RU2845911C1 - Конъюгаты белок-макромолекула и способы их применения - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к конъюгатам белок-макромолекула. Предложены конъюгат линкера, содержащий белок, ковалентно присоединенный к по меньшей мере одному линкеру, и конъюгат белок-(L-макромолекула)_z, в которых по меньшей мере один линкер является высвобождаемым линкером, белок представляет собой IL-2, макромолекула представляет собой метокси-ПЭГ. Также предложены способ получения конъюгата, композиции конъюгата для использования в лечении рака, инфекции или аутоиммунного заболевания, а также высвобождаемый линкер. Предложенный бифункциональный линкер позволяет конструировать конъюгаты лекарственного средства с предсказуемой и контролируемой скоростью высвобождения. Изобретения обеспечивают эффективную функционализацию белка с помощью множества бифункциональных высвобождаемых линкеров, улучшение фармакокинетических свойств высокофункционализированного белка. 6 н.п. ф-лы, 9 ил., 9 табл., 54 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] В настоящей заявке испрашивается преимущество и приоритет предварительной заявки США № 62/908435, поданной 30 сентября 2019 г., которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Эта заявка подается в электронном виде через EFS-Web и включает представленный в электронном виде перечень последовательностей в формате.txt.Файл.txt содержит список последовательностей под названием «CSPL_008_01WO_SeqList_ST25.txt», созданный 29 сентября 2020 г. и имеющий размер ~3,71 килобайта. Перечень последовательностей, содержащийся в этом файле.txt, является частью описания и полностью включен в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[3] Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгатов белок-макромолекула посредством использования бифункциональных линкеров. Кроме того, настоящее изобретение относится к новым конъюгатам, которые предназначены для фармакокинетического контроля при доставке белков с биологической функцией. В частности, изобретение относится к конъюгатам белок-макромолекула, имеющим желаемую скорость высвобождения белка. Более конкретно, изобретение относится к конъюгатам, содержащим фрагмент IL-2 (т. е. фрагмент, обладающий по меньшей мере некоторой активностью, сходной с активностью человеческого IL-2) и макромолекулы с одним или несколькими линкерами. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям на основе конъюгатов, способам получения конъюгатов, способам введения конъюгата и способу применения конъюгатов в области лечения рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[4] Многие лекарственные средства имеют неблагоприятные фармакокинетические параметры, которые ограничивают их эффективность. Быстрое выведение таких лекарственных средств из физиологических отделов посредством метаболизма или экскреции приводит к короткому сроку годности и уменьшению воздействия на мишени. Например, терапевтические агонисты на основе природных белков являются привлекательными иммуномодуляторами, которые могут помочь создать эффективный стойкий противоопухолевый ответ; однако они не являются идеальными фармацевтическими средствами из-за плохой фармакокинетики (PK), плохой переносимости и плейотропной активности, которая может обостряться при частом введении доз.

[5] Цитокин интерлейкин-2 (IL-2) представляет собой эндогенный агонист пути IL-2 и надлежащим образом описанный стимулятор CD8⁺ Т-клеток (CD8 Т-клеток) и NK-клеток. Режим высоких доз IL-2, вводимых каждые восемь часов в условиях больницы с использованием варианта IL-2, известного как «алдеслейкин», был одобрен в 1990-х годах Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для лечения метастатической меланомы и почечно-клеточной карциномы, обеспечивая до 25% устойчивых ответов. Высокие дозы IL-2 необходимы для активации CD8 Т-клеток и NK-клеток, которые склонны экспрессировать бета-гамма-субъединицы с низкой аффинностью рецептора IL-2 (IL-2Rβγ). Потребность в высоких дозах IL-2 усугубляется плохим PK-профилем этого белка. Высокие дозы алдеслейкина широко не используются из-за высокой токсичности, связанной с чрезмерной активацией иммунной системы. В дополнение к этой токсичности IL-2 также стимулирует пролиферацию и активацию регуляторных Т-клеток (Treg). Эти клетки конститутивно экспрессируют высокоаффинные гетеротримерные альфа-бета-гамма-субъединицы рецептора IL-2 (IL-2Rαβγ). Активация Treg может усугубить подавление иммунитета, потенциально снижая предполагаемый противоопухолевый ответ.

[6] Полимерные пролекарства и конъюгаты полимер-лекарственное средство могут повышать эффективность лекарственных средств для терапевтического применения. Лекарственные средства, конъюгированные с полимером, как правило, обладают более длительным периодом полувыведения, более высокой стабильностью, растворимостью в воде, более низкой иммуногенностью и антигенностью и специфическим нацеливанием на ткани или клетки. Полимеры используются в качестве носителей в полимерных пролекарствах/макромолекулярных пролекарствах для доставки лекарственных средств, белков, нацеливающих фрагментов и визуализирующих средств. Полимерные пролекарства можно рассматривать как системы доставки лекарств, которые проявляют свою терапевтическую активность посредством высвобождения меньших молекул терапевтического лекарственного средства из молекулы полимерной цепи в течение длительного периода времени, что приводит к улучшению фармакокинетических свойств за счет увеличения периода полувыведения, биодоступности и тем самым эффективности длительного фармакологического действия.

[7] В попытке решить проблемы токсичности и плохих фармакокинетических свойств IL-2 были предложены определенные конъюгаты IL-2. См., например, патенты США №№ 4766106, 5206344, 5089261, 4902502, 9861705 и WO 2019/028419.

[8] Помимо увеличения периода полувыведения из плазмы крови и снижения иммуногенности пегилирование дает возможность контролировать селективность связывания с белком. Например, NKTR214, клинический кандидат пегилированного IL-2, демонстрирует пониженное связывание с α-субъединицей рецептора IL-2 (IL-2Rα) благодаря сайт-специфичному пегилированию высвобождаемыми линкерами на лизиновых остатках поверхности контакта IL-2-IL-2Rα. Связывание с β-субъединицей рецептора IL-2 (IL-2Rβ) минимально затрагивается. Следовательно, NKTR-214 обеспечивает повышенную пролиферацию CD8+ эффекторных Т-клеток памяти, уничтожающих опухоль, сниженную пролиферацию иммуносупрессивных регуляторных Т-клеток и повышенную противоопухолевую эффективность по сравнению с IL-2 в доклинической оценке. См., например, U.S. 9,861,705, Clin. Cancer Res. 22, 680-690 (2016); PLOS ONE 12, e0179431 (2017).

[9] Выбор химического состава линкера важен при разработке терапевтических конъюгатов полимер-лекарственное средство, поскольку он обеспечивает пространственно-временной контроль расщепления и последующего высвобождения активных средств. Без достаточной стабильности линкера конъюгированное лекарственное средство может демонстрировать преждевременное высвобождение, что сводит на нет преимущества его макромолекулярного носителя. Однако в случае неактивного полимерного пролекарства недостаточное высвобождение лекарственного средства может привести к субтерапевтическим уровням лекарственного средства и, следовательно, к субоптимальной терапевтической эффективности. Следовательно, очень желателен профиль устойчивого высвобождения лекарственного средства, обеспечивающий длительную терапевтическую эффективность.

[10] Некоторые молекулы пролекарства высвобождают активные лекарственные средства в физиологических условиях благодаря рН-зависимому бета-выведению. В этом подходе используется спонтанная скорость первого порядка отщепления лекарственного средства от носителей ПЭГ, которая инициируется, когда конъюгат подвергается воздействию физиологического рН. Скорость их расщепления предопределяется кислотностью связи C-H на линкере; кислотность, в свою очередь, контролируется электроноакцепторными группами, присоединенными к ионизируемому С-Н. См., например, патенты США №№ 6504005, 8680315 и WO 2004/089279.

