Полностью функциональные варианты, как правило, содержат только консервативные вариации или вариации в некритических остатках, или в некритических областях. Функциональные варианты могут также содержать замещение аналогичных аминокислот, что не приводит к изменению или приводит к незначительному изменению функции. В качестве альтернативы, такие замены могут в некоторой степени положительно или отрицательно влиять на функцию. Нефункциональные варианты, как правило, содержат одну или большее число неконсервативных аминокислотных замещений, делеций, вставок, инверсий или усечений, или замещение, вставку, инверсию или делецию в критическом остатке или в критической области.

[000216] Аминокислоты, которые критически необходимы для функционирования, можно идентифицированы способами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез Cunningham et al., 244 Science 1081-85 (1989). Последняя процедура вводит единичные мутации аланина в каждом остатке в молекуле. Полученные мутантные молекулы затем тестируют на биологическую активность, такую как связывание с эпитопом или активность АЗКЦ in vitro. Сайты, которые являются критическими для связывания лиганда с рецептором, также можно определить с помощью структурного анализа, такого как кристаллография, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинное мечение Smith et al, 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos et al., 255 Science 306-12 (1992).

[000217] Более того, полипептиды часто содержат аминокислоты, отличные от двадцати «встречающихся в природе» аминокислот.Кроме того, многие аминокислоты, включительно с концевыми аминокислотами, могут быть модифицированы либо естественными процессами, такими как процессинг или другие посттрансляционные модификации, либо методиками химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники. Известные модификации включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование гликозилфосфатидилинозитолового (ГФИ, англ. «GPI») якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, добавление аминокислот, опосредованное транспортной РНК, к белкам, например, аргинилирование, и убиквитинирование. Такие модификации хорошо известны специалистам в данной области техники и были очень подробно описаны в научной литературе. Несколько особенно распространенных модификаций, например, гликозилирование, присоединение липида, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АДФ-рибозилирование, описаны в большинстве фундаментальных работ, таких как «Proteins - Structure and Molecular Properties» (2^nd ed., Т.E. Creighton, W.H. Freeman & Co., N.Y., 1993). На данную тему доступно множество подробных обзоров, например, работы Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, N.Y., 1983); Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); и Rattan et al. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).

[000218] В другом аспекте данного изобретения представлены производные антител. «Производное» антитела содержит дополнительные химические фрагменты, которые обычно не входят в состав белка. Ковалентные модификации белка включены в объем данного изобретения. Такие модификации могут быть введены в молекулу путем приведения целевых аминокислотных остатков данного антитела в реакцию с органическим дериватизирующим агентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Например, дериватизация бифункциональными агентами, хорошо известными в данной области техники, пригодна для сшивания антитела или фрагмента с нерастворимой в воде несущей матрицей или с другими макромолекулярными носителями.

[000219] Производные также включают в себя радиоактивно меченные моноклональные антитела. Например, меченные радиоактивным йодом (251,1311), углеродом (4С), серой (35S), индием, тритием (Н³) или подобным; конъюгаты моноклональных антител с биотином или авидином, с ферментами, такими как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-D-галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкоамилаза, ангидраза карбоновой кислоты, ацетилхолинэстераза, лизоцим, малатдегидрогеназа или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; а также конъюгаты моноклональных антител с биолюминесцентными агентами (такими как люцифераза), хемолюминесцентными агентами (такими как сложные эфиры акридина) или флуоресцентными агентами (такими как фикобилипротеины).

[000220] Другое производное бифункционального антитела согласно данному изобретению представляет собой биспецифическое антитело, полученное путем объединения частей двух отдельных антител, которые распознают две разные антигенные группы. Этого можно достичь с помощью методик перекрестного сшивания или рекомбинации. В качестве дополнения, фрагменты могут быть добавлены к антителу или его части для увеличения периода полужизни in vivo (например, путем увеличения времени выведения из кровотока). Такие методики включают в себя, например, добавление фрагментов ПЭГ (также называемое «пэгилированием»), и хорошо известны в данной области техники. См. публикацию заявки на патент США №20030031671.

[000221] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие указанное антитело, вводят непосредственно в клетку-хозяина, и указанную клетку инкубируют в условиях, достаточных для индуцирования экспрессии указанного кодируемого антитела. После того, как указанные нуклеиновые кислоты ввели в клетку, указанную клетку обычно инкубируют, как правило - при температуре 37°С, иногда с отбором, в течение периода времени, составляющего около 1-24 часов, чтобы обеспечить экспрессию указанного антитела. В одном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело секретируется в надосадочную жидкость среды, в которой растет указанная клетка. Традиционно моноклональные антитела получали в виде нативных молекул в мышиных гибридомных линиях. В дополнение к указанной технологии данное изобретение обеспечивает экспрессию антител по рекомбинантной ДНК. Это позволяет получать антитела, а также спектр производных антител и слитых белков у выбранного вида организма-хозяина.

[000222] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одно антитело, часть или полипептид согласно данному изобретению, может быть рекомбинирована с векторной ДНК в соответствии с традиционными методиками, включительно с тупыми или липкими концами для лигирования, расщеплением рестрикционным ферментом для получения подходящих концов, заполнением когезионных концов по мере необходимости, обработкой щелочной фосфатазой для избегания нежелательного соединения и лигированием соответствующими лигазами. Методики таких манипуляций, описанные, например, в работах Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989); и Ausubel et al. 1993, как указано выше, можно применять для конструирования последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют молекулу антитела или ее антигенсвязывающую область.

[000223] Молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, считается «способной экспрессировать» полипептид, если она содержит нуклеотидные последовательности, которые содержат информацию о регулировании транскрипции и трансляции, и такие последовательности «функционально связаны» с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют указанный полипептид. Функциональная связь представляет собой связь, при которой регуляторные последовательности ДНК и последовательность ДНК, которую требуется экспрессировать, соединены таким образом, чтобы обеспечить экспрессию генов в виде пептидов или частей антител в извлекаемых количествах. Точная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии генов, может варьировать от организма к организму, как хорошо известно в аналогичной области техники. См., например, работы Sambrook et al., 2001, как указано выше; Ausubel et al., 1993, как указано выше.

[000224] Соответственно, данное изобретение охватывает собой экспрессию антитела или пептида либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках. Подходящие организмы-хозяева включают в себя бактериальные или эукариотические организмы-хозяева, включительно с клетками бактерий, дрожжей, насекомых, грибов, птиц и млекопитающих либо in vivo, либо in situ, или клетки-хозяева, происходящие от млекопитающих, насекомых, птиц или дрожжей. Указанная клетка или ткань млекопитающего может происходить от человека, примата, хомяка, кролика, грызуна, коровы, свиньи, овцы, лошади, козы, собаки или кошки. Также можно использовать любую другую подходящую клетку млекопитающего, известную в данной области техники.

[000225] В одном варианте осуществления данного изобретения нуклеотидная последовательность согласно данному изобретению будет включена в плазмиду или вирусный вектор, способные к автономной репликации в реципиенте-хозяине. Для этой цели можно применять любой из широкого спектра векторов. См., например, работу Ausubel etal., 1993, как указано выше. Факторы, имеющие значение при выборе конкретной плазмиды или вирусного вектора, включают в себя: легкость, с которой клетки-реципиенты, содержащие данный вектор, могут быть распознаны и отобраны из тех клеток-реципиентов, которые не содержат данный вектор; число копий данного вектора, которые желательны у конкретного организма-хозяина; и желательна ли возможность «перемещать» вектор между клетками-хозяевами разных видов.

[000226] Примеры прокариотических векторов, известных в данной области техники, включают в себя плазмиды, например те, которые способны к репликации в Е. coli (такие как, например, pBR322, CoIE1, pSC101, pACYC 184, .pi.vX). Такие плазмиды описаны, например, в работах Maniatis et al., 1989, как указано выше; Ausubel et al, 1993, как указано выше. Плазмиды Bacillus включают в себя рС194, рС221, рТ127 и т.д. Такие плазмиды описаны в работе Gryczan, THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982). Подходящие плазмиды Streptomyces включают в себяр p1J101 (Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987), и бактериофаги Streptomyces, такие как phLC31 (Chater et al., SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986). Обзор плазмид Pseudomonas см. в работах John et al., 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); lzaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); и в работе Ausubel et al., 1993, как указано выше.

[000227] В качестве альтернативы, элементы экспрессии генов, пригодные для экспрессии кДНК, кодирующих антитела или пептиды, включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: (а) промоторы вирусной транскрипции и их энхансерные элементы, такие как ранний промотор SV40 (Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983), LTR вируса саркомы Рауса (Gorman et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982), и LTR вируса мышиного лейкоза Молони (Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985); (b) области сплайсинга и сайты полиаденилирования, такие как те, которые получены из поздней области SV40 (Okayarea et al., 1983), и (с) сайты полиаденилирования, такие как в SV40 (Okayama et al., 1983).

[000228] Иммуноглобулиновые гены кДНК можно экспрессировать так, как описано в работе Weidle et al., 51 Gene 21 (1987), используя в качестве элементов экспрессии ранний промотор SV40 и его энхансер, энхансеры промотора цепи Н иммуноглобулина мыши, сплайсинг мРНК поздней области SV40, промежуточную последовательность S-глобина кролика, сайты полиаденилирования иммуноглобулина и S-глобина кролика, и элементы полиаденилирования SV40. Для генов иммуноглобулинов, состоящих частично из кДНК, частично из геномной ДНК (Whittle et al., 1 Protein Engin. 499 (1987)), промотор транскрипции может представлять собой цитомегаловирус человека, энхансеры транскрипции могут представлять собой цитомегаловирус и иммуноглобулин мыши / человека, а области сплайсинга мРНК и полиаденилирования могут представлять собой нативные хромосомные последовательности иммуноглобулина.

[000229] В одном варианте осуществления данного изобретения для экспрессии генов кДНК в клетках грызунов промотор транскрипции представляет собой последовательность LTR вируса, энхансеры промотора транскрипции представляют собой один или оба из энхансера тяжелой цепи иммуноглобулина мыши и энхансера LTR вируса, область сплайсинга содержит интрон размером больше чем 31 п.о., и области полиаденилирования и терминации транскрипции получены из нативной хромосомной последовательности, соответствующей синтезируемой цепи иммуноглобулина. В других вариантах осуществления данного изобретения последовательности кДНК, кодирующие другие белки, объединяют с перечисленными выше элементами экспрессии для достижения экспрессии указанных белков в клетках млекопитающих.

