RU2846536C1

RU2846536C1 - Использование анти-pcsk9 антитела для профилактики или лечения заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина

Info

Publication number: RU2846536C1
Application number: RU2022107175A
Authority: RU
Inventors: Лэй ЦЯНЬ; Шижуй ЧЖЭН; Хуань ДЭН
Original assignee: Инновент Байолоджикс (Сучжоу) Ко., Лтд.
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2025-09-08

Abstract

Группа изобретений относится к способам профилактики или лечения заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина. Предложены способ снижения уровня холестерина у субъекта и способ профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем холестерина, выбранного из гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, включающие введение субъекту от 75 до 600 мг анти-PCSK9 антитела, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь с SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 35 соответственно. Анти-PCSK9 антитело вводят в интервале, равном или превышающем один раз в каждые две недели. Изобретения обеспечивают усовершенствованный метод лечения или профилактики заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина, характеризующийся длительным интервалом между введениями, вызывающим меньше побочных эффектов. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 21 ил., 8 табл., 16 пр.

Description

Настоящая заявка заявляет преимущества китайской заявки на патент №201910884902.9, поданной 19 сентября 2019 г., и китайской заявки на патент №202010424274.9, поданной 19 мая 2020 г., которые включены в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области терапии с использованием антител, в частности к использованию антитела, специфически связывающегося с пропротеин-конвертазой субтилизин/кексин 9-го типа (PCSK9) (далее - анти-PCSK9 антитело), и/или фрагмента такого антитела, а также содержащего его фармацевтического препарата, для профилактики или лечения заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию анти-PCSK9 антитела или его жидкого препарата для профилактики или лечения вышеуказанных заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Частота возникновения коронарной атеросклеротической болезни сердца и других заболеваний, связанных с атеросклерозом сосудов, а также смертность от них, в Китае в последнее время увеличиваются. Известным риском коронарной атеросклеротической болезни сердца является гиперхолестеринемия, и все больше данных говорит о том, что активная терапия гиперхолестеринемии ассоциирована с пониженным риском конечных сердечно-сосудистых событий, связанных с атеросклерозом коронарных артерий. Эта взаимосвязь особенно явно прослеживается у пациентов с высоким риском сердечнососудистых событий, например у пациентов с ишемической болезнью сердца.

В настоящее время основными препаратами для снижения уровня холестерина являются статины, которые играют важную роль в первичной и вторичной профилактике коронарной атеросклеротической болезни сердца. Однако нынешняя гиполипидемическая терапия не отвечает клиническим потребностям. Хотя статины могут снижать смертность от сердечнососудистых осложнений, терапия статинами имеет определенные ограничения. Во-первых, статины снижают уровень холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП, холестерин ЛПНП) не более чем на 40-55%, а увеличение дозы в два раза способно снижать ХС-ЛПНП лишь около на 6%. Кроме того, в китайской популяции высокоинтенсивная терапия статинами вызывает озабоченность в плане безопасности. К настоящему времени возрастающее количество исследований показывает, что высокоинтенсивная терапия статинами связана с повышенной частотой миопатии и увеличенным риском повышения активности печеночных ферментов, причем такая связь в китайской популяции выражена сильнее, чем в других популяциях. Исследование HPS2-THRIVE показало, что в случае умеренно-интенсивной терапии статинами частота нежелательных реакций со стороны печени у китайских пациентов заметно выше, чем у европейских. Так, частота повышения активности печеночных ферментов (>3 раз выше верхней границы нормы) у китайских пациентов в 10 раз выше, чем у европейских. Риск миопатии в китайской популяции также в 10 раз выше, чем в европейской (Zhao Shuiping, et al, Guidelines for the Prevention and Treatment of Dyslipidemia in Chinese Adults (2016 Revised Edition), China Circulation Journal 31 (10): 937-953, 2016). Данные по безопасности высокоинтенсивной терапии статинами в китайской популяции в настоящее время отсутствуют.

В связи с указанным выше, представляется необходимым продолжить разработку новых эффективных гипохолестеринемических препаратов на основе статинов, что имеет большое клиническое значение для снижения частоты конечных сердечно-сосудистых событий в популяциях высокого риска. В настоящее время выведены на рынок или находятся в стадии разработки гипохолестеринемические препараты с различными механизмами действия. К их числу относятся моноклональные антитела против PCSK-9, которые привлекают большое внимание по причине благоприятного профиля безопасности и эффективности (Zhao Shuiping, et al., Guidelines for the Prevention and Treatment of Dyslipidemia in Chinese Adults (2016, пересмотренное издание). Chinese Circulation Journal 31 (10): 937-953, 2016). Моноклональное антитело против PCSK-9 способно ингибировать PCSK-9, блокировать связывание PCSK-9 плазмы с рецепторами липопротеинов низкой плотности (LDL-рецепторы; LDLR), дополнительно предотвращать эндоцитоз и деградацию LDLR, увеличивать уровень экспрессии и количество LDL-рецепторов на поверхности клеток, увеличивать повторный захват ХС-ЛПНП рецепторами LDLR и оказывать прямой эффект на снижение уровня липидов в крови.

Моноклональное антитело против PCSK-9 оказывает значительный терапевтический эффект, а также отличается высокой безопасностью и удобством применения (его вводят подкожной инъекцией). Однако моноклональное антитело против PCSK-9 необходимо вводить с интервалом 2 или 4 недели в одном цикле лечения. Существует неудовлетворенная клиническая потребность в увеличении соблюдения пациентами режима терапии.

Также остается потребность в усовершенствованном методе лечения или профилактики заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина, который бы характеризовался более длительным интервалом между введениями, что было бы более удобно для пациентов и повысило бы их соблюдение терапии; и/или методе, вызывающем меньше побочных эффектов или более безопасном; и/или методе, который бы отличался более удобным способом применения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Метод профилактики или лечения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к методу снижения уровня холестерина у субъекта, состоящего во введении субъекту анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в дозе от около 15 мг до 3500 мг.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к методу профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем холестерина ЛПНП, у субъекта, состоящего во введении субъекту анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в дозе от около 15 мг до 3500 мг.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к методу профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем холестерина, такого как гиперхолестеринемия и/или гиперлипидемия, состоящего во введении субъекту анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в дозе от около 15 мг до 3500 мг.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH и вариабельную область легкой цепи VL, где VH содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10, HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17, и HCDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19; VL содержит комбинацию LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем LCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, LCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5, и LCDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH и вариабельную область легкой цепи VL, причем вариабельная область тяжелой цепи VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 30; вариабельная область легкой цепи VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 41; легкая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело представляет собой антитело ADI-10087, раскрытое в заявке РСТ на патент PCT/CN 2017/118050.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, холестерин является холестерином ЛПНП.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят субъекту в дозе от около 25 мг до около 3000 мг, от около 50 мг до около 2500 мг, от около 75 мг до около 2000 мг, от около 100 мг до около 2000 мг, от около 200 мг до около 2000 мг, от около 250 мг до около 1500 мг, от около 300 мг до около 1000 мг, около 450 мг до около 1000 мг, от около 600 мг до около 1000 мг, от около 350 мг до около 900 мг, от около 400 мг до около 800 мг, от около 450 мг до около 700 мг, от около 300 мг до около 600 мг или от около 450 мг до около 600 мг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят субъекту в дозе около 25 мг, около 50 мг, около 75 мг, около 100 мг, около 125 мг, около 140 мг, около 150 мг, около 200 мг, около 250 мг, около 300 мг, около 350 мг, около 400 мг, около 420 мг, около 450 мг, около 500 мг, около 550 мг, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг, около 1000 мг, около 1200 мг, около 1500 мг, около 2000 мг, около 2500 мг, около 3000 мг или около 3500 мг.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят парентерально.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят подкожно.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят внутривенно.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, уровень холестерина ЛПНП у субъекта остается сниженным на >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем холестерина ЛПНП у субъекта до введения.

B некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, уровень свободной PCSK-9 в сыворотке субъекта остается сниженным на >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем свободной PCSK-9 в сыворотке субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, уровень общего холестерина у субъекта остается сниженным на >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем общего холестерина у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, уровень аполипопротеина В у субъекта остается сниженным на >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем аполипопротеина В у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, уровень холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности, у субъекта остается сниженным на >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности, у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, уровень липопротеина (а) у субъекта остается сниженным на >20%, >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем липопротеина (а) у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, соотношение аполипопротеина В/аполипопротеина А1 у субъекта остается сниженным на >20%, >30%, >35%, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85% или >90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с соотношением аполипопротеина В/аполипопротеина А1 у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, холестерин или холестерин ЛПНП является сывороточным холестерином ЛПНП.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят один раз в течение периода, равного четырем неделям (р/4 нед), или превышающего его, например один раз в пять недель (р/5 нед), один раз в шесть недель (р/6 нед), один раз в семь недель (р/7 нед), один раз в восемь недель (р/8 нед), один раз в девять недель (р/9 нед), один раз в десять недель (р/10 нед), один раз в одиннадцать недель (р/11 нед), один раз в двенадцать недель (р/12 нед), один раз в 4 месяца, один раз в 5 месяцев, один раз в 6 месяцев, один раз в 7 месяцев или один раз в год.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, у субъекта после введения не развиваются тяжелые нежелательные явления, в частности тяжелые нежелательные явления, связанные с анти-PCSK9 антителом или его антиген-связывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, частота возникновения нежелательных явлений у субъекта сравнима с частотой возникновения таких явлений у субъекта, получившего плацебо.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, субъектом является человек.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, заболевание, связанное с повышенным уровнем холестерина, выбрано из гомозиготной наследственной гиперхолестеринемии, гетерозиготной наследственной гиперхолестеринемии и ненаследственной гиперхолестеринемии.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, метод заключается в подкожном или внутривенном введении субъекту антитела ADI-10087 один раз в четыре недели или в шесть недель в дозе от около 300 мг до 1000 мг (например, около 300 мг, около 350 мг, около 400 мг, около 420 мг, около 450 мг, около 500 мг, около 550 мг, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг), и при этом уровень холестерина ЛПНП у субъекта через четыре или шесть недель после введения остается сниженным на >50% по сравнению с уровнем холестерина ЛПНП у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, метод заключается в подкожном или внутривенном введении субъекту антитела ADI-10087 один раз в четыре недели или в шесть недель в дозе от около 450 мг до 1000 мг (например, около 450 мг, около 500 мг, около 550 мг, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг), и при этом уровень холестерина ЛПНП у субъекта через четыре или шесть недель после введения остается сниженным на >50% по сравнению с уровнем холестерина ЛПНП у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, метод заключается в подкожном или внутривенном введении субъекту антитела ADI-10087 один раз в шесть недель или в восемь недель в дозе от около 600 мг до 1000 мг (например, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг), и при этом уровень холестерина ЛПНП у субъекта через шесть или восемь недель после введения остается сниженным на >50% по сравнению с уровнем холестерина ЛПНП у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, метод заключается в подкожном или внутривенном введении субъекту антитела ADI-10087 один раз в четыре недели или в шесть недель в дозе от около 300 мг до 1000 мг (например, около 300 мг, около 350 мг, около 400 мг, около 450 мг, около 500 мг, около 550 мг, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг), и при этом уровень холестерина ЛПНП у субъекта через четыре или шесть недель после введения остается сниженным на >50%, а уровень свободной PCSK-9 в сыворотке у субъекта через четыре или шесть недель после введения остается сниженным на >60%, по сравнению с соответствующими уровнями у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, метод заключается в подкожном или внутривенном введении субъекту антитела ADI-10087 один раз в четыре недели или в шесть недель в дозе от около 450 мг до 1000 мг (например, около 450 мг, около 500 мг, около 550 мг, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг), и при этом уровень холестерина ЛПНП у субъекта через четыре или шесть недель после введения остается сниженным на >50%, а уровень свободной PCSK-9 в сыворотке у субъекта через четыре или шесть недель после введения остается сниженным на >80%, по сравнению с соответствующими уровнями у субъекта до введения.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, метод заключается в подкожном или внутривенном введении субъекту антитела ADI-10087 один раз в шесть недель или в восемь недель в дозе от около 600 мг до 1000 мг (например, около 600 мг, около 650 мг, около 700 мг, около 750 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг), и при этом уровень холестерина ЛПНП у субъекта через шесть или восемь недель после введения остается сниженным на >50%, а уровень свободной PCSK-9 в сыворотке у субъекта через восемь недель после введения остается сниженным на >50%, по сравнению с соответствующими уровнями у субъекта до введения.

В некоторых конкретных вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят в составе препарата, описанного ниже.

В некоторых конкретных вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят в составе жидкого препарата антитела, причем жидкий препарат антитела содержит:

(i) от около 100 мг/мл до около 200 мг/мл анти-PC8K-9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента;

(ii) от около 0,2 мг/мл до 10 мг/мл гистидина;

(iii) от около 1% до 6% сорбита; и

(iv) от около 0,05 мг/мл до 1 мг/мл полисорбата-80 или полисорбата-20;

причем рН жидкого препарата составляет от около 5,0 до 6,0.

(ii) от около 0,2 мг/мл до 10 мг/мл гистидина;

(iii) от около 1% до 6% сорбита и от около 50 ммоль/л до 180 ммоль/л аргинина или соли аргинина; и

В некоторых конкретных вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят в составе жидкого препарата антитела, и при этом жидкий препарат антитела содержит воду в качестве растворителя и следующие компоненты:

Анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент	150 мг/мл
Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	90 ммоль/л
Сорбит	3% (масс../об.)
Полисорбат-80	0,3 г/л

причем рН жидкого препарата составляет около 5,5.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения жидкий препарат антитела содержит воду в качестве растворителя и следующие компоненты:

ADI-10087	150 мг/мл
Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	90 ммоль/л
Сорбит	3% (масс../об.)
Полисорбат-80	0,3 г/л

Следует отметить, что антитело или его антиген-связывающие фрагменты, последовательность, состав препарата, биологическая активность и тому подобное, описанные в настоящем изобретении, были раскрыты в другой заявке РСТ на патент PCT/CN 2017/118050 (№ публикации WO 2018/113781), поданной тем же заявителем, и содержание этой заявки включено в этот документ посредством ссылки в полном объеме. Для удобства соотнесения и ссылок последовательности, раскрытые в этом документе (включая перечень последовательностей), и их нумерация напрямую цитируются из заявки на патент PCT/CN 2017/118050 без изменения нумерации.