[11] Несмотря на его широкое применение, существенным ограничением ПЭГ и его последующей применимости в терапии является его небиоразлагаемость. В настоящее время одобренные терапевтические средства с пегилированными белками используют ПЭГ с молекулярной массой ≤40 кДа, что близко к порогу клубочковой фильтрации, составляющему примерно 50 кДа. Хотя увеличение молекулярной массы обычно приводит к увеличению времени циркуляции, опасения, связанные с накоплением небиоразлагаемого ПЭГ, ограничивают оптимизацию молекулярной массы полимера и получаемой в результате фармакокинетики.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[12] В данном документе описана общая конструкция конъюгатов белок-[макромолекула]z с несколькими линкерами. Уникальные линкеры по настоящему изобретению позволяют конструировать конъюгаты лекарственного средства с предсказуемой регулируемой кинетикой высвобождения. Кроме того, молекулярную массу каждой макромолекулы можно регулировать до желаемой массы для почечного очищения, которая в некоторых вариантах осуществления составляет менее 40-50 кДа. Увеличивая количество макромолекул (z) на белке, можно увеличить общую молекулярную массу конъюгатов и, следовательно, увеличить время циркуляции конъюгатов. Помимо использования регулируемых электроноакцепторных групп на высвобождаемом линкере, скорость высвобождения активного белка можно дополнительно контролировать и оптимизировать путем изменения числа макромолекул (z) на белке.

[13] Как правило, конъюгация нескольких макромолекул с одним белком затруднена и неэффективна. Предусмотрели общий подход к конъюгации белка с несколькими бифункциональными линкерами, а затем реакции линкеров с макромолекулами с получением конъюгатов белок-[макромолекула]z. Этот метод обеспечивает преимущество минимизации стерических препятствий и, следовательно, повышает эффективность реакции. Кроме того, стадии синтеза и очистки упрощены и менее затратны. Таким образом, этот метод обеспечивает значительное преимущество для крупномасштабного производства полимерно-белковых терапевтических средств.

[14] Настоящее изобретение описывает эту общую стратегию получения конъюгатов белок-[макромолекула]z, имеющих высвобождаемые линкеры с предсказуемой и контролируемой скоростью высвобождения. Эти конъюгаты с контролируемой скоростью высвобождения могут быть ценным терапевтическим средством для лечения заболеваний. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании описаны конъюгаты белок-[макромолекула]z, имеющие невысвобождаемые линкеры и высвобождаемые линкеры. Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу получения таких конъюгатов, композициям, содержащим конъюгаты, и способам их применения, которые являются новыми и совершенно не предложенными в данной области техники.

[15] Соответственно, в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способам конъюгации для получения конъюгатов, содержащих белок с соответствующими биологическими функциями и множество макромолекул, соединенных линкерами. В некоторых вариантах осуществления способы конъюгации включают функционализацию белка бифункциональными линкерами с последующей конъюгацией с макромолекулой. В некоторых вариантах осуществления белок включает, но не ограничивается ими, цитокины, хемокины, антитела и пептиды. В некоторых вариантах осуществления макромолекула включает, но не ограничивается ими, водорастворимые полимеры, ПЭГ, липид, полисиаловую кислоту, альбумин и Fc.

[16] Настоящее изобретение также относится к новым бифункциональным высвобождаемым линкерам и их композициям, применению новых бифункциональных высвобождаемых линкеров в терапевтических применениях и способам получения. Одним из преимуществ раскрытой технологии является возможность эффективной функционализации белков с помощью множества бифункциональных высвобождаемых линкеров, предусмотренных в данном документе. Затем можно использовать конъюгацию с макромолекулами для улучшения фармакокинетических свойств высокофункционализированного белка.

[17] В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен конъюгат, причем конъюгат содержит остаток фрагмента IL-2, ковалентно присоединенный к одному или нескольким водорастворимым полимерам посредством высвобождаемых линкеров.

[18] В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен конъюгат, причем конъюгат содержит остаток фрагмента IL-2, ковалентно присоединенный к одному или нескольким водорастворимым полимерам посредством невысвобождаемых линкеров.

[19] В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен конъюгат, причем конъюгат содержит остаток фрагмента IL-2, ковалентно присоединенный к одному или нескольким водорастворимым полимерам посредством невысвобождаемых и высвобождаемых линкеров.

[20] В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ доставки конъюгата, включающий стадию внутривенного или подкожного введения пациенту композиции, состоящей из конъюгата остатка IL-2 и водорастворимых полимеров.

[21] В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ доставки конъюгата, включающий стадии введения пациенту с раком: (а) композиции, содержащей конъюгат остатка IL-2 и один или несколько водорастворимых полимеров; и (b) эффективного количества антитела против CTLA-4 или эффективного количества антитела против PD-1/PD-L1. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество антитела против CTLA-4 представляет собой количество, которое ингибирует путь CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество антитела против PD-1/PD-L1 представляет собой количество, которое ингибирует путь PD-1/PD-L1. Для ясности, что касается последовательности стадий в соответствии с этим способом, если не указано иное, способ не ограничивается последовательностью стадий, и стадия (а) может выполняться до, после или одновременно с выполнением стадии (b).

[22] В настоящем изобретении предусмотрены конъюгаты белок-макромолекула, высвобождаемые линкеры и макромолекулы, как определено в данном документе. Раскрытые конъюгаты обладают уникальными свойствами, которые основаны по меньшей мере на свойствах линкера и количестве фрагментов линкер-макромолекула. Также в данном документе предусмотрен уникальный способ синтеза и применения конъюгатов для лечения заболеваний и нарушений.

[23] Дополнительные варианты осуществления изобретения изложены в следующем описании и формуле изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[24] На фиг. 1 показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности rIL-2 (SEQ ID NO:1-3).

[25] На фиг. 2 показаны распределения IL-2-(N₃)z, определенные для примера 14, примера 16, примера 18 и примера 22, посредством ЖХ-МС.

[26] На фиг. 3 показан анализ с помощью SDS-PAGE (трис-ацетат) продукта клик-пегилирования rIL-2-(ПЭГ)_z для примера 15, примера 17, примера 19 и примера 22.

[27] На фиг. 4A-4E показаны кривые доза-ответ, сравнивающие анализ пролиферации клеток CTLL-2 на IL-2, невысвобожденные конъюгаты и высвобожденные конъюгаты из примера 15 (4A), примера 17 (4B), примера 19 (4C), примера 22 (4D) и примера 27 (4Е). Ось Y помечена как A_450-A₆₃₀.

[28] На фиг. 5, фиг. 6, фиг. 7, фиг. 8 и фиг. 9 показано ингибирование роста опухоли после введения rIL-2 и конъюгатов rIL-2-полимер при различных схемах введения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[29] При описании и заявлении одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения следующая терминология будет использоваться в соответствии с определениями, описанными ниже.

[30] Следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

[31] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится настоящая заявка. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в данном документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящей заявки, в данном документе описаны репрезентативные способы и материалы.

[32] В соответствии с устоявшимися условными обозначениями в патентном праве термины в единственном числе относятся к «одному или нескольким» при использовании в настоящей заявке, включая формулу изобретения. Таким образом, например, ссылка на «носитель» включает смеси одного или нескольких носителей, двух или более носителей и т.п.

[33] Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как измененные во всех случаях термином «около». Соответственно, если не указано иное, численные параметры, указанные в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут варьироваться в зависимости от желательных свойств, которые должны быть получены в настоящей заявке.

[34] Термин «соединение(-я) по настоящему изобретению» или «соединение(-я) по настоящему изобретению» относится к соединениям формул, раскрытым в данном документе, или к любым их подвидам, или к их фармацевтически приемлемым солям, стереоизомерам, сольватам или гидратам, как раскрыто в данном документе. В определенных вариантах осуществления промежуточные соединения рассматриваются как соединения по настоящему изобретению.