[000230] Каждый слитый ген может быть собран в экспрессионный вектор или вставлен в него. Клетки-реципиенты, способные экспрессировать продукт гена цепи иммуноглобулина, затем трансфицируют отдельно пептидом или геном, кодирующим цепь Н или L, или совместно трансфицируют геном цепей Н и L. Трансфицированные клетки-реципиенты культивируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию встроенных генов, и из указанной культуры извлекают экспрессированные цепи иммуноглобулина или интактные антитела, или их фрагменты.

[000231] В одном варианте осуществления данного изобретения слитые гены, кодирующие пептид или цепи Н и L, или их части, собираются в отдельные векторы экспрессии, которые затем используются для совместной трансфекции клетки-реципиента. В качестве альтернативы, слитые гены, кодирующие цепи Н и L, могут быть собраны на одном и том же векторе экспрессии. Для трансфекции векторов экспрессии и получения антитела указанная линия клеток-реципиентов может представлять собой клетки миеломы. Клетки миеломы могут синтезировать, собирать и секретировать иммуноглобулины, кодируемые генами трансфицированного иммуноглобулина, и обладают механизмом для гликозилирования указанного иммуноглобулина. Клетки миеломы можно выращивать в культуре или в брюшной полости мыши, при этом секретируемый иммуноглобулин можно получить из асцитной жидкости. Другие подходящие клетки-реципиенты включают в себя лимфоидные клетки, такие как В-лимфоциты собачьего или несобачьего происхождения, гибридомные клетки собачьего или несобачьего происхождения, или межвидовые гетерогибридомные клетки.

[000232] Вектор экспрессии, несущий конструкцию антитела или полипептид согласно данному изобретению, можно ввести в соответствующую клетку-хозяина любым из множества подходящих способов, включительно с такими биохимическими способами, как трансформация, трансфекция, конъюгация, слияние протопластов, осаждение с фосфатом кальция и нанесение поликатионов, таких как диэтиламиноэтил (ДЭАЭ, англ. «DEAE») декстран, и такими механическими способами, как электропорация, прямая микроинъекция и бомбардировка микрочастицами Johnston et al., 240 Science 1538 (1988).

[000233] Дрожжи могут обеспечить существенные преимущества перед бактериями в производстве цепей Н и L иммуноглобулина. Дрожжи осуществляют посттрансляционные пептидные модификации, включая гликозилирование. В настоящее время существует ряд стратегий рекомбинантной ДНК, которые используют сильные промоторные последовательности и плазмиды с большим числом копий, которые можно применять для получения желаемых белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидирующие последовательности продуктов клонированных генов млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидирующие последовательности (т.е. пре-пептиды) Hitzman et al., 11^th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982).

[000234] Дрожжевые системы экспрессии генов можно регулярно оценивать на предмет уровней продукции, секреции и стабильности пептидов, антител, их фрагментов и областей. Можно применять любую из ряда дрожжевых систем экспрессии генов, содержащих промоторные и терминационные элементы из активно экспрессируемых генов, кодирующих гликолитические ферменты, которые продуцируются в больших количествах при выращивании дрожжей в средах, богатых глюкозой. Известные гликолитические гены также могут обеспечить очень эффективные сигналы управления транскрипцией. Например, можно применять промоторные и терминационные сигналы гена фосфоглицераткиназы (ФГК, англ. «PGK»). Для оценки оптимальных экспрессионных плазмид для экспрессии клонированных кДНК иммуноглобулина в дрожжах можно применять ряд подходов. См. Vol. II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985.

[000235] Бактериальные штаммы также можно применять в качестве организмов-хозяев для получения молекул антител или пептидов, описанных в данном изобретении. В связи с указанными бактериальными хозяевами используют плазмидные векторы, содержащие репликон и контрольные последовательности, которые получены из видов, совместимых с клеткой-хозяином. Указанный вектор несет сайт репликации, а также специфические гены, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Можно применять ряд подходов для оценки экспрессии плазмид для получения антител, их фрагментов и областей, или цепей антител, кодируемых клонированными кДНК иммуноглобулина в бактериях (см. Работы Glover, 1985, как указано выше; Ausubel, 1993 как указано выше; Sambrook, 2001, как указано выше; Colligan et al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1994-2001); Colligan et al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1997-2001).

[000236] Клетки-хозяева, происходящие из млекопитающих, можно выращивать in vitro или in vivo. Клетки млекопитающих обеспечивают посттрансляционные модификации молекул белка иммуноглобулина, включительно с удалением лидирующего пептида, фолдинг и сборку цепей Н и L, гликозилирование молекул антител и секрецию функционального белка антитела. Клетки млекопитающих, которые могут быть полезны в качестве организмов-хозяев для продуцирования белков антител, в дополнение к клеткам лимфоидного происхождения, описанным выше, включают в себя клетки фибробластного происхождения, такие как клетки Vero (АТСС CRL 81) или клетки СНО-K1 (АТСС CRL 61). Доступно множество векторных систем для экспрессии клонированных пептидов из генов цепей Н и L в клетках млекопитающих (см. работу Glover, 1985, как указано выше). Для получения полных антител H2L2 можно применять различные подходы. Возможна совместная экспрессия цепей Н и L в одних и тех же клетках для достижения внутриклеточной ассоциации и сцепления цепей H и L в полные тетрамерные антитела H2L2 и (или) пептиды. Указанная совместная экспрессия может происходить при использовании либо одних и тех же, либо разных плазмид в одном и том же хозяине. Гены для обеих цепей и (или) пептидов Н и L можно поместить в одну и ту же плазмиду, которую затем трансфицируют в клетки, а затем отбирать непосредственно клетки, экспрессирующие обе указанные цепи. В качестве альтернативы, клетки можно сначала трансфицировать плазмидой, кодирующей одну цепь, например, цепь L, с последующей трансфекцией полученной клеточной линии плазмидой с цепью Н, содержащей второй маркер отбора. Клеточные линии, продуцирующие пептиды и (или) молекулы H2L2 любым из путей, можно трансфицировать плазмидами, кодирующими дополнительные копии пептидов цепей Н, L или Н плюс L, в сочетании с дополнительными маркерами отбора для получения клеточных линий с улучшенными свойствами, такими как более высокая продукция собранных молекул антител H2L2 или повышенная стабильность трансфицированных клеточных линий.

[000237] Для долгосрочного получения рекомбинантных антител с высоким выходом можно применять стабильную экспрессию. Например, можно сконструировать клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Вместо использования векторов экспрессии, которые содержат вирусные источники репликации, клетки-хозяева можно трансформировать кассетами экспрессии иммуноглобулина и маркера отбора. После введения чужеродной ДНК сконструированные клетки можно выращивать в течение 1-2 суток в обогащенной питательной среде, а затем перевести на селективную среду. Маркер отбора в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосому и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножать в клеточные линии. Такие сконструированные клеточные линии могут быть особенно полезны при скрининге и оценке соединений / компонентов, которые прямо или косвенно взаимодействуют с данной молекулой антитела.

[000238] Как только антитело согласно данному изобретению получено, его можно очистить любым способом очистки молекулы иммуноглобулина, известным в данной области техники, например, хроматографией (например, ионообменной, аффинной, в частности с аффинностью к специфическому антигену после белка А, и хроматографией на колонке с отсечением по размеру), центрифугированием, способом дифференциальной растворимости или любой другой стандартной методикой очистки белков. Во многих вариантах осуществления данного изобретения антитела секретируются из клетки в культуральную среду и собираются из указанной культуральной среды.

[000239] В другом аспекте данного изобретения представлено антитело, содержащее: константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434. В одном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение аспарагина в положении 434 гистидином (N434H).

[000240] Антитело, имеющее указанное замещение, может представлять собой любое подходящее антитело, известное специалисту в данной области техники. В одном примере указанное антитело представляет собой антитело против ИЛ-31. В другом примере указанное антитело представляет собой антитело против ФРН. В другом примере указанное антитело представляет собой антитело против ТФР-β.

[000241] Антитело против ИЛ-31 без описанного в данном документе замещения хорошо известно в данной области техники и полностью описано, например, в патентах США №10526405; №10421807; №9206253; и №8790651. Антитело против ФРН без описанного в данном документе замещения также хорошо известно в данной области техники и полностью описано, например, в патентах США №10125192; №10093725; №9951128; №9617334; и №9505829. Кроме того, антитело против ТФР-β без описанного в данном документе замещения также хорошо известно в данной области техники и полностью описано, например, в заявках на патент США №63/036092 и 63/248679, и в международной патентной РСТ-заявке PCT/US 2021/036347.

[000242] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению (т.е. антитело, имеющее замещение) снижает, ингибирует или нейтрализует ИЛ-31-опосредованные состояние зуда или аллергическое состояние. В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению снижает, ингибирует или нейтрализует активность ИЛ-31 у собаки.

[000243] В одном примере антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению связывается с ИЛ-31 в области примерно между 95 и 125 аминокислотными остатками аминокислотной последовательности ИЛ-31 собаки согласно SEQ ID NO: 44, предпочтительно в области примерно между аминокислотными остатками 102 и 122 последовательности ИЛ-31 собаки согласно SEQ ID NO: 44.

[000244] Последовательности VL, VH и CDR антител против ИЛ-31 хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, в патентах США№10526405; №10421807; №9206253; и №8790651. В одном примере антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну из следующих комбинаций последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR): (1) 11Е12: вариабельную тяжелую (VH)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 13, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 15, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 17, вариабельную легкую (VL)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 19, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 21 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 23; или (2) 34D03: VH-CDR1 согласно SEQ ID NO: 14, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 16, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 18, VL-CDR1 согласно SEQ ID NO: 20, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 22 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну CDR, описанную в данном документе.

[000245] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 25 (MU-11E12-VL), SEQ ID NO: 26 (CAN-11Е12-VL-cUn-FW2), SEQ ID NO; 27 (CAN-11E12-VL-cUn-13), SEQ ID NO: 28 (MU-34D03-VL) или SEQ ID NO: 29 (CAN-34D03-VL-998-1).

[000246] В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 (MU-11E12-VH), SEQ ID NO: 31 (CAN-11E12-VH-415-1), SEQ ID NO: 32 (MU-34D03-VH) или SEQ ID NO: 33 (CAN-34D03-VH-568-1).

[000247] В одном варианте осуществления данного изобретения мутантное антитело против ФРН согласно данному изобретению (т.е. антитело, имеющее замещение) снижает, ингибирует или нейтрализует активность ФРН у животного и (или) усиливает способность ингибировать связывание ФРН с Trk А и р75 для лечения ФРН-опосредованных боли или состояния.

[000248] Последовательности VL, VH и CDR антител против ФРН также хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, в патентах США №10125192; №10093725; №9951128; №9617334; и №9505829. В одном примере антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну из следующих последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR): ZTS-841: вариабельную тяжелую (VH)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 57, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 58, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 59, вариабельную легкую (VL)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 62, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 63 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения VL-CDR2 содержит остатки согласно SEQ ID NO: 63.

