RU2846028C1

RU2846028C1 - Лечение морщин верхней части лица

Info

Publication number: RU2846028C1
Application number: RU2022126633A
Authority: RU
Inventors: Николае ГРИГОРЕ; Кэти РАФФЛ; Филипп Пико
Original assignee: Ипсен Биофарм Лимитед
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2025-08-29

Abstract

Изобретение относится к лечению морщин на лице. Способ косметического лечения включает введение модифицированного BoNT/A посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума, где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 12 пг до 1754 пг модифицированного BoNT/A на участок, где множество участков выбраны из: до двух участков Musculus corrugator и одного участка Musculus procerus для лечения межбровных морщин, до пяти участков Musculus frontalis для лечения лобных морщин; и до трех участков во внешней части Musculus orbicularis oculi для лечения боковых периорбитальных морщин, где общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, составляет до 24500 пг, и где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C). Изобретение обеспечивает удержание в месте введения и приводит к увеличению продолжительности действия токсина BoNT/A. 8 з.п. ф-лы, 14 ил., 13 табл., 1 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к косметическому лечению (например, для лечения гиперфункциональных мимических морщин). Более подробно, изобретение относится к способам косметического лечения, включающим введение нейротоксинов более длительного действия, и, более конкретно, к способу лечения косметических недостатков с использованием ботулинических нейротоксинов более длительного действия.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гиперфункциональные мимические морщины являются распространенными эстетическими недостатками, которые могут включать, в качестве неограничивающих примеров: межбровные морщины, боковые периорбитальные морщины, лобные морщины и складки, "гусиные лапки", морщины вокруг бровей, носогубные складки, морщины вокруг губ и "морщины марионетки". Морщины верхней части лица могут возникать на лбу, в межбровной и боковых периорбитальных областях. Образование морщин также может происходить в межбровной и лобной областях из-за нахмуренного выражения лица, в то время как в боковых периорбитальных областях образование морщин может возникать из-за улыбающегося выражения лица. Чрезмерно выраженные морщины в этой области часто неправильно интерпретируют как усталость, что вызывает у индивидуумов значительное беспокойство относительно их внешности. Фактически, избыточно выраженные морщины на лице появляются в результате функционального натяжения нижележащих мышц, что в конечном итоге приводит к сморщиванию кожи. В межбровном комплексе эти мышцы включают Musculus corrugator supercilli, Musculus procerus и Musculus depressor supercilli, в то время как Musculus orbicularis oculi отвечает за образование боковых периорбитальных морщин.

Т.к. старение популяции продолжает увеличиваться, за последние несколько десятилетий вырос спрос на косметические процедуры для реверсирования возрастных изменений, особенно в области лица. Эта растущая озабоченность внешним видом привела к разработке множества различных продуктов и способов, таких как хирургическое вмешательство, шлифовка лица различных типов и использование филлеров. Т.е. ни один из этих способов не является полностью безопасным, необходимы непрерывные исследования для получения наиболее безопасных и наиболее эффективных способов ухода за стареющим лицом.

Хотя существует пять факторов, взаимодействующих так, что образуется то, что известно как "стареющее лицо", есть, главным образом, два фактора (кожа и нижележащие мышцы), взаимодействующие так, что образуются более значительные тонкие морщины и складки в противоположность глубоким морщинам. Многие способы терапии были развиты для лечения глубоких морщин и кожных факторов тонких морщин и складок, помимо прочего, различные типы шлифовки лица, дерматологические препараты и инъекции для контурной пластики лица.

Альтернативным косметическим способом для лечения внешнего вида морщин на лице является введение нейротоксина, в особенности ботулинического нейротоксина, в нижележащие мышцы под кожей лица. Dysport^® является лекарственным препаратом, содержащим лекарственный комплекс BoNT/A и гемагглютинина (BTX-A-HAC), выделенный и очищенный из штамма Clostridium botulinum типа A. На рынке также присутствует несколько других медицинских препаратов BoNT/A, в природе продуцируемого Clostridium botulinum.

BoNT/A селективно ингибирует высвобождение ацетилхолина из пресинаптических нервных окончаний и, таким образом, блокирует холинергическую передачу сигнала в нервно-мышечном синапсе, что индуцирует снижение мышечного сокращения и мышечного тонуса, заставляя мышцы, в которые произведена инъекция, расслабляться.

Dysport^® одобрен для лечения межбровных морщин с максимальной общей дозой до 50 единиц, вводимых в Musculus corrugator и Musculus procerus (см. фигуру 1). Клинический эффект Dysport^® может длиться до четырех месяцев. Повторное введение в клинических исследованиях показало непрерывную эффективность в течение до четырех повторных введений. Однако Dysport^® следует вводить не чаще раза в три месяца. Dysport^® до сих пор не одобрен FDA для лечения лобных морщин и боковых периорбитальных морщин.

Во избежание системных неврологических эффектов, во многих способах косметического лечения на основе клостридиальных токсинов используют прямое введение терапевтического средства на основе клостридиального токсина в указанный целевой участок (такой как целевая ткань). Проблема возникает, когда введение терапевтических средств на основе клостридиального токсина таким образом приводит к распространению токсина из места введения в окружающую ткань или системный кровоток. Диффузию токсина из целевой ткани считают причиной нежелательных побочных эффектов, которые в крайних случаях могут угрожать жизни. Это может быть особой проблемой при использовании терапевтических средств на основе клостридиального токсина (таких как терапевтические средства BoNT) в высоких дозах, концентрациях и объемах инъекций. Нежелательные эффекты, ассоциированные с этой проблемой, описанные для коммерческих терапевтических средств BoNT/A, включают астению, общую мышечную слабость, диплопию, птоз, дисфагию, дисфонию, дизартрию, недержание мочи и затруднение дыхания. Отек и затруднение дыхания могут угрожать жизни, и сообщали о случаях гибели, связанных с распространением эффектов токсина.

Настоящее изобретение позволяет преодолеть одну или более из указанных выше проблем.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что модифицированный BoNT/A особенно пригоден в косметическом лечении морщин на лице. Модифицированный BoNT/A может содержать одну или более модификаций обращенных к поверхности аминокислотных остатков, что приводит к повышенному суммарному положительному заряду. Повышенный заряд способствует электростатическим взаимодействиям между полипептидом и анионными внеклеточными компонентами, таким образом, способствуя связыванию между полипептидом и поверхностью клетки. В свою очередь, это повышает удержание (снижает диффузию из места введения) в месте введения и приводит к увеличению продолжительности действия (например, 6-9 месяцев). Альтернативно, модифицированный BoNT/A может содержать легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C), что, аналогично, приводит к образованию модифицированного BoNT/A, демонстрирующего повышенное удержание (сниженную диффузию из места введения) в месте введения и увеличивает длительность лечения (например, 6-9 месяцев). Преимущественно, модифицированный BoNT/A имеет профиль безопасности, улучшенный по сравнению с немодифицированным BoNT/A (например, Dysport^®). Этот улучшенный профиль безопасности может быть выражен по высоким коэффициентом безопасности, представленноым в настоящем описании для модифицированного BoNT/A.

Учитывая доклинические данные в настоящем описании (см. пример 6), показано, что индивидууму можно вводить более высокое общее количество модифицированного BoNT/A, в то же время достигая профиля безопасности, схожего с немодифицированным BoNT/A (например, Dysport^®), при этом в таких высоких дозах. Таким образом, модифицированный BoNT/A можно инъецировать в большее количество мышц/мест при косметическом лечении морщин на лице до достижения максимальной общей дозы. Это является важным и благоприятным результатом и приводит к улучшенному косметическому лечению морщин на лице, в то же время обеспечивая клиницистов более широким диапазоном вариантов лечения. Лечение можно улучшать так, чтобы оно обеспечивало лечение с более длительным действием (приводя к менее частому введению) по сравнению с лечением немодифицированным BoNT/A (например, Dysport^®), и/или его можно было бы адаптировать для индивидуума, например, позволяя клиницисту осуществлять введение в конкретные места в соответствии с эстетическими запросами индивидуума. Лечение по изобретению улучшено по сравнению с общепринятыми схемами лечения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к удобной, безопасной и эффективной однократной стандартной дозе, а также общей (максимальной) дозе, которую можно безопасно вводить за одно лечение. Настоящее изобретение также относится к соответствующему руководству по количеству раз, которое указанную единицу дозу можно вводить в мышцу (включая количество мест инъекций на мышцу) без возникновения токсичности для пациента. Таким образом, лечение по настоящему изобретению является гораздо менее сложным для клинициста и помогает избежать недостаточного дозирования и/или передозировки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В одном из аспектов изобретение относится к модифицированному BoNT/A для применения в лечении морщин на лице, где модифицированный BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 1 единицы до 41 единицы (от 2 единиц до 41 единицы) модифицированного BoNT/A на участок, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей,

где множество участков выбраны из:

до двух участков Musculus corrugator и одного участка Musculus procerus для лечения межбровных морщин,

до пяти участков Musculus frontalis для лечения лобных морщин; и

до трех участков во внешней части Musculus orbicularis oculi для лечения боковых периорбитальных морщин,

где общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, составляет до 574 единиц, и

где модифицированный BoNT/A содержит модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:

i. замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком;

ii. замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком;

iii. замены незаряженного, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком;

iv. инсерции основного аминокислотного остатка; и

v. делеции кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка.

В другом родственном аспекте изобретение относится к модифицированному BoNT/A для применения в лечении морщин на лице, где модифицированный BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 8,4 пг до 344,4 пг модифицированного BoNT/A на участок,

где множество участков выбраны из:

где общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, составляет до 4821,6 пг, и

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 2 единиц до 41 единицы модифицированного BoNT/A на участок и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей,

где множество участков выбраны из:

где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C).

В родственном аспекте изобретение относится к способу лечения морщин на лице, включающему введение модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где множество участков выбраны из:

В родственном аспекте, изобретение относится к способу лечения морщин на лице, включающему введение модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 2 единиц до 41 единицы модифицированного BoNT/A на участок, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей,

где множество участков выбраны из:

В другом родственном аспекте изобретение относится к применению модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения морщин на лице, где модифицированный BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где множество участков выбраны из:

В другом родственном аспекте, изобретение относится к применению модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения морщин на лице, где модифицированный BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где множество участков выбраны из:

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 0,5 единиц до 73 единиц модифицированного BoNT/A на участок, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей,

где множество участков выбраны из:

где общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, составляет до 1019 единиц, и

В другом аспекте изобретение относится к модифицированному BoNT/A для применения в лечении морщин на лице, где модифицированный BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 12 пг до 1754pg модифицированного BoNT/A на участок,

где множество участков выбраны из:

где общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, составляет до 24500 пг, и

где множество участков выбраны из:

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 12 пг до 1754 пг модифицированного BoNT/A на участок,

где множество участков выбраны из:

Ссылка на "мышцу" означает пораженную мышцу, вносящую вклад (например, в силу избыточного напряжения, натяжения или тонуса) в лежащее в основе эстетическое состояние, на которое направленное настоящее изобретение.

Первая группа мышц определена как Musculus procerus, вторая группа мышц определена как Musculus corrugator, третья группа мышц определена как Musculus orbicularis oculi, и четвертая группа мышц определена как Musculus frontalis.

Множество участков может находиться на одной группе мышц (например, правой и левой Musculus corrugator, правой и левой Musculus orbicularis oculi). Аналогично, множество участков может находиться на одной мышце (например, правой Musculus corrugator или левой Musculus corrugator; или правой Musculus orbicularis oculi или левой Musculus orbicularis oculi). Аналогично, множество участков может представлять собой комбинацию указанной мышцы и групп мышц. Таким образом, можно обеспечивать персонализированную схему лечения.

Модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может являться модифицированным BoNT/A, содержащим модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из: замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; инсерции основного аминокислотного остатка; и делеции кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка, или модифицированным BoNT/A, содержащим легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C).

Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении является модифицированным BoNT/A, содержащим модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из: замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; инсерции основного аминокислотного остатка; и делеции кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка.

Активность модифицированного BoNT/A для применения по изобретению, предпочтительно, определяют посредством анализа LD₅₀ мышей стандартными способами. В указанном анализе 1 единицу определяют как количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей. Предпочтительно, вычисленной медианной летальной интраперитонеальной дозе у мышей. Количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе, может составлять по меньшей мере 1 пг, 2 пг, 3 пг, 4 пг, 5 пг, 6 пг, 7 пг, 8 пг или 9 пг. Количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе может составлять ≤45 пг, ≤40 пг, ≤30 пг, ≤25 пг, ≤20 пг, ≤19 пг, ≤18 пг, ≤17 пг, ≤16 пг, ≤15 пг, ≤14 пг, ≤13 пг, ≤12 пг, ≤11 пг, ≤10 пг, ≤9 пг, ≤8 пг, ≤7 пг или ≤6 пг.

Если модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении является модифицированным BoNT/A, содержащим модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из: замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; замены кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком; инсерции основного аминокислотного остатка; и делеции кислого, экспонированного на поверхности аминокислотного остатка, количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе, может составлять 1-15 пг, например, 5-10 пг. Предпочтительно, количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе, может составлять 8-9 пг, более предпочтительно - 8,4 пг.

Если модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении, является модифицированным BoNT/A, содержащим легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C), количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе, может составлять 15-35 пг, например, 20-30 пг. Предпочтительно, количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе, может составлять 23-25 пг, более предпочтительно - 24,0 пг.

Термин "до" при использовании по отношению к значению (например, до 574 единиц) означает до и включая указанное значение. Таким образом, например, ссылка на введение "до 574 единиц" модифицированного BoNT/A включает введение 574 единиц модифицированного BoNT/A, а также введение менее 574 единиц модифицированного BoNT/A.

Дозу модифицированного BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков. Вводят одну однократную дозу на участок. Термин "вводят одну однократную дозу" означает, что вводят по существу всю из одной однократной дозы. Предпочтительно, по большей мере только остаточное количество (например, до 1%, 0,1% или 0,01%) однократной дозы может остаться во флаконе, в котором восстанавливали модифицированный BoNT/A. Однако, предпочтительно, вводят всю одну однократную дозу. В зависимости от группы мышц, одну однократную дозу, как правило, вводят в мышцу, выбранную из первой группы (представленной в настоящем описании), 2-кратную однократную дозу, как правило, вводят в мышцу, выбранную из второй группы (представленной в настоящем описании), 3-кратную однократную дозу, как правило, вводят в мышцу, выбранную из третьей группы (представленной в настоящем описании), и 5-кратную однократную дозу, как правило, вводят в мышцу, выбранную из четвертой группы (представленной в настоящем описании).

Однократную дозу можно выражать в терминах единиц модифицированного BoNT/A.

Однократная доза может составлять от 2 единиц до 41 единицы модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 40, 35, 30, 25, 20, 15 или 10 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 35 единиц. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 35. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 12 единиц до 35 единиц, от 12 единиц до 24 единиц, более предпочтительно - от 12 до 18 единиц.