[35] Соединения по настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые соли могут содержать один или несколько центров асимметрии и, таким образом, могут обеспечивать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые можно определить с точки зрения абсолютной стереохимии как (R)- или (S)- или, как (D)- или (L)- для аминокислот. Предполагается, что настоящее изобретение включает все такие возможные изомеры, а также их рацемические и оптически чистые формы, независимо от того, указаны они в данном документе конкретно или нет. Оптически активные (+) и (-), (R)- и (S)- или (D)- и (L)-изомеры могут быть получены с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов или разделены с использованием обычных методик, например, хроматографии и фракционной кристаллизации. Обычные методики получения/выделения отдельных энантиомеров включают хиральный синтез из подходящего оптически чистого предшественника или разделение рацемата (или рацемата соли или производного) с использованием, например, хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Если описанные в данном документе соединения содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, и если не указано иное, подразумевается, что соединения включают как E-, так и Z-геометрические изомеры. Также подразумевается, что включены все таутомерные формы.

[36] «Стереоизомер» относится к соединению, состоящему из тех же атомов, связанных одними и теми же связями, но имеющих разные трехмерные структуры, которые не являются взаимозаменяемыми. В настоящем изобретении рассматриваются различные стереоизомеры и их смеси. В некоторых вариантах осуществления термин «стереоизомер» в данном контексте относится к энантиомеру, смеси энантиомеров, диастереомеру или смеси двух или более диастереомеров.

[37] «Энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединения, которые не являются наложенными друг на друга зеркальными отображениями. Смесь таких изомеров можно назвать энантиомерной смесью.

[38] Смесь энантиомеров 50:50 называется рацемической смесью или рацематом, который может встречаться, если в химической реакции или процессе отсутствует стереоселективность или стереоспецифичность. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных соединений, лишенных оптической активности. Изобретение включает все стереоизомеры соединений, описанных в данном документе.

[39] «Диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности, молекулы которого не являются зеркальным отражением друг друга. Диастереомеры обладают различными физическими свойствами, например точками плавления, точками кипения, спектральными свойствами и реакционной способностью. Смеси диастереомеров можно разделить с помощью аналитических процедур высокого разрешения, таких как электрофорез и хроматография.

[40] Термин «региоизомер» признан в данной области техники и относится к соединениям, имеющим одинаковую молекулярную формулу, но отличающимся степенью связности атомов. Таким образом, «региоселективный процесс» представляет собой процесс, в котором образование конкретного региоизомера является предпочтительным по сравнению с другими, например, реакция значительно увеличивает выход конкретного региоизомера. Используемый в данном документе термин «региоизомер» может относиться к одному региоизомеру или смеси двух или более региоизомеров.

[41] «Таутомер» относится к протонному сдвигу от одного атома молекулы к другому атому той же молекулы. Настоящее изобретение включает таутомеры любых указанных соединений.

[42] Термины «фармацевтическая комбинация», «терапевтическая комбинация» или «комбинация», используемые в данном документе, относятся к разовой лекарственной форме, содержащей по меньшей мере два терапевтически активных средства, или к отдельным лекарственным формам, содержащим по меньшей мере два терапевтически активных средства вместе или по отдельности, для использования в комбинированной терапии. Например, одно терапевтически активное средство может быть составлено в виде одной лекарственной формы, а другое терапевтически активное средство может быть составлено в виде одной или разных лекарственных форм. Например, одно терапевтически активное средство может быть составлено в виде твердой лекарственной формы для перорального введения, тогда как второй терапевтически активное средство может быть составлено в виде лекарственной формы в виде раствора для парентерального введения.

[43] Используемый в данном документе протокол химического наименования и структурные диаграммы представляют собой модифицированную форму номенклатурной системы I.U.P.A.C. с использованием программного обеспечения ACD/Name версии 9.07, программы именования ChemDraw Ultra версии 11.0.1 и/или ChemDraw Ultra версии 14.0 (CambridgeSoft). Для сложных химических названий, используемых в данном документе, замещающая группа указывается перед группой, к которой она присоединена. Например, циклопропилэтил включает этильную цепь с циклопропильным заместителем. За исключением случаев, описанных ниже, все связи обозначены на диаграммах химической структуры в данном документе, за исключением некоторых атомов углерода, которые, как предполагается, связаны с достаточным количеством атомов водорода для завершения валентности.

[44] Термин «композиция» или «состав» означает одно или несколько веществ в физической форме, такой как твердое вещество, жидкость, газ или их смесь. Одним примером композиции является фармацевтическая композиция, т.е. композиция, относящаяся к лечению, приготовленная для него или используемая при лечении.

[45] Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый» означает подходящий для использования в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соизмеримый с разумным соотношением польза/риск и эффективный для их предполагаемого использования в рамках обоснованного врачебного решения.

[46] «Соли» включают производные активного средства, где активное средство модифицировано путем получения солей или основания присоединения кислот. Предпочтительно соли представляют собой фармацевтически приемлемые соли. Такие соли включают, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты, фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований, фармацевтически приемлемые соли металлов, соли аммония и алкилированного аммония. Соли присоединения кислоты включают соли неорганических кислот, а также органических кислот. Типичные примеры подходящих неорганических кислот включают хлористоводородную, бромистоводородную, йодистоводородную, фосфорную, серную, азотную кислоты и т.п. Типичные примеры подходящих органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пировиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую кислоты, ЭДТА, гликолевую, п-аминобензойную, глутаминовую, бензолсульфоновую, п-толуолсульфоновую кислоты, сульфаты, нитраты, фосфаты, перхлораты, бораты, ацетаты, бензоаты, гидроксинафтоаты, глицерофосфаты, кетоглутараты и тому подобное. Соли присоединения оснований включают, но не ограничиваются ими, этилендиамин, N-метил-глюкамин, лизин, аргинин, орнитин, холин, N, N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, диэтаноламин, прокаин, N-бензилфенетиламин, диэтиламин, пиперазин, трис-(гидроксиметил)-аминометан, гидроксид тетраметиламмония, триэтиламин, дибензиламин, эфенамин, дегидроабиетиламин, N-этилпиперидин, бензиламин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, основные аминокислоты, т. g., лизин и аргинин, дициклогексиламин и т.п. Примеры солей металлов включают соли лития, натрия, калия, магния и т.п. Примеры солей аммония и алкилированного аммония включают соли аммония, метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония, тетраметиламмония и т.п. Примеры органических оснований включают лизин, аргинин, гуанидин, диэтаноламин, холин и т.п. Стандартные способы получения фармацевтически приемлемых солей и их составов хорошо известны в данной области техники и описаны в различных источниках, включая, например, «Remington: The Science and Practice of Pharmacy», A. Gennaro, ed., 20th edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

[47] Используемый в данном документе термин «сольват» означает комплекс, образованный сольватацией (сочетание молекул растворителя с молекулами или ионами активного средства по настоящему изобретению), или агрегат, состоящий из иона или молекулы растворенного вещества (активного средства по настоящему изобретению) с одной или несколькими молекулами растворителя. В настоящем изобретении предпочтительным сольватом является гидрат. Примеры гидрата включают, но не ограничиваются ими, полугидрат, моногидрат, дигидрат, тригидрат, гексагидрат и т. д. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что фармацевтически приемлемая соль соединения по изобретению может также существовать в виде сольвата. Сольват обычно образуется посредством гидратации, которая является либо частью получения соединения по изобретению, либо путем природного поглощения влаги безводным соединением по настоящему изобретению. Сольваты, включая гидраты, могут состоять в стехиометрических соотношениях, например, с двумя, тремя, четырьмя молекулами соли на сольват или на молекулу гидрата. Другая возможность, например, состоит в том, что две молекулы соли стехиометрически связаны с тремя, пятью, семью молекулами растворителя или гидрата. Растворители, используемые для кристаллизации, такие как спирты, особенно метанол и этанол; альдегиды; кетоны, особенно ацетон; сложные эфиры, например, этилацетат; могут быть встроены в кристаллическую решетку. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые растворители.