[000249] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 61 (CAN-ZTS-841-VL).

[000250] В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 56 (CAN-ZTS-841-VH).

[000251] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению (т.е. антитело, имеющее замещение) снижает, ингибирует или нейтрализует ТФР-β-опосредованное заболевание или патологическое состояние, например, хроническую болезнь почек. В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению снижает, ингибирует или нейтрализует активность ТФР-β у собаки. Антитело против ТФР-β согласно данному изобретению может связываться с ТФР-β1,2,3 или с их комбинацией. Например, в одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению связывается с ТФР-β1. В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению связывается с ТФР-β2. В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению связывается с ТФР-β3. В еще одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению связывается с ТФР-β1, ТФР-β2, ТФР-β3 или с их комбинацией.

[000252] Последовательности VL, VH и CDR антител против ТФР-β хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, в заявках на патент США №63/036092 и №63/248679, и в международной патентной РСТ-заявке PCT/US2021/036347. В одном примере антитело против ТФР-β согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну из следующих комбинаций последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR): (1) ZTS-426: вариабельную тяжелую (VH)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 71, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 72, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 73, вариабельную легкую (VL)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 74, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 75 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 76; или (2) ZTS-501: VH-CDR1 согласно SEQ ID NO: 81, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 82, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 83, VL-CDR1 согласно SEQ ID NO: 84, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 85 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 86; или (3) ZTS-4155: VH-CDR1 согласно SEQ ID NO: 91, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 92, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 93, VL-CDR1 согласно SEQ ID NO: 94, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 95 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 96; или (4) ZTS-122: VH-CDR1 согласно SEQ ID NO: 101, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 102, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 103, VL-CDR1 согласно SEQ ID NO: 104, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 105 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 106; или (5) ZTS-207: VH-CDR1 согласно SEQ ID NO: 111, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 112, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 113, VL-CDR1 согласно SEQ ID NO: 114, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 115 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 116.

[000253] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну CDR, описанную в данном документе.

[000254] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 77 (ZTS-426), SEQ ID NO: 87 (ZTS-501), SEQ ID NO: 97 (ZTS-4155), SEQ ID NO: 107 (ZTS-122) или SEQ ID NO: 117 (ZTS-207).

[000255] В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ТФР-β согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 79 (ZTS-426), SEQ ID NO: 89 (ZTS-501), SEQ ID NO: 99 (ZTS-4155), SEQ ID NO: 109 (ZTS-122) или SEQ ID NO: 119 (ZTS-207).

Фармацевтическое и ветеринарное применение

[000256] В данном изобретении также представлена фармацевтическая композиция, содержащая молекулы согласно данному изобретению и один или большее число фармацевтически приемлемых носителей. Более конкретно, в данном изобретении представлена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, в качестве активного ингредиента, антитело или пептид согласно данному изобретению.

[000257] «Фармацевтически приемлемые носители» включают в себя любой эксципиент, который не токсичен для клетки или животного, подвергающегося его воздействию, в применяемых дозах и концентрациях. Фармацевтическая композиция может включать в себя один или большее число дополнительных терапевтических агентов.

[000258] «Фармацевтически приемлемое(-ый, -ая, -ые)» относится к тем соединениям, материалам, композициям и (или) дозированным формам, которые с медицинской точки зрения подходят для контакта с тканями животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем, или осложнений, в соответствии с разумным соотношением польза/риск.

[000259] Фармацевтически приемлемые носители включают в себя растворители, дисперсионные среды, буферы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, смачивающие агенты, консерванты, буферы, хелатирующие агенты, антиоксид анты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию.

[000260] Фармацевтически приемлемые носители включают в себя воду; физиологический раствор; фосфатно-солевой раствор; декстрозу; глицерол; спирты, такие как этанол и изопропанол; фосфат, цитрат и другие органические кислоты; аскорбиновую кислоту; полипептиды с низкой молекулярной массой (меньше чем около 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включительно с глюкозой, маннозой или декстринами; ЭДТА; противоионы, образующие соли, такие как натрий; и (или) неионные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полоксамеры; изотонические агенты, такие как сахара, полиспирты, такие как маннит и сорбит, и хлорид натрия; а также их комбинации.

[000261] Фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть приготовлены в различных формах, включительно с, например, жидкими, полутвердыми или твердыми лекарственными формами, такими как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, липосомы, суппозитории, таблетки, пилюли или порошки. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанные композиции составлены в форме растворов для инъекций или инфузий. Указанная композиция может быть в форме, подходящей для внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, подкожного, парентерального, трансмукозального, перорального, местного или трансдермального введения. Указанную композицию можно составить в форме фармацевтической композиции немедленного, контролируемого, пролонгированного или замедленного высвобождения.

[000262] Композиции согласно данному изобретению можно вводить либо в качестве отдельных терапевтических агентов, либо в комбинации с другими терапевтическими агентами. Их можно вводить отдельно, но обычно их вводят с фармацевтическим носителем, выбранным на основе выбранного способа введения и стандартной фармацевтической практики. Введение антител, описанных в данном документе, можно осуществлять любым подходящим способом, включительно с парентеральной инъекцией (такой как внутрибрюшинная, подкожная или внутримышечная инъекция), пероральным путем или путем местного введения антител (обычно содержащихся в фармацевтической композиции) на поверхность дыхательных путей. Местное введение на поверхность дыхательных путей можно осуществлять путем интраназального введения (например, с помощью капельницы, тампона или ингалятора). Местное введение антител на поверхность дыхательных путей также можно осуществлять путем ингаляционного введения, например, путем создания пригодных для вдыхания частиц фармацевтического состава (включительно как с твердыми, так и с жидкими частицами), содержащих антитела в виде аэрозольной суспензии, и затем вызывая вдыхание субъектом указанных пригодных для вдыхания частиц. Способы и устройство для введения пригодных для вдыхания частиц фармацевтических составов хорошо известны, и можно применять любую традиционную методику.

[000263] В некоторых желательных вариантах осуществления данного изобретения указанные антитела вводят посредством парентеральной инъекции. Для парентерального введения антитела или молекулы можно составить в форме раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем для парентерального введения. Например, указанный носитель может представлять собой раствор антитела или его смеси, растворенный в приемлемом носителе, таком как водный носитель, такими носителями являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор трегалозы или сахарозы, или 5% сывороточный альбумин, 0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как фиксированные масла. Указанные растворы стерильны и, как правило, не содержат твердых частиц. Указанные композиции могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными методиками стерилизации. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие рН и буферные агенты, регулирующие токсичность агенты и тому подобное, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и т.д. Концентрация антител в указанных фармацевтических составах может варьировать в широких пределах, например, от меньше чем около 0,5% по массе, обычно на уровне или по меньшей мере около 1% по массе, вплоть до 15% или 20% по массе, и выбирается главным образом на основе объемов жидкости, показателей вязкости и т.д., в соответствии с конкретным выбранным путем введения. Носитель или лиофилизированный порошок могут содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Указанный фармацевтический состав стерилизуют с помощью общепринятых методик. Фактические способы приготовления композиций для парентерального введения известны или очевидны специалистам в данной области техники и описаны более подробно, например, в работе REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15^th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).

[000264] Антитела или молекулы согласно данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что данная методика эффективна при использовании с обычными иммуноглобулинами. Можно использовать любые подходящие методики лиофилизации и восстановления. Специалистам в данной области техники будет понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности антител и что уровни использования, возможно, придется корректировать для компенсации. Композиции, содержащие указанные антитела или их смесь, можно вводить для предотвращения рецидива и (или) для терапевтического лечения существующего заболевания. Подходящие фармацевтические носители описаны в наиболее позднем издании «Фармацевтических наук Ремингтона» («REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES») - стандартной цитируемой работе в данной области техники. При терапевтическом применении композиции вводят субъекту, уже страдающему заболеванием, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, частичной остановки или облегчения указанного заболевания и его осложнений.

[000265] Эффективные дозы композиций согласно данному изобретению для лечения состояний или заболеваний, описанных в данном документе, варьируются в зависимости от множества различных факторов, включительно, например, но не ограничиваясь ими, с фармакодинамическими характеристиками конкретного агента, способом и путем его введения; целевым участком; физиологическим состоянием животного; другими вводимыми лекарственными препаратами; характером лечения - профилактическим или терапевтическим; возрастом, состоянием здоровья и массой тела реципиента; природой и степенью выраженности симптомов, характером сопутствующего лечения, частотой лечения и желаемым эффектом.

[000266] Однократное или многократное введение указанных композиций можно осуществлять с уровнями доз и схемой, выбираемыми лечащим ветеринаром. В любом случае, указанные фармацевтические композиции должны обеспечивать количество антитела (антител) согласно данному изобретению, достаточное для эффективного лечения данного субъекта. В иллюстративном варианте осуществления данного изобретения композицию согласно данному изобретению вводят один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев или один раз в семь месяцев.

[000267] Лечебные дозы можно титровать с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области техники, для оптимизации безопасности и эффективности.

[000268] Фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут содержать «терапевтически эффективное количество». «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному для достижения желаемого терапевтического результата при необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени. Терапевтически эффективное количество молекулы может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и масса тела субъекта, а также способность молекулы вызывать желаемый ответ у данного субъекта. Терапевтически эффективное количество также является таким, при использовании которого терапевтически благоприятные эффекты превосходят любые токсические или пагубные эффекты данной молекулы.

[000269] В другом аспекте данного изобретения композиции согласно данному изобретению можно применять, например, при лечении различных заболеваний и нарушений у собак. При употреблении в контексте данного документа термины «лечить» и «лечение» относятся к терапевтическому лечению, включительно с профилактическими или предупреждающими мерами, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения, связанного с заболеванием или состоянием. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания или состояния, стабилизацию заболевания или состояния (т.е. когда заболевание или состояние не ухудшается), задержку или замедление прогрессирования заболевания или состояния, смягчение или облегчение заболевания, или состояния, и ремиссию (частичную или полную) заболевания или состояния, независимо от того, обнаруживаемые они или нет. К числу тех, кто нуждается в лечении, относятся те, кто уже имеют заболевание или патологическое состояние, а также те, кто склонен к заболеванию или патологическому состоянию, или те, у кого заболевание или патологическое состояние необходимо предотвратить.

