RU2846725C1

RU2846725C1 - ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫЕ СОСТАВЫ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ К ПРОТОФИБРИЛЛАМ Аβ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Info

Publication number: RU2846725C1
Application number: RU2022127051A
Authority: RU
Inventors: Нобуо ЙОСИДА; Наоми САКУРАМОТО; Такахиса САКАГУТИ; Хирокадзу КИТО; Такахиро ОДЗАВА; Анджали ДЖОШИ; Юнг Юэх ХСУ; Пьер СУЙЯК
Original assignee: Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд.
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2025-09-12

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены водные фармацевтические составы, содержащие высокие концентрации выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, аргинин, полисорбат 80 и фармацевтически приемлемый буфер. При этом фармацевтический состав характеризуется рН, находящимся в диапазоне от 4,5 до 5,5. Изобретение применяется для лечения болезни Альцгеймера. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 33 ил., 54 табл., 10 пр.

Description

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США №62/992746, поданной 20 марта 2020 года, и предварительной заявке на патент США №63/027263, поданной 19 мая 2020 года; содержание обеих из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0002] Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим нейродегенеративным нарушением неизвестной этиологии и наиболее распространенной формой деменции среди пожилых людей. В 2006 году в мире имело место 26,6 миллиона случаев AD (диапазон: 11,4-59,4 миллиона) (Brookmeyer, R., et al., Forecasting the global burden of Alzheimer's Disease. Alzheimer Dement. 2007; 3:186-91), при этом по сообщениям более 5 миллионов человек в США жили с AD (2010 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer Dement. 2010; 6:158-94). К 2050 году прогнозируется рост распространенности AD до 106,8 миллиона случаев во всем мире (диапазон: 47,2-221,2 миллиона), тогда как в одних только США распространенность по оценкам будет составлять 11-16 миллионов случаев (Brookmeyer, см. выше, и 2010 Alzheimer's disease facts and figures, см. выше).

[0003] Данное заболевание обычно предполагает глобальное ухудшение когнитивной функции, которое медленно прогрессирует и приводит к тому, что субъекты на конечной стадии заболевания являются прикованными к постели. Выживаемость субъектов с AD обычно составляет всего от 3 до 10 лет после начала проявления симптомов, хотя известны крайние значения 2 и 20 лет (Hebert, L.E., et al., Alzheimer disease in the U.S. population: prevalence estimates using the 2000 census. Arch Neurol. 2003; 60:1119-1122). AD является седьмой ведущей причиной всех случаев смерти в США и пятой ведущей причиной смерти среди американцев старше 65 лет, несмотря на тот факт, что смертность от AD сильно недооценивается, поскольку в свидетельствах о смерти редко указывается AD как причина смерти (2010 Alzheimer' s disease facts and figures, см. выше).

[0004] С точки зрения гистологии заболевание характеризуется наличием сенильных бляшек, обнаруживаемых преимущественно в ассоциативной коре, лимбической системе и базальных ганглиях. Основным компонентом данных бляшек является бета-амилоидный пептид (Аβ). Aβ существует в различных конформационных состояниях - мономерах, олигомерах, протофибриллах и нерастворимых фибриллах. Подробные сведения о механистической взаимосвязи между началом болезни Альцгеймера и продуцированием Aβ остаются неизвестными. Тем не менее, некоторые антитела к Аβ в настоящее время проходят клиническое исследование в качестве потенциальных терапевтических средств для лечения болезни Альцгеймера.

[0005] Антитела к Аβ и другие белки можно вводить субъектам внутривенно, подкожно, внутримышечно и другими способами. При разработке подходящего фармацевтического состава может возникать множество сложностей с дозировкой и/или лекарственной формой антитела. Например, при высоких концентрациях антител могут возникнуть проблемы со стабильностью антитела вследствие образования межбелковых агрегатов или фрагментации. Как правило, агрегация увеличивается с увеличением концентрации антител. Более того, для высококонцентрированных составов на основе антител требуются высокие концентрации стабилизаторов и других вспомогательных веществ для достижения долговременной стабильности белка и срока хранения. Высококонцентрированные составы на основе антител зачастую также являются вязкими, что потенциально усложняет изготовление и введение фармацевтического состава.

[0006] В данном документе предусмотрены фармацевтические составы, содержащие терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллой Aβ. В данном документе также предусмотрены фармацевтические составы, содержащие 80-300 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллой Aβ, где антитело представляет собой BAN2401 (также известное как леканемаб). Было обнаружено, что фармацевтические составы, предусмотренные в данном документе, обладают рядом преимуществ. Например, несмотря на высокие концентрации антитела к протофибриллам Aβ (например, 100 мг/мл или 200 мг/мл), скорость межбелковой агрегации оказывается неожиданно низкой и сравнима со значениями скорости агрегации, обычно наблюдаемой при гораздо более низких концентрациях антител (например, 10 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы, раскрытые в настоящем изобретении, характеризуются более низкой начальной скоростью образования агрегатов, чем составы со значительно более низкими концентрациями антител к протофибриллам Aβ (например, ~0,3% начальный уровень агрегатов в случае 100 мг/мл антитела к протофибриллам Aβ в сравнении с ~0,8% начальным уровнем агрегатов в случае 10 мг/мл антитела к протофибриллам Aβ). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы, раскрытые в настоящем изобретении, характеризуются более низкой скоростью образования частиц довидимого диапазона, чем составы со значительно более низкими концентрациями антитела к протофибриллам Aβ (например, 10,6 частиц/мл в случае 100 мг/мл антитела к протофибриллам Aβ по сравнению с 12,6 частиц/мл в случае 10 мг/мл антитела к протофибриллам Aβ). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы, раскрытые в настоящем изобретении, характеризуются пониженной скоростью агрегации, пониженным начальным уровнем агрегации, пониженной скоростью фрагментации белка и/или снижением образования частиц довидимого диапазона по сравнению с составами со значительно более низкими концентрациями антител к протофибриллам Aβ. Низкая скорость агрегации, начальный уровень агрегации, скорость фрагментации белка и/или образование частиц довидимого диапазона могут обеспечить повышенную стабильность и/или более длительный срок хранения продукта. Более того, вспомогательные вещества в фармацевтических составах, раскрытых в настоящем изобретении, могут присутствовать в меньших количествах, чем в представленных в настоящее время на рынке продуктах для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления рН и осмоляльность фармацевтических составов, раскрытых в настоящем изобретении, являются приемлемыми для внутривенного введения после разведения в жидкостях для внутривенного введения.

[0007] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.

[0008] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 5 (HCDR1), SEQ ID NO: 6 (HCDR2) и SEQ ID NO: 7 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 8 (LCDR1), SEQ ID NO: 9 (LCDR2) и SEQ ID NO: 10 (LCDR3).

[0009] Отнесение аминокислот к каждому домену, как правило, соответствует определениям в SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (Kabat et al., 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991, которая далее в данном документе упоминается как "сообщение Kabat").

[0010] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит константную область человека. В некоторых вариантах осуществления константная область человека из по меньшей мере одного антитела к протофибриллам Aβ содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE и любых их аллельных вариантов, раскрытых в сообщении Kabat. В настоящем изобретении можно использовать любую одну или несколько из таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи выбрана из IgG1 и его аллельных вариантов. Аминокислотная последовательность константной области IgG1 человека известна из уровня техники и представлена под SEQ ID NO: 3.

[0011] В некоторых вариантах осуществления константная область человека из по меньшей мере одного антитела к Aβ содержит константную область легкой цепи, выбранную из константных областей κ/λ-цепей и любых их аллельных вариантов, обсуждаемых в сообщении Kabat. В настоящем изобретении можно использовать любую одну или несколько из таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи выбрана из κ-цепи и ее аллельных вариантов. Аминокислотная последовательность константной области κ-цепи человека известна из уровня техники и представлена под SEQ ID NO: 4.

[0012] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит каркасные области вариабельных областей тяжелой и легкой цепей человека. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит константную область тяжелой цепи IgG1 человека и константную область легкой каппа-цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4.

[0013] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ представляет собой BAN2401, также известное как леканемаб. BAN2401 представляет собой гуманизированный моноклональный IgG1-вариант mAb158, которое представляет собой мышиное моноклональное антитело, вырабатываемое для нацеливания на протофибриллы и раскрытое в WO 2007/108756 и Journal of Alzheimer' s Disease 43: 575-588 (2015). BAN2401 представляет собой по меньшей мере одно антитело к протофибриллам Aβ, демонстрирующее низкую аффинностью в отношении мономеров Aβ, при одновременном связывании с высокой селективностью с соединениями, представляющими собой растворимые агрегаты Aβ. Например, сообщалось, что BAN2401 демонстрирует в примерно 1000 раз большую и в от 5 раз до 10 раз большую селективность в отношении растворимых протофибрилл Aβ, чем в отношении мономеров Aβ или нерастворимых фибрилл Aβ соответственно.

[0014] BAN2401 содержит (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. Полноразмерные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи BAN2401 представлены под SEQ ID NO: 11 и 12 и описаны в WO 2007/108756 и в Journal of Alzheimer' s Disease 43:575-588 (2015).

[0015] Другие неограничивающие примеры подходящих антител для применения в качестве по меньшей мере одного антитела к протофибриллам Aβ в настоящем изобретении включают антитела, раскрытые в WO 2002/003911, WO 2005/123775, WO 2007/108756, WO 2011/001366, WO 2011/104696 и WO 2016/005466.

[0016] В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 80 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 80 мг/мл до 300 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, находящейся в диапазоне от 85 мг/мл до 275 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, находящейся в диапазоне от 90 мг/мл до 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, находящейся в диапазоне от 95 мг/мл до 225 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, находящейся в диапазоне от 100 мг/мл до 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 110 мг/мл, 120 мг/мл, 130 мг/мл, 140 мг/мл, 150 мг/мл, 160 мг/мл, 170 мг/мл, 180 мг/мл, 190 мг/мл, 200 мг/мл, 210 мг/мл, 220 мг/мл, 230 мг/мл, 240 мг/мл, 250 мг/мл, 260 мг/мл, 270 мг/мл, 280 мг/мл, 290 мг/мл или 300 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 100 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 250 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 300 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент представляет собой BAN2401. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержат три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 5 (HCDR1), SEQ ID NO: 6 (HCDR2) и SEQ ID NO: 7 (HCDR3); и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 8 (LCDR1), SEQ ID NO: 9 (LCDR2) и SEQ ID NO: 10 (LCDR3).

[0017] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав, содержащий терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллами Aβ, дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный компонент.В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный компонент в фармацевтическом составе выбран из буферов. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный компонент в фармацевтическом составе выбран из эмульгаторов. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный компонент в фармацевтическом составе выбран из лимонной кислоты (или моногидрата лимонной кислоты), хлорида натрия, гистидина (и/или гидрохлорида гистидина), аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) и полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный компонент в фармацевтическом составе выбран из лимонной кислоты (и/или моногидрата лимонной кислоты), аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) и полисорбата 80. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный компонент в фармацевтическом составе выбран из гистидина (и/или гидрохлорида гистидина), аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) и полисорбата 80.

[0018] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит аргинин (и/или гидрохлорид аргинина). В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 400 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе находится в диапазоне от приблизительно 110 мМ до приблизительно 380 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе находится в диапазоне от приблизительно 120 мМ до приблизительно 360 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе находится в диапазоне от приблизительно 125 мМ до приблизительно 350 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе составляет 125 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе составляет 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) в фармацевтическом составе составляет 350 мМ.

[0019] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит гистидин. В некоторых вариантах осуществления концентрация гистидина в фармацевтическом составе находится в диапазоне от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гистидина в фармацевтическом составе находится в диапазоне от 10 мМ до 100 мМ, от 12 мМ до 80 мМ, от 14 мМ до 60 мМ, от 15 мМ до 55 мМ, от 15 мМ до 35 мМ или от 15 мМ до 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гистидина составляет 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гистидина составляет 50 мМ.

[0020] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления концентрация полисорбата 80 в фармацевтическом составе находится в диапазоне приблизительно 0,01-0,1% вес/об., 0,01-0,08% вес/об., 0,02-0,08% вес/об., 0,03-0,07% вес/об. или 0,04-0,06% вес/об. В некоторых вариантах осуществления полисорбат 80 присутствует в фармацевтическом составе в концентрации, составляющей 0,01% вес/об., 0,02% вес/об., 0,03 вес/об., 0,04 вес/об., 0,05 вес/об., 0,06 вес/об., 0,07% вес/об. или 0,08% вес/об. В некоторых вариантах осуществления полисорбат 80 присутствует в фармацевтическом составе в концентрации, составляющей 0,02% вес/об. В некоторых вариантах осуществления полисорбат 80 присутствует в фармацевтическом составе в концентрации, составляющей 0,05% вес/об.

[0021] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит моногидрат лимонной кислоты. В некоторых вариантах осуществления концентрация моногидрата лимонной кислоты в фармацевтическом составе находится в диапазоне от приблизительно 10 мМ до 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация моногидрата лимонной кислоты в фармацевтическом составе находится в диапазоне от 10 мМ до 100 мМ, от 10 мМ до 90 мМ, от 15 мМ до 85 мМ, от 20 мМ до 80 мМ, от 25 мМ до 75 мМ, от 30 мМ до 70 мМ, от 30 мМ до 60 мМ или от 30 мМ до 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация моногидрата лимонной кислоты в фармацевтическом составе составляет 50 мМ.

[0022] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен фармацевтический состав, характеризующийся рН в диапазоне от 4,5 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления рН фармацевтического состава находится в диапазоне от 4,0 до 6,0, от 4,2 до 5,8, от 4,3 до 5,7, от 4,4 до 5,6 или от 4,5 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления рН составляет 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5. В некоторых вариантах осуществления рН составляет 5,0.

[0023] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические составы, раскрытые в данном документе, могут быть представлены в форме раствора и/или любого другого подходящего жидкого состава, которые специалист в данной области сочтет подходящими. Путь введения композиций по настоящему изобретению может быть внутривенным или подкожным. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав составлен в виде стерильной апирогенной жидкости для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав составлен в виде стерильной апирогенной жидкости для подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой солевой раствор.

[0024] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав представляет собой жидкую лекарственную форму, содержащую по меньшей мере одно выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллой Aβ, такое как BAN2401, и дополнительно содержащую, например, моногидрат лимонной кислоты, аргинин, гидрохлорид аргинина и полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит 100 мг/мл по меньшей мере одного выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллами Aβ, такого как BAN2401, 50 мМ моногидрата лимонной кислоты, 110 мМ аргинина, 240 мМ гидрохлорида аргинина и 0,05% (вес/об.) полисорбата 80 и характеризуется рН 5,0±0,4.

[0025] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав представляет собой жидкую лекарственную форму, содержащую по меньшей мере одно выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллой Aβ, такое как BAN2401, и дополнительно содержащую, например, гистидин, гидрохлорид гистидина, гидрохлорид аргинина и полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит 100 мг/мл или 200 мг/мл по меньшей мере одного выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллами Aβ, такого как BAN2401, 25 мМ гистидина и гидрохлорида гистидина, 200 мМ гидрохлорида аргинина и 0,05% (вес/об.) полисорбата 80 и характеризуется рН 5,0±0,4.

[0026] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав представляет собой жидкую лекарственную форму, содержащую по меньшей мере одно выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллой Aβ, такое как BAN2401, и дополнительно содержащую, например, гистидин, гидрохлорид гистидина, гидрохлорид аргинина и полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит 200 мг/мл по меньшей мере одного выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллами Aβ, такого как BAN2401, 50 мМ гистидина и гидрохлорида гистидина, 125 мМ гидрохлорида аргинина и 0,02% (вес/об.) полисорбата 80 и характеризуется рН 5,0±0,4.

[0027] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав представляет собой жидкую лекарственную форму, содержащую по меньшей мере одно выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллой Aβ, такое как BAN2401, и дополнительно содержащую, например, гистидин, гидрохлорид гистидина, гидрохлорид аргинина и полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит 200 мг/мл по меньшей мере одного выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллами Aβ, такого как BAN2401, 50 мМ лимонной кислоты (и/или моногидрата лимонной кислоты), 125 мМ аргинина (и/или гидрохлорида аргинина) и 0,02% (вес/об.) полисорбата 80 и характеризуется рН 5,0±0,4.

[0028] BAN2401 и способы, предусматривающие применение BAN2401, раскрыты в предварительной заявке на патент США №62/749614 и международной заявке согласно РСТ №PCT/US2019/043067, обе из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Краткое описание графических материалов

[0029] На фиг. 1 изображен процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 5°C.

[0030] На фиг. 2 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 5°C.

[0031] На фиг. 3 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 5°C.

[0032] На фиг. 4 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 25°C.

[0033] На фиг. 5 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 25°C.

[0034] На фиг. 6 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 25°C.

[0035] На фиг. 7 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 при значениях pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 5°C.

[0036] На фиг. 8 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 при значениях pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 5°C.

[0037] На фиг. 9 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 при значениях pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 5°C.

[0038] На фиг. 10 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 при значениях pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 25°C.

[0039] На фиг. 11 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 при значениях pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 25°C.

[0040] На фиг. 12 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 при значениях pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5 в моменты времени 0, 1, 2 и 3 месяца при 25°C.

[0041] На фиг. 13 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1 и 2 месяца при 25°C.

[0042] На фиг. 14 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1 и 2 месяца при 25°C.

[0043] На фиг. 15 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл в моменты времени 0, 1 и 2 месяца при 25°C.

[0044] На фиг. 16 изображено процентное значение агрегации мономеров в составах на основе BAN2401 в зависимости от концентрации аргинина.

[0045] На фиг. 17 изображена блок-схема способа изготовления состава для инъекции на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл.

[0046] На фиг. 18 изображена блок-схема способа изготовления состава для инъекции на основе BAN2401 с концентрацией 100 мг/мл.

[0047] На фиг. 19 изображены значения pH составов на основе BAN2401 со значениями pH в моменты времени 0 и 12 месяцев при 5°C.

[0048] На фиг. 20 изображены значения pH составов на основе BAN2401 со значениями pH в моменты времени 0, 1 и 3 месяца при 25°C.

[0049] На фиг. 21 изображены значения pH составов на основе BAN2401 со значениями pH после одного месяца при 5°C и с перемешиванием при 25°C.

[0050] На фиг. 22 изображено поглощение при 405 нм для составов на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев при 5°C.

[0051] На фиг. 23 изображено поглощение при 405 нм для составов на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1 и 3 месяца при 25°C.

[0052] На фиг. 24 изображено поглощение при 405 нм составов на основе BAN2401 через один месяц при 5°C и с перемешиванием при 25°C.

[0053] На фиг. 25 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев при 5°C.

[0054] На фиг. 26 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев при 5°C.

[0055] На фиг. 27 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев при 5°C.

[0056] На фиг. 28 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1 и 3 месяца при 25°C.

[0057] На фиг. 29 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1 и 3 месяца при 25°C.