II. Препарат антитела, раскрытый в настоящем документе

В методах по настоящему изобретению могут использоваться препараты антитела, описанные в заявке 201810450088.5, которая включена в этот документ посредством ссылки в полном объеме. Препарат анти-PCSK9 антитела, используемый в настоящем изобретении (далее - «препарат антитела, раскрытый в этом документе»), также подробно описан ниже.

В одном аспекте, в рамках настоящего изобретения может использоваться следующий жидкий препарат антитела (далее - «жидкий препарат антитела, раскрытый в этом документе»), который содержит:

(i) анти-PCSK9 антитело или его фрагмент (например, антиген-связывающий фрагмент), как определено в этом документе;

(ii) буфер;

(iii) ингибитор вязкости; и

(iv) поверхностно-активное вещество.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH и вариабельную область легкой цепи VL, где VH содержит три определяющие комплементарность участка (CDR), входящие в VH, представленную в SEQ ID NO: 30; VL содержит три определяющие комплементарность участка (CDR), входящие в VL, представленную в SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH и вариабельную область легкой цепи VL, причем VH содержит комбинацию HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10, HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17, и HCDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19; VL содержит комбинацию LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые содержат или состоят из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 4, 5 и 6 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH и вариабельную область легкой цепи VL, причем вариабельная область тяжелой цепи VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30; вариабельная область легкой цепи VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41; легкая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления методов, упомянутых выше, анти-PCSK9 антитело представляет собой антитело ADI-10087, раскрытое в китайской заявке на патент PCT/CN 2017/118050.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытого в этом документе, составляет от около 50 мг/мл/ до около 200 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 100 мг/мл/ до около 200 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет около 100 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет около 125 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет около 150 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет около 175 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения концентрация анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет около 200 мг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело является любым антителом, связывающимся с белком PCSK9 (таким как человеческая PCSK9), например поликлональным антителом, моноклональным антителом или комбинацией обоих. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело является моноклональным антителом. В одном варианте осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент является анти-PCSK9 антителом или его антиген-связывающим фрагментом, которые определены в этом документе.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 0,01 мг/мл до 50 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 0,1 мг/мл/ до 50 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 0,2 мг/мл до 10 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 0,5 мг/мл до 2,5 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 1,0 мг/мл/ до 2,0 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация буфера в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет около 1,5 мг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения буфер выбран из гистидина, глутамата, фосфата, ацетата, цитрата и трис(гидроксиметил)аминометана. В одном варианте осуществления изобретения буфером является гистидин.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация ингибитора вязкости в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 10 ммоль/л до 1000 ммоль/л. В одном варианте осуществления изобретения концентрация ингибитора вязкости в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 20 ммоль/л до 500 ммоль/л. В одном варианте осуществления изобретения концентрация ингибитора вязкости в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 50 ммоль/л до 300 ммоль/л. В одном варианте осуществления изобретения концентрация ингибитора вязкости в жидком препарате антитела, раскрытом в этом документе, составляет от около 50 ммоль/л до 200 ммоль/л.

В одном варианте осуществления изобретения ингибитор вязкости выбран из сахарных спиртов (таких как сорбит), аргинина, гидрохлорида аргинина, тиоцианата натрия, тиоцианата аммония, сульфата аммония, хлорида аммония, хлорида кальция, хлорида цинка, ацетата натрия и их комбинаций. В одном варианте осуществления изобретения ингибитором вязкости является сорбит. В одном варианте осуществления изобретения ингибитором вязкости является сорбит с концентрацией от около 1% до 6% (масс./об.). В одном варианте осуществления изобретения ингибитором вязкости является сорбит с концентрацией от около 1% до 6% (масс./об.), и жидкий препарат не содержит других ингибиторов вязкости. В одном варианте осуществления изобретения ингибитором вязкости является комбинация сорбита и аргинина или соли аргинина (предпочтительно аргинина гидрохлорида). В одном варианте осуществления изобретения ингибитором вязкости является комбинация сорбита и аргинина или соли аргинина (предпочтительно аргинина гидрохлорида), причем концентрация сорбита составляет от около 1% до 6% (масс./об.), предпочтительно от около 2% до 4% (масс./об.) и, более предпочтительно, около 3% (масс./об.), а концентрация аргинина или соли аргинина (предпочтительно аргинина гидрохлорида) составляет от около 50 ммоль/л до 180 ммоль/л, предпочтительно от около 70 ммоль/л до 150 ммоль/л и, более предпочтительно, около 90 ммоль/л. В одном варианте осуществления изобретения ингибитором вязкости является комбинация сорбита и аргинина или соли аргинина (предпочтительно аргинина гидрохлорида), причем концентрация сорбита составляет от около 1% до 6% (масс./об.), предпочтительно от около 2% до 4% (масс./об.) и, более предпочтительно, около 3% (масс./об.), а концентрация аргинина или соли аргинина составляет от около 50 ммоль/л до 180 ммоль/л, предпочтительно от около 70 ммоль/л до 150 ммоль/л и, более предпочтительно, около 90 ммоль/л, и при этом жидкий препарат не содержит других ингибиторов вязкости.

В одном варианте осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества составляет от около 0,01 мг/мл до 5 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества составляет от около 0,05 мг/мл/ до 1 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества составляет от около 0,1 мг/мл/ до 0,5 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества составляет около 0,3 мг/мл.

В одном варианте осуществления изобретения поверхностно-активное вещество является неионогенным поверхностно-активным веществом. В одном варианте осуществления изобретения поверхностно-активное вещество является, например, плюроником, полисорбатом-80, полисорбатом-60, полисорбатом-40 или полисорбатом-20.

В одном варианте осуществления изобретения жидкий препарат, раскрытый в настоящем изобретении, содержит растворитель, причем растворитель, предпочтительно, выбран из воды для инъекций, органических растворителей для инъекций (включая, помимо прочего, масло для инъекций, этанол, пропиленгликоль и тому подобное) и их комбинаций.

В одном варианте осуществления изобретения рН жидкого препарата составляет от 5,0 до 6,0. В одном варианте осуществления изобретения рН жидкого препарата составляет от 5,2 до 5,8. В одном варианте осуществления изобретения рН жидкого препарата составляет от 5,4 до 5,6. В одном варианте осуществления изобретения рН жидкого препарата составляет около 5,5.

В одном варианте осуществления изобретения вязкость жидкого препарата при 25°С составляет от около 1,0 до 20 сантипуаз. В одном варианте осуществления изобретения вязкость жидкого препарата при 25°С составляет от около 1,0 до 10 сантипуаз. В одном варианте осуществления изобретения вязкость жидкого препарата при 25°С составляет около 1,0 сантипуаза, 2,0 сантипуаза, 3,0 сантипуаз, 4,0 сантипуаз, 5,0 сантипуаз, 6,0 сантипуаз, 7,0 сантипуаз, 8,0 сантипуаз, 9,0 сантипуаз или 10,0 сантипуаз. В одном варианте осуществления изобретения вязкость жидкого препарата при 25°С составляет от около 5,0 до 7,0 сантипуаз. В одном варианте осуществления изобретения вязкость жидкого препарата при 25°С составляет около 5,2 сантипуаз. В одном варианте осуществления изобретения вязкость жидкого препарата при 25°С составляет около 6,0 сантипуаз.

В одном варианте осуществления изобретения жидкий препарат является фармацевтическим препаратом, предпочтительно инъекционной формой, и, более предпочтительно, подкожной инъекционной формой.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкий препарат антитела, раскрытый в этом документе, содержит:

(ii) от около 0,2 мг/мл до 10 мг/мл гистидина;

(iii) от около 1% до 6% (масс./об.) сорбита; и

В одном более предпочтительном варианте осуществления изобретения жидкий препарат антитела, раскрытый в этом документе, также содержит воду для инъекций.

(ii) от около 0,2 мг/мл до 10 мг/мл гистидина;

Анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент	150 мг/мл
Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	90 ммоль/л
Сорбит	3% (масс./об.)
Полисорбат-80	0,3 г/л

ADI-10087	150 мг/мл
Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	90 ммоль/л
Сорбит	3% (масс./об.)
Полисорбат-80	0,3 г/л

В одном варианте осуществления изобретения чистота анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате, содержащем раскрытое в этом документе анти-PCSK9 антитело, снижается не более чем на 10%, например не более чем на 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, или 0,1%, как определено методами ЭХ-ВЭЖХ и КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях, после хранения при температуре от около -80°С до около 45°С, например при -80°С, около -30°С, около -20°С, около 0°С, около 5°С, около 25°С, около 35°С, около 37°С, около 42°С или около 45°С в течение по меньшей мере 14 дней, по меньшей мере 28 дней, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или дольше.

В одном варианте осуществления изобретения гетерогенность заряда анти-PCSK9 антитела или его антиген-связывающего фрагмента в жидком препарате, содержащем раскрытое в этом документе анти-PCSK9 антитело, изменяется не более чем на 10%, например не более чем на 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, или 0,1%, как определено методом КОХ-ВЭЖХ, после хранения при температуре от около -80°С до около 45°С, например при -80°С, около -30°С, около -20°С, около 0°С, около 5°С, около 25°С, около 35°С, около 37°С, около 42°С или около 45°С в течение по меньшей мере 14 дней, по меньшей мере 28 дней, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или дольше.

Препарат, раскрытый в этом документе, содержит высокую концентрацию антитела, имеет низкую вязкость, пригодную для введения (в частности, для подкожного введения), характеризуется высокой физической и химической стабильностью, а также низкой склонностью к агрегации и образованию осадка, а также демонстрирует незначительное изменение гетерогенности заряда во время хранения. Эти характеристики весьма полезны для производства полноценных, эффективных и высокостабильных лекарственных препаратов для клинического использования.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что сорбит может использоваться в качестве ингибитора вязкости жидкого препарата, содержащего анти-PCSK9 антитело, что позволяет получать жидкий препарат, содержащий анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент, с низкой вязкостью и высокой концентрацией без добавления других ингибиторов вязкости; при этом жидкий препарат характеризуется высокой стабильностью. Кроме того, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что комбинация сорбита и аргинина в качестве ингибитора вязкости способна еще больше снижать вязкость жидкого препарата, содержащего анти-PCSK9 антитело, и обеспечивать жидкий препарат с высокой концентрацией, содержащий анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент, что позволяет обеспечить вязкость, пригодную для подкожной инъекции; и при этом жидкий препарат, содержащий анти-PCSK9 антитело, имеет более высокую стабильность.

В другом аспекте, предметом настоящего изобретения является твердый препарат, получаемый путем лиофилизации жидкого препарата, упомянутого выше. Перед применением твердый препарат может быть переведен в подходящий растворитель для получения жидкого препарата, раскрытого в этом документе.

III. Анти-PCSK9 антитело или его препарат для лечения или профилактики заболеваний

Настоящее изобретение относится к анти-PCSK9 антителу или его антиген-связывающему фрагменту или к жидкому препарату этого антитела, описанному выше, для использования в описанных выше методах по настоящему изобретению.

Следует понимать, что в перечисленных выше вариантах осуществления изобретения, относящихся к жидким препаратам, вводимая доза относится к количеству анти-PCSK9 антитела в составе препарате.

IV. Фармацевтическая единица дозирования для однократного применения, фармацевтический набор или их фармацевтическое применение

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической единице дозирования для однократного применения, которое содержит анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент в дозе от около 15 мг до 3500 мг; предпочтительно, анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент в дозе от около 25 мг до около 3000 мг, от около 50 мг до около 2500 мг, от около 75 мг до около 2000 мг, от около 100 мг до около 2000 мг, от около 200 мг до около 2000 мг, от около 250 мг до около 1500 мг, от около 300 мг до около 1000 мг, около 450 мг до около 1000 мг, от около 600 мг до около 1000 мг, от около 350 мг до около 900 мг, от около 400 мг до около 800 мг, от около 450 мг до около 700 мг, от около 300 мг до около 600 мг или от около 450 мг до около 600 мг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи VH и вариабельную область легкой цепи VL, причем

(a) VH содержит:

(i) комбинацию HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10; HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17; HCDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19; или

(II) три определяющие комплементарность участка (CDR), содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO: 30, и

(b) VL содержит:

(i) комбинацию LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем LCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4; LCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5; LCDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6; или

(ii) три определяющие комплементарность участка (CDR), содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO: 24.

(a) вариабельная область тяжелой цепи VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 30; и

(b) вариабельная область легкой цепи VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем

(a) тяжелая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 41; и

(b) легкая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35;

предпочтительно, анти-PCSK9 антитело является антителом ADI-10087.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическому набору, содержащему анти-PCSK9 антитело или его антиген-связывающий фрагмент, в соответствии с любым из описанных выше вариантов осуществления фармацевтической единицы дозирования для однократного применения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию фармацевтической единицы дозирования для однократного применения, описанной выше, или набора компонентов, описанного выше, для приготовления лекарственного средства для снижения уровня холестерина у субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию фармацевтической единицы дозирования для однократного применения, описанной выше, или набора компонентов, описанного выше, для профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем холестерина ЛПНП, у субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию фармацевтической единицы дозирования для однократного применения, описанной выше, или набора компонентов, описанного выше, для профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем холестерина, такого как гиперхолестеринемия и/или гиперлипидемия.

Следует понимать, что технические решения, основанные на комбинации технических признаков, описанных выше в разделе I и разделе III, и технические решения, описанные выше в разделе IV, также включены в настоящую заявку.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показаны кривые «средняя свободная концентрация - время» для антитела ADI-10087 после введения ADI-10087 субъектам из каждой дозовой группы; верхний график представлен в линейных координатах; нижний график - в полулогарифмических координатах; планки погрешностей соответствуют среднему значению ± стандартное отклонение; каждой дозовой группе соответствует одна кривая.

На ФИГ. 2 показаны кривые «средняя общая концентрация - время» для антитела ADI-10087 после введения ADI-10087 субъектам из каждой дозовой группы; верхний график представлен в линейных координатах, нижний график - в полулогарифмических координатах; планки погрешностей соответствуют среднему значению ± стандартное отклонение; каждой дозовой группе соответствует одна кривая.

