RU2846775C1

RU2846775C1 - Новые агонисты tlr9

Info

Publication number: RU2846775C1
Application number: RU2022121544A
Authority: RU
Inventors: Еидзи ЕСАСИ
Original assignee: ЭсБиАй БАЙОТЕК КО., ЛТД.
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2025-09-15

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: одноцепочечный олигонуклеотид-агонист Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), отличающийся тем, что олигонуклеотид содержит мотив последовательности, выбранный из группы, двухцепочечный олигонуклеотид, который может связываться с TLR9, конъюгат для лечения или профилактики целевого заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из новообразования, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD), и их терапевтическое применение. Также представлены фармацевтическая композиция для профилактики или лечения целевого заболевания или нарушения, средство для активации TLR9 у индивидуума и способ лечения или предупреждения целевого заболевания или нарушения у индивидуума. Изобретение можно использовать для активации или модулирования иммунитета у индивидуума. 8 н. и 27 з.п. ф-лы, 41 ил., 7 табл., 13 пр.

Description

[ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ]

[0001]

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в той же степени, как если бы индивидуальная публикация, патент или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны как включенные в качестве ссылок.

[0002]

Настоящее изобретение относится к новому олигонуклеотиду или его производному олигонуклеотиду, которые могут связываться с рецептором нуклеиновой кислоты, включая TLR9. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой олигонуклеотид. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения целевого заболевания, включающего злокачественную опухоль или инфекционное заболевание, с использованием такого олигонуклеотида.

[Уровень техники]

[0003]

TLR (toll-подобный рецептор) представляет собой семейство рецепторов, которые распознают ассоциированные с патогеном молекулярные паттерны (PAMP) и которые находятся на поверхности клеточной мембраны или мембраны эндосомы. Активация TLR приводит к секреции интерферонов типа I и воспалительных цитокинов. У человека известно десять типов TLR, от TLR1 до TLR10. Среди них, TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 находятся в эндосомах и в основном выявляют нуклеиновые кислоты. В то время как TLR3 в основном распознает двухцепочечные РНК и синтетические РНК, называемые поли(I:C), которые являются сходными с вирусной РНК, TLR7 и TLR8 в основном распознают одноцепочечные РНК. С другой стороны, TLR9 в основном распознает одноцепочечные ДНК. У человека TLR9 экспрессируется в плазмацитоидных дендритных клетках (pDC), B-клетках, эозинофилах, базофилах, макрофагах и NK-клетках (Roda, J.M., et al., J Immunol, 2005. 175(3): p.1619-27; Liu, M., et al., Nat Immunol, 2019. 20(3): p.265-275; Hemmi, H., et al., Nature, 2000. 408(6813): p.740-5).

[0004]

Агонисты TLR9 активируют pDC и B-клетки, способствуя их пролиферации, продуцированию воспалительных цитокинов и антител, презентации антигена и экспрессии костимулирующих молекул и молекул MHC. При стимуляции агонистами TLR9 в pDC- и B-клетках также возрастает экспрессия рецепторов хемокинов, резистентность к апоптозу и продуцирование цитокинов, включая индуцирующие Th1 хемокины, такие как макрофагальные воспалительные белки 1 (MIP1) и интерферон-индуцируемый белок массой 10 кДа (IP10). B-клетки памяти, в частности, дифференцируются в плазмациты, которые секретируют антитела в зависимости только от активации TLR9. Примером агонистов TLR9 является ДНК CpG (CpG). ДНК CpG содержит неметилированный цитозин и гуанин, который первоначально был обнаружен в качестве важного мотива, составляющего ассоциированные с патогеном молекулярные паттерны (PAMP) в бактериальной ДНК (Krieg, A.M., Nat Rev Drug Discov, 2006. 5(6): p.471-84).

[0005]

Сообщают, что CpG-олигодезоксинуклеотиды (ODN) подразделяют на четыре класса с учетом структуры и функции. ODN класса A, также известные как ODN класса D, имеют фосфоротиоатный остов нескольких нуклеотидов на 3’-конце и нескольких нуклеотидов на 5’-конце. ODN класса A содержат палиндромные последовательности, включающие CpG, которые могут образовывать структуру стебель-петля. Концы ODN класса A содержат последовательности поли-G, которые могут образовывать параллельные квадруплексные структуры, называемые G-тетрадами (Puig M. et al., Nucleic Acids Res. 2006, 34(22): p.6488-95). ODN класса A в высокой степени способствует продуцированию интерферона-альфа (IFN-α) из pDC, но только слабо активирует B-клетки. ODN класса B, также известные как ODN класса K, имеют одну или несколько последовательность(ей) CpG и имеют остов, в котором большинство нуклеотидов являются фосфоротиоатными. ODN класса B в высокой степени индуцирует пролиферацию B-клеток, способствует секреции IgM-антител из B-клеток и индуцирует дифференцировку и созревание pDC. ODN класса C имеют фосфоротиоатный остов. ODN класса C имеют палиндромную последовательность с CpG на 3’-конце, и палиндромная последовательность может подвергаться внутримолекулярной гибридизации с образованием шпилечной структуры. ODN класса C способствует продуцированию IFN-α из pDC и продуцированию IL-6 из B-клеток. Таким образом, ODN класса C имеют сходные функции как с ODN класса A, так и с ODN класса B. ODN класса P имеют две палиндромных последовательности. ODN класса P могут подвергаться межмолекулярной гибридизации с образованием конкатемеров на палиндроме на 5’-конце или внутримолекулярной гибридизации с образованием шпилечной структуры на GC-богатом 3’-конце. ODN класса P в высокой степени индуцирует продуцирование IFN типа I (Scheiermann, J. et al., Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89).

[0006]

Механизмы, посредством которых CpG-ODN активируют клетки, экспрессирующие TLR9, описаны ниже. Сначала интернализованные CpG-ODN связываются с TLR9 в эндосоме. После связывания CpG-ODN с TLR9, адаптерный белок MyD88, связывающийся с цитозольной стороной TLR9, активируется посредством фосфорилирования. Активированный MyD88 индуцирует транскрипцию цитокинов, включая интерфероны типа I (IFN), посредством активации факторов транскрипции, таких как IRF3, 5 и 7. Активированный MyD88 также передает сигнал через каскад ядерного фактора-каппа B (NF-B); сигнал ниже MyD88 приводит к убиквитинилированию IB (ингибитор B или ингибитор каппа-бета) и индуцирует деградацию IB, что активирует NF-B. При активации NF-B связывается с промоторами NF-B и активирует экспрессию генов-мишеней. В результате индуцируется продуцирование воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1 бета (IL-1β), TNF-альфа (TNF-α) и интерлейкин-6 (IL-6).

[0007]

Поскольку CpG-ODN обладают вышеупомянутой биологической активностью активации TLR9, введение CpG-ODN является пригодным для лечения и/или предупреждения нескольких заболеваний или нарушений следующим образцом.

[0008]

<Активность против злокачественной опухоли (противоопухолевая)>

CpG-ODN могут иметь эффекты на микроокружение опухоли (™E) и конвертировать холодную опухоль в горячую опухоль ("Warming "Cold" Melanoma with TLR9 Agonists", Cancer Discov, 2018. 8(6): p.670). ™E представляет собой среду, сконструированную опухолевыми клетками и неопухолевыми клетками, окружающими опухоли, такими как иммунные клетки, фибробласты и сосудистые клетки. Статус ™E существенно влияет на прогрессирование опухоли. Холодная опухоль представляет собой опухоль, которая содержит иммуносупрессивные клетки, такие как опухолеассоциированные макрофаги (TAM), клетки-супрессоры миелоидного происхождения (MDSC) и регуляторые T-клетки (Treg), которые составляют иммуносупрессивное ™E, и только немного активированных инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL). Холодная опухоль часто является резистентной к способам лечения злокачественной опухоли, включая иммунотерапию. Горячая опухоль представляет собой опухоль, которая содержит противоопухолевые иммунные клетки, включая TIL и макрофаги M1, которые составляют иммунологически активированное ™E. Горячая опухоль обычно отвечает на лечение злокачественной опухоли. Например, сообщалось, что внутриопухолевое введение CpG-ODN приводит к повышению уровня T-клеток, pDC и NK-клеток, снижению уровня Treg и подавлению MDSC (Shirota, H., et al., Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407). Кроме того, описано, что агонисты TLR9 переобучают проопухолевые M2-подобные макрофаги для индукции поляризации противоопухолевых M1-подобных макрофагов (Mantovani, A., et al., J Exp Med, 2015. 212(4): p.435-45).

Также описано, что CpG-ODN усиливают противоопухолевую активность макрофагов, направленную на поглощение злокачественных клеток, которые экспрессируют сигнал "не ешь меня", такой как CD47 (Liu, M., et al., Nat Immunol, 2019. 20(3): p.265-275).

[0009]

CpG-ODN также могут подавлять иммуносупрессивную природу моноцитарных (CD11b+, Ly6G-, Ly6C^high) MDSC, такую как супрессивная активность в отношении функции T-клеток (Shirota, Y., et al., J Immunol, 2012. 188(4): p.1592-9).

[0010]

<Профилактика или терапия опосредуемых Th2 или Th17 заболеваний>

CpG-ODN являются пригодными для эффективной профилактики или терапии опосредуемых Th2 или Th17 заболеваний. Было показано, что общепринятые CpG-ODN вследствие их иммуномодулирующих эффектов модулируют равновесие между иммунным ответом активирующих Th1-клеток и Treg и в результате подавляют Th2-клетки и Th17-клетки, считается, что индукция дифференцировки в Th1-клетки посредством CpG-ODN приводит к снижению уровня Th2-клеток, поскольку Th1-клетки и Th2-клетки реципрокно ингибируют дифференцировку друг друга, соответственно, в Th2-клетки или Th1-клетки.

[0011]

В последнее время описано множество факторов, модулирующих равновесие Th17-клеток и Treg. Примерами таких факторов являются нижерасположенные сигналы T-клеточных рецепторов, костимулирующие молекулы, цитокины, метаболические каскады и кишечная микробиота (Lee, G.R., Int J Mol Sci, 2018. 19(3): p.730).

Было описано, что агонист TLR4, LPS, индуцирует дифференцировку Th17-клеток, и агонист TLR2, пептидогликан, индуцирует дифференцировку Th17-клеток и Th1-клеток умеренно. Между тем, описано, что CpG-ODN предпочтительно индуцируют дифференцировку Th1-клеток через продуцирование IFN-α (Shi, G., et al., J Immunol, 2013. 191(1): p.415-23).

[0012]

Осуществимость способов терапии для поддержания равновесия иммунитета была показана в условиях in-vivo. Например, когда CpG-ODN вводили модельным мышам и пациентам, страдающим от язвенного колита, наблюдали, что количества клеток Th17 и продуцирование IL-17 и IL-6 снижались, в то время как количества Treg и продуцирование IL-10 возрастали, что приводило к улучшению симптомов (Schmitt, H et al., J Crohns Colitis, 2018, 12(Suppl1): p.S003). Также было описано, что добавление CpG снижает симптомы EAE у мышей, вызванные полным адъювантом Фрейнда, демонстрируя эффект CpG в отношении снижения Th17-опосредуемого патогенеза (Tigno-Aranjuez, JT, et al., J Immunol, 2009, 183(9): p.5654-61).

[0013]

Также было предположено, что CpG-ODN являются эффективными против астмы и атопических заболеваний, которые относится к Th17-опосредуемым заболеваниям, на основе наблюдения, что CpG-ODN индуцировали продуцирование индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) из дендритных клеток, и активацию и пролиферацию Treg (Kline, J.N., et al., Drug News Perspect, 2008. 21(8): p.434-9).

[0014]

<Комбинированная терапия>

Кроме того, также описано, что CpG-ODN являются пригодными для комбинированной терапии, поскольку CpG-ODN демонстрируют активность модулирования иммунной активности, как описано выше. В предшествующих сообщениях была описана комбинация со способами терапии, включающими (i) вакцины; (ii) антительные лекарственные средства; (iii) общепринятую химиотерапию; (iv) молекулярные таргетные лекарственные средства; (v) хирургическое лечение; (vi) цитокины; (vii) адоптивные способы терапии иммунными клетками (также известные как адоптивный клеточный перенос (ACT)); и (viii) агонисты рецепторов нуклеиновых кислот.

[0015]

Комбинация с "(i) вакцинами"

CpG-ODN могут повышать иммуногенность вакцин. Например, CpG-ODN можно вводить вместе с противораковой вакциной, такой как вакцина на основе антигена меланомы (Scheiermann, J. et al., D.M., Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89; Shirota, H., et al., Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407), а также с вакцинами против вирусов, таких как цитомегаловирус, вирус малярии, вирус сибирской язвы и вирус гриппа (Scheiermann, J. et al., D.M., Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89). Вакцина против гепатита B Heplisav-B®, содержащая CpG-ODN, и антигены гепатита B была одобрена FDA.[0016]

Комбинация с "(ii) антительными лекарственными средствами" (такими как ингибиторы иммунной точки контроля (CPI) и цитотоксические антитела)

CPI представляют собой лекарственные средства для преобразования иммуносупрессивного статуса микроокружения опухоли или среды, окружающей инфицированные клетки, путем связывания с молекулами точки контроля или их лигандами. Например, комбинация CpG-ODN с Кейтрудой (пембролизумаб) была исследована в клиническом испытании при прогрессирующей меланоме (Ribas, A., et al., Cancer Discov, 2018. 8(10): p.1250-1257). Было проведено клиническое испытание комбинированного применения Ервоя (ипилимумаб) с целью лечения прогрессирующей солидной опухоли (Reilley, M., et al., Journal of Clinical Oncology, 2019. 37(15_suppl): p.TPS2669-TPS2669). Интересно, что было предположено, что комбинация CpG-ODN и CPI является эффективной для пациентов, которые являются резистентными к стандартному лечению. Например, описано, что комбинация с CpG-ODN и CPI демонстрирует противоопухолевую активность, даже несмотря на то, что пациенты являются резистентными к CPI, таким как антитела против PD-1 (Wang, S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(46): p.E7240-E7249). Цитотоксические антитела представляют собой лекарственные средства, которые индуцируют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), комплемент-зависимую клеточную цитотоксичность (CDC) и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). Описаны синергические эффекты комбинированного применения CpG-ODN и цитотоксических антител (Hiramatsu, K., et al., Cancer Sci, 2015. 106(10): p.1474-8). Например, комбинация CpG-ODN с Ритуксаном (ритуксимаб) была исследована в клиническом испытании при неходжскинской лимфоме (Friedberg, J.W., et al., Blood, 2005. 105(2): p.489-95). Также было показано, что комбинация CpG-олигонуклеотида, поли(I:C) и цитотоксического антитела имела противоопухолевую активность, даже когда пациенты были резистентными к цитотоксическому антителу, такому как Герцептин (трастузумаб) (Charlebois, R., et al., Cancer Res, 2017. 77(2): p.312-319).

[0017]

Комбинация с "(iii) общепринятой химиотерапией"

Общепринятые химиотерапевтические лекарственные средства состоят из химических веществ, которые ингибируют пролиферацию быстрорастущих опухолевых клеток и уничтожают такие клетки. Например, проводили исследование комбинации лекарственного средства на основе платины, лекарственного средства на основе таксана и CpG-ODN в клиническом испытании (Krieg, A.M., J Clin Invest, 2007. 117(5): p.1184-94).

[0018]

Комбинация с "(iv) молекулярными таргетными лекарственными средствами"

Общепринятые молекулярные таргетные лекарственные средства, как правило, состоят из низкомолекулярных соединений, связывающихся с определенными молекулами-мишенями, и регулируют их функции. Примерами молекул-мишеней являются молекулы-мишени, которые вызывают канцерогенез, связаны с драйверными мутациями или вовлечены в гомеостаз опухолевых клеток. Например, была описана синергия между CpG и бортезомибом при множественной миеломе в доклинических условиях, и было сделано заключение, что она составляет основу осуществимости тестирования на данной клинической стадии (Ray, A., et al., Leukemia, 2014. 28(8): p.1716-24).

[0019]

Комбинация с (v) хирургическим лечением (включая лучевую терапию, криоабляцию или радиочастотную абляцию)

Было описано, что введение CpG-ODN после хирургической резекции повышало выживаемость (Weigel, B.J., et al., Clin Cancer Res, 2003. 9(8): p.3105-14). Лучевая терапия представляет собой способ лечения, который повреждает ДНК пролиферирующих опухолевых клеток и уничтожает такие клетки посредством радиационного излучения. Криоабляция представляет собой способ лечения, который замораживает и уничтожает опухолевые клетки. Радиочастотная абляция представляет собой способ лечения, который коагулирует опухолевые клетки посредством тепла, сгенерированного радиочастотами и уничтожает опухолевые клетки. CpG-ODN считаются эффективными для индукции иммунитета против опухолевых антигенов, высвобождающихся из погибших клеток, убитых посредством такого лечения (Jahrsdörfer, B. et al., G.J., Update Cancer Ther, 2008. 3(1): p.27-32).

[0020]

Комбинация с "(vi) цитокинами"

Примерами цитокинов являются IFN-α и IL-18, которые активируют NK-клетки или дендритные клетки. Было описано, что комбинация IL-18 и CpG-ODN индуцировала апоптоз злокачественных B-клеток, и эти B-клетки секретировали гранзим, который далее уничтожал соседние злокачественные B-клетки (Jahrsdörfer, B. et al., Update Cancer Ther, 2008. 3(1): p.27-32).

[0021]

Комбинация с "(vii) адоптивной терапией иммунными клетками"

Адоптивная терапия иммунными клетками представляет собой тип терапии, при котором проводят введение иммунных клеток, модифицированных ex vivo; примерами такой терапии являются следующие: терапия CAR-T с использованием генно-модифицированных T-клеток, трансдуцированных TCR против специфических антигенов злокачественной опухоли, и иммунными клетками, такими как TIL или дендритные клетки, либо от пациентов, либо от доноров, стимулированными ex vivo для приобретения противоопухолевых эффектов (Xu, L., et al., Clin Dev Immunol, 2010. 2010: p.410893).

[0022]

Комбинация с "(viii) агонистами рецепторов нуклеиновых кислот"

Было описано, что комбинация с агонистом TLR7/8 демонстрирует синергические эффекты в клинических испытаниях (Shirota, H., et al., Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407). Также описано, что синергический эффект между агонистом TLR9, таким как CpG, и агонистом стимулятора генов интерферонов (STING), усиливает Th1-смещенные иммунные ответы, такие как продуцирование антигенспецифических IgG и IFN-γ в PBMC, а также ответы цитотоксических CD8(+) T-клеток (Temizoz B., et al, Eur J Immunol, 2015, 45(4): p.1159-69).

[0023]

<Механизмы, являющиеся основой комбинированной терапии, включающей введение CpG>

Было показано, что некоторые из способов лечения и лекарственных средств, описанных выше, индуцируют гибель иммуногенных клеток (ICD), и они были исследованы в отношении комбинирования с CpG-ODN. ICD является типом клеточной смерти, где клеточные каркасы или погибающие клетки, убитые ICD, индуцируют сильный иммунный ответ посредством секреции DAMP; было описано, что молекулы, составляющие DAMP, представляют собой, например, кальретикулин, бокс высокомобильной группы (HMGB), белок теплового шока или ATP. Наблюдалась презентация повышенного количества таких DAMP по сравнению с обычной клеточной смертью. (Bedognetti, D., et al., J Immunother Cancer, 2019. 7(1): p.131). Некоторые химиотерапевтические лекарственные средства и некоторые молекулярные таргетные лекарственные средства известны как индукторы ICD; такие индукторы ICD включают доксорубицин, митоксантрон, оксалиплатин и бортезомиб. Лучевая и фотодинамическая терапия (PDT) также известны как индукторы ICD. (Galluzzi, L., et al., Nat Rev Immunol, 2017. 17(2): p.97-111)

[0024]

Некоторые из способов лечения или лекарственных средств, которые подавляют или уничтожают Treg, исследованы в отношении комбинирования с CpG-ODN, описанными выше. Например, CpG-ODN синергично усиливают иммунный ответ после истощения Treg посредством антитела против CD25 (Jarry, U., et al., J Neuroimmunol, 2014. 267(1-2): p.35-42).

[0025]

Следовательно, CpG-ODN можно вводить отдельно или в комбинации по меньшей мере с одним активным ингредиентом для следующих фармацевтических целей: (i) иммуностимулирующие эффекты для предупреждения и лечения новообразований, включая злокачественные опухоли (например, метастазирующая солидная злокачественная опухоль, меланома, Т-клеточная лимфома кожи, хронический лимфоцитарный лейкоз и т.п.) и инфекционные заболевания, (ii) иммуномодулирующие эффекты для предупреждения или лечения иммуноопосредуемых заболеваний, таких как обусловленные Th2 или Th17 заболевания, включая некоторые типы аутоиммунных заболеваний и аллергических заболеваний и (iii) модулирование способности к ответу опухолевых клеток, экспрессирующих TLR7/9, на противораковые лекарственные средства и иммунные клетки.