[48] Термины «вспомогательное вещество», «носитель» и «среда-носитель» используются взаимозаменяемо в данной заявке и обозначают вещество, с которым вводят соединение по настоящему изобретению.

[49] «Терапевтически эффективное количество» означает количество соединения или терапевтически активного средства, которое при введении пациенту для лечения заболевания или другого нежелательного медицинского состояния достаточно для оказания благоприятного эффекта в отношении этого заболевания или состояния. Терапевтически эффективное количество будет варьироваться в зависимости от типа выбранного соединения или терапевтически активного средства, заболевания или состояния и его тяжести, а также возраста, веса и т.д. пациента, подлежащего лечению. Определение терапевтически эффективного количества данного соединения или терапевтически активного средства находится в рамках понимания специалиста в данной области техники и требует не более чем обычных экспериментов.

[50] «Лечащий» или «лечение», как используется в данном документе, охватывает лечение представляющего интерес заболевания или состояния у млекопитающего, предпочтительно человека, имеющего представляющее интерес заболевание или состояние, и включает: предотвращение возникновения заболевания или состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к состоянию, но еще не было диагностировано его наличие; подавление заболевания или состояния, т.е. остановку его развития; облегчение заболевания или состояния, т.е. вызывание регрессии заболевания или состояния; или облегчение симптомов, возникающих в результате заболевания или состояния, т.е. облегчение боли без лечения основного заболевания или состояния.

[51] Используемые в данном документе термины «заболевание» и «состояние» могут использоваться взаимозаменяемо или могут отличаться тем, что конкретное заболевание или состояние не может иметь известного возбудителя (поэтому этиология еще не выяснена) и поэтому еще не признано заболеванием, а только нежелательным состоянием или синдромом, при котором врачами идентифицирован более или менее конкретный набор симптомов.

[52] Настоящее изобретение также охватывает продукты метаболизма раскрытых соединений in vivo. Такие продукты могут образовываться, например, в результате окисления, восстановления, гидролиза, амидирования, эстерификации и т.п. вводимого соединения, главным образом вследствие ферментативных процессов. Соответственно, изобретение включает соединения, полученные способом, включающим введение соединения по настоящему изобретению млекопитающему в течение периода времени, достаточного для получения продукта его метаболизма. Такие продукты обычно идентифицируют путем введения меченного радиоактивным изотопом соединения по изобретению в определяемой дозе животному, такому как крыса, мышь, морская свинка, обезьяна или человек, с предоставлением достаточного времени для осуществления метаболизма и выделением продуктов его превращения из мочи, крови или других биологических образцов.

[53] Используемый в данном документе термин «субъект» может представлять собой человека, примата, отличного от человека, млекопитающего, крысу, мышь, корову, лошадь, свинью, овцу, козу, собаку, кошку и т.п. Термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо в отношении, например, субъекта-млекопитающего, такого как человек.

[54] У субъекта может быть подозрение на наличие или риск развития рака, такого как рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичников, карцинома слюнных желез или рак эндометрия, или подозрение на наличие или риск развития акне, гирсутизма, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, кист яичников, поликистоза яичников, преждевременного полового созревания, спинальной и бульбарной мышечной атрофии или возрастной дегенерации желтого пятна. Методы диагностики различных видов рака, таких как рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярный рак, карцинома слюнных желез или рак эндометрия, а также методы диагностики акне, гирсутизма, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, кист яичников, поликистоза яичников, преждевременного полового созревания, спинальной и бульбарной мышечной атрофии или возрастной дегенерации желтого пятна, и клинические проявления рака, такого как рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярный рак, карцинома слюнных желез или рак эндометрия, диагностика и клинические проявления акне, гирсутизма, алопеции, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, кист яичников, поликистоза яичников, преждевременного полового созревания, спинальной и бульбарной мышечной атрофии или возрастной дегенерации желтого пятна известны специалистам в данной области техники.

[55] «Млекопитающие» включают людей и как домашних животных, таких как лабораторных животных и домашних животных (например, кошки, собаки, свиньи, крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, кролики), так и не домашних животных, таких как дикие животные и т.п.

[56] «Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное впоследствии событие или обстоятельство может или не может произойти, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда они не происходят. Например, «необязательно замещенный арил» означает, что арильный радикал может быть или не может быть замещен, и что описание включает как замещенные арильные радикалы, так и арильные радикалы, не имеющие замещения.

[57] «ПЭГ», «полиэтиленгликоль» и «поли(этиленгликоль)», используемые в данном документе, являются взаимозаменяемыми и охватывают любой непептидный водорастворимый поли(этиленоксид). Как правило, ПЭГ для использования в соответствии с изобретением имеют следующую структуру «-(OCH₂CH₂)_n-», где (n) составляет от 2 до 4000. Используемый в данном документе ПЭГ также включает «-CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-» и «-(OCH₂CH₂)_nO-» в зависимости от того, были ли замещены концевые атомы кислорода, например, во время синтетического превращения. В описании и формуле изобретения следует помнить, что термин «ПЭГ» включает структуры, имеющие различные концевые или «замыкающие» группы и т.д. Термин «ПЭГ» также означает полимер, который содержит большую часть, то есть более 50%, повторяющихся субъединиц -OCH₂CH₂-. Что касается конкретных форм, ПЭГ может иметь любое количество различных молекулярных масс, а также структуры или геометрию, такие как «разветвленная», «линейная», «раздвоенная», «многофункциональная» и т.п., которые будут более подробно описаны ниже.

[58] Термины «замыкающий» и «концевой» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения конца или конечной точки полимера, имеющего концевой замыкающий фрагмент. Обычно, хотя и не обязательно, замыкающий фрагмент включает гидрокси или C_1-20 алкоксигруппу, более предпочтительно C_1-10 алкоксигруппу и еще более предпочтительно C_1-5 алкоксигруппу. Таким образом, примеры замыкающих фрагментов включают алкокси (например, метокси, этокси и бензилокси), а также арил, гетероарил, цикло, гетероцикло и т.п. Следует помнить, что замыкающий фрагмент может включать один или несколько атомов концевого мономера в полимере [например, замыкающий фрагмент «метокси» в CH₃O(CH₂CH₂O)_n- и CH₃(OCH₂CH₂)_n-]. Кроме того, предусмотрены насыщенные, ненасыщенные, замещенные и незамещенные формы каждого из вышеперечисленных. Кроме того, замыкающая группа также может представлять собой силан. Замыкающая группа может также предпочтительно содержать обнаруживаемую метку. Если полимер имеет замыкающую группу, содержащую обнаруживаемую метку, количество или местоположение полимера и/или фрагмента (например, активного средства), с которым связан полимер, можно определить с помощью подходящего детектора. Такие метки включают, без ограничения, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества, фрагменты, используемые для мечения ферментов, колориметрические вещества (например, красители), ионы металлов, радиоактивные фрагменты и т.п. Подходящие детекторы включают фотометры, пленки, спектрометры и т.п. Замыкающая группа также может преимущественно содержать фосфолипид. Если полимер имеет замыкающую группу, содержащую фосфолипид, полимеру и полученному конъюгату придаются уникальные свойства. Примеры фосфолипидов включают, без ограничения, фосфолипиды, выбранные из класса фосфолипидов, называемых фосфатидилхолинами. Конкретные фосфолипиды включают, без ограничения, фосфолипиды, выбранные из группы, состоящей из дилауроилфосфатидилхолина, диолеилфосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, дистероилфосфатидилхолина, бегеноилфосфатидилхолина, арахидоилфосфатидилхолина и лецитина. Замыкающая группа может также включать нацеливающий фрагмент, так что полимер, а также все, что к нему присоединено, например, фрагмент IL-2, могут предпочтительно локализоваться в представляющей интерес области.

