RU2846467C2 - Варианты карбоангидразы для улучшения улавливания co2 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и касается вариантов рекомбинантной карбоангидразы для усиленного с помощью фермента улавливания СО₂. Изобретение также относится к полинуклеотидам, векторам, клеткам-хозяевам, способам и процессам, относящимся к ним. Изобретение позволяет эффективно улавливать СО₂ с помощью карбоангидраз. 10 н. и 23 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 табл., 3 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее описание относится к способам улучшенного с помощью фермента улавливания СО₂ из СО₂-содержащих сточных вод или газа. Более конкретно, в настоящем документе описаны варианты рекомбинантной карбоангидразы, имеющие улучшенную растворимость и/или термостабильность в условиях, соответствующих способам улавливания СО₂ на основе карбоангидразы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Все более угрожающие предупреждения мирового научного сообщества об опасностях изменения климата в сочетании с повышением осведомленности общественности побудили активизировать усилия по сокращению антропогенных выбросов парниковых газов (ПГ), в первую очередь диоксида углерода. Электростанции, работающие на ископаемом топливе, представляют собой один из крупнейших источников выбросов CO₂ во всем мире, и поэтому внедрение эффективной системы сокращения выбросов парниковых газов потребует снижения выбросов CO₂, производимых в этом секторе. Способы улучшенного с помощью карбоангидразы улавливания CO₂ представляют собой одно из наиболее многообещающих решений по улавливанию, утилизации и хранению углерода, однако существует ряд проблем, связанных с его широким коммерческим внедрением. Одной из основных задач является повышение экономической целесообразности. Основные эксплуатационные расходы, связанные со способами улучшенного с помощью карбоангидразы улавливания CO₂, связаны с восполнением обедненного или неактивного фермента карбоангидразы. Таким образом, существует потребность в улучшенных карбоангидразах, которые могут решить по меньшей мере некоторые из этих проблем.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описаны варианты рекомбинантной карбоангидразы, обладающие улучшенной растворимостью и/или термостабильностью для улучшенного с помощью фермента улавливания CO₂. Хотя применение ферментов карбоангидразы и их вариантов, обладающих повышенной термостабильностью, может значительно снизить эксплуатационные расходы, некоторые ферменты и варианты, демонстрирующие улучшенную термостабильность, связаны с нежелательным сопутствующим снижением растворимости фермента, что может препятствовать его применению в реальных операциях по улавливанию CO₂. Например, Пример 1 показывает, что термостабильная карбоангидраза Thermovibrio ammonificans дикого типа (ТАСА) может быть склонна к агрегации/осаждению при воздействии повышенных температур (например, 80°С) в щелочных карбонатных растворах.

Интересно, что замена одной аминокислоты, R156E, увеличивала растворимость фермента приблизительно в два раза при 80°С в щелочном карбонатном растворе (см. Таблицу 1). Эта замена одной аминокислоты привела к снижению расчетной изоэлектрической точки (pI) фермента с 8,8 до 8,3. Таким образом, комбинация случайного мутагенеза и рациональных подходов к конструированию с последующим эмпирическим тестированием была использована для разработки и экспрессии вариантов ТАСА, сохраняющих активность карбоангидразы, но имеющих постепенно снижающиеся изоэлектрические точки, например в диапазоне от 8,3 до 5,9. Варианты ТАСА, имеющие более низкие значения pI, обычно демонстрируют более высокую растворимость в щелочных карбонатных растворах (Таблица 1).

С целью обнаружения новых мутаций, оказывающих положительное влияние на термостабильность и/или растворимость, был проведен крупномасштабный скрининг случайного мутагенеза, начиная с различных матриц, кодирующих функциональные варианты ТАСА, сконструированные так, чтобы иметь постепенно более низкие изоэлектрические точки (Примеры 2 и 3). Чтобы упростить сравнение различных индивидуальных вариантов ТАСА, а также их влияние на соответствующие матрицы, результаты обширных испытаний растворимости и термостабильности были преобразованы в «показатели растворимости» и «показатели стабильности». Поскольку было установлено, что и растворимость, и термостабильность часто взаимосвязаны с точки зрения их преимущества в процессах улавливания CO₂, для каждого варианта также рассчитывали «общий показатель», объединяющий показатели растворимости и стабильности, что позволяло ранжировать различные варианты с точки зрения их потенциальной привлекательности для внедрения в способы улавливания CO₂.

Было обнаружено, что некоторые полезные замены аминокислот улучшают как термостабильность, так и растворимость, в то время как другие полезные замены улучшают либо термостабильность, либо растворимость. Интересно, что было обнаружено, что улучшение растворимости фермента часто снижает эффективную концентрацию этого фермента, необходимую для достижения заданной эффективности улавливания CO₂, по сравнению с ферментом, имеющим такую же термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. Кроме того, в целом было обнаружено, что индивидуальные замены аминокислот, которые оказывали положительный эффект с точки зрения растворимости и/или термостабильности на их исходных матрицах, также оказывали положительные эффекты при введении в другие матрицы. Более того, было обнаружено, что объединение нескольких индивидуальных вариантов, оказывающих благоприятный эффект на растворимость и/или термостабильность на одной и той же матрице, приводит к получению рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, которые обычно превосходят ферменты, имеющие только соответствующие единичные варианты.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, включающие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с SEQ ID NO: 5, и отличающийся на одну или более аминокислот от SEQ ID NO: 1 в положениях остатков, выбранных из 3, 6, 11, 15, 17, 20, 24, 25, 38, 39, 48, 64, 79, 88, 119, 128, 130, 137, 145, 148, 149, 154, 160, 166, 168, 195, 199, 203, 210 и 223, при этом указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость и/или повышенную термостабильность по сравнению с соответствующим полипептидом карбоангидразы, в котором отсутствуют указанные отличия на одну или более аминокислот.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, включающие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с SEQ ID NO: 5, причем указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы включает остаток (остатки): 3Е; 6R; 9А или 9N; 11L, 11P, или 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R, или 18S; 20K или 20L; 24I, 24М, или 24V; 25F; 27R; 38D, 38R, или 38T; 39H, 39I, 39L, 39R, или 39W; 48L, 48Q, или 48Т; 51D, 51E, 5IF, 51M, или 5IP; 64T; 73E или 73L; 77F; 79E, 79L или 79W; 88Е, 881, 88L, 88R, 88Т, или 88V; 105F; 116Е или 116R; 119D или 119М; 128Е, 128K, 128R, или 128Т; 130А, 130D, 130Е, 130F, 130Н, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130Т, 130V, 130W, или 130Y; 137D или 137Е; 138Е или 138L; 145D или 145Е; 148F, 148V, или 148W; 1491; 154D, 154K, 154Р, или 154V; 156V; 158Y; 160D или 160Q; 166Е или 166V; 167L; 168Е, 168F, 168R, или 168W; 170F; 192D; 195D или 195Е; 199А, 199D, или 199K; 203R или 203V; 206R; 210Н; 216Т; 219I; 2231, 223L, или 223V; 226R; или любую их комбинацию.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, включающие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с SEQ ID NO: 5, причем указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы сконструирован таким образом, чтобы иметь изоэлектрическую точку (pI) ниже таковой для SEQ ID NO: 2, 3 или 4, и иметь растворимость выше таковой для SEQ ID NO: 2, 3 или 4 через 24 часа при 80°С в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор с концентрацией от 1,38 до 1,85 М K₂СО₃ с альфа от 0,60 до 0,89.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны изолированные полинуклеотиды, кодирующие вышеупомянутые рекомбинантные полипептиды карбоангидразы.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны векторы экспрессии или клонирования, включающие вышеупомянутые изолированные полинуклеотиды.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны клетки-хозяева, включающие вышеупомянутый изолированный полинуклеотид или вышеупомянутые векторы экспрессии.

В некоторых аспектах в настоящем документе описан способ получения рекомбинантного полипептида карбоангидразы, включающий культивирование вышеупомянутой клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию вышеупомянутых рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, и выделение рекомбинантного полипептида карбоангидразы.

В некоторых аспектах в настоящем документе описано применение вышеупомянутых рекомбинантных полипептидов карбоангидразы в промышленном способе улавливания CO₂ из CO₂-содержащих сточных вод или газа.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны способы абсорбции CO₂ из CO₂-содержащих сточных вод или газа, причем способ включает: приведение CO₂-содержащих сточных вод или газа в контакт с водным абсорбирующим раствором для растворения CO₂ в водном абсорбирующем растворе; и обеспечение рекомбинантного полипептида карбоангидразы, определенного в настоящем документе, для осуществления катализа реакции гидратации растворенного CO₂ в ионы бикарбоната и водорода или обратной реакции.