[Список литературы]

[Патентные документы]

[0026]

WO2014082254A

JP5011520B

WO2004016805A

[Непатентные документы]

[0027]

(Авторы не указаны), Warming "Cold" Melanoma with TLR9 Agonists. Cancer Discov, 2018. 8(6): p.670.

Aarts, B.M., et al., Cryoablation and immunotherapy: an overview of evidence on its synergy. Insights Imaging, 2019. 10(1): p.53.

Bauer, S., et al., Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(16): p.9237-42.

Bedognetti, D., et al., Toward a comprehensive view of cancer immune responsiveness: a synopsis from the SITC workshop. J Immunother Cancer, 2019. 7(1): p.131.

Bhan, U., et al., TLR9 is required for protective innate immunity in Gram-negative bacterial pneumonia: role of dendritic cells. J Immunol, 2007. 179(6): p.3937-46.

Bode, C., et al., Human plasmacytoid dentritic cells elicit a Type I Interferon response by sensing DNA via the cGAS-STING signaling pathway. Eur J Immunol, 2016. 46(7): p.1615-21.

Chang, C.L., et al., Immune mechanism of the antitumor effects generated by bortezomib. J Immunol, 2012. 189(6): p.3209-20.

Charlebois, R., et al., PolyI:C and CpG Synergize with Anti-ErbB2 mAb for Trea™ent of Breast Tumors Resistant to Immune Checkpoint Inhibitors. Cancer Res, 2017. 77(2): p.312-319.

Davola, M.E., et al., Oncolytic viruses: how "lytic" must they be for therapeutic efficacy? Oncoimmunology, 2019. 8(6): p.e1581528.

Di Domizio, J., et al., TLR7 stimulation in human plasmacytoid dendritic cells leads to the induction of early IFN-inducible genes in the absence of type I IFN. Blood, 2009. 114(9): p.1794-802.

Ding A.S. et al., Targeting Myeloid Cells in Combination Trea™ents for Glioma and Other Tumors., Front Immunol, 2019, 10: p.1715

Friedberg, J.W., et al., Combination immunotherapy with a CpG oligonucleotide (1018 ISS) and rituximab in patients with non-Hodgkin lymphoma: increased interferon-alpha/beta-inducible gene expression, without significant toxicity. Blood, 2005. 105(2): p.489-95.

Gabrilovich, D. I., Myeloid-Derived Suppressor Cells. Cancer Immunol Res, 2017, 5(1): p.3-8

Galluzzi, L., et al., Immunogenic cell death in cancer and infectious disease. Nat Rev Immunol, 2017. 17(2): p.97-111.

Harrington, K., et al., Optimizing oncolytic virotherapy in cancer trea™ent. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(9): p.689-706.

Har™ann, G. et al., Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. J Immunol, 2000. 164(2): p.944-53.

Hato, S.V., et al., Molecular pathways: the immunogenic effects of platinum-based chemotherapeutics. Clin Cancer Res, 2014. 20(11): p.2831-7.

Hemmi, H., et al., A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature, 2000. 408(6813): p.740-5.

Hiramatsu, K., et al., CpG oligodeoxynucleotides potentiate the antitumor activity of anti-BST2 antibody. Cancer Sci, 2015. 106(10): p.1474-8.

Hollingsworth, R.E., et al., Turning the corner on therapeutic cancer vaccines. NPJ Vaccines, 2019. 4:p. 7.

Iurescia, S., et al., Targeting Cytosolic Nucleic Acid-Sensing Pathways for Cancer Immunotherapies. Front Immunol, 2018. 9: p.711.

Jahrsdörfer, B. et al., CpG oligodeoxynucleotides as immunotherapy in cancer. Update Cancer Ther, 2008. 3(1): p.27-32.

Jarry, U., et al., Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. J Neuroimmunol, 2014. 267(1-2): p.35-42.

Kasperkovitz, P.V., et al., Toll-like receptor 9 modulates macrophage antifungal effector function during innate recognition of Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun, 2011. 79(12): p.4858-67.

Kleinovink, J.W., et al., Photodynamic-Immune Checkpoint Therapy Eradicates Local and Distant Tumors by CD8. Cancer Immunol Res, 2017. 5(10): p.832-838.

Kline, J.N., et al., Toll-like receptor 9 activation with CpG oligodeoxynucleotides for asthma therapy. Drug News Perspect, 2008. 21(8): p.434-9.

Krieg, A.M., Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nat Rev Drug Discov, 2006. 5(6): p.471-84.

Krieg, A.M., Development of TLR9 agonists for cancer therapy. J Clin Invest, 2007. 117(5): p.1184-94.

Lee, G.R., The Balance of Th17 versus Treg Cells in Autoimmunity. Int J Mol Sci, 2018. 19(3): p.730.

Liu, M., et al., Metabolic rewiring of macrophages by CpG potentiates clearance of cancer cells and overcomes tumor-expressed CD47-mediated 'don't-eat-me' signal. Nat Immunol, 2019. 20(3): p.265-275.

Maeda, T., et al., A novel plasmacytoid dendritic cell line, CAL-1, established from a patient with blastic natural killer cell lymphoma. Int J Hematol, 2005. 81(2): p.148-54.

Mantovani, A., et al., The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. J Exp Med, 2015. 212(4): p.435-45.

Martinez-Quintanilla, J., et al., Oncolytic viruses: overcoming translational challenges. J Clin Invest, 2019. 130: p.1407-1418.

Narita, M., et al., Plasmacytoid dendritic cell leukemia with potent antigen-presenting ability. Acta Haematol, 2008. 120(2): p.91-9.

O'Donnell, J.S., et al., The Promise of Neoadjuvant Immunotherapy and Surgery for Cancer Trea™ent. Clin Cancer Res, 2019, 25(19): p.5743-5751.

Ohto, U., et al., Toll-like Receptor 9 Contains Two DNA Binding Sites that Function Cooperatively to Promote Receptor Dimerization and activation. Immunity, 2018. 48(4): p.649-658.

Ohue, Y., et al., Regulatory T (Treg) cells in cancer: Can Treg cells be a new therapeutic target? Cancer Sci, 2019. 110(7): p.2080-2089.

Pardoll, D.M., The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer, 2012. 12(4): p.252-64.

Passardi, A., et al., Immune Checkpoints as a Target for Colorectal Cancer Trea™ent. Int J Mol Sci, 2017. 18(6): E1324

Patin, E.C., et al., Pattern recognition receptors in fungal immunity. Semin Cell Dev Biol, 2019. 89: p.24-33.

Pohar, J., et al., Phosphodiester backbone of the CpG motif within immunostimulatory oligodeoxynucleotides augments activation of Toll-like receptor 9. Sci Rep, 2017. 7(1): p.14598.

Pohar, J., et al., Selectivity of Human TLR9 for Double CpG Motifs and Implications for the Recognition of Genomic DNA. J Immunol, 2017. 198(5): p.2093-2104.

Puig M. et al., Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in CpG ODN type D: structural studies and immunomodulatory activity in primates., Nucleic Acids Res. 2006, 34(22): p.6488-95

Raja, J., et al., Oncolytic virus immunotherapy: future prospects for oncology., J Immunother Cancer, 2018. 6(1): p.140.

Ray, A., et al., A novel TLR-9 agonist C792 inhibits plasmacytoid dendritic cell-induced myeloma cell growth and enhance cytotoxicity of bortezomib. Leukemia, 2014. 28(8): p.1716-24.

Reilley, M., et al., Phase 1 trial of TLR9 agonist lefitolimod in combination with CTLA-4 checkpoint inhibitor ipilimumab in advanced tumors. Journal of Clinical Oncology, 2019. 37(15_suppl): p.TPS2669-TPS2669.

Ribas, A., et al., SD-101 in Combination with Pembrolizumab in Advanced Melanoma: Results of a Phase Ib, Multicenter Study. Cancer Discov, 2018. 8(10): p.1250-1257.

Roda, J.M., et al., CpG-containing oligodeoxynucleotides act through TLR9 to enhance the NK cell cytokine response to antibody-coated tumor cells. J Immunol, 2005. 175(3): p.1619-27.

Sargent, D.J., et al., Defective mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer. J Clin Oncol, 2010. 28(20): p.3219-26.

Scheiermann, J. and Klinman, D.M., Clinical evaluation of CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases and cancer. Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89.

Shi, G., et al., Differential involvement of Th1 and Th17 in pathogenic autoimmune processes triggered by different TLR ligands. J Immunol, 2013. 191(1): p.415-23.

Shirota, H., et al., CpG Oligonucleotides as Cancer Vaccine Adjuvants. Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407.

Shirota, Y., et al., Intratumoral injection of CpG oligonucleotides induces the differentiation and reduces the immunosuppressive activity of myeloid-derived suppressor cells. J Immunol, 2012. 188(4): p.1592-9.

Schmitt, H et al., OP004 The TLR9 agonist cobitolimod induces anti-inflammatory effects and balances the Th17/T-reg cell response in ulcerative colitis. J Crohns Colitis, 2018, 12(Suppl1): p.S003

Sivanandam, V., et al., Oncolytic Viruses and Immune Checkpoint Inhibition: The Best of Both Worlds. Mol Ther Oncolytics, 2019. 13: p.93-106.

Spaner, D.E., et al., Toll-like receptor agonists in the trea™ent of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2007. 21(1): p.53-60.

Spisek, R., et al., Bortezomib enhances dendritic cell (DC)-mediated induction of immunity to human myeloma via exposure of cell surface heat shock protein 90 on dying tumor cells: therapeutic implications. Blood, 2007. 109(11): p.4839-45.

Swiecki, M., et al., Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol Rev, 2010. 234(1): p.142-62.

Temizoz B., et al, TLR9 and STING agonists synergistically induce innate and adaptive type-II IFN. Eur J Immunol, 2015, 45(4): p.1159-69

Tigno-Aranjuez, JT, et al., Encephalitogenicity of complete Freund's adjuvant relative to CpG is linked to induction of Th17 cells. J Immunol, 2009, 183(9): p.5654-61

Wang, S., et al., Intratumoral injection of a CpG oligonucleotide reverts resistance to PD-1 blockade by expanding multifunctional CD8+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(46): p.E7240-E7249.

Wang, X., et al., A CpG oligodeoxynucleotide acts as a potent adjuvant for inactivated rabies virus vaccine. Vaccine, 2008. 26(15): p.1893-901.

Weigel, B.J., et al., CpG oligodeoxynucleotides potentiate the antitumor effects of chemotherapy or tumor resection in an orthotopic murine model of rhabdomyosarcoma. Clin Cancer Res, 2003. 9(8): p.3105-14.

Winkler, J., Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther Deliv, 2013. 4(7): p. 791-809.

Xu, L., et al., CpG oligodeoxynucleotides enhance the efficacy of adoptive cell transfer using tumor infiltrating lymphocytes by modifying the Th1 polarization and local infiltration of Th17 cells. Clin Dev Immunol, 2010: p.410893.

Yang, L. et al., Tumor-associated macrophages: from basic research to clinical application. J Hematol Oncol, 2017. 10(1): p.58.

Zimmerman, G., et al., Post-traumatic anxiety associates with failure of the innate immune receptor TLR9 to evade the pro-inflammatory NFB pathway. Transl Psychiatry, 2012. 2: p.e78.

[Сущность изобретения]

[Технические проблемы]

[0028]

Настоящее изобретение относится к новым агонистам TLR и их терапевтическим применениям.

[Решение проблемы]

[0029]

Авторы изобретения впервые обнаружили, что

(1) олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться для активации или модулирования иммунитета у индивидуума; и

(2) олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются особенно пригодными для лечения индивидуума, страдающего от заболеваний, включающих опухоль, инфекцию микроорганизмом, первичное иммунодефицитное заболевание и Th2/Th17-обусловленное заболевание, или для профилактики таких заболеваний.

[0030]

Настоящее изобретение включает следующие варианты осуществления:

(1) Одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий мотивы последовательности 5’-tcgcaacgttt-3’ (SEQ ID NO:1) и 5’-cgacg-3’.

(2) Олигонуклеотид согласно (1), где олигонуклеотид содержит мотив нуклеотидной последовательности 5’-tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3’ (SEQ ID NO:2), где n обозначает любое основание.

(3) Олигонуклеотид согласно (1) или (2), где общее количество нуклеотидов составляет от 20 до 25, предпочтительно от 21 до 24, более предпочтительно от 22 до 23.

(4) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(3), где олигонуклеотид содержит мотив последовательности, выбранный из группы, состоящей из следующих:

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcggtcga (SEQ ID NO:54);

5’-tcgcaacgtttgcgacggcgctcga (SEQ ID NO:55);

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcgttcga (SEQ ID NO:56);

5’-tcgcaacgtttgcgacggcgttcga (SEQ ID NO:57);

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcgttcg (SEQ ID NO:58);

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcgttcgg (SEQ ID NO:59);

5’-tcgcaacgtttacgacgtcggtcga (SEQ ID NO:60);

5’-tcgcaacgtttacgacggcgctcga (SEQ ID NO:61);

5’-tcgcaacgtttacgacgtcgttcga (SEQ ID NO:62); и

5’-tcgcaacgtttacgacggcgttcga (SEQ ID NO:63).

(5) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(4), где межнуклеотидная связь(и) в олигонуклеотиде является частично или полностью химически модифицированной.

(6) Олигонуклеотид согласно (5), где химически модифицированная межнуклеотидная связь является фосфоротиоатной.

(7) Олигонуклеотид согласно (6), где олигонуклеотид содержит частично фосфоротиоатный олигонуклеотидный участок, выбранный из группы, состоящей из

5’-tCgcaacgtttgcgacgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:16);

5’-tCgcaaCgtttgcgacgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:17);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:18);

5’-tCgCaacgtttgCgaCgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:19);

5’-tCgCaacgtttgCgaCgtcgttCgA-3’ (SEQ ID NO:20);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:21);

5’-tCgCaaCgtttgCgaCgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:22);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:23);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:24);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:26);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgcCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:27);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgtaCgA-3’ (SEQ ID NO:28);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgtgCgA-3’ (SEQ ID NO:29);

5’-tCgCaaCgtttacgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:30);

5’-tCgCaaCgtttacgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:31);

5’-tCgCaaCgtttacgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:32);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:33);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:34);

5’-tCgCaaCgtttGcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:35);

5’-tCgCaaCgtttAcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:36);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:37);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:38);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCggtCgG-3’ (SEQ ID NO:39);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCggtCgG-3’ (SEQ ID NO:40);

5’-tCgCaaCgtttGcgacggCgctCgG-3’ (SEQ ID NO:41);

5’-tCgCaaCgtttAcgacggCgctCgG-3’ (SEQ ID NO:42);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCgttCgG-3’ (SEQ ID NO:43); и

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCgttCgG-3’ (SEQ ID NO:44);

где заглавной буквой указан нуклеозид без модифицированной межнуклеотидной связи на 3’-стороне, и прописной буквой указан нуклеозид с фосфоротиоатной межнукдеотидной связью на 3’-стороне.

(8) Олигонуклеотид согласно (6), где олигонуклеотид содержит частично фосфоротиоатный олигонуклеотидный участок, выбранный из группы, состоящей из,

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:33);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:34);

5’-tCgCaaCgtttGcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:35); и

5’-tCgCaaCgtttAcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:36),

где заглавными буквами указан нуклеозид без модифицированной межнуклеотидной связи на 3’-стороне, и строчной буквой указан нуклеозид с фосфоротиоатной межнуклеотидной связью на 3’-стороне.

(9) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(8), где олигонуклеотид составлен из ДНК.

(10) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(9), где в олигонуклеотиде дополнительно делетирован, заменен или добавлен один или несколько нуклеотид(ов).

(11) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(10), где олигонуклеотид содержится в экспрессирующем векторе.

(12) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(10), где олигонуклеотид является кольцевым.

(13) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(10), где олигонуклеотид является линейным.

(14) Олигонуклеотид согласно (13), где 3’-конец линейного олигонуклеотида не имеет фосфорной кислоты.

(15) Двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий олигонуклеотид согласно любому из (1)-(10) и комплементарный ему олигонуклеотид.

(16) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(15), который конъюгирован с активными молекулами.

(17) Олигонуклеотид согласно (16), где активная молекула выбрана из группы, состоящей из (поли)пептидов/антител и нуклеиновых кислот/олигонуклеотидов.

(18) Олигонуклеотид согласно (16) или (17), где конъюгация осуществлена через линкер.

(19) Олигонуклеотид согласно (18), где линкер выбран из группы, состоящей из глицерина, (S)-(-)-1,2,4-бутантриола, 1,3,5-пентантриола, цис, цис-1,3,5,-циклогексантриола, цис, транс-1,3,5-циклогексантриола, 1,3,5-трис-(2-гидроксиэтил)изоцианурата, тетраэтиленгликоля и гексаэтиленгликоля, диолов, таких как 1,3-пропандиол или додекан-1,12-диол, циклогександиол, холестерин, нитродиол, триэтиленгликоля, гексаэтиленгликоля, d-спейсера, ПЭГ-спейсера и алкильного линкера.

[0031]

(20) Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19) и фармацевтически приемлемый носитель.

[0032]

(21) Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения целевого заболевания или нарушения, содержащая терапевтически эффективное количество олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19), где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из новообразований, инфекционного заболевания, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

(22) Фармацевтическая композиция согласно (21), где целевое заболевание или нарушение представляет собой новообразование, выбранное из группы, состоящей из злокачественного новообразования, эпителиального новообразования или опухоли гемопоэтического органа, саркомы, мезотелиомы, доброкачественной опухоли, дисплазии и метаплазии.

(23) Фармацевтическая композиция согласно (21), где целевое заболевание или нарушение представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии или грибы.

(24) Фармацевтическая композиция согласно (21), где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание, обусловленное с Th2/Th17, выбранное из группы, состоящей из астмы, атопического заболевания, аллергии, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь крона, кожного плоского лишая и болезни Альцгеймера.

(25) Фармацевтическая композиция согласно (21), где целевое заболевание или нарушение представляет собой первичное иммунодефицитное заболевание, вызванное дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями в TLR.

(26) Фармацевтическая композиция согласно (20) или (21), где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один активный ингредиент.

(27) Фармацевтическая композиция согласно (20) или (21), где композицию вводят совместно по меньшей мере с одним активным ингредиентом.

(28) Фармацевтическая композиция согласно (26) или (27), где активный ингредиент выбран из группы, состоящей из противораковых лекарственных средств; молекулярных таргетных лекарственных средств, включая ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы ангиогенеза и ингибиторы протеасом; противораковых антительных лекарственных средств; цитокинов; вакцин; антибактериальных средств; противогрибковых средств; противовирусных средств; противопаразитарных лекарственных средств; антительных лекарственных средств для нейтрализации токсина; агонистов других TLR и их комбинации.

(29) Фармацевтическая композиция согласно (20) или (21), где композицию вводят индивидууму способом дозирования, выбранным из группы, состоящей из энтерального введения, парентерального введения, местного введения и ингаляции.

(30) Фармацевтическая композиция согласно (29), где индивидуумом является человек.

(31) Фармацевтическая композиция согласно (30), где композицию вводят индивидууму в дозе 0,3-60 мг/сутки, предпочтительно 1-30 мг/сутки, более предпочтительно 2-8 мг/сутки.

(32) Фармацевтическая композиция согласно (20) или (21), где композицию вводят до или после адоптивной терапии иммунными клетками или хирургического лечения, включая лучевую терапию, криоабляцию, радиочастотную абляцию и фотодинамическую терапию (PDT).

[0033]

(A1) Применение олигонуклеотидов согласно любому из (1)-(19) для производства лекарственного средства для лечения или профилактики целевого заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из новообразования, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

(A2) Применение олигонуклеотидов согласно любому из (1)-(19) для производства лекарственного средства для модулирования иммунного ответа у индивидуума.

(A3) Применение согласно (A1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой новообразование, выбранное из группы, состоящей из злокачественного новообразования, эпителиального новообразования или опухоли гемопоэтического органа, саркомы, мезотелиомы, доброкачественной опухоли, дисплазии и метаплазии.

(A4) Применение согласно (A1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии или грибы.

(A5) Применение согласно (A1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание, обусловленное с Th2/Th17, выбранное из группы, состоящей из астмы, атопического заболевания, аллергии, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь крона, кожного плоского лишая и болезни Альцгеймера.

(A6) Применение согласно (A1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой первичное иммунодефицитное заболевание, вызванное дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями в TLR.

(A7) Применение согласно (A1) или (A2), где лекарственное средство дополнительно содержит по меньшей мере один активный ингредиент.