Альтернативно или дополнительно, однократную дозу можно выражать в терминах количества модифицированного BoNT/A. Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения в лечении морщин на лице, где модифицированный BoNT/A вводят посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где модифицированный BoNT/A вводят с помощью однократной дозы от 18 пг до 350 пг модифицированного BoNT/A на участок,

где множество участков выбраны из:

где общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, составляет до 4850 пг, и

где множество участков выбраны из:

Настоящее изобретение также относится к соответствующему применению (в производстве лекарственного средства) и способам лечения.

Однократная доза может составлять от 18 пг до 350 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175,150, 125, 100 или 50 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 300 пг. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 или 300 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 20 пг. Однократная доза модифицированного BoNT/A выбрана из: от 18 пг до 350 пг, от 20 пг до 300 пг, наиболее предпочтительно - от 100 пг до 150 пг. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 20 пг до 300 пг модифицированного BoNT/A, например, от 50 пг до 250 пг.

Наиболее предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 80 до 180 пг, например, от 100 пг до 150 пг.

Однократная доза модифицированного BoNT/A может составлять от 2 единиц до 41 единицы. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 35 единиц. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2 единицы модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 2 единицы. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 2 единиц до 35 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 15 единиц до 25 единиц.

Однократная доза модифицированного BoNT/A выбрана из: от 2 единиц до 35 единиц, от 6 до 35 единиц, от 12 единиц до 35 единиц, от 12 единиц до 24 единиц, наиболее предпочтительно - от 12 единиц до 18 единиц.

Наиболее предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 5 до 25 единиц, например, от 12 единиц до 18 единиц.

Однократная доза может составлять от 8,4 пг до 350 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100 или 50 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 300 пг. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 или 300 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 10 пг. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 10 пг до 300 пг модифицированного BoNT/A, более предпочтительно - от 10 пг до 200 пг, например, от 50 пг до 250 пг.

Однократная доза модифицированного BoNT/A выбрана из: от 8,4 пг до 350 пг, от 10 пг до 300 пг, наиболее предпочтительно - от 60 пг до 120 пг.

Наиболее предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 80 до 180 пг, например, от 60 пг до 120 пг.

Однократная доза модифицированного BoNT/A может составлять от 1 единицы до 41 единицы. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 35 единиц. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 единицу модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 1 единицу. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 1 до 35 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 10 до 20 единиц.

Однократная доза модифицированного BoNT/A выбрана из: от 1 единицы до 35 единиц, от 3,5 до 35 единиц, от 7 единиц до 35 единиц, от 7 единиц до 24 единиц, наиболее предпочтительно - от 7 единиц до 14 единиц.

Наиболее предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 5 единиц до 20 единиц, например, от 7 единиц до 14 единиц.

Однократная доза может составлять от 0,5 единиц до 73 единиц модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 62 единицы. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 0,5,0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5 или 9 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 0,8 единиц. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 0,8 единиц до 62 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 20 до 40 единиц.

Наиболее предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 5 единиц до 25 единиц, например, от 10 единиц до 21 единицы.

Однократная доза может составлять от 12 пг до 1754 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона однократных доз может составлять 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 800, 600, 400, 200, 100 или 50 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 1000 пг. Нижний предел диапазона однократных доз может составлять 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 или 300 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 20 пг. Предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 20 пг до 1500 пг, более предпочтительно - от 20 пг до 1000 пг модифицированного BoNT/A, например, от 500 пг до 750 пг.

Наиболее предпочтительно, однократная доза модифицированного BoNT/A составляет от 200 до 750 пг, например, от 250 пг до 500 пг.

Эти единицы дозирования могут быть особенно важны, если модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C).

Однократную дозу модифицированного BoNT/A также можно выражать в единицах и количестве (пг) одновременно.

При лечении морщин на лице модифицированный BoNT/A можно вводить во множество участков, выбранных из: до двух участков Musculus corrugator и одного участка Musculus procerus для лечения межбровных морщин, до пяти участков Musculus frontalis для лечения лобных морщин; и до трех участков во внешней части Musculus orbicularis oculi для лечения боковых периорбитальных морщин.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению может составлять до 574 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого в указанный сеанс лечения может составлять до 574 единиц. Общая доза может составлять до 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450 или 440 единиц. Предпочтительно, общая доза может составлять до 288 единиц модифицированного BoNT/A.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению может составлять до 4850, 4500, 4000, 3550, 3000, 2750, 2500 пг, предпочтительно - до 2400 пг.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения в случае межбровных морщин может составлять до 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 800, 600, 400, 200, 100 или 50, предпочтительно - до 1000 пг.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения в случае лобных морщин может составлять до 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 800, 600, 400, 200, 100 или 50, предпочтительно - до 1000 пг.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения в случае боковых периорбитальных морщин может составлять до 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 800, 600, 400, 200, 80, 60, 40 или 20, предпочтительно - до 1200 пг.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению может составлять до 1019 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого в указанный сеанс лечения может составлять до 1019 единиц. Общая доза может составлять до 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400 или 400 единиц. Предпочтительно, общая доза может составлять до 333 единиц модифицированного BoNT/A.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению может составлять до 24500, 24000, 23500, 23000, 22500, 22000 пг, предпочтительно - до 8000 пг. Эти общие дозы могут являться особенно подходящими, если модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C).

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения в случае межбровных морщин может составлять до 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 или 50, предпочтительно - до 5000 пг.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения в случае лобных морщин может составлять до 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 или 50, предпочтительно - до 5000 пг.

Вводимая общая доза при осуществлении схемы лечения в случае боковых периорбитальных морщин может составлять до 6000, 5500, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 или 50, предпочтительно - до 6000 пг.

Эти общие дозы могут являться особенно подходящими, если модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен H_C).

Специалист в этой области будет учитывать, если индивидуума недавно подвергали (или впоследствии будут подвергать) дополнительному лечению клостридиальным нейротоксином (например, BoNT), например, как часть косметического лечения или лечения по другому показанию. Используя рутинные в этой области способы, специалист в этой области будет, таким образом, адаптировать схему лечения по настоящему изобретению.

Введение во множество мышц по настоящему изобретению, предпочтительно, осуществляют в один и тот же сеанс лечения.

Лечение можно повторять в подходящий период времени после введения модифицированного BoNT/A. Учитывая, что длительность действия приблизительно в два раза превышает таковую у немодифицированного BoNT/A (например, Dysport^®), существуют подходящие более длительные периоды между последующими введениями, чем когда индивидуума лечат немодифицированным BoNT/A (например, Dysport^®). Индивидууму можно вводить модифицированный BoNT/A повторно в соответствии с настоящим изобретением через по меньшей мере 18, 20, 25 или 30 недель после предшествующего введения. Например, индивидууму можно вводить модифицированный BoNT/A повторно в соответствии с настоящим изобретением через по меньшей мере 18-45 недель, предпочтительно - 20-35 недель после предыдущего введения.

В рамках изобретения "индивидуум" может являться млекопитающим, таким как человек или другое млекопитающее. Предпочтительно, термин "индивидуум" означает человека.

В рамках изобретения термин "лечить" или "лечение" включает профилактическое лечение (например, для профилактики дебюта нарушения), а также корректирующее лечение (лечение индивидуума, уже страдающего нарушением). Предпочтительно, в рамках изобретения термин "лечить" или "лечение" означает корректирующее лечение. В рамках изобретения термин "лечить" или "лечение" относится к нарушению и/или его симптому.

Подходящие полипептиды модифицированного BoNT/A (и кодирующие их нуклеотидные последовательности, если присутствуют) описаны в WO 2015/004461 A1 и WO 2017/191315, оба из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

BoNT/A является одним из примером клостридиального нейротоксина, продуцируемого бактериям рода Clostridia. Другие примеры таких клостридиальных нейротоксинов включают продуцируемые C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипов B-G, а также продуцируемые C. baratii и C. butyricum. Указанные нейротоксины являются высокоактивными и специфическими и могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые их доставляют. Среди клостридиальных токсинов есть некоторые из самых активных известных токсинов. В качестве примера, ботулинические нейротоксины имеют значения медианной летальной дозы (LD₅₀) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг, в зависимости от серотипа. Столбнячные и ботулинические токсины действуют, ингибируя функцию пораженных нейронов, в частности, высвобождение нейромедиаторов. Хотя ботулинический токсин действует в нервно-мышечном синапсе и ингибирует холинергическую передачу сигнала в периферической нервной системе, столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.

В природе клостридиальные нейротоксины (включая BoNT/A) синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, модифицируемого посттрансляционно посредством протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных друг с другом дисульфидной связью. Расщепление происходит в специфическом участке, зачастую обозначаемом как активационный участок, локализованный между остатками цистеина, обеспечивающими межцепочечную дисульфидную связь. Эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи обозначают как тяжелую цепь (H-цепь), имеющую молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкую цепь (L-цепь), имеющую молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит N-концевой транслокационный компонент (домен H_N) и C-концевой нацеливающий компонент (домен H_C). Участок расщепления локализуется между L-цепью и компонентами транслокационного домена. После связывания домена H_C с его целевым нейроном и интернализации связанного токсина в клетку с помощью эндосомы, домен H_N транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль, и L-цепь обеспечивает функцию протеазы (также известной как нецитотоксическая протеаза).

Нецитотоксические протеазы действуют, протеолитически расщепляя внутриклеточные транспортные белки, известные как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP или синтаксин) - см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Сокращение SNARE происходит от термина "растворимый рецептор присоединения NSF", где "NSF" означает N-этилмалеимид-чувствительный фактор. Белки SNARE необходимы для внутриклеточного слияния везикул и, таким образом, для секреции молекул с помощью везикулярного транспорта из клетки. Функция протеазы представляет собой цинк-зависимую эндопептидазную активность и демонстрирует высокую субстратную специфичность для белков SNARE. Таким образом, после доставки в желаемую клетку-мишень, нецитотоксическая протеаза может ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. L-цепь протеазы клостридиальных токсинов представляет собой нецитотоксические протеазы, расщепляющие белки SNARE.

В рамках изобретения термин "домен H_C" означает функционально отдельную область тяжелой цепи нейротоксина с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, делающем возможным связывание нейротоксина с рецептором, локализованным на поверхности клетки-мишени. Домен H_Cсостоит из двух структурно отличающихся поддоменов, "поддомена H_CN" (N-концевой части домена H_C) и "поддомена H_CC" (C-концевой части домена H_C), каждый из которых имеет молекулярную массу приблизительно 25 кДа.

В рамках изобретения термин "домен LH_N" означает нейротоксин, лишенный домена H_C и состоящий из эндопептидазного домена ("L" или "легкой цепи") и домена, отвечающего за транслокацию эндопептидазы в цитоплазму (домен H_N тяжелой цепи).

Как указано выше, клостридиальный токсины образуются из двух полипептидных цепей, тяжелой цепи (H-цепи), имеющей молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепи (L-цепь), имеющей молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит C-концевой нацеливающий компонент (рецептор-связывающий домен или домен H_C) и N-концевой транслокационный компонент (домен H_N).

Примеры референсных последовательностей легкой цепи включают:

Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки 1-448

Ботулинический нейротоксина типа B: аминокислотные остатки 1-440

Указанные выше референсные последовательности следует рассматривать как ориентир, т.к. в подсеротипах могут возникать небольшие изменения. В качестве примера, в патентной заявке США № 2007/0166332 (включенной, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) приведены немного другие клостридиальные последовательности:

Ботулинический нейротоксин типа A: аминокислотные остатки M1-K448

Ботулинический нейротоксина типа B: аминокислотные остатки M1-K441

Предпочтительным модифицированным BoNT/A является BoNT/A, содержащий модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277. Такой модифицированный BoNT/A демонстрирует снижение или отсутствие побочных эффектов по сравнению с использованием известного BoNT/A. Свойства повышенного удержания в ткани модифицированного BoNT/A по изобретению также относятся к повышенной активности и/или длительности действия и могут позволить снизить используемые дозы по сравнению с известными терапевтическими средствами на основе клостридиального токсина (или повышать дозы без каких-либо дополнительных нежелательных эффектов), таким образом, обеспечивая дополнительные преимущества.

Модификация может являться модификацией по сравнению с немодифицированным BoNT/A, приведенным как SEQ ID NO: 2, где нумерацию аминокислотных остатков определяют по выравниванию с SEQ ID NO: 2. Т.к. наличие остатка метионина в положении 1 SEQ ID NO: 2 (а также SEQ ID NO, соответствующих модифицированным полипептидам BoNT/A, представленным в настоящем описании) является необязательным, специалист в этой области будет учитывать наличие/отсутствие остатка метионина при определении нумерации аминокислотных остатков. Например, если SEQ ID NO: 2 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, ASN 886 будет являться ASN 886 из SEQ ID NO: 2). Альтернативно, если метионин в SEQ ID NO: 2 отсутствует, нумерацию аминокислотных остатков следует модифицировать на -1 (например, ASN 886 будет являться ASN 885 из SEQ ID NO: 2). Схожие соображения используют, если метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, представленных в настоящем описании, присутствует/отсутствует, и специалист в этой области легко определит корректную нумерацию аминокислотных остатков рутинными в этой области способами.

Аминокислотные остатки, показанные для модификации, являются обращенными к поверхности аминокислотными остатками.

Модифицированный BoNT/A может содержать модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277. Модифицированный BoNT/A может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 3, 5, 7 и 9. Например, последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичности последовательности в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 3, 5, 7 и 9. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может кодироваться нуклеиновой кислотой, содержащей (или состоящей из) SEQ ID NO: 3, 5, 7 или 9. Модифицированный BoNT/A может содержать полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, 6, 8 и 10. Например, полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичности последовательности в отношении полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, 6, 8 и 10. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может содержать (более предпочтительно - состоять из) полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4, 6, 8 и 10.

Термин "один или более аминокислотных остатков" при использовании в отношении модифицированного BoNT/A, предпочтительно, означает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 из указанных аминокислотных остатков. Таким образом, модифицированный BoNT/A может содержать по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или 7 (предпочтительно, 7) модификаций в указанных аминокислотных остатках. Модифицированный BoNT/A может содержать 1-30, 3-20 или 5-10 модификаций аминокислот. Более предпочтительно, термин "один или более аминокислотных остатков" при использовании в отношении модифицированного BoNT/A означает все из указанных аминокислотных остатков.

Предпочтительно, помимо одной или более модификаций аминокислот в указанных аминокислотных остатках, модифицированный BoNT/A не содержит каких-либо дополнительных модификаций аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 2.

Наиболее предпочтительно, модифицированный BoNT/A содержит (более предпочтительно, состоит из) модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 930,SER 955, GLN 991, ASN 1026, ASN 1052 и GLN 1229. Модифицированный BoNT/A может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 3. Например, последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может кодироваться нуклеиновой кислотой, содержащей (или состоящей из) SEQ ID NO: 3. Модифицированный BoNT/A может содержать полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 4. Например, полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может содержать (более предпочтительно, состоять из) SEQ ID NO: 4.