В некоторых аспектах в настоящем документе описан исходный или питательный раствор, включающий рекомбинантный полипептид карбоангидразы, как определено в настоящем документе, в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л.

Общие определения

Заголовки и другие идентификаторы, например (a), (b), (i), (ii) и т.д., представлены просто для удобства чтения описания и формулы изобретения. Использование заголовков или других идентификаторов в описании или формуле изобретения не обязательно требует, чтобы стадии или элементы выполнялись в алфавитном или числовом порядке или в том порядке, в котором они представлены.

Использование единственного числа вместе с термином «включающий» в формуле изобретения и/или описании может означать «один», но это также согласуется со значением «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более одного».

Термин «примерно» используется для обозначения того, что значение включает стандартное отклонение ошибки для устройства или способа, используемых для определения значения. Как правило, термин «примерно» означает возможное отклонение до 10%. Следовательно, в термин «примерно» включается вариация на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10% от значения. Если не указано иное, использование термина «примерно» перед диапазоном применяется к обоим концам диапазона.

Используемые в этом описании и пункте(-ах) формулы слова «включающий» (и иные формы от «включающий» такие, как «включать» и «включает»), «имеющий» (и иные формы от «имеющий» такие, как «иметь» и «имеет», «заключающий в себе» (и иные формы от «заключающий в себе» такие, как «заключает в себе» и «заключать в себе») или «содержащий» (и любые формы от «содержащий» такие, как «содержит» и «содержать») являются взаимозаменяемыми или допускающими из изменения и не исключают дополнительных неперечисленных элементов и этапов способа.

Другие задачи, преимущества и функции настоящего описания станут более очевидными после прочтения следующего неограничивающего описания конкретных вариантов его осуществления, приведенного только в качестве примера со ссылкой на сопроводительные чертежи.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На прилагаемых чертежах:

На Фиг. 1 показано выравнивание аминокислотной последовательности между SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

На Фиг. 2 показаны показатели стабильности некоторых вариантов SEQ ID NO: 3 (Фиг. 2А) и некоторых вариантов SEQ ID NO: 4 (Фиг. 2В).

На Фиг. 3 показана оптическая плотность при 595 нм различных растворов K₂СО₃, содержащих различные ферменты карбоангидразы (СА) (Фиг. 3А - Фиг. 3L), в концентрации 2 г/л после 24-часовой инкубации при 30°С (Фиг. 3А, 3С, 3Е, 3G, 3I и 3K) и 70°С (Фиг. 3В, 3D, 3F, 3Н, 3J и 3L). Концентрация K₂СО₃ варьируется от 1,38 М до 1,85 М. Содержание CO₂ в растворах варьировалось от 0,60 до 0,89 моль С/ моль K⁺. Из-за пределов растворимости KHСО₃, растворы с содержанием CO₂ 0,89 моль С/моль K⁺ ограничиваются растворами с концентрацией K₂СО₃ в диапазоне от 1,38 М до 1,45 М. Аналогичным образом растворы с содержанием CO₂ 0,84 моль С/моль K⁺ ограничиваются растворами с концентрацией K₂СО₃ от 1,38 М до 1,65 М включительно. Оптическая плотность при 595 нм связана с количеством нерастворимого/агрегированного фермента в растворе.

На Фиг. 4 показано увеличение времени полужизни (%) различных ферментов СА по сравнению с временем полужизни SEQ ID NO: 4 в 1,45 М K₂СО₃ альфа 0,70 моль С/моль K⁺ при 70, 85 и 95°С.

На Фиг. 5 показана оптическая плотность при 595 нм различных растворов K₂СО₃, содержащих ферменты СА, полученные из SEQ ID NO: 4, в концентрации 2 г/л после 24-часовой инкубации при 30°С (Фиг. 5А, 5С, 5Е, 5G, и 5I) и 70°С (Фиг. 5В, 5D, 5F, 5Н и 5J). Концентрация K₂СО₃ в растворах варьируется от 1,38 М до 1,85 М. Содержание CO₂ составляет от 0,60 до 0,89 моль С/моль K⁺. Из-за пределов растворимости KHСО₃, растворы с содержанием CO₂ 0,89 моль С/моль K⁺ ограничиваются растворами с концентрацией K₂СО₃ в диапазоне от 1,38 М до 1,45 М. Аналогичным образом растворы с содержанием CO₂ 0,84 моль С/моль K⁺ ограничиваются растворами с концентрацией K₂СО₃ от 1,38 М до 1,65 М включительно. Оптическая плотность при 595 нм связана с количеством нерастворимого/ агрегированного фермента в растворе.

На Фиг. 6 показан пример множественного выравнивания последовательностей карбоангидраз SEQ ID NO: 1 и 12-20, происходящих от разных организмов.

На Фиг. 7 показан анализ филогенетического дерева, соответствующий множественному выравниванию последовательностей, показанному на Фиг. 6.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, созданный 24 марта 2019 г. и имеющий размер примерно 44 КБ. Машиночитаемая форма включена в настоящую заявку в качестве ссылки.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее описание относится к вариантам рекомбинантной карбоангидразы, обладающим улучшенной растворимостью и/или термостабильностью для усиленного с помощью фермента улавливания CO₂, а также к полинуклеотидам, векторам, клеткам-хозяевам, способам и процессам, относящимся к ним.

Промышленные операции по улавливанию CO₂ на основе карбоангидразы обычно включают подвергание фермента воздействию повторяющихся колебаний температуры, которые могут быть в диапазоне от 10°С до 98°С, в зависимости от конкретных условий процесса. В заявке на патент РСТ WO/2016/029316 описаны способы улучшенного с помощью фермента улавливания CO₂ с применением карбоангидразы Thermovibrio ammonificans (ТАСА) или ее функциональных производных для катализа реакции гидратации CO₂ до бикарбоната и ионов водорода и/или катализа реакции десорбции с получением газа CO₂.В заявке на патент РСТ WO/2017/035667 описаны варианты ТАСА, разработанные для повышения эффективности операций по улавливанию CO₂, в частности, варианты ТАСА, обладающие улучшенной термостабильностью в контексте щелочного карбонатного абсорбирующего раствора по сравнению с ферментом дикого типа.

Хотя применение ферментов карбоангидразы и вариантов, обладающих повышенной термостабильностью, может значительно снизить эксплуатационные расходы, например, посредством увеличения периода полужизни фермента, некоторые ферменты и варианты, показывающие улучшенную термостабильность, связаны с нежелательным сопутствующим снижением растворимости фермента, что может препятствовать его применению в реальных операциях по улавливанию CO₂. Например, Пример 1 показывает, что термостабильная карбоангидраза Thermovibrio ammonificans дикого типа (ТАСА) может быть склонна к агрегации/осаждению при воздействии повышенных температур (например, 80°С) в щелочных карбонатных растворах.

В идеале фермент, используемый в операции по улавливанию CO₂ в промышленных масштабах, должен оставаться в растворе в активной форме (например, без образования агрегатов и/или без осаждения) на протяжении всего процесса улавливания CO₂, так как даже постепенное осаждение/агрегация фермента в любой момент во время термического цикла абсорбции/десорбции CO₂ со временем снизит эффективную концентрацию фермента в растворе, что потребует более частого добавления свежего фермента. И наоборот, фермент, имеющий улучшенную растворимость и/или повышенную устойчивость к агрегации в условиях способа улавливания CO₂, может иметь дополнительные технические и практические преимущества, такие как: потенциальное проявление более высокой стабильности на границе раздела фаз газ-жидкость (за счет снижения сродства к границе раздела фаз, которая является гидрофобной); облегчение солюбилизации высушенного или лиофилизированного фермента; минимизация потерь фермента вследствие агрегации (ферментативно неактивные растворимые агрегаты) и/или осаждения (нерастворимые агрегаты); предложение возможности приготовления высококонцентрированных «питательных» растворов для применения в способах улавливания CO₂; обеспечение возможности отгрузки более концентрированного исходного раствора от поставщиков ферментов, тем самым снижая стоимость доставки.

Интересно, что замена одной аминокислоты, R156E, увеличивала растворимость ТАСА приблизительно в два раза при 80°С в щелочном карбонатном растворе (см. Таблицу 1). Эта замена одной аминокислоты привела к небольшому снижению расчетной изоэлектрической точки (pI) фермента с 8,8 до 8,3. Таким образом, комбинация случайного мутагенеза и рациональных подходов к конструированию с последующим эмпирическим тестированием была использована для создания и экспрессии вариантов ТАСА, сохраняющих активность карбоангидразы, но имеющих постепенно более низкие изоэлектрические точки в диапазоне от 8,3 до 5,9. Испытанные варианты ТАСА, имеющие более низкие значения pI, обычно демонстрируют улучшенную растворимость в щелочных карбонатных растворах (Таблица 1).