(A8) Применение согласно (A1) или (A2), где лекарственное средство вводят совместно по меньшей мере с одним активным ингредиентом.

(A9) Применение согласно (A7) или (A8), где активный ингредиент выбран из группы, состоящей из противораковых лекарственных средств; молекулярных таргетных лекарственных средств, включая ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы ангиогенеза и ингибиторы протеасом; противораковых антительных лекарственных средств; цитокинов; вакцин; антибактериальных средств; противогрибковых средств; противовирусных средств; противопаразитарных лекарственных средств; антительных лекарственных средств для нейтрализации токсина; агонистов других TLR и их комбинации.

(A10) Применение согласно (A1) или (A2), где лекарственное средство вводят индивидууму способом дозирования, выбранным из группы, состоящей из энтерального введения, парентерального введения, местного введения и ингаляции.

(A11) Применение согласно (A10), где индивидуумом является человек.

(A12) Применение согласно (A11), где лекарственное средство вводят индивидууму в дозе 0,3-60 мг/сутки, предпочтительно 1-30 мг/сутки, более предпочтительно 2-8 мг/сутки.

(A13) Применение согласно (A1) или (A2), где лекарственное средство вводят до или после адоптивной терапии иммунными клетками или хирургического лечения, включая лучевую терапию, криоабляцию, радиочастотную абляцию и фотодинамическую терапию (PDT).

[0034]

(B1) Способ лечения или предупреждения целевого заболевания или нарушения у индивидуума, включающий введение индивидууму олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19) индивидууму, где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из новообразования, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD); предпочтительно где целевое заболевание или нарушение лечат или предупреждают посредством активации NF-B посредством олигонуклеотида у индивидуума.

(B2) Способ согласно (B1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой новообразование, выбранное из группы, состоящей из злокачественного новообразования, эпителиального новообразования или опухоли гемопоэтического органа, саркомы, мезотелиомы, доброкачественной опухоли, дисплазии и метаплазии.

(B3) Способ согласно (B1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии или грибы.

(B4) Способ согласно (B1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание, обусловленное с Th2/Th17, выбранное из группы, состоящей из астмы, атопического заболевания, аллергии, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь крона, кожного плоского лишая и болезни Альцгеймера.

(B5) Способ согласно (B1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой первичное иммунодефицитное заболевание, вызванное дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями в TLR.

(B6) Способ согласно (B1), где олигонуклеотид вводят совместно по меньшей мере с одним активным ингредиентом.

(B7) Способ согласно (B6), где активный ингредиент выбран из группы, состоящей из противораковых лекарственных средств; молекулярных таргетных лекарственных средств, включая ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы ангиогенеза и ингибиторы протеасом; противораковых антительных лекарственных средств; цитокинов; вакцин; антибактериальных средств; противогрибковых средств; противовирусных средств; противопаразитарных лекарственных средств; антительных лекарственных средств для нейтрализации токсина; агонистов других TLR и их комбинации.

(B8) Способ согласно (B1), где олигонуклеотид вводят индивидууму способом дозирования, выбранным из группы, состоящей из энтерального введения, парентерального введения, местного введения и ингаляции.

(B9) Способ согласно (B8), где индивидуумом является человек.

(B10) Способ согласно (B9), где олигонуклеотид вводят индивидууму в дозе 0,3-60 мг/сутки, предпочтительно 1-30 мг/сутки, более предпочтительно 2-8 мг/сутки.

(B11) Способ согласно (B1), дополнительно включающий стадию адоптивной терапии иммунными клетками или хирургического лечения, включая лучевую терапию, криоабляцию, радиочастотную абляцию и фотодинамическую терапию (PDT).

[0035]

(C1) Способ стимуляции иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19) для индукции воспалительного цитокина у индивидуума.

(C2) Способ перенацеливания Th2-смещенного иммунного ответа в сторону Th1-смещенного иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19) для индукции воспалительных цитокинов у индивидуума.

(C3) Способ согласно (C1) или (C2), где воспалительный цитокин выбран из группы, состоящей из IL-6, TNF-α, IFN-γ и IL-12.

[0036]

(D1) Олигонуклеотид согласно любому из (1)-(19) для применения для профилактики или лечения целевого заболевания или нарушения, где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из новообразования, инфекционного заболевания, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

(D2) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой новообразование, выбранное из группы, состоящей из злокачественного новообразования, эпителиального новообразования или опухоли гемопоэтического органа, саркомы, мезотелиомы, доброкачественной опухоли, дисплазии и метаплазии.

(D3) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии или грибы.

(D4) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание, обусловленное Th2/Th17, выбранное из группы, состоящей из астмы, атопического заболевания, аллергии, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь крона, кожного плоского лишая и болезни Альцгеймера.

(D5) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где целевое заболевание или нарушение представляет собой первичное иммунодефицитное заболевание, вызванное дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями в TLR.

(D6) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где олигонуклеотид вводят совместно по меньшей мере с одним активным ингредиентом.

(D7) Олигонуклеотид для применения согласно (D6), где активный ингредиент выбран из группы, состоящей из молекулярных таргетных лекарственных средств, включая ингибиторы тирозинкиназ, ингибиторы ангиогенеза, ингибиторы протеасом, противораковые антительные лекарственные средства и цитокины, и их комбинации.

(D8) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где олигонуклеотид вводят индивидууму способом дозирования, выбранным из группы, состоящей из энтерального введения, парентерального введения, местного введения и ингаляции.

(D9) Олигонуклеотид для применения согласно (D8), где индивидуумом является человек.

(D10) Олигонуклеотид для применения согласно (D9), где олигонуклеотид вводят индивидууму в дозе 0,3-60 мг/сутки, предпочтительно 1-30 мг/сутки, более предпочтительно 2-8 мг/сутки.

(D11) Олигонуклеотид для применения согласно (D1), где олигонуклеотид вводят до или после адоптивной терапии иммунными клетками или хирургического лечения, включая лучевую терапию, криоабляцию, радиочастотную абляцию и фотодинамическую терапию (PDT).

[0037]

(E1) Применение олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19) для лечения или профилактики целевого заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из новообразования, инфекционного заболевания, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

[0038]

(F1) Средство для модулирования иммунного ответа in vivo или in vitro, содержащее эффективное количество олигонуклеотида согласно любому из (1)-(19).

[Преимущественные эффекты изобретения]

[0039]

Настоящее изобретение может обеспечить новые CpG-олигонуклеотиды и терапевтическое применение олигонуклеотидов.

[Краткое описание чертежей]

[0040]

[ФИГ. 1] Активация NF-B и продуцирование провоспалительных цитокинов агонистами TLR в клеточной линии плазмацитоидных дендритных клеток (pDC) человека.

Клеточная линия CAL-1/NF-B-GFP была создана для мониторинга активности фактора транскрипции NF-B в клеточных способах анализа. Вектором, кодирующим репортерный ген GFP под контролем консенсусного транскрипционного элемента ответа NF-B, трансфицировали клеточную линию pDC человека CAL-1.

A. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали олигодезоксинуклеотидами (ODN) по настоящему изобретению или положительным контролем в течение 6 часов в количестве 1 мкМ (микромоль/л). Экспрессия GFP, индуцированная агонистами TLR9, показана на точечных графиках.

B. На графике представлено соотношение клеток CAL-1/NF-B-GFP, активированных через TLR9 посредством ODN. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN по настоящему изобретению или положительными контролями в течение 6 часов в дозе 0,3 мкМ. Доля положительных по GFP клеток в образце с CpG2395 была принята за 100%. Активность каждого ODN вычисляли посредством сравнения соотношения положительных по GFP клеток с клетками с CpG2395.

C. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 6 часов в количестве 1,0 мкМ. Активность A003#delA была несколько более слабой по сравнению с A003, однако активность все еще была значительно более высокой, чем у одного из аутентичных агонистов TLR9, CpG2395 (см. ФИГ. 1A). Активность активации TLR9 у A003#endG и A003 имела сходный уровень, что указывает на то, что 3’-нуклеозид не является важным для активности.

D. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN в количестве 1 мкМ в течение 6 часов и культуральные супернатанты отделяли. Продуцирование цитокинов оценивали посредством ELISA.

E, F. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали посредством ODN в течение 6 часов в количестве 1,0 мкМ. Исследовали экспрессию GFP (ФИГ. 1E) и продуцирование цитокинов в культуральных супернатантах оценивали посредством ELISA (ФИГ. 1F). Активность A003 и A013 была практически одинаковой при их сравнении, что указывает на то, что изменение основания в олигонуклеотиде не влияет на активность.

G. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали посредством ODN в количестве 1,0 мкМ в течение 6 часов и исследовали экспрессию GFP. Каждый набор из A001/A011, A002/A012, A003/A013 или A004/A014 демонстрировал одинаковую активность, что указывает на то, что изменение основания в каждом наборе ODN не влияет на активность.

[0041]

[ФИГ. 2] Активация TLR7 и TLR8 человека

A. Клетки HEK blue™ TLR7 стимулировали агонистами TLR в течение 24 часов. Как показано, агонисты TLR7 гардиквимод (GQ) и CL264 активировали TLR7 и обеспечивали положительные сигналы. Напротив, аутентичный агонист TLR9, CpG2395, и ODN по настоящему изобретению, A001-A004, в количестве 0,3 мкМ не могли активировать каскад передачи сигнала TLR7.

B. Клетки HEK blue™ TLR8 стимулировали посредством ODN в течение 24 часов. Как показано на ФИГ. , агонисты TLR8, TL8-506 и CL075, активировали TLR8 и давали положительные сигналы. Напротив, CpG2395, и A001-A004 (0,3 мкМ) не могли активировать каскад передачи сигнала TLR8.

[0042]

[ФИГ. 3] Активация NF-B и продуцирование провоспалительных цитокинов

A. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 6 часов в количестве 0,3 мкМ. CaaCg является важным для активации TLR9 человека.

B. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 6 часов в количестве 0,3 мкМ или 0,1 мкМ. Представлены доли положительных по GFP клеток (показанные в %).

C. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 6 часов в количестве 0,3 мкМ или 0,1 мкМ. A303, A603 и A703 продемонстрировали более высокую активность, чем другие протестированные ODN, что указывает на то, что присутствие CaaCg является более важным, чем количество Cg.

D. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN в течение 6 часов в количестве 0,3 мкМ и культуральные супернатанты отделяли. Продуцирование цитокинов оценивали посредством ELISA. A403 и A503 отчетливо продемонстрировали более низкие уровни активности индукции продуцирования цитокинов, что указывает на то, что CaaCg является важным для оптимальной стимуляции TLR9.

E. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 6 часов в количестве 0,3 мкМ. Доля положительных по GFP клеток для CpG2395 принята за 100% на этом чертеже. Активность каждого ODN вычисляли из доли положительных по GFP клеток по сравнению с CpG2395. DV093 и DV094 продемонстрировали более низкую активность в отношении TLR9, чем A003, что указывает на то, что для активности TLR9 является важным конкретный мотив caacg, локализованный в A003, но не мотив caacg в случайном положении.

F. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN в течение 6 часов в количестве 0,3 мкМ. Доля положительных по GFP клеток для CpG2395 принята за 100%. Активность каждого ODN вычисляли из доли положительных по GFP клеток по сравнению с CpG2395. Следует отметить, что структурное изменение участка caacg на участок CaaCg в DV093 и DV094 путем изменения межнуклеотидных связей не усиливает активность TLR9.

[0043]

[ФИГ. 4] Необязательные нуклеотиды в 3’-области ODN по настоящему изобретению

A, B. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN в количестве 0,3 мкМ в течение 6 часов. Доля положительных по GFP клеток (%) представлена в (B). Аутентичный агонист TLR9 CpG2006 продемонстрировал значительно более слабую активность по сравнению с A601, A602, A603, A604, A605, A606 и A607 (B).

[0044]

[ФИГ. 5] Активация TLR7 и TLR8 человека

A. Клетки HEK blue™ TLR7 стимулировали ODN или положительным контролем в течение 24 часов. Агонист TLR7 CL264 активировал TLR7 и давал положительный сигнал. Напротив, CpG2395, A601, A602 и A603 (0,3 мкМ) не могли активировать каскад передачи сигнала TLR7.

B. Клетки HEK blue™ TLR8 стимулировали ODN или положительным контролем в течение 24 часов. Агонист TLR8 CL075 активировал TLR8 и давал положительный сигнал. Напротив, CpG2395, A601, A602 и A603 (0,3 мкМ) не могли активировать каскад передачи сигнала TLR8.

[0045]

[ФИГ. 6] Ничтожно малый эффект на активность активации TLR9 посредством изменения межнуклеотидных связей и изменения оснований в середине ODN.

A. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали A601, A601G, A602 или A602G (0,3 мкМ) в течение 3 часов.

B. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали A601G, A611A, A602G или A612A (0,3 мкМ) в течение 3 часов.

C. Клетки CAL-1/NF-B-GFP стимулировали ODN в течение 3 часов в количестве 0,3 мкМ. Показана доля положительных по GFP клеток (%).

[0046]

[ФИГ. 7] Активация TLR7 и TLR8 человека

A. Клетки HEK blue™ TLR7 стимулировали агонистами TLR в течение 24 часов. Агонист TLR7 CL264 активировал TLR7 и давал положительный сигнал. Напротив, CpG2395, A601G, A611A, A602G и A612A (0,3 мкМ) не могли активировать каскад передачи сигнала TLR7.

B. Клетки HEK blue™ TLR8 стимулировали агонистами TLR в течение 24 часов. Агонист TLR8 CL075 активировал TLR8 и давал положительный сигнал. Напротив, CpG2395, A601G, A611A, A602G и A612A (0,3 мкМ) не могли активировать каскад передачи сигнала TLR8.

[0047]

[ФИГ. 8] Активность индукции продуцирования цитокинов в B-клетках человека или в PBMC человека

A. Клетки HAL-01 стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 24 часов в количестве 1 мкМ. Клетки окрашивали антителом (Ab) против CD40 и Ab против CD86. Индукцию экспрессии CD40 и CD86 оценивали посредством проточного цитометра.

B. PBMC человека стимулировали ODN по настоящему изобретению (0,1 мкМ) в течение 24 часов и клеточную пролиферацию оценивали посредством анализа WST-1.

C. PBMC человека стимулировали ODN по настоящему изобретению (0,3 мкМ) в течение 24 часов и культуральные супернатанты отделяли. Продуцирование цитокинов оценивали посредством ELISA.

[0048]

[ФИГ. 9] Активность агониста в отношении клеток мыши

A. Спленоциты мыши стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 24 часов и получали супернатанты. Продуцирование цитокинов оценивали посредством ELISA.

B, C. Спленоциты мыши стимулировали ODN по настоящему изобретению в течение 48 часов. Клеточную пролиферацию оценивали посредством анализа WST-1. A601, A602 и A603 демонстрировали более высокую активность, чем аутентичные агонисты TLR9 CpG2395 и CpG2006.

[0049]

[ФИГ. 10] Противоопухолевая активность in vivo

A. Клетки CT26 инокулировали в правый бок и мышей оставляли без лечения в течение двух недель. Проводили измерение объемов опухолей и мышей разделяли на три группы на основе объемов опухолей. Введение ODN по настоящему изобретению или PBS в околоопухолевые области проводили в день распределения на группы (сутки 0) и повторяли на 2 сутки. ODN по изобретению вводили всего два раза в ходе испытания. Объемы опухоли в каждой группе измеряли каждые двое суток.

B. Объем опухоли каждой мыши каждый день.

C. Среднее значение массы тела у мышей в каждой группе в ходе испытания. Не наблюдали серьезного снижения массы тела ни в одной из групп.

[0050]

[ФИГ. 11] Индукция памяти противоопухолевого иммунитета

B. Клетки CT26 вновь инокулировали в левый бок каждой группы мышей на 14 сутки, а затем мышей оставляли без лечения. Объемы опухолей на левом боку измеряли до 14 суток после повторной инокуляции CT26. Следует отметить, что у мышей, которым вводили ODN по настоящему изобретению, происходило отторжение повторной опухоли без какого-либо дополнительного лечения в течение 2 недель, что указывает на то, что ODN по настоящему изобретению индуцировали память противоопухолевого иммунитета.

[0051]

[ФИГ. 12] Эффективность in vivo в модели метастазов в легких

Для индукции метастазов клеток CT26 в легких клеточную суспензию внутривенно инъецировали мышам BALB/c (5×10⁵ клеток/мышь) из хвостовой вены (0 сутки). На 1 сутки начинали введение ODN по настоящему изобретению (подкожная инъекция в кожу спины, 40 мкг/50 мкл/мышь). ODN в той же дозе повторно вводили на 5 сутки. На 18 сутки мышей умерщвляли. Массу легких измеряли и подсчитывали метастатические опухолевые узелки в каждом легком мышей.

[0052]

[ФИГ. 13] Системный эффект против метастазов опухоли

A. Для индукции метастазов клеток CT26 в легких клеточные суспензии внутривенно инъецировали мышам BALB/c (5×10⁵ клеток/мышь) из хвостовых вен (0 сутки). На следующие сутки после инокуляции опухоли (сутки 1) начинали введение A602. Тестировали два пути введения. Один из них представляет собой подкожную (п/к) инъекцию в кожу спины, а другой представляет собой внутрикожную (в/к) инъекцию в основание уха (25 мкг/мышь). Введение в той же дозе проводили на 3 сутки и 5 сутки. На 16 сутки мышей умерщвляли и подсчитывали метастатические опухолевые узелки в каждом легком мышей (график справа). Фотографии: извлеченные легки протестированных мышей на 16 сутки.

B. Для индукции метастазов клеток CT26 в печени клеточные суспензии инъецировали в селезенку (1×10⁵ клеток/мышь, сутки 0). На 2 сутки мышей подразделяли на три группы на основе массы тела и начинали введение A602. В этом испытании тестировали два пути введения: п/к инъекцию в кожу спины и в/к инъекцию в основание уха (12,5 мкг/мышь). Введение в той же дозе также проводили на 5 сутки, 8 сутки и 12 сутки. На 20 сутки мышей умерщвляли и подсчитывали метастатические опухолевые узелки в печени от каждой мыши.

[0053]

[ФИГ. 14] Уничтожение клеток B-ALL посредством активированных PBMC

A. PBMC человека сокультивировали с клетками B-ALL человека, RCH-ACV, вместе с ODN по настоящему изобретению (0,1 мкМ) в течение 3 суток и все клетки анализировали посредством проточной цитометрии после окрашивания антителами против CD19 и CD138.

B. Представлены доли популяций RCH-ACV по сравнению с нестимулированным образцом, показатели которого были приняты за 100%.

[0054]

[ФИГ. 15] Уничтожение клеток карциномы толстого кишечника активированными PBMC

A. PBMC человека (5×10⁵) сокультивировали с клетками карциномы толстого кишечника человека, COLO205, вместе с ODN по настоящему изобретению (0,1 мкМ) в течение 3 суток и все клетки анализировали путем окрашивания антителами против CD45 и CD24.

B. Представлены доли популяций COLO205 в образцах по сравнению с нестимулированным образцом, показатели которого были приняты за 100%.

[0055]

[ФИГ. 16] Эффект на иммунные клетки

A. PBMC человека и спленоциты мыши стимулировали ODN по настоящему изобретению (0,15 мкМ) в течение 24 часов и оценивали клеточную пролиферацию посредством анализа WST-1.

B. PBMC человека сокультивировали со злокачественными клетками (RCH-ACV или COLO205) вместе с ODN по настоящему изобретению (0,1 мкМ) в течение 3 суток. Оценивали уничтожение злокачественных клеток посредством PBMC человека. Представлены доли злокачественных клетках в образцах по сравнению с нестимулированным образцом, показатели которого были приняты за 100%.

[Предпочтительный вариант осуществления]

[0056]

Если нет иных указаний, все термины в настоящем описании обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. Термины в форме единственного числа включает множественное число упоминаемых объектов, если контекст явно не указывает на иное. Аналогично, подразумевается, что слово "или" включает "и", если контекст не указывает на иное. Термин "немного" означает число от 2 до 3 в настоящем описании. Термин "несколько" означает число от 2 до 6 в настоящем описании. В случае противоречия настоящее описание, включая пояснения терминов, имеет преимущество. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и подразумевается, что они не являются ограничивающими. "Лечить", "проведение лечения" или "лечение" имеют одинаковое значение независимо от грамматики. Аналогично, "предупреждать", "проведение предупреждения" или "предупреждение" имеют одинаковое значение независимо от грамматики.

[0057]

"Нуклеотид": нуклеотид является компонентом молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, РНК и химерная молекула ДНК и РНК. Нуклеотид может состоять из основания, фосфорной кислоты и сахара. Нуклеотид может представлять собой фосфатный сложный эфир нуклеозида.