[0058] На фиг. 30 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 в моменты времени 0, 1 и 3 месяца при 25°C.

[0059] На фиг. 31 изображено процентное значение агрегации в составах на основе BAN2401 через один месяц при 5°C и с перемешиванием при 25°C.

[0060] На фиг. 32 изображено процентное значение фрагментации в составах на основе BAN2401 через один месяц при 5°C и с перемешиванием при 25°C.

[0061] На фиг. 33 изображено процентное значение мономеров в составах на основе BAN2401 через один месяц при 5°C и с перемешиванием при 25°C.

Определения

[0062] Ниже приведены определения терминов, используемых в настоящей заявке.

[0063] Используемые в данном документе формы существительного единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если контекст явно не указывает на иное.

[0064] Фраза "и/или", используемая в данном документе, означает "любой или оба" из элементов, соединенных таким образом, т.е. означает элементы, которые в некоторых случаях присутствуют совместно, а в других случаях присутствуют раздельно. Таким образом, в качестве неограничивающего примера "А и/или В" при использовании в сочетании с открытой формулировкой, такой как "содержащий", может относиться в некоторых вариантах осуществления только к А (необязательно включая элементы, отличные от В); в других вариантах осуществления только к B (необязательно включая элементы, отличные от A); еще в некоторых других вариантах осуществления как к A, так и к B (необязательно включая другие элементы); и т.д.

[0065] Используемый в данном документе термин "по меньшей мере один" означает один или несколько элементов из перечня элементов, но не обязательно включая по меньшей мере один из всех без исключения элементов, конкретно перечисленных в перечне элементов, и не исключая любые комбинации элементов из перечня элементов. Это определение также допускает, что могут необязательно присутствовать элементы, отличные от элементов, конкретно идентифицированных в перечне элементов, к которым относится фраза "по меньшей мере один", независимо от того, связаны они или не связаны с данными конкретно идентифицированными элементами. Таким образом, в качестве неограничивающего примера "по меньшей мере один из A и B" (или, что эквивалентно, "по меньшей мере один из A или B", или, что эквивалентно, "по меньшей мере один из A и/или B") может относиться в одном варианте осуществления к по меньшей мере одному, необязательно включая более одного, A без присутствия B (и необязательно включая элементы, отличные от B); в другом варианте осуществления к по меньшей мере одному, необязательно включая более одного, B без присутствия A (и необязательно включая элементы, отличные от A); в еще одном варианте осуществления к по меньшей мере одному, необязательно включая более одного, A и к по меньшей мере одному, необязательно включая более одного, B (и необязательно включая другие элементы); и т.д.

[0066] При упоминании числа либо отдельно, либо в качестве части числового диапазона следует понимать, что числовое значение может отклоняться в большую и меньшую сторону от указанного значения на дисперсию, которая является допустимой для описанного значения, как это признается специалистом в данной области техники.

[0067] Используемый в данном документе термин "фрагмент" антитела предусматривает часть антитела, например, содержащую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Неограничивающие примеры фрагментов включают Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, Fv-фрагменты, диатела, линейные антитела и молекулы одноцепочечных антител.

[0068] Используемый в данном документе термин "фрагментация" или "образование фрагментов" относится к разрушению антитела или его фрагмента при его нахождении в составе или его добавлении в состав. Фрагмент, образованный в результате фрагментации или образования фрагментов, может быть или не быть способен связываться с антигеном, с которым связывается антитело или его фрагмент.

[0069] Используемый в данном документе термин "гистидиновый буфер" может предусматривать гистидин, гидрохлорид гистидина или их комбинацию, где гидрохлорид гистидина может представлять собой моногидрат гидрохлорида гистидина.

[0070] Используемый в данном документе термин "цитратный буфер" может предусматривать лимонную кислоту, ее соли или их комбинацию, где лимонная кислота может представлять собой моногидрат лимонной кислоты или безводную лимонную кислоту.

Неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения

[0071] Определенные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к водным фармацевтическим составам.

[0072] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен водный фармацевтический состав, содержащий:

выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, содержащие (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, в концентрации 80-300 мг/мл; и

от 100 мМ до 400 мМ аргинина, где аргинин представляет собой аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинацию, необязательно содержащий любое одно или несколько из следующего:

от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80;

фармацевтически приемлемый буфер, где необязательно буфер представляет собой гистидиновый буфер или цитратный буфер; и

pH составляет от 4,5 до 5,5.

[0073] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен водный фармацевтический состав, содержащий:

фармацевтически приемлемый буфер, где буфер представляет собой гистидиновый буфер, где необязательно гистидиновый буфер имеет концентрацию приблизительно 25 мМ, необязательно содержащий любое одно или несколько из следующего:

от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80;

от 100 мМ до 400 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации; и

pH составляет от 4,5 до 5,5.

[0074] Некоторые варианты осуществления относятся к водному фармацевтическому составу, содержащему:

(a) выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллами Aβ человека, в концентрации от 80 мг/мл до 300 мг/мл,

(b) от 100 мМ до 400 мМ аргинина,

(c) от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

(d) фармацевтически приемлемый буфер,

где фармацевтический состав характеризуется рН, находящимся в диапазоне от 4,5 до 5,5, и

где антитело или его фрагмент содержат: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

и где аргинин представляет собой аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинацию.

[0075] Концентрация антитела

[0076] В случае любого из водных фармацевтических составов, описанных в данном документе, антитело может присутствовать в нижеследующих концентрациях.

[0077] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 100 мг/мл или больше. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 100 мг/мл.

[0078] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 200 мг/мл или больше. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 200 мг/мл.

[0079] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 80 мг/мл до 300 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 80 мг/мл до 240 мг/мл.

[0080] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 100 мг/мл до 200 мг/мл.

[0081] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 80 мг/мл до 300 мг/мл, от 85 мг/мл до 275 мг/мл, от 90 мг/мл до 250 мг/мл, от 95 мг/мл до 225 мг/мл, от 100 до 200 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, находящейся в диапазоне от 90 мг/мл до 220 мг/мл, от 100 мг/мл до 210 мг/мл или от 110 мг/мл до 200 мг/мл.

[0082] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 110 мг/мл, 120 мг/мл, 180 мг/мл, 190 мг/мл, 200 мг/мл, 210 мг/мл, 220 мг/мл, 230 мг/мл, 240 мг/мл, 250 мг/мл, 260 мг/мл, 270 мг/мл, 280 мг/мл, 290 мг/мл или 300 мг/мл.

[0083] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 100 мг/мл.

[0084] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 200 мг/мл.

[0085] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент представляют собой BAN2401.

[0086] Аргинин

[0087] В случае любого из водных фармацевтических составов, описанных в данном документе, состав может содержать аргинин, как указано ниже.

[0088] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит аргинин. В некоторых вариантах осуществления аргинин представляет собой аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинацию.

[0089] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина находится в диапазоне от приблизительно 100 мМ до приблизительно 400 мМ.

[0090] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина находится в диапазоне от 100 мМ до 400 мМ, от 110 мМ до 380 мМ, от 120 мМ до 360 мМ, от 125 мМ до 350 мМ, от 100 мМ до 200 мМ, от 125 мМ до 200 мМ или от 150 мМ до 200 мМ. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина находится в диапазоне от 150 мМ до 250 мМ, от 160 мМ до 240 мМ, от 170 мМ до 230 мМ, от 180 мМ до 220 мМ, от 190 мМ до 210 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации.

[0091] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина составляет 125 мМ.

[0092] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина составляет 200 мМ.

[0093] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина находится в диапазоне от 200 мМ до 400 мМ, от 210 мМ до 390 мМ, от 220 мМ до 380 мМ, от 230 мМ до 370 мМ, от 240 мМ до 360 мМ, от 240 мМ до 350 мМ или от 250 мМ до 350 мМ.

[0094] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация аргинина составляет 350 мМ.

[0095] Полисорбат 80 (PS80)

[0096] В случае любого из водных фармацевтических составов, описанных в данном документе, состав может содержать полисорбат 80, как указано ниже.

[0097] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация полисорбата 80 находится в диапазоне от приблизительно 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об., от 0,01% вес/об. до 0,08% вес/об., от 0,02% вес/об. до 0,08% вес/об., от 0,03% вес/об. до 0,07% вес/об. или от 0,04% вес/об. до 0,06% вес/об.

[0098] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава полисорбат 80 присутствует в концентрации, составляющей 0,01% вес/об., 0,02% вес/об., 0,03% вес/об., 0,04% вес/об., 0,05% вес/об., 0,06% вес/об., 0,07% вес/об. или 0,08% вес/об.

[0099] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава полисорбат 80 присутствует в концентрации, составляющей 0,02% вес/об.

[00100] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава полисорбат 80 присутствует в концентрации, составляющей 0,05% вес/об.

[00101] Буфер

[00102] В случае любого из водных фармацевтических составов, описанных в данном документе, состав может содержать фармацевтически приемлемый буфер, как указано ниже.

[00103] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава фармацевтически приемлемый буфер представляет собой цитратный буфер.

[00104] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава цитратный буфер присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ.

[00105] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация цитратного буфера находится в диапазоне от 10 мМ до 100 мМ, от 10 мМ до 90 мМ, от 15 мМ до 85 мМ, от 20 мМ до 80 мМ, от 25 мМ до 75 мМ, от 30 мМ до 70 мМ, от 30 мМ до 60 мМ или от 30 мМ до 50 мМ.

[00106] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава цитратный буфер присутствует в концентрации, составляющей 50 мМ.

[00107] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава фармацевтически приемлемый буфер представляет собой гистидиновый буфер.

[00108] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ.

[00109] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава концентрация гистидинового буфера находится в диапазоне от 10 мМ до 100 мМ, от 12 мМ до 80 мМ, от 14 мМ до 60 мМ или от 15 мМ до 55 мМ, от 15 мМ до 35 мМ или от 15 мМ до 25 мМ.

[00110] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер присутствует в концентрации, составляющей 25 мМ.

[00111] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер присутствует в концентрации, составляющей 50 мМ.

[00112] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер содержит гистидин и моногидрат гидрохлорида гистидина. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер содержит гистидин и моногидрат гидрохлорида гистидина, где гистидин находится в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 до 0,3 мг/мл, а моногидрат гидрохлорида гистидина находится в концентрации, составляющей от приблизительно 4 до 6 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер содержит гистидин и моногидрат гидрохлорида гистидина, где гистидин находится в концентрации, составляющей приблизительно 0,26 мг/мл, а моногидрат гидрохлорида гистидина находится в концентрации, составляющей приблизительно 4,89 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава гистидиновый буфер содержит гистидин и моногидрат гидрохлорида гистидина, где гистидин содержит 0,2-0,3 мг/мл гистидина и от 4,4 до 4,9 мг/мл гидрохлорида гистидина, где необязательно гидрохлорид гистидина представляет собой моногидрат.

[00113] pH

[00114] В случае любого из водных фармацевтических составов, описанных в данном документе, состав может содержать pH, как указано ниже.

[00115] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава рН находится в диапазоне от 4,0 до 6,0, от 4,2 до 5,8, от 4,3 до 5,7, от 4,4 до 5,6 или от 4,5 до 5,5.

[00116] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава рН составляет 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 или 5,5.

[00117] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава рН составляет от 4,5 до 5,5.

[00118] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава рН составляет 5,0.

[00119] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава фармацевтический состав пригоден для внутривенной инъекции.

[00120] В некоторых вариантах осуществления фармацевтического состава фармацевтический состав пригоден для подкожной инъекции.

[00121] В некоторых вариантах осуществления водного фармацевтического состава фармацевтический состав содержит метионин.

[00122] В некоторых вариантах осуществления раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 80 мг/мл до 240 мг/мл BAN2401,

(b) от 140 мМ до 260 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

(d) от 15 мМ до 35 мМ гистидинового буфера,

где фармацевтический состав характеризуется рН, находящимся в диапазоне от 4,5 до 5,5.

[00123] В некоторых вариантах осуществления раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 80 мг/мл до 240 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

(b) от 140 мМ до 260 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

(d) от 15 мМ до 35 мМ гистидинового буфера,

[00124] В некоторых вариантах осуществления раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 80 мг/мл до 240 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12,

(b) от 140 мМ до 260 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

(d) от 15 мМ до 35 мМ гистидинового буфера,

[00125] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 80 мг/мл до 120 мг/мл BAN2401,

(b) от 240 мМ до 360 мМ аргинина,

(c) от 0,03% вес/об. до 0,08% вес/об. полисорбата 80 и

(d) от 30 мМ до 70 мМ цитратного буфера,

где фармацевтический состав характеризуется рН, находящимся в диапазоне от 4,5 до 5,5, и где аргинин представляет собой аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинацию.

[00126] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 80 мг/мл до 120 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

(b) от 240 мМ до 360 мМ аргинина,

(d) от 30 мМ до 70 мМ цитратного буфера,

[00127] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 80 мг/мл до 120 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12,

(b) от 240 мМ до 360 мМ аргинина,

(d) от 30 мМ до 70 мМ цитратного буфера,

[00128] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 100 мг/мл BAN2401,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

[00129] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 100 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

[00130] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 100 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

[00131] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 200 мг/мл BAN2401,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

[00132] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 200 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

[00133] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 200 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

[00134] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) 100 мг/мл BAN2401,

(b) 350 мМ аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 50 мМ цитратного буфера,

[00135] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(b) 350 мМ аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 50 мМ цитратного буфера,

[00136] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(b) 350 мМ аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 50 мМ цитратного буфера,

[00137] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

от 150 мг/мл до 250 мг/мл BAN2401,

от 100 мМ до 150 мМ гидрохлорида аргинина,

от 0,01% вес/об. до 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

от 35 мМ до 65 мМ гистидинового буфера,

[00138] где фармацевтический состав характеризуется рН, находящимся в диапазоне от 4,5 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 150 мг/мл до 250 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

(b) от 100 мМ до 150 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) от 0,01% вес/об. до 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) от 35 мМ до 65 мМ гистидинового буфера,

[00139] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт водный фармацевтический состав, содержащий:

(a) от 150 мг/мл до 250 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12,

(b) от 100 мМ до 150 мМ гидрохлорида аргинина,

(d) от 35 мМ до 65 мМ гистидинового буфера,

[00140] В некоторых вариантах осуществления водный фармацевтический состав характеризуется pH 5,0.

Способ снижения образования агрегатов

[00141] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ снижения образования агрегатов выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, предусматривающий:

(a) обеспечение фармацевтического состава, содержащего выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллами Aβ человека, в концентрации, составляющей 50 мг/мл или больше, где необязательно концентрация составляет от 80 мг/мл до 300 мг/мл, где необязательно концентрация составляет от 100 мг/мл до 200 мг/мл, и

(b) добавление аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации и необязательно обеспечение фармацевтически приемлемого буфера, где буфер необязательно представляет собой гистидиновый буфер, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент содержат (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.

[00142] В некоторых вариантах осуществления способа снижения образования агрегатов рН фармацевтического состава находится в диапазоне от 4,5 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления способа рН фармацевтического состава составляет 5,0.

[00143] В некоторых вариантах осуществления способа снижения образования агрегатов аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинация присутствуют в концентрации, составляющей от 150 мМ до 250 мМ.

[00144] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ снижения фрагментации выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, предусматривающий:

(b) добавление гистидинового буфера и необязательно дополнительное обеспечение аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент содержат (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.

[00145] В некоторых вариантах осуществления способа снижения фрагментации рН фармацевтического состава находится в диапазоне от 4,5 до 5,5. В некоторых вариантах осуществления способа рН фармацевтического состава составляет 5,0.

[00146] В некоторых вариантах осуществления способа снижения фрагментации аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинация присутствуют в концентрации, составляющей от 100 мМ до 400 мМ.

[00147] В некоторых вариантах осуществления способа снижения фрагментации фармацевтический состав дополнительно содержит от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80.

[00148] В некоторых вариантах осуществления способа снижения фрагментации фармацевтический состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый буфер, где буфер представляет собой гистидиновый буфер, где необязательно гистидиновый буфер находится в диапазоне от 10 мМ до 100 мМ, от 12 мМ до 80 мМ, от 14 мМ до 60 мМ, или от 15 мМ до 55 мМ, от 15 мМ до 35 мМ, или от 15 мМ до 25 мМ.

[00149] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ снижения образования агрегатов и/или фрагментации выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, предусматривающий:

(a) обеспечение фармацевтического состава, содержащего выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмента, которые связываются с протофибриллами Aβ человека, в концентрации, составляющей 50 мг/мл или больше, где необязательно концентрация составляет от 80 мг/мл до 300 мг/мл, где необязательно концентрация составляет от 100 мг/мл до 200 мг/мл,

(b) добавление аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации и

(c) обеспечение фармацевтически приемлемого гистидинового буфера, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент содержат (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.

[00150] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ снижения образования агрегатов и/или фрагментации выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, предусматривающий:

(b) обеспечение гистидинового буфера и

(c) обеспечение аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации, где состав характеризуется pH 4,5-5,5, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент содержат (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.

[00151] Также в данном документе предусмотрены следующие варианты осуществления.

[Embodiment 01] Водный фармацевтический состав, содержащий:

a. выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые связываются с протофибриллами Aβ человека, в концентрации, составляющей от 80 мг/мл до 300 мг/мл,

b. от 100 мМ до 400 мМ аргинина,

c. от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

d. фармацевтически приемлемый буфер,

где фармацевтический состав характеризуется рН, находящимся в диапазоне от 4,5 до 5,5,

где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент содержат: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, и

где аргинин представляет собой аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинацию.

[Embodiment 02] Фармацевтический состав согласно пункту 1, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствует в концентрации, составляющей от 100 мг/мл до 200 мг/мл.

[Embodiment 03] Фармацевтический состав согласно пункту 1, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствует в концентрации, составляющей 100 мг/мл.

[Embodiment 04] Фармацевтический состав согласно пункту 1, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент присутствуют в концентрации, составляющей 200 мг/мл.

[Embodiment 05] Фармацевтический состав согласно любому из пунктов 1-4, дополнительно содержащий метионин.

[Embodiment 06] Фармацевтический состав согласно любому из пунктов 1-5, где фармацевтически приемлемый буфер представляет собой цитратный буфер или гистидиновый буфер.

[Embodiment 07] Фармацевтический состав согласно любому из пунктов 1-6, содержащий 10-100 мМ цитратного буфера или 10-100 мМ гистидинового буфера.

[Embodiment 08] Фармацевтический состав согласно любому из пунктов 1-7, содержащий 125-350 мМ аргинина.

[Embodiment 09] Фармацевтический состав согласно любому из пунктов 1-8, содержащий 200 мМ аргинина, где аргинин представляет собой гидрохлорид аргинина.

[Embodiment 10] Фармацевтический состав согласно любому из пунктов 1-9, содержащий 200 мМ аргинина, где аргинин представляет собой гидрохлорид аргинина, и 25 мМ гистидинового буфера.