[000270] Мутантную молекулу согласно данному изобретению можно применять для лечения любого подходящего заболевания или нарушения. Например, мутантное антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению можно применять для лечения опосредованных ИЛ-31 состояния зуда или аллергического состояния. Примеры опосредованного ИЛ-31 состояния зуда включают в себя, например, но не ограничиваются ими, атопический дерматит, экзему, псориаз, склеродермию и зуд. Примеры опосредованного ИЛ-31 аллергического состояния включают в себя, например, но не ограничиваются ими, аллергический дерматит, летнюю экзему, крапивницу, отеки, воспалительное заболевание дыхательных путей, рецидивирующую обструкцию дыхательных путей, гиперчувствительность дыхательных путей, хроническую обструктивную болезнь легких и воспалительные процессы, возникающие в результате аутоиммунитета.

[000271] Мутантное антитело против ФРН согласно данному изобретению можно применять для лечения опосредованных ФРН боли или состояния. Примеры боли включают в себя, например, следующие, но не ограничиваясь ими: хроническую боль, воспалительную боль, боль после хирургического надреза, нейропатическую боль, боль при переломе, боль при переломе, ассоциированном с остеопорозом, постгерпетическую невралгию, боль при онкологическом заболевании, боль, возникающую в результате ожогов, боль, связанную с ранами, боль, связанную с травмой, нейропатическую боль, боль, связанную с нарушением опорно-двигательного аппарата, ревматоидный артрит, остеоартрит, анкилозирующий спондилит, серонегативные (неревматоидные) артропатии, внесуставной ревматизм, периартикулярное нарушение или периферическую нейропатию. В конкретном варианте осуществления данного изобретения указанная боль представляет собой боль при остеоартрите.

[000272] Мутантное антитело против ТФР-β согласно данному изобретению можно применять для лечения ТФР-β-опосредованного заболевания или патологического состояния. Примеры ТФР-β-опосредованного заболевания или патологического состояния включают в себя, например, но не ограничиваются ей, хроническую болезнь почек.

[000273] Все патенты и литературные ссылки, указанные в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

[000274] Следующие ниже примеры представлены в дополнение к предшествующему описанию и для лучшего понимания изобретения, описанного в данном документе. Указанные примеры не следует рассматривать как ограничение описываемого изобретения. Следует понимать, что примеры и варианты осуществления данного изобретения, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что различные их модификации или изменения будут понятны квалифицированным специалистам в данной области техники и включены в данный документ, и могут осуществляться без отклонения от объема данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Конструирование Fc-мутантных собачьих IgG

[000275] Конструирование всех собачьих IgG (фиг. 1) осуществляли так, как описано в работе Bergeron et al. (Bergeron etal., 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol. 157 (1-2), pages 31-41), при этом использовали плазмиды, содержащие последовательность, кодирующую собачьи константные области для подкласса IgGB (65), и последовательности VH/VL для каждого исследуемого в данном примере мАт вставляли в положении к 5' и в рамке с нуклеотидами, кодирующими указанные константные домены. Мутации производили в положении N434 домена СН3 (фиг. 2) каждой плазмиды с использованием мутагенеза по технологии QuikChange II от Agilent и связанных с ним инструментов Agilent для разработки праймеров для мутагенеза, направленного на один сайт (https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp).

[000276] Конструкции антител кратковременно экспрессировали либо в клетках НЕК 293 с использованием стандартного протокола трансфекции липофектамином (Invitrogen Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США), либо в клетках СНО с использованием протоколов из набора реактивов ExpiCHO transient system (ThermoFisher Scientific). Экспрессия ExpiCHO соответствовала протоколам, изложенным ThermoFisher для совместной трансфекции плазмиды, содержащей последовательность генов, кодирующую легкую цепь IgG и тяжелую цепь IgG. Для экспрессии HEK293 совместно трансфицировали равные по весу количества плазмиды с тяжелой цепью и плазмиды с легкой цепью. Клетки выращивали в течение 7 суток, после чего собирали надосадочные жидкости для очистки от антител. Антитела подвергали скринингу на предмет связывания с сенсорами белка А или белка G с помощью количественного определения в системе Octet QKe (Pall ForteBio Corp, г. Менло-Парк, штат Калифорния, США). Конструкции, которые связывались с белком А, очищали и количественно определяли так, как описано в работе Bergeron et al. для качественной оценки белка.

ПРИМЕР 2

Анализ аффинности и активности связывания с целевой молекулой

[000277] Аффинность каждого мАт оценивали с помощью анализа по технологии Biacore и определяли IC₅₀ с помощью подходящего клеточного анализа активности. Проводили поверхностный плазмонный резонанс на приборе Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) для измерения аффинностей связывания каждого антитела с его целевой молекулой. По 2,5 мкг/мл каждого целевого белка иммобилизовали путем аминного связывания с использованием реактива EDC/NHS для получения конечной плотности, составляющей ~250 ЕР (единиц резонанса, англ. «RU») в проточных ячейках 2-4 сенсорного чипа СМ5, соответственно.

[000278] Проточную ячейку 1 использовали в качестве внутреннего референса для поправки на воздействие рабочего буфера. Связывание антител измеряли при температуре 15°С с продолжительностью контакта 250 с и скоростью потока 30 мкл/мин. Период диссоциации составлял 300 с. Восстановление проводили с использованием восстановительных буферов (10 мМ глицина, рН 1,5, и 10 мМ NaOH) и скоростью потока 20 мкл/мин в течение 60 с каждый. Рабочий буфер / разбавитель (IX HBS-EP, GE Healthcare, BR-1006-69, 10Х, содержащий 100 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 30 мМ ЭДТА и 0,5% об./об. сурфактанта Р20, рН 7,4, 1:10 в отфильтрованной MQ H₂O) использовали в качестве отрицательного контроля при том же формате анализа.

[000279] Данные анализировали с помощью программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation с использованием способа двойного референса. Полученные в результате кривые встраивали в модель связывания 1:1. Не было выявлено различий в аффинностях связывания или в IC₅₀ между IgG ДТ и мутантными IgG N434H (таблица 1).

ПРИМЕР 3

Анализ связывания FcRn in vitro

[000280] Выделяли и подготавливали собачий FcRn, и анализировали Fc-мутанты IgG по сравнению с собачьим FcRn в соответствии с работой Bergeron et.al, как обсуждалось выше. Применяли стандартный способ ПЦР для амплификации субъединицы α собачьего FcRn и β-микроглобулина с использованием вырожденных праймеров, разработанных на основании выравнивания последовательностей яванской макаки, человека, мыши и крысы. Праймеры содержали HindIII на 3'-концах и BamH1 на 5'-концах для облегчения субклонирования в векторы pcDNA3.1(+), сконструированные с С-концевой меткой 6х His+ВАР (AGLNDIFEAQKIEWHE). Субъединицу FcRn-α и β-микроглобулин совместно трансфицировали в клетки HEK 293, и комплекс FcRn очищали методом аффинной очистки посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (АХИМ, англ. «IMAC») с использованием С-концевой гистидиновой метки. Показатели KD измеряли с помощью Biacore 3000 или Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) с использованием сенсорного чипа СМ5.

[000281] FcRn иммобилизовали на поверхности сенсора с использованием стандартного способа аминной иммобилизации для достижения желаемой поверхностной плотности. HBS-EP использовали в качестве рабочего буфера для иммобилизации, а 10 мМ MES; 150 мМ NaCl; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 6 и р Н7,2, и ФСБ; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 7,4 использовали в качестве рабочих буферов для анализа и титрования. Fc-мутантные IgG пропускали над поверхностью рецепторов и определяли аффинность с помощью программного обеспечения Scrubber2 (BioLogic Software Pty, Ltd., Кэмпбелл, Австралия) или программного обеспечения Т200 Evaluation (таблица 2). Значения от пустых контрольных ячеек, содержащих только буфер, вычитали из значений для всех остальных ячеек. Проточные ячейки восстанавливали с использованием 50 мМ Трис рН 8. Прогоны проводили при температуре 15°С.

[000282] Мутации, произведенные в положении 434 для мАт 1, 2 и 3, оказали заметное влияние на аффинность указанных IgG к FcRn при рН 6. Мутация N434H привела к значительному повышению аффинности к FcRn при рН 6, сохраняя при этом слабую аффинность при рН 7,2 для всех трех мАт.Обширный мутагенез в положении 434 показывает, что несколько других мутаций повышают аффинность к FcRn при рН 6. Данное исследование показывает, что повышение аффинности IgG к FcRn не зависит от доменов VHVL и является универсальным для любого собачьего IgGB (65).

Таблица 2. Связывание IgG дикого типа (ДТ) и мутантного IgG N434 с собачьим FcRn, измеренное посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore):

ПРИМЕР 4

Исследования фармакокинетики Fc-мутантных IgG у собак

[000283] Цель данного исследования заключалась в определении фармакокинетики у собак 2 моноклональных антител IgG (мАт1 и мАт2), полученных против двух конкретных и разных целевых молекул, с мутантным Fc N434H, встроенным в каждый IgG.

[000284] Для исследования мАт1 ДТ и мутантных IgG N434H группам из 4 самцов собак породы бигль вводили однократную дозу в 2 мг/кг внутривенно. Для исследования мАт2 ДТ и мутантных IgG группам из 4 самцов и 4 самок собак породы бигль вводили по три дозы по 2 мг/кг одного из IgG с интервалом в 28 суток. Первые две дозы вводили подкожно, а последнюю дозу вводили внутривенно. «Свободные» IgG в сыворотке крови собак анализировали с использованием валидированных анализов связывания лигандов, специфичных для каждого IgG, автоматизированных на платформе Gyrolab хР™ (фиг. 3-6). Фармакокинетические расчеты проводили с использованием некомпартментарного подхода (правило линейной трапеции для расчетов AUC) с помощью Watson™ (таблица 3). Для мАт2 IgG периоды полужизни оценивали для первой и второй доз с использованием моментов времени с 7-х по 28-е сутки после введения доз. Периоды полужизни для последней дозы оценивали с использованием моментов времени с 7-х по 42-е сутки после введения дозы. Дополнительные расчеты выполняли с помощью Excel™, включительно с поправкой AUC, учитывающей перекрытие профилей концентрация время после 2-й и 3-й инъекций препарата. Сводные данные о концентрации во времени и фармакокинетические данные с простой статистикой (среднее значение, стандартное отклонение, коэффициент вариации) рассчитывали с использованием Excel™ или Watson™. Никакие другие статистические анализы не проводили.

[000285] Было показано, что точечная мутация N434H в собачьем IgGB (65) увеличивает период полужизни двух различных собачьих IgG у собак породы бигль. Для мАт1 период полужизни увеличился с 9,7 +/- 2,6 суток до 17,1 +/- 5,1 суток, а для мАт2 - с 9,2 +/- 1,7 суток до 19,3 +/- 3,1 суток. Механизм действия заключается в повышении аффинности к собачьему FcRn при рН 6, и это было продемонстрировано на трех собачьих IgG, которые связывают очень разные и конкретные растворимые целевые молекулы. Следовательно, было продемонстрировано, что продление периода полужизни мутациями N434 в IgGB (65) не зависит от доменов VHVL.