"Нуклеозид": нуклеозид может состоять из основания и молекулы сахара, и он является компонентом нуклеотида. Нуклеозид может включать дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезокситимидин, дезоксицитидин, аденозин, гуанозин, уридин и цитидин.

"Олигонуклеотид": олигонуклеотид представляет собой полимер/олигомер из нуклеотидов, которые соединены межнуклеотидными связями. Конформация олигонуклеотида может быть линейной или кольцевой.

"Основание": основание является одним из компонентов нуклеотида и нуклеозида. Природные основания включают две группы: пуриновые основания, такие как гуанин и аденин, и пиримидиновые основания, такие как тимин, цитозин и урацил.

"Сахар": сахар является одним из компонентов нуклеотида и нуклеозида. По сути, сахар, содержащийся в ДНК, представляет собой дезоксирибозу и сахар, содержащийся в РНК, представляет собой рибозу.

"Межнуклеотидная связь": межнуклеотидная связь означает связь между двумя соседними нуклеотидами молекулы нуклеиновой кислоты.

[0058]

Часть нуклеотида, нуклеозида, основания и сахара может быть замещена или модифицирована другой молекулой, которую называют их аналогом. Например, нуклеотид, кроме того, может включать неприродный искусственный нуклеотид, такой как PNA; основание может дополнительно включать неприродное основание, такое как гипоксантин (т.е. инозин в качестве нуклеозида); и сахар может включать неприродный элемент, такой как 2’-4’-мостик в закрытой нуклеиновой кислоте.

[0059]

В настоящей заявке "мотив (последовательности)" указывается только на основе "основания", в то время как "участок (последовательности)" указывается на основе "основания", "сахара" и "межнуклеотидной связи".

[0060]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может составлен с дезоксирибонуклеиновыми кислотами с остовом из дезоксирибозы, с рибонуклеиновыми кислотами с остовом из рибозы, или их смесью; сахарные остовы также могут быть заменены синтетическими молекулами, такими как закрытая нуклеиновая кислота (LNA), мостиковая нуклеиновая кислота (BNA), морфолино или пептидная нуклеиновая кислота (PNA).

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать химически модифицированные нуклеозиды и/или модифицированные межнуклеотидные связи для усиления одного или нескольких свойств, таких как резистентность к нуклеазам или фармакокинетика.

[0061]

Химически модифицированные нуклеозиды могут содержать модифицированные основания, как указано ниже, или модифицированные основания родственной структуры, но не ограничиваясь ими:

8-галоген(бром, хлор, фтор, йод)-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил-, 8-аза-, 8-оксо- и другие 8-замещенные пурины;

5-галоген(бром, хлор, фтор, йод)-, 5-дифторметил-, 5-трифторметил-, 5-гидрокси, 5-карбокси-, 5-гидроксиметил-, 5-бромвинил-, 5-формил-, 5-аза-, 5-алкинил-5-пропинил-, 5-(C1-C6)-алкил-, 5-(C2-C6)-алкенил-, 5-(C2-C6)-алкинил- и другие 5-замеущенные пиримидины;

5,6-дигидрокси-5,6-дигидротимин, N6-метиладенин; N4-этилцитозин, N4-алкилцитозин и другой N4-замещенный цитозин;

2-меркаптоцитозин, изоцитозин, псевдо-изоцитозин, 4-тиоурацил, дигидроурацил, псевдоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 2-амино-6-хлоропурин, 2,4-диаминопурин, 6-тиогуанин, N2-метилгуанин, N2-диметилгуанин и другие N2-замещенные гуанины.

Модифицированные нуклеотидные основания также могут представлять собой основания, замененные другими гетероциклами, например, 7-деазааденин, 8-аза-7-деазааденин, 7-деазагуанин, 2-аминопиридин и 2-пиридон.

Модифицированные нуклеотидные основания также могут содержать дополнительные конденсированные кольца, примерами таких нуклеотидных оснований являются N6-этеноаденозин, N4-этеноцитидин, N2-этеногуанозин и другие родственные производные.

[0062]

Межнуклеотидные связи представляют собой ковалентные связи остова между нуклеотидами в олиго/полинуклеотидах. Как правило, природные межнуклеотидные связи имеют фосфодиэфирную структуру, однако было описано, что различные модификации влияют на химические или физические свойства молекул. Химическая модификация в модифицированных межнуклеотидных связях, которые могут использоваться в олигонуклеотиде по настоящему изобретению, включает конвертирование природной фосфодиэфирной структуры в следующие структуры связей: фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфонат, метилфосфоротиоат, этилфосфат, фосфоноацетат, альфа-гидроксибензилфосфат, изопропилфеноксиацетат, боранофосфат, фосфонокарбоксилат, альфа-гидроксибензилфосфонат, фосфат-(C1-C21)-O-алкиловый сложный эфир, фосфат-[(C6-C12)арил-(C1-C21)-O-алкиловый] сложный эфир, сложный фосфотриэфир, сложный фосфотриэфирамид, простой эфир, ацеталь, простой тиоэфир, тиоацеталь, фосфорамидат, силоксан, карбонат, карбоксиметиловый эфир, ацетамидат, карбамат, мочевина, тиомочевина, сульфонамид или сульфонилмочевина, карбонат, карбоксиметил, амид, этиленоксидный линкер, сульфонат, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленимино, метиленаминокарбонил, метиленметилимино (MMI), метиленгидразо, метилендиметилгидразо (MDH) и метиленоксиметилимино.

[0063]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой, но не ограничиваться ими, одноцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту, одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту или ее химерную молекулу.

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой либо одинарную цепь, либо двойную цепь, или гибрид одинарной и двойной цепи. Также он может образовывать кольцевую структуру путем соединения 5’- и 3’-концов одной молекулы; несколько олигонуклеотидов по настоящему изобретения могут быть соединены посредством ковалентных связей или посредством обособленных линкеров либо на 5’-конце, либо на 3’-конце, с образованием тандемно-соединенных удлиненных структур или поливалентных структур. Олигонуклеотиды могут подвергаться межмолекулярной или внутримолекулярной гибридизации с образованием удлиненных структур, мультимерных структур или конкатемеров. Олигонуклеотиды могут быть связаны с другими молекулами с образованием мультимера. Олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть связан с другими олигонуклеотидами. Олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть включен в экспрессирующий вектор, включающий плазмидные векторы и вирусные векторы.

[0064]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать CpG-мотив, а именно, неметилированные динуклеотиды, цитозин и гуанин.

[0065]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать распространенные мотивы последовательности: tcgcaacgttt (SEQ ID NO:1) и cgacg, предпочтительно, tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg (SEQ ID NO:2), или более предпочтительно, tcgcaacgttt-r-cgacg-k-cg-bd-cg (SEQ ID NO:3); где каждый из a, t, c или g обозначает основание, соответственно, соответствующее аденину, тимину/урацилу, цитозину или гуанину; n обозначает любое основание; r обозначает аденин или гуанин; k обозначает гуанин или тимин/урацил, соответственно; b обозначает цитозин, гуанин или тимин/урацил; и d обозначает аденин, гуанин или тимин/урацил.

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может иметь r (аденин или гуанин) на 3’ мотива, образуя tcgcaacgttt-r-cgacg-k-cg-b n-cg-r (SEQ ID NO:4).

[0066]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать фосфоротиоатные межнуклеотидные связи. Каждая из фосфоротиоатных межнуклеотидных связей может содержать стереогенный атом α-фосфора, образующий R- или S-диастереомер.

Фосфоротиоатные межнуклеотидные связи также могут содержать фосфородитиоатные структуры. Олигонуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно имеет характерный частичный фосфоротиоатный участок CaaCg в 5’-областях олигонуклеотидов с частично фосфоротиоатными или фосфодиэфирными межнуклеотидными связями, где заглавной буквой обозначен нуклеозид с нестабилизированной 3’-межнуклеотидной связью, такой как фосфодиэфирная связь без неприродной химической модификации, и прописной буквой указан нуклеотид с 3’-межнуклеотидной связью, представляющей собой стабилизированную структуру, такой как фосфоротиоатная связь.

[0067]

Частично фосфоротиоатная версия олигонуклеотида по настоящему изобретению предпочтительно может содержать частично фосфоротиоатный участок, такой как tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-C-г (SEQ ID NO:5), где строчной буквой обозначен нуклеозид с 3’-межнуклеотидной связью, представляющей собой стабилизированную структуру, такой как фосфоротиоатная связь.

[0068]

Вышеупомянутые мотивы и участки должны присутствовать последовательно в одном олигонуклеотиде; мотивы могут быть разделены в середине посредством инсерции/инсерций нуклеотида(ов), однако предпочтительно нуклеотид(ы) встроен в каждом положении в количестве 1 или 2. Мотивы, упомянутые выше, могут быть мутантными, однако предпочтительно нуклеотид(ы) является мутантным в каждом мотиве в количестве 1 или 2. Мотивы могут быть частично удалены на концах в количестве вплоть до 2 оснований.

[0069]

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть выбран из олигонуклеотидов со следующими мотивами последовательности, представленными в таблице 1, где межнуклеотидные связи могут быть выбраны из природных (например, фосфодиэфирная) или синтетических (например, фосфоротиоатная), или их смеси:

[Таблица 1]

[0070]

В другом варианте осуществления олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть полностью фосфоротиоатными в межнуклеотидных связях. Примеры олигонуклеотидов по настоящему изобретению представлены в таблице 2 ниже:

[Таблица 2]

Заглавными буквами в последовательностях выше указан нуклеозид или нуклеозид с фосфодиэфирной связью в качестве 3’-межнуклеотидной связи, и строчными буквами указан нуклеозид с фосфоротиоатной связью в качестве 3’-межнуклеотидной связи.

[0071]

В другом варианте осуществления олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут иметь частично фосфоротиоатные межнуклеотидные связи.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать мотив последовательности caacg, предпочтительно частично фосфоротиоатный участок caaCg, Caacg или CaaCg, более предпочтительно частично фосфоротиоатные участки CaaCg.

Примеры таких олигонуклеотидов представлены в таблице 3 ниже:

[Таблица 3]

Заглавные буквы в последовательностях выше обозначают нуклеозид или нуклеотид с фосфодиэфирной связью в качестве 3’-межнуклеотидной связи, и строчные буквы обозначают нуклеозид с фосфоротиоатной связью в качестве 3’-межнуклеотидной связи.

[0072]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут связываться TLR9 и обладают активностью усиления передачи сигнала ниже рецептора.

Активность активации TLR9 можно оценивать посредством следующих явлений в качестве суррогатных показателей, но не ограничиваясь ими (WO2014082254A, JP5011520B):

(i) сила активности связывающего NF-B олигонуклеотида в отношении промотора, описанная в качестве уровней экспрессии GFP, контролируемой промотором в клетке, такой как CAL-1/NF-B-GFP;

(ii) уровни продуцирования цитокинов из клеток; и

(iii) уровни экспрессии маркерных белков, таких как костимулирующие молекулы, включая CD40, CD80 или CD86, в клетке-мишени, такой как антигенпредставляющие клетки.

[0073]

Активацию клеток-мишеней можно оценивать по усилению вышеупомянутых суррогатных показателей. Усиление таких маркеров можно исследовать по повышению уровней по сравнению с нормальным статусом или статусом без активирующих стимулов, включающих добавление лигандов.

[0074]

Такую активность олигонуклеотидов по настоящему изобретению можно анализировать в культивируемых клетках, таких как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) или полученные и иммуортализованные клеточные линии. Такие клеточные линии включают HAL-1 и RCH-ACV вместо B-клеток, CAL-1 (Maeda, T., et al., Int J Hematol, 2005. 81(2): p.148-54), Gen2,2/Gen3 (Di Domizio, J., et al., Blood, 2009. 114(9): p.1794-802) или PMDC05 (Narita, M., et al., Acta Haematol, 2008. 120(2): p.91-9) вместо плазмацитоидных дендритных клеток.

[0075]

<Целевые заболевания>

Олигонуклеотид по настоящему изобретению можно применять для профилактики или терапии целевых заболеваний или нарушений, ассоциированных с иммунным ответом, или для модулирования иммунного ответа у индивидуума. Примерами целевых заболеваний или нарушений являются новообразования, инфекционные заболевания, обусловленные Th2 или Th17 заболевания, включая заболевания, возникающие при активации Th2 или Th17, первичное иммунодефицитное заболевание или посттравматическое стрессовое расстройство (PTSD).

[0076]

Указанные новообразования включают (злокачественные) опухоли, такие как карциномы (включая злокачественные новообразования, эпителиальные новообразования, интраэпителиальные новообразования и гемопоэтические опухоли), саркомы и мезотелиомы, доброкачественные опухоли, дисплазию и метаплазию. Указанные злокачественные опухоли включают, но не ограничиваются ими, злокачественные опухоли, такие как рак легкого (мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак печени, рак желчных путей, рак желчных протоков, рак почки, пиелоуретральный рак, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак яичка, рак предстательной железы, рак полового члена, рак щитовидной железы, рак матки, рак молочной железы, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичника, меланома, плоскоклеточный рак, нейробластома, рак полости рта, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, неходжскинская лимфома, лимфома Ходжкина, хронический миелоидный лейкоз, злокачественная лимфома и множественная миелома.

[0077]

Указанные саркомы включают, но не ограничиваются ими, остеосаркому, остеоцитому, аневризматическую кисту кости, остеоидную остеому, хондросаркому, низкодифференцированные круглоклеточные/веретеноклеточные опухоли (включают саркому Юинга), гемангиоэндотелиому, ангиосаркому, фибросаркому/миофибросаркому, хордому, адамантиному, липосаркому, лейомиосаркому, злокачественную опухоль оболочки периферического нерва, рабдомиосаркому, синовиальную саркому, злокачественную солитарную фиброзную опухоль, атипичную липоматозную опухоль, возвышающуюся дерматофибросаркому, злокачественную солитарную фиброзную опухоль, воспалительную миофибробластную опухоль, низкодифференцированную миофибробластную саркому, фибросаркому (включает взрослый и склерозирующий эпителиоидный типы), миксофибросаркому, низкодифференцированную фиброкиксоидную саркому, гигантоклеточную опухоль мягких тканей, злокачественную гломусную опухоль, рабдомиосаркому, гемангиоэндотелиому, ангиосаркому мягких тканей, внескелетную остеосаркому, желудочно-кишечную стромальную опухоль (GIST), злокачественную опухоль оболочки периферического нерва, злокачественную тритон-опухоль, злокачественную зернистоклеточную опухоль, злокачественную оссифицирующую фибромиксоидную опухоль, стромальную саркому, миоэпителиальную карциному, злокачественную фосфатурическую мезенхимальную опухоль, эпителиоидную саркому, альвеолярную саркому мягких тканей, светлоклеточную саркому мягких тканей, внескелетную микосидную хондросаркому, внескелетную саркому Юинга, десмопластическую мелкоклеточную круглоклеточную опухоль, внепеченочную рабдоидную опухоль, околососудистую эпителиоидную клеточную опухоль, интимальную саркому, плейоморфную саркому и круглоклеточную саркому.

Указанные мезотелиомы включают, но не ограничиваются ими, перикардиальную мезотелиому, перитонеальную мезотелиому и плевральную мезотелиому.

[0078]

Указанные дисплазии включают, но не ограничиваясь ими, миелодиспластический синдром и дисплазию шейки матки.

[0079]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению демонстрирует эффективность против целевых заболеваний на основе активации иммунитета против злокачественных клеток. Ожидается, что если он будет использоваться отдельно, то эффективность будет более высокой при использовании против новообразований с высокой иммуногенностью. Новообразования с высокой иммуногенностью включают, но не ограничиваются ими, злокачественные клетки, которые экспрессируют неоантигены, которые образуются вследствие мутаций генов, происходящих на стадиях образования опухоли; такие злокачественные опухоли включают злокачественные опухоли с дефектом репарации несоответствующих оснований (dMMR) или высокой микросателлитной нестабильностью (MSI-H) (Sargent, D.J., et al., J Clin Oncol, 2010. 28(20): p.3219-26; Passardi, A., et al., Int J Mol Sci, 2017. 18(6 ): E1324).

[0080]

Олигонуклеотид по настоящему изобретению может активировать pDC посредством активации TLR9. Активированные pDC далее активируют различные другие иммунные клетки через интерфероны. Таким образом, олигонуклеотид по настоящему изобретению может применяться для профилактики или терапии различных инфекционных заболеваний, вызванных микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии и грибы.

[0081]

Вирусы, вызывающие инфекционные заболевания, включают, но не ограничиваются ими, вирус контагиозного моллюска, вирус простого герпеса (HSV), вирус ветряной оспы, вирус опоясывающего герпеса, ротавирус, вирус папилломы человека, цитомегаловирус (CMV), вирус полиомиелита, вирус Коксаки, риновирус, вирус краснухи, вирус кори, вирус гриппа, вирус свинки, респираторно-синцитиальный (RS) вирус, вирус гепатита и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Описано, что среди этих вирусов некоторые вирусы, такие как CMV, ВИЧ, вирус гриппа, HSV, вирус гепатита B (HBV) или вирус гепатита C (HCV), активируют иммунитет хозяина непосредственно путем связывания с TLR9 (Swiecki, M., et al., Immunol Rev, 2010. 234(1): p.142-62).

[0082]

Бактерии, вызывающие инфекционные заболевания, подразделяют на грамотрицательные и грамположительные, однако настоящее изобретение может использоваться в отношении бактерий из любой группы. Описано, что TLR9 необходим по меньшей мере для активации врожденного иммунитета против грамотрицательных бактерий (Bhan, U., et al., J Immunol, 2007. 179(6): p.3937-46). Грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitides, Hemophilus parainfluenzae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis и Yersinia pestis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Citrobacter, Salmonella enterica subsp. enterica серовар Typhi, Salmonella enterica subsp. enterica серовар Paratyphi A, Salmonella enterica subsp. enterica серовар Paratyphi B, Salmonella Typhimurium, Salmonella enterica серовар Enteritidis, Shigella dysenteriae, Shigella frexneri, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter, Serratia, Hafnia, Proteus, Morganella, Providencia, Yersinia, Campylobacter, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonas, Xanthomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Brucella, Legionella, Veillonella, Bacteroides и Fusobacterium.

[0083]

Инфекционные заболевания, вызываемые грибами, включают, но не ограничиваясь ими, криптококкоз, кандидоз, аспергиллез, пневмонию, вызываемую Pneumocystis carinii, дерматофитоз, вызываемый трихофитоном, и кожную инфекцию Tinea versicolor. В действительности, описано, что ДНК или РНК, происходящие из грибов, распознаются TLR9 млекопитающих (Kasperkovitz, P.V., et al., Infect Immun, 2011. 79(12): p.4858-67; Patin, E.C., et al., Semin Cell Dev Biol, 2019. 89: p. 24-33).

[0084]

Заболевания, обусловленные Th2/Th17, представляют собой заболевания, вызываемые супрессией Th1 и активацией Th2 и/или Th17; эти заболевания включают, но не ограничиваются ими, астму, атопическое заболевание (дерматит, экзема), аллергию, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, включая язвенный колит и болезнь Крона, кожный плоский лишай и болезнь Альцгеймера.

[0085]

Первичные иммунодефицитные заболевания представляют собой нарушения, при которых часть иммунной системы отсутствует врожденно или не функционирует надлежащим образцом, и известно, что пациенты с такими заболеваниями являются особенно предрасположенными к инфекциям. Ожидается, что олигонуклеотиды по изобретению продемонстрируют эффективность, особенно у пациентов, у которых отсутствует функциональные связанные с TLR системы, таких как пациенты с дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями TLR, однако эффективность не ограничена такими заболеваниями, поскольку ожидается, что олигонуклеотиды по изобретению будут более широко активировать иммунитет против инфекционных заболеваний.

[0086]

Посттравматическое стрессовое расстройство (PTSD) представляет собой одно из заболеваний, которое, согласно сообщениям, смягчается агонистом TLR9, и это заболевание также считается одним из целевых заболеваний (Zimmerman, G., et al., Transl Psychiatry, 2012. 2: p.e78).

[0087]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться в качестве одного из активных ингредиентов фармацевтической композиции, вводимой пациентам, страдающим от вышеупомянутых целевых заболеваний или нарушений, однако олигонуклеотиды по изобретению также можно использовать у индивидуума для профилактической цели против вышеупомянутых целевых заболеваний.

[0088]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть соединены с другими активными молекулами, возможно посредством определенных линкеров. Например, связывание фармацевтических соединений для совместного введения может облегчать совместное введение; связывание липида или пегилирование может улучшить распределение в тканях или фармакокинетику. Описано, что пегилирование олигонуклеотидов удлиняет длительность нахождения in vivo у индивидуума путем снижения выведения почками.