[Embodiment 11] Водный фармацевтический состав, содержащий:

a. от 80 мг/мл до 240 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

b. от 140 мМ до 260 мМ гидрохлорида аргинина,

c. от 0,02% вес/об. до 0,08% вес/об. полисорбата 80 и

d. от 15 мМ до 35 мМ гистидинового буфера,

[Embodiment 12] Водный фармацевтический состав, содержащий:

a. от 80 мг/мл до 120 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2,

b. от 240 мМ до 360 мМ аргинина,

c. от 0,02% вес/об. до 0,08% вес/об. полисорбата 80 и

d. от 30 мМ до 50 мМ цитратного буфера,

[Embodiment 13] Способ снижения образования агрегатов выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, предусматривающий:

обеспечение водного фармацевтического состава, содержащего выделенное антитело к протофибриллам Aβ или его фрагмент, которые содержат: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, в концентрации, составляющей от 80 мг/мл до 300 мг/мл, и

добавление аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации в указанный водный фармацевтический состав, где рН фармацевтического состава находится в диапазоне от 4,5 до 5,5.

[Embodiment 14] Способ согласно пункту 13, где аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинация присутствуют в концентрации, составляющей 150-250 мМ.

[Embodiment 15] Способ согласно пункту 14, где аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинация присутствуют в концентрации, составляющей 200 мМ.

[Embodiment 16] Способ согласно любому из пунктов 13-15, где фармацевтический состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый буфер.

[Embodiment 17] Способ согласно пункту 16, где фармацевтически приемлемый буфер представляет собой гистидиновый буфер или цитратный буфер.

[Embodiment 18] Способ снижения фрагментации выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, предусматривающий:

добавление гистидинового буфера в указанную водную фармацевтическую композицию, где рН фармацевтического состава находится в диапазоне от 4,5 до 5,5.

[Embodiment 19] Способ согласно пункту 18, предусматривающий 15-35 мМ гистидинового буфера.

[Embodiment 20] Способ согласно любому из пунктов 13-19, где фармацевтический состав дополнительно содержит от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80.

[Embodiment 21] Водный фармацевтический состав, содержащий:

от 80 мг/мл до 240 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ или его фрагмента, содержащих: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

от 140 мМ до 260 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации;

от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

от 15 мМ до 35 мМ гистидинового буфера или от 30 мМ до 50 мМ цитратного буфера,

[Embodiment 22] Фармацевтический состав согласно варианту осуществления 21, содержащий 100 мг/мл антитела.

[Embodiment 23] Фармацевтический состав согласно варианту осуществления 21, содержащий 200 мг/мл антитела.

[Embodiment 24] Фармацевтический состав согласно варианту осуществления 21, содержащий от 90 мг/мл до 220 мг/мл, от 100 мг/мл до 210 мг/мл или от 110 мг/мл до 200 мг/мл антитела.

[Embodiment 25] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-24, содержащий гистидиновый буфер, где гистидиновый буфер содержит от 15 мМ до 30 мМ, от 15 мМ до 25 мМ или от 20 мМ до 30 мМ гистидина.

[Embodiment 26] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-25, содержащий гистидиновый буфер, где гистидиновый буфер содержит 0,2-0,3 мг/мл гистидина и 4,4-4,9 мг/мл гидрохлорида гистидина, где необязательно гидрохлорид гистидина представляет собой моногидрат.

[Embodiment 27] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-26, содержащий от 150 мМ до 250 мМ, от 160 мМ до 240 мМ, от 170 мМ до 230 мМ, от 180 мМ до 220 мМ, от 190 мМ до 210 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации.

[Embodiment 28] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-27, содержащий от 0,02% вес/об. до 0,05% или от 0,04% вес/об. до 0,04% вес/об. полисорбата 80.

[Embodiment 29] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-28, содержащий цитратный буфер.

[Embodiment 30] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-29, содержащий гистидиновый буфер.

[Embodiment 31] Фармацевтический состав согласно любому из вариантов осуществления 21-30, дополнительно содержащий метионин.

[Embodiment 32] Водный фармацевтический состав, содержащий:

от 100 мг/мл до 200 мг/мл антитела, содержащего: (i) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2;

200 мМ гидрохлорида аргинина;

0,05% вес/об. полисорбата 80 и

25 мМ гистидинового буфера,

[Embodiment 33] Фармацевтический состав согласно варианту осуществления 32, содержащий 100 мг/мл антитела.

[Embodiment 34] Фармацевтический состав согласно варианту осуществления 32, содержащий 200 мг/мл антитела.

[Embodiment 35] Способ снижения образования агрегатов и/или фрагментации антитела, предусматривающий:

добавление 1) аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации или 2) гистидинового буфера в указанную водную фармацевтическую композицию.

[Embodiment 36] Способ согласно варианту осуществления 35, где рН фармацевтического состава находится в диапазоне от 4,5 до 5,5.

[Embodiment 37] Способ согласно варианту осуществления 35, где аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинация присутствуют в концентрации, составляющей 150-250 мМ.

[Embodiment 38] Способ согласно варианту осуществления 37, где аргинин, гидрохлорид аргинина или их комбинация присутствуют в концентрации, составляющей 200 мМ.

[Embodiment 39] Способ согласно варианту осуществления 38, предусматривающий 15-25 мМ гистидинового буфера.

[Embodiment 40] Способ согласно любому из вариантов осуществления 35-39, где фармацевтический состав дополнительно содержит от 0,01% вес/об. до 0,1% вес/об. полисорбата 80.

[Embodiment 41] Способ согласно любому из вариантов осуществления 35-40, где фармацевтический состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый буфер.

[Embodiment 42] Способ согласно варианту осуществления 41, где фармацевтически приемлемый буфер представляет собой гистидиновый буфер или цитратный буфер.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Исследование концентрации белка

[00152] Получали образцы с тремя концентрациями белка (10, 100, 200 мг/мл) и проверяли их в исследовании концентрации. Материал с концентрацией 10 мг/мл представлял собой очищенную лекарственную субстанцию BAN2401 (PDS), а материалы с концентрацией 100 и 200 мг/мл получали из PDS BAN2401 с применением центрифужных фильтров Amicon Ultra-15. Все образцы находились в одном и том же рецептурном буфере (25 мМ цитрата натрия, 125 мМ хлорида натрия, pH 5,7), за исключением того, что каждый из них имел отличающийся уровень PS80. Процентные значения PS80 в образцах с концентрацией 10, 100, 200 мг/мл составляли 0,02%, 0,16% и 0,32% соответственно. Все образцы фильтровали через 0,2-мкм фильтр и разделяли на аликвоты в стерильные полипропиленовые (PP) пробирки для тестирования стабильности. (Примечание: способ удаления PS80 был недоступен на момент проведения исследования концентрации.)

[00153] Стабильность образца оценивали при двух температурах (5 и 25°C) в течение 3 месяцев с использованием нативной HPLC-SEC, pH и DLS. В отношении образцов, полученных в момент времени T=0, проводили дополнительные анализы определения характеристик, такие как проверка содержания PS80. Подробности в отношении тестирования образцов представлены в таблице 1.

Таблица 1. График тестирования (исследование концентрации)
Момент времени	T=0	T=1 мес.	T=2 мес.	T=3 мес.
Температура	N/A	5°C	5°C	5°C
Температура	N/A	25°C	25°C	25°C
Число образцов	3	6	6	6
Тестирование	Нативная SEC pH DLS	Нативная SEC pH DLS	Нативная SEC pH DLS	Нативная SEC pH DLS

[00154] pH измеряли с применением рН-метра с микрозондом. Перед измерениями проводили калибровку с применением стандартов с pH 4,0 и 7,0.

[00155] Агрегацию и физическое разрушение концентрированного BAN2401 оценивали путем проведения нативной HPLC-SEC в отношении образцах для оценки стабильности, хранившихся при 5 и 25°C.

[00156] (Нативный) HPLC-SEC-анализ проводили с использованием колонки TSK G3000 SW× L с подвижной фазой, представляющей собой 0,2 М фосфата натрия, рН 7,0, при скорости потока, составляющей 1,0 мл/мин. Объемы ввода образца составляли 15, 1,5 или 0,8 мкл для концентраций белка 10, 100 или 200 мг/мл соответственно. Это гарантировало, что в ходе исследования в колонку вводилось примерно 150 мкг белка. Результаты по относительным площадям пиков (%) для мономера, агрегата и фрагмента представлены на фиг. 1-6.

[00157] При обеих температурах (5 и 25°C) более высокие процентные значения и скорость агрегации наблюдали при увеличении концентраций белка. В случае образцов с концентрацией 100 и 200 мг/мл начальные процентные значения агрегата были почти в два раза больше, чем в случае образца с концентрацией 10 мг/мл. Это указывало на то, что процесс концентрирования сам по себе вызывает агрегацию белка. Дополнительная агрегация происходила во время хранения при 5 и 25°С.Средняя скорость агрегации за 3 месяца при 5°C составляла 0,17% в месяц в случае 100 мг/мл и 0,20% в месяц в случае 200 мг/мл. Для сравнения при тех же условиях образец с концентрацией 10 мг/мл проявлял скорость агрегации всего лишь 0,07% в месяц. Подводя итог, оказалось, что BAN2401 в концентрации 100 мг/мл или выше не проявляло физическую стабильность в составе.

[00158] Концентрацию белка оценивали с помощью УФ путем измерения поглощения при 280 и 320 нм на спектрофотометре Beckman DU-800. Образцы разводили в 500 раз и готовили в двух повторностях. Концентрацию белка рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции ε, составляющего 1,32, по следующей формуле:

концентрация=(A280-A320)/ε x коэффициент разбавления.

[00159] Концентрацию белка измеряли с помощью спектрофотометра в УФ и видимом спектрах. Результаты представлены в таблице 2. В целом, при обеих температурах концентрации оставались неизменными в течение 3 месяцев.

Таблица 2. Результаты по концентрации белка (исследования концентрации)
ID образца	Концентрация белка (мг/мл)
	T=0	T=1 мес.		T=2 мес.		T=3 мес.
	T=0	5°C	25°C	5°C	25°C	5°C	25°C
10 мг/мл	10,6	9,93	9,93	9,9	10,0	10,11	10,15
100 мг/мл	110,3	110,1	114,1	103,4	104,2	106,6	106,4
200 мг/мл	210,8	197,2	224,5	207,4	205,4	205,3	205,8

Пример 2. Скрининговое исследование pH

[00160] Оценивали стабильность BAN2401 в концентрации 200 мг/мл при пяти различных значениях pH. Для получения образцов PDS BAN2401 с удаленным PS80 концентрировали и подвергали диафильтрации в буфер, содержащий 50 мМ цитрата натрия, 100 мМ хлорида натрия, рН 4,5. Окончательную корректировку концентрации проводили посредством разведения с достижением концентрации, составляющей 200 мг/мл белка и 0,02% PS80. Полученный материал разделяли на 5 аликвот; четыре аликвоты титровали с помощью 10 н. раствора гидроксида натрия с получением образцов с различным рН (т.е. рН 5,0, 5,5, 6,0 и 6,5). Полученные образцы фильтровали через 0,2-мкм фильтр и дополнительно разделяли на аликвоты в стерильные полипропиленовые (PP) пробирки для оценки стабильности.

[00161] Стабильность образцов оценивали на протяжении 3 месяцев при двух температурах (5 и 25°C) с использованием нативной HPLC-SEC, pH и DLS. Дополнительно для момента времени 1 месяц проводили исследование с перемешиванием, при котором подгруппу образцов, хранившихся при 5°C, перемешивали горизонтально со скоростью 250 об/мин в течение 3 дней в термостате при 25°C. Подробности в отношении тестирования образцов представлены в таблице 3.

Таблица 3. График тестирования (исследование pH)
Момент времени	T=0	T=1 месяц	T=2 месяца	T=3 месяца
Температура	n/a	5°C	5°C	5°C
Температура	n/a	25°C	25°C	25°C
Перемешивание	n/a	Перемешивание	Не предусмотрено	Не предусмотрено
Число образцов	5	15	10	10
Тестирование	Нативная SEC pH DLS DSC	Нативная SEC pH DLS	Нативная SEC pH DLS	Нативная SEC pH DLS

[00162] SEC-HPLC-анализ проводили с использованием колонки TSK G3000 SW× L с подвижной фазой, представляющей собой 0,2 М фосфата натрия, рН 7,0, при скорости потока, составляющей 1,0 мл/мин. Объемы ввода образца составляли 15, 1,5 или 0,8 мкл для концентраций белка 10, 100 или 200 мг/мл соответственно. Это гарантировало, что в ходе исследования в колонку вводилось примерно 150 мкг белка. Регистрировали результаты по относительным площадям пиков (%) для мономера, агрегата и фрагмента.

[00163] Агрегацию и физическое разрушение концентрированного BAN2401 оценивали путем проведения нативной HPLC-SEC в отношении образцах для оценки стабильности, хранившихся при 5 и 25°C. Результаты представлены на фиг. 7-12. BAN2401 оказалось более стабильным при более низком pH при обеих температурах (5 и 25°C). С самого начала составы с рН 4,5 и 5,0 проявляли низкие процентные значения агрегатов и характеризовались более медленным увеличением образования агрегатов при скорости ~0,07% в месяц при 5°C. Кроме агрегации также анализировали фрагментацию белка. Результаты позволяли предположить, что фрагментация BAN2401 была более выраженной в составах на основе BAN2401 с более низким pH. Исходя из данных фактов, составы на основе BAN2401 с pH 5,0 считались наиболее стабильными (т.е. они проявляли меньшую агрегацию и/или физическое разрушение BAN2401 по сравнению с другими составами при других значениях pH).

Пример 3. Скрининговое исследование вспомогательных веществ

[00164] В данном исследовании подвергали скринингу двенадцать вспомогательных веществ. Для получения образцов с BAN2401 в концентрации 200 мг/мл BAN2401 с удаленным PS80 концентрировали путем стадии TFF с последующей стадией диафильтрации с основным буфером (50 мМ цитрата, 0,02% PS80, pH 6,0). Концентрированный материал разделяли на аликвоты в количестве двадцать четыре части. В каждую часть вносили исходный раствор, содержащий определенное вспомогательное вещество. Для большинства вспомогательных веществ проверяли две концентрации, за исключением хлорида натрия и аскорбиновой кислоты, для которых получали образцы с тремя и одним уровнем концентрации соответственно. Перечень применяемых вспомогательных веществ и их концентрации представлены в таблице 4.

Таблица 4. Перечень вспомогательных веществ и соответствующих концентраций
Вспомогательное вещество	Концентрация (№состава)
Отсутствует	Контрольный образец (F0) содержал белок в основном буфере без добавления какого-либо вспомогательного вещества.
Сахароза	1% (F1), 6% (F2)
Трегалоза	0,5% (F3), 3,5% (F4)
Маннит	0,5% (F5), 1,8% (F6)
Пролин	50 мМ (F9), 400 мМ (F10)
Глицин	50 мМ (F11), 400 мМ (F12)
Аргинин	25 мМ (F13), 160 мМ (F14)
NaCl	50 мМ (F16), 150 мМ (F17), 500 мМ (F18)
PS80	0,05% об./об. (F19), 0,1% об./об. (F20)
PEG400	1% (F21), 6% (F22)
Декстран, LMW	1% (F23), 5% (F24)
Аскорбиновая кислота	50 мМ (F15)
Сорбит	1% (F7), 6% (F8)

[00165] Все образцы, в том числе контроль (т.е. образец в основном буфере без вспомогательного вещества), фильтровали через 0,2-мкм фильтр и затем в асептических условиях разливали в шприцы BD с применением ручного укупорочного инструмента. Контрольные образцы также разливали в стеклянные флаконы. Флаконы и шприцы BD помещали в 5 и 25°C. Стабильность образца оценивали в течение 2 месяцев с помощью нативной HPLC-SEC и рН.

[00166] Образцы для скринингового исследования вспомогательных веществ получали в неоптимальных буферных условиях (50 мМ цитрата, 0,02% PS80, pH 6,0) с целью усиления положительных эффектов вспомогательных веществ в предотвращении образования агрегатов. Профиль стабильности (агрегации) каждого состава на протяжении 2 месяцев при 25°C оценивали путем проведения нативной HPLC-SEC.

[00167] Как показано на фиг. 13-15, состав, содержащий 160 мМ аргинина (F14), приводил к наиболее низкой скорости агрегации среди составов. Для сравнения, состав, содержащий 160 мМ аргинина, проявлял лишь 1,4% агрегатов при 25°C через 2 месяца, в то время как у контроля (т.е. состава в основном буфере без вспомогательного вещества - F0) показано 2,4% агрегатов в тот же момент времени при тех же условиях.

[00168] Кроме того, составы с аргинином имели наиболее низкие исходные процентные значения агрегатов, что свидетельствовало о том, что аргинин был способен подавлять образование агрегатов во время стадии концентрирования белка. Фрагментация была несколько выше в случае состава, содержащего аргинин (F14), по сравнению с контролем (F0). Однако отличие могло быть в пределах изменчивости результатов анализа.

[00169] Вторым по качеству вспомогательным веществом в данном исследовании был состав с 400 мМ пролина (F10), хотя его эффект на контроль агрегации был не таким же эффективным, как в случае состава, содержащего аргинин (F14).

[00170] Для составов с хлоридом натрия (F16-F18) не наблюдали эффекта в отношении стабильности по сравнению с контрольным образцом. То же наблюдение сделали для составов с PS80 (F19 и F20): никаких эффектов в отношении стабильности не наблюдали при изменении содержания PS80. Для состава с аскорбиновой кислотой (F15) показан сильнейший эффект, заключавшийся в увеличение процентных значений агрегатов и фрагментов от начала исследования.

[00171] pH двух составов, содержащих аргинин (F13 и F14), измеряли, чтобы удостовериться, что присутствие аргинина в составах не вызывало медленного изменения pH с течением времени. Как показано в таблице 4, изменения pH не наблюдали. Также измеряли осмоляльность двух составов. Образцы хранили при температуре -20°С, прежде чем их размораживали в одно и то же время для проведения измерений.

Таблица 5. pH и осмоляльность составов, содержащих аргинин (F13 и F14)
Состав, содержащий аргинин (F13 и F14; момент времени)	pH	мОсм/кг
F13, T=0	образец отсутствовал	образец отсутствовал
F14, T=0	5,86	образец отсутствовал
F13, T=1 месяц	5,97	231
F14, T=1 месяц	5,88	477
F13, T=2 месяца	5,97	230
F14, T=2 месяца	5,89	459

Пример 4. Исследование концентрации аргинина

[00172] Взаимосвязь между концентрацией аргинина и агрегатами в составе исследовали с помощью Design Expert® 7.0. Факторы, выбранные для данного исследования, и уровни, изученные для каждого фактора, представлены в таблице 6 ниже.