Модификация может быть выбрана из:

Как указано выше, модификация приводит к модифицированному BoNT/A, имеющему повышенный положительный поверхностный заряд и повышенную изоэлектрическую точку по сравнению с соответствующим немодифицированным BoNT/A.

Изоэлектрическая точка (pI) является специфическим свойством указанного белка. Как хорошо известно в этой области, белки состоят из специфической последовательности аминокислот (также обозначаемых в белке как аминокислотные остатки). Каждая аминокислота из стандартного набора двадцати аминокислот имеет иную боковую цепь (или R-группу), что означает, что каждый аминокислотный остаток в белке проявляет разные химические свойства, такие как заряд и гидрофобность. На эти свойства может влиять окружающая химическая среда, например, температура и pH. Общие химические характеристики белка будут зависеть от суммы различных факторов.

Некоторые аминокислотные остатки (подробно описанные ниже) имеют ионизируемые боковые цепи, которые могут демонстрировать электрический заряд, зависящий от pH окружающей среды. Заряжена ли такая боковая цепь при указанном pH или нет, зависит от pKa соответствующего ионизируемого остатка, где pKa представляет собой отрицательный логарифм кислой константы диссоциации (Ka) для определенного протона от сопряженного основания.

Например, кислые остатки, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, имеют группы карбоновой кислоты в боковой цепи со значениями pKa приблизительно 4,1 (точные значения pKa могут зависеть от температуры, ионной силы и микроокружения ионизируемой группы). Таким образом, эти боковые цепи демонстрируют отрицательный заряд при pH 7,4 (зачастую обозначаемый как "физиологический pH"). При низких значениях pH эти боковые цепи будут протонированы и потеряют свой заряд.

И наоборот, основные остатки, такие как лизин и аргинин, имеют азотсодержащие группы боковой цепи со значениями pKa приблизительно 10-12. Таким образом, эти боковые цепи демонстрируют положительный заряд при pH 7,4. Эти боковые цепи будут депротонированы и потеряют свой заряд при высоких значениях pH.

Таким образом, общий (суммарный) заряд белковой молекулы зависит от количества кислых и основных остатков, присутствующих в белке (и их степени экспонирования на поверхности), и pH окружающей среды. Изменение pH окружающей среды изменяет общий заряд белка. Таким образом, для каждого белка существует определенный pH, при котором количество положительных и отрицательных зарядов равно, и белок не демонстрирует общего суммарного заряда. Эта точка известна как изоэлектрическая точка (pI). Изоэлектрическая точка представляет собой стандартную концепцию в биохимии белков, известную специалисту в этой области.

Таким образом, изоэлектрическую точку (pI) определяют как значение pH, при котором белок демонстрирует нулевой суммарный заряд. Повышение pI означает, что более высокое значение pH необходимо, чтобы белок демонстрировал нулевой суммарный заряд. Таким образом, повышение pI представляет собой повышение суммарного положительного заряда при указанном pH. И наоборот, снижение pI означает, что необходимо более низкое значение pH, чтобы белок демонстрировал нулевой суммарный заряд. Таким образом, снижение pI представляет собой снижение суммарного положительного заряда белка при указанном pH.

Способы определения pI белка известны в этой области и будут известны специалисту в этой области. В качестве примера, pI белка можно вычислять из средних значений pKa каждой аминокислоты, присутствующей в белке ("вычисленная pI"). Такие вычисления можно осуществлять с использованием известных в этой области компьютерных программ, таких как Compute pI/MW Tool от ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/), что представляет собой предпочтительный способ вычисления pI в соответствии с настоящим изобретением. Сравнение значений pI между разными молекулами следует осуществлять с использованием того же способа/программы для вычисления.

При необходимости, вычисленную pI белка можно подтверждать экспериментально способом изоэлектрофокусирования ("наблюдаемая pI"). В этом способе используют электрофорез для разделения белков по их pI. Изоэлектрофокусирование, как правило, осуществляют с использованием геля, имеющего иммобилизованный градиент pH. При приложении электрического поля белок мигрирует через градиент pH до достижения pH, при котором он имеет нулевой суммарный заряд, эта точка является pI белка. Результаты, полученные посредством изоэлектрофокусирования, как правило, имеют относительно низкое разрешение по своей природе, и, таким образом, авторы настоящего изобретения считают, что результаты, полученные с помощью вычисленной pI (как описано выше), больше подходят для использования.

На всем протяжении настоящего описания обозначение "pI" означает "вычисленную pI", если не указано иначе.

pI белка можно повышать или снижать, изменяя количество основных и/или кислых групп, экспонированных на его поверхности. Этого можно достигать, модифицируя одну или более аминокислот белка. Например, повышение pI можно обеспечивать, снижая количество кислых остатков или повышая количество основных остатков.

Модифицированный BoNT/A по изобретению может иметь значение pI, составляющее по меньшей мере на 0,2, 0,4, 0,5 или 1 единицу pI больше, чем у немодифицированного BoNT/A (например, SEQ ID NO: 2). Предпочтительно, модифицированный BoNT/A может иметь pI по меньшей мере 6,6, например, по меньшей мере 6,8.

Свойства 20 стандартных аминокислот указаны в таблице ниже:
Аминокислота			Боковая цепь
Аспарагиновая кислота	Asp	D	Заряженная (кислая)
Глутаминовая кислота	Glu	E	Заряженная (кислая)
Аргинин	Arg	R	Заряженная (основная)
Лизин	Lys	K	Заряженная (основная)
Гистидин	His	H	Незаряженная (полярная)
Аспарагин	Asn	N	Незаряженная (полярная)
Глутамин	Gln	Q	Незаряженная (полярная)
Серин	Ser	S	Незаряженная (полярная)
Треонин	Thr	T	Незаряженная (полярная)
Тирозин	Tyr	Y	Незаряженная (полярная)
Метионин	Met	M	Незаряженная (полярная)
Триптофан	Trp	W	Незаряженная (полярная)
Цистеин	Cys	C	Незаряженная (полярная)
Аланин	Ala	A	Незаряженная (гидрофобная)
Глицин	Gly	G	Незаряженная (гидрофобная)
Валин	Val	V	Незаряженная (гидрофобная)
Лейцин	Leu	L	Незаряженная (гидрофобная)
Изолейцин	Ile	I	Незаряженная (гидрофобная)
Пролин	Pro	P	Незаряженная (гидрофобная)
Фенилаланин	Phe	F	Незаряженная (гидрофобная)

Следующие аминокислоты считают заряженными аминокислотами: аспарагиновая кислота (отрицательная), глутаминовая кислота (отрицательная), аргинин (положительная) и лизин (положительная).

При pH 7,4 боковые цепи аспарагиновой кислоты (pKa 3,1) и глутаминовой кислоты (pKa 4,1) имеют отрицательный заряд, в то время как боковые цепи аргинина (pKa 12,5) и лизина (pKa 10,8) имеют положительный заряд. Аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту обозначают как кислые аминокислотные остатки. Аргинин и лизин обозначают как основные аминокислотные остатки.

Следующие аминокислоты считают незаряженными, полярными (что означает, что они могут участвовать в образовании водородных связей) аминокислотами: аспарагин, глутамин, гистидин, серин, треонин, тирозин, цистеин, метионин и триптофан.

Следующие аминокислоты считают незаряженными, гидрофобными аминокислотами: аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, пролин и глицин.

При инсерции аминокислоты дополнительный аминокислотный остаток (остаток, который в норме не присутствует) встраивают в полипептидную последовательность BoNT/A, таким образом, повышая общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности. При делеции аминокислоты аминокислотный остаток удаляют из аминокислотной последовательности клостридиального токсина, таким образом, снижая общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности.

Предпочтительно, модификация является заменой, преимущественно, сохраняющей то же количество аминокислотных остатков в модифицированном BoNT/A. При замене аминокислоты аминокислотный остаток, образующий часть полипептидной последовательности BoNT/A, заменяют другим аминокислотным остатком. Заменяющий аминокислотный остаток может являться одной из 20 стандартных аминокислот, как описано выше. Альтернативно, замещающая аминокислота при замене аминокислоты может являться нестандартной аминокислотой (аминокислотой, неявляющейся частью описанного выше стандартного набора 20 аминокислот). В качестве примера, замещающая аминокислота может являться основной нестандартной аминокислотой, например L-орнитином, L-2-амино-3-гуанидинопропионовой кислотой или D-изомерами лизина, аргинина и орнитина). Способы встраивания нестандартных аминокислот в белки известны в этой области и включают синтез рекомбинантных белков с использованием ауксотрофных экспрессирующих хозяев E. coli.

В одном из вариантов осуществления замена выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком, замены кислого аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком и замены незаряженного аминокислотного остатка основным аминокислотным остатком. В одном из вариантов осуществления, где замена является заменой кислого аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком, кислый аминокислотный остаток заменяют соответствующим незаряженным амидом аминокислотного остатка (т.е. аспарагиновую кислоту заменяют аспарагином и глутаминовую кислоту заменяют глутамином).

Предпочтительно, основный аминокислотный остаток является остатком лизина или остатком аргинина. Другими словами, замена является заменой лизином или аргинином. Наиболее предпочтительно, модификация является заменой лизином.

После модификации по изобретению модифицированный BoNT/A может связываться с рецепторами клетки-мишени, с которыми связывается немодифицированный BoNT/A (например, SEQ ID NO: 2).

Модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может содержать легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A (домен LH_N BoNT/A) и домен H_C BoNT/B. Домен LH_N BoNT/A ковалентно связан с доменом H_C BoNT/B. Указанный модифицированный BoNT/A также обозначают в настоящем описании как "BoNT/AB" или "химеру BoNT/AB".

C-концевой аминокислотный остаток домена LH_N может соответствовать первому аминокислотному остатку 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C BoNT/A, и N-концевой аминокислотный остаток домена H_C может соответствовать второму аминокислотному остатку 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C в BoNT/B.

Пример полипептидной последовательности BoNT/B приведен как SEQ ID NO: 16 (регистрационный номер UniProt B1INP5).

В настоящем описании ссылка на "первый аминокислотный остаток 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C BoNT/A" означает N-концевой остаток 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C.

В настоящем описании ссылка на "второй аминокислотный остаток 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C BoNT/B" означает аминокислотный остаток после N-концевого остатка 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C.

"3₁₀-спираль" является типом вторичной структуры, обнаруживаемым в белках и полипептидах вместе с α-спиралями, β-листами и обратными поворотами. Аминокислоты в 3₁₀-спирали расположены в правовинтовой спиральной структуре, где каждый полной поворот завершается тремя остатками и десятью атомами, разделяющими внутримолекулярную водородную связь между ними. Каждая аминокислота соответствует повороту на 120° в спирали (т.е. спираль имеет три остатка на поворот) и перемещению на 2,0 Å (=0,2 нм) по оси спирали и имеет 10 атомов в кольце, образованном с помощью водородных связей. Что наиболее важно, N-H-группа аминокислоты образует водородную связь с C=O-группой аминокислоты на три остатка выше; это повторяющееся соединение водородными связями i+3 → i определяет 3₁₀-спираль. 3₁₀-спираль представляет собой стандартную концепцию в структурной биологии, известную специалисту в этой области.

3₁₀-спираль соответствует четырем остаткам, образующим конкретную спирали и два кэпирующих (или временных) остатков, по одному на каждом конце этих четырех остатков. В рамках изобретения термин "3_10-спираль, разделяющая домены LH_N и H_C" состоит из этих 6 остатков.

Посредством структурных анализов и выравнивания последовательностей идентифицировали 3₁₀-спираль, разделяющую домены LH_N и H_C. Эта 3₁₀-спираль окружена α-спиралью на своем N-конце (т.е. в C-концевой части домена LH_N) и β-листом на своем C-конце (т.е. в N-концевой части домена H_C). Первый (N-концевой) остаток (кэпирующий или временной остаток) 3₁₀-спирали также соответствует C-концевому остатку этой α-спирали.

3₁₀-спираль, разделяющую домены LH_N и H_C, можно определять, например, из общедоступных кристаллических структур ботулинических нейротоксинов, например, 3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA) и 1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW) для ботулинических нейротоксинов A1 и B1, соответственно.

Для определения локализации 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C в других нейротоксинах, также можно использовать инструменты для моделирования in silico и выравнивания, являющиеся общедоступными, например, серверы для моделирования гомологии LOOPP (Learning, Observing and Outputting Protein Patterns, http://loopp.org), PHYRE (Protein Homology/analogY Recognition Engine, http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) и Rosetta (https://www.rosettacommons.org/), сервер для наложения белков SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/), программу для выравнивания Clustal Omega (http://www.clustal.org/omega/) и ряд других инструментов/сервисов, указанных в Internet Resources for Molecular and Cell Biologists (http://molbiol-tools.ca/). В частности, область вокруг соединения "H_N/H_CN" является структурно высококонсервативной, что делает ее идеальной областью для наложения разных серотипов.

Например, для определения последовательности этой 3₁₀-спирали в других нейротоксинов использовали следующую методологию:

1. Инструмент для моделирования структурной гомологии LOOP (http://loopp.org) использовали для получения прогнозируемой структуры других серотипов BoNT на основе кристаллической структуры BoNT/A1 (3BTA.pdb);

2. Полученные таким образом структурные файлы (pdb) редактировали для включения только N-конца домена H_CN и приблизительно 80 остатков до него (являющиеся частью домена H_N), таким образом, сохраняя область "H_N/H_CN", являющуюся структурно высококонсервативной;

3. Сервер для наложения белков SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/) использовали для наложения каждого серотипа на структуру 3BTA.pdb;

4. Наложенные файлы pdb исследовали для локализации 3₁₀-спирали в начале домена H_C BoNT/A1, а затем идентифицировали соответствующие остатки в другом серотипе.

5. Другие последовательности серотипа BoNT выравнивали с помощью Clustal Omega для проверки того, что соответствующий остатки являлись правильными.