[0089]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также могут быть конъюгированы с некоторыми органическими соединениями, такими как витамин E (α-токоферол) или витамин D, с целью улучшения показателей фармакокинетики, таких как время полужизни in vivo или поглощение клетками (Winkler, J., Ther Deliv, 2013. 4(7): p.791-809).

[0090]

Для соединения олигонуклеотидов по настоящему изобретению с другими органическими или неорганическими частями в качестве линкера можно использовать органическое химическое соединение; линкер включает, но не ограничивается ими, глицерин, (S)-(-)-1,2,4-бутантриол, 1,3,5-пентантриол, цис, цис-1,3,5-циклогексантриол, цис, транс-1,3,5-циклогексантриол, 1,3,5-трис-(2-гидроксиэтил)изоцианурат, тетраэтиленгликоль и гексаэтиленгликоль, диолы, такие как 1,3-пропандиол или додекан-1,12-диол, циклогександиол, холестерин, нитроиндол, триэтиленгликоль, гексаэтиленгликоль, d-спейсер, ПЭГ-спейсер и алкиловый линкер. Линкерная часть также может быть составлена из аминокислот, нуклеотидов и/или их производных.

[0091]

Линкеры также могут использоваться для обеспечения нековалентных связей. Линкеры включают, но не ограничиваясь ими, биотин-авидин, SPB (сукцинимидил-[4-(псорален-8-илокси)]бутират), который интеркалирует в нуклеиновую кислоту, нуклеиновые кислоты, последовательности которых являются комплементарными и связываются друг с другом, и белок-белковое взаимодействие, такое как биспиральная структура.

[0092]

В одном варианте осуществления олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации друг с другом, с другими олигонуклеотидами со сходным механизмом функционирования, с другими органическими соединениями, такими как (поли)пептиды/антитела или нуклеиновые кислоты/олигонуклеотиды, или неорганическими соединениями, такими как цитотоксические средства, которые часто используются для улучшения или модификации физических свойств лекарственных средств. Такую комбинацию можно получать либо с ковалентным связыванием, либо без него.

[0093]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот (например, геномная или кДНК), однако предпочтительно являются синтетическими. Олигонуклеотиды по изобретению могут быть синтезированы на различных автоматизированных устройствах для синтеза нуклеиновых кислот, доступных в продаже. Эти олигонуклеотиды называют синтетическими олигонуклеотидами.

[0094]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть введены отдельно или совместно введены с одним или несколькими другими ингредиентами одновременно или последовательно. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также могут использоваться одновременно или последовательно с одним или несколькими другими способами терапии.

[0095]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить совместно с общепринятыми лекарственными средствами и способами терапии злокачественной опухоли для облегчения различных симптомов, возникающих по мере формирования опухоли. Примеры общепринятых лекарственных средств против злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими: антибиотики, такие как антрациклин или митоксантрон; платину; алкилирующие средства; антиметаболиты; лекарственные средства для гормональной терапии; фитоалкалоиды, такие как алкалоиды барвинка; таксаны, такие как паклитаксел или доцетаксел; и ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан или этопозид.

[0096]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также можно совместно вводить индивидуумам, нуждающимся в этом, с другими молекулярными лекарственными средствами, нацеленными на биологические характеристики злокачественных клеток; молекулярные таргетные лекарственные средства включают ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы ангиогенеза или ингибиторы протеасом. Примеры молекулярного таргетного средства включают, но не ограничиваются ими:

эверолимус (Афинитор), тамоксифен (Нолвадекс), торемифен (Фарестон), фулвестрант (Фаслодекс), анастрозол (Аримидекс), экземестан (Аромазин), лапатиниб (Тайкерб), лектрозол (Фемара), пальбоциклиб (Ибранс), рибоциклиб (Кискали), нератиниб малеат (Нерлинкс), амемациклиб (Верзенио), олапариб (Линпарза), регорафениб (Стиварга), иматиниб мезилат (Гливек), ланреотид ацетат (Соматулин Депо), сунитиниб (Сутент), сорафениб (Нексавар), пазопаниб (Вотриент), темсиролимус (Торизел), акситиниб (Инлита), карбозантиниб (Карбометикс), ленватиниб мезилат (Ленвима), третиноин (Весаноид), дасатиниб (Сприцел), нилотиниб (Тасигна), босутиниб (Босулиф), ибрутиниб (Имбрувика), иделалисиб (Зиделиг), венетоклакс (Венклекста), понатиниб гидрохлорид (Иклусиг), мидостаурин (Ридапт), энесидениб мезилат (Идхифа), инотузумаб озагомицин (Беспонса), тисагенлеклейцел (Кимриа), ивосидениб (Тибсово), девелисиб (Копиктра), сорафениб (Нексавар), кризотиниб (Ксалкори), эрлотиниб (Тарцева), гефитиниб (Иресса), афатиниб дималеат (Гилотриф), церитиниб (LDK378/Зикадия), осимертиниб (Тагриссо), алектиниб (Алеценса), бригатиниб (Алунбриг), траметиниб (Мекинист), дабрафениб (Тафинлар), дакомитиниб (Визимпро), денилейкин дифтитокс (Онтак), вориностат (Золинза), ромидепсин (Истодакс), бексаротен (Таргретин), бортезомиб (Велькейд), пралатрексат (Фолотин), силтуксимаб (Силвант), иделалисиб (Зиделиг), белиностат (Белеодак), копанлисиб гидрохлорид (Аликвопа), акалабрутиниб (Калквенс), карфилзомиб (Кипролис), панобиностат (Фаридак), иксазомиб цитрат (Нинларо), руксолитиниб фосфат (Якафи), кабазитаксел (Евтана), энзалутамид (Кстанди), абиратерон ацетат (Зитига), дихлорид радия 223 (Ксофиго), апалутамид (Эрлеада), висмодегиб (Эриведж), сонидегиб (Одомзо), вемурафениб (Зелбораф), кобиметиниб (Котеллик), алитретиноин (Панретин), энкорафениб (Брафтови), биниметиниб (Мектови), цемиплимаб-rwlc (Либтайо), алитретиноин (Панретин) и вандетаниб (Капрелса).

[0097]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также можно совместно вводить индивидуумам с противораковыми антительными лекарственными средствами. Ожидается, что совместное введение с ODN по настоящему изобретению синергически усиливает активность антительных лекарственных средств, которые, в частности, используют иммунную систему для атаки на злокачественные клетки. Примеры таких антительных лекарственных средств включают, но не ограничиваются ими:

(i) антительные лекарственные средства, содержащие антитело одного типа: трастузумаб (Герцептин), алемтузумаб (Кампат), бевацизумаб (Авастин), пертузумаб (Перьета), цетуксимаб (Эрбитукс), панитумумаб (Вектибикс), нецитумумаб (Портразза), динутуксимаб (Унитуксин), раумцирумаб (Цирамза), оларатумаб (Лартруво), ипилимумаб (Ервой), ниволумаб (Опдиво), пембролизумаб (Кейтруда), атезолизумаб (Тецентрик), деносумаб (Ксгева), дурвалумаб (Имфинзи), авелумаб (Бавенсио), ибритутомаб тиуксетан (Зевалин), брентуксимаб ведотин (Адцетрис), обинутузумаб (Газива), могамулизумаб-kpkc (Потелигео), даратумумаб (Дарзалекс), элотузумаб (Эмплицити), рукапариб камсилат (Рубрака), нирапариб тозилат моногидрат (Зеюла), антитело против OX40;

(ii) антительные лекарственные средства, содержащие биспецифическое антитело: блинатумомаб (Блинцито);

(iii) антительные лекарственные средства, содержащие конъюгат антитело-лекарственное средство, ADC: ибритутомаб тиуксетан (Зевалин), брентуксимаб ведотин (Адцетрис), адо-трастузумаб эмтанзин (Кадцила), гемтузумаб озагомицин (Милотарг); и

(iv) зив-афлиберцепт (Залтрап).

[0098]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также можно вводить совместно с цитокинами, такими как GM-CSF, IFN-α, IFN-β или IFN-γ, которые уже применяются в качестве стандартных лекарственных средств против злокачественной опухоли.

[0099]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать вместе с хирургическими процедурами, включающими радиационную терапию, радиочастотную абляцию, криоабляцию (Aarts, B.M., et al., Insights Imaging, 2019. 10(1): p.53) или фотодинамическую терапию (PDT) после введения фотосенсибилизирующего средства.

Ожидается, что комбинирование с введением олигонуклеотидов по настоящему изобретению продемонстрирует синергическую эффективность, учитывая, что было описано, что, в частности, PDT повышает противораковый иммунитет (Kleinovink, J. W. et al., Cancer Immunol Res, 2019, 5(10): p.832-838).

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить в качестве активных ингредиентов в адъювантном или неоадъювантном контексте (O'Donnell, J.S., et al., Clin Cancer Res, 2019, 25(19): p.5743-5751).

[0100]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также можно использовать в комбинации с адоптивной терапией иммунными клетками (также известной как адоптивный клеточный перенос (ACT)), такой как терапия T-клетками с химерным рецептором антигена (CAR-T) (аксикабтаген цилолейцел (Ескарта®) или тисагенлеклейцел (Кимрия®)), терапия инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL), терапия дендритными клетками или терапия NK-клетками. ODN по настоящему изобретению также можно комбинировать со способами терапии с использованием онколитических вирусов, в которых используется искусственно модифицированный вирус для лизиса опухолевой массы (Davola, M.E., et al., Oncoimmunology, 2019. 8(6): p.e1581528; Sivanandam, V., et al., Mol Ther Oncolytics, 2019. 13: p.93-106; Raja, J., et al., J Immunother Cancer, 2018. 6(1): p.140; Martinez-Quintanilla, J., et al., J Clin Invest, 2019. 130: p.1407-1418; Harrington, K., et al., Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(9): p.689-706).

[0101]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с терапевтическими вакцинами, которые, как ожидается, будут усиливать иммунитет, необходимый для терапии. Терапевтические вакцины представляют собой класс вакцин, используемый для цели терапии существующих заболеваний. Такие терапевтические вакцины включают не только вакцины, полученные с использованием ослабленных или детоксифицированных микроорганизмов, но также клеточные вакцины ex vivo, полученные с использованием обработанных ex vivo клеток, и вакцины in vivo, которые активируют иммунитет, такой как противораковый иммунитет, путем активации иммунных клеток-мишеней. Клеточная вакцина ex vivo включает Сипулейцел-T (Провенж), который получают из аутологичных или аллогенных дендритных клеток, или GVAX, который получают путем модификации аутологичных или аллогенных злокачественных клеток. Загрузки таких дендритных клеток антигенами можно достигать, приводя антигены, включающие пептиды, рекомбинантные белки или опухолевый лизат, в контакт с дендритными клетками в культуре ex vivo, но также ее можно достигать путем слияния клеток, экспрессирующих антигены (например, злокачественных клеток) с дендритными клетками (Hollingsworth, R.E., et al., NPJ Vaccines, 2019. 4: p.7).

[0102]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с группой вакцин in vivo. Вакцины in vivo могут включать инструменты для доставки к антигенпредставляющим клеткам (APC), являющимся мишенями, в комбинации с антигенами, такими как антигены злокачественной опухоли или вирусные антигены; белки-мишени для инструментов доставки к APC включают следующие белки клеточной поверхности:

дендритные клетки: DEC205, CD11c, DC-SIGN, рецептор маннозы, TLR, CD91,

B-клетки: CD180, BCR, CD21, CD19,

плазмацитоидные дендритные клетки (pDC): CD32, CLEC12a, BDCA2, DCIR, TLR9.

Антигены, используемые для вакцин in vivo, могут включать пептиды или рекомбинантные белки, содержащие антигены злокачественной опухоли, которые описаны ниже, или вирусные антигены; полинуклеотиды, кодирующие антигены, можно использовать для направления экспрессии антигенов в таких APC-мишенях.

[0103]

Профилактические вакцины против злокачественной опухоли включают вакцину против вируса гепатита B, вакцину против вируса папилломы человека (HPV), такую как Гардасил или Церварикс. Также можно ожидать, что олигонуклеотиды по настоящему изобретению будут повышать профилактическую активность выпускаемых в продажу вакцин или вакцин на предпродажных стадиях.

[0104]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или терапии инфекционных заболеваний. Олигонуклеотиды также можно смешивать с вакцинной композицией в качестве адъюванта. В ином случае, олигонуклеотиды можно вводить индивидууму в комбинации с фармацевтической композицией для лечения инфекционных заболеваний, включающих антибактериальные средства, противогрибковые средства, противогрибковые средства, противовирусные средства, противопаразитарные средства, вакцины, антительные лекарственные средства для нейтрализации токсина.

Вакцины, которые используются для профилактики или терапии инфекционных заболеваний, включают вакцины из следующих категорий:

- живые аттенуированные вакцины, которые содержат ослабленную версию живого микроорганизма.

- инактивированные вакцины, которые содержат убитые микробы, но сохраняют антигенность.

- субъединичные вакцины, которые содержат только антигены, которые наиболее эффективно стимулируют иммунную систему.

- токсоидные вакцины, которые нацелены на детоксификацию токсинов из микробов.

- конъюгатные вакцины, которые являются специализированными типами субъединичных вакцин, позволяющими формирование иммунитета против микроорганизмов у индивидуумов со слабым иммунитетом посредством конъюгации с другими субъединицами с более высокой иммуногенностью.

- вакцины на основе нуклеиновых кислот, которые приводят к тому, что клетки организма продуцируют антигены, обеспечивая дополнительную иммунизацию in vivo.

- вакцины на основе рекомбинантных векторов, которые содержат генетическую информацию рекомбинантных антигенов для стимуляции иммунитета против микроорганизов-мишеней.

Примерами вакцин, которые могут использоваться в комбинации с олигонуклеотидом по настоящему изобретению, являются: вакцина БЦЖ, противохолерная вакцина, вакцина против дифтерии, вакцина против Haemophilus influenzae, вакцина против гепатита A, вакцина против гепатита B, вакцина против вируса папилломы человека, вакцина против пандемического вируса гриппа H1N1, сезонная вакцина против вируса гриппа, вакцина против японского энцефалита, вакцина против вируса кори, вакцина против вируса Свинки, менингококковая вакцина, пневмококковая вакцина, коклюшная вакцина, вакцина против вируса полиомиелита, вакцина против вируса бешенства, вакцина против ротавируса, вакцина против краснухи, вакцина на основе столбнячного токсоида, тифоидная вакцина и вакцина против желтой лихорадки.

[0105]

В последнее время интенсивно разрабатывается класс лекарственных средств, называемых ингибиторами иммунной точки контроля (CPI), которые влияют на молекулы иммунной точки контроля, группу белков, регулирующих иммунитет, для стимуляции иммунитета, необходимого для лечения целевых заболеваний. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать с CPI для синергичного повышения эффективности CPI посредством активации антигенпредставляющих клеток, связанных с процессами иммунных точек контроля.

Примерами молекул-мишеней для ингибиторов иммунной точки контроля являются: PD-1, PD-L1, PD-L2, CD28, CD80, CD86, ICOS, B7RP1 (ICOSL), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), CD28H, B7-H5, VISTA, BTLA, HVEM, CD40L, CD40, OX40, OX40L, CD137, CD137L, CD27, CD70, TIM3, GAL9, GITR, GITRL, LAG-3, MHC-II, CD47, ADORA2A (рецептор аденозина A2A) и аденозин (Pardoll, D.M., Nat Rev Cancer, 2012. 12(4): p.252-64).

[0106]

Способы терапии или лекарственные средства, которые подавляют активность иммуносупрессивных иммунных клеток, таких как Treg, опухолеассоциированные макрофаги (TAM) или MDSC, также можно использовать для комбинированной терапии с олигонуклеотидами по настоящему изобретению. Примерами являющихся мишенями молекул или каскадов, на которые воздействуют такие способы терапии или лекарственные средства, являются:

- Treg - цитотоксический T-лимфоцитарный антиген-4 (CTLA-4), TGF-бета (TGFβ), IL-10, IL-35, ICOS и ген активации лимфоцитов 3 (LAG-3), индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO), триптофан 2,3-диоксигеназа (TDO), CD39, CD73, PI3K, Atg7 и Atg5,

- TAM - ось CCL2-CCR2 и передача сигнала CSF1/рецептор CSF1 (CSF1R),

- MDSC - PDE-5, COX-2, HDAC, STAT3, CCL2/CCR2, каскад VEGF-A/MET/TIE2/VEGFR2, IL-8/CXCR1/2, галектин-1 (Gal-1),

Способы терапии или лекарственные средства, которые удаляют такие иммуносупрессивные иммунные клетки, также можно использовать для комбинирования с олигонуклеотидами по настоящему изобретению. Примерами маркерных белков клеточной поверхности, которые можно использовать для истощения таких клеток, являются следующие:

Treg - CD25, CTLA-4, PD-1, ICOS, GITR, OX40, CD15, CCR4 и CCR8,

TAM - CD206, легумаин, рецептор-мусорщик A и CD52,

(Ohue, Y., et al., Cancer Sci, 2019. 110(7): p.2080-2089; Yang, L., et al., J Hematol Oncol, 2017, 10(1): p. 58; Gabrilovich, D. I., Cancer Immunol Res, 2017, 5(1): p.3-8; Ding A.S. et al., Front Immunol, 2019, 10: p.1715)

[0107]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать вместе с антигенными белками, пептидами, гликоконъюгатами или другими органическими веществами с целью усиления специфических антигенных реакций против целевых заболеваний. Примерами антигенных веществ являются нижеследующие:

AFP, AKAP-4, ALK, рецептор андрогенов, B7H3, BAGE, bcr-abl, BMLF1, BmpA, BmpB, BORIS, BRLF1, BZLF1, карбоангидраза IX, каталаза B, CDC27, CDCA1, CDH3, CDK4, CEA, crf1, циклин B1, CYP1B1, DEPDC1, EBNA1, EBNA-1, EGFRvIII, гликопротеин оболочки D, EpCAM, EphA2, EphA3, ERG, ETV6-AML, FAP, Fos-родственный антиген 1, FOXM1, фукозил GM1, GD2, GD3, Gel1, GloboH, GM3, gp100, GPC3, HA, белки HBV, белки HCV, HER2, гексон, HJURP, HMWMAA, HPV-16 E6, HPV-16 E7, HPV-18 E7, идиотип поверхностного Ig, IE-1, KIF20A, KOC1, белки KSV, большой T-антиген, малый T-антиген, LCK, легумаин, LMP1, LMP2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE, MAGE-3, MAGE-A1, MAGE-A4, MAM-A, мелан-A/MART-1, MELK, MELOE-1/2, мезотелин, МЛ-IAP, MP1, MP2, MP65, MPHOSPH1, MUC1, муцин-1, MYCN, NA, NA17, NeuGcGM3, неструктурные белки NS4, неструктурные белки NS5, NY-BR-1, NY-ESO-1, ospA, ospB, ospC, OY-TES1, p53, Page4, PAP, PAX3, PAX5, PDGFR-бета, пентон, PLAC1, pmel17, pmp20, полисиаловая кислота, pp65, PRAME, простатспецифический мембранный антиген 10, простеин, протеаза 3 (PR1), PSA, PSCA, PSMA, Ras, RGS5, RhoC, RM2, RNF43, ROR1, участки разрыва при транслокации при саркоме, SART3, Select, сериновая протеаза NS3, SHMP, sLe, SOD, белок спермы 17, SSX2, STEAP1, STn, сурвивин, TARP, Tax-белок, теломераза, теломераза, TERT, Tie 2, ™4SF5, Tn, TOMM34, триозофосфатизомераза, TRP1, TRP2, TTK, тирозиназа, родственный тирозиназе белок 1, родственный тирозиназе белок 2, URLC10, VEGFR2, капсидные белки вируса, коровый белок вируса, нуклеопротеин вируса, WT1, XAGE 1, альфа-актинин-4 и бета-катенин.

Неоантиген является хорошим кандидатом для применения в качестве антигенного вещества; неоантиген представляет собой антиген, который вновь образуется посредством процесса in vivo, такого как мутагенез, который происходит в ходе образования опухоли, или образуется из инфекционных чужеродных веществ, которые распознаются собственной иммунной системой.

[0108]

Противораковые химиотерапевтические лекарственные средства, особенно лекарственные средства, индуцирующие смерть иммуногенных клеток (ICD), можно совместно вводить с олигонуклеотидами по настоящему изобретению, чтобы продемонстрировать синергично усиленную эффективность. Примерами лекарственных средств, индуцирующих ICD, являются: антрациклины, включающие митоксантрон, противораковые средства на основе платины, включающие оксалиплатин, цисплатин, карбоплатин, недаплатин, триплатин тетранитрат, пикоплатин, сатраплатин (Hato, S.V., et al., Clin Cancer Res, 2014. 20(11): p.2831-7).