На ФИГ. 3 показана зависимость C_max для общей концентрации ADI-10087 и свободной концентрации ADI-10087 после подкожной инъекции в живот ADI-10087 в дозе 25-600 мг; (диаграмма рассеяния) линия перегиба на графике соответствует медианному значению в каждой дозовой группе; каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует отдельному значению; сплошная линия соответствует соответствующему параметру для свободного ADI-10087, а пунктирная - для общего ADI-10087.

На ФИГ. 4 показана зависимость AUC_0-last для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087 после подкожной инъекции в живот ADI-10087 в дозе 25-600 мг; (диаграмма рассеяния) линия перегиба на графике соответствует медианному значению в каждой дозовой группе; каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует отдельному значению; сплошная линия соответствует соответствующему параметру для свободного ADI-10087, а пунктирная - для общего ADI-10087.

На ФИГ. 5 показана зависимость AUC_0-∞ для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087 после подкожной инъекции в живот ADI-10087 в дозе 25-600 мг; (диаграмма рассеяния) линия перегиба на графике соответствует медианному значению в каждой дозовой группе; каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует отдельному значению; сплошная линия соответствует соответствующему параметру для свободного ADI-10087, а пунктирная - для общего ADI-10087.

На ФИГ. 6 показана скорость изменения (%) концентрации свободного PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 7 показан линейные графики зависимости изменений ХС-ЛПНП, рассчитанных методом наименьших квадратов, относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 8 показана средняя скорость изменения концентрации ХС-ЛПНП относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 9 показаны кривые «средняя концентрация - время» для ХС-ЛПНП после однократного введения.

На ФИГ. 10 показана скорость изменения концентрации общего холестерина относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 11 показана скорость изменения концентрации АроВ относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 12 показана скорость изменения концентрации ХС-не-ЛПВП относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 13 показана скорость изменения концентрации липопротеина (a) (Lp(a)) относительно исходного уровня после однократного введения.

На ФИГ. 14 показана скорость изменения (%) концентрации свободного PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 15 показана скорость изменения уровня ХС-ЛПНП относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 16 показаны изменения уровня ХС-ЛПНП относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 17 показана скорость изменения уровня липопротеина(а) (Lp(a)) относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 18 показана скорость изменения уровня АроВ относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 19 показана скорость изменения уровня ХС-не-ЛПВП относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 20 показана скорость изменения уровня общего холестерина (ОХ) относительно исходного уровня после многократных введений.

На ФИГ. 21 показана скорость изменения уровня АроВ/ApoA1 относительно исходного уровня после многократных введений.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Термины, используемые в описании настоящего изобретения, имеют следующие определения. Если определение в этом документе отсутствует, предпочтительно руководствоваться определениями, приведенными в заявке на патент PCT/CN 2017/118050. Если определения отсутствуют в обеих заявках на патент, термины, используемые в описании настоящего изобретения, имеют общепринятый смысл, понятный специалистам в данной области.

В целях объяснения данного описания будут использоваться следующие определения, причем, в зависимости от контекста, используемые в единственном числе термины могут включать и множественное число, и наоборот. Следует понимать, что используемые в настоящем документе термины предназначены для описания лишь конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения его объема.

Используемый в настоящем документе термин «и/или» относится к любому из вариантов или к любым двум или более вариантам.

Используемые в этом документе термины «содержать» или «включать» следует понимать как включение описанных элементов, целых чисел или этапов, но не как исключение каких-либо других элементов, целых чисел или этапов. Используемые в настоящем документе термины «содержать» или «включать», если не указано иное, также охватывают ситуацию, когда целое состоит из описанных элементов, целых чисел или этапов. Например, если сказано, что вариабельная область антитела «содержит» определенную последовательность, также подразумевается охват вариабельной области антитела, состоящей из определенной последовательности.

«Антитела или их антиген-связывающие фрагменты» в применении к настоящему изобретению включают, помимо прочего, поликлональные, моноклональные, моновалентные, биспецифические, изоконъюгатные, мультиспецифические, рекомбинантные, гетерогенные, гетерогенные гибридные, химерные, гуманизированные (в частности, с привитой CDR), деиммунизированные или человеческие антитела, Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки Fab, Fd, Fv, связанные через дисульфидные мостики Fv (dsFv), одноцепочечные антитела (например, scFv), диатела и тетратела (Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (14), 6444-6448), наноантитела (также называемые однодоменными антителами), анти-идиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела против антитела, раскрытого в этом документе), и эпитоп-связывающие фрагмент любого из перечисленных.

Термин «индивид» или «субъект» включает млекопитающих. Млекопитающие включают, помимо прочего, домашних животных (например, крупный рогатый скор, коз, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления изобретения индивид или субъект является человеком, в том числе ребенком, подростком или взрослым.

Термин «комбинированная терапия» означает, что два или более терапевтических агентов вводят для лечения заболеваний, связанных с повышенным уровнем холестерина, как описано в настоящем документе. Такое введение включает совместное введение этих терапевтических агентов по существу одновременно, например в виде одной капсулы с фиксированным соотношением активных ингредиентов. В альтернативном варианте, такое введение включает совместное введение каждого активного ингредиента в различных или в раздельных контейнерах (например, в виде таблеток, капсул, порошка и жидкости). Порошок и/или жидкость перед введением могут быть восстановлены или разведены до требуемой дозы. Кроме того, такое введение также включает применение терапевтических агентов каждого типа последовательно примерно в одно и то же время или в различные моменты времени. В любом случае режим терапии обеспечит полезный эффект комбинации лекарственных препаратов при лечении нарушений или симптомов, описанных в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» (или «лечить» или «обеспечивающий лечение») относится к замедлению, прерыванию, остановке, облегчению, прекращению, ослаблению или реверсии прогрессирования или тяжести существующего симптома, нарушения, патологического состояния или заболевания.

Используемый в настоящем документе термин «профилактика» (или «предотвращать» или «обеспечивать профилактику») относится к замедлению проявления или прогрессирования симптомов заболевания или нарушения, либо конкретного заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления изобретения кандидатами на профилактическую терапию являются субъекты с соответствующим семейным анамнезом. В целом, термин «профилактика» (или «предотвращать» или «обеспечивать профилактику») относится к введению лекарственного препарата до проявления заболевания или симптомов, в особенности у субъектов из группы риска.

Термин «заболевание, связанное с повышенным уровнем холестерина» включает одно или более из следующих заболеваний: гиперхолестеринемия, гиперлипидемия, заболевание сердца, метаболический синдром, сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, инсульт, сердечно-сосудистые заболевания, болезнь Альцгеймера и общая дислипидемия (например, повышенный уровень общего холестерина в сыворотке, повышенный уровень ЛПНП, повышенный уровень триглицеридов, повышенный уровень ЛПОНП и/или пониженный уровень ЛПВП). К неограничивающим примерам первичных или вторичных дислипидемий, для лечения которых может применяться анти-PCSK9 антитело (само по себе или в комбинации с одним или более другими лекарственными препаратами) относятся метаболический синдром, сахарный диабет, наследственная комбинированная гиперлипидемия, наследственная гипертриглицеридемия, наследственные гиперхолестеринемии, включая гетерозиготную гиперхолестеринемию, гомозиготную гиперхолестеринемию и наследственный дефицит аполипопротеина В100; полигенная гиперхолестеринемия; гомозиготная наследственная гиперхолестеринемия, гетерозиготная наследственная гиперхолестеринемия и ненаследственная гиперхолестеринемия; наследственная дисбеталипопротеинемия; недостаточность печеночной липазы; дислипидемия, вызванная любой из следующих причин: неосмотрительное питание, гипотиреоз, лекарственные препараты (включая эстрогенную и прогестероновую терапевтические средства, β-блокаторы и тиазидные диуретики); нефротический синдром, хроническая почечная недостаточность, синдром Кушинга, первичный билиарный цирроз, болезни накопления гликогена, гепатома, холестаз, акромегалия, инсулинома, изолированная недостаточность соматотропного гормона и гипертриглицеридемия, вызванная употреблением алкоголя.

Термин «гиперхолестеринемия», используемый в этом документе, относится к нарушению, при котором концентрация холестерина повышается выше определенного уровня. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень холестерина ЛПНП повышается выше определенного уровня. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень холестерина ЛПНП в сыворотке повышается выше определенного уровня.

Используемый в настоящем документе термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной обеспечивать пролиферацию другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Этот термин включает векторы, которые служат для самореплицирующихся структур нуклеиновых кислот, а также векторы, связывающиеся с геномом клетки-хозяина, в которую они были введены. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновой кислоты, с которой они функционально связаны. Такие векторы называются в настоящем документе «экспрессионными векторами».

Термин «эффективное количество» относится к количеству или дозе препарата, антитела или фрагмента, описанных в этом документе, которые вызывают ожидаемый эффект у пациента, получающего терапию, после введения ему одной или несколько доз. Эффективное количество может быть легко определено лечащим врачом как лицом, являющимся специалистом в данной области, путем рассмотрения следующих разнообразных факторов: вид, например млекопитающее; размер, возраст и общее состояние здоровья; конкретное имеющееся заболевание; степень или тяжесть заболевания; ответ у конкретного пациента; конкретное вводимое антитело; путь введения; параметры биодоступности вводимого препарата; выбранный режим введения и применение сопутствующей терапии.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному для достижения желаемого терапевтического результата при необходимой дозировке в течение необходимого периода времени. Терапевтически эффективное количество препарата, антитела или фрагмента антитела, описанных в этом документе, либо его конъюгата или композиции может различаться в зависимости от разнообразных факторов, таких как болезненное состояние, возраст, пол и вес индивида, а также способность антитела или части антитела оказывать желаемый ответ у индивида. Под терапевтически эффективным количеством также понимается такое количество, при котором любой токсический или нежелательный эффект препарата, антитела или фрагмента антитела, либо его конъюгата или композиции уступает терапевтически полезному эффекту.

Термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному для достижения желаемого профилактического результата при необходимой дозировке в течение необходимого периода времени. В целом, поскольку профилактическая доза вводят субъекту до начала заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

Термин «фармацевтическая единица дозирования для однократного применения» относится к дозированной фармацевтической форме для однократного применения, включая растворы для инъекций, таблетки и лиофилизированные порошки, которые вводят пациенту во время схемы применения.

Термин «препарат», используемый в этом документе, относится к композиции, которая пригодна для введения животным, предпочтительно млекопитающим (включая человека), и содержит по меньшей мере один активный ингредиент и по меньшей мере один неактивный ингредиент. Термин «жидкий препарат» относится к препарату в форме жидкости. Жидкий препарат, раскрытый в этом документе, содержит (i) анти-PCSK-9 антитело или его фрагмент (предпочтительно антиген-связывающий фрагмент); (ii) буфер; (iii) ингибитор вязкости; (iv) поверхностно-активное вещество и (v) растворитель. Композиция препарата, раскрытая в этом документе, может соответствовать вариантам осуществления жидких препаратов, упомянутым выше. Жидкий препарат, раскрытый в этом документе, предпочтительно является инъекционной формой и, более предпочтительно, подкожной инъекционной формой.

Термин «буфер», используемый в этом документе, относится к буферу для поддержания рН. Предпочтительно буфер способен поддерживать рН жидкого препарата, раскрытого в этом документе, в диапазоне от около 5,0 до 6,0, предпочтительно от около 5,2 до 5,8, более предпочтительно, от около 5,4 до 5,6 и, наиболее предпочтительно, около 5,5. Концентрация буфера в жидком препарате составляет, например, от около 0,01 мг/мл до 50 мг/мл, от около 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, от около 0,2 мг/мл до 10 мг/мл, от около 0,5 мг/мл до 2,5 мг/мл, от около 1,0 мг/мл до 2,0 мг/мл или около 1,5 мг/мл. Предпочтительно буфер выбран из гистидина, глутамата, фосфата, ацетата, цитрата и трис(гидроксиметил)аминометана.

Термин «ингибитор вязкости», используемый в этом документе, относится к веществу, способному снижать вязкость жидкого препарата, содержащего анти-PCSK9 антитело. Концентрация ингибитора вязкости в жидком препарате составляет, например, от около 10 ммоль/л до 1000 ммоль/л, от около 20 ммоль/л до 500 ммоль/л, от около 50 ммоль/л до 300 ммоль/л или от около 50 ммоль/л до 200 ммоль/л. Предпочтительно, ингибитор вязкости выбран из сахарного спирта, аргинина, гидрохлорида аргинина, тиоцианата натрия, тиоцианата аммония, сульфата аммония, хлорида аммония, хлорида кальция, хлорида цинка, ацетата натрия и их комбинаций. Более предпочтительно, ингибитор вязкости является сорбитом или комбинацией сорбитом и аргинина или соли аргинина (предпочтительно аргинина гидрохлорида). Предпочтительно, концентрация сорбитом в жидком препарате составляет от около 1% до 6% (масс./об.), а концентрация аргинина или соли аргинина (предпочтительно аргинина гидрохлорида) в жидком препарате составляет от около 50 ммоль/л до 180 ммоль/л, предпочтительно от около 70 ммоль/л до 150 ммоль/л и, более предпочтительно, около 90 ммоль/л.

Термин «поверхностно-активное вещество», используемый в этом документе, относится к веществу, которое способно существенным образом изменять состояние границы раздела в системе растворов, будучи добавленным в небольшом количестве. Концентрация поверхностно-активного вещества в жидком препарате составляет, например, от около 0,01 мг/мл до 5 мг/мл, от около 0,05 мг/мл до 1 мг/мл, от около 0,1 мг/мл до 0,5 мг/мл и, более предпочтительно, около 0,3 мг/мл. Предпочтительно, поверхностно-активное вещество является неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как плюроники, полисорбат-80, полисорбат-60, полисорбат-40 или полисорбат-20.

Термин «растворитель», используемый в этом документе, относится к жидкости, применяемой для растворения или суспендирования активных ингредиентов и неактивных ингредиентов для получения жидкого препарата. К растворителям, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, помимо прочего, вода для инъекций, органические растворители для инъекций (включая, помимо прочего, масло для инъекций, этанол и пропиленгликоль) и их комбинации.

Термин «сахарный спирт», используемый в этом документе, относится к соответствующему полиолу, который получен с помощью реакции восстановления, такой как каталитическое гидрирование, моносахарида. К сахарным спиртам относятся, помимо прочего, сорбит, маннитол, эритритол, мальтитол, лактитол, ксилитол и т.п.

Термин «около», используемый в комбинации с численным значением, предназначен для охвата численных значений в диапазоне от нижней границы, отличающейся от указанного численного значения на 10% в меньшую сторону, до верхней границы, отличающейся от указанного численного значения на 10% в большую сторону.