С целью обнаружения новых мутаций, оказывающих положительное влияние на термостабильность без отрицательного воздействия на растворимость, три варианта ТАСА, обладающие ферментативной активностью, но разными изоэлектрическими точками, были использованы в качестве исходных матриц для скрининга случайного мутагенеза, как описано в Примерах 2 и 3. Использованные матрицы для скрининга случайного мутагенеза представлены с помощью SEQ ID NO: 5, которая представляет собой объединение SEQ ID NO: 2, 3 и 4 (см. Таблицу 1). Чтобы упростить сравнение различных идентифицированных индивидуальных вариантов ТАСА, а также их влияние на соответствующие исходные матрицы, данные испытаний растворимости и термостабильности были преобразованы в «показатели растворимости» и «показатели стабильности». Поскольку было обнаружено, что и растворимость, и термостабильность часто взаимосвязаны с точки зрения их преимущества в процессах улавливания CO₂, для каждого варианта также рассчитывали «общие показатели», объединяющие показатели растворимости и стабильности, что позволяло ранжировать различные варианты с точки зрения их потенциальной пригодности для внедрения в способы улавливания CO₂.

Соответственно, в настоящем документе описаны замены аминокислот, которые, как показано, оказывают положительное влияние, по отдельности и/или вместе, на растворимость и/или термостабильность ферментов карбоангидразы, полученных из ТАСА дикого типа (представленных в настоящем документе посредством SEQ ID NO: 1). Для большей ясности выражение «ТАСА дикого типа», используемое в настоящем документе, предназначено для обозначения аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, которая в общем случаесоответствует аминокислотной последовательности встречающейся в природе ТАСА (например, номер доступа WP_013538320.1), за исключением того, что N-концевая часть фермента оптимизирована, как описано в WO/2017/035667, для увеличения продукции фермента в бактериальной системе экспрессии. Было обнаружено, что некоторые полезные замены аминокислот, описанные в настоящем документе, улучшают как термостабильность, так и растворимость, в то время как другие полезные замены аминокислот улучшают либо термостабильность, либо растворимость. Интересно, что было обнаружено, что улучшение растворимости фермента часто снижает эффективную концентрацию этого фермента, необходимую для достижения заданной эффективности улавливания CO₂, по сравнению с ферментом, имеющим такую же термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. В настоящем документе выражение «эффективная концентрация фермента» относится к концентрации фермента, которая вызывает определенную величину ответа в данной системе, где концентрация фермента включает все формы фермента, такие как растворимый фермент, нерастворимый фермент и растворимые агрегаты фермента. Кроме того, в целом было обнаружено, что индивидуальные замены аминокислот, которые оказывали положительный эффект с точки зрения растворимости и/или термостабильности на их исходных матрицах, также оказывали положительные эффекты при введении в другие матрицы. Более того, было обнаружено, что объединение нескольких индивидуальных вариантов, оказывающих благоприятный эффект на растворимость и/или стабильность на одной и той же матрице, приводит к получению рекомбинантных ферментов карбоангидразы, которые обычно превосходят ферменты, имеющие только соответствующие единичные варианты.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, обладающие карбоангидразной активностью, содержащие аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с любой из SEQ ID NO: 1-5, и одно или более аминокислотное отличие по сравнению с SEQ ID NO: 1 в положениях остатков, выбранных из 3, 6, 11, 15, 17, 20, 24, 25, 38, 39, 48, 64, 79, 88, 119, 128, 130, 137, 145, 148, 149, 154, 160, 166, 168, 195, 199, 203, 210 и 223. В настоящем документе показано, что замены аминокислот в этих положениях оказывают положительный эффект на растворимость и/или термостабильность фермента (например, в щелочном карбонатном растворе, как описано в настоящем документе) по сравнению с соответствующими полипептидами карбоангидразы, в которых отсутствуют замены аминокислот.

В настоящем документе выражение «щелочной карбонатный раствор» обычно относится к раствору, содержащему карбонатное соединение или карбонатные ионы, имеющему щелочной рН (например, рН более 7 при комнатной температуре), который подходит для оценки улучшенной термостабильности и/или растворимость ферментов ТАСА и вариантов, описанных в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах осуществления щелочной карбонатный раствор может иметь концентрацию карбоната от 0,1 до 3 М, от 0,5 до 2 М, от 1 до 2 М или от 1,25 до 1,75 М. В конкретных вариантах осуществления щелочной карбонатный раствор может представлять собой раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М карбоната (например, K₂СО₃) с альфа в диапазоне от 0,60 до 0,89, как описано в тесте растворимости путем титрования, показанном в Примере 3.

В настоящем документе термин «альфа» в контексте щелочных карбонатных растворов относится к загрузке CO₂ и соответствует отношению концентрации углерода к калию в растворе (т.е. загрузка CO₂ или альфа = [углерод] / [калий]). Например, чистый раствор 1,45 М K₂СО₃ имеет альфа [1,45]/[2×1,45]=0,5, а чистый раствор 2,9 М KНСО₃ имеет альфа [2,9]/[2,9]=1. Смесь 0,87 М K₂СО₃+1,16 М KНСО₃ имеет альфа [0,87+1,16]/[(0,87×2)+1,16]=2,03/2,9=0,7.

В настоящем документе выражение «рекомбинантный полипептид(ы) карбоангидразы» относится к не встречающимся в природе ферментам, способным катализировать гидратацию диоксида углерода, сконструированного или полученного с использованием рекомбинантной технологии. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут включать любой тип модификации (например, химические или посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, фосфорилирование, гликозилирование, сульфатирование, сумоилирование, пренилирование, убиквитинирование и т.д.). Для большей ясности предусмотрены модификации полипептидов при условии, что модификация не нарушает карбоангидразную активность полипептидов карбоангидразы, описанных в настоящем документе. Способы измерения активности карбоангидразы описаны, например, в WO/2016/029316 и/или WO/2017/035667.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать остаток (остатки): 3Е; 6R; 9А или 9N; 11L, 11P, или 11Y; 15L; 17Y; 18I, 18L, 18R, или 18S; 20K или 20L; 241, 24М, или 24V; 25F; 27R; 38D, 38R, или 38Т; 39Н, 391, 39L, 39R, или 39W; 48L, 48Q, или 48Т; 51D, 51Е, 51F, 51М, или 51Р; 64Т; 73Е или 73L; 77F; 79Е, 79L или 79W; 88Е, 88I, 88L, 88R, 88Т, или 88V; 105F; 116Е или 116R; 119D или 119М; 128Е, 128K, 128R, или 128Т; 130А, 130D, 130Е, 130F, 130Н, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130Т, 130V, 130W, или 130Y; 137D или 137Е; 138Е или 138L; 145D или 145Е; 148F, 148V, или 148W; 149I; 154D, 154K, 154Р, или 154V; 156V; 158Y; 160D или 160Q; 166Е или 166V; 167L; 168Е, 168F, 168R, или 168W; 170F; 192D; 195D или 195Е; 199А, 199D, или 199K; 203R или 203V; 206R; 210Н; 216Т; 219I; 223I, 223L, или 223V; 226R; или любую их комбинацию. Эти замены аминокислот представляют собой замены, которые, как показано в настоящем документе экспериментально, связаны с показателем растворимости, показателем стабильности или общим показателем более 1,0, что указывает на то, что их присутствие оказало положительный эффект на растворимость и/или термостабильность фермента в щелочном карбонатном растворе, или были обнаружены на матрицах карбоангидраз с SEQ ID NO: 3 и 4, имеющих повышенную растворимость по сравнению с ТАСА дикого типа при 80°С в щелочном карбонатном растворе.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать остатков, определенных выше. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны все комбинации благоприятных замен аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать остаток (остатки): 3Е; 11P; 18S; 24I; 38D; 39I, 39L, 39Н, 39R, 39L, или 39I; 88I; 130S или 130D; 154D или 154Р; 223L или 223I; 130S и 154D; 130А и 154D; 130D и 154D; 130А, 154Р, и 195Е; 15L, 38D, и 128K; 195Е и 2231; 25F, 38D, и 128K; 38D и 128K; 38D, 128K и 137Е; 38D, 128K, 137Е, и 154D; 38D, 128K, 137Е, и 154Р; 38D, 128K, и 145Е; 38D, 128K, и 148W; 38D, 128K, и 160Q; 38D, 128K, и 167L; 38D, 128K, и 168D; 38D, 128K, и 195Е; 38D, 128K, и 199А; 38D, 128K, и 216V; 38D, 128K, и 219L; 38D, 128K, и 226K; 38D, E88I, и 128K; 38D, Е88K, и 128K; S39I, 128K, 154D, и 2231; S39I, 130А, 154Р, 195Е, и 223I; 39I, 130А, 154Р, 195Е, и 223L; 39I, 130А, 154D, и 223L; S39I, 130А, 154D, и 223I; 39I и 195Е; 39I и 223I; 39L и 223L; 39L и 223I; 39I и 223L. Эти замены аминокислот представляют собой замены, которые, как показано в настоящем документе экспериментально, связаны с общими показателями более 2,0, что указывает на то, что их присутствие оказало положительный эффект на растворимость и/или термостабильность фермента в щелочном карбонатном растворе.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, сконструированы таким образом, чтобы иметь более низкие изоэлектрические точки по сравнению с ферментами дикого типа или исходными ферментами, не имеющими такой конструкции. Используемый в настоящем документе термин «изоэлектрическая точка» или «pI» относится к рН, при котором полипептид не несет суммарного электрического заряда или является электрически нейтральным, что может быть определено экспериментально или теоретически (рассчитано). В некоторых вариантах осуществления pI полипептида, описанного в настоящем документе, может быть определена экспериментально способами, известными в данной области техники, такими как изоэлектрическое фокусирование. В других вариантах осуществления pI полипептида, описанного в настоящем документе, может представлять собой теоретическую pI, вычисленную с применением алгоритма, например, основанного на использовании уравнения Хендерсона-Хассельбаха с различными значениями рK. В некоторых вариантах осуществления pI полипептида, описанного в настоящем документе, можно вычислить с применением доступного онлайн-инструмента, такого как онлайн-инструмент Compute pI/Mw, доступный на портале ресурсов ExPASy Bioinformatics (https://web.expasy.org).