[0109]

Другие лекарственные средства, которые известны по их свойству активации противоракового иммунитета, такие как ингибиторы индоламин 2,3-диоксигеназы (IDO) (Prendergast, G.C., et al., Cancer Res, 2017. 77(24): p.6795-6811) или ингибиторы протеасом, включая бортезомиб (Spisek, R., et al., Blood, 2007. 109(11): p.4839-45; Chang, C.L., et al., J Immunol, 2012. 189(6): p.3209-20), можно совместно вводить с олигонуклеотидами по настоящему изобретению, чтобы они демонстрировали синергическую эффективность.

[0110]

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить совместно с другими агонистами TLR9 или агонистами других TLR, таких как TLR3, 4, 8 или 7. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению также можно использовать в комбинации со средствами, усиливающими внутриклеточные чувствительные к нуклеотидам сигнальные пути, такие как путь cGAS-STING или путь RIG-I/MDA5 (Bode, C., et al., Eur J Immunol, 2016. 46(7): p.1615-21; Iurescia, S., et al., Front Immunol, 2018. 9: p.711), поскольку эти каскады имеют общие молекулы-мишени с TLR9, такие как IFN-α или NF-B, и ожидается, что они продемонстрируют синергический эффект при одновременной активации. Примерами молекул, активирующих каждый рецептор, являются следующие:

агонист TLR3: Ринтатолимод, поли C 3SBIO, поли(I:C), хилтонол,

агонист TLR4: ALD046, CRX527, CRX675, G100, липид A, GSK1795091, OM174, PGN007,

агонист TLR7: весатолимод, VML600, 852A, NKTR262, ™X101, GS9620, RG7795, DSP0509, PF4878691, RG7854, RG7863, ™X202, TQA3334,

агонист TLR8: GS-9688, VTX 2337,

агонист TLR9: хеплисав, SD-101, IMO2125, IMO2055, MGN1703, MGN1706, CPG 7909, литенимод, AST008, DUK-CPG-001, актилон, CMP001, DV281, кобитолимод,

агонист TLR9 и NOD2: MIS416,

активатор каскада передачи сигнала STING: ADU-S100,

агонист STING: MK-1454, SB 11285, IMSA101,

агонист RIG-I: RGT 100.

[0111]

Олигонуклеотиды по изобретению можно вводить в/с носителем для доставки или в форме, связанной с носителем. Носитель включает, но не ограничивается ими, стерин (например, холестерин), кохлеаты, эмульсомы, ISCOM; липид (например, катионный липид, анионный липид), липосомы; этиленгликоль (ПЭГ); сополимер гликолида и лактида (PGLA); микросферы; полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза (CMC), хитозан, маннит, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC)); живые бактериальные векторы (например, Salmonella, Escherichia coli, bacillus Calmette-Gurin, Shigella, Lactobacillus); живые вирусные векторы (например, вирус коровьей оспы, аденовирус, вирус простого герпеса), виросомы, вирусоподобные частицы.

[0112]

Целевым индивидуумом для введения олигонуклеотида по настоящему изобретению предпочтительно является человек, однако в одном варианте осуществления индивидуум может представлять собой не являющихся человеком животных, таких как собака, кошка, лошадь, свинья, коза, овца, корова, обезьяна, курица, мышь или крыса.

[0113]

"Терапевтически эффективное количество": для лечения или предупреждения целевого заболевания или нарушения, индивидууму вводят терапевтически эффективное количество олигонуклеотидов по настоящему изобретению. "Терапевтически эффективное количество" одного или нескольких олигонуклеотидов означает достаточное количество олигонуклеотидов, используемое для достижения желаемого результата лечения или предупреждения нарушения у индивидуума. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно использовать в чистой форме или в фармацевтически приемлемых носителях. Альтернативно ODN по настоящему изобретению можно вводить в качестве фармацевтических композиций. "Количество" в рамках изобретения относится к дозе. Дозу можно определять стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области, и она может зависеть от различных факторов, включая, но не ограничиваясь ими, размер или/и общее состояние здоровья индивидуума или тяжесть симптома заболевания. Введение олигонуклеотида по изобретению можно проводить в качестве однократного введения или на протяжении серии введений. Дозы олигонуклеотида по изобретению для индивидуума на введение находятся в диапазоне от приблизительно 1 мкг (микрограмм) до 10 г на введение. Предпочтительно, дозы находятся в диапазоне от 0,1 мг до 5 г. Более предпочтительно, дозы находятся в диапазоне от 0,3 мг до 3 г. Наиболее предпочтительно, дозы находятся в диапазоне от 1 мг до 1 г.

Терапевтически эффективное количество для человека может быть оценено на основе количества для подходящих не являющихся человеком животных с использованием эквивалентной дозы для человека (HED) или эквивалентной для человека концентрации (HEC). Терапевтически эффективное количество для человека может составлять, но не ограничиваться ими, 0,3-60 мг/сутки, предпочтительно 1-30 мг/сутки, более предпочтительно 2-8 мг/сутки.

[0114]

"Путь введения": для применения в клинике олигонуклеотид по настоящему изобретению можно вводить отдельно или составлять в фармацевтическую композицию посредством любого подходящего пути введения, который является эффективным для достижения желаемого терапевтического результата. "Путь" введения олигонуклеотида по настоящему изобретению означает энтеральное, парентеральное и местное введение или ингаляцию. Энтеральные пути введения олигонуклеотида по настоящему изобретению включают пероральный, желудочный, кишечный и ректальный. Парентеральный путь включает подкожный, внутривенный, трансдермальный, внутрикожный, сублингвальный, интраназальный, трансмукозальный, легочный, вагинальный, посредством аэрозоля, внутриглазной, интратрахеальный, интраректальный, внутрипозвоночный, внутримышечный, внутрисуставной, внутрибрюшинный, внутрисердечный, внутрикостный, интратекальный, интравитреальный, ингаляционный или местный пути введения. Местный путь введения олигонуклеотида по изобретению означает нанесение олигонуклеотида наружно на эпидермис, на буккальную полость и в глаз, ухо и нос. Внутриопухолевое введение представляет собой один из путей введения, которое обычно проводят путем инъекции тестируемого соединения(ий) в опухоль или в околоопухолевую область.

[0115]

"Фармацевтическая композиция": фармацевтическая композиция означает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество олигонуклеотида по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем или без него. Фармацевтические композиции могут содержать один или несколько олигонуклеотидов по изобретению. Композиция включает, но не ограничиваясь ими, водные или солевые растворы, частицы, аэрозоли, шарики, гранулы, порошки, таблетки, покрытые таблетки, перорально растворяющиеся/дезинтегрирующие таблетки, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли и другие фармацевтические композиции, пригодные для применения в различных системах доставки лекарственных средств. Композиции можно вводить парентерально, перорально, ректально, интравагинально, внутрибрюшинно, местным путем (в дозированной форме, такой как порошки, мази, гели, капли или трансдермальный пластырь), буккальным путем или в качестве перорального или назального спрея. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения, и должна быть защищена от микробного заражения. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению для парентеральной инъекции включают фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления в стерильные инъекционные растворы или дисперсии непосредственно перед применением. Олигонуклеотид по изобретению можно суспендировать в водном носителе, например, в изотоническом буферном растворе, при pH от приблизительно 3,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно при pH от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,4, от 3,5 до 6,0 или от 3,5 до приблизительно 5,0. Буферный раствор включает буферы цитрат натрия-лимонная кислота и фосфат натрия-фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота. Для перорального введения композицию составляют с пищевыми носителями с образованием порошков таблеток, пилюль, перорально растворяющихся/дезинтегрирующих таблеток, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. Для твердой композиции общепринятый нетоксичный твердый носитель может включать маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической категории. Для буккального введения композиция представляет собой общепринятую таблетку или пастилку. Для ингаляции композиция представляет собой аэрозольный спрей из упаковки под давлением, небулайзер или сухой порошок, и она может быть выбрана специалистом в данной области. В некоторых случаях для пролонгирования эффекта олигонуклеотида по изобретению, олигонуклеотид по настоящему изобретению также в подходящем случае вводят посредством систем замедленного высвобождения. Олигонуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в воде для замедления высвобождения олигонуклеотида. Альтернативно отсроченного высвобождения парентерально вводимой лекарственной формы олигонуклеотида достигают путем растворения или суспендирования олигонуклеотида в гидрофобном материале (таком как приемлемый масляный носитель). Инъекционную депо-форму получают путем заключения олигонуклеотида в липосомы или микроэмульсии, или другие биодеградируемые полупроницаемые полимерные матрицы, такие как полилактид-полигликолид, сложные полиортоэфиры и полиангидриды.

[Примеры]

[0116]

Изобретение более подробно описано в приведенных ниже примерах. Между тем, изобретение не ограничивается этими примерами. В этих примерах проводили эксперименты с использованием коммерчески доступных наборов и реагентов в соответствии с прилагаемыми протоколами, если нет иных указаний. Специалисту в данной области будет понятно, что олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно без труда применять для лечения целевых заболеваний, включающих злокачественные опухоли и инфекционные заболевания. Настоящее изобретение далее демонстрируется следующими неограничивающими примерами.

[0117]

Материалы и способы:

<Олигодезоксинуклеотиды (ODN)>

Одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды (ODN) синтезировали в Hokkaido System Science Co., Ltd. посредством общепринятого способа с фосфорамидитом в форме, не имеющей фосфата на 3’-конце, и чистоту и идентичность подтверждал производитель. В приведенных ниже примерах нуклеозиды с фосфоротиоатными (PS) межнуклеотидными связями на 3’-стороне приводятся строчными буквами, в то время как нуклеозиды и олигонуклеозиды с фосфодиэфирными (PO) внутринуклеотидными связями на 3’-стороне приводятся заглавными буквами. Все синтезированные ODN сначала растворяли дистиллированной свободной от пирогенов водой, и дальнейшее разведение проводили с использованием свободных от пирогенов реагентов для испытаний.

[0118]

<Полная среда 10% FBS-RPMI>

Среду RPMI1640 дополняют 10% FBS, 2 мМ L-глутамином, 1% пенициллином-стрептомицином, 10 мМ HEPES, 1 мМ пируватом натрия и 50 мМ 2-меркаптоэтанолом. Среду далее фильтруют через 0,45-мкм шприцевой фильтр.

[0119]

<Клетки CAL-1>

Клетки CAL-1 (линия плазмацитоидных дендритных клеток человека; Maeda et al., Int J Hematol., 2005, 81, 148-54; JP5011520B) культивируют в условиях увлажненной атмосферы и 5% CO₂ при 37°C с 10% FBS-полной средой RPMI. Клетки CAL-1 смыкаются в монослой в течение двух суток после субкультивирования до 1:5, однако для испытаний, описанных ниже, клетки пассируют перед смыканием. Для культивирования клеток CAL-1 используют чашку с суспензионной культурой.

[0120]

<Детекция активации TLR9 посредством индукции GFP через активацию NF-B>

Проводили мониторинг уровней транскрипционной активности промотора NF-B, который индуцируется посредством каскада передачи сигнала TLR9, в качестве показателя уровней активности передачи сигнала TLR9. Получали клеточную линию CAL-1/NF-B-GFP для мониторинга активности фактора транскрипции NF-B в клеточных способах анализа (WO2014082254A). Для получения клеточной линии CAL-1/NF-B-GFP, вектором, кодирующим репортерный ген GFP, контролируемый консенсусным транскрипционным элементом ответа NF-B, трансфицировали клетки CAL-1 посредством электропорации. Далее проводили селекцию трансфицированных клеток с зеоцином. Стабильные трансфектанты получали посредством клонирования единичных клеток отобранных трансфектантов. Подтверждали экспрессию GFP, индуцированную агонистом TLR9, CpG2395 (5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccG-3’, SEQ ID NO:45). В кратком изложении, клетки CAL-1/NF-B-GFP (1×10⁵/лунка) высевали в 96-луночный планшет с плоским дном и культивировали с CpG2395 или без него. Клетки инкубировали при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в течение 6 часов. Уровень экспрессии GFP в клетках оценивали с использованием проточного цитометра (FACS Calibur, BD Bioscience Co., Ltd). Процент положительных по GFP клеток анализировали в качестве показателя уровней активности передачи сигнала TLR9. Эти полученные клетки NF-B-GFP/CAL-1 использовали в каждом анализе.

[0121]

<Детекция активации TLR7>

Активность TLR7 определяли в качестве ферментативной активности секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) в клетках HEK-Blue™ TLR7 (Invivogen). Клетки инкубировали с указанными олигонуклеотидами или агонистами TLR7, такими как 1 мкг (микрограммов)/мл гардиквимода (GQ) или 1 мкг/мл CL264, при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в течение 24 часов; индуцированную SEAP определяли по уровням поглощения при 655 нм в результате расщепления субстратов (HEK-Blue™ Detection, Invivogen).

[0122]

<Детекция активации TLR8>

Активность TLR8 определяли в качестве ферментативной активности секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) в клетках HEK-Blue™ TLR8 (Invivogen). Клетки инкубировали с указанными олигонуклеотидами или агонистами TLR7, такими как 200 нг/мл TL8-506 или 5 мкг/мл CL075, в течение 24 часов при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ в течение 24 часов; индуцированную SEAP определяли по уровням поглощения при 655 нм в результате расщепления субстратов (HEK-Blue™ Detection, Invivogen).

[0123]

<Детекция продуцирования цитокинов>

Уровни цитокинов измеряли посредством ELISA с использование следующих наборов: IFN-α человека (eBioscience), IL-6 человека, TNF-α человека (Thermo Fisher Scientific), IL-12p40 человека (BioLegend), IFN-α мыши (PBL), IL-6 мыши, TNF-α мыши и IL-12p40 мыши (Thermo Fisher Scientific). Измерение проводили в соответствии с протоколами изготовителей.

[0124]

<Выделение PBMC человека>

Периферическую кровь выделяли от здоровых добровольцев. Тот же объем среды RPMI добавляли к крови и хорошо перемешивали. PBMC человека очищали посредством центрифугирования на Histopaque™. В кратком изложении, Histopaque-1077 (SIGMA) помещали в пробирку для центрифугирования и тот же объем смеси кровь/RPMI помещали на Histopaque™. Пробирку центрифугировали в течение 20 минут при 1800 об/мин (700×g). Белый слой в середине извлекали посредством пипетки в другую пробирку и добавляли полную среду 10% FBS-RPMI. Смесь раствора центрифугировали в течение 10 минут при 1800 об/мин (700×g) и супернатант удаляли. Клеточный осадок обрабатывали 2 мл дистиллированной воды для лизиса эритроцитов, а затем в пробирку сразу добавляли 20 мл полной среды 10% FBS-RPMI. После промывания средой два раза клетки суспендировали в среде и подсчитывали количество клеток. В каждом анализе использовали свежевыделенные PBMC.

[0125]

<Получение спленоцитов мыши>

Из мыши извлекали селезенку. Селезенку помещали в чашку, заполненную средой RPMI. Селезенку измельчали посредством нейлонового сита с использованием резинового наконечника поршня шприца (2,5-мл шприца). Клетки селезенки, включенные в среду, переносили в 50-мл пробирку Falcon путем фильтрования через 70-мкм сито. После центрифугирования при 1500×g в течение 5 минут клетки промывали посредством 1×DPBS. Клетки обрабатывали лизирующим буфером ACK для лизиса эритроцитов. В клеточному осадку добавляли 1 мл лизирующего буфера ACK и пипетировали 20 раз посредством пипетки P1000, а затем пробирку оставляли стоять на льду в течение 2 минут. В пробирку сразу добавляли двадцать мл полной среды RPMI с 10% FBS. После промывания средой два раза клетки ресуспендировали в той же среде и подсчитывали количество клеток. Затем спленоциты использовали для дальнейшего исследования.

[0126]

Пример 1

Полностью фосфоротиоатные ODN по настоящему изобретению обладают адъювантной активностью.

Полностью фосфоротиоатные ODN, использованные в этом испытании, приведены в следующей таблице 4.

Строчными буквами указан нуклеозид, модифицированный фосфоротиоатом в межнуклеотидной связи с 3'-стороны, и заглавной буквой указан нуклеозид, который является немодифицированным (без фосфодиэфирной связи) с 3’-стороны.

[Таблица 4]

[0127]

<Анализ иммуностимулирующей активности ODN>

ODN, представленные в таблице 4, инкубировали с клетками CAL-1/NF-B-GFP в течение 6 часов в указанной концентрации (0,1 мкМ или 0,3 мкМ). Активацию NF-B посредством ODN оценивали на основе процента положительных по GFP клеток, проанализированных с использованием проточного цитометра (FACS Calibur, BD Bioscience Co., Ltd.). Данные анализировали посредством FlowJo™ ver 10 (FlowJo LLC).

[0128]

Как показано на ФИГ. 1A, экспрессия GFP индуцировалась в клетках CAL-1/NF-B-GFP посредством стимуляции аутентичным агонистом TLR9, CpG2395, что указывает на то, что активация NF-B индуцировалась путем активации TLR9 посредством CpG2395. Было показано, что ODN по настоящему изобретению - полностью фосфоротиоатные (PS) A001, A002, A003 и A004 - обладают более высокой активностью активации TLR9 по сравнению с CpG2395. Кроме того, как продемонстрировано на ФИГ. 1B, ODN по настоящему изобретению демонстрировали более выраженную активность TLR9, чем другие известные CpG-ODN, такие как CpG685, M362 и D60-1. Учитывая, что уровни активности TLR9, индуцированные посредством ODN, не зависят от длины нуклеиновой кислоты, считалось, что в основе отличий активности агонистов было лежали конкретные последовательности.

[0129]

Поскольку во многих предшествующих сообщениях приводились доводы в пользу важности последовательности gtcgtt в CpG-ODN для оптимальной активации TLR9 человека (Har™ann, G. et al., J Immunol, 2000. 164(2): p.944-53, Bauer, S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(16): p.9237-42), CpG2395 и CpG685 (5’-tcgtcgacgtcgttcgttctC-3’; SEQ ID NO:46) имеют одну последовательность gtcgtt. В предшествующих сообщениях утверждалось, что последовательность tcgt на 5’-конце CpG-ODN является очень важной для активации TLR9 человека (Pohar, J., et al., J Immunol, 2017. 198(5): p.2093-2104; Ohto, U., et al., Immunity, 2018. 48(4): p.649-658). Общепринятые CpG-ODN, CpG2395, CpG685 и M362 (5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgaT-3’; SEQ ID NO:47), имеют последовательность tcgt на 5’-конце в качестве активирующего TLR9 мотива, в соответствии с этим правилом.

Среди ODN по настоящему изобретению только A003 имеет одну последовательность gtcgtt, а другие не имеют последовательность gtcgtt, и все из ODN не имеют последовательность tcgt на 5’-конце. Однако все ODN по настоящему изобретению демонстрировали более выраженную активацию TLR9 человека, чем общепринятые CpG-ODN, такие как CpG2395, CpG685 и M362.

[0130]

Как описано выше, в то время как мотивы 5’-tcgt и "gtcgtt" в аутентичных CpG-ODN известны как TLR9-активирующие мотивы у человека (Wang, X., et al., Vaccine, 2008. 26(15): p.1893-901), было показано, что эти мотивы в ODN по настоящему изобретению имеют ничтожно малый вклад в общую активность, что указывает на то, что другие оптимальные участки/мотивы для TLR9 человека существуют в ODN по настоящему изобретению.

Как показано на ФИГ. 1C и 1D, активность A003 и A003#endG была одинаковой. В то время как активность A003#delA несколько снижалась в результате конвертирвоания основания на 3’-конце, активность все еще была значительно более высокой, чем у общепринятого CpG-CpG-ODN2395 (показанного на ФИГ. 1A). Это указывает на то, что нуклеотид на 3’-конце является необязательным для активности.

[0131]

Кроме того, как показано на ФИГ. 1E, 1F и 1G, все из наборов ODN: A001 и A011; A002 и A012; A003 и A013; и A004 и A014, демонстрировали сходные уровни активности друг с другом, что указывает на то, что замена указанных нуклеотидов в ODN не приводила ни к каким значимым изменениям активности ODN.

Взятые вместе, мутации оснований в положении 12, 18, 21 и 25 с 5’-конца в ODN могут не вызвать снижение стимулирующей активности ODN. Было показано, что ODN по изобретению имеют 5’-tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3’ (SEQ ID NO:2) в качестве центральной структуры с активностью активации TLR9.

[0132]

Пример 2

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению в значительной степени активируют TLR9.

<Активация TLR7 и TLR8 человека посредством ODN>

Клетки HEK blue™ TLR7 стимулировали агонистами TLR в течение 24 часов.