Термин «масс./об.», используемый в этом документе, означает «масса/объем», например «1% масс./об.» означает 1 г/100 мл = 0,01 г/мл = 10 мг/мл.

Термины «обеспечение введения» и «введение» в этом документе используются на равных основаниях, если не указано иное.

Фармацевтический набор в этом документе также может обозначаться как набор компонентов.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано примерами, и следующие примеры не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.

Сокращения:

ЭХ-ВЭЖХ: эксклюзионная хроматография - высокоэффективная жидкостная хроматография

КЭ-ДСН: капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия

КЗЭ: капиллярный зональный электрофорез

п/к: подкожная инъекция

в/в: внутривенная инъекция

ФК: фармакокинетика

ХС-ЛПНП: холестерин липопротеинов низкой плотности

Пример 1. Приготовление жидкого препарата, содержащей анти-PCSK9 антитело (препарат А - исследуемый препарат)

Жидкий препарат, содержащий анти-PCSK9 антитело в концентрации 150 мг/мл, готовили в соответствии с составом А.

Состав А

Анти-PCSK9 антитело (ADI-10087)	150 мг/мл
Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	90 ммоль/л
Сорбит	3% (масс./об.)
Полисорбат-80	0,3 г/л
рН	5,5

Анти-PCSK9 антитело (ADI-10087), описанное в заявке на патент PCT/CN 2017/118050, добавляли в центрифужную пробирку для ультрафильтрации (порог отсечения по молекулярной массе: 30 кДа); после концентрирования путем центрифугирования анти-PCSK9 антитело разводили водным раствором состава А без полисорбата-80 и анти-PCSK9 антитела (гистидин 1,5 г/л, аргинин 90 ммоль/л, сорбит 3%, рН 5,5) и концентрировали; эту процедуру повторяли до полного замещения растворителя. Концентрацию белка в растворе после замещения растворителя доводили до 150 мг/мл. Затем добавляли водный раствор полисорбата-80 (30 г/л; 1/100 по объему), чтобы скорректировать конечную концентрацию полисорбата-80 до 0,3 г/л. После фильтрации в асептических условиях полуготовый продукт разливали по флаконам, которые затем закрывали резиновыми пробками и алюминиево-пластиковыми колпачками, и получали готовый продукт.

Пример 2. Приготовления препарата сравнения (препарата В), представляющего собой жидкий препарат, содержащий анти-PCSK9 антитело

Препарат сравнения (пример): препарат, содержащий анти-PCSK9 антитело в жидкости с концентрацией 150 мг/мл, приготовленной в соответствии с составом В.

Состав В

Анти-PCSK9 антитело (ADI-10087)	150 мг/мл
Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	180 ммоль/л
Полисорбат-80	0,3 г/л
рН	5,5

Анти-PCSK9 антитело (ADI-10087), описанное в заявке на патент PCT/CN 2017/118050, добавляли в центрифужную пробирку для ультрафильтрации (порог отсечения по молекулярной массе: 30 кДа); после концентрирования путем центрифугирования анти-PCSK9 антитело разводили водным раствором состава В без полисорбата-80 и анти-PCSK9 антитела (гистидин 1,5 г/л, аргинин 180 ммоль/л, рН 5,5) и концентрировали; эту процедуру повторяли до полного замещения растворителя. Концентрацию белка в растворе после замещения растворителя доводили до 150 мг/мл. Затем добавляли водный раствор полисорбата-80 (30 г/л; 1/100 по объему), чтобы скорректировать конечную концентрацию полисорбата-80 до 0,3 г/л. После фильтрации в асептических условиях полуготовый продукт разливали по флаконам, которые затем закрывали резиновыми пробками и алюминиево-пластиковыми колпачками, и получали готовый продукт.

Пример 3. Измерение вязкости жидкого препарата, содержащего анти-PCSK9 антитело

Вязкость измеряли вискозиметром с конусом и плоскостью (Brookfield, САР1000+/2000+. Подробности см. на сайте http://www.sinoinstrument.com/product_details-4-83-401-60.html) при комнатной температуре от 20°С до 25°С. Были выбраны следующие ротор и скорость вращения (ротор: ср-40, скорость вращения: 25 об/мин). Добавляли образцы после закрепления ротора с помощью соединительной гайки и коррекции положения. Чтобы начать измерение вязкости образцов, нажимали кнопку Run (Пуск). Согласно указанным выше условиям эксперимента, вязкость препарата А составила 5,2 сантипуаза, а препарата В - 6,0 сантипуаз. Неожиданно оказалось, что вязкость препарата А заметно ниже вязкости препарата В, из чего следует, что комбинация аргинина и сорбита более предпочтительна для снижения вязкости препарата с высокой концентрацией антитела.

Пример 4. Изменение чистоты белка в жидком препарате, содержащем анти-PCSK9 антитело

С целью изучения стабильности препарата А и препарата В было проведено ускоренное исследование стабильности. Стабильность препарата А и препарата В, разлитых по закрытым крышкой и укупоренным флаконам, изучали в ускоренном исследовании стабильности при температуре 40°С ± 2°С/60% ОВВ ± 5% ОВВ в течение 2 месяцев. Одновременно методами ЭХ-ВЭЖХ и КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях определяли изменение чистоты белка, как показано ниже.

ЭХ-ВЭЖХ:

Образец разводили до концентрации 2 мг/мл; использовали колонку для эксклюзионной хроматографии с гидрофильным силикагелем TSKG 3000 SWxl; количество введенного белка составляло 100 мкг; использовали подвижные фазы 20 ммоль/л Na₂HPO₄•12 Н₂О; 150 ммоль/л NaCl и 200 ммоль/л аргинина; рН составляла 6,8; скорость потока - 0,5 мл/мин, длина волны детектирования - 280 нм; температура колонки - 25°С; и для расчета использовали метод нормализации площадей.

КЭ-ДСН:

Отбирали 100 мкг образца и добавляли его к буферу для образца (рН 7,0) до получения общего объема 95 мкл. Для получения восстановленного образца добавляли 5 мкл β-меркаптоэтанола, а затем добавляли невосстановленный образец с 5 мкл NEM с концентрацией 250 ммоль/л. После смешивания смесь нагревали при 70°С в течение 10 мин и проводили выявление.

На основании процентного уменьшения площади основного пика ЭХ, полученной при ЭХ-ВЭЖХ, установили, что изменения чистоты белка в препарате А через 1 месяц проявились в снижении на 2,6%, а через 2 месяца - на 3,7%; в препарате В через 1 месяц проявились в снижении на 4,1%, а через 2 месяца- на 7,0%. На основании процентного уменьшения интенсивности полос при КЭ-ДСН в невосстанавливающих условиях установили, что изменения чистоты белка в препарате А через 2 недели проявились в снижении на 0,4%, а через 1 месяц - на 2,0%; в препарате В через 2 недели проявились в снижении на 2,5%, а через 1 месяц - на 7,3%. Можно видеть, что скорость изменения чистоты в препарате А заметно ниже, чем в препарате В. То есть стабильность препарата А выше, чем стабильность препарата В.

Пример 5. Анализ гетерогенности заряда в жидком препарате, содержащем анти-PCSK9 антитело

Для анализа гетерогенности заряда в разные моменты времени отбирали образцы препарата А и препарата В, взятые в ускоренное исследование стабильности (пример 4). Использовали непокрытые капилляры Beckman и аппарат для капиллярного электрофореза Beckman РА800 plus; давление введения составляло 0,5 фунтов на кв. дюйм, время отбора пробы - 10,0 с, напряжение разделения - 30 кВ, и время анализа - 30 мин. Для расчета площади пиков кислотных компонентов, площади пиков основных компонентов и площади основного пика в процентах от общей площади пиков использовали метод нормализации площадей. По результатам КЗЭ в препарате А основной пик через 2 недели снизился на 0%, а через 1 месяц - на 2,9%. По результатам КЗЭ в препарате В основной пик через 2 недели снизился на 2,0%, а через 1 месяц - на 7,6%.

Можно видеть, что скорость изменения гетерогенности заряда в препарате А существенно ниже, чем к препарате В, то есть комбинация аргинина и сорбита позволяет уменьшить скорость изменения гетерогенности заряда в препарате.

Пример 6. Препарат плацебо (контрольный препарат)

Плацебо без антитела готовили в соответствии с составом С с использованием воды в качестве растворителя.

Состав С

Гистидин	1,5 г/л
Аргинин	90 ммоль/л
Сорбит	3% (масс./об.)
Полисорбат-80	0,3 г/л
рН	5,5

Пример 7. Определение параметров фармакокинетики в образцах крови и метод анализа ADI-10087

(1) Метод определения ФК-параметров по общему ADI-10087: ФК-параметры по общему ADI-10087 выявляли методом количественного электрохемилюминесцентного определения общего ADI-10087 в человеческой сыворотке. Лунки планшета MSD покрывали нейтрализующим антителом к ADI-10087, затем добавляли подкисленный образец сыворотки, содержащий нейтрализованное ADI-10087, и проводили выявление с использованием поликлонального антитела против ADI-10087, меченного рутением. Меченное рутением поликлональное антитело против ADI-10087 образовывало иммунный комплекс с лекарственным препаратом и нейтрализующим антителом к ADI-10087, нанесенном на планшет. После инкубации в течение необходимого времени планшет промывали, добавляли буфер для считывания и помещали планшет в устройство MSD для считывания; сигналы люминесценции генерировались в ходе электрокаталитической реакции хемилюминесценции. Интенсивность сигналов хемилюминесценции была пропорциональна содержанию ADI-10087 в образце.

(2) Метод определения ФК-параметров по свободному ADI-10087: в соответствии с принципом метода ELISA лунки микропланшета покрывали нейтрализующим антителом к ADI-10087 и фиксировали его, затем добавляли в них образцы сыворотки; ADI-10087 из образцов сыворотки специфически связывалось с нанесенным антигеном, затем добавляли меченое биотином нейтрализующее антитело к ADI-10087 для захвата и, наконец, в лунки вносили SA-HRP (пероксидаза хрена, меченная стрептавидином) для выявления. После этого добавляли субстрат ТМВ (тетраметилбензидин) фермента пероксидазы (HRP), интенсивность окраски субстрата ТМВ была пропорциональна содержанию свободного ADI-10087; и концентрацию моноклонального антитела ADI-10087 в клинических образцах сыворотки определяли по значениям оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм или 620 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Пример 8. Метод выявления антитела ADI-10087 против PCSK-9

В соответствии с принципом метода ELISA лунки микропланшета покрывали антителом ADI-10087 и фиксировали его, затем добавляли в них образцы сыворотки; PCSK-9 из образцов сыворотки специфически связывалась с нанесенным ADI-10087, затем добавляли козье поликлональное антитело против человеческой PCSK-9 и, наконец, добавляли конъюгат козьего IgG с HRP для выявления. После этого добавляли субстрат ТМВ фермента HRP, интенсивность окраски субстрата ТМВ была пропорциональна содержанию PCSK-9; и концентрацию PCSK-9 в клинических образцах сыворотки определяли по значениям оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм или 620 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Пример 9. Метод выявления антител к лекарственному препарату ADI-10087

Антитела к лекарственному препарату (АЛП), то есть к ADI-10087, в человеческой сыворотке выявляли методом полуколичественной электрохемилюминесценции. Образец человеческой сыворотки подвергали ацидолизу, после чего захватывали свободные АЛП нанесенным на лунки микропланшета антителом ADI-10087, вновь проводили ацидолиз, элюированные АЛП смешивали с ADI-10087, меченным биотином и рутением, для инкубирования с образованием иммунного комплекса, который фиксировали в лунках планшета MSD, покрытых стрептавидином. После инкубации в течение необходимого времени планшет промывали, добавляли буфер для считывания и помещали планшет в устройство MSD для считывания; сигналы люминесценции генерировались в ходе электрокаталитической реакции хемилюминесценции. Интенсивность сигналов хемилюминесценции находилась в положительной корреляции с содержанием АЛП в образце.

Пример 10. Метод выявления нейтрализующих антител к ADI-10087

В образцах, определенных как положительные по АЛП, определяли присутствие нейтрализующих антител (нАт) к ADI-10087 методом электрохемилюминесценции. Образец человеческой сыворотки подвергали ацидолизу, свободные нАт захватывали антителом ADI-10087, нанесенным на лунки микропланшета, вновь проводили ацидолиз, элюированные нАт смешивали с ADI-10087, меченным рутением, и инкубировали с образованием иммунного комплекса, который затем добавляли в лунки планшета MSD, на которых предварительно была нанесена PCSK-9, меченная биотином, для инкубации со стрептавидином. Свободное лекарственное вещество, меченное рутением, в анализируемом растворе связывалось с меченной биотином PCSK-9, предварительно нанесенной на планшет. После инкубации в течение необходимого времени планшет промывали, добавляли буфер для считывания и помещали планшет в устройство MSD для считывания; сигналы люминесценции генерировались в ходе электрокаталитической реакции хемилюминесценции. Интенсивность сигналов хемилюминесценции находилась в отрицательной корреляции с содержанием нАт в образце.

Пример 11. Оценка безопасности и переносимости у здоровых взрослых субъектов китайского происхождения, которые получили однократное введение ADI-10087

Дизайн исследования:

58 субъектов будут разбиты на 8 когорт с увеличивающимися дозами (25 мг п/к, 75 мг п/к, 75 мг в/в, 150 мг п/к, 300 мг п/к, 450 мг п/к, 450 мг в/в и 600 мг п/к). Когорта 25 мг п/к включает 2 субъекта, которые будут получать однократное введение ADI-10087. И эти 2 субъекта, после оценки безопасности в течение 14 дней, будут включены в клинические исследования с последующими дозовыми когортами. Каждая из последующих когорт (от 75 мг п/к до 600 мг п/к) включает 8 субъектов, причем первые 2 субъекта из когорты 75 мг п/к будут включены в открытое исследование, получая ADI-10087 в дозе 75 мг п/к, а последние 6 субъектов будут получать случайным образом в соотношении 2:1 либо ADI-10087 (N=4), либо плацебо (N=2). В остальных 6 когортах субъекты будут получать случайным образом в соотношении 3:1 однократное введение либо ADI-10087 (N=6), либо плацебо (N=2).