Примеры доменов LH_N, H_C и 3₁₀-спирали, определенные этим способом, приведены ниже:

Нейротоксин	Регистрационный номер (и версия последовательности после десятичного знака)	LH_N	H_C	3₁₀-спираль
BoNT/A1 (SEQ ID NO: 2)	A5HZZ9.1	1-872	873-1296	⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷
BoNT/A2	X73423.3	1-872	873-1296	⁸⁷²NIVNTS⁸⁷⁷
BoNT/A3	DQ185900.1 (также известный как Q3LRX9.1)	1-872	873-1292	⁸⁷²NIVNTS⁸⁷⁷
BoNT/A4	EU341307,1 (также известный как Q3LRX8.1)	1-872	873-1296	⁸⁷²NITNAS⁸⁷⁷
BoNT/A5	EU679004,1 (также известный как C1IPK2.1)	1-872	873-1296	⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷
BoNT/A6	FJ981696.1	1-872	873-1296	⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷
BoNT/A7	JQ954969.1 (также известный как K4LN57.1)	1-872	873-1296	⁸⁷²NIINTS⁸⁷⁷
BoNT/A8	KM233166,1	1-872	873-1297	⁸⁷²NITNTS⁸⁷⁷
BoNT/B1 (SEQ ID NO: 16)	B1INP5.1	1-859	860-1291	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B2	AB084152.1 (также известный как Q8GR96.1)	1-859	860-1291	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B3	EF028400.1 (также известный как A2I2S2.1)	1-859	860-1291	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B4	EF051570.1 (также известный как A2I2W0.1)	1-859	860-1291	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B5	EF033130.1 (также известный как A2I2U6.1)	1-859	860-1291	⁸⁵⁹DILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B6	AB302852.1 (также известный как A8R089.1)	1-859	860-1291	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B7	JQ354985.1 (также известный как H9CNK9.1)	1-859	860-1291	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴
BoNT/B8	JQ964806.1 (также известный как I6Z8G9.1)	1-859	860-1292	⁸⁵⁹EILNNI⁸⁶⁴

При использовании структурного анализа и выравнивания последовательностей обнаружено, что β-цепь после 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C, является консервативной структурой в ботулинических и столбнячных нейротоксинах и начинается с 8-ого остатка, начиная с первого остатка 3₁₀-спирали, разделяющей домены LH_N и H_C (например, в остатке 879 в случае BoNT/A1).

Химера BoNT/AB может содержать домен LH_N из BoNT/A, ковалентно связанный с доменом H_C из BoNT/B,

где C-концевой аминокислотный остаток домена LH_N соответствует восьмому аминокислотному остатку, N-концевому относительно β-цепи, локализованной в начале (N-конце) домена H_C BoNT/A, и

где N-концевой аминокислотный остаток домена H_C соответствует седьмому аминокислотному остатку, N-концевому относительно β-цепи, локализованной в начале (N-конце) домена H_C BoNT/B.

где C-концевой аминокислотный остаток домена LH_N соответствует C-концевому аминокислотному остатку α-спирали, локализованной в конце (C-конце) домена LH_N BoNT/A, и

где N-концевой аминокислотный остаток домена H_C соответствует аминокислотному остатку, непосредственно C-концевому относительно C-концевого аминокислотного остатка α-спирали, локализованной на конце (C-конце) домена LH_N BoNT/B.

Обоснованием дизайна химеры BoNT/AB является попытка обеспечения отсутствия нарушения вторичной структуры и, таким образом, минимизация каких-либо изменений третичной структуры и функции каждого домена. Не желая быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что отсутствие нарушения четырех центральных аминокислотных остатков 3₁₀-спирали в химере BoNT/AB обеспечивает оптимальную конформацию для химерного нейротоксина, что, таким образом, позволяет химерному нейротоксину выполнять свои функции в полной мере.

Фактически, неожиданно, сохранение исключительно первого аминокислотного остатка 3₁₀-спирали BoNT/A и второго аминокислотного остатка 3₁₀-спирали, начиная с BoNT/B, не только делает возможной продукцию растворимой и функциональной химеры BoNT/AB, но дополнительно приводит к улучшенным свойствам по сравнению с другими химерами BoNT/AB, в частности, повышенной активности, повышенной коэффициент безопасности и/или большей длительности действия (а также повышенному коэффициенту безопасности и/или длительности действия по сравнению с немодифицированным BoNT/A).

Домен LH_N из BoNT/A может соответствовать аминокислотным остаткам 1-872 SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении нее. Домен LH_N из BoNT/A может соответствовать аминокислотным остаткам 1-872 SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 90% или 95% идентичности последовательности в отношении нее. Предпочтительно, домен LH_N из BoNT/A соответствует аминокислотным остаткам 1-872 SEQ ID NO: 2.

Домен H_C из BoNT/B может соответствовать аминокислотным остаткам 860-1291 SEQ ID NO: 16 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении нее. Домен H_C из BoNT/B может соответствовать аминокислотным остаткам 860-1291 SEQ ID NO: 16 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 90% или 95% идентичности последовательности в отношении нее. Предпочтительно, домен H_C из BoNT/B соответствует аминокислотным остаткам 860-1291 SEQ ID NO: 16.

Предпочтительно, химера BoNT/AB содержит домен LH_N BoNT/A1 и домен H_C BoNT/B1. Более предпочтительно, домен LH_N соответствует аминокислотным остаткам 1-872 BoNT/A1 (SEQ ID NO: 2), и домен H_C соответствует аминокислотным остаткам 860-1291 BoNT/B1 (SEQ ID NO: 16).

Предпочтительно, домен H_C BoNT/B дополнительно содержит по меньшей мере одну замену, добавление или делецию аминокислотного остатка в поддомене H_CC, обладающую эффектом повышения аффинности связывания нейротоксина BoNT/B с Syt II человека по сравнению с последовательностью природного BoNT/B. Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в поддомене H_CC BoNT/B описана в WO2013/180799 и WO2016/154534 (включенных в настоящее описание в качестве ссылки).

Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в поддомене H_CC BoNT/B включают мутации-замены, выбранные из группы, состоящей из: V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

Подходящие замены, добавления или делеции аминокислотного остатка в поддомене H_CC BoNT/B дополнительно включают комбинации двух мутаций-замен, выбранных из группы, состоящей из: E1191M и S1199L, E1191M и S1199Y, E1191M и S1199F, E1191Q и S1199L, E1191Q и S1199Y, E1191Q и S1199F, E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W, E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y или E1191V и W1178Q.

Подходящие замены, добавления или делеции аминокислотного остатка в поддомене H_CC BoNT/B также включают комбинацию трех мутаций-замен, представляющих собой E1191M, S1199W и W1178Q.

Предпочтительно, подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в поддомене H_CC BoNT/B включает комбинацию двух мутаций-замен, представляющих собой E1191M и S1199Y. Такие модификации присутствуют в химерах BoNT/AB SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.

Модификация может являться модификацией по сравнению с немодифицированным BoNT/B, приведенным как SEQ ID NO: 16, где нумерацию аминокислотного остатка определяют посредством выравнивания с SEQ ID NO: 16. Т.к. наличие остатка метионина в положении 1 SEQ ID NO: 16 (а также SEQ ID NO, соответствующих модифицированным полипептидам BoNT/A, представленным в настоящем описании) является необязательным, специалист в этой области будет учитывать наличие/отсутствие остатка метионина при определении нумерации аминокислотного остатка. Например, если SEQ ID NO: 16 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, E1191 будет E1191 SEQ ID NO: 16). Альтернативно, если метионин в SEQ ID NO: 16 отсутствует, нумерацию аминокислотных остатков следует модифицировать на -1 (например, E1191 будет E1190 SEQ ID NO: 16). Схожие соображения используют, если метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, представленных в настоящем описании, присутствует/отсутствует, и специалист в этой области легко определит корректную нумерацию аминокислотных остатков рутинными в этой области способами.

Модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может содержать полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 11-15. Например, полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичности последовательности в отношении полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 11-15. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может содержать (более предпочтительно - состоять из) полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11-15.

Если модифицированный BoNT/A является химерой BoNT/AB, предпочтительно, чтобы модифицированный BoNT/A содержал полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 14. Например, полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может содержать (более предпочтительно - состоять из) SEQ ID NO: 14.

В этой области известны способы модификации белков посредством замен, инсерций или делеций аминокислотных остатков. В качестве примера, модификации аминокислот можно вносить посредством модификации последовательности ДНК, кодирующей BoNT/A (например, кодирующей немодифицированный BoNT/A). Этого можно достигать стандартными способами молекулярного клонирования, например, посредством сайт-специфического мутагенеза, когда короткие цепи ДНК (олигонуклеотиды), кодирующие желаемые аминокислоты, используют для замены исходной кодирующей последовательности с использованием фермента полимеразы, или посредством инсерции/делеции частей гена с помощью различных ферментов (например, лигаз и рестрикционные эндонуклеазы). Альтернативно, модифицированную последовательность гена можно синтезировать химически.

Как указано выше, модифицированный BoNT/A, представленный в настоящем описании, имеет свойства повышенного удержания в ткани, что также обеспечивает повышенную активность и/или длительность действия и может позволить вводить повышенные дозы без каких-либо дополнительных отрицательных эффектов. Одним из способов, которым эти благоприятные свойства (представляющие собой повышение терапевтического индекса) можно определять, являются термины коэффициента безопасности модифицированного BoNT/A. В связи с этим, нежелательные эффекты клостридиального токсина (вызванные диффузией токсина из участка введения) можно оценивать экспериментально, измеряя процент потери массы тела в соответствующей модели на животных (например, мышь, потерю массы тела определяют в течение семи дней от введения). И наоборот, желаемые целевые эффекты клостридиального токсина можно оценивать экспериментально с помощью анализа по шкале отведения пальцев (DAS), измерения паралича мышц. Анализ DAS можно осуществлять посредством инъекции 20 мкл клостридиального токсина, составленного в фосфатном буфере с желатином, в икроножный/камбаловидный комплекс мыши с последующей оценкой по шкале отведения пальцев способом Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001). В анализе DAS, мышей ненадолго подвешивают за хвост для вызывания характерного четверохолмного рефлекса, при котором мышь вытягивает свои задние конечности и отводит пальцы на задних конечностях. После инъекции клостридиального токсина различные степени отведения пальцев оценивают по пятибалльной шкале (от 0=норма до 4=максимальное уменьшение отведение пальцев и вытягивания задних конечностей).

Затем коэффициент безопасности модифицированного BoNT/A по изобретению (или немодифицированного BoNT/A для сравнения) можно выражать как соотношение между количеством токсина, необходимым для 10%-ного снижения массы тела (измеряемого как пиковый эффект в первые семь дней после введения мыши), и количеством токсина, необходимым для достижения баллов DAS 2. Таким образом, высокие баллы коэффициента безопасности являются желательными и свидетельствуют, что токсин может эффективно парализовать целевую мышцу с небольшими нежелательными нецелевыми эффектами. Модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности выше коэффициента безопасности эквивалентного немодифицированного (нативного) BoNT/A.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности более 7 (например, по меньшей мере 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50), где коэффициент безопасности вычисляют следующим образом: доза токсина, необходимая для изменения массы тела -10% (пг/мышь), разделенная на DAS ED₅₀ (пг/мышь) [ED₅₀=доза, необходимая для достижения баллов DAS 2].

В одном из вариантов осуществления модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности по меньшей мере 10. В одном из вариантов осуществления модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности по меньшей мере 15.

Предпочтительно, если модифицированный BoNT/A является BoNT/A, содержащим один или более аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, как представлено в настоящем описании, указанный модифицированный BoNT/A имеет коэффициент безопасности по меньшей мере 20, более предпочтительно - по меньшей мере 22 (например, 23-25).

Предпочтительно, если модифицированный BoNT/A является BoNT/A, содержащим легкую цепь и транслокационный домен BoNT/A и домен H_C BoNT/B, модифицированный BoNT/A имеет коэффициент безопасности по меньшей мере 10, более предпочтительно - по меньшей мере 12 (например, 14-15).

Фактически, модифицированный BoNT/A по изобретению находится в форме двойной цепи.

Модифицированный BoNT/A, предпочтительно, находится в некомплексированной форме (т.е. не содержит комплексообразующих белков, присутствующих в природном BoNT/A). Примеры таких комплексообразующих белков включают нейротоксин-ассоциированные белки (NAP) и нетоксичный-негемагглютининовый компонент (NTNH). Предпочтительно, модифицированный BoNT/A является рекомбинантным модифицированным BoNT/A.

Модифицированный BoNT/A можно получать способом получения одноцепочечного модифицированного BoNT/A, имеющего легкую цепь и тяжелую цепь, включающим экспрессию нуклеиновой кислотой (такой, как описано выше) в подходящей клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина для получения гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный модифицированный BoNT/A и выделение одноцепочечного модифицированного BoNT/A. Затем модифицированный BoNT/A можно активировать способом, включающим получение одноцепочечного белка модифицированного BoNT/A, который можно получать способом получения одноцепочечного модифицированного BoNT/A, как описано выше, приведение модифицированного BoNT/A в контакт с протеазой, расщепляющей полипептид по участку распознавания (участку расщепления), локализованному между легкой цепью и тяжелой цепью, и, таким образом, превращение полипептида в двухцепочечный модифицированный BoNT/A, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены дисульфидной связью.

Модифицированный BoNT/A по изобретению можно составлять любым подходящим способом для введения индивидууму, например, как часть фармацевтической композиции. Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей модифицированный BoNT/A по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, вспомогательное вещество и/или соль.

В одном из аспектов изобретение относится к единичной лекарственной форме модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), содержащей:

a. от 1 единицы до 41 единиц (от 2 единиц до 41 единицы) модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей; или

b. от 8,4 пг до 350 пг (от 18 пг до 350 пг) модифицированного BoNT/A; и

c. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, вспомогательное вещество и/или соль,

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к единичной лекарственной форме, содержащей:

a. от 1 единицы до 35 единиц модифицированного BoNT/A; или

b. от 10 пг до 300 пг модифицированного BoNT/A.

a. от 2 единиц до 41 единицы модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей; или

b. от 18 пг до 350 пг модифицированного BoNT/A; и

c. необязательно фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, вспомогательное вещество и/или соль,

a. от 0,5 единиц до 73 единиц модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее вычисленной медианной летальной дозе (LD₅₀) у мышей; или

b. от 12 пг до 1754 пг модифицированного BoNT/A; и

Изобретение относится к единичной лекарственной форме, содержащей:

a. от 0,8 единиц до 62 единиц модифицированного BoNT/A; или

b. от 20 пг до 1500 пг модифицированного BoNT/A.

Единичная лекарственная форма может содержать от 6 единиц до 35 единиц, от 12 единиц до 35 единиц, от 12 единиц до 24 единиц, предпочтительно - от 12 единиц до 18 единиц модифицированного BoNT/A.

Единичная лекарственная форма может содержать от 50 пг до 300 пг, от 100 до 300 пг, от 100 до 200 пг, предпочтительно - от 100 до 150 пг модифицированного BoNT/A.

Набор, содержащий:

a. единичную лекарственную форму, определенную выше; и

b. инструкции по его использованию в лечении морщин на лице; и

c. необязательно, разбавитель.

Варианты осуществления, относящиеся к разному терапевтическому применению по изобретению, можно использовать в отношении способов, композиций (например, единичных лекарственных форм) и наборов по изобретению, и наоборот.

ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Для определения процента идентичности можно использовать любые из способов выравнивания последовательностей, включая, в качестве неограничивающих примеров, глобальные способы, локальные способы и гибридные способы, такие как, например, способы сегментного подхода. Способы определения процента идентичности являются рутинными способами для специалиста в этой области. Глобальными способами выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют лучшее выравнивание, складывая баллы отдельных пар остатков и накладывая штрафы за пропуски. Неограничивающие способы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996). Локальными способами выравнивают последовательности, идентифицируя один или более консервативных мотивов, общих для всех вводных последовательностей. Неограничивающие способы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); семплирование по Гиббсу, см., например, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).