Таблица 6. Факторы, исследованные в примере 4
Фактор	Диапазон факторов	Уровни фактора
BAN2401	30-120 мг/мл	30, 53, 75, 98, 120 мг/мл
pH	4,5-6,0	4,5, 4,9, 5,2, 5,6 и 6,0
Аргинин	0-450 мМ	0, 225, 338 и 450 мМ
Полисорбат 80	0-0,1%	0, 0,025, 0,05, 0,075 и 0,1%

[00173] Рандомизацию образцов производили с помощью D-оптимального дизайна в Design Expert® 7.0. Полученный набор образцов содержал 25 точек данных, включая 4 повторности, как показано в таблице 7. Каждый состав получали и оценивали.

Таблица 7. Составы, полученные для примера 4
Запись	BAN2401 (мг/мл)	pH	Аргинин (мМ)	Полисорбат 80 (%)
1	30	5,2	0	0,000
2	30	6,0	0	0,050
3	30	4,5	0	0,100
4	30	4,5	0	0,100
5	30	6,0	225	0,000
6	30	4,5	450	0,000
7	30	4,5	450	0,000
8	30	6,0	450	0,100
9	30	6,0	450	0,100
10	53	5,6	225	0,025
11	53	4,9	338	0,075
12	75	4,5	0	0,000
13	75	4,5	0	0,000
14	75	6,0	0	0,100
15	75	5,2	225	0,000
16	75	6,0	450	0,000
17	75	6,0	450	0,000
18	98	4,5	450	0,100
19	98	5,6	225	0,025
20	120	4,9	338	0,075
21	120	6,0	0	0,000
22	120	4,5	0	0,100
23	120	5,2	225	0,050
24	120	4,5	450	0,000
25	120	6,0	450	0,100

[00174] Связь между концентрацией аргинина и уровнями агрегатов в составах на основе BAN2401 с концентрацией 100 мг/мл при pH 5,0, содержащих 0,02% полисорбата 80, оценивали с помощью Design Expert® 7.0. Результат оценки показан на фиг. 16.

Пример 5. Исследование PS80

[00175] Для оценки изменений качества лекарственного продукта в стрессовых условиях проводили исследования с перемешиванием и замораживанием-оттаиванием с использованием рецептурного буфера для составления (pH 5,0, 350 мМ аргинина, 50 мМ лимонной кислоты). В данном эксперименте исследовали составы с различной концентрацией полисорбата 80 для подтверждения эффекта полисорбата 80 на образование частиц довидимого диапазона в таких стрессовых условиях. Исследованные составы и применяемые стрессовые условия представлены в таблице 8.

Таблица 8. Составы, исследованные в ходе исследований в отношении стресса при перемешивании и замораживании-оттаивании
Состав	Концентрации полисорбата 80	Стрессовое условие
100 мг/мл BAN2401 50 мМ цитратного буфера 350 мМ аргинина pH 5,0	0% 0,02% 0,05% 0,1%	Встряхивание при 250 об/мин в течение 3 дней при 5°C Встряхивание при 250 об/мин в течение 3 дней при температуре окружающей среды Три цикла замораживания-оттаивания (от -20°C до температуры окружающей среды)

[00176] Образцы получали таким же образом, как описано в примере 4. 10% раствор PS80 добавляли до достижения целевой концентрации PS80 в составах, а окончательную корректировку концентрации белка выполняли путем разведения рецептурным буфером. Составы пропускали через 0,2-мкм фильтры и разливали во флаконы по 2 мл с объемом заполнения 1,3 мл. Образцы помещали на орбитальный шейкер в горизонтальной ориентации (во флаконе, лежащем на боку), который затем помещали в холодильник или на лабораторный стол. Образцы встряхивали на 250 об/мин в течение 3 дней. Остальные образцы замораживали, помещая в камеру с температурой -20°C на 2 часа, затем извлекали и оставляли при комнатной температуре на 2 часа для оттаивания. Цикл замораживания-оттаивания повторяли три раза. Образцы из исследований с перемешиванием и замораживанием-оттаиванием оценивали по внешнему виду, уровням агрегатов и фрагментов с помощью SEC-HPLC, а частицы довидимого диапазона оценивали с помощью микропроточной визуализации (MFI).

[00177] Ниже обобщены результаты исследований с перемешиванием и замораживанием-оттаиванием на составах с BAN2401 с различными уровнями PS80.

SEC-HPLC-анализ

[00178] SEC-HPLC-анализ проводили с использованием колонки TSK G3000 SW× L с подвижной фазой, представляющей собой 0,2 М фосфата натрия, рН 7,0, при скорости потока, составляющей 1,0 мл/мин. Объемы ввода образца составляли 5,0 мкл или 2,5 мкл для концентраций белка 50 или 100 мг/мл соответственно. Это гарантировало, что в ходе исследования в колонку вводилось примерно 250 мкг белка. Регистрировали результаты по относительным площадям пиков (%) для мономера, агрегата и фрагмента.

[00179] Что касается уровня агрегатов, у составов с pH 5 с различными концентрациями полисорбата 80, хранившихся при 25°C в течение 3 месяцев, отсутствовало значимое отличие в уровнях агрегатов при увеличении концентрации PS80 от 0% до 0,06% при pH состава, составляющем 5,0. Сделан вывод, что PS80 не оказывал влияния на образование агрегатов, т.е. димеров и тримеров, по результатам измерения с помощью SEC-HPLC во время хранении составов на основе BAN2401 при 25°C.

[00180] Что касается эффекта концентрации полисорбата 80 на уровни фрагментов в составах при рН 5, концентрация полисорбата 80 не оказывала влияния на уровни фрагментов BAN2401.

[00181] Что касается внешнего вида составов после встряхивания при 250 об/мин в течение 3 дней при температуре окружающей среды, образец без PS80 был мутным с осажденным белком, в то время как остальные образцы (0,02%, 0,05% и 0,1% полисорбата 80) представляли собой визуально прозрачные растворы без частиц. Все образцы, которые встряхивали при 250 об/мин в течение 3 дней при 5°C, были прозрачными и не содержали осадка. Все образцы, подвергнутые циклам замораживания/оттаивания, также были прозрачными и не содержали осадка.

[00182] Уровни агрегатов и фрагментов в составах на основе BAN2401, подвергнутых перемешиванию и замораживанию-оттаиванию, представлены в таблице 9. Стрессовым условием, которое вызывало наибольшую нестабильность, было перемешивание в условиях окружающей среды. В данных условиях у образца без PS80 наблюдали наибольшее образование высокомолекулярных соединений и наибольшую потерю мономера. Данный эффект сводился на нет по мере увеличения концентрации PS80.

Таблица 9. Результаты по уровням агрегатов и фрагментов, полученные в ходе исследований с перемешиванием и замораживанием-оттаиванием
Стрессовое условие	Полисорбат 80 (%)	Чистота по HPLC (% площади)
Стрессовое условие	Полисорбат 80 (%)	HMW1 ^(a)	HMW2 ^(a)	Мономер	LMW ^(b)
5°C (контроль)	0	-	0,4	99,4	0,2
	0,02	-	0,5	99,3	0,2
	0,05	-	0,5	99,4	0,2
	0,1	-	0,5	99,4	0,2
Встряхивание при 5°C	0	0,5	0,6	98,7	0,2
	0,02	-	0,5	99,3	0,2
	0,05	-	0,5	99,3	0,2
	0,1	-	0,5	99,3	0,2
Встряхивание при температуре окружающей среды	0^(c)	1,5	1,2	97,1	0,2
	0,02	4,0	0,8	95,1	0,2
	0,05	0,1	0,5	99,2	0,2
	0,1	-	0,5	99,3	0,2
Три цикла замораживания/оттаивания	0	-	0,4	99,4	0,2
	0,02	-	0,5	99,4	0,2
	0,05	-	0,4	99,4	0,2
	0,1	-	0,5	99,4	0,2

^(a)Высокомолекулярные соединения; ^(b)низкомолекулярные соединения; и ^(c)образец был мутным

Анализ частиц довидимого диапазона

[00183] Анализ частиц довидимого диапазона выполняли с использованием микропроточной визуализации (проточный микроскоп DPA4100 и проточная кювета BP-4100-FC-400-UN). Общий объем образца составлял 0,9 мл, а результаты регистрировали для диапазонов 2,25-100 мкм, 5-100 мкм, 10-100 мкм и 25-100 мкм.

[00184] Увеличение количества частиц довидимого диапазона (2-10 мкм) наблюдали в образцах без PS80, подвергнутых встряхиванию и замораживанию-оттаиванию. По мере увеличения концентрации PS80 в составе все большей степени подавлялось образование частиц довидимого диапазона. Данный эффект наблюдали для всех исследованных диапазонов размеров. В составах, содержащих 0,05% и 0,1% полисорбата 80, отсутствовало значимое изменение в содержании частиц довидимого диапазона. Поэтому в качестве оптимальной для состава была выбрана концентрация PS80, составляющая 0,05%.

[00185] Эти данные позволяют предположить, что PS80 не оказывает эффект на образование агрегатов (димеров и тримеров) и фрагментов BAN2401, по результатам измерения с помощью SEC-HPLC. Поэтому на основании результатов исследований с перемешиванием и замораживанием-оттаиванием была выбрана данная концентрация PS80. Концентрация PS80, составляющая 0,05%, была выбрана для предотвращения возможного осаждения во время транспортировки и для сведения к минимуму образования частиц довидимого диапазона.

Пример 6. Получение внутривенных (IV) составов на основе BAN2401

Состав на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл

[00186] Состав на основе BAN2401 с концентрацией с 10 мг/мл для внутривенной инъекции ("состав для инъекции с концентрацией 10 мг/мл") изготавливали с помощью традиционного асептического способа по cGMP для получения стерильного водного состава. Состав для инъекции на основе BAN2401 с концентрацией 10 мг/мл получали из соответствующего состава на основе лекарственной субстанции BAN2401, которые представлены ниже, без добавления каких-либо вспомогательных веществ и разведения. Иллюстративный IV состав, содержащий 10 мг/мл BAN2401, показан в таблице 10.

Таблица 10. Сравнительный IV состав с концентрацией 10 мг/мл, содержащий BAN2401
компонент	композиция
BAN2401	10 мг/мл
Буфер на основе цитрата натрия/лимонной кислоты	25 мМ
Хлорид натрия	125 мМ
Полисорбат 80	0,02% (вес/об.)
Вода для инъекции	QS
pH	5,7

[00187] Профильтрованный раствор лекарственной субстанции BAN2401 в асептических условиях разливали по флаконам, как проиллюстрировано на фиг. 17 (обозначен на фиг. 17 как "состав А"). Объединенную лекарственную субстанцию подвергали стадии фильтрации для снижения бионагрузки через 0,2-мкм фильтр. Окончательную стерилизующую фильтрацию проводили через два последовательных 0,2-мкм фильтра, а также проводили тесты на целостность фильтров до и после фильтрации. Стерильный нерасфасованиый лекарственный продукт в асептических условиях разливали по флаконам. Во время операции разлива точность разлива подтверждали путем измерения веса заливаемого содержимого флакона. Заполненные флаконы закупоривали, а затем герметично закрывали алюминиевым обжимным колпачком. После укупорки обжатием продукт хранили при 5±3°С.

[00188] Флаконы анализировали с использованием Способа 1 (исследование частиц методом затенения) в соответствии с USP 788. Результаты представлены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11. Распределение частиц по размерам (частиц/контейнер) для флаконов с составом для инъекций с концентрацией 10 мг/мл
Партия №	A1	A2	A3		A4	A5		A6	A7	A8	A9		A10	A11	A12
25 мкм	1	1	1	0	1	1	1	1	1	1	5	5	2	1	1
10 мкм	126	145	469	241	469	225	107	617	249	315	215	273	231	191	125
5 мкм	-	-	-	2922	-	-		-	-	-	-		-	-	-
2 мкм	-	-	-	16636	-	-		-	-	-	-		-	-	-

Таблица 12. Распределение частиц по размерам (частиц/мл) для флаконов с составом для инъекций с концентрацией 10 мг/мл
Партия №	A1	A2	A3		A4	A5		A6	A7	A8	A9		A10	A11	A12
25 мкм	0,1	0,1	0,1	0	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,5	0,5	0,2	0,1	0,1
10 мкм	12,6	14,5	46,9	24,1	46,9	22,5	10,7	61,7	24,9	31,5	21,5	27,3	23,1	19,1	12,5
5 мкм	-	-	-	292,2	-	-		-	-	-	-		-	-	-
2 мкм	-	-	-	1664	-	-		-	-	-	-		-	-	-

Пример 7. Получение внутривенных (IV) и подкожных (SC) составов на основе BAN2401

Составы на основе BAN2401 с концентрацией 100 мг/мл

[00189] Состав на основе BAN2401 с концентрацией с 100 мг/мл ("состав для инъекции с концентрацией 100 мг/мл") изготавливали с помощью традиционного асептического способа по cGMP для получения стерильного водного состава. BAN2401 с концентрацией 100 мг/мл получали из соответствующих лекарственных субстанций BAN2401 без добавления каких-либо вспомогательных веществ и разведения (таблица 13).

Таблица 13. Иллюстративный IV состав с концентрацией 100 мг/мл, содержащий BAN2401
компонент	композиция
BAN2401	100 мг/мл
Буфер на основе лимонной кислоты	50 мМ
Аргинин	110 мМ
Гидрохлорид аргинина	240 мМ
Полисорбат 80	0,05% (вес/об.)
Вода для инъекции	QS
pH	5,0

[00190] Профильтрованный раствор лекарственной субстанции BAN2401 (состав для инъекций с концентрацией 100 мг/мл) в асептических условиях разливали по флаконам, как проиллюстрировано на фиг. 18 (обозначен на фиг. 18 как "состав B"). Лекарственную субстанцию подвергали стадии фильтрации для снижения бионагрузки через 0,2-мкм фильтр. Окончательную стерилизующую фильтрацию проводили через два последовательных 0,2-мкм фильтра, а также проводили тесты на целостность фильтров до и после фильтрации. Стерильный нерасфасованиый лекарственный продукт в асептических условиях разливали по флаконам. Во время операции разлива точность разлива подтверждали путем измерения веса заливаемого содержимого флакона. Заполненные флаконы закупоривали, а затем герметично закрывали алюминиевым обжимным колпачком. После укупорки обжатием продукт хранили при 5±3°С.

[00191] Флаконы анализировали с использованием Способа 1 (исследование частиц методом затенения) в соответствии с USP 788. Результаты представлены в таблицах 14 и 15.

Таблица 14. Распределение частиц по размерам (частиц/флакон) для флаконов с составом для инъекций с концентрацией 100 мг/мл
Партия №	B1	B2	B3	B4
25 мкм	0	0	1	0
10 мкм	53	8	9	9
5 мкм	631	72	51	60
2 мкм	1954	321	249	267

Таблица 15. Распределение частиц по размерам (частиц/мл) для флаконов с составом для инъекций с концентрацией 100 мг/мл
Партия №	B1	B2	B3	B4
25 мкм	0	0	0,2	0
10 мкм	10,6	1,6	1,8	1,8
5 мкм	126,2	14,4	10,2	12
2 мкм	390,8	64,2	49,8	53,4

[00192] Изготавливали другой состав для инъекций на основе BAN2401 с концентрацией 100 мг/мл. Во втором иллюстративном составе, содержащем 100 мг/мл BAN2401, можно использовать следующие материалы, которые представлены в таблице 16.

Таблица 16. Другой иллюстративный IV состав с концентрацией 100 мг/мл, содержащий BAN2401
компонент	композиция
BAN2401	100 мг/мл
Гистидин	Всего 25 мМ
Гистидин-HCl	Всего 25 мМ
Аргинин-HCl	200 мМ
Полисорбат 80	0,05% (вес/об.)
Вода для инъекции	QS
pH	5,0±0,4

Состав на основе BAN2401 с концентрацией 200 мг/мл

[00193] В иллюстративном SC составе, содержащем 200 мг/мл BAN2401, можно использовать следующие материалы, которые представлены в таблице 17. Стабильность BAN2401 в данных составах (FSC1, FSC2 и FSC3) оценивали в сочетании с оценкой стабильности материала в трех закрытых контейнерах:

предварительно заполненный шприц (PFS) из стекла Becton-Dickenson Hypak Biotech и пробка

пластиковый PFS West Crystal Zenith и пробка

5-мл стеклянный флакон West и пробка

Таблица 17. Иллюстративный SC состав с концентрацией 200 мг/мл, содержащий BAN2401
компонент	композиция
ID образца	FSC1a	FSC1b	FSC2	FSC3	FSC4
BAN2401	200 мг/мл	200 мг/мл	200 мг/мл	200 мг/мл	200 мг/мл
Гистидин	Всего 50 мМ ¹	Всего 50 мМ ¹	Всего 50 мМ ¹	--	Всего 25 мМ ¹
Гистидин-HCl	Всего 50 мМ ¹	Всего 50 мМ ¹	Всего 50 мМ ¹	--	Всего 25 мМ ¹
Лимонная кислота	--	--	--	50 мМ	--
Аргинин-HCl	125 мМ	125 мМ	125 мМ	125 мМ	200 мМ
Полисорбат 80	0,02% (вес/об.)	0,02% (вес/об.)	0,02% (вес/об.)	0,02% (вес/об.)	0,05% (вес/об.)
Метионин	--	5 мМ	--	--	--
Вода для инъекции	QS	QS	QS	QS	QS
pH	5,0±0,4	5,0±0,4	5,5±0,4	5,0±0,4	5,0±0,4

¹ Общая концентрация в виде гистидина

[00194] BAN2401 при целевой концентрации белка, составляющей 200 мг/мл, получали с помощью TFF, как обобщено ниже. Для получения материала BAN2401 в каждом рецептурном буфере выполняли отдельную операцию TFF, за исключением FSC1a и FSC1b. Для двух указанных составов выполняли одну операцию TFF, и полученный концентрированный материал разделяли на две половинные партии. Небольшое количество простерилизованного фильтрацией материала в каждом конечном рецептурном буфере не разливали в нулевой момент времени, а хранили в замороженном виде при -20°C для разлива в соответствующие закрытые контейнеры для тестирования шприцев.

Получение BAN2401

[00195] Способ концентрирования/диафильтрации белка посредством TFF можно подразделить на 3 стадии:

1. Концентрирование материала до 100-150 мг/мл

2. Диафильтрация (5× ) против рецептурного буфера.

3. Концентрирование до>200 мг/мл

[00196] Стадию концентрирования/диафильтрации проводили с использованием системы Pall Centramate LV с встроенной мембраной с площадью 0,02 м². Материал BAN2401 (собранный в ходе производства партии по GMP перед добавлением PS80) загружали в систему TFF и проводили 10-15-кратное концентрирование (стадия 1). Затем материал подвергали диафильтрации против 5 диаобъемов рецептурного буфера (стадия 2), при этом для отслеживания диафильтрации проводили проверки pH и проводимости пермеата. После диафильтрации материал дополнительно концентрировали до целевой концентрации белка, составляющей 210-250 мг/мл (стадия 3). Ретентат собирали и отбирали образцы для определения концентрации белка.