Как показано на ФИГ. 2A, агонисты TLR7 гардиквимод (GQ) и CL264 активировали TLR7 и давали положительные сигналы. Напротив, аутентичный агонист TLR9 CpG2395 и ODN по настоящему изобретению не могли активировать каскад передачи сигнала TLR7.

Кроме того, клетки HEK blue™ TLR8 стимулировали агонисты TLR в течение 24 часов. Как показано на ФИГ. 2B, агонисты TLR8, TL8-506 и CL075, активировали TLR8 и давали положительные сигналы. Напротив, аутентичный агонист TLR9 CpG2395 и ODN по настоящему изобретению не могли активировать каскад передачи сигнала TLR8.

[0133]

Пример 3

Характерные нуклеотидные участки с частичными фосфоротиоатными связями в олигонуклеотидах по настоящему изобретению

Изучали существование минимального участка олигонуклеотидов по настоящему изобретению, который повышает активность агониста TLR9.

[0134]

<ODN>

Одноцепочечные ODN с межнуклеотидными связями с частичными фосфоротиоатными связями получали, как приведено в таблице 5.

[Таблица 5]

Строчными буквами обозначается, что нуклеозид модифицирован фосфоротиоатом в межнуклеотидной связи с 3'-стороны, и заглавной буквой обозначается, что нуклеозид имеет фосфодиэфирную межнуклеотидную связь или не модифицирован (без фосфодиэфирной связи) с 3’-стороны.

[0135]

<Анализ активности ODN в качестве агонистов TLR9 >

Активность ODN в качестве агонистов анализировали по экспрессии GFP в клетках CAL-1/NF-B-GFP.

Как показано на ФИГ. 3A, полностью PS A003 демонстрирует низкую активность в тестируемой концентрации при стимуляции в течение 6 часов. Как было описано, изменение межнуклеотидной связи посредством фосфодиэфирной (PO) связи в мотиве CG аутентичных полностью PS CpG-ODN повышало активность активации TLR9 (Pohar, J., et al., Sci Rep, 2017. 7(1): p.14598., WO2004016805A), A103 и A203, которые имеют мотив CG с PO-связью и в которых сохранена та же последовательность, что и в A003, продемонстрировали увеличенную активность. Однако дополнительная PO-связь на CA в участке CAACG ODN (A303) дополнительно повышала активность, как показано на ФИГ. 3A и 3B. Как можно видеть из левой панели ФИГ. 3B (0,1 мкМ), A303 демонстрировал значительно более высокую активность, чем A103 и A203. Это указывает на важность связей PO в участке CAACG (CaaCg) для активности.

Как показано на ФИГ. 3C, A403 и A503 демонстрировали сниженную активность по сравнению с A303, в то время как оба из A403 и A503 имеют увеличенное количество CG-мотивов с PO-связью относительно A303. Это указывает на то, что количество CG-мотивов с PO-связью в ODN по настоящему изобретению не является важным для активности, хотя ранее полагалось, что количество CG-мотивов с PO-связью в аутентичных CpG-ODN является важным для активности (WO2004016805A). Важно, что как A403, так и A503, не имеют участка CaaCg (2 PO-связи в мотиве CAACG). В то время как A603 и A503 имеют одинаковое количество PO-связей в CG-мотивах, A603 демонстрировал лучшую активность, чем A503. A603 сохраняет участок CaaCg подобно A303, и он продемонстрировал сходную активность с A303, что указывает на важность участка CaaCg по сравнению с увеличенными количествами мотивов CG с PO-связью для оптимальной активности. A703 имеет PO-связи во всех мотивах CG, однако он демонстрировал более низкую активность, чем A303 и A603 (стимуляция в дозе 0,1 мкМ), указывая на то, что увеличение количества CG-мотивов с PO-связью является необязательным для максимизированной активности ODN по настоящему изобретению. Общие количества CG-мотивов с PO-связью являются ничтожно малыми для оптимизации активности, что не было ожидаемым, исходя из ранее известного эффекта Py (пиримидин)-PO-Pu (пурин) (WO2004016805A).

[0136]

Как показано на ФИГ. 3D, важность участка CaaCg далее подтверждали путем детекции продуцирования воспалительных цитокинов, индуцированного ODN. A303 и A603 индуцировали сходные уровни цитокинов друг с другом, и уровни продуцирования были более высокими, чем у A403 и A503.

Важность участка CaaCg была исследована для ранее описанных CpG, DV093 и DV094 (ФИГ. 3E). В то время как оба из DV093 и DV094 имеют мотив caacg в их последовательности, их активность была значительно меньшей, чем у A003.

[0137]

Интересно, что участок CaaCg (мотив CAACG с частичными фосфоротиоатными связями) в DV093C и DV094C не мог повышать их активность по сравнению с исходными DV093 или DV094. Изменение межнуклеотидной связи, заменяющее участок caacg на CaaCg в DV093 и DV094, не повышало активность, как показано на ФИГ. 3F.

Эти данные указывают на то, что существование определенного участка CaaCg, такого как участок в ODN по настоящему изобретению, но не в ODN со случайно расположенным CaaCg, имеет уникальное свойство повышения активности TLR9. В совокупности, участок 5’-tCgCaaCg (такой как участок в A303 и A603) может находиться в центральной структуре ODN по настоящему изобретению.

[0138]

Пример 4

Центральные структуры ODN по настоящему изобретению

<ODN>

Одноцепочечные ODN с межнуклеотидными связями с частичными фофоротиоатными связями получали, как описано в таблице 6.

[Таблица 6]

[0139]

Активность ODN анализировали по экспрессии GFP в клетках CAL-1/NF-B-GFP. Как показано на ФИГ. 4A и 4B, все протестированные ODN, которые имеют варьирование оснований в положениях 18, 21 и 22 в 3’-областях, демонстрировали сходные уровни активности друг с другом, и их активность была значительно более высокой, чем у аутентичных CpG-ODN, таких как CpG2006. Это указывает на то, что основания в положениях 18, 21 и 22 в 3’-области ODN являются необязательными для активности.

Как описано выше, мотивы "gtcgtt" в аутентичных CpG-ODN известны как активирующий TLR9 мотив для человека (Wang, X., et al., Vaccine, 2008. 26(15): p.1893-901) и CpG2006 имеет три мотива в последовательности. Между тем, только A603 имеет один мотив среди протестированных авторами изобретения ODN и все протестированные ODN, включая A603, демонстрировали сходные уровни активности, указывая на то, что в ODN по настоящему изобретению существуют другие оптимальные мотивы или участки для активности в отношении TLR9 человека. Кроме того, данные, полученные авторами изобретения, указывают на то, что мотив "gtcgtt" в ODN по настоящему изобретению имеет ничтожно малый вклад в общую активность при условии, что в них сохраняется участок Cg-nn-Cg в их 3’-областях. Для 3’-конца ODN по настоящему изобретению необходим g-n-Cg-nn-Cg в качестве центральной структуры.

[0140]

Как показано на ФИГ. 5A и 5B, ODN по настоящему изобретению, а также аутентичный агонист TLR9 CpG2395, не могли активировать каскады передачи сигнала как TLR7, так и TLR8, указывая на то, что ODN по настоящему изобретению являются агонистами TLR9.

[0141]

Пример 5

Частично дефосфорилированный ODN по настоящему изобретению не обладает активностью TLR7 и TLR8

<ODN>

Одноцепочечные ODN с частичными фосфоротиоатными межнуклеотидными связями получали, как указано в таблице 7.

[Таблица 7]

[0142]

Активность ODN анализировали по экспрессии GFP в клетках CAL-1/NF-B-GFP. Как показано на ФИГ. 6A, 6B и 6C, все протестированные ODN, которые имеют варьирование оснований и/или межнуклеотидные связи с 3’-стороны в положении 12, продемонстрировали сходные уровни активности в отношении активации NF-B. Это указывает на то, что нуклеотид в положении 12 допускает мутацию и межнуклеотидная связь на 3’-стороне нуклеотида может представлять собой связь либо PO, либо PS.

[0143]

Как показано на ФИГ. 7A и 7B, ODN, а также аутентичный агонист TLR9 CpG2395, не могли активировать передачу сигнала ни TLR7, ни TLR8, указывая на то, что ODN были активаторами TLR9.

[0144]

В совокупности, исходя из примеров 1-5, было показано, что ODN по изобретению имеют 5’-tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3’ (SEQ ID NO:2) в качестве центральной последовательности. Для максимальной активности стимуляции TLR9 человека ODN предпочтительно имеют 5’-tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg-3’(SEQ ID NO:5) в качестве центральной структуры.

Кроме того, поскольку ODN по настоящему изобретению не соответствуют описанным ранее правилам, ODN по настоящему изобретению отличаются от описанных аутентичных CpG-ODN и являются новым типом агонистов TLR9.

[0145]

Пример 6

Оценка уровней стимуляции TLR9 в клетках человека

<Стимуляция клеток HAL-01>

Линию клеток B-ALL человека, клетки HAL-01, приобретали от DSMZ (каталожный номер № ACC610). Клетки HAL-01 поддерживали с использованием полной среды 10% FBS-RPMI и стимулировали посредством ODN в течение 24 часов в дозе 1,0 мкМ. Клетки окрашивали конъюгированным с APC Ab против CD40 (eBiosciences) и конъюгированным с PE Ab против CD86 (BD Pharmingen). Индукцию экспрессии CD40 и CD86 оценивали посредством проточного цитометра.

[0146]

<Стимуляция PBMC человека>

Полученные PBMC человека (5×10⁵ клеток/200 мкл) стимулировали ODN в течение 24 часов в дозе 0,1 мкМ или 0,3 мкМ. Пролиферацию клеток оценивали посредством анализа WST-1 (Roche) в соответствии с протоколами изготовителей. Культуральные супернатанты отделяли и продуцирование цитокинов оценивали посредством ELISA в соответствии с протоколами изготовителя.

[0147]

Известно, что B-клетки человека экспрессируют TLR9 и, таким образом, агонист TLR9 может активировать B-клетки человека. Было продемонстрировано, что линия клеток B-ALL стимулировалась посредством агониста TLR9 и поверхностная экспрессия костимулирующих молекул, таких как CD40 и CD86, повышалась при стимуляции. Как показано на ФИГ. 8A, ODN по настоящему изобретению активировали линию клеток B-ALL, клетки HAL-01, что было показано посредством повышенной экспрессии на поверхности CD40 и CD86.

Продемонстрировано, что ODN по настоящему изобретению могут индуцировать пролиферацию PBMC человека и продуцирование воспалительных цитокинов. Как показано на ФИГ. 8B и 8C, ODN по настоящему изобретению могли стимулировать PBMC человека, что индуцировало пролиферацию клеток и продуцирование воспалительных цитокинов, таких как IFN-α, IL-6 и IL-12.

[0148]

Пример 7

Оценка уровней стимуляции TLR9 в клетках мыши

<Стимуляция клеток селезенки мыши (спленоциты)>

Полученные спленоциты стимулировали ODN в дозе 0,03 мкМ в течение 24 часов. Культуральные супернатанты отделяли и оценивали продуцирование цитокинов в культуральных супернатантах посредством ELISA в соответствии с протоколами изготовителей.

Полученные спленоциты стимулировали ODN в течение 24 часов в различных концентрациях. Клеточную пролиферацию оценивали посредством анализа WST-1 (Roche) в соответствии с протоколами изготовителей.

[0149]

Известно, что агонист TLR9 может индуцировать продуцирование воспалительных цитокинов и пролиферацию спленоцитов мыши. Как показано на ФИГ. 9A, ODN по настоящему изобретению могли индуцировать продуцирование воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-12. Кроме того, как показано на ФИГ. 9B и 9C, ODN индуцировали пролиферацию спленоцитов мыши. Активность ODN очевидно была более высокой, чем у аутентичных агонистов TLR9 CpG2395 и CpG2006.

[0150]

Протестированные ODN A601, A602 и A603 имеют структуру 5’-tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg-3’ (SEQ ID NO:5) в качестве центральной структуры, и эти ODN могли активировать спленоциты мыши, также как и PBMC человека. Это указывает на то, что определенная межнуклеотидная PO-связь в конкретном положении, как например, в структурах "tCgCaaCg" и "Cg-nn-Cg", является важной для оптимальной активации TLR9 как у мышей, так и у человека.

[0151]

Пример 8

Противоопухолевая эффективность ODN in vivo

<Клетки CT26>

Происходящую из мышей BALB/c линию клеток карциномы толстого кишечника CT26 приобретали от American Type Culture Collection (ATCC, CRL-2638). Клетки CT26 культивировали в полной среде 10% FBS-RPMI в увлажненной атмосфере и условиях 5% CO2 при 37°C.

[0152]

<Инокуляция клеток CT26 мышам>

Клетки CT26 выделяли с использованием 0,25% раствора трипсина-EDTA в PBS. После суспендирования в среде клетки пропускали через сито с размером ячеек 40 мкМ и посчитывали количество клеток. Концентрацию клеток в суспензии доводили до 2×10⁶ клеток/мл. Для инокуляции мышам BALB/c использовали 100 мкл суспензии клеток на мышь (2×10⁵ клеток/мышь). Спину мыши брили, а затем 100 мкл суспензии клеток CT26 инъецировали подкожно в правый бок мышей через иглу калибра 28. Мышей содержали без лечения в течение двух недель до тех пор, пока объем опухоли не достигал приблизительно 150 мм³. Объем опухоли определяли каждые 2 или 3 суток, и мышей подразделяли на три группы, исходя из объема опухоли.

Объем опухоли вычисляли по следующей формуле:

Объем опухоли (мм³)=1/2 (длина × ширина²)

[0153]

<Введение ODN>

Введение ODN (40 мкг/50 мкл/мышь) в околоопухолевую область начинали в день распределения на группы (сутки 0) и повторяли на 2 сутки. Введение ODN по настоящему изобретению проводили всего два раза в ходе исследования. Объем опухоли и массу тела каждой мышей в каждой группе определяли каждые двое или трое суток.

Как показано на ФИГ. 10, введение ODN по настоящему изобретению отчетливо индуцировало регрессию опухоли у мышей. На 11 сутки, опухоли практически у всех мышей устранялись посредством введения ODN (ФИГ. 10A и 10B). В ходе испытания не наблюдали снижения массы ни в одной из групп мышей (ФИГ. 10C). Это указывает на то, что ODN (A601 и A602) обладают противоопухолевой активностью и имеют небольшую токсичность. Учитывая тот факт, что A601, A602 и A603 продемонстрировали одинаковую активность в спленоцитах мышей, как показано на ФИГ. 9B, A603 будет демонстрировать ту же высокую противоопухолевую активность, что и A601 и A602. Было показано, что ODN по настоящему изобретению обладают противоопухолевой активностью.

[0154]

Пример 9

Противоопухолевая эффективность ODN in vivo (2)

<Инокуляция клеток CT26 и введение ODN>

Клетки CT26 инокулировали в правый бок мышей BALB/c, как описано выше. Мышей содержали без лечения в течение двух недель до тех пор, пока объем опухоли не достигал приблизительно 100 мм³. Объем опухоли определяли каждые 2 или 3 суток, и мышей подразделяли на три группы, исходя из объема опухоли. Введение ODN (A601 и A602) (40 мкг/50 мкл/мышь) в околоопухолевую область начинали в день распределения на группы (сутки 0) и повторяли на 2 сутки. Введение ODN по настоящему изобретению проводили всего два раза в ходе исследования. В качестве отрицательного контроля, вместо раствора, содержавшего ODN, вводили PBS. Объем опухоли и массу тела каждой мышей в каждой группе определяли каждые двое или трое суток до тех пор, пока не было подтверждено устранение опухоли (14 сутки).

Объем опухоли (мм³)=1/2 (длина × ширина²)

[0155]

<Повторная инокуляция клеток CT26 мышам, которые были подвергнуты лечению>

Клетки CT26 (2×10⁵) повторно инокулировали в левый бок мышей на 14 сутки, которым была инокулирована опухоль, и было подтверждено устранение опухоли, и мышей далее оставляли без лечения. Объем опухоли в левом боку каждой мыши определяли каждые 2 или 3 суток до 14 суток после повторного введения CT26.

[0156]

Как показано на ФИГ. 11A, введение ODN по настоящему изобретению отчетливо индуцировало устранение опухоли у мышей. Кроме того, у мышей, которым вводили ODN, также происходило устранение опухоли (ФИГ. 11B). В то время как опухоль в левом боку росла у мышей без лечения посредством ODN по настоящему изобретению, у всех мышей, которым вводили ODN, происходило устранение повторно введенной опухоли без какого-либо дополнительного лечения в течение 2 недель (ФИГ. 11B). Это указывает на то, что ODN по настоящему изобретению могут индуцировать и формировать память противоопухолевого иммунитета.

[0157]

Пример 10

Эффективность in vivo ODN против метастазов в легких

<Модель метастазов CT26 в легких>

Суспензию клеток CT26 получали, как описано выше. Суспензию доводили до конечной концентрации 2,5×10⁶ клеток/ мл. Для индукции метастазов в клеток CT26 легких, 200 мкл клеточной суспензии внутривенно (в/в) инъецировали мышам BALB/c (5×10⁵ клеток/мышь) из хвостовой вены с использованием иглы калибра 28 (сутки 0). На 2 сутки начинали введение ODN (подкожная инъекция в кожу спины, 40 мкг/50 мкл/мышь). Ту же дозу введения повторяли на 5 сутки. В качестве отрицательного контроля вместо раствора, содержавшего ODN, вводили aPBS.

Определение массы тела и наблюдение за поведением мышей проводили три раза в неделю после трансплантации клеток CT26. На 18 сутки мышей умерщвляли и определяли массу легких. Также подсчитывали метастатические опухолевые узелки в каждом легком.

[0158]

Как показано на ФИГ. 12, масса легких у мышей в группе введения PBS значительно возрастала, и наблюдалось множество опухолевых узелков. Напротив, не наблюдали такого увеличения массы легких у мышей в группе, в которой вводили ODN по настоящему изобретению. Кроме того, у мышей в группе лечения наблюдали только небольшое количество опухолевых узелков. Это указывает на то, что ODN по настоящему изобретению могут подавлять рост метастатических злокачественных клеток в легком.

[0159]

Пример 11

Эффективность ODN in vivo, исследованная при варьировании путей введения

<Модель метастазов CT26 в легких>

Индукцию метастазов клеток CT26 в легких проводили, как описано выше. На следующие сутки после инъекции клеток CT26 начинали введение ODN A602. В этом исследовании тестировали два пути введения. Одним из них является подкожная (п/к) инъекция в кожу спины (25 мкг/50 мкл/мышь) а другим является внутрикожная (в/к) инъекция в основание уха (25 мкг/20 мкл/мышь). Введение в той же дозе повторяли на 3 сутки и 5 сутки. После трансплантации клеток CT26 проводили измерение массы тела и наблюдение поведения три раза в неделю. На 16 сутки мышей умерщвляли и подсчитывали метастатические опухолевые узелки в каждом легком мыши.

[0160]

<Модель метастазов CT26 в печени>

Суспензии клеток CT26 получали, как описано выше. Суспензию клеток доводили до конечной концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл. Для индукции метастазов клеток CT26 в печени, 100 мкл клеточной суспензии инъецировали в селезенку (1×10⁵ клеток/мышь), как описано ниже (сутки 0). В кратком изложении, мышей подвергали анестезии и кожу брили. Создавали абдоминальный разрез (0,5 см) рядом с селезенкой (разрез на левом боку был приблизительно на 2 см левее средней линии живота). Полученную суспензию клеток CT26 инъецировали в селезенку с использованием иглы 30G, которую оставляли в селезенке на пять минут после инъекции. Для предотвращения кровотечения кровеносные сосуды селезенки туго перевязывали хирургическими швами, а затем проводили спленэктомию острыми ножницами. Брюшину и кожу зашивали и мышь нагревали под действием света. Проводили мониторинг и подтверждение восстановления мыши от анестезии. На 2 сутки мышей подразделяли на три группы на основе массы тела, и начинали введение ODN A602. В этом испытании тестировали два пути введения. Одним из них является п/к инъекция в кожу спины (12,5 мкг/50 мкл/мышь), а другим является в/к инъекция в основание уха (12,5 мкг/20 мкл/мышь). Ту же дозу введения повторяли на 5 сутки, 8 сутки и 12 сутки. Измерение массы тела и наблюдение за поведением мышей проводили три раза в неделю после трансплантации клеток CT26. На 20 сутки мышей умерщвляли и подсчитывали метастатические узелки опухоли в каждой печени мыши.

[0161]

Как показано на ФИГ. 13A, множество опухолевых узелков наблюдали в группе введения PBS. Напротив, только небольшие количества опухолевых узелков наблюдали в обеих группах, в которых проводили лечение п/к или в/к путем. Интересно, что в/к введение в основание уха демонстрировало лучшую эффективность, чем п/к введение. Эти результаты указывают на то, что ODN по настоящему изобретению могут блокировать рост метастатических злокачественных клеток в легком и могут достигать системной эффективности.