Таким образом, процент идентичности последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. В кратком изложении, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации баллов выравнивания с использованием штрафа за открытие пропуска 10, штрафа за увеличение пропуска 1, и матрицу замен "blosum 62" из Henikoff and Henikoff (выше), как показано ниже (аминокислоты указаны с помощью стандартного однобуквенного кода).

"Процент идентичности последовательности" между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности можно вычислять как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, разделенное на общее количество нуклеотидов/аминокислоты и умноженное на 100. При вычислении % идентичности последовательности также можно учитывать количество пропусков и длину каждого пропуска, который необходимо включать для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнения последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями можно осуществлять с использованием конкретных математических алгоритмов, таких как BLAST, известных специалисту в этой области.

ALIGNMENT SCORES FOR DETERMINING ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ IDENTITY

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V

A 4

R -1 5

N -2 0 6

D -2 -2 1 6

C 0 -3 -3 -3 9

Q -1 1 0 0 -3 5

E -1 0 0 2 -4 2 5

G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6

H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8

I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4

L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4

K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5

M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5

F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6

P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7

S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4

T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5

W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11

Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7

V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4

Затем процент идентичности вычисляют следующим образом:

По существу гомологичные полипептиды характеризуют как имеющие одну или более аминокислот, делеций или добавлений замен. Эти изменения, предпочтительно, носят второстепенный характер, являясь консервативными аминокислотными заменами (см. ниже) и другими заменами, значимо не влияющими на фолдинг или активность полипептида; небольшими делециями, как правило, от одной до приблизительно 30 аминокислот; и небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как амино-концевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до приблизительно 20-25 остатков или аффинная метка.

КОНСЕРВАТИВНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ

Основные	аргинин
	лизин
	гистидин
Кислые	глутаминовая кислота
Кислые	аспарагиновая кислота
Полярные	глутамин
Полярные	аспарагин
Гидрофобные	лейцин
	изолейцин
	валин
Ароматические	фенилаланин
	триптофан
	тирозин
Небольшие	глицин
	аланин
	серин
	треонин
	метионин

В дополнение к 20 стандартным аминокислотам, аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению можно заменять нестандартными аминокислотами (такими как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин). Аминокислотные остатки полипептид можно заменять ограниченным количеством неконсервативных аминокислот, аминокислот, некодируемых генетическим кодом, и неприродных аминокислот. Полипептиды по настоящему изобретению также могут содержать неприродные аминокислотные остатки.

Неприродные аминокислоты включают, в качестве неограничивающих примеров, транс-3-метилпролин, 2,4-метано-пролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В этой области известно несколько способов включения неприродных аминокислотных остатков в белки. Например, можно использовать систему in vitro, где нонсенс-мутации супрессируют с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. В этой области известны способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации осуществляют в бесклеточной системе, содержащей экстракт S30 E. coli и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают посредством хроматографии. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993. Во втором способе, трансляцию осуществляют в ооцитах шпорцевой лягушки посредством микроинъекции мутантной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В третьем способе клетки E. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, подлежащей замене (например, фенилаланина), и в присутствии желаемых неприродных аминокислот (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Неприродную аминокислоту встраивают в полипептид вместо его природного эквивалента. См., Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Природные аминокислотные остатки можно превращать в неприродные посредством химической модификации in vitro. Химическую модификацию можно комбинировать с сайт-специфическим мутагенеза для дополнительного расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

Аминокислотные остатки полипептидов по настоящему изобретению можно заменять ограниченным количеством неконсервативных аминокислот, аминокислот, некодируемых генетическим кодом, невстречающихся в природе аминокислот и неприродных аминокислот.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению можно идентифицировать известными в этой области способами, такими как сайт-специфический мутагенез или мутагенез со сканированием аланином (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Участки биологического взаимодействия также можно определять посредством физического анализа структуры, что определяют такими способами, как ядерно-магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в комбинации с мутацией предполагаемых аминокислот участка контакта. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть очевидна из анализа гомологии с родственными компонентами (например, транслокационными или протеазными компонентами) полипептидов по настоящему изобретению.

Множество замен аминокислот можно осуществлять и тестировать известными способами мутагенеза и скрининга, такими как описанные Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). В кратком изложении, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, селекции функционального полипептида, а затем секвенирования подвергнутых мутагенезу полипептидов для определения спектра осуществимых замен в каждом положении. Другие способы, которые можно использовать, включают фаговый дисплей (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США № 5223409; Huse, публикация WIPO № WO 92/06204) и нацеленный на область мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, общепринято понятное специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) приведены общие словари многих из терминов, используемых в настоящем описании.

Настоящее изобретение не ограничено примерами способов и материалов, представленными в настоящем описании, и в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, схожие или эквивалентные представленным в настоящем описании. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иначе, любые последовательности нуклеиновой кислоты написаны слева направо в ориентации 5'-3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от амино- к карбокси-концу, соответственно.

Заголовки, приведенные в настоящем описании, не ограничивают различные аспекты или варианты осуществления настоящего изобретения.

Аминокислоты обозначают в настоящем описании с использованием названия аминокислоты, трехбуквенного сокращения или однобуквенного сокращения. В рамках изобретения термин "белок" включает белки, полипептиды и пептиды. В рамках изобретения термин "аминокислотная последовательность" синонимичен термину "полипептид" и/или термину "белок". В некоторых случаях термин "аминокислотная последовательность" синонимичен термину "пептид". В некоторых случаях термин "аминокислотная последовательность" синонимичен термину "фермент". Термины "белок" и "полипептид" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. В настоящем описании и формуле изобретения, можно использовать общепринятые однобуквенные и трехбуквенные коды аминокислотных остатков. 3-буквенный код для аминокислоты определен в соответствии с требованиями Объединенной комиссии по биохимической номенклатуре (JCBN) IUPACIUB. Также следует понимать, что полипептид может быть закодирован более чем одной нуклеотидной последовательностью из-за вырожденности генетического кода.

На всем протяжении настоящего описания могут встречаться другие определения терминов. Перед более подробным описанием примеров вариантов осуществления, следует понимать, что настоящее описание не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления и, в связи с этим, может варьироваться. также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления, а не для ограничения, т.к. объем настоящего изобретения будет определен исключительно формулой изобретения.

Если приведен диапазон значений, следует понимать, что также конкретно описано каждое промежуточное значение до десятой доли нижнего предела, если контекст четко не указывает на иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона. Каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим указанным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне включен в настоящее изобретение. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены или исключены из диапазона, и каждый диапазон, в котором любой, никакой или оба предела включены в меньшие диапазоны, также включен в настоящее изобретение с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в настоящее изобретение.

Необходимо отметить, что в рамках изобретения и в формуле изобретения термины в единственном числе включают ссылку на множественное, если контекст четко не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на "ботулинический нейротоксин A" включает множество таких средств-кандидатов, и ссылка на "ботулинический нейротоксин A" включает ссылку на один или более клостридиальных нейротоксинов и их эквивалентов, известных специалистам в этой области, и т.д.

Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, приведены исключительно по их описанию до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не следует истолковывать как в качестве признания того, что такие публикации представляют собой предшествующий уровень техники относительно прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Варианты осуществления изобретения далее будут описаны исключительно в качестве примера со ссылкой на следующие фигуры и примеры.

На фигуре 1 показаны одобренные FDA дозы Dysport^® для лечения морщин на лице у взрослых.

На фигуре 2 показан гель с изоэлектрофокусированием (IEF) катионных конструкций.

На фигуре 3 показан процент расщепления SNAP-25 в эмбриональных нейронах спинного мозга (eSCN) крысы в случае Cat5v2(K1064H/N954K) (A), Cat5v2(K1064H/N886K) (B) и Cat5v2(K1064H/N1025K) (C), и суммарная pEC₅₀ относительно nBoNT/A1. (A, B, C) Эмбриональные нейроны спинного мозга крысы культивировали в течение трех недель и обрабатывали Cat5v4 в течение 24 ч. перед вестерн-блоттингом с SNAP-25-специфическим антителом. Данные представляют собой среднее значение ± SEM для трех независимых экспериментов в трех параллелях. (D) Относительная активность Cat5v2(K1064H/N886K), Cat5v2(K1064H/N954K) и Cat5v2(K1064H/ N1025K) в отношении nBoNT/A1 (List Biological Laboratories) в анализе активности расщепления SNAP-25 eSCN крысы. Каждая точка соответствует отдельной партии и представляет собой среднее значение для 3 независимых определений pEC₅₀ на основе 8-точечной кривой концентрация-ответ (CRC). Каждую концентрацию в CRC оценивали в трех параллелях. Сравнения активности проводили относительно среднего значения указанных партий, объединенные данные n=24. Данные представляют собой среднее значение ± SEM n=3 партий на Cat5v4.

На фигуре 4 показана активность (t₅₀) nBoNT/A1 и Cat5v4 в анализе диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD). Ткань диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши инкубировали с Cat5v4 или нативным BoNT/A1, как указано. Сократительную способность диафрагмы регистрировали, пока сокращение не становилось недектируемым или через 140 минут. Каждая точка соответствует независимому определению. Значение t₅₀ представляет собой время, необходимое для ингибирования сократительной способности купола диафрагмы мыши на 50%.

На фигуре 5 показан ПААГ с SDS очищенной рекомбинантной химеры BoNT/AB 1, 2 и 3A (SEQ ID NO: 11, 12 и 13 соответственно). Дорожки помечены как "маркер" (маркер молекулярной массы), "-DTT" (образец окисленной химеры BoNT/AB) и "+DTT" (образец восстановленной химеры BoNT/AB).

На фигуре 6 показано расщепление SNAP-25 в нейронах спинного мозга крысы рекомбинантной химерой BoNT/AB 1, 2 и 3A (SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно). Культивируемые первичные нейроны спинного мозга (SCN) крысы подвергали воздействию различных концентраций рекомбинантной химеры BoNT/AB 1, 2 или 3A в течение 24 часов при 37°C во влажной камере с 10% CO₂. Затем клетки лизировали 1-кратным буфером NuPAGE, дополненным DTT и бензоназой. Образцы переносили в микроцентрифужные пробирки, нагревали в течение 5 мин при 90°C на термоблоке и хранили при -20°C перед анализом расщепления SNAP-25 посредством вестерн-блоттинга. SNAP-25 определяли с использованием поликлонального антитела, определяющего полноразмерную и расщепленную формы SNAP-25 (Sigma, кат. №S9684). HRP-конъюгированное антитело против кролика (Sigma, кат. №A6154) использовали в качестве вторичного антитела.

На фигуре 7 показан анализ отведения пальцев мышами. Мышам делали инъекцию в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса одной задней конечности под кратковременным общим наркозом; ослабление мышц измеряли по шкале 0-4 с использованием баллов отведения пальцев (DAS). Максимальные значения DAS определяли для каждой дозы, строили график относительно дозы и аппроксимировали данные к 4-параметрическому логистическому уравнению, определяли значения ED₅₀ и дозы, приводящей к DAS 4 (дозы DAS 4).

На фигуре 8 показан электрофорез в ПААГ с SDS очищенной рекомбинантной химеры BoNT/AB 3B и 3C (SEQ ID NO: 14 и 15, соответственно). Дорожки помечены как "маркер" (маркер молекулярной массы), "-DTT" (образец окисленной химеры BoNT/AB) и "+DTT" (образец восстановленной химеры BoNT/AB).

На фигуре 9 показано расщепление SNAP-25 немодифицированным BoNT/A и химерой BoNT/AB 3B и 3C (SEQ ID NO: 2, 14 и 15, соответственно) в периферических человек нейронах человека, полученных из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (PERI.4U - Axiogenesis, Germany). Клетки PERI.4U подвергали воздействию различных концентраций рекомбинантного BoNT/A или химеры BoNT/AB 3B или 3C в течение 24 часов при 37°C во влажной камере, содержащей 5% CO₂. Затем клетки лизировали с помощью 1-однократного буфера NuPAGE, дополненного DTT и бензоназой. Образцы переносили в микроцентрифужные пробирки, нагревали в течение 5 мин при 90°C на термоблоке и хранили при -20°C перед анализом расщепления SNAP-25 посредством вестерн-блоттинга. SNAP-25 определяли с использованием поликлонального антитела, определяющего полноразмерную и расщепленную формы SNAP-25 (Sigma, кат. №S9684). HRP-конъюгированное антитело против кролика (Sigma, кат. №A6154) использовали в качестве вторичного антитела.

На фигуре 10 показана длительности ослабления мышц с течением времени в анализе отведения пальцев мыши. Мышам делали инъекцию в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса одной задней конечности под кратковременным общим наркозом; ослабление мышц измеряли по шкале 0-4 с использованием баллов отведения пальцев (DAS). Животных из группы, которой инъецировали наименьшую дозу, индуцирующую DAS 4 в течение первых четырех дней после инъекции, подвергали мониторингу до полного восстановления слабости мышц до DAS 0 (отсутствие наблюдаемой слабости мышц).

На фигуре 11 показаны места инъекций для внутримышечного введения модифицированного BoNT/A при лечении межбровных морщин.

На фигуре 12 показаны места инъекций для внутримышечного введения модифицированного BoNT/A при лечении межбровных морщин и лобных морщин.

На фигуре 13 показаны места инъекций ля внутримышечного введения модифицированного BoNT/A при лечении только боковых периорбитальных морщин.

На фигуре 14 показаны места инъекций для внутримышечного введения модифицированного BoNT/A при лечении межбровных морщин, лобных морщин и боковых периорбитальных морщин.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Если в любой из следующих SEQ ID NO указан начальный аминокислотный остаток Met или соответствующий начальный кодон, указанный остаток/кодон является необязательным.

SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность немодифицированного BoNT/A)

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO: 2 (полипептидная последовательность немодифицированного BoNT/A)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 3 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-A")

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO: 4 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-A")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 5 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-B")

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAaTCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAAGAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO: 6 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-B")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFKKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 7 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-C")

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAAGAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO: 8 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-C")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLKKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 9 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-D")

ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAaGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCaAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAaTTGCTGATaTTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCaATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGTCGTGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG

SEQ ID NO: 10 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Cat-D")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 11 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Химера 1")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 12 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Химера 2")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIIELGGGGSELSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 13 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Химера 3A")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 14 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Химера 3B")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

SEQ ID NO: 15 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A "Химера 3C")

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

SEQ ID NO: 16 (полипептидная последовательность BoNT/B)

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Клонирование, экспрессия и очистка

Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 2), подвергали мутагенезу для встраивания следующих замен для получения четырех конструкций, приведенных в таблице 1 ниже:

Конструкция	Мутации	Нуклеотидная последовательность	Полипептидная последовательность
Cat-A	N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N886K	3	4
Cat-B	N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N954K	5	6
Cat-C	N930K, S955K, Q991K, N1026K, N1052K, Q1229K, N1025K	7	8
Cat-D*	N1188R, D1213R, G1215R, N1216R, N1242R, N1243R, S1274R, T1277R	9	10

Таблица 1. Конструкции.

*Cat-D имела вычисленную pI 7,45 и молекулярную массу 149859.