ПРИМЕР 5

Анализ связывания FcRn

[000286] Выделяли и подготавливали собачий FcRn, и анализировали Fc-мутанты IgG по сравнению с собачьим FcRn в соответствии с работой Bergeron et. al, как обсуждалось выше. Применяли стандартный способ ПЦР для амплификации субъединицы α собачьего FcRn и β-микроглобулина. Субъединицу FcRn-α и β-микроглобулин совместно трансфицировали в клетки HEK 293, и комплекс FcRn очищали методом аффинной очистки посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (АХИМ, англ. «IMAC») с использованием С-концевой гистидиновой метки. Комплекс FcRn метили биотином с помощью ферментативной реакции биотинилирования BirA. Показатели KD измеряли с помощью Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) или Biacore 8K (Cytiva, г. Мальборо, штат Массачусетс, США) с использованием сенсорного чипа SA.

[000287] FcRn захватывали на поверхности указанного сенсора с использованием модифицированного метода захвата SA. 10 мМ MES; 150 мМ NaCl; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 6 использовали в качестве буфера для захвата, анализа и титрования. 1х HBS-P, 0,5 мг/мл БСА; рН 7,4 также использовали в качестве буфера для анализа и титрования. Fc-мутантные IgG пропускали над поверхностью рецепторов и определяли аффинность с помощью программного обеспечения Т200 Evaluation или программного обеспечения Biacore Insight Evaluation. Значения от пустых контрольных ячеек, содержащих только буфер, вычитали из значений для всех остальных ячеек. Проточные ячейки восстанавливали с использованием 50 мМ Трис рН 8 или рН 9. Прогоны проводили при температуре 15°С.

[000288] Мутации, произведенные в соответствующих положениях, оказали заметное влияние на аффинность указанных IgG к FcRn при рН 6. Связывание IgG дикого типа (ДТ) и мутантных IgG с собачьим FcRn измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore).

[000289] Заметное влияние на аффинность наблюдалось у совершенно разных и структурно различающихся антител, которые связывают разные целевые молекулы (т.е. у антител против ИЛ-31 и против ФРН), а также у разных версий антител, которые связывают одну и ту же целевую молекулу (т.е. у разных версий антител против ИЛ-31 и против ФРН) (таблицы 1-4). Следовательно, повышение аффинности IgG к FcRn не зависит от доменов VHVL или областей CDR. В дополнение к этому, заметное влияние на аффинность наблюдалось у множества подклассов IgG, хотя и присутствовала небольшая вариабельность. В целом, данные результаты показывают, что повышение аффинности IgG к FcRn к не зависит от подкласса собачьих IgG.

ПРИМЕР 6

Исследования фармакокинетики Fc-мутанта IgG у собак

[000290] Цель данного исследования заключалась в определении эффективности дозы ZTS-00008183, составляющей 4,0 мг/кг, на основании эффективности в модели индуцированного зуда у собак, при этом эффективность измеряли путем оценки снижения зуда на протяжении до 210 суток, включительно, после введения исследуемого препарата в сутки 0. При употреблении в контексте данного документа термин «ZTS-00008183» обозначает антитела против ИЛ-31, имеющее мутацию N434H в его константной области. ZTS-00008183 содержит вариабельные области (т.е. VL и VH, включающие в себя CDR) из 34D03, как описано в данном документе.

[000291] ZTS-00008183 или плацебо вводили путем однократной п/к инъекции собакам породы бигль (возраст ~4 года). Виды воздействий обобщены ниже.

[000292] Образцы сыворотки крови отбирали до введения препарата (сутки -7) и в сутки 7, 14, 28, 56, 84, 112, 140, 168 и 210 после введения препарата.

[000293] В частности, собакам породы бигль (n=8, возраст около 4 лет на дату введения дозы) однократно вводили п/к-дозу ZTS-00008183 4 мг/кг в исследовании ИЛ-31-индуцированного зуда. Образцы сыворотки крови отбирали до введения препарата (сутки -7) и в сутки 7, 14, 28, 56, 84, 112, 140, 168 и 210 после введения препарата.

[000294] Тестируемые мАт количественно определяли с использованием анализов связывания лигандов. Антитела против лекарственных препаратов (АПЛП, англ. «ADA») оценивали с помощью соответствующих способов анализа АПЛП.

[000295] Биоаналитические данные были получены от BioAgilytix Labs в виде файлов Excel™. Данные импортировали в Watson™ v. 7.4.1. Токсикокинетические и фармакокинетические параметры (C_max, t_max, AUC, AUC экстрап. и t_1/2) рассчитывали с использованием некомпартментарного подхода с помощью Watson™ v. 7.4.1. Периоды полужизни ZTS-00008183 оценивали для групп В02 с использованием моментов времени с 56-х по 210-е сутки после введения доз. Проводили оценку иммуногенности.

[000296] Концентрации ZTS-00008183 в сыворотке крови перечислены в таблице 6.

[000297] Средние значения фармакокинетических параметров ZTS-00008183 представлены в таблице 7 ниже.

[000298] Иммуногенности, вызванной лечением, обнаружено не было.

[000299] Профили ZTS-00008183 в сыворотке крови проиллюстрированы на фиг. 7. Средние профили ZTS-00008183 в сыворотке крови проиллюстрированы на фиг. 8.

[000300] В целом, данные результаты демонстрируют, что константный домен собачьего IgG, имеющий мутацию N434H, обеспечивал период полужизни, составляющий около 30 суток. Это увеличение периода полужизни больше чем в 2 раза (т.е. на 200%) по сравнению с периодом полужизни для дикого типа, составляющим от 9,2 суток до 9,7 суток (см. таблицу 2).

ПРИМЕР 7

Длительный терапевтический эффект Fc-мутанта IgG

[000301] Оценивали однократную подкожную дозу ZTS-00008183, составляющую 4 мг/кг, в модели ИЛ-31-индуцированного зуда у собак.

[000302] Двадцать четыре здоровых собаки породы бигль рандомизированно распределяли по группам воздействия с использованием рандомизированной схемы полного блока и вводили им ZTS-00008183 в дозе по 4 мг/кг массы тела или плацебо в параллельном исследовании эффективности. Животных распределяли на основании исторических оценок зуда, чтобы сформировать восемь (8) полных блоков размером по 3.

[000303] Каждому животному в день -7 исследования вводили ИЛ-31 (по 2,5 мкг/кг) для индуцирования зуда, чтобы установить базовую оценку зуда. Дополнительные введения ИЛ-31 выполняли в дни исследования 7, 28, 56, 84, 112, 140, 168 и 210.

[000304] За животными наблюдали на предмет связанного с зудом поведения в течение 120-минутного периода после каждого введения. Наблюдения проводили в течение 1-минутного периода, и любая связанная с зудом активность в течение этого периода обозначалась как положительный ответ. Совокупное число положительных ответов определяло оценку зуда.

[000305] Во время этого исследования не было отмечено каких-либо побочных эффектов, и все исследуемые и контрольные препараты, и вводимые материалы, вводили в соответствии с протоколом.

[000306] Полученные результаты демонстрируют, что однократная п/к-доза ZTS-00008183, составляющая 4,0 мг/кг, характеризовалась значительно более низкой оценкой зуда по способу наименьших квадратов (таблицы 9, 11 и 13) по сравнению с контролем через 3, 4 и 5 месяцев (Р<0,0001) в данной модели ИЛ-31-индуцированного зуда у собак.

[000307] Как показано на фиг. 9-13, ZTS-0008183 (В02) в дозе 4 мг/кг характеризуется значительно более низкой общей оценкой зуда в данной модели ИЛ-31-индуцированного зуда у собак по сравнению с контролем в дни исследования 84, 112, 140, 168 и 210.

[000308] Основываясь на данных оценках зуда, полученные результаты также демонстрируют, что ZTS-00008183 терапевтически эффективен в течение 84, 112, 140, 168 и 210 суток (т.е. около 7 месяцев).

[000309] Данные результаты дополнительно демонстрируют, что ZTS-00008183 обладает долгосрочным терапевтическим эффектом и может вводиться один раз в 3, 4, 5, 6 или 7 месяцев.

[000310] В целом, полученные результаты демонстрируют, что константный домен собачьего IgG, имеющий мутацию N434H, поддерживает терапевтический уровень в сыворотке крови на протяжении около 210 суток (т.е. на 7 месяцев). Это в несколько раз превышает длительности поддержания терапевтического уровня антител против ИЛ-31 дикого типа, о которых сообщалось в более ранних исследованиях.

ПРИМЕР 8

Анализ связывания FcRn

[000311] Как обсуждалось в примере 3, выделяли и подготавливали собачий FcRn, и анализировали Fc-мутанты IgG по сравнению с собачьим FcRn в соответствии с работой Bergeron et.al, как обсуждалось выше. Применяли стандартный способ ПЦР для амплификации субъединицы α собачьего FcRn и β-микроглобулина с использованием вырожденных праймеров, разработанных на основании выравнивания последовательностей яванской макаки, человека, мыши и крысы. Праймеры содержали HindIII на 3'-концах и BamH1 на 5'-концах для облегчения субклонирования в векторы pcDNA3.1(+), сконструированные с С-концевой меткой 6х His+ВАР (AGLNDIFEAQKIEWHE). Субъединицу FcRn-α и β-микроглобулин совместно трансфицировали в клетки HEK 293, и комплекс FcRn очищали методом аффинной очистки посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (АХИМ, англ. «IMAC») с использованием С-концевой гистидиновой метки. Показатели KD измеряли с помощью Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) с использованием сенсорного чипа СМ5 или SA.

[000312] FcRn захватывали на поверхности указанного сенсора с использованием модифицированного метода захвата SA. 10 мМ MES; 150 мМ NaCl; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 6 использовали в качестве буфера для захвата, анализа и титрования. 1х HBS-P, 0,5 мг/мл БСА; рН 7,4 также использовали в качестве буфера для анализа и титрования. Fc-мутантные IgG пропускали над поверхностью рецепторов и определяли аффинность с помощью программного обеспечения Т200 Evaluation или программного обеспечения Biacore Insight Evaluation. Значения от пустых контрольных ячеек, содержащих только буфер, вычитали из значений для всех остальных ячеек. Проточные ячейки восстанавливали с использованием 50 мМ Трис рН 8 или рН 9. Прогоны проводили при температуре 15°С.