В Примере 1 показано, что конструирование ТАСА дикого типа для снижения его pi может помочь увеличить растворимость фермента, особенно при повышенных температурах (например, 80°С) в щелочном карбонатном растворе карбоната. Действительно, в Таблице 1 показано, что варианты карбоангидразы SEQ ID NO: 2-7, имеющие постепенно снижающиеся значения pi (т.е. от 8,3 до 6,9), связаны с постепенно повышающейся растворимостью при 80°С в щелочном карбонатном растворе (например, 1,45 М K₂СО₃ альфа 0,7) по сравнению с ТАСА дикого типа (SEQ ID NO: 1), имеющим pi 8,8. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть сконструированы таким образом, чтобы иметь изоэлектрическую точку (pI) ниже, чем у SEQ ID NO: 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут иметь pI на уровне или ниже 8,3, 8,2, 8,1, 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 или 4,5. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут иметь pi от 4 до 8, от 4,5 до 7,5, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5 или от 5 до 6.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, содержащие одну или более аминокислотных отличий по сравнению с SEQ ID NO: 1 в положениях остатков, описанных в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость и/или повышенную термостабильность по сравнению с соответствующим исходным полипептидом карбоангидразы, не содержащим одно или более аминокислотных различий (именуемых в настоящем документе «контрольным полипептидом карбоангидразы»), особенно в щелочном карбонатном растворе. В некоторых вариантах осуществления тесты на растворимость и/или термостабильность могут быть выполнены, как описано в Примерах 1-3. В некоторых вариантах осуществления может быть выполнен тест на термостабильность, как описано, например, в WO/2017/035667.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость после 24-часовой выдержки при 22°С или 70°С в щелочном карбонатном растворе по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость после 24-часовой выдержки при 80°С в щелочном карбонатном растворе. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную растворимость, как определено тестом растворимости путем титрования. В некоторых вариантах осуществления тест растворимости путем титрования может быть выполнен путем измерения мутности 2 г/л рекомбинантного полипептида карбоангидразы в растворах в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K₂СО₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89, как описано в Примере 3. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут иметь растворимость более 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9, 12 г/л через 24 часа при 80°С в щелочном карбонатном растворе.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную термостабильность по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы после 72-часовой выдержки при 85°С в щелочном карбонатном растворе. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут проявлять повышенную термостабильность по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы после 16-часовой выдержки при 95°С в щелочном карбонатном растворе.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96,%, 97%, 98% или 99% идентичности с любой из SEQ ID NO, описанных в настоящем документе, относящихся к карбоангидразе Thermovibrio ammonificans (например, SEQ ID NO: 1-11).

Методы определения «идентичности последовательности» аминокислот известны в данной области техники. Например, широко используется программа Emboss Needle (https://www.ebi.ac.uk), использующая алгоритм Нидлмана-Вунша. Эта программа оптимально выравнивает две последовательности, заданные в качестве входных данных, в соответствии с выбранной матрицей подобия (например, BLOSOM62) и другими параметрами (например, раскрытие пробела, размер пробела). На выходе она выдает выравнивание последовательностей, количество пробелов, которые она включает, а также проценты сходства и идентичности. Процент идентичности рассчитывают путем деления общего числа остатков, у которых одна и та же аминокислота обнаруживается в обеих последовательностях, на длину последовательности эталонного фермента (например, SEQ ID NO: 4, имеющего 226 остатков). Для большей ясности при вычислении процента идентичности данной последовательности относительно эталонной последовательности, которая определяет возможность присутствия более чем одной аминокислоты в данном положении остатка (например, SEQ ID NO: 5), данная последовательность считается совпадающей с эталонной последовательностью в этом положении остатка, если данная последовательность включает любую из возможных аминокислот, определенных для этого положения эталонной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с карбоангидразой дикого типа из Persephonella marina (Номер доступа: WP_015898908.1; SEQ ID NO: 12), Persephonella sp.KM09-Lau-8 (WP_029522463.1; SEQ ID NO: 13), Persephonella sp.IF05-L8 (WP_029521561.1; SEQ ID NO: 14), некультивированных бактерий (AVN84966.1; SEQ ID NO: 15), Persephonella hydrogeniphila (WP_096999253.1; SEQ ID NO: 16), Aquiflcae bacterium (RMD45622.1; SEQ ID NO: 17), Caminibacter mediatlanticus (WP_007474387.1; SEQ ID NO: 18), Hydrogenimonas sp.(BBG65557.1; SEQ ID NO: 19) или Hydrogenimonas sp.(RUM45284.1; SEQ ID NO: 20). Вышеупомянутые карбоангидразы представляют собой одни из самых близких ортологов ТАСА с точки зрения консервации аминокислотной последовательности, а также происходят от термофильных организмов. В некоторых вариантах осуществления замены аминокислот, продемонстрированные в настоящем документе для обеспечения положительного эффекта с точки зрения растворимости и/или термостабильности различных матриц ТАСА, могут быть сконструированы в соответствующие положения остатков на фоне любой из SEQ ID NO: 12-20. Соответствующие положения остатков могут быть идентифицированы специалистами в данной области техники путем выполнения множественного выравнивания последовательностей с последовательностями ТАСА, описанными в настоящем документе, как показано на Фиг. 6.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны изолированные полинуклеотиды, кодирующие рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изолированный полинуклеотид может быть функционально связан с гетерологичным промотором.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны векторы экспрессии или клонирования, содержащие изолированные полинуклеотиды, как определено в настоящем документе.

В некоторых аспектах, в настоящем документе описаны клетки-хозяева, содержащие изолированные полинуклеотиды, как определено в настоящем документе, или векторы экспрессии или клонирования, как определено в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки, дрожжевые клетки или клетки грибов.

В некоторых аспектах в настоящем документе описаны способы получения рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, причем способ включает культивирование клеток-хозяев, как определено в настоящем документе, в условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида карбоангидразы, как определено в настоящем документе, и выделение рекомбинантного полипептида карбоангидразы.

В некоторых аспектах рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, предназначены для применения в промышленном способе улавливания CO₂ из CO₂-содержащих сточных вод или газа.

В некоторых аспектах в настоящем документе описан способ абсорбции CO₂ из CO₂-содержащих сточных вод или газа, причем указанный способ включает: приведение CO₂-содержащих сточных вод или газа в контакт с водным абсорбирующим раствором для растворения CO₂ в водном абсорбирующем растворе; и обеспечение рекомбинантного полипептида карбоангидразы, как описано в настоящем документе, для осуществления катализа реакции гидратации растворенного CO₂ в ионы бикарбоната и водорода или обратной реакции.

В некоторых вариантах осуществления способ включает подвергание описанных в настоящем документе вариантов рекомбинантного полипептида карбоангидразы воздействию условий способа (например, водный абсорбционный раствор, температура и/или условия рН), которые усиливают их улучшенную растворимость и/или термостабильность, что приводит к снижению скорости или количества потребления/истощения рекомбинантного полипептида карбоангидразы по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2, или другим контрольным полипептидом карбоангидразы. Поскольку восполнение рекомбинантного полипептида карбоангидразы относится к эксплуатационным расходам способа улавливания CO₂, уменьшение скорости или количества, с которыми фермент потребляется/истощается в способе, значительно снизит эксплуатационные расходы.