2 субъекта из когорты 25 мг п/к могут включать в когорту 75 мг п/к по прошествии 14 дней после инъекции, предусмотренных для оценки безопасности. Всех субъектов из когорты 75 мг п/к могут включать в когорту 150 мг п/к по прошествии 14 дней после инъекции, предусмотренных для оценки безопасности. В когорту 150 мг п/к могут включать субъектов из когорты 75 мг в/в после включения. Всех субъектов из когорты 150 мг п/к могут включать в когорту 300 мг п/к по прошествии 14 дней, предусмотренных для оценки безопасности. Всех субъектов из когорты 300 мг п/к могут включать в когорту 450 мг п/к по прошествии 14 дней после инъекции, предусмотренных для оценки безопасности. Всех субъектов из когорты 450 мг п/к могут включать в когорту 600 мг п/к по прошествии 14 дней после инъекции, предусмотренных для оценки безопасности. В когорту 600 мг п/к могут включать субъектов из когорты 450 мг в/в после включения.

За каждым субъектом будут наблюдать до дня 85 (12 недель) для оценки безопасности, переносимости, ФК/ФД и иммуногенности лекарственного препарата.

Демографические характеристики субъектов

В выборке для анализа безопасности (SS), которая включает 5 8 субъектов, 44 (75,9%) являются мужчинами; средний возраст составляет 30,1±5,74 лет с минимальным возрастом 19 лет и максимальным возрастом 44 года; средняя масса тела составляет 67,20±9,419 кг с минимальной массой тела 50,9 кг и максимальной массой тела 92,4 кг; средний рост составляет 169,12±7,468 см с минимальным ростом 151,0 см и максимальным ростом 186,0 см; средний ИМТ составляет 23,44±2,309 кг/м² с минимальным ИМТ 19,3 кг/м² и максимальным ИМТ 27,4 кг/м²; 57 пациентов (98,3%) принадлежат к ханьской национальности. Из 44 субъектов в группе ADI-10087, 43 (97,7%) субъекта являются ханьской национальности, их средний возраст составляет 30,3±5,71 лет, средний рост - 168,36±6,992 см, средняя масса тела - 66,17±8,289 кг, а средний ИМТ - 23,31±2,175 кг/м². Из 14 субъектов в группе плацебо, 14 (100%) субъектов являются ханьской национальности, их средний возраст составляет 29,8±6,03 лет, средний рост - 171,50±8,716 см, средняя масса тела - 70,43±12,122 кг, а средний ИМТ - 23,82±2,741 кг/м². Демографические характеристики субъектов находятся в согласии с критериями включения в исследование; и в обеих группах демографические характеристики были сходными.

Лекарственный препарат, применявшийся в исследовании

Исследуемым препаратом, применявшемся в исследовании, был препарат, приготовленный как описано в примере 1; контрольным препаратом, применявшимся в исследовании, было плацебо, приготовленное как описано в примере 6.

Схемы введения

Всем субъектам каждой из когорт 18 вводили ADI-10087 или плацебо в однократной дозе 25 мг п/к, 75 мг п/к, 75 мг в/в, 150 мг п/к, 300 мг п/к, 450 мг п/к, 450 мг в/в или 600 мг п/к.

Техника подкожной (п/к) инъекции: субъекты получали подкожные инъекции исследуемого препарата или плацебо в живот. Исследователи выполняли инъекции в живот в виде однократного введения подкожной дозы 1 мл с помощью иглы, что соответствует фактически объему инъекции исследуемого препарата. Для проведения инъекции субъектам из групп 25 мг и 75 мг жидкий препарат отбирали с помощью шприца на 1 мл (игла для 2 мл), и затем, после удаления воздуха, делали инъекцию 1 мл через иглу. Для проведения инъекции субъектам из группы 150 мг и из групп с дозой более 150 мг жидкий препарат отбирали с помощью шприца на 2 мл (игла для 2 мл), и затем, после удаления воздуха, делали инъекцию 1 мл через иглу.

Техника внутривенного (в/в) введения:

(1) Группа75 мгв/в: отбирали 150 мг исследуемого препарата для инъекции (1 мл) и добавляли его в мешок для внутривенной инфузии, содержащий отмеченные 100 мл стерильного 0,9% хлорида натрия. Объем раствора для внутривенного введения составлял 50 мл, а время введения составляло 30 минут.

(2) Группа 450 мг в/в: отбирали 900 мг исследуемого препарата для инъекции (1 мл) и добавляли его в мешок для внутривенной инфузии, содержащий отмеченные 200 мл стерильного 0,9% хлорида натрия. Объем раствора для внутривенного введения составлял 100 мл, а время введения составляло 1 час.

Нежелательные явления

Все нежелательные явления (НЯ), возникавшие в ходе описанного выше исследования, регистрировали, и для кодирования нежелательных явлений использовали принятые в словаре MedDRA (версии 21.0) системно-органные классы (СОК) и предпочтительные термины (ПТ). Нежелательные явления, связанные с препаратом, относят к одной из трех категорий: «связь несомненна», «связь возможна» и «не подлежит оценке». Если соответствующие данные отсутствуют, нежелательное явление будет считаться связанным с препаратом.

НЯ представляли и классифицировали по исследуемым группам в соответствии с СОК и ПТ. Результаты будут представлены в порядке убывания частоты возникновения явлений как в разных СОК, так и внутри одного СОК. В сводной таблице НЯ частота возникновения НЯ рассчитана исходя из числа субъектов, у которых отмечены НЯ, а не из числа отмеченных НЯ. При расчете числа и процента субъектов НЯ учитывается только один раз, если одно и то же НЯ возникало несколько раз у одного и того же субъекта.

НЯ, возникающее в периоде скрининга, - это НЯ, возникающее до первого введения исследуемого препарата. Нежелательные явления на фоне терапии (НЯФТ), определяются как НЯ, которые возникают или усугубляются в течение 12 недель (включая день 85) от первого введения исследуемого препарата до последнего введения исследуемого препарата. Стадии развития НЯ, которые невозможно установить по причине недостатка времени для проявления, относят к категории НЯФТ.

В таблице 1 показана классификация и обобщение СОК и ПТ нежелательных явлений (НЯФТ) на фоне терапии, связанных с лекарственным препаратом.

В группе ADI-10087 частота возникновения нежелательных явлений на фоне терапии составляет 52,3%, а частота возникновения нежелательных явлений на фоне терапии, связанных с лекарственным препаратом, составляет 38,6%; в группе плацебо частота возникновения нежелательных явлений на фоне терапии составляет 57,1%, а частота возникновения нежелательных явлений на фоне терапии, связанных с лекарственным препаратом, составляет 50,0%. По меньшей мере одно нежелательное явление, представляющее интерес (явление со стороны печени, явление со стороны мышц, аллергическая реакция и реакция в месте инъекции), в группах ADI-10087 и плацебо было отмечено у 13,6% и 28,6% субъектов соответственно; тяжелых нежелательных явлений, тяжелых нежелательных явлений, связанных с лекарственным препаратом, нежелательных явлений, требовавших исключения из исследования, и нежелательных явлений, приведших к смерти, отмечено не было. Наиболее частыми нежелательными явлениями на фоне терапии, связанными с лекарственным препаратом, в группе ADI-10087 были инфекция верхних дыхательных путей (20,5%) и повышение активности креатинфосфокиназы в крови (6,8%); наиболее частым нежелательным явлением на фоне терапии, связанным с лекарственным препаратом, в группе плацебо была инфекция верхних дыхательных путей (14,3%).

Нежелательные явления, связанные с лекарственным препаратом, в группе ADI-10087 были легкой или умеренной степени тяжести, не требовали специфического лечения и улучшались после корректирующего лечения. В частности, в группе, получавшей препарат в дозе до 450 мг п/к, никаких нежелательных явлений отмечено не было.

Оценка иммуногенности

Иммуногенность оценивали на основе выборки для анализа иммуногенности (IS); при этом оценивали такие параметры, как количество антител к ADI-10087 (АЛП) и количество нейтрализующих антител (нАт). Для каждой группы определяли долю субъектов, у которых вырабатывались антитела к ADI-10087 и нейтрализующие антитела (нАт); и также представляли список субъектов, которые были положительными на антитела к ADI-10087 (АЛП) / нейтрализующие антитела (нАт).

Выработку антител к лекарственному препарату (АЛП) и нейтрализующих антител (нАт) в сыворотке определяли с помощью анализа иммуногенности. (1) Моменты времени отбора образцов для обнаружения антител к лекарственному препарату и нейтрализующих антител:

1 час до введения; 336 часов (день 15), 672 часа (день 29), 1344 часа (день 57), 2016 часов (день 85) после введения.

Моменты времени отбора образцов крови для анализа иммуногенности: в течение 1 часа до введения; 336 часов (±12 ч) (день 15), 672 часа (±24 ч) (день 29), 1344 часа (±48 ч) (день 57), 2016 часов (±48 ч) (день 85) после введения.

Ни у одного субъекта после введения препарата антител к ADI-10087 (АЛП) обнаружено не было; исключение составлял 1 субъект (1,7%) из группы плацебо, который был положительным по АЛП на начальной этапе до введения. Нейтрализующих антител (нАт) у этого субъекта обнаружено не было. Таким образом, ни в группе ADI-10087, ни в группе плацебо АЛП или нАт после введения препарата не было положительных результатов, что говорит о надлежащей безопасности препарата.

Пример 12. Оценка фармакокинетики у здоровых взрослых субъектов китайского происхождения, которые получили однократное введение ADI-10087

В исследовании, описанном выше в примере 11, образцы крови для анализа ФК собирали в следующие моменты времени:

1 час перед введением; 4 часа после введения; 24 часа (день 2), 48 часов (день 3), 72 часа (день 4), 96 часов (день 5), 144 часа (день 7), 168 часов (день 8), 240 часов (день 11), 336 часов (день 15), 504 часа (день 22), 672 часа (день 29), 840 часов (день 36), 1008 часов (день 43), 1344 часа (день 57), 1680 часов (день 71), 2016 часов (день 85) после введения инъекции.

Фармакокинетические параметры для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087 рассчитывали для фактических моментов времени отбора крови с использованием метода некомпартментного анализа (NCA) и с использованием программного обеспечения WinNonlin Professional, включая T_max, C_max, AUC, V, t_1/2 и CL, что позволяет полностью описать характеристики распределения и выведения лекарственного препарата из человеческого организма, и основные параметры показаны в таблицах 2 и 3 ниже.

Кривые «средняя общая концентрация- время» для ADI-10087 после введения ADI-10087 субъектам из каждой дозовой группы показаны на ФИГ. 2, а кривые «средняя свободная концентрация - время» для ADI-10087 для каждой дозовой группы показаны на ФИГ. 1.

Оценки фармакокинетических параметров были основаны на выборке для оценки фармакокинетической концентрации (PKCS), которая проанализирована по данным 44 субъектов. После однократной подкожной инъекции в живот препарата ADI-10087 в дозе 25-600 мг средний кажущийся объем распределения (V_z/F) общего ADI-10087 составлял около 3,2-7,4 л, средний кажущийся клиренс (CL/F) составлял около 13,0-40,2 мл/ч, и средний период полувыведения (t_1/2) составлял около 5-7 суток; среднее значение V_z/F для свободного ADI-10087 составляло около 4,0-8,6 л, среднее значение CL/F составляло 17,4-74,6 мл/ч, и среднее значение t_1/2 составляло около 3-7 суток. По мере увеличения дозы Vz/F и CL/F непрерывно снижались, a t_1/2 постепенно увеличивался.

После однократной подкожной инъекции в живот препарата ADI-10087 в дозе 25-600 мг значение T_max для общего ADI-10087 в сыворотке составляло около 3-6 суток, и значение T_max для свободного ADI-10087 в сыворотке составляло около 2,5-10 суток. Следует отметить, что в случае инъекции в живот ADI-10087 всасывается в кровоток не сразу; при этом по мере увеличения дозы время достижения максимальной концентрации накопления увеличивается.

В диапазоне доз однократного введения ADI-10087 в дозах 25-600 мг C_max, увеличение значений AUC_0-last и AUC_0-∞ для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087 происходило сильнее, чем пропорциональное увеличение с дозой, и демонстрировало нелинейную кинетическую зависимость.

После однократного внутривенного введения в дозе 75 мг и 450 мг среднее значение V_z для общего ADI-10087 составляло около 2,6 л и 2,1 л соответственно; среднее значение V_ssсоставляло около 3,0 л и 4,3 л соответственно; среднее значение CL составляло около 17,3 мл/ч и 9,81 мл/ч соответственно; и среднее значение t_1/2 составляло около 4 суток и 6 суток соответственно; среднее значение V_z для свободного ADI-10087 составляло около 2,3 л и 2,1 л соответственно; среднее значение V_ss составляло около 2,5 л и 3,0 л соответственно; среднее значение CL составляло около 24,1 мл/ч и 9,41 мл/ч соответственно; среднее значение t_1/2 составляло около 3 суток и 7 суток соответственно. По мере увеличения дозы значение CL также снижалось, a t_1/2 увеличивалось. Абсолютная биодоступность ADI-10087 после его подкожной инъекции в живот составляла около 58% (в расчете на общий ADI-10087) в диапазоне доз 75-450 мг.

В таблице 4 приведены соответствующие среднегеометрические значения AUC_0-∞ для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087 после введения препарата в дозе 75 мг и 450 мг подкожной инъекцией в живот или внутривенным капельным введением, а также соответствующие оценки абсолютной биодоступности в случае подкожного введения.

Можно видеть, что при оценке расчете на общий ADI-10087 его абсолютная биодоступность в случае подкожного введения здоровым субъектам препарата в дозах 75 мг и 450 мг была около одинаковой и составляла 57,8% и 57,5% соответственно, что указывает на то, что абсолютная биодоступность в случае подкожного введения в диапазоне доз 75-450 мг существенно не меняется.

При оценке в расчете на свободный ADI-10087 абсолютная биодоступность в случае подкожного введения здоровым субъектам препарата в дозах 75 мг и 450 мг составляла 33,8% и 49,2% соответственно, что несколько ниже, чем результат оценки для общего ADI-10087.

Для анализа корреляции между ФК-параметрами (C_max, AUC_0-last и AUC_0-∞) и дозой в случае подкожных инъекций препарата в живот в дозах 25-600 мг использовали графический метод.