[00197] При получении данного состава целевая концентрация белка, составляющая 210-250 мг/мл, не была достигнута вследствие высокого давления в системе для TFF. Поэтому целевую концентрацию белка получили за счет использования центрифужных фильтрующих блоков Millipore (30000 MWCO). Для проведения данной стадии концентрирования фильтрующие блоки уравновешивали рецептурным буфером для BAN2401 с последующим центрифугированием материала BAN2401 при 3600 об/мин (~3000 x g) в течение 30-минутных интервалов при 20°C до тех пор, пока, согласно ожиданиям, концентрации белка в ретентате не превысила 200 мг/мл. Ретентат извлекали из фильтрующих блоков и объединяли в пул. После тщательного перемешивания из объединенного в пул ретентата отбирали образцы для измерений концентрации белка.

[00198] После концентрирования белка из пула отбирали образец и разводили его в 500 раз соответствующим рецептурным буфером. Поглощение у разведенного образца при 280 нм и 320 нм измеряли в сравнении с холостым буфером. Окончательную корректировку концентрации белка проводили посредством разведения соответствующим рецептурным буфером. Наконец, к BAN2401 добавляли 10% раствор PS80 для обеспечения 0,02% PS80 в конечном растворе, и раствор белка тщательно перемешивали путем вертикального переворачивания.

[00199] Окончательный составленный материал BAN2401 фильтровали с использованием 0,2-мкм шприцевых фильтров и затем разливали по флаконам или PFS. Данную стадию выполняли в асептических условиях в боксе биологической безопасности. Полученные флаконы или PFS помещали в морозильную камеру при -20°С.Флаконы хранили перевернутыми, а PFS хранили горизонтально, чтобы имитировать условия "наихудшего случая".

Эксперименты по исследованию стабильности на иллюстративных SC составах с концентрацией 200 мг/мл, содержащих BAN2401

[00200] Стабильность образца оценивали при 5°C (3 мес., 6 мес., 9 мес., 12 мес.) и 25°C (1 мес., 3 мес.) с помощью анализа в отношении pH (фиг. 19-21), поглощения при 405 нм (фиг. 22-24) (для обнаружения увеличения пожелтения), эксклюзионной хроматографии (SEC) (фиг. 25-33) и 5°C после этого. См. таблицу 17 для сведений об иллюстративных составах FSC1-FSC4; следует отметить, что на фиг. 19-33 "F1a" относится к FSC1a, "F1b" относится к FSC1b, "F2" относится к FSC2, а "F3" относится к FSC3. Дополнительные анализы для определения характеристик, в том числе определение концентрации белка, дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC), анализ на PS80 и осмоляльность, проводили на образцах в момент времени t=0. Тестирование частиц довидимого диапазона проводили на образцах в моменты времени t=0 и t=6 месяцев. На образцах, хранившихся в течение 1 месяца при 5°C, проводили исследование с 3-дневным перемешиванием. Образцы для исследования с перемешиванием через 1 месяц переносили из хранилища с температурой 5°C в температуру 25°C с перемешиванием в течение 3 дней при 250 об/мин.

[00201] Результаты тестов показали, что для BAN2401 с концентрацией 200 мг/мл во всех составах FSC1a-FSC3 характерны схожие уровни агрегатов и фрагментов после хранения при 2-8°C в течение 12 месяцев. Стабильность BAN2401 при 200 мг/мл оценивали в трех составах FSC1a-FSC3. В целом, стабильность BAN2401 в каждом протестированном составе оказалась схожей, и после хранения при 5°C в течение 12 месяцев независимо от протестированного закрытого контейнера сохранялось более 98,2% мономера. Кроме того, после хранения при 5°С в течение 12 месяцев рН оставался стабильным, при этом заметное повышение пожелтения при А405 отсутствовало.

Концентрация белка (образцы в момент времени T=0)

[00202] Концентрацию белка измеряли с помощью спектрофотометра в УФ и видимом спектрах. Результаты приведены в таблице 18.

Таблица 18. Результаты оценки концентрации белка
ID образца	Концентрация белка (мг/мл)
FSC1a	206
FSC1b	204
FSC2	201
FSC3	189

[00203] Концентрацию белка оценивали путем измерения поглощения при 280 и 320 нм на спектрофотометре Beckman DU-800 с применением 1-см кварцевой кюветы. Образцы разводили в 500 раз и готовили в трех повторностях. Концентрацию белка рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции ε, составляющего 1,32, по следующей формуле:

Полисорбат 80 (образцы в момент времени T=0)

[00204] Содержание PS80 в образцах измеряли путем количественной оценки олеиновой кислоты. Результаты представлены в таблице 19.

ID образца	Полисорбат 80 (%)
FSC1a	0,016
FSC1b	0,022
FSC2	0,019
FSC3	0,019

Таблица 19. Результаты оценки полисорбата 80

[00205] Измерение проводили путем количественной оценки олеиновой кислоты, продукта гидролиза PS80. При основном гидролизе PS80 высвобождает олеиновую кислоту в молярном соотношении 1:1. Затем олеиновую кислоту можно отделить от других продуктов гидролиза PS80 и матриц с использованием обращенно-фазовой HPLC. Олеиновую кислоту отслеживали без дериватизации с использованием поглощения при 195 нм [J. Chromatography B, 878 (2010) 1865- 1870]. В условиях эксперимента образцы смешивали с гидроксидом натрия для выделения олеиновой кислоты, которую впоследствии экстрагировали ацетонитрилом. Экстракт разводили раствором фосфата калия и образец объемом 100 мкл вводили в колонку Waters Symmetry C18. Разделение выполняли с использованием изократического элюирования, содержащего 80% органической фазы А (ацетонитрил) и 20% водной фазы В (20 мМ одноосновного фосфата калия, рН 2,8). Концентрацию PS80 в образце рассчитывали на основании площади пика с использованием стандартной кривой.

Осмоляльность (образцы в момент времени T=0)

[00206] Осмоляльность образцов определяли с использованием устройства для определения осмоляльности по точке замерзания. Результаты представлены в таблице 20.

Таблица 20. Результаты оценки осмоляльности
ID образца	Осмоляльность (мОсмоль/кг H₂O)
FSC1a	294
FSC1b	309
FSC2	297
FSC3	327

[00207] Осмоляльность измеряли с использованием устройства для определения осмоляльности по точке замерзания Precision Systems Osmette III. Образцы разводили в 3 раза с помощью WFI и разведенные образцы объемом 10 мкл отбирали и загружали в прибор с использованием пипетки прибора для измерения осмоляльности. Полученные измерения осмоляльности корректировали с учетом разведения образца.

Частицы довидимого диапазона

[00208] Анализ частиц довидимого диапазона проводили с использованием прибора Fluid Technologies FlowCarn. Результаты для момента времени T=0 приведены в таблице 21. По всей видимости при хранении материала при температуре 5°C наблюдали увеличение общей концентрации частиц и числа частиц размером более 10 мкм с течением времени. Степень повышения изменения была небольшой и располагалась в следующем порядке: FSC1a<FSC1b<FSC2<FSC3.

Таблица 21. Результаты оценки частиц довидимого диапазона

ID образца	Частицы/мл, всего	Частицы/мл, ≥10 мкм	Частицы/мл, ≥ 25 мкм
FSC1a	1,2 ×10 ⁴	9	0
FSC1b	2,6 × 10 ⁴	0	0
FSC2	2,8 × 10 ⁴	18	0
FSC3	3,9 × 10⁴	63	0

[00209] Анализ частиц довидимого диапазона выполняли с использованием Fluid Imaging Technologies FlowCam с 20× объективом и 50-мкм проточной кюветой. Перед прогоном образцов BAN2401 проточную кювету промывали с помощью деионизированной H₂O и проводили измерение на деионизированной H₂O, чтобы убедиться в чистоте проточной кюветы. Если общее число частиц, подсчитанное на 0,2 мл деионизированной H₂O, было 2, проточную кювету считали готовой к использованию. Образцы уравновешивали до комнатной температуры, затем разводили в 20 раз деионизированной водой. Разведенные образцы в двух повторностях анализировали с использованием объема образца 0,2 мл и скорости потока образца 0,02 мл/мин. Частота автосъемки составляла 14, что давало эффективность 19,6% и время цикла 10 минут.Полученные концентрации частиц корректировали с учетом разведения образца.

pH

[00210] pH каждого состава отслеживали на протяжении всего тестирования стабильности. Как показано на фиг. 19-21, ни в одном из протестированных условий хранения у образцов не наблюдали явного изменения.

HPLC-SEC

[00211] Анализ методом эксклюзионной хроматографии с высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC-SEC) проводили с использованием колонки TSK G3000 SW× L с подвижной фазой, представляющей собой 0,2 М фосфата натрия, рН 7,0, при скорости потока, составляющей 1,0 мл/мин. Объем ввода образца составлял 0,8 мкл при концентрации белка 200 мг/мл. Это гарантировало, что в ходе исследования в колонку вводилось примерно 150 мкг белка. Представлены результаты по относительным площадям пиков (%) для мономера, агрегата и фрагмента, как показано на фиг. 25-33.

[00212] Физическое разрушение BAN2401 оценивали путем проведения HPLC-SEC на образцах для измерения стабильности, хранившихся при 5 и 25°C. После хранения при 5°C в течение 12 месяцев процент агрегата у 3 составов был схожим и составлял примерно 1,1%. Процент образования фрагментов для всех протестированных составов находился в диапазоне 0,4-0,5%. Содержание мономера после 12 месяцев хранения при 5°С находилось в диапазоне 98,4-98,6% у всех протестированных составов и закрытых контейнеров. При текущих скоростях разрушения возможно, что BAN2401 во всех протестированных составах мог бы характеризоваться более 97% мономера после хранения при 5°C вплоть до 24 месяцев.

[00213] После хранения при 25°С вплоть до 3 месяцев образование фрагментов через 3 месяца находилось в диапазоне 0,4-0,8%. Содержание мономера было немного выше 98% у всех составов, за исключением FSC3, который характеризовался содержанием мономера чуть менее 98% после 3 месяцев при 25°C.

Пример 8. Выбор концентраций белка, аргинина и полисорбата 80

Получение образцов

[00214] Каждый состав-кандидат (F1-F12) получали следующим образом. Промежуточный продукт из процесса получения лекарственной субстанции (DS) концентрировали и уравновешивали соответствующими рецептурными буферами (таблица 22) с помощью центрифужных фильтрующих блоков. После концентрирования и уравновешивания добавляли PS80, растворенный в рецептурном буфере, с обеспечением предварительно определенных концентраций, и концентрации белка корректировали до конечной концентрации. Каждый состав-кандидат разливали по флаконам с объемом заполнения 0,5 мл. Составы-кандидаты (F1-F12) представлены в таблице 22. Состав F0 оценивали в качестве контроля.

Таблица 22. Состав (F0) и составы-кандидаты F1-F12
№состава	BAN2401	Буфер		Стабилизатор (аргинин)		Полисорбат 80		pH	Объем разлива
	мг/ мл	ммоль/л	мг/ мл	ммоль/л	мг/ мл	(вес/об.) %	мг/ мл		мл
F0	100	Цитрат, 50	9,6	350	61,0	0,05	0,5	5,0	5/ 0,5^b
F1	200	Гистидин, 25	3,9	150	26,1	0,05	0,5	5,0	0,5
F2^a	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,05	0,5	5,0	0,5
F3	200	Гистидин, 25	3,9	250	43,6	0,05	0,5	5,0	0,5
F4	200	Гистидин, 25	3,9	300	52,3	0,05	0,5	5,0	0,5
F5	200	Гистидин, 25	3,9	350	61,0	0,05	0,5	5,0	0,5
F6	250	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,05	0,5	5,0	0,5
F7	300	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,05	0,5	5,0	0,5
F8	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0	0	5,0	0,5
F9	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,02	0,2	5,0	0,5
F10^a	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,05	0,5	5,0	0,5
F11	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,08	0,8	5,0	0,5
F12	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,10	1,0	5,0	0,5
a: F2 и F10 представляют собой одинаковые составы, полученные для разных исследований. b: При выборе концентрации полисорбата 80 раствор лекарственного средства отбирали из лекарственного продукта и доливали 0,5 мл для выравнивания объема заполнения и системы закрытого контейнера.

Протокол исследования стабильности

[00215] Протоколы исследования стабильности представлены в таблице 23, таблице 24 и таблице 25. После извлечения из хранилища флаконы хранили при 5°C до тестирования. Условия хранения были следующими:

Условие длительного испытания: хранили при 5°C±3°C в вертикальном положении

Условие ускоренного испытания: хранили при 25°C±2°C, 60%RH±5%RH в вертикальном положении

Стрессовое условие (замораживание-оттаивание): замораживали при -30°C и оттаивали при комнатной температуре в вертикальном положении.

Стрессовое условие (перемешивание): 5°С, в лежачем положении, горизонтально, при 250 об/мин на шейкере с возвратно-поступательным движением платформы с амплитудой встряхивания 50 мм.

Таблица 23. Протокол исследования стабильности (условие при длительном и ускоренном испытании)
	Момент времени тестирования
Предмет тестирования	Начальный момент времени	5°C±3°C, вертикальное положение	25°C±2°C, 60%RH±5%RH, вертикальное положение
Предмет тестирования	Начальный момент времени	3 мес.	1 мес.	3 мес.
Внешний вид	F0-F7	F0-F7	F0-F7	F0-F7
pH	F0-F7	F0-F7	F0-F7	F0-F7
Эксклюзионная HPLC	F0-F7	F0-F7	F0-F7	F0-F7
Ионообменная HPLC	F0-F7	F0-F7	N/A	F0-F7
Полисорбат 80	F0-F7	F0-F7	F0-F7	F0-F7
N/A: не применимо.

Таблица 24. Протокол исследования стабильности (стрессовое условие: F0-F7)
	Момент времени тестирования
Предмет тестирования	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (-30°C⇐комнатная температура)
Предмет тестирования	Начальный момент времени	3 цикла
Внешний вид	F0-F7	F6-F7
pH	F0-F7	F0-F7
Эксклюзионная HPLC	F0-F7	F0-F7
Ионообменная HPLC	F0-F7	F0-F7
Полисорбат 80	F0-F7	N/A
Концентрация белка	F0-F7	N/A
Вязкость	F0-F7	N/A
Осмоляльность	F0-F7	N/A
N/A: не применимо.

Таблица 25. Протокол исследования стабильности (стрессовое условие: F0, F8-F12)
	Момент времени тестирования
Предмет тестирования	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (-30°C⇐комнатная температура)	Перемешивание (5°C, лежачее положение, горизонтально, 250 об/мин)
Предмет тестирования		3 цикла	3 дня
Внешний вид	F0, F8-F12	F0, F8-F12	F0, F8-F12
pH	F0, F8-F12	F0, F8-F12	F0, F8-F12
Концентрация белка	F0, F8-F12	F0, F8-F12	F0, F8-F12
Инородные нерастворимые вещества (видимые частицы)	F0, F8-F12	F0, F8-F12	F0, F8-F12
Эксклюзионная HPLC (SEC)	F0, F8-F12	F0, F8-F12	F0, F8-F12
Полисорбат 80 (PS80)	F0, F9-F12	F0, F9-F12	F0, F9-F12
Микропроточная визуализация (MFI)	F0, F8-F12	F0, F8-F12	F0, F8-F12
N/A: не применимо.

[00216] Поскольку известно, что вязкость раствора в высококонцентрированных растворах белка возрастает экспоненциально, для анализа концентрации белка в каждом составе-кандидате (F1-F5) доводили до 200±10 мг/мл с помощью рецептурного буфера, содержащего 0,05 (вес/об.)% PS80. Остальные составы перед измерением не разводили.

Результаты и обсуждение

Выбор концентрации аргинина

[00217] Для выбора целевой концентрации аргинина в составе оценивали физические свойства и проводили исследования стабильности с замораживанием-оттаиванием, при длительном и ускоренном испытании для составов-кандидатов с различной концентрацией аргинина (150-350 ммоль/л, F1-F5) и сравнивали с составом F0 (см. таблицу 22). Физические свойства и результаты исследования с замораживанием-оттаиванием представлены в таблице 26. Результаты исследования стабильности при длительном и ускоренном испытании представлены в таблице 27 и таблице 28.

Таблица 26. Результаты по физическим свойствам и стабильности с замораживанием-оттаиванием лекарственного продукта BAN2401 (F0-F5)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0 (контроль)		F1 Arg, 150 мМ		F2 Arg, 200 мМ		F3 Arg, 250 мМ		F4 Arg, 300 мМ		F5 Arg, 350 мМ
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)
Внешний вид	Регистрируемый результат	CSYL	NS	CSYL	NS	CSYL	NS	CSYL	NS	CSYL	NS	CSYL	NS
pH	Регистрируемый результат	5,00	5,01	4,89	4,90	4,90	4,90	4,90	4,91	4,90	4,90	4,93	4,92
Эксклюзионная HPLC	Регистрируемый результат	98,8%	98,8%	98,7%	98,7%	98,7%	98,7%	98,8%	98,7%	98,8%	98,8%	98,8%	98,8%
	Мономер	98,8%	98,8%	98,7%	98,7%	98,7%	98,7%	98,8%	98,7%	98,8%	98,8%	98,8%	98,8%
	Агрегат	0,9%	0,9%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%	1,0%
	Фрагмент	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,2%	0,2%
Ионообменная HPLC	Регистрируемый результат	67,2%	67,2%	67,1%	70,6%	70,4%	70,7%	67,6%	67,9%	70,1%	67,3%	70,7%	70,5%
	Главный пик	67,2%	67,2%	67,1%	70,6%	70,4%	70,7%	67,6%	67,9%	70,1%	67,3%	70,7%	70,5%
	Кислотный пик	27,3%	27,1%	24,5%	23,3%	23,2%	23,1%	24,1%	24,2%	23,5%	24,6%	23,1%	23,5%
	Основный пик	5,4%	5,7%	8,4%	6,2%	6,4%	6,2%	8,3%	7,9%	6,3%	8,1%	6,3%	6,1%
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,053%	N/A	0,054%	N/A	0,052%	N/A	0,050%	N/A	0,037%	N/A	0,052%	N/A
Концентрация белка	Регистрируемый результат (мг/мл)	103	N/A	224	N/A	222	N/A	213	N/A	207	N/A	217	N/A
Вязкость^a	Регистрируемый результат (сП)	2,6	N/A	7,3	N/A	7,8	N/A	8,0	N/A	8,1	N/A	8,0	N/A
Вязкость^a	Концентрация белка (мг/мл)	N/A	N/A	204	N/A	210	N/A	203	N/A	200	N/A	199	N/A
Осмоляльность	Регистрируемый результат (мОсм/кг)	506	N/A	367	N/A	455	N/A	533	N/A	615	N/A	691	N/A
мМ: ммоль/л, CSYL: прозрачная слегка желтая жидкость, Arg: аргинин, NS: не планировали. a: Концентрацию белка корректировали перед измерением вязкости (F1-F5).