[59] «Не встречающийся в природе» по отношению к полимеру, как описано в данном документе, означает полимер, который полностью не встречается в природе. Однако не встречающийся в природе полимер может содержать один или несколько мономеров или сегментов мономеров, встречающихся в природе, при условии, что общая структура полимера не встречается в природе.

[60] Термин «водорастворимый», как и в случае с «водорастворимым полимером», означает любой полимер, растворимый в воде при комнатной температуре. Как правило, водорастворимый полимер пропускает по меньшей мере около 75%, более предпочтительно по меньшей мере около 95%, света, пропускаемого тем же раствором после фильтрации. По весу водорастворимый полимер предпочтительно должен быть растворим в воде по меньшей мере около на 35% (по весу), более предпочтительно по меньшей мере около на 50% (по весу), еще более предпочтительно около на 70% (по весу) и еще более предпочтительно около на 85% (по весу). Однако наиболее предпочтительно, чтобы водорастворимый полимер был около на 95% (по весу) растворим в воде или полностью растворим в воде.

[61] Молекулярная масса водорастворимого полимера, такого как ПЭГ, может быть выражена либо как среднечисловая молекулярная масса, либо как средневесовая молекулярная масса. Если не указано иное, все ссылки на молекулярную массу в данном документе относятся к средневесовой молекулярной массе. Оба определения молекулярной массы, среднечисловую и средневесовую, можно измерить с использованием гель-проникающей хроматографии или других методов жидкостной хроматографии. Также могут использоваться другие методы измерения значений молекулярной массы, такие как использование анализа конечных групп или измерение коллигативных свойств (например, снижение температуры замерзания, повышение точки кипения или осмотическое давление), для определения среднечисловой молекулярной массы, или использование методов светорассеяния, ультрацентрифугирования или вискозиметрии для определения средневесовой молекулярной массы. Полимеры по настоящему изобретению обычно являются полидисперсными (т.е. среднечисловая молекулярная масса и средневесовая молекулярная масса полимеров не равны), обладают низкими значениями полидисперсности, предпочтительно менее около 1,2, более предпочтительно менее около 1,15, еще более предпочтительно менее около 1,10, еще более предпочтительно менее около 1,05 и наиболее предпочтительно менее около 1,03.

[62] Термины «активный», «реакционноспособный» или «активированный» при использовании в сочетании с конкретной функциональной группой относятся к реакционноспособной функциональной группе, которая легко вступает в реакцию с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле. Это отличается от тех групп, которым требуются сильные катализаторы или крайне непрактичные условия реакции для реакции (т. е. «нереакционноспособная» или «инертная» группа).

[63] Используемый в данном документе термин «функциональная группа» или любой его синоним означает, что он охватывает ее защищенные формы, а также незащищенные формы.

[64] Используемый в данном документе термин «группа, изменяющая электрон» включает любой атом или функциональную группу, которая изменяет электронную плотность фрагмента, к которому она присоединена. Группы, изменяющие электрон, включают электронодонорные группы, которые отдают электронную плотность (например, амин, гидрокси, алкоксил, алкил), и электроноакцепторные группы (например, нитро, циано, трифторметил), которые отнимают электронную плотность.

[65] Термины «спейсерный фрагмент», «связь» и «линкер» используются в данном документе для обозначения связи, или атома, или набора атомов, необязательно используемых для связывания соединяющих фрагментов, таких как конец сегмента макромолекулы и белок или электрофил или нуклеофил белка. Спейсерный фрагмент может быть гидролитически стабильным или может включать физиологически гидролизуемую или ферментативно расщепляемую связь. Если из контекста явно не следует иное, спейсерный фрагмент необязательно существует между любыми двумя элементами соединения (например, предоставленные конъюгаты, содержащие остаток белка и макромолекулы, могут быть присоединены прямо или косвенно через спейсерный фрагмент).

[66] Подходящие спейсеры по настоящему изобретению включают спейсеры, содержащие линкер, который может включать один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов фосфора, атомов кислорода и их комбинаций. Подходящий спейсерный фрагмент может включать амидную, вторичную аминовую, карбаматную, тиоэфирную, фосфатную, фосфоротиоатную, дисульфидную группу и/или группы продуктов клик-химии. Неограничивающие примеры конкретных спейсерных фрагментов включают фрагменты, выбранные из группы, состоящей из -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -OP(O)(OH)-, -OP(S)(OH)-, -C(S)-, -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, O-CH₂-, -CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-, -C(O)-NH-CH₂-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH₂-, -CH₂-C(O)-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-, -C(O)-O-CH₂-CH₂-, -NH-C(O)-CH₂-, -CH₂-NH-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-, -NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -C(O)-NH-CH₂-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -O-C(O)-NH-CH₂-, -O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -NH-CH₂-, -NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-NH-CH₂-, -C(O)-CH₂-, -C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -O-C(O)-NH-[CH₂]_l-(OCH₂CH₂)_m-, двухвалентной циклоалкильной группы, двухвалентного арила, -O-, -S-, двухвалентного аминокислотного остатка, -N(R³)- и комбинаций двух или более любых из вышеперечисленных, где R³ представляет собой Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного алкенила, замещенного или незамещенного алкинила, замещенного или незамещенного арила, (l) составляет от нуля до шести и (m) составляет от нуля до 20. Другие конкретные спейсерные фрагменты имеют следующие структуры: C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)- и -O-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, где значения нижнего индекса после каждого метилена указывают количество метиленов, содержащихся в структуре, например, (CH₂)_1-6 означает, что структура может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 метиленов.

[67] Термин «бифункциональный линкер» относится к линкеру, как определено выше, имеющему два реакционноспособных атома или функциональные группы. В определенных вариантах осуществления две реакционноспособные группы представляют собой ортогональные функциональные группы с разными режимами реакционной способности, так что каждая функциональная группа способна вступать в реакцию независимо от другой и в определенной последовательности, если это желательно. Как должно быть понятно специалисту в данной области техники, описанные в данном документе бифункциональные линкеры можно использовать для проведения сайт-специфических реакций для сборки конъюгатов белок-макромолекула.

[68] «Ацил» относится к -C(=O)-алкильному радикалу.

[69] «Амино» относится к радикалу -NH₂.

[70] «Циано» относится к радикалу -CN.

[71] «Гало» «галид» или «галоген» относится к радикалам брома, хлора, фтора или йода.

[72] «Гидрокси» или «гидроксил» относится к радикалу -OH.

[73] «Имино» относится к заместителю =NH.

[74] «Нитро» относится к радикалу -NO₂.

[75] «Оксо» относится к заместителю =O.

[76] «Тиоксо» относится к заместителю =S.

[77] «Сульфгидрид» и «меркапто» относятся к радикалу -SH.

[78] Водород представляет собой H или D.