В некоторых вариантах осуществления снижение скорости или количества потребления рекомбинантного полипептида карбоангидразы может быть результатом снижения эффективной концентрации рекомбинантного полипептида карбоангидразы, необходимой для достижения целевого уровня улавливания CO₂, по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2 или другим контрольным рекомбинантным полипептидом карбоангидразы. Более конкретно, в Примере 4 описано, что улучшение растворимости рекомбинантной карбоангидразы, как описано в настоящем документе, приводит к снижению эффективной концентрации фермента, необходимой для достижения заданной эффективности улавливания CO₂, по сравнению с контрольной или сопоставимой рекомбинантной карбоангидразой, имеющей такую же или подобную термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. Не будучи связанными теорией, предполагается, что повышение растворимости может уменьшить образование нерастворимых и/или растворимых агрегатов ферментов, которые ослаблены или неактивны с точки зрения активности карбоангидразы. Несмотря на это, преимущество введения вариантов, которые улучшают растворимость, может снизить количество фермента, необходимое с течением времени для поддержания заданной эффективности улавливания CO₂. Кроме того, возможность использовать более низкую концентрацию рекомбинантной карбоангидразы в процессе улавливания CO₂ без ущерба для характеристик или эффективности улавливания CO₂ является желательной для потенциального снижения эксплуатационных расходов.

В некоторых вариантах осуществления снижение скорости или количества потребления рекомбинантного полипептида карбоангидразы может быть результатом снижения скорости или количества активного рекомбинантного полипептида карбоангидразы (т.е. рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, обладающих карбоангидразной активностью), которое теряется или истощается вследствие агрегации и/или термической нестабильности по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2, или другим контрольным полипептидом карбоангидразы. В настоящем документе показано, что некоторые термостабильные рекомбинантные полипептиды карбоангидразы могут быть склонны к агрегации и/или осаждению, особенно при более высоких температурах в щелочном карбонатном растворе (например, при 80°С или выше в 1,45 М K₂СО₃ альфа 0,7). Сконструированные рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, имеющие улучшенные профили растворимости и/или более низкие изоэлектрические точки, могут иметь большую устойчивость к осаждению и/или агрегации в условиях, регулярно встречающихся в способах улавливания CO₂, и, таким образом, могут снизить эксплуатационные расходы, связанные с восполнением ферментов и/или дополнительными вмешательствами, связанными с этим.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, применяют в комбинации с абсорбирующим раствором, включающим по меньшей мере одно абсорбирующее соединение, которое способствует абсорбции CO₂. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе абсорбирующие растворы могут включать по меньшей мере одно абсорбирующее соединение, такое как: (а) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичная аминокислота, вторичная аминокислота, третичная аминокислота, диалкиловый эфир полиалкиленшиколей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислота или ее производное, моноэтаноламин (МЕА), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино)этанол (АЕЕ), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA), триизопропаноламин (TIPA), триэтаноламин (TEA), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (ММЕА), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (ТВЕЕ), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDA), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (ВТЕЕ), этоксиэтоксиэтанол-третбутиламин (ЕЕЕТВ), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил)эфир или их комбинация; (b) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичная аминокислота, вторичная аминокислота, третичная аминокислота; или их комбинация; (с) диалкиловый эфир полиалкиленгликолей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислота или ее производное, или их комбинация; (d) пиперазин или его производное, предпочтительно замещенное по меньшей мере одной из алканольных групп; (е) моноэтаноламин (МЕА), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино) этанол (АЕЕ), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA), триизопропаноламин (TIPA), триэтаноламин (TEA), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (ММЕА), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (ТВЕЕ), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDA), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (ВТЕЕ), этоксиэтоксиэтанол-трет-бутиламин (ЕЕЕТВ), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис-(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил) эфир; (f) аминокислота или ее производное, которая предпочтительно представляет собой глицин, пролин, аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, метионин, серии, треонин, глутамин, цистеин, аспарагин, валин, лейцин, изолейцин, аланин, тирозин, триптофан, фенилаланин, таурин, Мщклогексил 1,3-пропандиамин, N-вторичный бутилглицин, N-метил N-вторичный бутилглицин, диэтилглицин, диметилглицин, саркозин, метилтаурин, метил-α-аминопропионовую кислоту, N-β(этокси)таурин, N-(β-аминоэтил)таурин, N-метилаланин, 6-аминогексановую кислоту, калиевую или натриевую соль аминокислоты или любую их комбинацию; (g) карбонатное соединение; (h) карбонат натрия, карбонат калия или MDEA; (i) карбонат натрия; или (j) карбонат калия.

В некоторых вариантах осуществления концентрация абсорбирующего соединения в растворе может составлять от примерно 0,1 до 10 М, в зависимости от различных факторов. Когда абсорбирующее соединение представляет собой соединение на основе амина, концентрация раствора на основе амина может составлять от примерно 0,1 до 8 М, а когда абсорбирующее соединение представляет собой соединение на основе аминокислоты, концентрация раствора на основе аминокислоты может составлять от примерно 0,1 до 6 М. Когда абсорбирующее соединение представляет собой соединение на основе карбоната, рН абсорбирующего раствора может составлять примерно от 8 до 12, в зависимости, например, от абсорбирующего соединения и загрузки раствора СO₂.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе абсорбирующие растворы могут содержать абсорбирующее соединение, которое представляет собой карбонатное соединение в концентрации от примерно 0,1 до 3 М, от 0,5 до 2,5 М, от 0,5 до 2 М, от 1 до 2 М или от 1,25 до 1,75 М. В некоторых вариантах осуществления карбонатное соединение может представлять собой карбонат натрия или карбонат калия.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы улавливания CO₂ могут включать подвергание описанных в настоящем документе рекомбинантных полипептидов карбоангидразы воздействию температуры 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99°С, и/или рН 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9 или 11 в какой-то момент во время указанного процесса (например, как часть колебаний температуры и/или рН в повторяющемся тепловом цикле процесса). В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы улавливания CO₂ могут включать подвергание описанных в настоящем документе рекомбинантных полипептидов карбоангидразы воздействию рН от 8 до 11, от 8,5 до 11, от 9 до 10,5 или от 9 до 10 в какой-то момент во время указанного процесса (например, как часть колебаний температуры и/или рН в повторяющемся тепловом цикле процесса). С помощью таких повышенных температур и рН, особенно в контексте карбонатных растворов, можно усиливать или использовать улучшенные профили растворимости и/или термостабильности рекомбинантных полипептидов карбоангидразы, описанных в настоящем документе, для повышения эффективности улавливания CO₂ и/или снижения эксплуатационных расходов.

В некоторых вариантах осуществления CO₂-содержащие сточные воды или газ могут содержать от примерно 0,04% об. до 80% об., от 3% об. до 50% об., от 5% об. до 40% об., от 5% об. до 35% об. или от 5% об. до 30% об. CO₂. В некоторых вариантах осуществления CO₂-содержащие сточные воды или газ могут содержать N₂, О₂, благородные газы, VOCs, Н₂О, СО, SOx, соединения NOx, NH₃, меркаптаны, H₂S, H₂, тяжелые металлы, пыль, золу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления CO₂-содержащие сточные воды или газ могут быть получены в результате сжигания природного газа, сжигания угля, сжигания биогаза, повышения качества биогаза или очистки природного газа от серы.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в способах улавливания CO₂ можно использовать полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, в абсорбирующем растворе в концентрации от примерно 0,01 до 50 г/л, от 0,05 до 10 г/л или от 0,1 до 4 г/л. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в способах улавливания CO₂ можно применять полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, в абсорбирующем растворе в концентрации примерно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 или 4 г/л.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть получены в исходных или питательных растворах (например, для использования в способах улавливания CO₂), включающих рекомбинантный полипептид карбоангидразы, как описано в настоящем документе, в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л. В некоторых вариантах осуществления исходный или питательный растворы теряют менее 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5% (масс/об.) его начальной концентрации после инкубации в течение 24 часов при 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 или 90°С, например, из-за сниженной агрегации/осаждения фермента по сравнению с контрольным полипептидом карбоангидразы. Такую агрегацию/осаждение можно определить, например, как описано в Примере 1 и Таблице 1.

В некоторых вариантах осуществления способы улавливания CO₂, описанные в настоящем документе, могут включать один или более дополнительных признаков (например, относящихся к общей системе улавливания CO₂, блоку абсорбции, блоку десорбции, блоку разделения, устройству измерения и/или параметрам/условиям процесса), как описано в WO/2016/029316 и/или WO/2017/035667.