Физические свойства

[00218] Как показано в таблице 26, значения осмоляльности увеличивались по мере увеличения концентрации аргинина. Для F1, F2 и F3 показаны более низкие значения осмоляльности по сравнению с F4 и F5. Следовательно концентрацию аргинина ограничивали до 250 ммоль/л или меньше. Значения вязкости F1-F5 находились в пределах узкого диапазона (7,3-8,1 сП) и не коррелировали с концентрацией аргинина в пределах 150-350 ммоль/л. Результаты по внешнему виду, рН и концентрации PS80 и белка были практически целевыми.

Исследование стабильности с замораживанием-оттаиванием

[00219] Как показано в таблице 26, не наблюдали никаких значимых изменений по всем предметам тестирования после трех циклов тестирования с замораживанием-оттаиванием.

Исследование стабильности при длительном испытании

[00220] Как показано в таблице 27, не наблюдали никаких значимых изменений по всем предметам тестирования, за исключением эксклюзионной HPLC (SEC), после трехмесячного хранения. Количества агрегатов и фрагментов по данным SEC немного увеличивались в составах-кандидатах F1-F5. Каждое увеличение скорости было схожим с таковым состава F0.

Исследование стабильности при ускоренном испытании

[00221] Как показано в таблице 28, не наблюдали никаких значимых изменений по всем предметам тестирования, за исключением SEC и ионообменной HPLC (IE× ). Хотя, как и ожидалось, количество агрегата по результатам SEC увеличивалось у всех кандидатов (F1-F5, BAN2401 с концентрацией 200 мг/мл) и скорость была выше, чем у состава F0, все кандидаты считались пригодными с учетом результатов при условии длительного испытания и стабильности F0 с длительным сроком хранения. Более высокая концентрация аргинина приводила к несколько более медленному образованию агрегатов, что согласуется с результатами, описанными в примере 4. Количество фрагмента по результатам SEC также увеличивалось у всех кандидатов, но скорость была схожа с таковой у состава F0. Что касается IE× , количество кислотного пика увеличивалось у всех кандидатов, но скорость была схожей с таковой у F0.

Концентрация аргинина

[00222] Как показано в таблице 26, F4 и F5 (при концентрациях аргинина, составляющих 300 и 350 ммоль/л) не считались пригодными с точки зрения осмоляльности. Среди пригодных кандидатов F1, F2 и F3 (при концентрациях аргинина, составляющих 150, 200 и 250 ммоль/л), F1 был наиболее близок к изотоническому. Как показано в таблице 28, составы с более высокими концентрациями аргинина показали более низкую скорость образования агрегатов в исследованиях стабильности при ускоренном испытании, но отличие в скорости было незначимым в оцениваемом диапазоне концентраций аргинина. Принимая во внимание как изотоничность, так и скорость образования агрегатов, 200 ммоль/л была выбрана в качестве целевой концентрации аргинина на основе состава F2.

Выбор концентрации белка

[00223] Для выбора целевой концентрации белка в составе оценивали физические свойства и проводили исследования стабильности с замораживанием-оттаиванием, при длительном и ускоренном испытании для составов-кандидатов с различной концентрацией белка (200-300 ммоль/л, F2, F6, F7) и состава F0. Физические свойства и результаты исследования с замораживанием-оттаиванием представлены в таблице 29. Результаты исследований стабильности при длительном и ускоренном испытании представлены в таблице 27 и таблице 28.

Таблица 29. Результаты по физическим свойствам и стабильности с замораживанием-оттаиванием лекарственного продукта BAN2401 (F0, F6 и F7)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0^a(контроль)		F2^aBAN2401, 200 мг/мл		F6 BAN2401, 250 мг/мл		F7 BAN2401, 300 мг/мл
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)
Внешний вид	Регистрируемый результат	CSYL	NS	CSYL	NS	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL
pH	Регистрируемый результат	5,00	5,01	4,90	4,90	4,88	4,83	4,85	4,86
Эксклюзионная HPLC	Регистрируемый результат	98,8%	98,8%	98,7%	98,7%	98,5%	98,5%	98,5%	98,4%
	Мономер	98,8%	98,8%	98,7%	98,7%	98,5%	98,5%	98,5%	98,4%
	Агрегат	0,9%	0,9%	1,0%	1,0%	1,1%	1,1%	1,2%	1,2%
	Фрагмент	0,3%	0,3%	0,3%	0,3%	0,4%	0,4%	0,4%	0,4%
Ионообменная HPLC	Регистрируемый результат	67,2%	67,2%	70,4%	70,7%	71,1%	71,2%	71,2%	71,4%
	Главный пик	67,2%	67,2%	70,4%	70,7%	71,1%	71,2%	71,2%	71,4%
	Кислотный пик	27,3%	27,1%	23,2%	23,1%	22,7%	22,6%	22,8%	22,5%
	Основный пик	5,4%	5,7%	6,4%	6,2%	6,2%	6,2%	6,0%	6,1%
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.(%))	0,053%	NS	0,052%	NS	0,056%	NS	0,051%	NS
Концентрация белка	Регистрируемый результат (мг/мл)	103	NS	222	NS	242	NS	299	NS
Вязкость	Регистрируемый результат (сП)	2,6	NS	7,8 (210 мг/мл)	NS	21	NS	48	NS
Осмоляльность	Регистрируемый результат (мОсм/кг)	506	NS	455	NS	507	NS	554	NS
CSYL: прозрачная слегка желтая жидкость, NS: не планировали. a: Результаты были такими же, что и в таблице 26.

Физические свойства

[00224] Как показано в таблице 29, F2 и F6 показали более низкие значения осмоляльности по сравнению с F7. Значения вязкости у F2, F6 и F7 составляли 7,8, 21 и 48 сП соответственно. Высокая вязкость свыше 20 сП будет создавать проблемы при изготовлении DS за счет увеличения противодавления в насосе и уменьшения трансмембранного потока во время стадий ультрафильтрации и диафильтрации. Кроме того, раствор с более высокой концентрацией затрудняет процесс разлива DP за счет засорения разливочных головок, что приводит к колебаниям массы разлива. Поскольку сообщается, что требуемая вязкость не превышает 20 сП³, F2 был пригодным. Результаты по внешнему виду, рН и концентрации PS80 и белка были практически целевыми.

Исследование с замораживанием-оттаиванием

[00225] Как показано в таблице 29, не наблюдали никаких значимых изменений по всем протестированным предметам после трех циклов тестирования с замораживанием-оттаиванием.

[00226] Как показано в таблице 27, не наблюдали никаких значимых изменений кроме эксклюзионной HPLC (SEC), после трехмесячного хранения. Количество агрегата по результатам SEC немного увеличивалось в составах-кандидатах F2, F6 и F7, но скорость увеличения была схожа с таковой у F0.

[00227] Как показано в таблице 28, не наблюдали никаких значимых изменений, кроме SEC и ионообменной HPLC (IE× ). Количество агрегата по результатам SEC увеличивалось у всех кандидатов (F2, F6 и F7) со схожими значениями скорости в момент времени три месяца (увеличение на 0,7-0,8%). Таким образом, все кандидаты считались пригодными. Количество фрагмента по результатам SEC также увеличивалось у всех кандидатов, но скорость была схожа с таковой у F0. Что касается IE× , количество кислотного пика по результатам IE× увеличивалась у всех кандидатов, но скорость была схожей с таковой у F0.

Концентрация белка

[00228] Принимая во внимание результаты по осмоляльности и вязкости, показанные в таблице 29, и результаты оценки общей стабильности, показанные в таблице 27 и таблице 28, выбрали концентрацию белка, составляющую 200 мг/мл.

Выбор концентрации PS80

[00229] Для выбора целевой концентрации PS80 в составе проводили исследования с замораживанием-оттаиванием и перемешиванием для составов-кандидатов с различной концентрацией PS80 [0-0,10 (вес/об.) %, F8-F12] и состава F0. Результаты исследования с замораживанием-оттаиванием и перемешиванием представлены в таблице 30 и таблице 31 соответственно.

Таблица 30. Результаты исследования с замораживанием-оттаиванием лекарственного продукта BAN2401 (F0, F8-F12)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0 (контроль)		F8 PS80 0 вес/об.%		F9 PS80 0,02 вес/об.%		F10 PS80 0,05 вес/об.%		F11 PS80 0,08 вес/об.%		F12 PS80 0,10 вес/об.%
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)	Начальный момент времени	Замораживание-оттаивание (3 цикла)
Внешний вид	Регистрируемый результат	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL
pH	Регистрируемый результат	4,98	4,98	4,85	4,86	4,85	4,86	4,85	4,86	4,85	4,86	4,85	4,85
Видимые частицы	Регистрируемый результат	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP
Эксклюзионная HPLC	Регистрируемый результат	98,3%	98,4%	98,0%	98,0%	98,0%	97,9%	98,0%	98,0%	8,0%	98,0%	98,0%	98,0%
	Мономер	98,3%	98,4%	98,0%	98,0%	98,0%	97,9%	98,0%	98,0%	8,0%	98,0%	98,0%	98,0%
	Агрегат	1,0%	1,0%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%
	Фрагмент	0,7%	0,7%	0,9%	0,9%	0,9%	1,1%	0,9%	1,0%	0,9%	0,9%	0,9%	0,9%
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,051%	0,050%	<0,010%	<0,010%	0,020%	0,019%	0,051%	0,050%	0,083%	0,082%	0,106%	0,104%
Концентрация белка	Регистрируемый результат (мг/мл)	105	104	187	187	190	187	190	190	187	189	190	191
MFI	Регистрируемый результат (ед./мл)	1	0	55	4	1	1	0	0	3	5	1	0
	25 мкм	1	0	55	4	1	1	0	0	3	5	1	0
	10-25 мкм	4	11	1065	83	14	11	5	8	3	14	8	5
	5-10 мкм	27	73	1317	287	15	20	8	53	51	56	19	59
	2-5 мкм	150	308	2321	1172	43	80	50	339	174	304	47	358
CSYL: прозрачная слегка желтая жидкость, FVP: без видимых частиц.

Таблица 31. Результаты исследования с перемешиванием лекарственного продукта BAN2401 (F0, F8-F12)


Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0 (контроль)		F8 PS80 0 вес/об.%		F9 PS80 0,02 вес/об.%		F10 PS80 0,05 вес/об.%		F11 PS80 0,08 вес/об.%		F12 PS8 0,10 вес/об.%
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	Перемешивание, 250 об/мин/3 дня	Начальный момент времени	Перемешивание, 250 об/мин/3 дня	Начальный момент времени	Перемешивание, 250 об/мин/3 дня	Начальный момент времени	Перемешивание, 250 об/мин/3 дня	Начальный момент времени	Перемешивание, 250 об/мин/3 дня	Начальный момент времени	Перемешивание, 250 об/мин/3 дня
Внешний вид	Регистрируемый результат	CSYL	CSYL	CSYL	OWL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL	CSYL
pH	Регистрируемый результат	4,98	4,99	4,87	4,89	4,87	4,87	4,87	4,88	4,88	4,87	4,88	4,88
Видимые частицы	Регистрируемый результат	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP
Эксклюзионная HPLC	Регистрируемый результат	98,3%	98,3%	97,8%	95,3%	97,9%	97,9%	98,0%	98,0%	98,0%	98,0%	98,1%	98,0%
	Мономер	98,3%	98,3%	97,8%	95,3%	97,9%	97,9%	98,0%	98,0%	98,0%	98,0%	98,1%	98,0%
	Агрегат	1,0%	1,0%	1,1%	3,8%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%	1,1%
	Фрагмент	0,7%	0,7%	1,1%	0,9%	1,1%	1,0%	0,9%	0,9%	0,9%	0,9%	0,9%	0,9%
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,051%	0,049%	<0,010%	<0,010%	0,019%	0,019%	0,053%	0,054%	0,086%	0,084%	0,107%	0,108%
Концентрация белка	Регистрируемый результат (мг/мл)	105	105	206	195	207	206	206	206	209	207	209	206
MFI	Регистрируемый результат	1	3	24	NT^a	3	1	0		1	0	0	1
	25 мкм	1	3	24	NT^a	3	1	0		1	0	0	1
	10-25 мкм	4	10	555	NT^a	4	5	3	5	3	6	3	6
	5-10 мкм	27	27	1242	NT^a	25	22	18	45	67	34	28	27
	2-5 мкм	150	75	3209	NT^a	62	50	67	176	145	335	182	250
CSYL: прозрачная слегка желтая жидкость, OWL: белая опалесцентная жидкость, FVP: без видимых частиц, NT: не тестировали. a: Результаты не сообщались, поскольку частицы нельзя было надлежащим образом измерить из-за загрязнения пузырьками вследствие недостаточного объема образца.

Исследование с замораживанием-оттаиванием

[00230] Как показано в таблице 30, не наблюдали никаких значимых изменений по всем протестированным предметам после трех циклов тестирования с замораживанием-оттаиванием. У F8 (без PS80) количество частиц по MFI было относительно высоким.

Исследование с перемешивании

[00231] Как показано в таблице 31, составы, содержащие от 0,02 (вес/об.) % до 0,10 (вес/об.) % PS80 (F9-F12), были стабильными после перемешивания. Изменения у F8 (без PS80) наблюдали по внешнему виду, концентрации белка и количеству агрегатов по результатам SEC после перемешивания. Внешний вид изменился с прозрачной слегка желтоватой жидкости на белую опалесцентную жидкость. Концентрация белка слегка снизилась с 206 до 195 мг/мл. Количество агрегатов увеличилось с 1,1% до 3,8%. Поэтому F8 (без PS80) не считался пригодным.

Концентрация PS80

[00232] На основании результатов, представленных в таблице 30 (исследование с замораживанием-оттаиванием) и таблице 31 (исследование с перемешиванием), составы, содержащие от 0,02 (вес/об.) % до 0,10 (вес/об.) % PS80, были стабильными после трех циклов замораживания-оттаивания и перемешивания вплоть до трех дней. Поэтому в качестве целевой выбирали концентрацию PS80, составляющую 0,05% (вес/об.) %.

Заключение

[00233] В заключение необходимо отметить, что в качестве состава на основе BAN2401 для последующих исследований выбирали следующий состав.

Таблица 32. Состав для последующих исследований
№состава	BAN2401	Буфер		Стабилизатор (аргинин)		Полисорбат 80		pH
	мг/мл	Ммоль /л	мг/ мл	ммоль/л	мг/ мл	(вес/об.) %	мг/ мл
F2	200	Гистидин, 25	3,9	200	34,8	0,05	0,5	5,0

Пример 9. Исследование стабильности составов на основе BAN2401 с концентрацией с 200 мг/мл с различным pH

[00234] Для тестирования стабильности составов на основе BAN2401 с концентрацией с 200 мг/мл с различным рН проводили исследование стабильности. Кроме того, тестировали влияние добавления метионина на стабильность лекарственного продукта (DP).

Получение образцов

[00235] Каждый состав-кандидат (таблица 33) получали следующим образом. Составы уравновешивали соответствующим рецептурным буфером с помощью центрифужных фильтрующих блоков. Только в случае получения F20 рецептурный буфер при рН 3,5 применяли до тех пор, пока не получали отфильтрованный раствор с рН 4,0, поскольку вблизи полупроницаемой мембраны протоны отталкиваются концентрированным заряженным белком, что известно как эффект Доннана. После концентрирования и уравновешивания добавляли PS80, растворенный в рецептурном буфере, с обеспечением предварительно определенной концентрации, а затем концентрацию белка корректировали до конечной концентрации. Каждый состав-кандидат разливали по флаконам с объемом заполнения 0,5 мл. Состав F0 (см. таблицу 33) оценивали в качестве контроля.

Таблица 33. Композиция лекарственной субстанции и SC составов-кандидатов
№	BAN2401	Буфер		Стабилизатор		Полисорбат 80		pH ^a	Объем разлива
	мг/ мл	ммоль/л	мг/ мл	ммоль/л	мг/ мл	(вес/об.) %	мг/ мл		мл /флакон
F0	100	Цитрат, 50	9,6	Arg, 350	61,0	0,05	0,5	5,0	5
F13	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200	34,8	0,05	0,5	4,5	0,5
F15	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200	34,8	0,05	0,5	5,0	0,5
F17	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200	34,8	0,05	0,5	5,5	0,5
F18	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200 Met, 10	34,8 1,5	0,05	0,5	5,0	0,5
F20	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200	34,8	0,05	0,5	4,0	0,5
F21^b	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200	34,8	0,05	0,5	5,0	0,5
F22	200	Гистидин, 25	3,9	Arg, 200	34,8	0,05	0,5	6,0	0,5
Arg: аргинин, Met: метионин a: Для корректировки pH в F0 объединяли аргинин и гидрохлорид аргинина, а в F13-F22 добавляли гидрохлорид. b: F21 представляет собой такой же состав, что и F15

Протокол хранения

[00236] Протоколы хранения представлены в таблице 34, таблице 35 и таблице 36. После извлечения из хранилища флаконы хранили при температуре 5°C до начала тестирования. Условия хранения были следующими:

1000 люкс: 25°C±2°C, 60%RH±5%RH, в лежачем положении с воздействием света 1000 люкс

Темнота: 25°C±2°C, 60%RH±5%RH, в лежачем положении без воздействия света за счет покрытия алюминиевой фольгой

[00237] Для подтверждения уровня агрегатов после трехмесячного или более длительного хранения производили дополнительную оценку посредством эксклюзионной HPLC у образцов продолжительного хранения через девять месяцев в случае исследования стабильности при длительном испытании и через три месяца в случае исследования стабильности при ускоренном испытании. Последние образцы тестировали после хранения в холодильнике в течение шести месяцев.