[79] «Алкил» или «алкильная группа» относится к полностью насыщенному углеводородному радикалу с прямой (линейной) или разветвленной цепью, имеющему от одного до двадцати атомов углерода и присоединенному к остальной части молекулы одинарной связью. Включены алкилы, содержащие любое число атомов углерода от 1 до 20. Алкил, содержащий до 20 атомов углерода, представляет собой C₁-C₂₀ алкил, алкил, содержащий до 10 атомов углерода, представляет собой C₁-C₁₀ алкил, алкил, содержащий до 6 атомов углерода, представляет собой C₁-C₆ алкил и алкил, содержащий до 5 атомов углерода, представляет собой C₁-C₅ алкил. C₁-C₅ алкил включает C₅ алкилы, C₄ алкилы, C₃ алкилы, C₂ алкилы и C₁ алкил (т.е., метил). C₁-C₆ алкил включает все фрагменты, описанные выше для C₁-C₅ алкилов, но также включает C₆ алкилы. C₁-C₁₀ алкил включает все фрагменты, описанные выше для C₁-C₅ алкилов и C₁-C₆ алкилов, но также включает C₇, C₈, C₉ и C₁₀ алкилы. Аналогично, C₁-C₁₂ алкил включает все предыдущие фрагменты, но также включает C₁₁ и C₁₂ алкилы. Неограничивающие примеры C₁-C₁₂ алкила включают метил, этил, н-пропил, изо-пропил, втор-пропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, трет-амил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил и н-додецил. Если в описании конкретно не указано иное, алкильная группа может быть необязательно замещена. Термин «низший алкил» относится к C₁-C₆ алкилу, который может быть линейным или разветвленным, например, включая разветвленный C₃-C₆ алкил. Примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, бутил, пентил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, 3-метилпентил и т.п. Используемый в данном документе термин «алкил» включает циклоалкил, а также циклоалкилен-содержащий алкил.

[80] «Алкилен», «-алкил-» или «алкиленовая цепь» относятся к полностью насыщенному, прямому или разветвленному двухвалентному углеводородному радикалу, содержащему от одного до двадцати атомов углерода. Неограничивающие примеры C₁-C₂₀ алкилена включают метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. Алкиленовая цепь присоединена к остальной части молекулы посредством одинарной связи и к радикальной группе посредством одинарной связи. Точки присоединения алкиленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут проходить через один атом углерода или любые два атома углерода в цепи. Если в описании конкретно не указано иное, алкиленовая группа может быть необязательно замещена.

[81] «Алкенил» или «алкенильная группа» относится к углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему от двух до двадцати атомов углерода и имеющему одну или несколько углерод-углеродных двойных связей. Каждая алкенильная группа присоединена к остальной части молекулы одинарной связью. Включены алкенильные группы, содержащие любое число атомов углерода от 2 до 20. Алкенильная группа, содержащая до 20 атомов углерода, представляет собой C₂-C₂₀ алкенил, алкенил, содержащий до 10 атомов углерода, представляет собой C₂-C₁₀ алкенил, алкенильная группа, содержащая до 6 атомов углерода, представляет собой C₂-C₆ алкенил и алкенил, содержащий до 5 атомов углерода, представляет собой C₂-C₅ алкенил. C₂-C₅ алкенил включает C₅ алкенилы, C₄ алкенилы, C₃ алкенилы и C₂ алкенилы. C₂-C₆ алкенил включает все фрагменты, описанные выше для C₂-C₅ алкенилов, но также включает C₆ алкенилы. C₂-C₁₀ алкенил включает все фрагменты, описанные выше для C₂-C₅ алкенилов и C₂-C₆ алкенилов, но также включает C₇, C₈, C₉ и C₁₀ алкенилы. Аналогично, C₂-C₁₂ алкенил включает все предыдущие фрагменты, но также включает C₁₁ и C₁₂ алкенилы. Неограничивающие примеры C₂-C₁₂ алкенила включают этенил (винил), 1-пропенил, 2-пропенил (аллил), изо-пропенил, 2-метил-1-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил, 5-гексенил, 1-гептенил, 2-гептенил, 3-гептенил, 4-гептенил, 5-гептенил, 6-гептенил, 1-октенил, 2-октенил, 3-октенил, 4-октенил, 5-октенил, 6-октенил, 7-октенил, 1-ноненил, 2-ноненил, 3-ноненил, 4-ноненил, 5-ноненил, 6-ноненил, 7-ноненил, 8-ноненил, 1-деценил, 2-деценил, 3-деценил, 4-деценил, 5-деценил, 6-деценил, 7-деценил, 8-деценил, 9-деценил, 1-ундеценил, 2-ундеценил, 3-ундеценил, 4-ундеценил, 5-ундеценил, 6-ундеценил, 7-ундеценил, 8-ундеценил, 9-ундеценил, 10-ундеценил, 1-додеценил, 2-додеценил, 3-додеценил, 4-додеценил, 5-додеценил, 6-додеценил, 7-додеценил, 8-додеценил, 9-додеценил, 10-додеценил и 11-додеценил. Если в описании конкретно не указано иное, алкильная группа может быть необязательно замещена.

[82] «Алкенилен» или «алкениленовая цепь» относится к двухвалентному углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему от двух до двадцати атомов углерода и имеющему одну или несколько углерод-углеродных двойных связей. Неограничивающие примеры C₂-C₂₀ алкенилена включают этен, пропен, бутен и т.п. Алкениленовая цепь присоединена к остальной части молекулы посредством одинарной связи и к радикальной группе посредством одинарной связи. Точки присоединения алкениленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут проходить через один атом углерода или любые два атома углерода в цепи. Если в описании конкретно не указано иное, алкениленовая группа может быть необязательно замещена.

[83] «Алкинил» или «алкинильная группа» относится к углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему от двух до двадцати атомов углерода и имеющему одну или несколько углерод-углеродных тройных связей. Каждая алкинильная группа присоединена к остальной части молекулы одинарной связью. Включены алкинильные группы, содержащие любое число атомов углерода от 2 до 20. Алкинильная группа, содержащая до 20 атомов углерода, представляет собой C₂-C₂₀ алкинил, алкинил, содержащий до 10 атомов углерода, представляет собой C₂-C₁₀ алкинил, алкинильная группа, содержащая до 6 атомов углерода, представляет собой C₂-C₆ алкинил и алкинил, содержащий до 5 атомов углерода, представляет собой C₂-C₅ алкинил. C₂-C₅ алкинил включает C₅ алкинилы, C₄ алкинилы, C₃ алкинилы и C₂ алкинилы. C₂-C₆ алкинил включает все фрагменты, описанные выше для C₂-C₅ алкинилов, но также включает C₆ алкинилы. C₂-C₁₀ алкинил включает все фрагменты, описанные выше для C₂-C₅ алкинилов и C₂-C₆ алкинилов, но также включает C₇, C₈, C₉ и C₁₀ алкинилы. Аналогично, C₂-C₁₂ алкинил включает все предыдущие фрагменты, но также включает C₁₁ и C₁₂ алкинилы. Неограничивающие примеры C₂-C₁₂ алкенила включают этинил, пропинил, бутинил, пентинил и т.п. Если в описании конкретно не указано иное, алкильная группа может быть необязательно замещена.

[84] «Алкинилен» или «алкиниленовая группа» относится к двухвалентному углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему от двух до двадцати атомов углерода и имеющему одну или несколько углерод-углеродных тройных связей. Неограничивающие примеры C₂-C₂₀ алкинилена включают этинилен, пропаргилен и т. п. Алкиниленовая цепь присоединена к остальной части молекулы посредством одинарной связи и к радикальной группе посредством одинарной связи. Точки присоединения алкиниленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут проходить через один атом углерода или любые два атома углерода в цепи. Если в описании конкретно не указано иное, алкиниленовая группа может быть необязательно замещена.

[85] «Алкокси» или «-O-алкил» относятся к радикалу формулы -OR_a, где R_a представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двадцати атомов углерода. Если в описании конкретно не указано иное, алкоксигруппа может быть необязательно замещена.