В различных вариантах осуществления рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в способах улавливания CO₂ в качестве ферментов, которые свободны или растворены в растворителе, иммобилизованы или захвачены или иным образом прикреплены к частицам, которые находятся в абсорбирующем растворе, или к уплотнителю или другим структурам, которые закреплены в реакционной камере. В случае, когда рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть иммобилизованы по отношению к материалу носителя, это может быть осуществлено способом иммобилизации, выбранным из адсорбции, ковалентного связывания, захвата, сополимеризации, сшивания и инкапсулирования или их комбинации.

В одной ситуации описанные в настоящем документе рекомбинантные полипептиды карбоангидразы могут быть иммобилизованы на носителе, который находится в форме частиц, шариков или. Такие носители могут быть твердыми или пористыми, с покрытием(ями) на их поверхности или без него. Рекомбинантные полипептиды карбоангидразы, описанные в настоящем документе, могут быть ковалентно присоединены к носителю и/или покрытию носителя или захвачены внутри подложки или носителя. В некоторых вариантах осуществления покрытие может быть пористым материалом, который захватывает описанные в настоящем документе рекомбинантные полипептиды карбоангидразы в порах и/или иммобилизует ферменты путем ковалентного связывания с поверхностями носителя. В некоторых вариантах осуществления материал подложки может включать нейлон, целлюлозу, диоксид кремния, силикагель, хитозан, полиакриламид, полиуретан, альгинат, полистирол, полиметилметакрилат, магнитный материал, сефарозу, диоксид титана, диоксид циркония и/или оксид алюминия, их соответствующие производные и/или другие материалы. В некоторых вариантах осуществления материал носителя может иметь плотность от примерно 0,6 г/мл до примерно 5 г/мл, такую как плотность выше 1 г/мл, плотность выше 2 г/мл, плотность выше 3 г/мл или плотность примерно 4 г/мл.

В некоторых ситуациях описанные в настоящем документе рекомбинантные полипептиды карбоангидразы могут быть представлены в виде агрегатов сшитых ферментов (CLEA) и/или в виде кристаллов сшитых ферментов (CLEC). В случае применения ферментных частиц, включая CLEA или CLEC, частицы могут иметь размер в диаметре примерно 17 мкм или меньше, необязательно примерно 10 мкм, примерно 5 мкм, примерно 4 мкм, примерно 3 мкм, примерно 2 мкм, примерно 1 мкм, примерно 0,9 мкм, примерно 0,8 мкм, примерно 0,7 мкм, примерно 0,6 мкм, примерно 0,5 мкм, примерно 0,4 мкм, примерно 0,3 мкм, примерно 0,2 мкм, примерно 0,1 мкм, примерно 0,05 мкм или примерно 0,025 мкм. Частицы также могут иметь распределение разных размеров.

Объем формулы изобретения не должен ограничиваться аспектами, ситуациями, реализациями, примерами или вариантами осуществления, изложенными в примерах и описании, но должен иметь самое широкое толкование, совместимое с описанием в целом.

Все патенты, опубликованные заявки на патенты и ссылки, которые упомянуты в настоящем документе, включены в настоящую заявку посредством ссылки. В случае несоответствий преимущественную силу имеет настоящее раскрытие.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы описаны в WO/2017/035667, если не указано иное.

Пример 1:

Карбоангидраза из Thermovibrio ammonificans демонстрирует заметное снижение растворимости в щелочном карбонатном буфере при повышенных температурах

Растворимость ТАСА дикого типа оценивали путем измерения остаточной концентрации исходных растворов 6, 9 или 12 г/л wtTACA (SEQ ID NO: 1) в 1,45 M растворе K₂СО₃ альфа 0,7 после 24-часовой инкубации при 80°С, где альфа представляет собой молярное отношение углерода к калию. Измерения концентрации белка (г/л) проводили по способу Брэдфорда. Перед измерением образцы центрифугировали для удаления нерастворимых веществ. Интересно, что растворимость wtTACA упала всего до 1,0 г/л после 24-часовой инкубации при 80°С (см. Таблицу 1). Не будучи связанным теорией, резкое падение растворимости при 80°С могло быть вызвано повышенным воздействием на гидрофобные аминокислотные остатки wtTACA, вызванным более высокой температурой, что привело к агрегации белка.

Теоретически белок имеет самую низкую растворимость в своей изоэлектрической точке (pI), которая представляет собой рН, при котором белок имеет нулевой чистый заряд. При определении путем использования онлайн-инструмента Compute pI/Mw на портале ресурсов ExPASy Bioinformatics (https://web.expasy.org), теоретическая pI wtTACA составляет 8,81 (см. Таблицу 1), что может быть не идеальным с точки зрения растворимости для щелочные условий, используемых в способах улавливания CO₂.Случайный мутагенез и рациональные подходы к конструированию в комбинации с эмпирическим тестированием был использован для разработки и экспрессии вариантов ТАСА, сохраняющих активность карбоангидразы, но имеющих постепенно понижающиеся изоэлектрические точки.

Растворимость при 80°С нескольких вариантов ТАСА, имеющих постепенно пониажающиеся изоэлектрические точки, показана в Таблице 1.

Таблица 1: Растворимость wtTACA и вариантов через 24 часа при 80°С в 1,45 М K₂СО₃ альфа 0,7

С целью обнаружения новых мутаций, которые увеличивают термостабильность без отрицательного воздействия на растворимость, были отобраны три варианта ТАСА (каждый из которых имеет различную pi, но все проявляют карбоангидразную активность) и использованы в качестве матриц для случайного мутагенеза, как описано в Примерах 2 и 3. Три матрицы, использованные для случайного мутагенеза, представляли собой SEQ ID NO: 2, 3 и 4 - см. Таблицу 1. SEQ ID NO: 5 представляет собой смесь трех матриц, а на Фиг. 1 показано множественное выравнивание последовательностей SEQ ID NO: 1-4.

Пример 2:

Скрининг мутагенеза на основе SEQ ID NO: 2

Крупномасштабный случайный мутагенез, нацеленный на остатки, которые, согласно прогнозам, подвергаются действию растворителя, в соответствии с атомистической структурой белка PDB ID NO 4С3Т, проводили, начиная с варианта ТАСА SEQ ID NO: 2, имеющего теоретическую изоэлектрическую точку 8,3. Мутировавшие ферменты были экспрессированы в Е. coli, очищены и охарактеризованы, как описано в WO/2017/035667, в отношении активности карбоангидразы и термостабильности. Статистика уэтой стадии мутагенеза представлена в Таблице 2.

Растворимость вариантов ТАСА оценивали путем измерения остаточной концентрации фермента 5 г/л в 1,45 М растворе K₂СО₃ альфа 0,7 после 24-часовой инкубации при комнатной температуре (RT) или при 70°С, где альфа - молярное отношение углерода к калию. Результаты представлены в Таблице 3.

Кроме того, чтобы упростить сравнение различных вариантов ТАСА с точки зрения их растворимости, каждому варианту был присвоен единый «показатель растворимости», который учитывает растворимость этого варианта при всех испытанных температурах (комнатная температура и 70°С) по сравнению с исходной матрицей, используемой в качестве исходной точки для мутагенеза этого варианта. В частности, показатель растворимости 1,0 присваивали, когда вариант демонстрировал значения растворимости, сравнимые с растворимостью фермента с его родительской матрицей. Показатель растворимости ниже 1,0 присваивали, когда вариант проявлял менее благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей, в то время как показатель растворимости более 1,0 присваивали, когда вариант проявлял более благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей. Максимальный показатель растворимости был установлен на уровне 1,5, при этом варианты, которым присвоен этот максимальный показатель, не показали осаждения/агрегации во время тестирования растворимости.

Анализы стабильности выполняли путем измерения остаточной активности для каждого варианта после 3 дней воздействия в 1,45 М K₂СО₃ альфа 0,7 при 85°С и последующего сравнения с активностью соответствующего фермента с родительской матрицей. Результаты показаны в Таблице 3, где столбец, обозначенный «Показатель стабильности», указывает соотношение этих остаточных активностей к активности соответствующего фермента с родительской матрицей (SEQ ID NO: 2).