На ФИГ. 3-5, соответственно, показаны диаграммы рассеяния значений C_max, AUC_0-last и AUC_0-inf для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087, которые изменялись с дозами, после подкожной инъекции в живот в дозах 25-600 мг здоровым субъектам. Результаты показывают, что в диапазоне доз 25-600 мг C_max и AUC для общего ADI-10087 и свободного ADI-10087 увеличивались с увеличением дозы, причем степень увеличения была выше, чем пропорциональное увеличение дозы, и ADI-10087 демонстрирует нелинейную кинетическую зависимость. Например, среднее значение C_max для общего ADI-10087 увеличивалось в соотношении примерно 1:3,4:8,0:13:22:29, а среднее значение AUC_0-last увеличивалось в соотношении примерно 1:4,2:11:26:46:82 относительно кратности увеличения дозы 25-600 мг (1:3:6:12:18:24). В группе, получавшей 25 мг, ФК-параметры для свободного ADI-10087 определить не удалось по причине низкой концентрации; в диапазоне доз 75 600 мг (кратность доз составляла 1:2:4:6:8) среднее значение C_max для свободного ADI-10087 увеличивалось в соотношении примерно 1:2,9:5,4:10:12, а среднее значение AUC_0-last увеличивалось в соотношении примерно 1:3,9:12:21:34.

Внутривенное капельное введение препарата выполняли только для двух доз - 75 мг и 450 мг. В случае 6-кратного увеличения дозы для внутривенного капельного введения средние значения C_max и AUC_0-last для общего ADI-10087 увеличивались в 4,6 и 11 раз соответственно; при этом средние значения C_max и AUC_0-last для свободного ADI-10087 увеличивались в 6,1 и 17 раз соответственно.

Пример 13. Оценка фармакодинамики у здоровых взрослых субъектов китайского происхождения, которые получили однократное введение ADI-10087

В исследовании, описанном в примере 11 выше, образцы крови отбирали в следующие моменты времени: 1 час перед введением; 4 часа после введения; 24 часа (день 2), 48 часов (день 3), 72 часа (день 4), 96 часов (день 5), 144 часа (день 7), 168 часов (день 8), 240 часов (день 11), 336 часов (день 15), 504 часа (день 22), 672 часа (день 29), 840 часов (день 36), 1008 часов (день 43), 1344 часа (день 57), 1680 часов (день 71), 2016 часов (день 85) после введения инъекции. Уровни PCSK-9, ХС-ЛПНП, общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП), липопротеина (a) (Lp(a)), холестерина липопротеинов очень низкой плотности (ХС-ЛПОНП), холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности (ХС-не-ЛПВП), аполипопротеина А1 (ApoA1), аполипопротеина В (АроВ) и подобные параметры определяли согласно методам, описанным в этом документе или хорошо известным в данной области; и строили графики с результатами.

(1) Изменение концентрации свободной PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня

В центральной лаборатории в заранее заданные моменты времени будут отбирать образцы крови для исследования концентраций свободной PCSK-9 в сыворотке. Фармакодинамическую оценку будут выполнять на основе выборки для анализа фармакодинамики (PDS); полученные значения для каждого момента времени и скорость изменения (%) концентрации свободной PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня будут представлены в виде сводных таблиц и списков. За исходный уровень принимали значение наблюдаемой концентрации PCSK-9 до введения препарата. Скорость изменения (%) относительно исходного уровня = 100×(значение наблюдаемой концентрации после введения значение исходной концентрации)/значение исходной концентрации. Индивидуальные концентрации свободной PCSK-9 в сыворотке, средние значения концентрации PCSK-9 для каждой дозовой группы и скорость изменения относительно исходного уровня будут представлены в виде графиков, изображающих кривые «концентрация - время» (включая график с линейными концентрациями и график с логарифмическими концентрациями), на основе данных дозовых групп.

Скорость изменения концентрации свободной PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня представлена на ФИГ. 6. Полученные результаты показывают, что: средняя продолжительность снижения концентрации PCSK-9 увеличивалась с увеличением дозы; через 24 после введения среднее максимальное снижение PCSK-9 в каждой группе составляло 90% 100%; через 2 недели после введения концентрация PCSK-9 снизилась в среднем на >70% в группе, получавшей 75 мг п/к ADI-10087, а также в группе, получавшей 150 мг, и в группах с более высокими дозами; через 4 недели после введения концентрация PCSK-9 снизилась в среднем на >60% в группе, получавшей 300 мг ADI-10087, в группах п/к введения с более высокими дозами и в группе в/в введения; через 6 недель после введения PCSK-9 снизилась в среднем на >80% в группе, получавшей 450 мг п/к ADI-10087, в группе, получавшей 450 мг в/в, и в группе, получавшей 600 мг п/к; через 8 недель после введения PCSK-9 снизилась в среднем на >50% в группе, получавшей 600 мг п/к ADI-10087.

(2) Средние изменения ХС-ЛПНП, рассчитанные методом наименьших квадратов, относительно исходного уровня

Для каждого момента времени оценки анализировали сравнение изменений концентрации ХС-ЛПНП в сыворотке относительно исходного уровня в каждой дозовой группе исследуемого препарата и в группе плацебо с использованием модели смешанных эффектов с множественными измерениями (MMRM), а результаты анализа включали средние изменения величин, рассчитанные методом наименьших квадратов, средние разности между группами, 95%-ные доверительные интервалы и Р-значения. Результаты анализа, основанного на этой модели, показали, что в течение одного месяца после введения Р-значения большинства дозовых групп исследуемого препарата по сравнению с группой плацебо составляли <0,05. По мере увеличения времени после введения Р-значения группы препарата с низкой дозой по сравнению с группой плацебо стало >0,05. Ко «дню 29» Р-значения для группы, получавшей 150 мг, и групп с более высокой дозой по сравнению с группой плацебо составили <0,05; ко «дню 57» Р-значения группы, получавшей только 450 мг, и групп с более высокой дозой по сравнению с группой плацебо составили <0,05; ко «дню 71» Р-значения для группы, получавшей 600 мг, по сравнению с группой плацебо составило <0,05; ко «дню 85» Р-значения любой из дозовых групп исследуемого препарата по сравнению с группой плацебо составили >0,05. Изменения ХС-ЛПНП, рассчитанные методом наименьших квадратов, относительно исходного уровня для каждого момента времени оценки для каждой дозовой группы показаны на ФИГ. 7.

(3) Средняя скорость изменения концентрации ХС-ЛПНП относительного исходного уровня

Средняя скорость изменения концентрации ХС-ЛПНП относительного исходного уровня показана на ФИГ. 8. Результаты демонстрируют, что продолжительность снижения концентрации ХС-ЛПНП в сыворотке зависела от дозы ADI-10087. Снижение ХС-ЛПНП, близкое к максимальному, впервые достигалось к дню 5. В день 15 снижение ХС-ЛПНП в каждой дозовой группе было близким к максимальному. Среднее максимальное снижение ХС-ЛПНП в каждой группе, получавшей подкожное введение ADI-10087, составляло 51,7%-72,1%. Через 7 дней после введения среднее снижение ХС-ЛПНП в группах, получавших 75 мг и 150 мг ADI-10087, составило >50%; среднее снижение ХС-ЛПНП в группе, получавшей 75 мг, составило >50% и сохранялось на этом уровне в течение 15 дней; а среднее снижение ХС-ЛПНП в группе, получавшей 150 мг, сохранялось в течение 22 дней. В день 11 после введения среднее снижение ХС-ЛПНП в группе, получавшей 300 мг ADI-10087, и в группах с более высокой дозой составило >50% и могло сохраняться на этом уровне по меньшей мере до дня 43 (неделя 6). На день 57 (8 недель) после введения среднее снижение ХС-ЛПНП в группе, получавшей 600 мг п/к ADI-10087, составило >50%. На день 71 (10 недель) среднее снижение ХС-ЛПНП в группе, получавшей 600 мг п/к ADI-10087, составило >30%.

При использовании эволокумаба в качестве контроля было показано, что максимальное снижение ХС-ЛПНП и продолжительность такого снижения в случае препарата ADI-10087 были > чем в случае эволокумаба в той же дозе.

(4) Площадь под кривой «уровень ХС-ЛПНП - время»

График зависимости «средняя концентрация ХС-ЛПНП - время» показан на ФИГ. 9.

Площадь под кривой «ХС-ЛПНП - время» рассчитывали с использованием метода трапеций. Площадь под кривой «ХС-ЛПНП - время» для досрочно выбывших субъектов также рассчитывали с использованием метода трапеций на основе данных о концентрации, полученных до выбывания. Для площади под кривой «уровень ХС-ЛПНП - время» среднегеометрическое значение для всех дозовых групп исследуемого препарата составило 3522,433, а геометрический коэффициент вариации составил 44,3; среднегеометрическое значение для всех групп плацебо составило 5609,877, а геометрический коэффициент вариации составил 20,1. Площадь под кривой для группы, получавшей 75 мг в/в, была выше, чем для других дозовых групп исследуемого препарата, среднегеометрическое значение составило 4709,056, а геометрический коэффициент вариации составил 18,0; площадь под кривой для группы, получавшей 450 мг в/в, была самой низкой, среднегеометрическое значение составило 1978,572, а геометрический коэффициент вариации составил 99,0.

(5) Скорость изменения концентрации общего холестерина (ОХ) относительно исходного уровня

Скорость изменения концентрации общего холестерина (ОХ) относительно исходного уровня показана на ФИГ. 10. Результаты демонстрируют, что: средняя продолжительность снижения общего холестерина увеличивалась с дозой. В группе, получавшей 75 мг ADI-10087, и в группах с более высокой дозой среднее значение максимального снижения общего холестерина находилось в диапазоне от 37,9% до 48,6%; что близко к максимальному значению, достигаемому через 11 дней после введения.

(6) Скорость изменения концентрации аполипопротеина В (АроВ) относительно исходного уровня

Скорость изменения концентрации аполипопротеина В (АроВ) относительно исходного уровня показана на ФИГ. 11. Результаты демонстрируют, что: средняя продолжительность снижения АроВ увеличивалась с дозой. В группе, получавшей 75 мг ADI-10087, и в группах с более высокой дозой среднее значение максимального снижения общего холестерина находилось в диапазоне от 52,1% до 62,8%; что близко к максимальному значению, достигаемому через 11 дней после введения.

(7) Скорость изменения концентрации холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности (ХС-не-ЛПВП), относительно исходного уровня

Скорость изменения концентрации холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности (ХС-не-ЛПВП), относительно исходного уровня показана на ФИГ. 12. Результаты демонстрируют, что: средняя продолжительность снижения ХС-не-ЛПВП увеличивалась с дозой. В группе, получавшей 75 мг ADI-10087, и в группах с более высокой дозой среднее значение максимального снижения общего холестерина находилось в диапазоне от 56,8% до 69,7%; что близко к максимальному значению, достигаемому через 11 дней после введения.

(8) Скорость изменения средней концентрации липопротеина (a) (Lp(a)) относительно исходного уровня

Скорость изменения средней концентрации липопротеина (a) (Lp(a)) относительно исходного уровня показана на ФИГ. 13. Через 7 дней после введения препарата Lp(a) в каждой из дозовых групп ADI-10087 снизился; и среднее значение максимального снижения в каждой группе находилось в диапазоне от 24,9% до 62,3%.

Пример 14. Оценка фармакокинетики ADI-10087 в случае введений его многократных повторяющихся доз в популяции китайских пациентов с гиперхолестеринемией

1. Отбор исследуемой популяции

Включенные в исследование субъекты должны удовлетворять одновременно всем критериям, перечисленным ниже:

(1) предоставление подписанного и датированного информированного согласия;

(2) мужчина или женщина в возрасте >18 и <70 лет на момент скрининга;

(3) ИМТ>18 кг/м² и <30 кг/м²;

(4) у субъекта диагностирована гиперлипидемия и он получал лечение статином в умеренной или более высокой дозе в течение по меньшей мере 4 недель (см. Guidelines for the Prevention and Treatment of Dyslipidemia in Chinese Adults 2016 - Руководство по профилактике и лечению дислипидемии у взрослых китайского происхождения);

(5) ХС-ЛПНП натощак >100 мг/дл (2,6 ммоль/л) и <220 мг/дл (5,7 ммоль/л) при скрининге;

(6) триглицериды натощак <400 мг/дл (4,5 ммоль/л) при скрининге; и

(7) желание сотрудничать с тем, чтобы пройти все этапы исследования и получить исследуемую терапию в полном объеме.

2. Дизайн исследования

В общей сложности 60 пациентов, отвечавших критериям включения, прошли случайный отбор и были поровну распределены по следующим дозовым группам, получавшим разные дозы, которым вводили в разные моменты времени: 1 подкожную инъекцию ADI-10087 в дозе 75 мг или 140 мг, либо инъекцию плацебо каждые 2 недели; 1 подкожную инъекцию ADI-10087 в дозе 300 мг или 420 мг, либо инъекцию плацебо каждые 4 недели; или 1 подкожную инъекцию ADI-10087 в дозе 450 мг или 600 мг, либо инъекцию плацебо каждые 6 недель. Для каждой дозы пациентов рандомизировали по когортам ADI-10087 и плацебо в соотношении 4:1. Терапию продолжали в течение 12 недель, после чего приступали к анализу результатов.

3. Лекарственные препараты, применявшиеся в исследовании

4. Схемы введения

Подкожная инъекция исследуемого препарата или плацебо в живот

5. Сбор и обработка образцов

Моменты времени отбора образцов для анализа ФК/ФД (PCSK9)

• Схемы введения для групп, получавших 75 мг р/2 нед и 140 мг р/2 нед:

1^-е введение: до введения (в течение 1 ч); 4 ч (±10 мин), 24 ч (±1 ч) (день 1), 48 ч (±2 ч) (день 2), 72 ч (±3 ч) (день 3), 96 ч (±4 ч) (день 4), 144 ч (±6 ч) (день 6), 168 ч (±6 ч) (день 7), 240 ч (±12 ч) (день 10) и 288 ч (±12 ч) (день 12) после введения;

2^-е/3^-е/4^-е/5^-е введение: до введения (в течение 1 ч);

6^-е введение: до введения (в течение 1 ч); 4 ч (±10 мин), 24 ч (±1 ч) (день 1), 48 ч (±2 ч) (день 2), 72 ч (±3 ч) (день 3), 96 ч (±4 ч) (день 4), 144 ч (±6 ч) (день 6), 168 ч (±6 ч) (день 7), 240 ч (±12 ч) (день 10), 288 ч (±12 ч) (день 12) и 336 ч (±12 ч) (день 14) после введения;

образцы крови для анализа ФК/ФД (PCSK9) отбирали на визите досрочного завершения, если субъект не мог завершить исследование в полном объеме и выбывал из него раньше срока;

1 образец крови для анализа ФК/ФД (PCSK9) отбирали на последующем визите определения безопасности.