Конструкции ДНК, кодирующие указанные выше молекулы модифицированного BoNT/A, синтезировали, клонировали в экспрессирующий вектор pJ401, а затем с их помощью трансформировали E. coli BL21 (DE3). Это делало возможной гиперэкспрессию растворимых рекомбинантных белков Cat-A, Cat-B, Cat-C и Cat-D в E. coli BL21 (DE3).

Рекомбинантные модифицированные BoNT очищали из лизатов E. coli общепринятыми способами хроматографии. Использовали начальную стадию очистки с использованием катионообменной смолы с последующей промежуточной стадии очистки с использованием смолы для гидрофобных взаимодействий. Затем одноцепочечный рекомбинантный модифицированный BoNT расщепляли посредством протеолиза, получая активированный двухцепочечный модифицированный BoNT. Затем использовали конечную стадию очистки для удаления оставшихся примесей. Подходящие способы описаны в WO2015/166242, WO2017055274A1, EP2524963B1, EP2677029B1 и US10087432B2.

ПРИМЕР 2

Характеризация очищенного модифицированного BoNT/A

Модифицированные BoNT, описанные в примере 1 выше, охарактеризовывали экспериментально следующим образом.

Измерение pI показало, что модифицированные BoNT имели изоэлектрическую точку выше таковой у немодифицированного (нативного) BoNT/A1 - см. фигуру 2 и таблицу 2 ниже.

Молекула BoNT/A1	pI (вычисленная)	pI (наблюдаемая)
Модифицированный, "Cat-A" [Cat5v2(K1064H/N886K] (SEQ ID NO: 4)	6,9	~8,0
Модифицированный, "Cat-B" [Cat5v2(K1064/N954K)] (SEQ ID NO: 6)	6,9	~8,0
Модифицированный, "Cat-C" [Cat5v2(K1064H/N1025K)] (SEQ ID NO: 8)	6,9	7,8-8,0
Нативный BoNT/A1 [rBoNT/A1] (SEQ ID NO: 2)	6,05	~7,4

Таблица 2. Значения pI модифицированного BoNT/A.

Способность модифицированных BoNT проникать в нейроны и расщеплять SNAP-25 (мишень BoNT/A1) оценивали с использованием эмбриональных нейронов спинного мозга крысы (eSCN). На фигуре 3 показано, что модифицированные BoNT сохраняли ту же способность проникать в нейрон и расщеплять SNAP-25, что и нативный BoNT/A1.

Активность модифицированных BoNT дополнительно оценивали с использованием анализ диафрагмального нерва и купола диафрагмы мыши (mPNHD). На фигуре 4 показано, что модифицированные BoNT сохраняли ту же способность ингибировать сократительную способность диафрагмы мыши, что и нативный BoNT/A1.

Анализ отведения пальцев (DAS) мыши in vivo использовали для оценки активности, а также безопасности относительно нативного BoNT/A1. Обе молекулы (Cat-A [SEQ ID NO: 4] и Cat-B [SEQ ID NO: 6]) демонстрировали более высокий коэффициент безопасности, чем нативный BoNT/A1, и были немного более активными. Эти данные приведены в таблице 3 ниже:

Молекула	DAS ED₅₀ (пг/мышь)	Доза DAS 4 (пг/мышь)	Доза для ΔBW -10% (пг/мышь)	Коэффициент безопасности
Нативный BoNT/A1 (n=5) (SEQ ID NO: 2)	2	10-20	9,9-14,5	7
Модифицированный, "Cat-A" (SEQ ID NO: 4)	1,16	10-20	27,4	24
Модифицированный, "Cat-B" (SEQ ID NO: 6)	1,79	25	47,6	27

Таблица 3. Анализ DAS и коэффициент безопасности.

-DAS ED₅₀: Вычисленная доза, индуцирующая DAS 2

- Доза DAS 4: Экспериментальная доза, индуцирующая DAS 4

- BW: Масса тела

- Доза для ΔBW -10%: Вычисленная доза, индуцирующая снижение BW на 10% по сравнению с BW в D0

- Коэффициент безопасности: Доза для ΔBW -10%/DAS ED₅₀

Коэффициент безопасности является мерой отрицательного эффекта введения BoNT (потери массы) относительно активности (полумаксимальные баллы отведения пальцев (DAS)). Его вычисляют как соотношение между массой тела (BW) -10% и DAS ED₅₀, где обозначение "BW -10%" относится к количеству BoNT (пг/животное), необходимому для 10%-ного снижения массы тела, и обозначение "ED₅₀" относится к количеству BoNT (пг/животное), которое будет приводить к DAS 2.

Анализ DAS осуществляют посредством инъекции 20 мкл модифицированного BoNT/A, составленного в фосфатном буфере с желатином, в икроножно-камбаловидный комплекс мыши с последующей оценкой отведения пальцев, как описано ранее Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001).

ПРИМЕР 3

Клонирование, экспрессия и очистка химер BoNT/AB

Химерные конструкции BoNT/AB 1, 2, 3A, 3B и 3C (SEQ ID NO: 11-15, соответственно) конструировали из ДНК, кодирующей молекулу родительского серотипа, и подходящих олигонуклеотидов стандартными способами молекулярной биологии. Затем их клонировали в экспрессирующий вектор pJ401 с C-концевой His₁₀-меткой или без нее и с помощью них трансформировали клетки E. coli BLR (DE3) для гиперэкспрессии. Эти клетки выращивали при 37°C с встряхиванием при 225 об./мин. в 2-литровых конических колбах с дефлекторами, содержащих 1 л модифицированного Terrific Broth (mTB), дополненного подходящим антибиотиком. После достижения A₆₀₀>0,5 температуру инкубатора снижали до 16°C, а затем, через час проводили индукцию с помощью 1 мМ IPTG в течение 20 ч. с встряхиванием при 225 об./мин. для экспрессии конструкции рекомбинантного BoNT/AB.

Собранные клетки лизировали посредством обработки ультразвуком и очищали посредством центрифугирования при 4500 об./мин. в течение 1 ч. при 4°C. Затем химерные молекулы рекомбинантного BoNT/AB выделяли в сульфат аммония и очищали посредством стандартной жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC). Она включала использование смолы для гидрофобных взаимодействий для захвата и анионообменной смолы для промежуточной стадии очистки. Затем частично очищенные молекулы протеолитически расщепляли эндопептидазой Lys-C для получения активной двойной цепи. Их дополнительно очищали с помощью второй смолы для гидрофобных взаимодействий для получения конечной химеры BoNT/AB.

В случае химерных молекул BoNT/AB с декагистидиновой меткой (H₁₀) (химера 1, 2, 3A) на стадии захвата использовали смолу с иммобилизованным никелем вместо смолы для гидрофобных взаимодействий.

Последовательность каждой химеры приведена в таблице 4.

Молекула	SEQ ID NO	Последовательность
Химера 1	11	A1:1-871+B1:858-1291 (E1191M/S1199Y) + His₁₀-tag
Химера 2	12	A1:1-874+ELGGGGSEL+B1:858-1291 (E1191M/S1199Y) + His₁₀-tag
Химера 3A	13	A1:1-872+B1: 860-1291 (E1191M/S1199Y) + His₁₀-tag
Химера 3B	14	A1:1-872+B1: 860-1291 (E1191M/S1199Y)
Химера 3C	15	A1:1-872+B1: 860-1291

Таблица 4 - Конструкции химерного BoNT/AB

ПРИМЕР 4

Сравнение химер BoNT/AB 1, 2 и 3A

Химеры BoNT/AB 1, 2 и 3A, имеющие C-концевую His₁₀-метку и двойную мутацию E1191M/S1199Y, очищали, как описано в примере 3 (фигура 5), и тестировали на функциональную активность.

АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ SNAP-25 В НЕЙРОНАХ СПИННОГО МОЗГА КРЫСЫ

Первичные культуры нейронов спинного мозга (SCN) крысы получали и выращивали в течение 3 недель в 96-луночных планшетах для культивирования тканей (как описано в Masuyeret al., 2011, J. Struct. Biol. Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B; и Chaddocket al., 2002, Protein Expr. Purif. Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A). Серийные разведения BoNT/AB получали в питательной среде SCN. Среду для выращивания из лунок, подлежащих обработке, собирали и фильтровали (фильтр 0,2 мкм). 125 мкл отфильтрованной среды добавляли обратно в каждую тестовую лунку. Затем 125 мкл разведенного токсина добавляли на планшет (лунки в трех параллелях). Обработанные клетки инкубировали при 37°C, 10% CO₂, в течение 24 ± 1 ч.).

Анализ активности BoNT с использованием анализа расщепления SNAP-25

После обработки BoNT удаляли и клетки однократно промывали PBS (Gibco, UK). Клетки лизировали в 1-кратном лизирующем буфере NuPAGE (Life Technologies), дополненном 0,1 M дитиотреитолом (DTT) и 250 единиц/мл бензоназы (Sigma). Белки лизата разделяли с помощью электрофореза в ПААГ с SDS и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны анализировали с помощью первичного антитела против SNAP-25 (Sigma, кат. №S9684), распознающего нерасщепленный SNAP-25, а также SNAP-25, расщепленный эндопептидазой BoNT/A. Используемым вторичным антителом являлось HRP-конъюгированный IgG против кролика (Sigma, кат. №A6154). Полосы определяли с помощью усиленной хемилюминесценции и визуализировали с использованием pXi6 Access (Synoptics, UK). Интенсивность полос определяли с использованием программного обеспечения GeneTools (Syngene, Cambridge, UK) и вычисляли процент расщепленного SNAP-25 при каждой концентрации BoNT. Данные аппроксимировали к 4-параметрическому логистическому уравнению и вычисляли pEC₅₀ с использованием GraphPad Prism версии 6 (GraphPad).

В таблице 5 ниже приведены значения pEC_50, определенные для химер 1, 2 и 3A в анализе расщепления SNAP-25 в SCN крысы. Эти результаты свидетельствуют о том, что три химеры BoNT/AB сохраняли способность проникать в нейроны спинного мозга крысы и расщеплять свой целевой субстрат. Однако в этом анализе химера 3A являлась более активной, чем химера 1 и 2 (также см. фигуру 6).

	pEC₅₀ ±SEM
Химера 1	12,42 ±0,04
Химера 2	12,57 ±0,01
Химера 3A	12,89 ±0,04

Таблица 5. Значения pEC₅₀.

АНАЛИЗ ОТВЕДЕНИЯ ПАЛЬЦЕВ (DAS)

Способ измерения активности химеры BoNT/AB 1, 2 и 3A в анализе DAS основан на четверохолмном рефлексе с разведением пальцев у мышей, когда их кратковременно подвешивают за хвост. Этот рефлекс балльно оценивают по шкале отведения пальцев (DAS), и он ингибируется после введения BoNT в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса задней конечности. Мышей кратковременно подвешивают за хвост для вызывания характерного четверохолмного рефлекса, при котором животное вытягивает свои задние конечности и отводит пальцы (Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10).

В день инъекции мышей анестезировали в индукционной камере, подавая в нее изофлуран 3% в кислороде. Каждой мыши делали внутримышечную инъекцию химеры BoNT/AB или носителя (фосфатного буфера, содержащего 0,2% желатина) в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса правой задней конечности.

После инъекции нейротоксина различные степени отведения пальцев балльно оценивали по шкале от нуля до четырех, где 0=норма и 4=максимальное снижение отведения пальцев и вытягивания конечностей. ED₅₀ определяли посредством анализа нелинейной корректировки с использованием среднего значения максимального эффекта в каждой дозе. Используемой математической моделью являлась 4-параметрическая логистическая модель.

DAS осуществляли каждые 2 часа в течение первого дня после введения, затем 3 раза в день в течение 4 дней.

На фигуре 7 показаны аппроксимированные кривые для химер 1, 2 и 3A (SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно). Кривая для химеры 3A сдвинута влево, что означает, что при более низких дозах химеры 3A достигали схожего ответа DAS по сравнению с химерами 1 и 2, что, таким образом, свидетельствует о том, что химера 3A является более активной, чем другие в анализе DAS на мышах; также см. таблицу ниже (таблица 6), где приведены значения вычисленного ED₅₀ и доза, приводящая к DAS 4 (наибольшему баллу) для каждой химеры.

В таблице 6 ниже приведены ED₅₀ и дозы DAS 4, определенные для немодифицированного рекомбинантного BoNT/A1 (rBoNT/A1 - SEQ ID NO: 2) и химер 1, 2 и 3A в анализе DAS мыши. Эти результаты свидетельствуют о том, что из трех химер, химера 3A имеет наибольшую активность in vivo в индуцировании ослабления мышц. Исследования, показанные на фигуре 7 и в таблице 6, осуществляли у мышей, полученных Charles River Laboratories.

	ED₅₀(пг/мышь)	Доза DAS 4 (пг/мышь)
rBoNT/A1	1	5
Химера 1	23	200
Химера 2	89	>300
Химера 3A	18	133

Таблица 6. Значения ED₅₀.

ПРИМЕР 5

Сравнение химеры BoNT/AB 3B, 3C и немодифицированного BoNT/A1

Немеченые химеры BoNT/AB 3B и 3C, соответственно, с двойной мутацией E1191M/S1199Y и без нее (SEQ ID NO: 14 и 15) очищали, как описано в примере 3 (фигура 8), и тестировали на функциональную активность с использованием немодифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 2) в качестве референса.

АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ SNAP-25 В ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

Криоконсервированные клетки PERI.4U приобретали в Axiogenesis (Cologne, Germany). Размораживание и посев клеток осуществляли по инструкциям производителя. В кратком изложении, криопробирки, содержащие клетки, размораживали на водяной бане при 37°C в течение 2 минут. После осторожного ресуспендирования клетки переносили в пробирку 50 мл. Криопробирку промывали 1 мл среды для размораживания Peri.4U^®, поставляемой производителем, и покапельно переносили среду в суспензию клеток в пробирку 50 мл перед покапельным добавлением еще 2 мл среды для размораживания Peri.4U^® в пробирку 50 мл. Затем клетки подсчитывали с использованием гемоцитометра. Затем к суспензии клеток добавляли еще 6 мл среды для размораживания Peri.4U^®. Клеточный осадок получали посредством центрифугирования при 260×g (например, 1100 об./мин.) в течение 6 минут при комнатной температуре. Затем клетки ресуспендировали в полной среде для культивирования Peri.4U^®, поставляемой производителем. Клетки высевали с плотностью от 50000 до 150000 клеток/см² на планшеты для клеточных культур, покрытые поли-L-орнитином и ламинином. Клетки культивировали при 37°C во влажной камере с CO₂ и среду полностью меняли каждые 2-3 дня культивирования.

Для обработки токсином получали серийные разведения BoNT в среде для культивирования Peri.4U^®. Среду из лунок, подлежащих обработке, собирали и фильтровали (фильтр 0,2 мкм). 125 мкл отфильтрованной среды добавляли обратно в каждую тестовую лунку. Затем 125 мкл разбавленного токсина добавляли на планшет (лунки в трех параллелях). Обработанные клетки инкубировали при 37°C, 10% CO₂ в течение 48 ± 1 ч.