Таблица 34. График отбора образцов для исследования стабильности при длительном испытании (5°C±3°C в вертикальном положении)
	F13, F17			F0, F15, F18			F20, F21, F22
	Начальный момент времени	5°C		Начальный момент времени	5°C		Начальный момент времени	5°C
		2 мес.	9 мес.^a		2 мес.	9 мес.^a		3 мес.
Цвет	×	×	NT	×	×	NT	×	×
Прозрачность	×	×	NT	×	×	NT	×	×
Частицы	×	×	NT	×	×	NT	×	×
pH	×	×	NT	×	×	NT	×	×
Конц. белка	×	×	NT	×	×	NT	×	×
ELISA	×	×	NT	×	×	NT	NT	NT
FcR	×	×	NT	×	×	NT	NT	NT
cSDS-R	×	×	NT	×	×	NT	NT	NT
cSDS-NR	×	×	NT	×	×	NT	NT	NT
SEC	×	×	×	×	×	×	×	×
IE×	×	×	NT	×	×	NT	×	×
Вязкость	×	NT	NT	×	NT	NT	×	NT
Осмоляльность	×	NT	NT	×	NT	NT	×	NT
PS80	×	×	NT	×	×	NT	×	×
MFI	×	×	NT	×	×	NT	×	NT
PMAP-R	NT	NT	NT	×	×	NT	NT	NT
× : проведено, NT: не тестировали Цвет: степень окрашивания жидкостей, прозрачность: прозрачность и степень опалесценции, Конц. белка: концентрация белка, ELISA: ELISA для определения связывания антигена, FcR: анализ связывания (CD32a), cSDS: капиллярный гель-электрофорез в присутствии SDS, R: в восстанавливающих условиях, NR: в невосстанавливающих условиях, SEC: эксклюзионная HPLC, IE× : ионообменная HPLC, PS80: содержание полисорбата 80, MFI: микропроточная визуализация, PMAP: пептидная карта a: Расширенная оценка

Таблица 35. График отбора образцов для исследования стабильности при ускоренном испытании (25°C±2°C, 60%RH±5%RH в вертикальном положении)
Предметы тестирования	F13, F17			F0. F15, F18				F20, F21, F22
	Начальный момент времени	25°C		Начальный момент времени	25°C			Начальный момент времени	25°C
		1 мес., 2 мес.	Расш.		1 мес.	2 мес.	Расш.		1 мес.	3 мес.
Цвет	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
Прозрачность	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
Частицы	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
pH	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
Конц. белка	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
ELISA	×	×	NT	×	×	×	NT	NT	NT	NT
FcR	×	×	NT	×	×	×	NT	NT	NT	NT
cSDS-R	×	×	NT	×	×	×	NT	NT	NT	NT
cSDS-NR	×	×	NT	×	×	×	NT	NT	NT	NT
SEC	×	×	×	×	×	×	×	×	×	×
IE×	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
Вязкость	×	NT	NT	×	NT	NT	NT	×	NT	NT
Осмоляльность	×	NT	NT	×	NT	NT	NT	×	NT	NT
PS80	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	×
MFI	×	×	NT	×	×	×	NT	×	×	NT
PMAP-R	NT	NT	NT	×	NT	×	NT	NT	NT	NT
Расш.: расширенная оценка, хранение в течение 3 мес.при 25°C и в течение 6 мес.при 5°C после взятия образца × : проведено, NT: не тестировали Цвет: степень окрашивания жидкостей, Прозрачность: прозрачность и степень опалесценции, Конц. белка: концентрация белка, ELISA: ELISA для определения связывания антигена, FcR: анализ связывания (CD32a), cSDS: капиллярный гель-электрофорез в присутствии SDS, R: в восстанавливающих условиях, NR: в невосстанавливающих условиях, SEC: эксклюзионная HPLC, IE× : ионообменная HPLC, PS80: содержание полисорбата 80, MFI: микропроточная визуализация, PMAP: пептидная карта

Таблица 36. График отбора образцов для исследования с замораживанием-оттаиванием и исследования фотостабильности
Предметы тестирования	F15				F18
	Начальный момент времени	FT	Темнота	1000 люкс	Начальный момент времени	FT	Темнота	1000 люкс
		3 цикла	7 дней	7 дней		3 цикла	7 дней	7 дней
Цвет	×	×	×	×	×	×	×	×
Прозрачность	×	×	×	×	×	×	×	×
Частицы	×	×	×	×	×	×	×	×
Конц. бел.	×	×	×	×	×	×	×	×
pH	×	×	×	×	×	×	×	×
PS80	×	×	×	×	×	×	×	×
ELISA	×	×	×	×	×	×	×	×
FcR	×	×	×	×	×	×	×	×
cSDS-R	×	×	×	×	×	×	×	×
cSDS-NR	×	×	×	×	×	×	×	×
SEC	×	×	×	×	×	×	×	×
IE×	×	×	×	×	×	×	×	×
PMAP-R	×	NT	×	×	×	NT	×	×
FT: замораживание-оттаивание (замораживали при -30°C и оттаивали при комнатной температуре в вертикальном положении), Темнота: 25°C±2°C, 60%RH±5%RH, в лежачем положении без воздействия света за счет покрытия алюминиевой фольгой, 1000 люкс: 25°C±2°C, 60%RH±5%RH, в лежачем положении с воздействием света 1000 люкс под флуоресцентным светом, × : проведено, Цвет: степень окрашивания жидкостей, Прозрачность: прозрачность и степень опалесценции, MFI: микропроточная визуализация, Конц. бел.: концентрация белка, PS80: содержание полисорбата 80, ELISA: ELISA для определения связывания антигена, FcR: анализ связывания (CD32a), cSDS: капиллярный гель-электрофорез с добавлением SDS, R: в восстанавливающих условиях, NR: в невосстанавливающих условиях, SEC: эксклюзионная HPLC, IE× : ионообменная HPLC, PMAP: пептидная карта

Результаты и обсуждение

[00238] Для составов-кандидатов оценивали физические свойства и проводили исследования при длительном и ускоренном испытании, в том числе оценивали изменение pH (от pH 4,0 до pH 6,0) и добавление метионина. Также проводили исследования с замораживанием-оттаиванием и исследования фотостабильности для оценки эффективности добавления метионина.

Изменение pH

[00239] Как показано в таблице 37, таблицы 38А и 38 В, таблицы 39 и таблицы 40, никаких значимых отличий между составами-кандидатами (F13, F15, F17 и F20-F22) не наблюдали ни по каким предметам тестирования, за исключением эксклюзионной HPLC (SEC). Для состава F20 (т.е. состава с более низким pH 4,0) показано меньшее количество агрегатов по результатам SEC в начальный момент времени. Кроме того, в исследовании стабильности при ускоренном испытании наблюдали несколько более низкую скорость образования агрегатов и более высокую скорость образования фрагментов. Подтверждалось, что результаты для составов с рН 4,5-5,5 являются сопоставимыми.

Таблица 37. Результаты исследования стабильности для составов на основе BAN2401 с pH 4,0-6,0, хранившихся при 5°C±3°C в вертикальном положении
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0 (контроль)		F13 pH 4,5		F15 pH 5,0		F17 pH 5,5		F20 pH 4,0		F21 pH 5,0		F22 pH 6,0
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	5°C/2 мес.	Начальный момент времени	5°C/2 мес.	Начальный момент времени	5°C/2 мес.	Начальный момент времени	5°C/2 мес.	Начальный момент времени	5°C/3 мес.	Начальный момент времени	5°C/3 мес.	Начальный момент времени	5°C/3 мес.
Цвет	Регистрируемый результат	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5
Прозрачность	Регистрируемый результат	≤RS2	≤RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3
Частицы	Регистрируемый результат	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP
pH	Регистрируемый результат	4,95	4,98	4,63	4,64	4,94	4,96	5,68	5,73	4,03	4,05	4,91	4,92	5,90	5,91
Конц. белка	Регистрируемый результат (мг/мл)	104	102	200	201	197	195	204	204	197	195	200	195	207	195
ELISA	Регистрируемый результат	101,3%	102,6%	109,2%	104,5%	102,1%	123,1%	107,0%	125,7%	NT	NT	NT	NT	NT	NT
FcR	Регистрируемый результат	91,7%	93,8%	101,0%	100,4%	108,8%	99,0%	116,6%	103,4%	NT	NT	NT	NT	NT	NT
cSDS-R	Регистрируемый результат	98,3%	97,7%	98,8%	98,2%	98,9%	98,5%	98,8%	98,4%	NT	NT	NT	NT	NT	NT
cSDS-NR	Регистрируемый результат	91,2%	91,9%	91,5%	92,5%	91,2%	92,9%	91,3%	92,6%	NT	NT	NT	NT	NT	NT
SEC	Мономер ≥ 95,0%	98,6%	98,7%	99,2%	99,2%	99,1%	99,1%	98,8%	98,8%	99,3%	99,1%	99,2%	99,0%	98,8%	98,6%
	Агрегат ≤ 5,0%	1,0%	0,9%	0,8%	0,8%	0,9%	0,9%	1,2%	1,2%	0,7%	0,7%	0,8%	1,0%	1,2%	1,4%
	Регистрируемый фрагмент	0,5%	0,4%	<0,1%	<0,1%	<0,1%	<0,1%	<0,1%	<0,1%	0,1%	0,2%	<0,1%	<0,1%	<0,1%	<0,1%
IE×	Главный пик 50%-90%	71,3%	70,8%	77,2%	73,1%	76,7%	72,9%	76,8%	72,8%	76,8%	74,7%	76,7%	75,2%	76,6%	74,8%
	Кислотный	24,4%	25,2%	19,1%	19,5%	19,4%	19,7%	19,4%	19,9%	18,8%	21,6%	18,9%	21,1%	19,1%	21,3%
	Основный	4,2%	4,0%	3,7%	7,4%	3,9%	7,4%	3,8%	7,2%	4,4%	3,6%	4,3%	3,7%	4,3%	3,9%
Вязкость	Регистрируемый результат	2,6	NT	8,1	NT	7,9	NT	10,0	NT	8,0	NT	9,4	NT	11,6	NT
Осмоляльность	Регистрируемый результат	512	NT	416	NT	407	NT	402	NT	420	NT	423	NT	396	NT
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,048%	0,051%	0,044%	0,047%	0,044%	0,047%	0,043%	0,045%	0,052%	0,049%	0,052%	0,052%	0,051%	0,048%
MFI	Регистрируемый результат
	25 мкм	1	5	3	3	7	3	0	0	0	NT	0	NT	0	NT
	10-25 мкм	4	81	99	5	26	26	17	10	10	NT	5	NT	14	NT
	5-10 мкм	27	283	537	67	335	170	214	207	152	NT	5	NT	76	NT
	2-5 мкм	150	1452	980	276	1246	977	1365	1273	698	NT	95	NT	322	NT
BY5: эквивалентен эталонному раствору BY5. RS2: эталонная суспензия II, RS3: эталонная суспензия III, FVP: без видимых частиц, NT: не тестировали.

Таблица 39. Результаты расширенного исследования стабильности для составов с pH 4,5-5,5, хранившихся при 5°C±3°C в вертикальном положении
Предмет тестирования		F0 (контроль)			F13 pH 4,5			F15 pH 5,0			F17 pH 5,5
Предмет тестирования		Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.	Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.	Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.	Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.
Эксклюзионная HPLC	Мономер	98,6%	98,7%	98,6%	99,2%	99,2%	98,8%	99,1%	99,1%	98,6%	98,8%	98,8%	98,3%
	Агрегат	1,0%	0,9%	1,0%	0,8%	0,8%	1,1%	0,9%	0,9%	1,4%	1,2%	1,2%	1,7%
	Фрагмент	0,5%	0,4%	0,5%	<0,1%	<0,1%	0,1%	<0,1%	<0,1%	0,1%	<0,1%	<0,1%	<0,1%

Таблица 40. Результаты расширенного исследования стабильности для текущего и перспективного состава с pH 4,5-5,5, хранившихся при 25°C±2°C, 60%RH±5%RH в вертикальном положении
Предмет тестирования		F0 (контроль)				F13 pH 4,5				F15 pH 5,0				F17 pH 5,5
Предмет тестирования		Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.	Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.	Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.	Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.
Эксклюзионная HPLC	Мономер	98,6%	98,4%	98,4%	98,0%	99,2%	98,6%	98,4%	97,7%	99,1%	98,4%	98,2%	97,7%	98,8%	98,2%	98,2%	97,7%
	Агрегат	1,0%	1,0%	0,9%	1,0%	0,8%	1,1%	1,2%	1,5%	0,9%	1,4%	1,5%	1,8%	1,2%	1,8%	1,7%	2,0%
	Фрагмент	0,5%	0,5%	0,7%	0,9%	<0,1%	0,2%	0,4%	0,8%	<0,1%	0,1%	0,3%	0,5%	<0,1%	0,1%	0,1%	0,3%

Добавление метионина

[00240] Как видно из таблиц 41А и 41 В и таблицы 42 - таблицы 46, не наблюдали значимого отличия между составами с метионином или без него (F18 и F15). Для состава с метионином (F18) наблюдали немного более низкую скорость образования агрегатов в расширенном исследовании стабильности при длительном испытании, исследовании стабильности при ускоренном испытании и исследовании фотостабильности. Для F18 также показано несколько более низкое окисление остатка метионина (например, в положении 259 в тяжелых цепях) при воздействии света 1000 люкс вплоть до семи дней. Исследование с замораживанием-оттаиванием не показало какого-либо отличия. Эффект метионина в концентрации 10 ммоль/л в качестве стабилизатора был ограниченным.

Таблица 41А. Результаты исследования стабильности для составов с Met или без него, хранившихся при 5°C±3°C в вертикальном положении
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0 (контроль)		F15 Met (-)		F18 Met (+)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	5°С/2 мес.	Начальный момент времени	5°С/2 мес.	Начальный момент времени	5°С/2 мес.
Цвет	Регистрируемый результат	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5
Прозрачность	Регистрируемый результат	≤ RS2	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3
Частицы	Регистрируемый результат	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP
pH	Регистрируемый результат (мг/мл)	4,95	4,98	4,94	4,96	4,95	4,98
Конц. белка	Регистрируемый результат	104	102	197	195	191	189
ELISA	Регистрируемый результат	101,3%	102,6%	102,1%	123,1%	108,2%	118,1%
FcR	Регистрируемый результат	91,7%	93,8%	108,8%	99,0%	92,4%	94,7%
cSDS-R	Регистрируемый результат	98,3%	97,7%	98,9%	98,5%	98,9%	98,5%
cSDS-NR	Регистрируемый результат	91,2%	91,9%	91,2%	92,9%	91,5%	92,7%
SEC	Мономер ≥ 95,0%	98,6%	98,7%	99,1%	99,1%	99,2%	99,1%
	Агрегат ≤ 5,0%	1,0%	0,9%	0,9%	0,9%	0,8%	0,9%
	Регистрируемый фрагмент	0,5%	0,4%	<0,1%	<0,1%	<0,1%	<0,1%
IE×	Главный пик 50%-90%	71,3%	70,8%	76,7%	72,9%	77,2%	75,9%
	Кислотный	24,4%	25,2%	19,4%	19,7%	19,0%	19,2%
	Основный	4,2%	4,0%	3,9%	7,4%	3,8%	4,9%
Met: метионин, BY5: эквивалентен эталонному раствору BY₅. RS2: эталонная суспензия II, RS3: эталонная суспензия III, FVP: без видимых частиц

Таблица 41B
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0	(контроль)	F15	Met (-)	F18	Met (+)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	5°С/2 мес.	Начальный момент времени	5°С/2 мес.	Начальный момент времени	5°С/2 мес.
Вязкость	Регистрируемый результат (сП)	2,6	NT	7,9	NT	7,3	NT
Осмоляльность	Регистрируемый результат (мОсм/кг)	512	NT	407	NT	416	NT
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,048%	0,051%	0,044%	0,047%	0,045%	0,039%
MFI	25 мкм	1	5	7	3	0	0
	10-25 мкм	4	81	26	26	3	0
	5-10 мкм	27	283	335	170	131	159
	2-5 мкм	150	1452	1246	977	691	163
Met: метионин, NT: не тестировали.

Таблица 42. Результаты исследования стабильности для составов с Met или без него, хранившихся при 25°C±2°C, 60%RH±5%RH в вертикальном положении

Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F0 (контроль)			F15 Met (-)			F18 Met (+)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	25°С/1 мес.	25°С/2 мес.	Начальный момент времени	25°С/1 мес.	25С/2 мес.	Начальный момент времени	25°С/1 мес.	25С/2 мес.
Цвет	Регистрируемый результат	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5
Прозрачность	Регистрируемый результат	≤ RS2	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3
Частицы	Регистрируемый результат	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP
pH	Регистрируемый результат	4,95	4,94	4,99	4,94	4,96	4,98	4,95	4,94	4,97
Конц. белка	Регистрируемый результат	104	103	101	197	194	192	191	192	189
ELISA	Регистрируемый результат	101,3%	102,7%	91,8%	102,1%	103,6%	96,9%	108,2%	97,0%	97,8%
FcR	Регистрируемый результат	91,7%	95,5%	93,5%	108,8%	98,3%	102,2%	92,4%	91,9%	92,9%
cSDS-R	Регистрируемый результат	98,3%	98,1%	97,2%	98,9%	98,8%	98,0%	98,9%	98,8%	98,1%
cSDS-NR	Регистрируемый результат	91,2%	89,7%	90,4%	91,2%	89,5%	90,0%	91,5%	89,8%	90,6%
SEC	Мономер ≥ 95,0%	98,6%	98,4%	98,4%	99,1%	98,4%	98,2%	99,2%	98,6%	98,5%
	Агрегат ≤ 5,0%	1,0%	1,0%	0,9%	0,9%	1,4%	1,5%	0,8%	1,2%	1,2%
	Регистрируемый фрагмент	0,5%	0,5%	0,7%	<0,1%	0,1%	0,3%	<0,1%	0,1%	0,3%
IE×	Главный пик 50%-90%	71,3%	69,4%	67,7%	76,7%	75,2%	71,4%	77,2%	76,1%	72,9%
	Кислотный	24,4%	26,3%	28,2%	19,4%	20,6%	23,2%	19,0%	20,2%	22,6%
	Основный	4,2%	4,4%	4,1%	3,9%	4,2%	5,4%	3,8%	3,7%	4,4%
Вязкость	Регистрируемый результат (сП)	2,6	NT	NT	7,9	NT	NT	7,3	NT	NT
Осмоляльность	Регистрируемый результат (мОсм/кг)	512	NT	NT	407	NT	NT	416	NT	NT
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,048%	0,052%	0,050%	0,044%	0,047%	0,043%	0,045%	0,043%	0,038%
MFI	25 мкм	1	5	0	7	0	0	0	0	3
	10-25 мкм	4	3	35	26	49	35	3	7	65
	5-10 мкм	27	81	292	335	959	714	131	230	647
	2-5 мкм	150	457	1830	1246	2919	1963	691	792	2516
Met: метионин, NT: не тестировали, BY5: эквивалентен эталонному раствору BY₅. RS2: эталонная суспензия II, RS3: эталонная суспензия III, FVP: без видимых частиц, NT: не тестировали.