[000313] Мутации, произведенные в положении 434 для антител мАт3 против ТФР-β, оказали заметное влияние на аффинность указанных IgG к FcRn при рН 6. Мутация N434H привела к значительному повышению аффинности к FcRn при рН 6, сохраняя при этом слабую аффинность при рН 7,4. Данное исследование показывает, что повышение аффинности IgG к FcRn не зависит от доменов VHVL и является универсальным для любого собачьего антитела против ТФР-β.

[000314] Предпочтительные варианты осуществления данного изобретения описаны в данном документе, но следует понимать, что данное изобретение не ограничивается указанными точными вариантами осуществления данного изобретения, и что специалисты в данной области техники могут вносить в него различные изменения и модификации без отступления от объема или духа данного изобретения, определенных в прилагаемой формуле данного изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Zoetis Services LLC

Bergeron, Lisa Marie

Campos, Henry Luis

<120> ВАРИАНТЫ СОБАЧЬИХ АНТИТЕЛ

<130> ZP000358A-PCT

<150 63/084241

<151> 28.09.2020

<160> 120

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 1

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys

100 105 110

Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln

145 150 155 160

Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys

195 200 205

Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser

225 230 235 240

Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys

245 250 255

Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln

260 265 270

Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg

290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu

305 310 315 320

His His His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 2

<211> 335

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 2

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys

100 105 110

Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln

145 150 155 160

Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys

195 200 205

Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser

225 230 235 240

Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys

245 250 255

Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln

260 265 270

Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg

290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu

305 310 315 320

His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 3

<211> 1005

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 3

gccagcacca cagctccctc cgtgttcccc ctggctccta gctgcggctc tacctccggc 60

agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtcc ggctacttcc ctgagccagt gaccgtgagc 120

tggaactccg gctccctgac ctccggagtg cacacatttc caagcgtgct gcagtcttcc 180

ggcctgtatt ctctgagctc tatggtgacc gtgccttcca gcaggtggcc atctgagaca 240

ttcacctgca acgtggccca tcccgcttcc aagacaaagg tggacaagcc cgtgcctaag 300

agggagaatg gaagggtgcc ccggccccct gattgcccta agtgtccagc tccagagatg 360

ctgggaggac catccgtgtt catctttcca cccaagccca aggataccct gctgatcgct 420

agaacccctg aggtgacatg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaggtgcag 480

atctcttggt tcgtggatgg caagcagatg cagaccgcca agacacagcc tagggaggag 540

cagtttaacg gcacctacag ggtggtgtcc gtgctgccaa tcggccacca ggactggctg 600

aagggcaagc agtttacctg caaggtgaac aataaggctc tgccttctcc aatcgagaga 660

acaatctcca aggccagggg ccaggctcat cagcctagcg tgtacgtgct gcctccatcc 720

agagaggagc tgagcaagaa caccgtgtct ctgacatgtc tgatcaagga tttctttccc 780

cctgacatcg atgtggagtg gcagagcaat ggccagcagg agccagagtc taagtatcgc 840

accacaccac cccagctgga cgaggatggc agctacttcc tgtatagcaa gctgtctgtg 900

gacaagtcta gatggcagcg cggcgatacc tttatctgtg ccgtgatgca cgaggcactg 960

cacaatcact acacccagga gagtctgagc cacagcccag gaaaa 1005

<210> 4

<211> 1005

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 4

gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60

agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120

tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180

ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240

ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300

agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaaatg 360

ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420

agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480

atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540

cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600

aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660

actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720

cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780

cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840

accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900

gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960

cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005

<210> 5

<211> 96

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 5

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

<210> 6

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 6

Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys

1 5 10 15

Pro Lys Cys Pro

20

<210> 7

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 7

Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe

35 40 45

Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 8

Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe

20 25 30

Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu

35 40 45

Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly

50 55 60

Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

65 70 75 80

Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn

85 90 95

His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 9

<211> 291

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 9

gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60

agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120

tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180

ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240

ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc c 291

<210> 10

<211> 57

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 10

gtgcctaaaa gggagaatgg aagggtgcca agaccacctg attgccctaa gtgtcca 57

<210> 11

<211> 330

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 11

gctccagaaa tgctgggagg accaagcgtg ttcatctttc cacccaagcc caaagacaca 60

ctgctgattg ctagaactcc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacctgga tccagaggac 120

cccgaagtgc agatctcctg gttcgtggat gggaagcaga tgcagacagc caaaactcag 180

cctcgggagg aacagtttaa cggaacctat agagtggtgt ctgtgctgcc aattggacac 240

caggactggc tgaagggcaa acagtttaca tgcaaggtga acaacaaggc cctgcctagt 300

ccaatcgaga ggactatttc aaaagctagg 330

<210> 12

<211> 327

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 12

ggacaggctc atcagccttc cgtgtatgtg ctgcctccat cccgggagga actgtctaag 60

aacacagtga gtctgacttg tctgatcaaa gatttctttc cccctgacat tgatgtggag 120

tggcagagca atgggcagca ggagccagaa tccaagtaca gaaccacacc accccagctg 180

gacgaagatg gctcctattt cctgtacagt aagctgtcag tggacaaatc taggtggcag 240

cgcggggata cctttatctg cgccgtgatg cacgaggctc tgcacaatca ttacacacaa 300

gaaagtctgt cacatagccc cggcaag 327

<210> 13

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 13

Tyr Tyr Asp Ile Asn

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 14

Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 15

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 15

Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 16

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 16

Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 17

Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 18

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 19

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 20

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Gly Leu Met His

1 5 10 15

<210> 21

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 21

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 22

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 23

Gln Gln Ser Asn Lys Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 24

Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 25

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 25

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 26

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Последовательность канинизированной вариабельной области

легкой цепи мАт из Mus musculus и Canis

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Последовательность канинизированной вариабельной области легкой

цепи мАт из Mus musculus и Canis

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 28

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Thr

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Последовательность канинизированной вариабельной области легкой

цепи мАт из Mus musculus и Canis

<400> 29

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 30

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Последовательность канинизированной вариабельной области тяжелой

цепи мАт из Mus musculus и Canis

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Tyr Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Thr Ser Val Ile Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Последовательность канинизированной вариабельной области тяжелой

цепи мАт из Mus musculus и Canis

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 159

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 34

Met Leu Ser His Thr Gly Pro Ser Arg Phe Ala Leu Phe Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ser Met Glu Thr Leu Leu Ser Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu

20 25 30

Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser

35 40 45

Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu

50 55 60

Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro

65 70 75 80

Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro

85 90 95

Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys

100 105 110

Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp

115 120 125

Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser

130 135 140

Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln

145 150 155

<210> 35

<211> 477

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 35

atgctctccc acacaggacc atccaggttt gccctgttcc tgctctgctc tatggaaacc 60

ttgctgtcct cccatatggc acccacccat cagctaccac caagtgatgt acgaaaaatc 120

atcttggaat tacagccctt gtcgagggga cttttggaag actatcagaa gaaagagaca 180

ggggtgccag aatccaaccg taccttgctg ctgtgtctca cctctgattc ccaaccacca 240

cgcctcaaca gctcagccat cttgccttat ttcagggcaa tcagaccatt atcagataag 300

aacattattg ataaaatcat agaacagctt gacaaactca aatttcaaca tgaaccagaa 360

acagaaattt ctgtgcctgc agatactttt gaatgtaaaa gcttcatctt gacgatttta 420

cagcagttct cggcgtgcct ggaaagtgtg tttaagtcac taaactctgg acctcag 477

<210> 36

<211> 333

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 36

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gcactggtac 120

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240

cctgtggaga ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaataa ggatccgctc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333

<210> 37

<211> 363

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 37

caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcaaa tactatgata taaactgggt gaggcagagg 120

cctgaacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gagatggtgg tactaagtac 180

aatgagacgt tcaagggcaa ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcaggctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagagggggg 300

acttcggtga taagggatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 38

<211> 333

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 38

gacattttgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccatc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgtcagt tttgctggta ctggtttaat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagca acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaagct 180

ggggttccta ccaggtttag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caatatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat ttctgtcagc aaagcaggga atatccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 39

<211> 353

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 39

gaggtgcagt tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt ctctttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagttatg gtggtagtta cacctactat 180

ccagacaata taaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagggggtat 300

ggttacgata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc gag 353

<210> 40

<211> 331

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 40

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val

100 105 110

Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro

115 120 125

Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

130 135 140

Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

145 150 155 160

Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln

165 170 175

Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln

180 185 190

Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp

195 200 205

Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala

210 215 220

His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro

245 250 255

Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu

260 265 270

Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr

275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

290 295 300

Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr

305 310 315 320

Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 41

<211> 993

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 41

gcctccacca cggcgccctc ggttttccca ctggccccca gctgcgggtc cacttccggc 60

tccacggtgg ccctggcctg cctggtgtca ggctacttcc ccgagcctgt aactgtgtcc 120

tggaactccg gctccttgac cagcggtgtg cacaccttcc cgtccgtcct gcagtcctca 180

gggcttcact ccctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggcc cagcgagacc 240