После обработки BoNT удаляли и клетки однократно промывали PBS (Gibco, UK). Клетки лизировали в 1-кратном лизирующем буфере NuPAGE (Life Technologies), дополненном 0,1 M дитиотреитолом (DTT) и 250 единиц/мл бензоназой (Sigma). Белки лизата разделяли посредством электрофореза в ПААГ с SDS и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны анализировали с помощью первичного антитела против SNAP-25 (Sigma, кат. №S9684), распознающего нерасщепленный SNAP-25, а также SNAP-25, расщепленный эндопептидазой BoNT/A. Используемым вторичным антителом являлось HRP-конъюгированный IgG против кролика (Sigma, кат. №A6154). Полосы определяли с помощью усиленной хемилюминесценции и визуализировали с использованием pXi6 Access (Synoptics, UK). Интенсивность полос определяли с использованием программного обеспечения GeneTools (Syngene, Cambridge, UK) и вычисляли процент расщепленного SNAP-25 при каждой концентрации BoNT. Данные аппроксимировали к 4-параметрическому логистическому уравнению и вычисляли pEC₅₀ с использованием GraphPad Prism версии 6 (GraphPad).

На фигуре 9 показано, что химеры 3B и 3C демонстрировали более высокую активность, чем rBoNT/A1, в расщеплении SNAP-25 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека, но первая химера - значимо больше. Это можно объяснить двойной мутацией, повышающей аффинность химеры 3B к рецептору белка синаптотагмина II человека, присутствующему в этих клетках (фигура 9, таблица 7).

	pEC₅₀ ±SEM
rBoNT/A1	10,21 ± 0,05
Химера 3B	12,38 ± 0,06
Химера 3C	10,72 ± 0,08

Таблица 7. Значения pEC₅₀.

АНАЛИЗ ОТВЕДЕНИЯ ПАЛЬЦЕВ (DAS) - КОЭФФИЦИЕНТ БЕЗОПАСНОСТИ

Способ измерения активности BoNT в анализе DAS основан на четверохолмном рефлексе с разведением пальцев у мышей, когда их кратковременно подвешивают за хвост. Этот рефлекс балльно оценивают по шкале отведения пальцев (DAS), и он ингибируется после введения BoNT в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса задней конечности. Мышей кратковременно подвешивают за хвост для вызывания характерного четверохолмного рефлекса, при котором животное вытягивает свои задние конечности и отводит пальцы (Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10).

В день инъекции мышей анестезировали в индукционной камере, подавая в нее изофлуран 3% в кислороде. Каждой мыши делали внутримышечную инъекцию BoNT или носителя (фосфатного буфера, содержащего 0,2% желатина) в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса правой задней конечности.

DAS осуществляли каждые 2 часа в течение первого дня после введения, затем 3 раза в день в течение 4 дней для всех доз. Затем животных из групп, которым инъецировали носитель и наименьшую дозу, индуцирующую DAS 4 в первые четыре дня после инъекции, подвергали мониторингу до полного восстановления слабости мышц до DAS 0 (отсутствие наблюдаемой слабости мышц).

Для вычисления коэффициента безопасности всех животных взвешивали за день до инъекции токсина (D0), а затем раз в сутки на всем протяжении исследования. Среднюю массу тела, ее стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего вычисляли ежедневно для группы каждой дозы. Для получения коэффициента безопасности BoNT (-10% ΔBW/ED₅₀) дозу, при которой в любое время в течение исследования средняя масса для группы была ниже на 10% средней массы в D0 в той же группе, разделяли на ED₅₀ исследуемого BoNT. Летальную дозу определяли как дозу, при которой погибало одно или более животных в группе.

На фигуре 10 показана длительность ослабления мышц с течением времени в анализе отведения пальцев у мышей для немодифицированного BoNT/A, химеры 3B и химеры 3C (SEQ ID NO: 2, 14 и 15), свидетельствующая о том, что химера имела более высокую длительность действия.

В таблице 8 ниже приведены ED₅₀ и дозы DAS 4, определенные для rBoNT/A1 и химер 3B и 3C в анализе DAS мыши. В таблице также приведена общая длительность действия для дозы DAS 4 до полного восстановления слабости мышц до DAS 0 (отсутствие наблюдаемой слабости мышц). Кроме того, в таблице приведены летальная доза для мышей и коэффициент безопасности (-10% ΔBW/ED₅₀), определяемый, как описано выше. По сравнению с rBoNT/A1, химеры 3B и 3C имели более высокую длительность действия, лучший коэффициент безопасности и более высокую летальную дозу. Исследования, показанные на фигуре 10 и в таблице 8, осуществляли на мышах, полученных в Janvier Laboratories.

	ED₅₀(доза DAS 2) (пг/ мышь)	Доза DAS 4 (пг/ мышь)	Общая длительность действия (дни) при наименьшей дозе DAS 4	Летальная доза для мышей (пг)	Коэффициент безопасности (-10% ΔBW/ED₅₀)
rBoNT/A1	0,9	2,3	29	18	4,5
Химера 3B	8,0	89	42	200	14,1
Химера 3C	5,0	26	42	8,9	7,4

Таблица 8. DAS и коэффициенты безопасности химер BoNT/AB.

ПРИМЕР 6

Доклиническое тестирование модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4)

Модифицированный BoNT/A "Cat-A" (SEQ ID NO: 4) подвергали дополнительного доклиническому тестированию.

Материалы и способы

Анализ отведения пальцев (DAS) у крыс

Для оценки эффектов модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в отношении мышечной активности in vivo проводили исследования доза-ответ с использованием анализа DAS крыс. Анализ DAS крыс основан на рефлексе разведения пальцев, характерном четверохолмном рефлексе, когда животное быстро хватают. После однократной инъекции нейротоксина в комплекс левой малоберцовой мышцы, слабость мышц приводила к снижению отведения пальцев. Различные степени отведения пальцев регистрировали по 5-балльной шкале: от 0=норма до 4=максимальное снижение отведение пальцев и вытягивания конечностей (Broide RS, Rubino J, Nicholson GS, et al. The rat Digit Abduction Score (DAS) assay: A physiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletal muscle paralysis. Toxicon 2013;71:18-24). Измеряли значения DAS для первых пяти последовательных дней после инъекции токсина, а затем с интервалами от двух до трех дней до полного исчезновения эффекта модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в отношении рефлекса разведения пальцев в случае более низких доз и полного восстановления до DAS2 в случае доз, приводивших к DAS4. Временные индуцированные BoNT дозозависимые эффекты в отношении набора массы тела считают признаком генерализованного эффекта токсина (Torii Y, Goto Y, Nakahira S, et al. Comparison of Systemic Toxicity between Botulinum Toxin Subtypes A1 and A2 in Mice and Rats. Basic Clin. Pharmacol.Toxicol. 2015;116:524-528). Таким образом, в каждый момент времени оценки крыс взвешивали и отмечали побочные эффекты. Дозировку растворов BoNT маскировали (обозначали случайно выбранными буквами) перед инъекцией и до конца исследования. Активность определяли как дозу, необходимую для индуцирования 50% эффекта (ED₅₀: доза, приводящая к значению DAS 2). Для определения ED₅₀ и 95%-ных доверительных интервалов (CI) тестировали дозы в диапазоне от 2,5 до 750 пг/кг. Для оценки возможных побочных эффектов также вводили более высокие дозы 1, 1,5, 2, 2,4, 3, 4 и 5 нг/кг.

Для оценки длительности действия модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) и его сравнения с длительностью действия немодифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 2), оценивали медиану времени, необходимого для возвращения к DAS2 в случае максимальной переносимой дозы (без оценки влияния на массу тела по сравнению с крысами, которым их не вводили) для обоих токсинов в двух независимых параллельных исследованиях.

Исследования однократных доз на крысах

Крысам делали однократную внутримышечную (i.m.) инъекцию модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в дозах 0, 0,1, 1 и 3 нг/кг, вводимых в правую икроножную мышцу. Контрольным животным в правую икроножную мышцу вводили разбавитель для SEQ ID NO: 4. Животных умерщвляли через 7 дней после введения (десять самцов и десять самок на группу) или после 13- или 26-недельного периода наблюдения (пять самцов и пять самок на дозу). Наблюдения для теста Ирвина для оценки функционирования центральной нервной системы осуществляли до тестирования (день -1), в день 8 и в течение недель 13 и 27. Другими оцениваемыми клиническими (нежелательными) признаками являлись прихрамывание, небольшой размер мышцы, в которую инъецировали токсин и мягкий вздутый живот.

Исследования на обезьянах

Обезьянам вводили однократные дозы i.m. 0, 0,1, 0,25 и 0,75 нг/кг модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4), вводимого в правую икроножную мышцу. Животных умерщвляли через 7 дней после введения (трех самцов и трех самок на группу) или после 13- или 26-недельного периода наблюдения (два самца и две самки на дозу). Обследования сердечно-сосудистой системы, включающие гемодинамические, электрокардиографические и респираторные параметры, осуществляли посредством внешней телеметрии до тестирования и в дни 8 и 15.

Предварительные усиленные исследования EFD на беременных крысах

Целью исследования являлось получение начальной информации об эффектах модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в отношении эмбрионального и плодного развития крысы при введении путем i.m. на всем протяжении периода органогенеза. Модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 4) вводили посредством ежедневной i.m. инъекции (в икроножную мышцу) в дозе 0,02, 0,05 и 0,1 нг/кг/сутки в группах по девять спаренных самок крыс линии Спрег-Доули со дня беременности 6 (G6) по 17 (G17), включительно. Клиническое исследование, массу тела и потребление пищи подвергали мониторингу на всем протяжении исследования. Самок подвергали кесаревому сечению в день G21 и регистрировали параметры выводка. При некропсии самок обследовали макроскопически, беременные матки взвешивали и, у тех, у кого наблюдали небольшую икроножную мышцу, в которую делали инъекции, взвешивали эту мышцу и противоположную мышцу. Все плоды взвешивали. Затем плоды осматривали на внешние аномалии и аномалии внутренних органов и определяли пол. Головы приблизительно половины плоды фиксировали для внутреннего исследования посредством получения серийных срезов. Выпотрошенные тела всех плодов обрабатывали для исследования скелета.

Предварительные усиленные исследования EFD на беременных кроликах

Целью исследования являлось получение начальной информации об эффектах модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в отношении эмбрионального и плодного развития кролика при введении путем i.m. на всем протяжении периода органогенеза. Модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 4) вводили посредством ежедневной i.m. инъекции (в икроножную мышцу) в дозе 0,002, 0,005 и 0,01 нг/кг/сутки в группах по девять спаренных самок кроликов новозеландской белой породы со дня беременности 6 (G6) по 19 (G19), включительно. Клиническое исследование, массу тела и потребление пищи подвергали мониторингу на всем протяжении исследования. Самок подвергали кесаревому сечению в день G29 и регистрировали параметры выводка. При некропсии самок обследовали макроскопически, беременные матки взвешивали и, у тех, у кого наблюдали небольшую икроножную мышцу, в которую делали инъекции, взвешивали эту мышцу и противоположную мышцу. Все плоды взвешивали. Затем плоды осматривали на внешние аномалии и аномалии внутренних органов и определяли пол. Головы приблизительно половины плоды фиксировали для внутреннего исследования посредством получения серийных срезов. Выпотрошенные тела всех плодов обрабатывали для исследования скелета.

Результаты

Проводя исследования, как указано выше, получали следующие фармакологические данные (указанные в таблице 9 ниже) для ряда биологических видов, которым вводили модифицированный BoNT/A.

Животное	Тип исследования	Результаты
Мышь	LD₅₀ IP	0,422 нг/кг
Крыса	DAS	ED50 0,013 нг/кг DAS4 0,125 пг/кг
	Отдаленное распространение однократной дозы CMAP	0,002 нг/кг: без распространения 0,3 нг/кг: -25% 0,8 нг/кг: -56%
	Однократная доза	Приблизительная NOAEL 1,5 нг/кг Приблизительная летальная доза 3 нг/кг

Таблица 9. Доклинические результаты.

Кроме того, тестировали модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в анализе DAS на крысах для определения длительности действия по сравнению с Dysport^®. Результаты приведены в таблице 10 ниже:

	Dysport^® 3 ед./крысу 15 ед./кг	Модифицированный BoNT/A 150 пг/крысу 0,750 нг/кг
Длительность действия (медиана дней)	21,9	46,4

Таблица 10. Длительность действия.

Эти данные свидетельствуют о том, что модифицированный BoNT/A имеет длительность действия, более чем в 2 раза превышающую таковую у Dysport^®.

ПРИМЕР 7

Вычисление однократной дозы модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) для лечения морщин на лице

В свете доклинических фармакологических данных, полученных в примере 6 выше, вычисляли подходящий диапазон однократных доз (UD) для введения модифицированного BoNT/A людям. Исследования показали, что модифицированный BoNT/A обеспечивает большую длительность действия, чем немодифицированный BoNT/A, в то же время демонстрируя улучшенный профиль безопасности. Этот улучшенный профиль безопасности можно выражать с помощью высокого коэффициента безопасности, представленного в настоящем описании, для модифицированного BoNT/A.

Т.к. модифицированный BoNT/A имеет тот же механизм действия, что и Dysport^® (хотя и с повышенным терапевтическим индексом (т.е. повышенным коэффициентом безопасности) из-за своих модифицированных свойств), наименьшая доза модифицированного BoNT/A для лечения индивидуума с морщинами на лице помещена в один контекст с отмеченными дозами Dysport^® для одних и тех же групп мышц:

В модели отведения пальцев на крысах ED₅₀модифицированного BoNT/A, полученного с использованием партии, предназначенной для клинического использования, составляет 13 пг/кг, и она более чем в 100 раз ниже приблизительной дозы, не вызывающая развития наблюдаемых нежелательных эффектов, (NOAEL) 1500 пг/кг у того же вида животного. После использования соответствующего аллометрического фактора эту ED₅₀ можно переводить в эквивалентную дозу для человека (HED) 130 пг. С учетом результатов DAS на крысах 100 пг модифицированного BoNT/AB будут приблизительно равны приблизительно 4 ед. продаваемого на рынке Azzalure/Dysport. Если тот же подход использовать для вычисления начальной дозы с использованием ED₅₀ DAS на крысах, полученной для Azzalure/Dysport (т.е. ED₅₀ 0,5 ед./кг), это будет равно общей начальной дозе 5 ед., составляющей 1/10 от общей зарегистрированной дозы 50 ед. для временного улучшения GL от умеренных до тяжелых.

определяли интраперитонеальную LD₅₀ для мышей как 0,422 нг/кг (8,44 пг/животное). В этих условиях доза 0,84 нг модифицированного BoNT/A соответствует дозе 100 ед. Dysport^®.

Таким образом, вычисленная наименьшая начальная общая доза составляет 100 пг. Для обеспечения некоторого контекста и используя указанные выше данные об интраперитонеальной LD₅₀ мыши, 100 пг модифицированного BoNT/A равны приблизительно 12 ед. Dysport^®и, таким образом, будут активны при введении внутримышечно для лечения морщин на лице.