[86] «Алкиламино» относится к радикалу формулы -NHR_a или -NR_aR_a, где каждый R_a независимо представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двенадцати атомов углерода. Если в описании конкретно не указано иное, алкиламиногруппа может быть необязательно замещена.

[87] «Алкилкарбонил» относится к фрагменту -C(=O)R_a, где R_a представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше. Неограничивающим примером алкилкарбонила является метилкарбонильный («ацетальный») фрагмент. Алкилкарбонильные группы также могут обозначаться как «ацил Cw-Cz», где w и z обозначают диапазон числа атомов углерода в R_a, как определено выше. Например, «C1-C₁₀ ацил» относится к алкилкарбонильной группе, как определено выше, где R_a представляет собой C₁-C₁₀ алкильный, C₁-C₁₀ алкенильный или C₁-C₁₀ алкинильный радикал, как определено выше. Если в описании конкретно не указано иное, алкилкарбонильная группа может быть необязательно замещена.

[88] Термин «аминоалкил» относится к алкильной группе, которая замещена одной или несколькими группами -NH₂. В определенных вариантах осуществления аминоалкильная группа замещена одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более группами -NH₂. Аминоалкильная группа может быть необязательно замещена одним или несколькими дополнительными заместителями, как описано в данном документе.

[89] «Арил» относится к радикалу углеводородной кольцевой системы, содержащему атом водород, от 6 до 18 атомов углерода и по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Для целей настоящего описания арильный радикал может представлять собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Арильные радикалы включают, но не ограничиваются ими, арильные радикалы, полученные из ацеантрилена, аценафтилена, ацефенантрилена, антрацена, азулена, бензола, хризена, флуорантена, флуорена, as-индацена, s-индацена, индана, индена, нафталина, феналена, фенантрена, плеядена, пирена и трифенилена. Если в описании конкретно не указано иное, термин «арил» подразумевает включение арильных радикалов, которые необязательно замещены. Арил включает несколько арильных колец, которые могут быть конденсированными, как в нафтиле, или неконденсированными, как в бифениле. Арильные кольца также могут быть конденсированы или не конденсированы с одним или несколькими циклическими углеводородными, гетероарильными или гетероциклическими кольцами. Используемый в данном документе термин «арил» включает гетероарил.

[90] «Аралкил», «арилалкил» или «-алкиларил» относится к радикалу формулы -R_b-R_c, где R_b представляет собой алкиленовую, алкениленовую или алкиниленовую группу, как определено выше, и R_c представляет собой один или несколько арильных радикалов, как определено выше, например , бензил, дифенилметил и т.п. Если в описании конкретно не указано иное, аралкильная группа может быть необязательно замещена.

[91] «Алкокси» относится к группе -OR, где R представляет собой алкил или замещенный алкил, предпочтительно C_1-6 алкил (например, метокси, этокси, пропилокси и т. д.).

[92] «Карбоциклил», «карбоциклическое кольцо» или «карбоцикл» относятся к кольцевой структуре, в которой каждый атом, образующий кольцо, представляет собой атом углерода. Карбоциклические кольца могут содержать от 3 до 20 атомов углерода в кольце. Карбоциклические кольца включают арилы и циклоалкил. Циклоалкенил и циклоалкинил, как определено в данном документе. Если в описании конкретно не указано иное, карбоциклильная группа может быть необязательно замещена.

[93] «Циклоалкил» относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому полностью насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода, предпочтительно имеющие от трех до примерно 12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до примерно 8 атомов углерода, и который присоединен к остальной части молекулы одинарной связью. Моноциклические циклоалкильные радикалы включают, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. Полициклические циклоалкильные радикалы включают, например, адамантил, норборнил, декалинил, 7,7-диметилбицикло[2.2.1]гептанил, бицикло[3.1.0]гексан, октагидропентален, бицикло[1.1.1]пентан, кубан и т.п. Если в описании конкретно не указано иное, циклоалкильная группа может быть необязательно замещена. «Циклоалкилен» относится к циклоалкильной группе, которая встроена в алкильную цепь путем присоединения цепи к любым двум атомам углерода в циклической кольцевой системе.

[94] «Циклоалкенил» относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, имеющему одну или несколько углерод-углеродных двойных связей, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода, предпочтительно имеющий от трех до десяти атомов углерода и присоединенный к остальной части молекулы одинарной связью. Моноциклические циклоалкенильные радикалы включают, например, циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил, циклоктенил и т. п. Полициклические циклоалкенильные радикалы включают, например, бицикло[2.2.1]гепт-2-енил и т.п. Если в описании конкретно не указано иное, циклоалкенильная группа может быть необязательно замещена.

[95] «Циклоалкинил» относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, имеющему одну или несколько тройных углерод-углеродных связей, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода, предпочтительно имеющий от трех до десяти атомов углерода и присоединенный к остальной части молекулы одинарной связью. Моноциклические циклоалкинильные радикалы включают, например, циклогептинил, циклооктинил и т. п. Если в описании конкретно не указано иное, циклоалкинильная группа может быть необязательно замещена.

[96] «Циклоалкилалкил» или «-алкилциклоалкил» относится к радикалу формулы -R_b-R_d, где R_b представляет собой алкиленовую, алкениленовую или алкиниленовую группу, как определено выше, и R_d представляет собой циклоалкильный, циклоалкенильный, циклоалкинильный радикал, как определено выше. Если в описании конкретно не указано иное, циклоалкилалкильная группа может быть необязательно замещена.

[97] «Галогеналкил» относится к алкильному радикалу, как определено выше, который замещен одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более галогенорадикалами, как определено выше, например, трифторметилом, дифторметилом, трихлорметилом, 2,2,2-трифторэтилом, 1,2-дифторэтилом, 3-бром-2-фторпропилом, 1,2-дибромэтилом и т.п. Если в описании конкретно не указано иное, галогеналкильная группа может быть необязательно замещена.

[98] «Галоалкенил» относится к алкенильному радикалу, как определено выше, который замещен одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более галогенорадикалами, как определено выше, например, 1-фторпропенил, 1,1-дифторбутенил и т. п. Если в описании конкретно не указано иное, галогеналкенильная группа может быть необязательно замещена.

[99] «Галогеналкинил» относится к алкинильному радикалу, как определено выше, который замещен одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более галогенорадикалами, как определено выше, например, 1-фторпропинил, 1-фторбутинил и т.п. Если в описании конкретно не указано иное, галогеналкенильная группа может быть необязательно замещена.

[100] Термин «замещенный», как, например, «замещенный алкил», относится к фрагменту (например, алкильной группе), замещенному одним или несколькими не мешающими заместителями, такими как, но не ограничиваясь ими: алкил, C_3-8 циклоалкил, например циклопропил, циклобутил и т.п.; галоген, например, фтор, хлор, бром и йод; циано; нитро; алкокси, низший фенил; замещенный фенил; и тому подобное. «Замещенный арил» представляет собой арил, имеющий одну или несколько немешающих групп в качестве заместителя. Для замещения в фенильном кольце заместители могут иметь любую ориентацию (например, орто-, мета- или пара-).

[101] «Немешающие заместители» представляют собой те группы, которые, когда они присутствуют в молекуле, обычно не вступают в реакцию с другими функциональными группами, содержащимися в молекуле. Неограничивающие примеры включают галоген (F, Br, Cl, I), алкил (например, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, пентил, неопентил, гексил, изоамил и т. п.), галогеналкил (например, CF₃, CHF₂, CH₂F и т.п.), циклоалкил (циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т. п.), алкокси (-OR), галогеналкокси (например, -OCF₃, -OCHF₂, -OCH₂F и т. п.), амино (например, -N(H)алкил, -N(алкил)₂, -NH(циклоалкил), -NH(арил) и т. п.), амидо (например, -NH(COR), сульфонил (например, -SO₂R), ацил (например, -C(O)R, циано, нитро, фенил и гетероарил (например, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиридил, пиримидинил и т. п.), где R независимо представляет собой H, алкил, алкилокси, амино или арил (например, фенил).