ttcacctgca acgtggtcca cccagccagc aacactaaag tagacaagcc agtgttcaat 300

gaatgcagat gcactgatac acccccatgc ccagtccctg aacctctggg agggccttcg 360

gtcctcatct ttcccccgaa acccaaggac atcctcagga ttacccgaac acccgaggtc 420

acctgtgtgg tgttagatct gggccgtgag gaccctgagg tgcagatcag ctggttcgtg 480

gatggtaagg aggtgcacac agccaagacc cagtctcgtg agcagcagtt caacggcacc 540

taccgtgtgg tcagcgtcct ccccattgag caccaggact ggctcacagg gaaggagttc 600

aagtgcagag tcaaccacat agacctcccg tctcccatcg agaggaccat ctctaaggcc 660

agagggaggg cccataagcc cagtgtgtat gtcctgccgc catccccaaa ggagttgtca 720

tccagtgaca cagtcagcat cacctgcctg ataaaagact tctacccacc tgacattgat 780

gtggagtggc agagcaatgg acagcaggag cccgagagga agcaccgcat gaccccgccc 840

cagctggacg aggacgggtc ctacttcctg tacagcaagc tctctgtgga caagagccgc 900

tggcagcagg gagacccctt cacatgtgcg gtgatgcatg aaactctaca gaaccactac 960

acagatctat ccctctccca ttctccgggt aaa 993

<210> 42

<211> 335

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 42

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys

100 105 110

Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln

145 150 155 160

Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys

195 200 205

Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser

225 230 235 240

Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys

245 250 255

Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln

260 265 270

Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg

290 295 300

Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu

305 310 315 320

His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 43

<211> 1005

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 43

gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60

agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120

tggaacagcg gctctctgac ctccggggtg cacacatttc catctgtgct gcagtctagt 180

ggcctgtact ccctgtcaag catggtgact gtgccttcct ctaggtggcc atcagaaact 240

ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300

agggagaatg gaagggtgcc aagaccacct gattgcccta agtgtccagc tccagaaatg 360

ctgggaggac caagcgtgtt catctttcca cccaagccca aagacacact gctgattgct 420

agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480

atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540

cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600

aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660

actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720

cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780

cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840

accacaccac cccagctgga cgaagatggc tcctatttcc tgtacagtaa gctgtcagtg 900

gacaaatcta ggtggcagcg cggggatacc tttatctgcg ccgtgatgca cgaggctctg 960

cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005

<210> 44

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 44

Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp

1 5 10 15

Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln

35 40 45

Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser

65 70 75 80

His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr

85 90 95

Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys

100 105

<210> 45

<211> 318

<212> ДНК

<213> Canis familiaris

<400> 45

aggaacgacg cccagcctgc tgtgtatctg tttcagccct cccctgatca gctgcacact 60

ggctctgcta gtgtggtgtg tctgctgaac agcttctacc caaaggatat caatgtgaag 120

tggaaagtgg acggcgtgat ccaggatact gggattcagg agtccgtgac cgaacaggac 180

aaagattcaa catatagcct gagctccact ctgaccatgt ctagtaccga gtacctgagc 240

cacgaactgt attcctgcga gatcactcat aagtccctgc cctctaccct gatcaagagc 300

ttccagagat cagagtgt 318

<210> 46

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность

канинизированной вариабельной области легкой цепи мАт из

Mus musculus и Canis

<400> 46

gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60

atcacatgca aggccagcca gagcgtgtcc ttcgccggca caggcctgat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggccaggc ccccaagctg ctgatctacc gggccagcaa cctggaagcc 180

ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcagctt caccatcagc 240

agcctcgaac ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcagaga gtacccctgg 300

accttcggcc agggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 47

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность

канинизированной вариабельной области тяжелой цепи мАт из

Mus musculus и Canis

<400> 47

gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60

agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc aactacggca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcagctacg gcggcagcta cacctactac 180

cccgacaaca tcaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccatgt actactgcgt gcggggctac 300

ggctacgaca caatggacta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtctc gagc 354

<210> 48

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность

канинизированной вариабельной области легкой цепи мАт из

Mus musculus и Canis

<400> 48

gatatagtga tgacacaaac tcctctcagt ctttccgtat caccgggaga accggcttcc 60

atttcctgtc gggcctcaga gtctgtggac aactacggga tatccttcat gcactggtat 120

cagcagaaac ccggccagcc ccctaaactc cttatttaca gggccagtaa tctggaaagc 180

ggtgtgcccg atcgatttag cggttccggg agcggcacag atttcaccct gcgaatctct 240

agagttgaag cggatgatgc aggagtatat tactgccagc aatccaataa ggatcccctt 300

acattcggcg cgggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 49

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность

канинизированной вариабельной области тяжелой цепи мАт из

Mus musculus и Canis

<400> 49

gaggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaaga ccagcggcta caccttcaag tactacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120

cctggcgccg gactggattg gatgggctgg atcttccccg gcgacggcgg caccaagtac 180

aacgagacat tcaagggcag agtgaccctg accgccgaca ccagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgag agccggcgat atcgctgtgt actactgcgc cagaggcggc 300

accagcgtga tccgggacgc tatggactac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtctcg 360

agc 363

<210> 50

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность

канинизированной вариабельной области легкой цепи мАт из

Mus musculus и Canis

<400> 50

gacattgtta tgactcagac gcccctgagc ctgagcgtct cccccggcga gcccgctagt 60

attagttgcc gggcatccga gtcagtggac aattatggca tcagctttat gcattggttt 120

cagcagaaac caggtcagtc ccctcaactc ctgatttaca gagcttccaa tctggaatca 180

ggcgttcctg acagatttag cggatcaggc tccgggacag atttcaccct gcgcatcagt 240

cgcgtggaag ccgatgacgc aggcgtctat tattgtcaac agtccaacaa ggatcccctt 300

acattcggag ccggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 51

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Последовательность канинизированной вариабельной области легкой

цепи мАт из Mus musculus и Canis

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Arg Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asp Asp Ala Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Lys Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 52

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность

канинизированной вариабельной области легкой цепи мАт из

Mus musculus и Canis

<400> 52

gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtgt cccctggcga gcctgccagc 60

atcagctgca gagccagcga gagcgtggac aactacggca tcagcttcat gcactggttc 120

cagcagaagc ccggccagag cccccagcgg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgcccg atcggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gcggatctct 240

cgggtggaag ccgatgacgc cggagtgtac tactgccagc agagcaacaa ggaccccctg 300

acctttggcg ccggtaccaa gctggagatc aag 333

<210> 53

<211> 148

<212> БЕЛОК

<213> Искусственный

<220>

<223> Полноразмерный белок ИЛ-31 собаки, кодируемый кодон-

оптимизированной нуклеотидной последовательностью

<400> 53

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser His Met Ala

1 5 10 15

Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile Leu Glu

20 25 30

Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys Lys Glu

35 40 45

Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ser

50 55 60

Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro Tyr Phe

65 70 75 80

Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys Ile Ile

85 90 95

Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr Glu Ile

100 105 110

Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu Thr Ile

115 120 125

Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser Leu Asn

130 135 140

Ser Gly Pro Gln

145

<210> 54

<211> 444

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая

полноразмерный белок ИЛ-31 собаки

<400> 54

atgagaggat cccatcacca tcaccaccac ggctcatctc atatggctcc tactcaccaa 60

ttaccaccct ccgatgtccg taaaattatt ctcgaattac aacctttatc ccgcggtctg 120

ctcgaagatt accaaaaaaa agaaacaggc gtcccagaaa gcaaccgtac attactcctt 180

tgccttacct ccgattccca accacctcgt cttaactcat cagccattct cccttatttc 240

cgtgccattc gccctctttc tgataaaaat attattgaca aaattattga acaactcgac 300

aaattaaaat tccaacacga acccgaaacc gaaatctccg tacctgccga tacctttgaa 360

tgcaaatcct ttatcctcac tattttacaa caattctccg catgtctcga atccgtcttc 420

aaatctctca attccggtcc acag 444

<210> 55

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи ZTS-841

<400> 55

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagat ttggtgaagc ctggggggtc cttgagactg 60

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt agccacggca tgcactgggt ccgtcagtct 120

ccagggaagg gactgcagtg ggtcgcagtt attaacagcg gtggaagtag cacatactac 180

acagacgctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacagtgtat 240

ctacagatga acagcctgag agccgaggac acggccatgt attactgtgc aaaggagtcc 300

gtcggggggt gggagcaact ggtcggacct cattttgact actggggcca gggaaccctg 360

gtcatcgtct cgagc 375

<210> 56

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи ZTS-841

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Ser Val Gly Gly Trp Glu Gln Leu Val Gly Pro His Phe

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser

115 120 125

<210> 57

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 57

Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 58

Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 59

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 59

Ala Lys Glu Ser Val Gly Gly Trp Glu Gln Leu Val Gly Pro His Phe

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 60

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи ZTS-841

<400> 60

cagtctgtgc tgactcagcc gacctcagtg tcagggtccc ttggccagag ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcacgaa caacatcggt attcttggtg cgagctggta ccaactgttc 120

ccaggaaagg cccctaaact cctcgtgtac ggtaatggga atcgaccgtc aggggtccct 180

gaccggtttt ccggcgccga ctctggcgac tcagtcaccc tgaccatcac tgggcttcag 240

gctgaggacg aggctgatta ttactgccag tcctttgata ccacgcttgg tgctcatgtg 300

ttcggcggag gcacccacct gaccgtcctt 330

<210> 61

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи ZTS-841

<400> 61

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu

20 25 30

Gly Ala Ser Trp Tyr Gln Leu Phe Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ala Asp Ser Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu

85 90 95

Gly Ala His Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 62

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 62

Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu Gly

1 5

<210> 63

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 63

Gly Asn Gly Asn

1

<210> 64

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 64

Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu Gly Ala His Val

1 5 10

<210> 65

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 65

Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe

20 25 30

Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu

35 40 45

Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly

50 55 60

Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

65 70 75 80

Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His His

85 90 95

His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 66

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Canis familiaris

<400> 66

His Glu Ala Leu His His His Tyr Thr Gln Glu

1 5 10

<210> 67

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь ZTS-00008183

<400> 67

gagatcgtga tgacccagag ccccgccagc ctgagcctga gccaggaaga gaaagtcacc 60

atcacatgca aggccagcca gagcgtgtcc ttcgccggca caggcctgat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggccaggc ccccaagctg ctgatctacc gggccagcaa cctggaagcc 180

ggcgtgccaa gcagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcagctt caccatcagc 240

agcctcgaac ccgaggacgt ggccgtgtac tactgccagc agagcagaga gtacccctgg 300

accttcggcc agggtaccaa gctggaaatc aagcggaacg acgcccagcc cgccgtgtac 360

ctgttccagc ccagccccga tcagctgcac accggcagcg cttcagtcgt ctgcctgctg 420

aacagcttct accccaagga catcaacgtg aagtggaagg tggacggcgt gatccaggac 480

accggcatcc aggaaagcgt caccgagcag gacaaggaca gcacctacag cctgagcagc 540

accctgacca tgtccagcac cgagtacctg agccacgagc tgtatagctg cgagatcacc 600

cacaagagcc tgcctagcac cctgatcaag agcttccagc ggagcgagtg ctagtag 657

<210> 68

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь ZTS-00008183

<400> 68

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln

115 120 125

Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln Asp

145 150 155 160

Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His

180 185 190

Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu

195 200 205

Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys

210 215

<210> 69

<211> 1365

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь ZTS-00008183

<400> 69

gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg 60

agctgtgtgg ccagcggctt caccttcagc aactacggca tgagctgggt ccgacaggcc 120

cctggcaagg gactgcagtg ggtggccacc atcagctacg gcggcagcta cacctactac 180

cccgacaaca tcaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccatgt actactgcgt gcggggctac 300

ggctacgaca caatggacta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtctc gagcgcctca 360

acaactgctc ctagcgtgtt tcccctggcc cctagctgcg gaagtacctc aggcagcaca 420

gtggccctgg cttgtctggt gtctggatat ttccctgagc cagtgaccgt gagttggaac 480

agcggctctc tgacctccgg ggtgcacaca tttccatctg tgctgcagtc tagtggcctg 540

tactccctgt caagcatggt gactgtgcct tcctctaggt ggccatcaga aactttcacc 600

tgcaacgtgg cccatcccgc cagcaagacc aaagtggaca agcccgtgcc taaaagggag 660

aatggaaggg tgccaagacc acctgattgc cctaagtgtc cagctccaga aatgctggga 720

ggaccaagcg tgttcatctt tccacccaag cccaaagaca cactgctgat tgctagaact 780

cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacctg gatccagagg accccgaagt gcagatctcc 840

tggttcgtgg atgggaagca gatgcagaca gccaaaactc agcctcggga ggaacagttt 900

aacggaacct atagagtggt gtctgtgctg ccaattggac accaggactg gctgaagggc 960

aaacagttta catgcaaggt gaacaacaag gccctgccta gtccaatcga gaggactatt 1020

tcaaaagcta ggggacaggc tcatcagcct tccgtgtatg tgctgcctcc atcccgggag 1080

gaactgtcta agaacacagt gagtctgact tgtctgatca aagatttctt tccccctgac 1140

attgatgtgg agtggcagag caatgggcag caggagccag aatccaagta cagaaccaca 1200

ccaccccagc tggacgaaga tggctcctat ttcctgtaca gtaagctgtc agtggacaaa 1260

tctaggtggc agcgcgggga tacctttatc tgcgccgtga tgcacgaggc tctgcaccat 1320

cattacacac aagaaagtct gtcacatagc cccggcaagt agtag 1365

<210> 70

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь ZTS-00008183

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Ile

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala

130 135 140

Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val

210 215 220

Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu

245 250 255

Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met

275 280 285

Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly

305 310 315 320

Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile

325 330 335

Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val

340 345 350

Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu

370 375 380

Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His His His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser

435 440 445

His Ser Pro Gly Lys

450

<210> 71

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 71

Ser Ser Trp Met Asn

1 5

<210> 72

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 72

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 73

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 73

Ala Arg His Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr

1 5 10

<210> 74

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 74

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 75

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 75

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 76

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 77

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Tyr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 78

gaggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60

agctgcaaga catctggcta caccttcatc tccagctgga tgaactgggt gagacaggct 120

ccaggagctg gcctggactg gatgggccag atctaccctg gcgacggcga tacaaactat 180

aatggcaagt ttaagggaag ggtgaccctg acagctgaca ccagcacatc taccgcttac 240

atggagctgt cttccctgag ggccggcgat atcgccgtgt actattgtgc ccggcactat 300

gacggctcca ccgattactg gggccagggc acactggtga ccgtctcgag c 351

<210> 79

<211> 103

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 79

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

100

<210> 80

<211> 306

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 80

gagatcgtga tgacccagtc ccctgcttct ctgtccctga gccagggcga gaaggtgacc 60

atcacatgca gggcctctga gaacatctac tccaatctgg cttggtatca gcagcggccc 120

ggacaggctc ctaagctgct gatctacgcc gctacaaacc tggctgacgg cgtgccaagc 180

aggttctctg gatccggaag cggcaccgac ttttctctga caatctccag cctggagcca 240

gaggatgtgg ccgtgtacta ttgtcagcac ttctggggca ccccctatac atttggccag 300

ggtacc 306

<210> 81

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 81

Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 82

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 82

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr

1 5 10

<210> 83

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 83

Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Asp Pro Gln Tyr Ser

1 5 10

<210> 84

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 84

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp Leu Gly

1 5 10

<210> 85

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 85

Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 86

Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 87

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 87

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Asp Pro Gln Tyr Ser

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 88

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 88

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctcgtgaagc ctggcggctc tctgagactg 60

tcctgtgtgg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggaaaag gcctgcagtg ggtggccgtg atctcctacg acggctccat caagtactac 180

gccgacgccg tgaagggccg gttcaccatc agcagagaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc tagaaccggc 300

gagtactccg gctacgatac cgacccccag tactcttggg gccagggcac cacagtgacc 360

gtctcgagc 369

<210> 89

<211> 103

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 89

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

100

<210> 90

<211> 309

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 90

gaaattgtga tgacccagag cccggcgagc ctgagcctga gccaggaaga aaaagtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcca gggcattggc gatgatctgg gctggtatca gcagaaaccg 120

ggccaggcgc cgaaactgct gatttatggc accagcaccc tgcagagcgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttagcttta ccattagcag cctggaaccg 240

gaagatgtgg cggtgtatta ttgcctgcag gatagcaact atccgctgac ctttggcgcg 300

ggcaccaaa 309

<210> 91

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 91

Gly Tyr Ile Phe Ile Thr Tyr

1 5

<210> 92

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 92

Phe Pro Ala Ser Gly Ser

1 5

<210> 93

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 93

Gly Asp Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 94

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 94

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 95

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 95

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 96

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 96

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 97

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 97

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asp Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr

115

<210> 98

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 98

gaggtgcagt tggttcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggggcctc tgtaaaggtc 60

agctgcaaga ctagcggata tacatttatc acatactgga tgaactgggt ccgacaagcc 120

cctggtgccg gcctggattg gatgggccag atcttcccag caagcggatc taccaattac 180

aatgagatgt tcgagggtag ggtgaccctc acagctgata ccagtacttc aactgcatac 240

atggaactga gttccctgag agcaggcgac atcgcagttt actattgtgc ccgaggcgac 300

ggcaattatg cactggatgc tatggactac tggggtcagg gaaccctggt gaca 354

<210> 99

<211> 104

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 99

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Arg

1 5 10 15

Glu Thr Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Ser Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Asn Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln

100

<210> 100

<211> 312

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Mus musculus и Canis

<400> 100

gatattgtga tgacacagac tccaccctcc ctttctgtca gccctcggga gaccgcctcc 60

attagctgtc gcgccagtga gtccgtcgat tcctacggaa atagcttcat gcactggtat 120

ctgcagaaac caggtcagtc tcctcaattg ctgatctacc tggcttctaa cctggaaagc 180

ggtgtgtcag ataggttttc cggaagtggt agcggaactg actttaccct gcgtatttcc 240

cgagtggaag ccaatgacac tggtgtttac tactgtcagc agaataacga agaccccctg 300

acctttggcc ag 312

<210> 101

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 101

Ser Asn Val Ile Ser

1 5

<210> 102

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 102

Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 103

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 103

Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 104

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 104

Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 105

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 105

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro

1 5

<210> 106

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 106

Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 107

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 107

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Ala Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Ser Asn

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 108

<211> 359

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 108

gaggtgcagc tggtgcagag cgccgctgag gtgaagaagc caggcgcctc cgtgaaggtg 60

agctgcaaga catctggcta catcttcatc tccaacgtga tcagctgggt gcagcaggct 120

ccaggagctg gactggagtg gatgggcggc gtgatcccta tcgtggacat cgccaattac 180

gctcagaggt ttaagggccg ggtgaccctg acagccgata cctctacaaa caccgtgtat 240

atggagctgt ccaatctgag gacagaggac accgccgtgt actattgtgc ttctaccctg 300

ggcctggtgc tggacgctat ggattattgg ggccagggca cactggtgac cgtctcgag 359

<210> 109

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 109

Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 110

<211> 309

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 110

gagaccgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgtccctga gcccaggaga gagggccaca 60

ctgtcttgcc gggcttctca gtccctgggc tccagctacc tggcctggta tcagcagaag 120

ccaggccagg ctcccaggct gctgatctac ggagcctctt ccagagctcc aggcgtgcct 180

gctcgcttca gcggatctgg ctccggcacc gactttaccc tgacaatcag ctctctggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctattgtcag cagtatgctg attcccctat cacatttggc 300

cagggtacc 309

<210> 111

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 111

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn Val

1 5

<210> 112

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 112

Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala

1 5

<210> 113

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 113

Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 114

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 114

Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 115

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 115

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 116

Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr

1 5

<210> 117

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 118

<211> 359

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область тяжелой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 118

gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgac ctggtgaagc cagctggctc tctgaggctg 60

tcctgcgtgg ctagcggcta caccttctcc agcaacgtga tgtcttgggt gagacaggct 120

ccaggcaagg gactgcagtg ggtgggctac gtgatcccta tcgtggacat cgccaactat 180

gccgatgctg tgaagggcag gtttaccatc tctcgggaca acgctaagaa tacactgtac 240

ctgcagatga actccctgag agtggaggat acagccgtgt actattgtac ccgcacactg 300

ggcctggtgc tggacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtctcgag 359

<210> 119

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 119

Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 120

<211> 309

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Канинизированная последовательность – вариабельная область легкой

цепи, сконструированная так, чтобы содержать последовательности из

Homo sapiens и Canis

<400> 120

gagaccgtgc tgacacagag ccctggcacc ctgtccctga gcccaggaga gagggccaca 60

ctgtcttgcc gggcttctca gtccctgggc tccagctacc tggcctggta tcagcagaag 120

ccaggccagg ctcccaggct gctgatctac ggagcctctt ccagagctcc aggcgtgcct 180

gctcgcttca gcggatctgg ctccggcacc gactttaccc tgacaatcag ctctctggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctattgtcag cagtatgctg attcccctat cacatttggc 300

cagggtacc 309

<---

Claims (14)

1. Модифицированный IgG, обладающий свойствами повышенной аффинности связывания с неонатальным рецептором Fc (FcRn), содержащий:

(1) константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату,

при этом указанное замещение представляет собой замещение аспарагина в положении 434 гистидином (N434H), и

(2) вариабельный домен собачьего IgG, и

при этом указанный IgG представляет собой молекулу против TGF-β (трансформирующий фактор роста β).

2. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный модифицированный IgG, имеющий указанный константный домен собачьего IgG, обладает увеличенным периодом полужизни по сравнению с полипептидом, имеющим константный домен собачьего IgG дикого типа.

3. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный модифицированный IgG содержит константную область Fc, содержащую домен CH2 или CH3 или их комбинацию.

4. Модифицированный IgG по п. 2, отличающийся тем, что указанный константный домен собачьего IgG дикого типа содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2.

5. Фармацевтическая композиция для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови собаки, содержащая модифицированный IgG по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Набор, предназначенный для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке крови собаки, содержащий модифицированный IgG по п. 1 в контейнере и инструкции по применению.

7. Слитая молекула, обладающая свойствами повышенной аффинности связывания с FcRn, содержащая модифицированный IgG по п. 1, слитый с гетерологичным белком.

8. Применение композиции для повышения аффинности связывания с FcRn у собаки, при этом указанная композиция содержит полипептид, содержащий (1) константный домен собачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом собачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату, при этом указанное замещение представляет собой замещение аспарагина в положении 434 гистидином (N434H), и (2) вариабельный домен собачьего IgG, и при этом указанный IgG представляет собой молекулу против TGF-β.

9. Применение по п. 8, где указанный полипептид содержит константную область Fc, содержащую домен CH2 или CH3 или их комбинацию.

10. Применение по п. 8, где указанный константный домен собачьего IgG дикого типа содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2.