Вычисленный таким образом верхний предел однократной дозы будет составлять 300 пг (0,3 нг), при этом вводимая индивидууму общая доза составляет 4800 пг, т.к. она остается ниже NOAEL крысы, переведенной в дозу для человека.

Таким образом, подходящая однократная доза для лечения морщин на лице с использованием модифицированного BoNT/A вычислена как 20-300 пг. Учитывая полученные доклинические данные, она составляет 2-35 единиц модифицированного BoNT/A в учетом вычисленной медианы летальной интраперитонеальной дозы (LD₅₀) у мышей, определяемой с использованием интраперитонеального анализа летальной дозы для мышей.

Преимущественно, модифицированный BoNT/A можно инъецировать в большее количество мышц при лечении морщин на лице до достижения максимальной дозы. Это значимый и полезный результат, приводящий к улучшенному лечению морщин верхней части лица, в то же время предоставляющий клиницистам больший диапазон вариантов лечения.

ПРИМЕР 8

Режим дозирования для лечения межбровных морщин

Модифицированный BoNT/A предоставляют в виде лиофилизированного порошка в прозрачных стеклянных флаконах по 2 мл, содержащих 15 нг модифицированного BoNT/A на флакон. Лиофилизированный порошок восстанавливают смесью стерильного раствора хлорида натрия 0,9% об./масс. без консервантов и разбавителя (состав буфера, содержащий только эксципиенты модифицированного BoNT/A). После восстановления раствор дополнительно, при необходимости, разводят.

Межбровные морщины от умеренных до тяжелых лечат в соответствии со схемой инъецирования, показанной на фигуре 11.

Однократная доза составляет 20-300 пг (2-35 единиц).

Внутримышечные инъекции делают в до пяти участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 1500 пг (177 единиц).

ПРИМЕР 9

Режим дозирования для лечения межбровных морщин и лобных морщин

Межбровные и лобные морщины от умеренных до тяжелых лечат в соответствии со схемой инъецирования, показанной на фигуре 12.

Внутримышечные инъекции делают в до десяти участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 3000 пг (355 единиц).

ПРИМЕР 10

Режим дозирования для лечения боковых периорбитальных морщин

Боковые периорбитальные морщины от умеренных до тяжелых лечат в соответствии со схемой инъецирования, показанной на фигуре 13.

Внутримышечные инъекции делают в до шести участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 1800 пг (213 единиц).

ПРИМЕР 11

Режим дозирования для лечения межбровных, лобных и боковых периорбитальных морщин

Межбровные, лобные и боковые периорбитальные морщины от умеренных до тяжелых лечат в соответствии со схемой инъецирования, показанной на фигуре 14.

Внутримышечные инъекции делают в до шестнадцати участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 4800 пг (569 единиц).

ПРИМЕР 12

Дополнительная характеризация модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)

Химеру BoNT/AB SEQ ID NO: 14 тестировали в анализе LD₅₀ мыши, получая результат 1,202 нг/кг. Таким образом, в этом анализе 1 ед. SEQ ID NO: 14 соответствует 24,04 пг.

Кроме того, указанную химеру BoNT/AB тестировали в анализе DAS на крысах для определения длительности действия (как в примере 6) по сравнению с Dysport^®. Результаты приведены в таблице 13 ниже:

	Dysport^® 3 ед./крысу 15 ед./кг	BoNT/AB 300 пг/крысу 1,5 нг/кг
Длительность действия (медиана дней)	21,9	47,7

Таблица 13. Длительность действия.

В заключение, длительность действия BoNT/AB гораздо превосходила таковую у Dysport^® и являлась схожей с SEQ ID NO: 4. Таким образом, ожидают, что однократные дозы и режим дозирования для SEQ ID NO: 4 аналогичным образом можно использовать для BoNT/AB для обеспечения улучшенного лечения морщин на лице.

ПРИМЕР 13

Вычисление однократной дозы модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14) для морщин верхней части лица

Учитывая доклинические фармакологические данные, вычисляли подходящий диапазон однократных доз (UD) для введения модифицированного BoNT/A людям.

В случае вычисляли SEQ ID NO: 14 ED₅₀ в DAS 13 пг/кг. ED₅₀ считают минимальной фармакологически активной дозой, составляющей приблизительно в 300 меньше, чем доза, не вызывающая развития наблюдаемых нежелательных эффектов, (NOAEL) 4 нг/кг у того же вида животных. ED₅₀ 13 пг/кг для SEQ ID NO: 14 у крыс соответствует дозе 0,8 нг для человека массой 60 кг.

Таким образом, выбирали нижний предел однократной дозы 20 пг. Выбирали верхний предел однократной дозы 1500 пг, составляющий меньше NOAEL 4 нг/кг для обоих биологических видов, на которых оценивали неклиническую безопасность (крысы и обезьяны), преобразуемой в дозу для человека массой 60 кг.

Учитывая улучшенный профиль безопасности, максимальную общую дозу для лечения морщин верхней части лица устанавливали на 24000 пг, полученные из NOAEL 4 нг/кг для обоих биологических видов, на которых оценивали неклиническую безопасность (крысы и обезьяны), преобразуемой в дозу для человека массой 60 кг.

ПРИМЕР 14

Режим дозирования для лечения межбровных морщин с использованием модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)

Модифицированный BoNT/A предоставляют в виде лиофилизированного порошка во флаконе, содержащем 36 нг модифицированного BoNT/A на флакон. Лиофилизированный порошок восстанавливают.

Однократная доза составляет 20-1500 пг (0,8-62 единиц).

Внутримышечные инъекции делают в до пяти участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 7500 пг (312 единиц).

ПРИМЕР 15

Режим дозирования для лечения межбровных морщин и лобных морщин с использованием модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)

Внутримышечные инъекции делают в до десяти участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 15000 пг (624 единицы).

ПРИМЕР 16

Режим дозирования для лечения боковых периорбитальных морщин с использованием модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)

Внутримышечные инъекции делают в до шести участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 9000 пг (374 единицы).

ПРИМЕР 17

Режим дозирования для лечения межбровных, лобных и боковых периорбитальных морщин с использованием модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)

Однократная доза составляет 20-1500 пг (0,8-62 единицы).

Внутримышечные инъекции делают в до шестнадцати участков в соответствии с однократной дозой. Вводимая максимальная общая доза составляет 24000 пг (998 единиц).

Все публикации, упомянутые в представленном выше описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки. Различные модификации и варианты описанных способов и системы по настоящему изобретению будут очевидны специалистам в этой области без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано с учетом конкретных предпочтительных вариантов осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не следует необоснованно ограничивать такими конкретными вариантами осуществления. Фактически, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, очевидные специалистам в биохимии и биотехнологии или родственных областях, предназначены для включения в объем следующей формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> IPSEN BIOPHARM LIMITED

<120> ЛЕЧЕНИЕ МОРЩИН ВЕРХНЕЙ ЧАСТИ ЛИЦА

<130> P66420WO

<150> GB2003813.9

<151> 2020-03-16

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3888

<212> ДНК

<213> Clostridium botulinum

<400> 1

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 2

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 3

<211> 3888

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-A"

<400> 3

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaagca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 4

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-A"

<400> 4

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 5

<211> 3888

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-B"

<400> 5

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca agaagattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 6

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-B"

<400> 6

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Lys Lys Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 7

<211> 3888

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-C"

<400> 7

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaagaagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 8

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-C"

<400> 8

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Lys Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 9

<211> 3888

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-D"

<400> 9

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gcgtaaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctcgtg tccgtcgtct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gaccgtcgtg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgcc gtagccgtcg tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 10

<211> 1296

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-D"

<400> 10

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Arg

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Arg Val Arg Arg Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Arg Arg Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Arg Ser Arg Arg Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 11

<211> 1315

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 1"

<400> 11

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu

865 870 875 880

Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly

885 890 895

Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln

900 905 910

Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn

915 920 925

Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe

930 935 940

Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile

945 950 955 960

His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp

965 970 975

Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile

980 985 990

Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp

995 1000 1005

Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn

1010 1015 1020

Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser

1025 1030 1035

Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu

1040 1045 1050

Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile

1055 1060 1065

Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser

1070 1075 1080

Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu

1085 1090 1095

Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr

1100 1105 1110

Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys

1115 1120 1125

Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln

1130 1135 1140

Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys

1145 1150 1155

Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp

1160 1165 1170

Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu

1175 1180 1185

Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu

1190 1195 1200

Glu Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe

1205 1210 1215

Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr

1220 1225 1230

Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu

1235 1240 1245

Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val

1250 1255 1260

Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu

1265 1270 1275

Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn

1280 1285 1290

Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu His His His

1295 1300 1305

His His His His His His His

1310 1315

<210> 12

<211> 1327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 2"

<400> 12

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Glu Leu Gly Gly Gly Gly

865 870 875 880

Ser Glu Leu Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr

885 890 895

Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu

900 905 910

Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr

915 920 925

Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile

930 935 940

Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile

945 950 955 960

Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr

965 970 975

Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile

980 985 990

Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr

995 1000 1005

Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu

1010 1015 1020

Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asn

1025 1030 1035

Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn Thr Asp

1040 1045 1050

Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile Ile Phe

1055 1060 1065

Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys

1070 1075 1080

Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn Ile Glu

1085 1090 1095

Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys Asp Phe

1100 1105 1110

Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met Phe Asn

1115 1120 1125

Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro

1130 1135 1140

Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn Ser Lys

1145 1150 1155

Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe Ile Ile

1160 1165 1170

Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg

1175 1180 1185

Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu

1190 1195 1200

Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Met Lys

1205 1210 1215

Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr

1220 1225 1230

Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln

1235 1240 1245

Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu

1250 1255 1260

Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu

1265 1270 1275

Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val

1280 1285 1290

Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe

1295 1300 1305

Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu His His His His His His

1310 1315 1320

His His His His

1325

<210> 13

<211> 1314

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 3A"

<400> 13

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala

885 890 895

Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe

900 905 910

Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln

915 920 925

Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp

930 935 940

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His

945 950 955 960

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys

965 970 975

Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn

980 985 990

Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile

995 1000 1005

Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn

1025 1030 1035

Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp

1055 1060 1065

Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn

1070 1075 1080

Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp

1115 1120 1125

Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn

1130 1135 1140

Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

1145 1150 1155

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

1160 1165 1170

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn

1175 1180 1185

Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu

1190 1195 1200

Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr

1205 1210 1215

Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser

1220 1225 1230

Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile

1235 1240 1245

Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe

1250 1255 1260

Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys

1265 1270 1275

Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp

1280 1285 1290

Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu His His His His

1295 1300 1305

His His His His His His

1310

<210> 14

<211> 1304

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 3B"

<400> 14

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala

885 890 895

Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe

900 905 910

Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln

915 920 925

Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp

930 935 940

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His

945 950 955 960

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys

965 970 975

Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn

980 985 990

Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile

995 1000 1005

Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn

1025 1030 1035

Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp

1055 1060 1065

Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn

1070 1075 1080

Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp

1115 1120 1125

Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn

1130 1135 1140

Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

1145 1150 1155

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

1160 1165 1170

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn

1175 1180 1185

Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu

1190 1195 1200

Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr

1205 1210 1215

Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser

1220 1225 1230

Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile

1235 1240 1245

Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe

1250 1255 1260

Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys

1265 1270 1275

Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp

1280 1285 1290

Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1295 1300

<210> 15

<211> 1304

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 3C"

<400> 15

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala

885 890 895

Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe

900 905 910

Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln

915 920 925

Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp

930 935 940

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His

945 950 955 960

Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys

965 970 975

Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn

980 985 990

Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile

995 1000 1005

Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn

1025 1030 1035

Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile

1040 1045 1050

Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp

1055 1060 1065

Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn

1070 1075 1080

Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp

1115 1120 1125

Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn

1130 1135 1140

Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe

1145 1150 1155

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

1160 1165 1170

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn

1175 1180 1185

Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu

1190 1195 1200

Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr

1205 1210 1215

Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser

1220 1225 1230

Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile

1235 1240 1245

Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe

1250 1255 1260

Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys

1265 1270 1275

Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp

1280 1285 1290

Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1295 1300

<210> 16

<211> 1291

<212> БЕЛОК

<213> Clostridium botulinum

<400> 16

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<---

Claims

1. Способ косметического лечения, включающий введение модифицированного BoNT/A посредством внутримышечной инъекции во множество участков на лице индивидуума,

где множество участков выбраны из:

2. Способ косметического лечения по п. 1, где:

(a) где однократная доза модифицированного BoNT/A выбрана из: от 12 пг до 1750 пг, от 20 пг до 1500 пг, наиболее предпочтительно - от 250 пг до 500 пг; и/или

(b) общая доза модифицированного BoNT/A, вводимого во время лечения, выбрана из до: 24500 пг, 24000 пг, наиболее предпочтительно - 8000 пг.

3. Способ косметического лечения по любому из предшествующих пунктов, где модифицированный BoNT/A имеет коэффициент безопасности более 7, где коэффициент безопасности вычисляют следующим образом: доза токсина, необходимая для изменения массы тела на -10%, измеренная как пг/мышь, разделенная на ED₅₀ DAS, измеренную как пг/мышь, где ED₅₀=доза, необходимая для получения DAS 2.

4. Способ косметического лечения по любому из предшествующих пунктов, где:

(а) способ косметического лечения предназначен для лечения межбровных морщин, предпочтительно, где указанный модифицированный BoNT/A вводят в два участка Musculus corrugator и один участок Musculus procerus, более предпочтительно, где указанный модифицированный BoNT/A вводят всего в пять участков; или

(b) способ косметического лечения предназначен для лечения лобных морщин, предпочтительно, где указанный модифицированный BoNT/A вводят в пять участков Musculus frontalis; или

(с) способ косметического лечения предназначен для лечения боковых периорбитальных морщин, предпочтительно, где указанный модифицированный BoNT/A вводят в три участка во внешней части Musculus orbicularis oculi для лечения боковых периорбитальных морщин, более предпочтительно, где указанный модифицированный BoNT/A вводят всего в шесть участков;

предпочтительно, где указанный модифицированный BoNT/A вводят в 8, 10, 12, 14 или 16 участков; или

где указанный модифицированный BoNT/A вводят в 7, 9, 11, 13 или 15 участков.

5. Способ косметического лечения по любому из предшествующих пунктов, где указанный модифицированный BoNT/A содержит модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277.

6. Способ косметического лечения по п. 5, где указанный модифицированный BoNT/A содержит модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 или THR 1277.

7. Способ косметического лечения по любому из предшествующих пунктов, где указанная модификация содержит (предпочтительно, состоит из) модификацию в одном или более аминокислотных остатках, выбранных из: ASN 886, ASN 930, SER 955, GLN 991, ASN 1026, ASN 1052 и GLN 1229.

8. Способ косметического лечения по любому из предшествующих пунктов, где модификация является заменой, предпочтительно - заменой лизином или аргинином.

9. Способ косметического лечения по любому из предшествующих пунктов, где модифицированный BoNT/A содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности последовательности в отношении SEQ ID NO: 14.