• Схемы введения для групп, получавших 300 мг р/4 нед и 420 мг р/4 нед:

1^-е введение: до введения (в течение 1 ч); 4 ч (±10 мин), 24 ч (±1 ч) (день 1), 48 ч (±2 ч) (день 2), 72 ч (±3 ч) (день 3), 96 ч (±4 ч) (день 4), 144 ч (±6 ч) (день 6), 168 ч (±6 ч) (день 7), 240 ч (±12 ч) (день 10), 336 ч (±12 ч) (день 14) и 504 ч (±24 ч) (день 21) после введения;

2^-е введение: до введения (в течение 1 ч);

3^-е введение: до введения (в течение 1 ч); 4 ч (±10 мин), 24 ч (±1 ч) (день 1), 48 ч (±2 ч) (день 2), 72 ч (±3 ч) (день 3), 96 ч (±4 ч) (день 4), 144 ч (±6 ч) (день 6), 168 ч (±6 ч) (день 7), 240 ч (±12 ч) (день 10), 336 ч (±12 ч) (день 14), 504 ч (±24 ч) (день 21) и 672 ч (±24 ч) (день 28) после введения;

образцы крови для анализа ФК/ФД отбирали на визите досрочного завершения, если субъект не мог завершить исследование в полном объеме и выбывал из него раньше срока;

1 образец крови для анализа ФК/ФД отбирали на последующем визите определения безопасности.

Схемы введения для групп, получавших 450 мг р/6 нед и 600 мг р/6 нед:

1^-е введение: до введения (в течение 1 ч); 4 ч (±10 мин), 24 ч (±1 ч) (день 1), 48 ч (±2 ч) (день 2), 72 ч (±3 ч) (день 3), 96 ч (±4 ч) (день 4), 144 ч (±6 ч) (день 6), 168 ч (±6 ч) (день 7), 240 ч (±12 ч) (день 10), 336 ч (±12 ч) (день 14), 504 ч (±24 ч) (день 21), 672 ч (±24 ч) (день 28) и 840 ч (±24 ч) (день 35) после введения;

2^-е введение: до введения (в течение 1 ч); 4 ч (±10 мин), 24 ч (±1 ч) (день 1), 48 ч (±2 ч) (день 2), 72 ч (±3 ч) (день 3), 96 ч (±4 ч) (день 4), 144 ч (±6 ч) (день 6), 168 ч (±6 ч) (день 7), 240 ч (±12 ч) (день 10), 336 ч (±12 ч) (день 14), 504 ч (±24 ч) (день 21), 672 ч (±24 ч) (день 28), 840 ч (±24 ч) (день 35) и 1008 ч (±48 ч) (день 42) после введения;

для дозовой группы 600 мг один образец крови для анализа ФК/ФД собирали через 1344 ч (+48 ч) (день 56) после 2-го введения.

Образцы крови для анализа ФК/ФД (PCSK9) анализировали в центральной лаборатории. Уровень липидов в крови в периоде скрининга анализировали в местной лаборатории, а начиная с исходного уровня после начала применения препарата- в центральной лаборатории.

Отбирали 5 мл цельной крови в пробирку для вакуумного отбора крови с прокоагулянтом, отделяли сыворотку, разделяли на аликвоты и замораживали для последующего анализа ФК/ФД (PCSK9).

Уровни липидов в крови определяли, как описано выше.

6. Результаты анализа фармакокннетики

Фармакокинетические параметры для концентрации свободного антитела ADI-10087 рассчитывали по фактическим моментам времени отбора крови с использованием некомпартментного анализа (NCA) и программного обеспечения Pkanalix 2019R2 (Lixoft, Antony, France).

В таблицах 5 и 6 показаны обобщенные результаты по средним значениям фармакокинетических параметров для каждой дозовой группы в случае первого введения и в случае введения после достижения стационарной концентрации ADI-10087 после нескольких подкожных инъекций ADI-10087 в различных дозах у пациентов с гиперхолестеринемией.

В диапазоне доз первая доза 75-600 мг ADI-10087 давала увеличение значений C_max и AUC_0-inf ADI-10087 сильнее, чем пропорциональное увеличение с дозой, и демонстрировала нелинейную кинетическую зависимость.

В исследовании ФК цикла 1 и цикла достижения стационарного состояния, медиана времени достижения максимальной концентрации (T_max) ADI-10087 в плазме после подкожной инъекции в живот препарата ADI-10087 в дозе 75-600 мг составляла 70,7-239 ч (2,9-10 суток); после введения для достижения стационарного состояния после инъекции ADI-10087 в дозе 75 600 мг подкожно в живот, медиана времени достижения максимальной концентрации (T_max) ADI-10087 составляла 95,1 155 ч (3,96-6,46 суток). Эти результаты показывают, что в случае инъекции в живот ADI-10087 всасывается в кровоток не сразу, и по мере увеличения дозы время достижения максимальной концентрации в плазме увеличивается.

После подкожной инъекции в живот препарата ADI-10087 в дозе 75-600 мг в цикле 1 среднее значение Vz/F ADI-10087 составляло около 5,14-33,4 л, среднее значение CL/F составляло около 0,0163-0,242 л/ч, а среднее значение t_1/2 составляло около 88,6-291 ч (3,69-12,1 суток); после подкожной инъекции в живот ADI-10087 в дозе 75 600 мг в цикле достижения стационарного состояния, среднее значение Vz/F ADI-10087 составляло около 5,13-12,2 л, среднее значение CL/F составляло около 0,0124-0,091 л/ч, а среднее значение t_1/2 составляло около 98,6-430 ч (4,10-17,9 суток). По мере увеличения дозы Vz/F и CL/F непрерывно снижались, t_1/2 постепенно увеличивался.

В случае введения лекарственного препарата с частотой раз в 2 недели средние коэффициенты накопления концентрации через 336 ч (С_{336 ч}) после введения ADI-10087 в группах, получавших дозы 75 мг и 140 мг многократными подкожными инъекциями, составляли 3,44 и 3,83 соответственно, а средние коэффициенты накопления AUC_{0-336 ч} составляли 3,20 и 3,64 соответственно;

в случае применения лекарственного препарата с частотой раз в 4 недели средние коэффициенты накопления концентрации через 672 ч (С_{672 ч}) после введения ADI-10087 в группах, получавших дозы 300 мг и 420 мг многократными подкожными инъекциями, составляли 2,03 и 1,47 соответственно, а средние коэффициенты накопления AUC_{0-672 ч} составляли 1,34 и 1,28 соответственно;

в случае применения лекарственного препарата с частотой раз в 6 недель средние коэффициенты накопления концентрации через 1008 ч (С_{1008 ч}) после введения ADI-10087 в группах, получавших дозы 450 мг и 600 мг многократными подкожными инъекциями, составляли 1,18 и 0,983 соответственно, а средние коэффициенты накопления AUC_{0-1008 ч} составляли 1,02 и 0,986. По мере увеличения дозы интервал в цикле введения увеличивался, а коэффициент накопления ADI-10087 снижался, о чем свидетельствуют данные, показанные в таблице 7.

Пример 15. Оценка фармакодинамики ADI-10087 в случае введений его многократных повторяющихся доз в популяции китайских пациентов с гиперхолестеринемией

Отбор исследователей, дизайн исследования, лекарственные препараты, применявшиеся в исследовании, схемы введения, процедура отбора и обработки образцов были такими же, как в примере 14.

Результаты оценки фармакодинамики

Фармакодинамику оценивали на основе выборки для анализа фармакодинамики (PDS). Перед каждым введением определяли изменения концентрации свободной PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня, а наблюдаемые значения для каждого момента времени и скорость изменения (%) концентрации свободной PCSK-9 в сыворотке относительно исходного уровня представляли в виде сводных таблиц. Выборка PDS включала 60 субъектов с гиперхолестеринемией (48 из группы ADI-10087 и 12 из группы плацебо). Данные по концентрации PCSK9 в сыворотке после повторяющихся многократных введений ADI-10087 через различные промежутки времени анализировали, и выборка PDS включала все популяции пациентов, которые получили по меньшей мере одну дозу исследуемого препарата и для которых имелся по меньшей мере один действительный результат анализа после введения.

1. Скорость изменения концентрации свободной PCSK9 в сыворотке относительно исходного уровня после введения

Скорость изменения концентрации свободной PCSK9 в сыворотке относительно исходного уровня после введения показана на ФИГ. 14. Результаты демонстрируют, что в группе плацебо уровень PCSK9 статистически значимо не изменился. После первого введения ADI-10087 в группе ADI-10087: в дозовых группах 75-600 мг максимальное снижение PCSK9 в основном достигалось через около 24 ч, и причем в каждой дозовой группе хорошо коррелировало время, требуемое для максимального снижения. После первого введения ADI-10087 в дозовой группе 75 мг максимальное снижение PCSK9 составляло около 78%, а в дозовых группах 140-600 мг максимальное снижение PCSK9 составляло >90%, причем чем выше была доза, тем более выраженным было снижение PCSK9; и при достижении дозы 300 мг или больше подавление PCSK9 было практически полным; после момента максимального снижения уровень PCSK9 начинал восстанавливаться, и чем выше была доза препарата, тем в меньше было восстановление. В случае многократных введений ADI-10087 концентрация PCSK9 оставалась на определенном сниженном уровне; в когорте с 2-недельным интервалом введения концентрация PCSK9 в дозовой группе 75 мг оставалась на уровне, близком к исходному, а концентрация PCSK9 в дозовой группе 140 мг оставалась на уровне, сниженном на 80%; в когортах с 4-недельным, 6-недельным интервалом введения концентрация PCSK9 в дозовых группах 300-600 мг оставалась на уровне, сниженном на 80% или более.

2. Сравнение процентных изменений ХС-ЛПНП относительно исходного уровня для одних и тех же интервалов между введениями

Группа с 2-недельным интервалом введения: в группе, получавшей 75 мг р/2 нед уровень ХС-ЛПНП после первого введения препарата заметно снижался относительно исходного уровня; максимальное снижение перед 2^-м введением составляло около 51,09% (день 11); явного восстановления уровня ХС-ЛПНП в период между 4 ч и 336 ч после последнего введения не наблюдалось; при этом через 336 ч после последнего введения этот уровень оставался заметно сниженным (61,323%) по сравнению с исходным уровнем. Уровень ХС-ЛПНП в группе, получавшей 140 мг р/2 нед, после первого введения также продемонстрировал заметное снижение; при этом максимальное снижение до 2^-го введения составило около 45,99% (день 13). Хотя было небольшое восстановление через 4 336 ч после последнего введения и уровень ХС-ЛПНП несколько увеличился, уровень ХС-ЛПНП все равно был на 54,296-60,991% ниже по сравнению с исходным уровнем.

Группы с 4-недельным интервалом введения: в группе, получавшей 300 мг р/4 нед, и в группе, получавшей 420 мг р/4 нед, уровень ХС-ЛПНП после первого введения заметно снижался по сравнению с исходным уровнем; и максимальное снижение перед вторым введением наблюдалось в день 29 и составляло 59,8% и 71,363% соответственно; снижение ХС-ЛПНП в группе, получавшей 420 мг р/4 нед, перед каждым введением было заметно более выраженным, чем в группе, получавшей 300 мг р/4 нед; после последнего введения явного восстановления ни в одной из групп не наблюдалось; и в группе, получавшей 450 мг р/4 нед, концентрация ХС-ЛПНП оставалась сниженной на уровне 72,256% (60,136%, в группе, получавшей 300 мг р/4 нед) через 672 ч после последнего введения.

Группы с 6-недельным интервалом введения: в группе, получавшей 450 мг р/6 нед, и в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, уровень ХС-ЛПНП после первого введения заметно снижался по сравнению с исходным уровнем, и в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, снижение было выраженным (максимальное снижение составило около 71,875%); снижение уровня ХС-ЛПНП в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, после второго введения (то есть после последнего введения) было более выраженным, чем в группе, получавшей 450 мг р/6 нед; через 672 ч после второго введения наблюдалось некоторое восстановление уровня, а снижение было менее выраженным (разница около 2,9%); через 1008 ч после второго введения уровень ХС-ЛПНП в группах, получавших 450 мг р/6 нед и 600 мг р/6 нед, оставался сниженным по сравнению с исходным уровнем (составляя 62,883% и 56,516% соответственно). Как видно из результатов исследования, представленных в примере 13, продолжительность снижения ХС-ЛПНП и продолжительность подавления PCSK9 были выражены при более высоких дозах препарата: в группе 600 мг уровень ХС-ЛПНП оставался сниженным на 43,455% по сравнению с исходным уровнем через 8 недель после введения (1344 ч после второго введения). Было показано, что препарат ADI-10087 можно вводить с большим интервалом, составляющим 4-8 недель. Скорость изменения концентрации ХС-ЛПНП относительного исходного уровня до и после каждого введения показана на ФИГ. 15.

3. Скорость изменения уровня ХС-ЛПНП через 6 недель, 12 недель и 14 недель относительно исходного уровня

Через 6 недель непрерывного применения уровень ХС-ЛПНП был заметно ниже относительно исходного уровня в каждой дозовой группе ADI-10087 по сравнению с плацебо, конкретно составляя: -52,385% в группе, получавшей 75 мг р/2 нед, -52,523% в группе, получавшей 140 мг р/2 нед, -60,353% в группе, получавшей 450 мг р/6 нед, и -62,175% в группе, получавшей 600 мг р/6 нед; процентное снижение ХС-ЛПНП относительно исходного уровня увеличивалось с увеличением дозы, то есть при более высоких дозах снижение ХС-ЛПНП было более выраженным.

Через 12 недель непрерывного применения снижение уровня ХС-ЛПНП относительно исходного уровня ни в одной дозовой группе ADI-10087 не продемонстрировало значительного восстановления по сравнению со снижением через 6 недель после введения, а процентные изменения уровней ХС-ЛПНП относительно исходного уровня в каждой дозовой группе по сравнению со снижением в группе плацебо составляли: -58,913% в группе, 75 мгр/2 нед, -51,886% в группе, получавшей 140 мг р/2 нед, -57,726% в группе, получавшей 300 мг р/4 нед, -69,846% в группе, получавшей 420 мг р/4 нед, -60,473% в группе, получавшей 450 мг р/6 нед, и -54,106% в группе, получавшей 600 мг р/6 нед; при этом снижение уровня ХС-ЛПНП в группе, получавшей 420 мг р/4 нед, составило 72,256% (-2,410% в группе плацебо).