Таблица 43. Результаты расширенного исследования стабильности для текущего и перспективного состава с Met или без него из DS1 или DS2, хранившихся при 5°C±3°C в вертикальном положении
Предмет тестирования		F0 (контроль)			F15 Met (-)			F18 Met (+)
Предмет тестирования		Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.	Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.	Начальный момент времени	5°С/ 2 мес.	5°С/ 9 мес.
Эксклюзионная HPLC	Мономер	98,6%	98,7%	98,6%	99,1%	99,1%	98,6%	99,2%	99,1%	98,7%
	Агрегат	1,0%	0,9%	1,0%	0,9%	0,9%	1,4%	0,8%	0,9%	1,2%
	Фрагмент	0,5%	0,4%	0,5%	<0,1%	<0,1%	0,1%	<0,1%	<0,1%	0,1%
Met: метионин

Таблица 44. Результаты расширенного исследования стабильности для составов с Met или без него, хранившихся при 25°C±2°C, 60%RH±5%RH в вертикальном положении
Предмет тестирования		F0 (контроль)				F15 Met (-)				F18 Met (+)
Предмет тестирования		Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.	Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.	Начальный момент времени	25°С/ 1 мес.	25°С/ 2 мес.	25°С/ 3 мес. +5°С/ 6 мес.
Эксклюзионная HPLC	Мономер	98,6%	98,4%	98,4%	98,0%	99,1%	98,4%	98,2%	97,7%	99,2%	98,6%	98,5%	98,0%
	Агрегат	1,0%	1,0%	0,9%	1,0%	0,9%	1,4%	1,5%	1,8%	0,8%	1,2%	1,2%	1,5%
	Фрагмент	0,5%	0,5%	0,7%	0,9%	<0,1%	0,1%	0,3%	0,5%	<0,1%	0,1%	0,3%	0,5%
Met: метионин

Таблица 45. Результаты исследования стрессовых условий (замораживание-оттаивание и фотостабильность) для составов с метионином или без него
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	F15 Met (-)				F18 Met (+)
Предмет тестирования	Критерий приемлемости	Начальный момент времени	FT, 3 цикла	25°C, темнота/7 дней	25°C, 1000 люкс/7 дней	Начальный момент времени	FT, 3 цикла	25°C, темнота/7 дней	25°C, 1000 люкс/7 дней
Цвет	Регистрируемый результат	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5	BY5
Прозрачность	Регистрируемый результат	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3	≤ RS3
Частицы	Регистрируемый результат	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP	FVP
pH	Регистрируемый результат	4,94	4,94	4,94	4,94	4,95	4,94	4,93	4,92
Конц. белка	Регистрируемый результат	197	197	190	193	191	190	189	190
ELISA	Регистрируемый результат	102,1%	107,7%	107,0%	100,9%	108,2%	105,8%	104,7%	109,1%
FcR	Регистрируемый результат	108,8%	107,5%	104,0%	117,6%	106,0%	105,6%	104,8%	109,4%
cSDS-R	Регистрируемый результат	98,9%	99,3%	99,3%	98,7%	98,9%	99,1%	99,3%	98,7%
cSDS-NR	Регистрируемый результат	91,2%	93,0%	92,6%	92,0%	91,5%	92,8%	92,9%	91,4%
Эксклюзионная HPLC	Мономер ≥ 95,0%	99,1%	99,0%	98,9%	97,5%	99,2%	99,1%	98,9%	97,9%
	Агрегат ≤ 5,0%	0,9%	1,0%	1,0%	2,4%	0,8%	0,9%	1,0%	2,0%
	Регистрируемый фрагмент	<0,1%	<0,1%	0,1%	0,1%	<0,1%	<0,1%	0,1%	0,1%
IE×	Главный пик 50%-90%	76,7%	73,5%	74,8%	65,5%	77,2%	77,3%	76,2%	62,7%
	Кислотный	19,4%	20,8%	20,9%	20,3%	19,0%	18,8%	19,8%	20,0%
	Основный	3,9%	5,8%	4,4%	14,2%	3,8%	3,9%	3,9%	17,3%
Вязкость	Регистрируемый результат	7,9	NT	NT	NT	7,3	NT	NT	NT
Осмоляльность	Регистрируемый результат	407	NT	NT	NT	416	NT	NT	NT
Полисорбат 80	Регистрируемый результат (вес/об.%)	0,044%	0,047%	0,046%	0,046%	0,045%	0,047%	0,042%	0,046%
MFI	25 мкм	7	0	NT	44	0	5	NT	14
	10-25 мкм	26	76	NT	278	3	44	NT	99
	5-10 мкм	335	661	NT	1074	131	294	NT	698
	2-5 мкм	1246	2704	NT	3293	691	1289	NT	2491
FT: замораживание-оттаивание (замораживали при -30°C и оттаивали при комнатной температуре в вертикальном положении), 25°C: 25°C±2°C, 60%RH±5%RH, 1000 люкс: в лежачем положении с воздействием света 1000 люкс, Темнота: в лежачем положении без воздействия света за счет покрытия алюминиевой фольгой, Met: метионин, BY5: эквивалентен эталонному раствору BY₅, RS3: эталонная суспензия III, FVP: без видимых частиц, NT: не тестировали

Таблица 46. Результаты картирования пептидов в восстанавливающих условиях
№состава		F0			F15 Met (-)					F18 Met (+)
№состава		Начальный момент времени	5°C 2 мес.	25°C 2 мес.	Начальный момент времени	5°C 2 мес.	25°C 2 мес.	25°C Темнота, 7 дней	25°C 1000 люкс, 7 дней.	Начальный момент времени	5°C 2 мес.	25°C 2 мес.	25°C Темнота, 7 дней	25°C 1000 люкс, 7 дней.
Последовательность Охват	HC	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%	100,0%
Последовательность Охват	LC	99,5%	100,0%	100,0%	100,0%	98,6%	100,0%	100,0%	98,6%	98,6%	100,0%	100,0%	98,6%	98,6%
Дезамидирование	N332 HC	8,7%	8,4%	8,3%	8,2%	7,6%	7,6%	7,6%	7,8%	7,7%	7,2%	7,2%	7,7%	7,6%
Дезамидирование	N33 LC	11,0%	11,6%	12,3%	11,1%	10,4%	11,3%	10,8%	10,5%	11,0%	10,9%	11,3%	10,3%	10,7%
Окисление	M259 HC	<1%	4,5%	5,0%	3,5%	4,0%	5,8%	4,3%	12,4%	2,7%	2,7%	2,8%	3,1%	9,4%
	M356 HC	<1%	<1%	<1%	<1%	<1%	<1%	<1%	1,9%	<1%	<1%	<1%	<1%	<1%
	M435 HC	3,4%	2,4%	2,8%	1,9%	2,1%	2,7%	2,7%	9,6%	1,7%	1,4%	1,5%	0,8%	8,2%
	M4 LC	1,5%	1,5%	1,5%	1,6%	1,8%	1,7%	1,8%	2,2%	1,6%	1,5%	1,4%	1,7%	1,7%
Потеря Lys	K454 HC	95,6%	96,0%	95,8%	98,7%	98,6%	98,6%	98,6%	98,7%	98,5%	98,7%	98,7%	98,6%	98,6%
N-гликан N304 HC	A2G0	3,1%	3,0%	2,8%	2,3%	2,3%	2,2%	2,2%	2,2%	2,3%	2,3%	2,3%	2,3%	2,3%
	A2G0F	57,0%	55,5%	55,2%	52,2%	54,3%	53,0%	53,3%	53,1%	52,9%	52,7%	53,8%	53,3%	53,6%
	A2G1F	34,8%	34,1%	34,6%	37,8%	38,1%	39,1%	38,7%	38,1%	39,1%	39,4%	38,4%	39,1%	38,8%
	A2G2F	5,2%	5,1%	5,2%	5,7%	5,3%	5,7%	5,9%	5,4%	5,6%	5,6%	5,4%	5,3%	5,4%
	M5	0,0%	1,2%	1,1%	1,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%
	M8	0,0%	1,2%	1,1%	1,0%	0,0%	0,0%	0,0%	1,1%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%	0,0%

Met: метионин, 5°C: 5°C±3°C, 25°C: 25°C±2°C, 60%RH±5%RH, 1000 люкс: в лежачем положении с воздействием света 1000 люкс, Темнота: в лежачем положении без воздействия света за счет покрытия алюминиевой фольгой, HC: тяжелая цепь, LC: легкая цепь

Заключение

[00241] Среди составов на основе BAN2401 с изменением pH от pH 4,5 до pH 5,5 показатели качества были сопоставимы. При рН 4,0 они характеризовались более низкой скоростью образования агрегатов и, наоборот, более высокой скоростью образования фрагментов во время хранения. Авторы настоящего изобретения не видели значимого отличия между составами с метионином и без него при концентрации, составляющей 10 ммоль/л, исходя из оценок качества, исследований стабильности, в том числе при длительном, ускоренном испытании, замораживании-оттаивании и оценке фотостабильности. Хотя и наблюдали несколько более низкую скорость образования агрегатов и незначительное подавление окисления аминокислотного остатка, отличия не были значимыми. В заключение следует отметить, что F15 и F21, которые состояли из 200 мг/мл BAN2401, 25 ммоль/л L-гистидина/гидрохлорида гистидина, 200 ммоль/л L-аргинина, 0,05 (вес/об.) % полисорбата 80, при рН 5,0±0,5 определяли как хороших кандидатов на лекарственные субстанции для дальнейшей разработки.

Пример 10. Исследование эффекта концентрации аргинина на стабильность состава на основе BAN2401

[00242] Оценивали эффект концентрации аргинина (0, 50, 100 и 200 ммоль/л) на стабильность BAN2401 при концентрации 200 мг/мл. Образцы с каждым уровнем концентрации аргинина хранили в условиях ускоренного испытания (25°С/60% RH) и тестировали через 0, 1 и 2 месяца.

Получение образцов

[00243] Образцы (F1-F4) получали путем замены буфера у концентрированного промежуточного продукта лекарственной субстанции BAN2401 посредством ультрафильтрации. После асептической фильтрации каждый образец объемом 0,4 мл наливали во флакон. Информация об образце представлена в таблице 47.

Таблица 47. Информация об образце
№ состава	BAN2401	Буфер	Стабилизатор (аргинин)	Полисорбат 80	pH
F1	200 мг/мл	Гистидин, 25 ммоль/л	0 ммоль/л	0,05 (вес/об.) %	5,0
F2	200 мг/мл	Гистидин, 25 ммоль/л	50 ммоль/л	0,05 (вес/об.) %	5,0
F3	200 мг/мл	Гистидин, 25 ммоль/л	100 ммоль/л	0,05 (вес/об.) %	5,0
F4	200 мг/мл	Гистидин, 25 ммоль/л	200 ммоль/л	0,05 (вес/об.) %	5,0

Результаты

[00244] Результаты данного исследования стабильности для образцов F1-F4 представлены в таблицах 48-51. Отличие в pH и концентрации белка среди образцов отсутствовало, а уровень концентрации аргинина соответствовал целевому значению для исходных образцов.

[00245] % агрегатов у образцов, содержащих аргинин (F2-F4), был ниже, чем у образца без аргинина (F1).

Таблица 48. Результаты тестирования образца F1 (целевой уровень аргинина 0 ммоль/л)
Предметы тестирования		Начальный момент времени	1 мес.	2 мес.
pH		5,1	-	-
Концентрация белка (мг/мл)		195	-	-
SEC	Площадь мономеров, %	98,3%	98,0%	97,8%
	Площадь агрегатов, %	1,6%	1,7%	1,9%
	Площадь фрагментов, %	0,1%	0,2%	0,3%
Концентрация аргинина (ммоль/л)		1	-	-

Таблица 49. Результаты тестирования образца F2 (целевой уровень аргинина 50 ммоль/л)
Предметы тестирования		Начальный момент времени	1 мес.	2 мес.
pH		5,0	-	-
Концентрация белка (мг/мл)		192	-	-
SEC	Площадь мономеров, %	98,4%	98,1%	97,8%
	Площадь агрегатов, %	1,5%	1,7%	1,8%
	Площадь фрагментов, %	0,1%	0,2%	0,4%
Концентрация аргинина (ммоль/л)		47	-	-

Таблица 50. Результаты тестирования образца F3 (целевой уровень аргинина 100 ммоль/л)
Предметы тестирования		Начальный момент времени	1 мес.	2 мес.
pH		5,0	-	-
Концентрация белка (мг/мл)		198	-	-
SEC	Площадь мономеров, %	98,4%	98,1%	97,8%
	Площадь агрегатов, %	1,5%	1,7%	1,8%
	Площадь фрагментов, %	0,1%	0,2%	0,4%
Концентрация аргинина (ммоль/л)		87	-	-

Таблица 51. Результаты тестирования образца F4 (целевой уровень аргинина 200 ммоль/л)
Предметы тестирования		Начальный момент времени	1 мес.	2 мес.
pH		5,0	-	-
Концентрация белка (мг/мл)		191	-	-
SEC	Площадь мономеров, %	98,4%	98,1%	97,9%
	Площадь агрегатов, %	1,5%	1,6%	1,7%
	Площадь фрагментов, %	0,1%	0,2%	0,4%
Концентрация аргинина (ммоль/л)		173	-	-

Обсуждение и заключение

[00246] Результаты данного исследования свидетельствовали о том, что концентрации аргинина от 50 до 200 ммоль/л предотвращают увеличение уровней белковых агрегатов в составе на основе BAN2401 с концентрацией 200 мг/мл. Изменение концентрации аргинина у разных партий может привести к изменению % агрегатов у разных партий. Кроме того, концентрация аргинина может влиять на тенденцию к увеличению % агрегатов в исследовании стабильности.

[00247] Состав, содержащий гистидиновый буфер, судя по всему, оказывал эффект на снижение фрагментации BAN2401 по сравнению с процентным значением фрагментации в образце F1 с процентным значением фрагментации, показанным на фиг. 11 в примере 2, в котором применяли образцы, содержащие 200 мг/мл BAN2401, 50 мМ цитрата натрия и 100 мМ хлорида натрия.

9.1.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Таблица 52. Аминокислотные последовательности вариабельных областей mAb
mAb	Цепь IgG	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
BAN2401	Тяжелая цепь	1	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYGDTVKGRFTISRDNAKNSLFLQMSSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGRSYYTMDYWGQGTTVTVSS
BAN2401	Легкая цепь	2	DVVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPPTFGPGTKLEIK

Таблица 53. Аминокислотные последовательности константных областей mAb
mAb	Цепь IgG	Класс	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
BAN2401	Тяжелая цепь	IgG1	3	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BAN2401	Легкая цепь	Каппа-цепь	4	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Таблица 54. Аминокислотные последовательности CDR mAb
mAb	Цепь IgG	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
BAN2401	HCDR1	5	SFGMH
	HCDR2	6	YISSGSSTIYYGDTVKG
	HCDR3	7	EGGYYYGRSYYTMDY
BAN2401	LCDR1	8	RSSQSIVHSNGNTYLE
	LCDR2	9	KVSNRFS
	LCDR3	10	FQGSHVPPT

Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 11): evqlvesggglvqpggslrlscsasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayissgsstiyygdtvkgrftisrdnaknslflqmsslraedtavyycareggyyygrsyytmdywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

Легкая цепь (SEQ ID NO: 12): dvvmtqsplslpvtpgapasiscrssqsivhsngntylewylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlrisrveaedvgiyycfqgshvpptfgpgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD.

<120>ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫЕ СОСТАВЫ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ К

ПРОТОФИБРИЛЛАМ Аβ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130>08061.0047-00304

<140>

<141>2021-03-19

<150>62/992,746

<151>2020-03-20

<150>63/027,263

<151>2019-05-19

<160>12

<170>PatentIn версия 3.5

<210>1

<211>124

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

<223>/примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400>1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>2

<211>112

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический полипептид"

<400>2

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>3

<211>330

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический полипептид"

<400>3

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>4

<211>107

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический полипептид"

<400>4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>5

<211>5

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический пептид"

<400>5

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210>6

<211>17

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический пептид"

<400>6

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>7

<211>15

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический пептид"

<400>7

Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210>8

<211>16

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический пептид"

<400>8

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210>9

<211>7

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический пептид"

<400>9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210>10

<211>9

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический пептид"

<400>10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr

1 5

<210>11

<211>454

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический полипептид"

<400>11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210>12

<211>219

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<221>источник

синтетический полипептид"

<400>12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<---

Claims

1. Водный фармацевтический состав для лечения болезни Альцгеймера, содержащий:

выделенное антитело к протофибриллам Aβ, которое связывается с протофибриллами Aβ человека, в концентрации от 80 до 300 мг/мл,

от 100 до 400 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации,

от 0,01 до 0,1% вес/об. полисорбата 80 и

фармацевтически приемлемый буфер,

где выделенное антитело к протофибриллам Aβ содержит: (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

2. Фармацевтический состав по п. 1, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей от 100 до 200 мг/мл.

3. Фармацевтический состав по п. 1, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей 100 мг/мл.

4. Фармацевтический состав по п. 1, где выделенное антитело к протофибриллам Aβ присутствует в концентрации, составляющей 200 мг/мл.

5. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащий метионин.

6. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-5, где фармацевтически приемлемый буфер представляет собой цитратный буфер или гистидиновый буфер.

7. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-6, содержащий 10-100 мМ цитратного буфера или 10-100 мМ гистидинового буфера.

8. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-7, содержащий 125-350 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации.

9. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-8, содержащий 200 мМ гидрохлорида аргинина.

10. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-9, содержащий 200 мМ гидрохлорида аргинина и 25 мМ гистидинового буфера.

11. Фармацевтический состав по п. 1, содержащий:

от 80 до 240 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ,

от 140 до 260 мМ гидрохлорида аргинина,

от 0,02 до 0,08% вес/об. полисорбата 80 и

от 15 до 35 мM гистидинового буфера,

12. Фармацевтический состав по п. 1, содержащий:

от 80 до 120 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ,

от 240 до 360 мМ аргинина, гидрохлорида аргинина или их комбинации,

от 0,02 до 0,08% вес/об. полисорбата 80 и

от 30 до 50 мM цитратного буфера,

13. Фармацевтический состав по п. 1, содержащий:

(a) 100 мг/мл или 200 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ,

(b) от 190 до 210 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) от 0,04 до 0,06% вес/об. полисорбата 80 и

(d) от 15 до 35 мМ гистидинового буфера.

14. Фармацевтический состав по п. 1, содержащий:

(a) 100 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера.

15. Фармацевтический состав по п. 1, содержащий:

(a) 200 мг/мл выделенного антитела к протофибриллам Aβ,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес/об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера.

16. Фармацевтический состав по любому из пп. 13-15, в котором гистидиновый буфер представляет собой комбинацию гистидина и моногидрата гидрохлорида гистидина.

17. Фармацевтический состав по любому из пп. 13-16, отличающийся тем, что фармацевтический состав имеет pH 5,0.

18. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-17, в котором выделенное антитело к протофибриллам Aβ представляет собой леканемаб.

19. Водный фармацевтический состав для лечения болезни Альцгеймера, содержащий:

(a) 100 мг/мл леканемаба,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес./об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

где фармацевтический состав характеризуется рН приблизительно 5,0.

20. Водный фармацевтический состав для лечения болезни Альцгеймера, содержащий:

(a) 200 мг/мл леканемаба,

(b) 200 мМ гидрохлорида аргинина,

(c) 0,05% вес./об. полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

21. Водный фармацевтический состав для лечения болезни Альцгеймера, содержащий:

(a) 100 мг/мл леканемаба,

(b) 42,13 мг/мл гидрохлорида аргинина,

(c) 0,50 мг/мл полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

22. Водный фармацевтический состав для лечения болезни Альцгеймера, содержащий:

(a) 200 мг/мл леканемаба,

(b) 42,13 мг/мл гидрохлорида аргинина,

(c) 0,50 мг/мл полисорбата 80 и

(d) 25 мМ гистидинового буфера,

23. Фармацевтический состав по любому из пп. 19-22, где гистидиновый буфер представляет собой комбинацию гистидина и гидрохлорида гистидина.

24. Фармацевтический состав по любому из пп. 19-23, где гистидиновый буфер представляет собой комбинацию гистидина и моногидрата гидрохлорида гистидина.