Как показано на ФИГ. 13B, тяжелые метастазы в печени также наблюдали в группе лечения PBS. Напротив, не было выявлено узелков опухоли в обеих из групп, в которых проводили лечение п/к или в/к путем, что указывает на то, что ODN по настоящему изобретению могут предупреждать рост метастатических злокачественных клеток в печени и могут достигать системной эффективности.

В совокупности, ODN по настоящему изобретению могут системно блокировать и устранять рост метастатических опухолей.

[0162]

Пример 12

Активация противоопухолевого иммунитета PBMC человека

<Сокультивирование клеток B-ALL человека и PBMC человека>

Полученные PBMC человека (5×10⁵ клеток) сокультивировали с линией клеток B-ALL человека RCH-ACV (5×10⁴ клеток) вместе с ODN (0,1 мкМ) в 200 мкл полной среды 10% FBS-RPMI в течение 3 суток и сокультивированные клетки выделяли. Устранение RCH-ACV посредством PBMC человека оценивали по уменьшению количества RCH-ACV, определяемому путем окрашивания конъюгированного с APC Ab против CD19 и конъюгированного с FITC Ab против CD138. В качестве контролей окрашивания использовали PBMC человека отдельно и RCH-ACV отдельно. Существование дважды положительных по CD19 и CD138 клеток (RCH-ACV) анализировали с использованием проточного цитометра. Существование RCH-ACV в PBMC без стимуляции принято за 100% на ФИГ. 14B.

[0163]

<Сокультивирование клеток карциномы толстого кишечника человека и PBMC человека>

Полученные PBMC человека (5×10⁵ клеток) совместно культивировали с клеткой карциномы толстого кишечника человека, COLO205 (ATCC, CCL-222) (5×10⁴ клеток) вместе с ODN (0,1 мкМ) в 200 мкл полной среды 10% FBS-RPMI в течение 3 суток и сокультивированные клетки выделяли. Устранение COLO205 посредством PBMC человека оценивали по снижению уровня клеток COLO205, определяемому по окрашиванию конъюгированным с APC Ab против CD24 и конъюгированным с FITC Ab против CD45. В качестве контролей окрашивания использовали PBMC человека отдельно и COLO205 отдельно. Существование положительных по CD24/отрицательных по CD45 клеток (COLO205) анализировали посредством проточного цитометра. Существование COLO205 в нестимулированных PBMC принято за 100% на ФИГ. 15B.

[0164]

Как показано на ФИГ. 14A, клетки RCH-ACV были дважды положительными по CD19 и CD138, в то время как не наблюдали дважды положительных по CD19 и CD138 клеток в полученных PBMC человека отдельно. 8,6% клеток RCH-ACV было обнаружено, когда PBMC человека и RCH-ACV сокультивировали в условиях без стимуляции. В присутствии A601, A602 и A603, только от 0,2% до 0,3% RCH-ACV было обнаружено в культивированных клетках, что указывает на то, что PBMC человека устраняли практически все из клеток RCH-ACV в ответ на ODN по настоящему изобретению. Эффективность устранения гематологических злокачественных клеток далее подтверждали, как показано на ФИГ. 14B.

[0165]

Как показано на ФИГ. 15A, клетки COLO205 были положительными по CD24 и отрицательными по CD45, в то время как такие клетки не наблюдались в полученных PBMC человека отдельно. 19,2% клеток COLO205 было обнаружено, когда PBMC человека и COLO205 сокультивировали в условиях без стимуляции (культивирование без ODN). В присутствии A601, A602 и A603, только от 0,5% до 0,9% COLO205 обнаруживались в культивируемых клетках, что указывает на то, что PBMC человека устраняли практически все из клеток COLO205 в ответ на ODN по настоящему изобретению. Эффективность устранения далее подтверждали, как показано на ФИГ. 15B.

[0166]

В совокупности, было предположено, что активированные PBMC человека с ODN по настоящему изобретению могут устранять как гематологические злокачественные опухоли, так и солидные опухоли.

[0167]

Пример 13

Эффективность ODN, отличных от A601, A602 и A603.

PBMC человека и спленоциты мыши стимулировали ODN по настоящему изобретению (0,15 мкМ) в течение 24 часов и клеточную пролиферацию оценивали посредством анализа WST-1.

PBMC сокультивировали со злокачественными клетками (RCH-ACV или COLO205) вместе с ODN по настоящему изобретению (0,1 мкМ) в течение 3 суток, как проводили в примере 12. Исследовали устранение злокачественных клеток посредством PBMC человека. Существование злокачественных клеток в PBMC без стимуляции принято за 100% на ФИГ. 16B.

[0168]

Как ранее показано на ФИГ. 6, все из ODN, A601, A602, A601G, A611A, A602G и A612A, демонстрировали сходные уровни активности в отношении активации TLR9 при исследовании в клетках CAL-1/NF-B-GFP. Для оценки того, демонстрируют ли ODN одинаковые признаки в первичных PBMC человека и в клетках мыши, ODN A601G, A611A, A602G и A612A оценивали в нескольких системах анализа, в которых ранее тестировали A601 и A602. Как показано на ФИГ. 16A, все протестированные ODN по настоящему изобретению индуцировали клеточную пролиферацию на сходном уровне как в PBMC человека, так и в спленоцитах мыши. Кроме того, как показано на ФИГ. 16B, все протестированные ODN по настоящему изобретению индуцировали значительное устранение злокачественных клеток в присутствии PBMC человека. Эти результаты указывают на то, что активированные PBMC человека с ODN A601G, A611A, A602G и A612A могут устранять как гематологические злокачественные опухоли, так и солидные опухоли, также как и A601 и A602.

[0169]

В совокупности, предполагается, что все из ODN по настоящему изобретению, которые демонстрировали сходные уровни активности с A601 или A602 в клетках CAL-1/NF-κB-GFP, будут индуцировать устранение злокачественных клеток человека посредством PBMC человека, также как противоопухолевые иммунные реакции у мышей.

[Промышленная применимость]

[0170]

Настоящее изобретение относится к новым олигонуклеотидам и их производным олигонуклеотидам. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид(ы), выбранный из указанных олигонуклеотидов. Настоящее изобретение также относится к способу лечения целевых заболеваний путем введения олигонуклеотида(ов), выбранного из указанных олигонуклеотидов.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

<110> SBI Biotech Co., Ltd.

<120> Новые агонисты TLR9

<130> FP4645PCT

<150> JP 2020-002715

<151> 2020-01-10

<160> 63

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> распространенный мотив последовательности

<400> 1

tcgcaacgtt t 11

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (12)..(12)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (18)..(18)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (21)..(21)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (22)..(22)

<223> n означает любое основание

<400> 2

tcgcaacgtt tncgacgncg nncg 24

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 3

tcgcaacgtt trcgacgkcg bdcg 24

<210> 4

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (22)..(22)

<223> n означает любое основание

<400> 4

tcgcaacgtt trcgacgkcg bncgr 25

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> распространенный частично фосфоротиоатный участок

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (12)..(12)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (18)..(18)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (21)..(21)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (22)..(22)

<223> n означает любое основание

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<223> модифицированное фосфоротиоатом на 3'-межнуклеотидной связи

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<400> 5

tcgcaacgtt tncgacgncg nncg 24

<210> 6

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A001

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 6

tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A002

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 7

tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A003

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 8

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 9

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A004

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 9

tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga 25

<210> 10

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A003#delA

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(23)

<400> 10

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg 24

<210> 11

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A003#endG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 11

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25

<210> 12

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A011

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 12

tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25

<210> 13

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A012

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 13

tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25

<210> 14

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A013

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 14

tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25

<210> 15

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A014

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 15

tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga 25

<210> 16

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A103

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(24)

<400> 16

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 17

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A203

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(24)

<400> 17

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 18

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A303

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(24)

<400> 18

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 19

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A403

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(12)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (14)..(15)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (17)..(24)

<400> 19

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 20

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A503

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(12)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (14)..(15)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (17)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 20

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 21

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A603

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 21

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 22

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A703

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(12)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (14)..(15)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (17)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 22

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 23

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A601

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 23

tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25

<210> 24

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A602

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 24

tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25

<210> 25

<400> 25

000 25

<210> 26

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A604

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 26

tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga 25

<210> 27

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A605

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 27

tcgcaacgtt tgcgacgccg ttcga 25

<210> 28

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A606

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 28

tcgcaacgtt tgcgacggcg tacga 25

<210> 29

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A607

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 29

tcgcaacgtt tgcgacggcg tgcga 25

<210> 30

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A611

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 30

tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25

<210> 31

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A612

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 31

tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25

<210> 32

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A613

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 32

tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25

<210> 33

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A601G

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 33

tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25

<210> 34

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A611A

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 34

tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25

<210> 35

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A602G

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 35

tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25

<210> 36

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A612A

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 36

tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25

<210> 37

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A603G?

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 37

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 38

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A613A

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 38

tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25

<210> 39

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A601GendG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 39

tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcgg 25

<210> 40

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A611AendG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 40

tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcgg 25

<210> 41

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A602GendG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 41

tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcgg 25

<210> 42

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A612AendG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 42

tcgcaacgtt tacgacggcg ctcgg 25

<210> 43

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A603GendG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 43

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25

<210> 44

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> A613AendG

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(3)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (5)..(6)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(11)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (13)..(18)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(22)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (24)..(24)

<400> 44

tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcgg 25

<210> 45

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CpG2395

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(21)

<400> 45

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 46

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CpG685

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(20)

<400> 46

tcgtcgacgt cgttcgttct c 21

<210> 47

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> M362

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(24)

<400> 47

tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

<210> 48

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> D60-1

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(29)

<400> 48

tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30

<210> 49

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DV093

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(17)

<400> 49

tcgtgcatcg atgcaacg 18

<210> 50

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DV093C

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(1)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (3)..(13)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (15)..(16)

<400> 50

tcgtgcatcg atgcaacg 18

<210> 51

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DV094

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(17)

<400> 51

aacaacaacg ttgttgtt 18

<210> 52

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> DV094C

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(2)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (4)..(5)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (7)..(8)

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (10)..(17)

<400> 52

aacaacaacg ttgttgtt 18

<210> 53

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CpG2006

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(23)

<400> 53

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 54

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 54

tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25

<210> 55

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 55

tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25

<210> 56

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 56

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25

<210> 57

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 57

tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga 25

<210> 58

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 58

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg 24

<210> 59

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 59

tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25

<210> 60

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 60

tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25

<210> 61

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 61

tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25

<210> 62

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 62

tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25

<210> 63

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность по изобретению

<400> 63

tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga 25

<---

Claims

1. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), отличающийся тем, что олигонуклеотид содержит мотив последовательности, выбранный из группы, состоящей из следующих:

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcggtcga (SEQ ID NO:54);

5’-tcgcaacgtttgcgacggcgctcga (SEQ ID NO:55);

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcgttcga (SEQ ID NO:56);

5’-tcgcaacgtttgcgacggcgttcga (SEQ ID NO:57);

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcgttcg (SEQ ID NO:58);

5’-tcgcaacgtttgcgacgtcgttcgg (SEQ ID NO:59);

5’-tcgcaacgtttacgacgtcggtcga (SEQ ID NO:60);

5’-tcgcaacgtttacgacggcgctcga (SEQ ID NO:61);

5’-tcgcaacgtttacgacgtcgttcga (SEQ ID NO:62); и

5’-tcgcaacgtttacgacggcgttcga (SEQ ID NO:63).

2. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по п.1, где межнуклеотидная связь(и) в олигонуклеотиде является частично или полностью химически модифицированной.

3. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по п.2, где химически модифицированная межнуклеотидная связь является фосфоротиоатной.

4. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по п.3, отличающийся тем, что олигонуклеотид содержит частично фосфоротиоатный олигонуклеотидный участок, выбранный из группы, состоящей из

5’-tCgcaacgtttgcgacgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:16);

5’-tCgcaaCgtttgcgacgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:17);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:18);

5’-tCgCaacgtttgCgaCgtcgttcgA-3’ (SEQ ID NO:19);

5’-tCgCaacgtttgCgaCgtcgttCgA-3’ (SEQ ID NO:20);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:21);

5’-tCgCaaCgtttgCgaCgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:22);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:23);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:24);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:26);

5’-tCgCaaCgtttgcgacgcCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:27);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgtaCgA-3’ (SEQ ID NO:28);

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgtgCgA-3’ (SEQ ID NO:29);

5’-tCgCaaCgtttacgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:30);

5’-tCgCaaCgtttacgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:31);

5’-tCgCaaCgtttacgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:32);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:33);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:34);

5’-tCgCaaCgtttGcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:35);

5’-tCgCaaCgtttAcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:36);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:37);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCgttCgA-3’ (SEQ ID NO:38);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCggtCgG-3’ (SEQ ID NO:39);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCggtCgG-3’ (SEQ ID NO:40);

5’-tCgCaaCgtttGcgacggCgctCgG-3’ (SEQ ID NO:41);

5’-tCgCaaCgtttAcgacggCgctCgG-3’ (SEQ ID NO:42);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCgttCgG-3’ (SEQ ID NO:43); и

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCgttCgG-3’ (SEQ ID NO:44);

где заглавной буквой обозначен нуклеозид без модифицированной межнуклеотидной связи с 3’-стороны и строчной буквой обозначен нуклеозид с межнуклеотидной фосфоротиоатной связью с 3’-стороны.

5. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по п.3, отличающийся тем, что олигонуклеотид содержит частично фосфоротиоатный олигонуклеотидный участок, выбранный из группы, состоящей из

5’-tCgCaaCgtttgcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:24);

5’-tCgCaaCgtttGcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:33);

5’-tCgCaaCgtttAcgacgtCggtCgA-3’ (SEQ ID NO:34);

5’-tCgCaaCgtttGcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:35); и

5’-tCgCaaCgtttAcgacggCgctCgA-3’ (SEQ ID NO:36),

где заглавной буквой обозначен нуклеозид без модифицированной межнуклеотидной связи с 3’-стороны, и строчной буквой обозначен нуклеозид с фосфоротиоатной межнуклеотидной связью с 3’-стороны.

6. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что олигонуклеотид состоит из ДНК.

7. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что олигонуклеотид содержится в экспрессирующем векторе.

8. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что олигонуклеотид является кольцевым.

9. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что олигонуклеотид является линейным.

10. Одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по п.9, отличающийся тем, что 3’-конец линейного олигонуклеотида не имеет фосфорной кислоты.

11. Двухцепочечный олигонуклеотид, который может связываться с TLR9, содержащий одноцепочечный олигонуклеотид-агонист TLR9 по любому из пп.1-6 и комплементарную ему олигонуклеотидную цепь.

12. Конъюгат одноцепочечного олигонуклеотида-агониста TLR9 по любому из пп.1-10 или двухцепочечного олигонуклеотида по п.11 и по меньшей мере одной активной молекулы для лечения или профилактики целевого заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из новообразования, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

13. Конъюгат по п.12, где активная молекула выбрана из группы, состоящей из (поли)пептидов/антител и нуклеиновых кислот/олигонуклеотидов.

14. Конъюгат по п.12 или 13, в котором одноцепочечный олигонуклеотид по любому из пп.1-10 или двухцепочечный олигонуклеотид по п.11 конъюгирован с по меньшей мере одной активной молекулой через линкер.

15. Конъюгат по п.14, где линкер выбран из группы, состоящей из глицерина, (S)-(-)-1,2,4-бутантриола, 1,3,5-пентантриола, цис, цис-1,3,5,-циклогексантриола, цис, транс-1,3,5-циклогексантриола, 1,3,5-трис-(2-гидроксиэтил)изоцианурата, тетраэтиленгликоля и гексаэтиленгликоля, диолов, таких как 1,3-пропандиол или додекан-1,12-диол, циклогександиола, холестерина, нитроиндола, триэтиленгликоля, гексаэтиленгликоля, d-спейсера, ПЭГ-спейсера и алкилового линкера.

16. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения целевого заболевания или нарушения, содержащая терапевтически эффективное количество одноцепочечного олигонуклеотида-агониста TLR9 по любому из пп.1-10, двухцепочечного полинуклеотида по п.11 или конъюгата по любому из пп.12-15, где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из новообразований, инфекционного заболевания, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

17. Средство для активации TLR9 у индивидуума, содержащее терапевтически эффективное количество одноцепочечного олигонуклеотида-агониста TLR9 по любому из пп.1-10, двухцепочечного олигонуклеотида по п.11 или конъюгата по любому из пп.12-15.

18. Фармацевтическая композиция по п.16, где целевое заболевание или нарушение представляет собой новообразование, выбранное из группы, состоящей из злокачественного новообразования, эпителиального новообразования или опухоли гемопоэтического органа, саркомы, мезотелиомы, доброкачественной опухоли, дисплазии и метаплазии.

19. Фармацевтическая композиция по п.16, где целевое заболевание или нарушение представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии или грибы.

20. Фармацевтическая композиция по п.16, где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание, обусловленное Th2/Th17, выбранное из группы, состоящей из астмы, атопического заболевания, аллергии, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь крона, кожного плоского лишая и болезни Альцгеймера.

21. Фармацевтическая композиция по п.16, где целевое заболевание или нарушение представляет собой первичное иммунодефицитное заболевание, вызванное дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями в TLR.

22. Фармацевтическая композиция по п.16, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один активный ингредиент.

23. Фармацевтическая композиция по п.16, где композицию вводят совместно по меньшей мере с одним активным ингредиентом.

24. Фармацевтическая композиция по п.22 или 23, где активный ингредиент выбран из группы, состоящей из противораковых лекарственных средств; молекулярных таргетных лекарственных средств, включая ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы ангиогенеза и ингибиторы протеасом; противораковых антительных лекарственных средств; цитокинов; вакцин; антибактериальных средств; противогрибковых средств; противовирусных средств; противопаразитарных лекарственных средств; антительных лекарственных средств для нейтрализации токсина; агонистов других TLR и их комбинации.

25. Фармацевтическая композиция по п.16, где композицию вводят индивидууму способом дозирования, выбранным из группы, состоящей из энтерального введения, парентерального введения, местного введения и ингаляции.

26. Фармацевтическая композиция по п.25, где индивидуумом является человек.

27. Фармацевтическая композиция по п.26, где композицию вводят индивидууму в количестве от 2 до 8 мг/сутки.

28. Применение одноцепочечного олигонуклеотида-агониста TLR9 по любому из пп.1-10, двухцепочечного олигонуклеотида по п.11, конъюгата по любому из пп. 12-15 или фармацевтической композиции по п.16 для производства лекарственного средства для лечения или профилактики любого, выбранного из группы, состоящей из новообразований, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).

29. Фармацевтическая композиция по п.16, где композицию вводят до или после адоптивной терапии иммунными клетками или хирургического лечения, включая лучевую терапию, криоабляцию, радиочастотную абляцию и фотодинамическую терапию (PDT).

30. Способ лечения или предупреждения целевого заболевания или нарушения у индивидуума, включающий введение индивидууму одноцепочечного олигонуклеотида-агониста TLR9 по любому из пп.1-10, двухцепочечного олигонуклеотида по п.11, конъюгата по любому из пп.12-15 или фармацевтической композиции по п.16, где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из новообразования, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD); предпочтительно где целевое заболевание или нарушение лечат или предупреждают посредством активации NF-κB посредством олигонуклеотида у индивидуума.

31. Способ по п.30, где целевое заболевание или нарушение представляет собой новообразование, выбранное из группы, состоящей из злокачественного новообразования, эпителиального новообразования или опухоли гемопоэтического органа, саркомы, мезотелиомы, доброкачественной опухоли, дисплазии и метаплазии.

32. Способ по п.30, где целевое заболевание или нарушение представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмами, включающими вирусы, бактерии или грибы.

33. Способ по п.30, где целевое заболевание или нарушение представляет собой заболевание, обусловленное с Th2/Th17, выбранное из группы, состоящей из астмы, атопического заболевания, аллергии, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, включая язвенный колит и болезнь крона, кожного плоского лишая и болезни Альцгеймера.

34. Способ по п.30, где целевое заболевание или нарушение представляет собой первичное иммунодефицитное заболевание, вызванное дефицитом IRAK4, дефицитом MyD88, дефицитом Unc93B или мутациями в TLR.

35. Применение одноцепочечного олигонуклеотида по любому из пп.1–10, двухцепочечного олигонуклеотида по п.11, конъюгата по любому из пп.12-15 или фармацевтической композиции по п.16 для лечения или профилактики целевого заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из новообразования, инфекции, заболевания, обусловленного Th2/Th17, первичного иммунодефицитного заболевания и посттравматического стрессового расстройства (PTSD).