Поскольку и растворимость, и термостабильность являются важными факторами, влияющими на эффективную активность конкретного варианта для эффективного улавливания CO₂ в течение нескольких термических циклов, для каждого варианта был присвоен общий показатель, который был получен путем умножения показателей растворимости и стабильности. Этот общий показатель позволил провести более значимое ранжирование различных вариантов операций по улавливанию CO₂ по сравнению с ранжированием отдельных вариантов только с точки зрения растворимости или стабильности. Например, вариант, связанный с повышенной стабильностью, но вызывающий осаждение фермента при более высоких температурах, может быть менее привлекательным, чем вариант, который увеличивает растворимость, но существенно не влияет на стабильность. В Таблице 3 мутант «E156R», имеющий общий показатель 0,8, относится к wtTACA, поскольку аминокислотная замена просто возвращает матрицу фермента обратно к SEQ ID NO: 1.

«Низкая продуктивность»: вариант фермента не экспрессировался в количествах, достаточных для характеризации; «н/о»: не определено.

Пример 3:

Скрининг мутагенеза на основе SEQ ID NO: 3 и 4

ТАСА-вариант SEQ ID NO: 3, имеющий теоретическую изоэлектрическую точку 7,16, был сконструирован путем введения следующих 15 мутаций относительно wtTACA: K27R, N38D, K88R, K116R, N119D, K128R, R156E, E160D, D168E, E192D, E199D, K203R, K206R, V216T и L219I (см. Фиг. 1 и Таблицу 1). Параллельно с этим был сконструирован вариант ТАСА SEQ ID NO: 4, имеющий теоретическую изоэлектрическую точку 6,06, путем введения следующих 16 мутаций относительно wtTACA: Y77F, V79E, К88Е, Y105F, К116Е, К128Е, E137D, E145D, R156E, D168E, Y170F, E195D, E199D, V216T, L219I и K226R (см. Фиг. 1 и Таблицу 1).

Мутировавшие ферменты были экспрессированы в Е. coli, очищены и охарактеризованы в отношении карбоангидразной активности, растворимости и термостабильности, как описано выше в Примерах 1 и 2. Примеры результатов тестирования стабильности для вариантов, полученных из SEQ ID NO: 3 и 4, показаны на Фиг. 2А и 2В соответственно.

Кроме того, учитывая относительно более высокую исходную растворимость ферментов обеих матриц, используемых в качестве исходных точек в Примере 3, по сравнению с матрицей, использованной в Примере 2, для выявления замен аминокислот, связанных с дальнейшим повышением растворимости, использовали более строгие испытания растворимости путем титрования. Тестирование растворимости путем титрования проводили путем измерения мутности нескольких растворов, содержащих 2 г/л фермента. Растворы находились в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K₂СО₃ с изменением альфа от 0,60 до 0,89. Низкая мутность (близкая к нулю) указывает на растворимый фермент, а высокая мутность указывает на агрегацию ферментов. Примеры результатов тестирования растворимости титрованием показаны на Фиг. 3.

Результаты охарактеризованных вариантов ТАСА, полученных из матриц SEQ ID NO: 3 и 4, показаны в Таблицах 4 и 5. Следует отметить, что «Показатели растворимости» в Таблицах 4 и 5 отличаются от показателей в Примере 2 тем, что показатели были модифицированы для включения данных обоих тестов на растворимость (тех, которые описаны в Примере 2, и дополнительного тестирования растворимости путем титрования, описанного выше). Что касается Таблицы 3, показатель растворимости 1,0 присваивали, когда вариант демонстрировал значения растворимости, сравнимые с растворимостью фермента с его родительской матрицей. Показатель растворимости ниже 1,0 присваивали, когда вариант проявлял менее благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей, в то время как показатель растворимости более 1,0 присваивали, когда вариант проявлял более благоприятный профиль растворимости по сравнению с ферментом с его родительской матрицей. Максимальный показатель растворимости был установлен на уровне 1,5, при этом варианты, которым присвоен этот максимальный показатель, не показали заметного осаждения/агрегации во время всех тестов растворимости.

Более того, характеризация вариантов ТАСА в Таблицах 4 и 5 позволила идентифицировать отдельные замены аминокислот, оказывающие положительное влияние на стабильность и/или растворимость фермента. Чтобы считаться имеющей положительный эффект («АК с положительным эффектом на растворимость» или «АК с положительным эффектом на стабильность»), показатель варианта, несущего мутацию, должен быть как минимум на 10% выше, чем у варианта без этой мутации. Например, мутант «SEQ ID NO: 4+N38D+E128K+D137E» имеет показатель стабильности 3,26, тогда как мутант «SEQ ID NO: 4+N38D+E128K+D137E+T154D» имеет показатель стабильности 4,89. Разница между этими двумя мутантами составляет T154D, что увеличивает показатель на 50%. Таким образом, T154D является мутацией, положительно влияющей на стабильность.

Наконец, каждому варианту присваивали общий показатель путем умножения показателей растворимости и стабильности. Общий показатель выше 1,0 указывает на положительное влияние мутаций аминокислот на растворимость и/или стабильность ферментов.

Пример 4:

Комбинации нескольких полезных мутаций приводят к вариантам, которые превосходят wtTACA с точки зрения стабильности и растворимости

В целом было обнаружено, что отдельные мутации, имеющие положительный эффект с точки зрения растворимости и/или термостабильности в одной матрице, также имели такой же положительный эффект, когда те же мутации были введены в другую матрицу. Кроме того, было обнаружено, что комбинирование нескольких мутаций, оказывающих положительное влияние на растворимость и/или стабильность, позволило получить рекомбинантные ферменты, имеющие более высокую термостабильность и/или улучшенную растворимость, чем wtTACA, в щелочных карбонатных растворах для улавливания CO₂ - см. Фиг. 4 и 5 и SEQ ID NO: 6 и 7 в Таблице 1.

Было обнаружено, что некоторые полезные варианты улучшают как термостабильность, так и растворимость, в то время как другие полезные варианты улучшают либо термостабильность, либо растворимость. Варианты, связанные с улучшенной термостабильностью, обеспечивают явное преимущество для способов улавливания CO₂, например, за счет уменьшения количества фермента, необходимого с течением времени для поддержания заданной эффективности улавливания CO₂. Интересно, что варианты, связанные с улучшенной растворимостью, обеспечивают аналогичное преимущество способов улавливания CO₂. Более конкретно, улучшение растворимости фермента может снижать эффективную концентрацию этого фермента, необходимую для достижения заданной эффективности улавливания CO₂, по сравнению с ферментом, имеющим такую же термостабильность, хотя и с более низкой растворимостью. Не будучи связанным теорией, предполагается, что повышение растворимости может уменьшить образование растворимых агрегатов ферментов, которые ослаблены или неактивны с точки зрения активности карбоангидразы. Несмотря на это, преимущество введения вариантов, которые улучшают растворимость, может снизить количество фермента, необходимое с течением времени для поддержания заданной эффективности улавливания CO₂.

Claims (47)

1. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы, обладающий карбоангидразной активностью, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с SEQ ID NO: 4, и где указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы содержит по меньшей мере один остаток(и), выбранный из группы: 3E; 6R; 9A или 9N; 11L, 11P или 11Y; 15L; 17Y;18I, 18L, 18R или 18S; 20K или 20L; 24I, 24M или 24V; 25F; 27R; 38D, 38R или 38T; 39H, 39I, 39L, 39R или 39W; 48L, 48Q или 48T; 51D, 51E, 51F, 51M или 51P; 64T; 73E или 73L; 79L или 79W; 88I, 88L, 88R, 88T или 88V; 116R; 119D или 119M; 128K, 128R или 128T; 130A, 130D, 130E, 130F, 130H, 130K, 130Q, 130R, 130S, 130T, 130V, 130W или 130Y; 137E; 138E или 138L; 145E; 148F, 148V или 148W; 149I; 154D, 154K, 154P или 154V; 156V; 158Y; 160D или 160Q; 166E или 166V; 167L; 168F, 168R или 168W; 192D; 195E; 199A, 199K; 203R или 203V; 206R; 210H; 223I, 223L, или 223V, или любую их комбинацию, причем рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость и/или термостабильность по сравнению с соответствующим исходным полипептидом карбоангидразы, не содержащим одно или более аминокислотных различий.

2. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по п.1, имеющий изоэлектрическую точку (pI) ниже, чем у SEQ ID NO: 2 или 3.

3. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по п.1, имеющий pI ниже 8,3, 8,2, 8,1, 8,0, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 или 4,5.

4. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по п.1, имеющий pI от 4 до 8, от 4,5 до 7,5, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5 или от 5 до 6.

5. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-4, включающий по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать остатков по п.1.

6. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-4, содержащий 3E; 11P; 18S; 24I; 38D; 39H, 39R, 39L, или 39I; 88I; 130S или 130D; 154D или 154P; 223L или 223I; 130S и 154D; 130A и 154D; 130D и 154D; 130A, 154P и 195E; 15L, 38D и 128K; 195E и 223I; 25F, 38D и 128K; 38D и 128K; 38D, 128K и 137E; 38D, 128K, 137E, и 154D; 38D, 128K, 137E, и 154P; 38D, 128K и 145E; 38D, 128K и 148W; 38D, 128K и 160Q; 38D, 128K и 167L; 38D, 128K и 195E; 38D, 128K, и 199A; 38D, 88I и 128K; 39I, 128K, 154D и 223I; 39I, 130A, 154P, 195E и 223I; 39I, 130A, 154P, 195E, и 223L; 39I, 130A, 154D и 223L; 39I, 130A, 154D и 223I; 39I и 195E; 39I и 223I; 39L и 223L; 39L и 223I; или 39I и 223L.

7. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость и/или повышенную термостабильность по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.

8. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы через 24 часа воздействия при 22°С или 70°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.

9. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы через 24 часа воздействия при 80°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор в диапазоне от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.

10. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную растворимость по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы, как определено испытанием растворимости путем титрования, включающим измерение мутности 2 г/л указанного рекомбинантного пептида карбоангидразы в растворах от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.

11. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-10, имеющий растворимость более 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 или 12 г/л через 24 часа при 80°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор с концентрацией от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.

12. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы имеет повышенную термостабильность по сравнению с указанным соответствующим полипептидом карбоангидразы после 72-часового воздействия при 85°C в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с изменением альфа от 0,60 до 0,89, или после 16-часового воздействия при 95° в щелочном карбонатном растворе, таком как раствор с концентрацией от 1,38 до 1,85 М K₂CO₃ с альфа, изменяющимся от 0,60 до 0,89.

13. Рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-12, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере-71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности SEQ ID NO: 4.

14. Изолированный полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13.

15. Генетическая конструкция, кодирующая рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13, состоящая из изолированного полинуклеотида по п.14, функционально связанного с гетерологичным промотором.

16. Вектор экспрессии, включающий изолированный полинуклеотид по п.14.

17. Вектор клонирования, включающий изолированный полинуклеотид по п.14.

18. Клетка-хозяин для получения рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп.1-13, содержащая изолированный полинуклеотид по п.15, или вектор экспрессии по п.16.

19. Клетка-хозяин по п.18, которая представляет собой бактериальную клетку, дрожжевую клетку или клетку гриба.

20. Способ получения рекомбинантного полипептида карбоангидразы, включающий культивирование клетки-хозяина по п.18 или 19, в условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп.1-13, и выделение рекомбинантного полипептида карбоангидраз .

21. Применение рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп. 1-13 в промышленном способе улавливания СО₂ из СО₂-содержащих сточных вод или газа.

22. Способ абсорбции СО₂ из СО₂-содержащих сточных вод или газа, включающий: приведение СО₂-содержащих сточных вод или газа в контакт с водным абсорбирующим раствором для растворения СО₂ в водном абсорбирующем растворе; и обеспечение рекомбинантного полипептида карбоангидразы по любому из пп.1-13 для осуществления катализа реакции гидратации растворенного CO₂ в ионы бикарбоната и водорода или обратной реакции.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный способ включает воздействие на рекомбинантный полипептид карбоангидразы водным абсорбционным раствором, температурой и/или условиями pH, которые усиливают их улучшенную растворимость и/или термостабильность, что приводит к снижению скорости потребления или истощения рекомбинантного полипептида карбоангидразы по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что снижение скорости потребления рекомбинантного полипептида карбоангидразы является результатом: (i) снижения эффективной концентрации рекомбинантного полипептида карбоангидразы, необходимой для достижения целевого уровня улавливания CO₂, по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2; (ii) снижения скорости потери активного рекомбинантного полипептида карбоангидразы вследствие агрегации и/или термической нестабильности по сравнению с соответствующим способом, осуществляемым с полипептидом карбоангидразы SEQ ID NO: 1 или 2; или обоих (i) и (ii).

25. Способ по любому из пп.22-24, согласно которому абсорбирующий раствор включает по меньшей мере одно абсорбирующее соединение, включающее:

(а) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичную аминокислоту, вторичную аминокислоту, третичную аминокислоту, диалкиловый эфир полиалкиленгликолей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислоту или ее производное, моноэтаноламин (MEА), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино)этанол (AEE), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA ), триизопропаноламин (TIPА), триэтаноламин (TEА), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (MMEA), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (TBEE), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDA), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (BTEE), этоксиэтоксиэтанол-третбутиламин (EEETB), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил)эфир или их комбинацию;

(b) первичный амин, вторичный амин, третичный амин, первичный алканоламин, вторичный алканоламин, третичный алканоламин, первичную аминокислоту, вторичную аминокислоту, третичную аминокислоту; или их комбинацию;

(c) диалкиловый эфир полиалкиленгликолей, диалкиловый эфир или диметиловый эфир полиэтиленгликоля, аминокислоту или ее производное, или их комбинацию;

(d) пиперазин или его производное, предпочтительно замещенное по меньшей мере одной из алканольных групп;

(e) моноэтаноламин (MEA), 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP), 2-(2-аминоэтиламино)этанол (AEE), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (Tris или AHPD), N-метилдиэтаноламин (MDEA), диметилмоноэтаноламин (DMMEA), диэтилмоноэтаноламин (DEMEA ), триизопропаноламин (TIPA), триэтаноламин (TEA), диэтаноламин (DEA), диизопропиламин (DIPA), метилмоноэтаноламин (MMEA), трет-бутиламиноэтоксиэтанол (TBEE), N-2-гидроксиэтилпиперазин (HEP), 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол (AHPD), стерически затрудненный диамин (HDА), бис-(трет-бутиламиноэтокси)-этан (BTEE), этоксиэтоксиэтанол-трет-бутиламин (EEETB), бис-(трет-бутиламиноэтил)эфир, 1,2-бис-(трет-бутиламиноэтокси)этан и/или бис-(2-изопропиламинопропил)эфир;

(f) аминокислоту или ее производное, которая предпочтительно представляет собой глицин, пролин, аргинин, гистидин, лизин, аспарагинову кислоту, глутаминовую кислоту, метионин, серин, треонин, глутамин, цистеин, аспарагин, валин, лейцин, изолейцин, аланин, тирозин, триптофан, фенилаланин, таурин, N-циклогексил 1,3-пропандиамин, -вторичный бутилглицин, -метил -вторичный бутилглицин, диэтилглицин, диметилглицин, саркозин, метилтаурин, метил-а-аминопропионовую кислоту, N-β(этокси)таурин, N-(β-аминоэтил)таурин, N-метилаланин, 6-аминогексановую кислоту, калиевую или натриевую соль аминокислоты или любую их комбинацию;

(g) карбонатное соединение;

(h) карбонат натрия, карбонат калия или MDEA;

(i) карбонат натрия; или

(j) карбонат калия.

26. Способ по любому из пп.22-24, отличающийся тем, что абсорбирующий раствор включает абсорбирующее соединение, которое представляет собой карбонатное соединение в концентрации от примерно 0,1 до 3 М, от 0,5 до 2 М, от 1 до 2 М или от 1,25 до 1,75 М.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что карбонатное соединение представляет собой карбонат натрия или карбонат калия.

28. Способ по любому из пп.22-27, включающий воздействие на указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы температурой 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99°C в какой-то момент во время указанного способа.

29. Способ по любому из пп.22-28, отличающийся тем, что указанные СО₂-содержащие сточные вод или газ:

(a) содержат от примерно 0,04% об. до примерно 80% об. СО₂;

(b) содержат N₂, O₂, благородные газы, VOCs, H₂O, CO, SOx, соединения NOx, NH₃, меркаптаны, H₂S, H₂, тяжелые металлы, пыль, золу или любую их комбинацию;

(c) получены в результате сжигания природного газа, сжигания угля, сжигания биогаза, повышения качества биогаза или очистки природного газа; или

(d) любая комбинация пунктов (a) - (c).

30. Способ по любому из пп.22-29, включающий воздействие на указанный рекомбинантный полипептид карбоангидразы pH от 8 до 11, от 8,5 до 11, от 9 до 10,5 или от 9 до 10 в какой-то момент во время указанного способа.

31. Способ по любому из пп.22-30, отличающийся тем, что концентрация полипептида карбоангидразы в абсорбирующем растворе составляет примерно от 0,01 до 50 г/л, от 0,05 до 10 г/л или от 0,1 до 4 г/л.

32. Исходный раствор для абсорбции СО₂ из СО₂-содержащих сточных вод или газа, включающий рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13 в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л.

33. Питательный раствор для абсорбции СО₂ из СО₂-содержащих сточных вод или газа, включающий рекомбинантный полипептид карбоангидразы по любому из пп.1-13 в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 г/л.