Через 14 недель после начала применения, то есть через 8 недель после второго введения, уровень ХС-ЛПНП в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, снизился относительно исходного уровня на 43,455% (-16,980% в группе плацебо). Скорость изменения уровня ХС-ЛПНП относительного исходного уровня до и после каждого введения показана на ФИГ. 16.

4. Анализ скорости изменения (%) Lp(a) относительно исходного уровня через 6 недель, 12 недель и 14 недель

Через 6 недель непрерывного применения среднее снижение Lp(a) в каждой дозовой группе ADI-10087 составляло от 8,720% до 22,436% относительно исходного уровня по сравнению со снижением в группе плацебо; в группах, получавших 75 мг р/2 нед и 450 мг р/6 нед, снижение было наиболее выраженным и составляло -22,436% и -21,914% соответственно.

Через 12 недель непрерывного применения среднее снижение Lp(a) в каждой дозовой группе ADI-10087 составляло от 2,088% до 28,638% относительно исходного уровня по сравнению со снижением в группе плацебо; в группах, получавших 75 мг р/2 нед и 450 мг р/6 нед, снижение было наиболее выраженным и составляло 28,638% и 27,362% соответственно; и снижение Lp(a) в группах, получавших 600 мг р/6 нед и 420 мг р/4 нед, было менее выраженным, составляя от 2 до 7%.

Через 14 недель непрерывного применения (8 недель после второго введения) уровень Lp(a) в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, снизился на 24,520% относительно исходного уровня при сравнении со снижением в группе плацебо. Скорость изменения уровня Lp(a) до и после каждого введения показана на ФИГ. 17.

5. Анализ скорости изменения (%) АроВ относительно исходного уровня через 6 недель, 12 недель и 14 недель

Через 6 недель непрерывного применения концентрация АроВ продемонстрировала заметное снижение относительно исходного уровня при сравнении с плацебо. Среднее снижение АроВ в каждой дозовой группе ADI-100876 составляло от 57,118% до 61,414%; чем выше была доза, тем в большей степени снижалась концентрация АроВ.

Через 12 недель непрерывного применения среднее снижение АроВ в каждой дозовой группе ADI-10087 составляло от 53,761% до 69,573% относительно исходного уровня при сравнении со снижением в группе плацебо; и снижение концентрации АроВ коррелировало со снижением ХС-ЛПНП; причем в дозовой группе, получавшей 420 мг р/4 нед, снижение АроВ приближалось к 70% относительно исходного уровня.

Через 14 недель непрерывного применения (8 недель после второго введения) уровень АроВ в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, снизился на 61,729% относительно исходного уровня при сравнении со снижением в группе плацебо. Скорость изменения уровня АроВ относительно исходного уровня до и после каждого введения показана на ФИГ. 18.

6. Анализ скорости изменения (%) ХС-не-ЛПВП относительно исходного уровня через 12 недель и 14 недель

Через 12 недель непрерывного применения среднее снижение ХС-не-ЛПВП относительно исходного уровня в каждой дозовой группе ADI-10087 составляло более 55% при сравнении со снижением в группе плацебо, а максимальное снижение составляло 75,394% (в группе, получавшей 420 мг р/4 нед);

через 14 недель непрерывного применения (8 недель после второго введения) уровень ХС-не-ЛПВП в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, снизился на 61,958% относительно исходного уровня при сравнении со снижением в группе плацебо. Скорость изменения уровня ХС-не-ЛПВП относительного исходного уровня до и после каждого введения показана на ФИГ. 19.

7. Анализ скорости изменения (%) ОХ относительно исходного уровня через 12 недель и 14 недель

Через 12 недель непрерывного применения среднее снижение ОХ относительно исходного уровня в каждой дозовой группе ADI-10087 варьировало от 40% до 57%; максимальное снижение составляло около 56% в группе, получавшей 420 мг р/4 нед. В группе плацебо концентрация ОХ статистически значимо не изменялась относительно исходного уровня (увеличение на около 0,5%).

Через 14 недель непрерывного применения (8 недель после второго введения) концентрация ОХ в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, была снижена на 36,184% относительно исходного уровня, при этом в группе плацебо концентрация ОХ увеличилась на 10,635% относительно исходного уровня. Скорость изменения уровня ОХ относительно исходного уровня до и после каждого введения показана на ФИГ. 20.

8. Анализ скорости изменения (%) АроВ/ApoA1 относительно исходного уровня через 12 недель и 14 недель

Через 12 недель непрерывного применения среднее снижение АроВ/ApoA1 относительно исходного уровня в каждой дозовой группе ADI-10087 составляло более 50% при сравнении со снижением в группе плацебо, а максимальное снижение составляло 68,476% (в группе, получавшей 420 мг р/4 нед).

Через 14 недель непрерывного применения (8 недель после второго введения) уровень АроВ/ApoA1 в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, было снижено на 53,656% относительно исходного уровня при сравнении со снижением в группе плацебо. Скорость изменения уровня АроВ/ApoA1 относительно исходного уровня до и после каждого введения показана на ФИГ. 21.

9. Вывод из анализа эффективности

В анализ эффективности были включены 48 пациентов из группы ADI-10087 и 12 субъектов из группы плацебо, входившие в выборку для анализа безопасности. На неделе 12 снижение средней концентрации ХС-ЛПНП в каждой дозовой группе варьировало от 54,3% до 72,26% относительно исходного уровня. В частности, было показано, что в группе, получавшей 600 мг р/6 нед, концентрация ХС-ЛПНП снизилась на 56,52% (от 40,54% до 72,50%), причем снижение сохранялось до недели 14 (8 недель после второго введения), и снижение составляло 43,46% (от 25,96% до 60,96%) относительно исходного уровня. На неделе 12 среднее снижение Lp(a) по сравнению с исходным уровнем варьировало от 24,04% до 50,59%. Концентрации других липидов в каждой дозовой группе также снижались по сравнению со снижением в группе плацебо. Таким образом, параметры ФК/ФД (ХС-ЛПНП) ADI-10087 свидетельствуют о хороших характеристиках препарата и демонстрируют соответствие требованиям его введения с более длительным интервалом 4-8 недель.

Пример 16. Оценка безопасности ADI-10087 в случае введений его многократных повторяющихся доз в популяции китайских пациентов с гиперхолестеринемией

Результаты демонстрируют: в этом исследовании применение многократных повторяющихся доз подкожных инъекций ADI-10087 в популяции китайских пациентов с гиперхолестеринемией является вполне безопасным. В группе ADI-10087 частота возникновения нежелательных явлений на фоне терапии (НЯФТ) составляет 70,8%, а частота возникновения НЯФТ, связанных с лекарственным препаратом, составляет 31,3%; в группе плацебо частота возникновения НЯФТ составляет 75,0%, а частота возникновения НЯФТ, связанных с лекарственным препаратом, составляет 41,7%. Частота возникновения в виде по меньшей мере одного нежелательного явления, представляющего интерес (аллергическая реакция, реакция в месте введения, повышение активности аминотрансфераз, поражение печени или явление со стороны мышц), в группах ADI-10087 и плацебо была отмечена у 10,4% и 25,0% субъектов соответственно; тяжелых нежелательных явлений, тяжелых нежелательных явлений, связанных с лекарственным препаратом, нежелательных явлений, требовавших исключения из исследования, и нежелательных явлений, приведших к смерти, отмечено не было. Нежелательные явления, связанные с лекарственным препаратом, в группе ADI-10087 были легкой или умеренной степени тяжести, не требовали специфического лечения и улучшались после корректирующего лечения, что говорит о безопасности препарата. Данные по нежелательным явлениям, возникшим в ходе исследования, приведены в таблице 8.

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения описаны выше. Специалисты в данной области должны понимать, что эти варианты приведены лишь в целях иллюстрации и что, не выходя за рамки объема настоящего изобретения, могут быть осуществлены их различные другие замены, адаптации и модификации. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления изобретения, перечисленными в этом документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd.

<120> ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИ-PCSK9 АНТИТЕЛА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ

ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПОВЫШЕННЫМ УРОВНЕМ ХОЛЕСТЕРИНА

<130> PF 200572PCT

<160> 10

<170> PatentIn версии 3.3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи CDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи CDR2

<400> 5

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи CDR3

<400> 6

Gln Gln Arg Arg Asn Trp Phe Thr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи CDR1

<400> 10

Gly Ser Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Trp Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи CDR2

<400> 17

Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи CDR3

<400> 19

Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 126

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи ADI-10087

<400> 30

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp

100 105 110

Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 35

<211> 213

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

< 223> Легкая цепь

<400> 35

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 41

<211> 451

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь ADI-10087

<400> 41

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Glu Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp

100 105 110

Phe Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

210 215 220

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

225 230 235 240

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<---

Claims

1. Способ снижения уровня холестерина у субъекта, включающий введение субъекту анти-PCSK9 антитела в дозе от 75 до 600 мг,

в котором анти-PCSK9 антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем

(a) указанная тяжелая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 41; и

(b) указанная легкая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35; и

где анти-PCSK9 антитело вводят в интервале, равном или превышающем один раз в каждые две недели (р/2 нед).

2. Способ профилактики или лечения заболевания, связанного с повышенным уровнем холестерина, выбранного из гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, включающий введение субъекту анти-PCSK9 антитела в дозе от 75 до 600 мг,

(b) указанная легкая цепь содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 35;

3. Способ по п. 1 или 2, где указанное антитело вводят один раз в каждые две недели (р/2 нед), один раз в каждые четыре недели (р/4 нед), один раз в каждые пять недель (р/5 нед), один раз в каждые шесть недель (р/6 нед), один раз в каждые семь недель (р/7 нед), один раз в каждые восемь недель (р/8 нед), один раз в каждые девять недель (р/9 нед), один раз в каждые десять недель (р/10 нед), один раз в каждые одиннадцать недель (р/11 нед), один раз в каждые двенадцать недель (р/12 нед), один раз в каждые 4 месяца, один раз в каждые 5 месяцев, один раз в каждые 6 месяцев, один раз в каждые 7 месяцев или один раз в год.

4. Способ по п. 1 или 2, где указанное антитело вводят в интервале, равном или превышающем один раз в каждые четыре недели (р/4 нед).

5. Способ по любому из пп. 1-3, где указанное антитело вводят один раз в каждые две недели (р/2 нед), один раз в каждые четыре недели (р/4 нед), один раз в каждые пять недель (р/5 нед), или один раз в каждые шесть недель (р/6 нед).

6. Способ по любому из пп. 1-5, где холестерин является холестерином ЛПНП.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где анти-PCSK9 антитело вводят субъекту в дозе от 300 до 600 мг или от 450 до 600 мг.

8. Способ по п.7, где анти-PCSK9 антитело вводят субъекту в дозе 450 или 600 мг.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где анти-PCSK9 антитело вводят парентерально.

10. Способ по любому из пп. 1-8, где анти-PCSK9 антитело вводят подкожно или внутривенно.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где уровень холестерина ЛПНП у субъекта остается сниженным на > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем холестерина ЛПНП у субъекта до введения.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где уровень свободной PCSK-9 в сыворотке субъекта остается сниженным на > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем свободной PCSK-9 в сыворотке субъекта до введения.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где уровень общего холестерина у субъекта остается сниженным на > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем общего холестерина у субъекта до введения.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где уровень аполипопротеина B у субъекта остается сниженным на > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем аполипопротеина B у субъекта до введения.

15. Способ по любому из пп. 1-14, где уровень холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности, у субъекта остается сниженным на > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем холестерина, не связанного с липопротеинами высокой плотности, у субъекта до введения.

16. Способ по любому из пп. 1-15, где уровень липопротеина (a) у субъекта остается сниженным на > 20%, > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем липопротеина (a) у субъекта до введения.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где уровень ApoB/ApoA1 у субъекта остается сниженным на > 20%, > 30%, > 35%, > 40%, > 45%, > 50%, > 55%, > 60%, > 65%, > 70%, > 75%, > 80%, > 85% или > 90% через 4 недели после введения, 5 недель после введения, 6 недель после введения, 7 недель после введения, 8 недель после введения, 9 недель после введения, 10 недель после введения, 3 месяца после введения, 4 месяца после введения или 5 месяцев после введения по сравнению с уровнем ApoB/ApoA1 у субъекта до введения.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где холестерин или холестерин ЛПНП является сывороточным холестерином ЛПНП.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где анти-PCSK9 антитело вводят один раз в каждые четыре недели (р/4 нед), один раз в каждые шесть недель (р/6 нед) или один раз в каждые восемь недель (р/8 нед).

20. Способ по любому из пп. 1-19, где у субъекта после введения не развиваются тяжелые нежелательные явления.

21. Способ по любому из пп. 1-19, где у субъекта после введения не развиваются тяжелые нежелательные явления, связанные с анти-PCSK9 антителом.

22. Способ по любому из пп. 1-21, где частота возникновения нежелательных явлений у субъекта сравнима с частотой возникновения таких явлений у субъекта после введения, получившего плацебо.

23. Способ по любому из пп. 2-22, где заболевание, связанное с повышенным уровнем холестерина, выбрано из гомозиготной наследственной гиперхолестеринемии, гетерозиготной наследственной гиперхолестеринемии и ненаследственной гиперхолестеринемии.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где анти-PCSK9 антитело вводят в составе жидкого препарата антитела, содержащего:

(i) от 100 до 200 мг/мл анти-PCSK-9 антитела;

(ii) от 0,2 до 10 мг/мл гистидина;

(iii) от 1 до 6% сорбита и/или от 50 до 180 ммоль/л аргинина или соли аргинина; и

(iv) от 0,05 до 1 мг/мл полисорбата-80 или полисорбата-20;

причем pH жидкого препарата составляет от около 5,0 до 6,0.

25. Способ по любому из пп. 1-24, где анти-PCSK9 антитело вводят в составе жидкого препарата антитела, и при этом указанный жидкий препарат антитела содержит воду в качестве растворителя и состоит из следующих компонентов:

анти-PCSK9 антитело 150 мг/мл гистидин 1,5 г/л аргинин 90 ммоль/л сорбит 3% (масс./об.) полисорбат-80 0,3 г/л;

причем pH жидкого препарата составляет 5,5.