[102] «Гетероциклил», «гетероциклическое кольцо» или «гетероцикл» относятся к стабильному 3-20-членному неароматическому кольцевому радикалу, который состоит из двух-двенадцати атомов углерода и от одного до шести гетероатомов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Гетероциклические или гетероциклические кольца включают гетероарилы, как определено ниже. Если в описании конкретно не указано иное, гетероциклильный радикал может представлять собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы; и атомы азота, углерода или серы в гетероциклильном радикале могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно кватернизован; и гетероциклильный радикал может быть частично или полностью насыщенным. Примеры таких гетероциклильных радикалов включают, но не ограничиваются ими, диоксоланил, тиенил[1,3]дитианил, декагидроизохинолил, имидазолинил, имидазолидинил, изотиазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил, 2-оксопирролидинил, оксазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, пиразолидинил, хинуклидинил, тиазолидинил, тетрагидрофурил, тритианил, тетрагидропиранил, тиоморфолинил, тиаморфолинил, 1-оксотиоморфолинил и 1,1-диоксотиоморфолинил. Если в описании конкретно не указано иное, гетероциклильная группа может быть необязательно замещена. В некоторых вариантах осуществления «замещенный гетероцикл» представляет собой гетероцикл, имеющий одну или несколько боковых цепей, образованных из немешающих заместителей.

[103] Термин «гидроксиалкил» или «гидроксиалкил» относится к алкильной группе, которая замещена одной или несколькими гидроксильными (-ОН) группами. В определенных вариантах осуществления гидроксиалкильная группа замещена одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или более группами -ОН. Гидроксиалкильная группа необязательно может быть замещена одним или несколькими дополнительными заместителями, как описано в данном документе.

[104] Термин «гидрокарбил» относится к одновалентному углеводородному радикалу, независимо от того, является ли он алифатическим, частично или полностью ненасыщенным, ациклическим, циклическим или ароматическим, или любой их комбинации. В определенных вариантах осуществления гидрокарбильная группа имеет от 1 до 40 или более, от 1 до 30 или более, от 1 до 20 или более или от 1 до 10 или более атомов углерода. Термин «гидрокарбилен» относится к двухвалентной гидрокарбильной группе. Гидрокарбильная или гидрокарбиленовая группа может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, как описано в данном документе.

[105] Термин «гетерогидрокарбил» относится к гидрокарбильной группе, в которой каждый из одного или нескольких атомов углерода независимо заменен гетероатомом, выбранным из кислорода, серы, азота и фосфора. В определенных вариантах осуществления гетерогидрокарбильная группа содержит от 1 до 40 или более, от 1 до 30 или более, от 1 до 20 или более или от 1 до 10 или более атомов углерода и от 1 до 10 или более, или от 1 до 5 или более гетероатомов. Термин «гетерогидрокарбилен» относится к двухвалентной гидрокарбильной группе. Примеры гетерогидрокарбильных и гетерогидрокарбиленовых групп включают, без ограничения, фрагменты этиленгликоля и полиэтиленгликоля, такие как (-CH₂CH₂O-)_nH (одновалентная гетерогидрокарбильная группа) и (-CH₂CH₂O-)_n (двухвалентная гетерогидрокарбиленовая группа), где n представляет собой целое число от 1 до 12 или более, и фрагменты пропиленгликоля и полипропиленгликоля, такие как (-CH₂CH₂CH₂O-)_nH и (-CH₂CH(CH₃)O-)_nH (одновалентные гетерогидрокарбильные группы) и (-CH₂CH₂CH₂O-)_n и (-CH₂CH(CH₃)O-)_n (двухвалентные гетерогидрокарбиленовые группы), где n представляет собой целое число от 1 до 12 или более. Гетерогидрокарбильная или гетерогидрокарбиленовая группа может быть необязательно замещена одним или несколькими заместителями, как описано в данном документе.

[106] «N-гетероциклил» относится к гетероциклильному радикалу, описанному выше, содержащему по меньшей мере один атом азота, причем точка присоединения гетероциклильного радикала к остальной части молекулы находится у атома азота в гетероциклильном радикале. Если в описании конкретно не указано иное, N-гетероциклильная группа может быть необязательно замещена.

[107] «Гетероциклилалкил» или «-алкилгетероциклил» относится к радикалу формулы -R_b-R_e, где R_b представляет собой алкиленовую, алкениленовую или алкиниленовую цепь, как определено выше, и R_e представляет собой гетероциклильный радикал, как определено выше, и если гетероциклил представляет собой азот-содержащий гетероциклил, гетероциклил может быть присоединен к алкильному, алкенильному, алкинильному радикалу на атоме азота. Если в описании конкретно не указано иное, гетероциклилалкильная группа может быть необязательно замещена.

[108] «Гетероарил» относится к радикалу 5-20-членной кольцевой системы, содержащему атомы водорода, от одного до тринадцати атомов углерода, от одного до шести гетероатомов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы, и по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Для целей настоящего изобретения гетероарильный радикал может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может содержать конденсированные или мостиковые кольцевые системы; и атомы азота, углерода или серы в гетероарильном радикале могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно кватернизован. Примеры включают, помимо прочего, азепинил, акридинил, бензимидазолил, бензотиазолил, бензиндолил, бензодиоксолил, бензофуранил, бензооксазолил, бензотиазолил, бензотиадиазолил, бензо[b][1,4]диоксепинил, 1,4-бензодиоксанил, бензонафтофуранил, бензоксазолил, бензодиоксолил, бензодиоксинил, бензопиранил, бензопиранонил, бензофуранил, бензофуранонил, бензотиенил (бензотиофенил), бензотриазолил, бензо[4,6]имидазо[1,2-а]пиридинил, карбазолил, циннолинил, дибензофуранил, дибензотиофенил, фуранил, фуранонил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, индолил, индазолил, изоиндолил, индолинил, изоиндолинил, изохинолил, индолизинил, изоксазолил, нафтиридинил, оксадиазолил, 2-оксоазепинил, оксазолил, оксиранил, 1-оксидопиридинил, 1-оксидопиримидинил, 1-оксидопиразинил, 1-оксидопиридазинил, 1-фенил-1H-пирролил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, птеридинил, пуринил, пирролил, пиразолил, пиридинил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, хиназолинил, хиноксалинил, хинолинил, хинуклидинил, изохинолинил, тетрагидрохинолинил, тиазолил, тиадиазолил, триазолил, тетразолил, триазинил и тиофенил (т. е., тиенил). Если в описании конкретно не указано иное, гетероарильная группа может быть необязательно замещена. В некоторых вариантах осуществления «замещенный гетероарил» представляет собой гетероарил, имеющий одну или несколько немешающих групп в качестве заместителей.

[109] «N-гетероарил» относится к гетероарильному радикалу, описанному выше, содержащему по меньшей мере один атом азота, причем точка присоединения гетероарильного радикала к остальной части молекулы находится у атома азота в гетероарильном радикале. Если в описании конкретно не указано иное, N-гетероарильная группа может быть необязательно замещена.

[110] «Гетероарилалкил» или «-алкилгетероарил» относится к радикалу формулы -R_b-R_f, где R_b представляет собой алкиленовую, алкениленовую или алкиниленовую цепь, как определено выше, и R_f представляет собой гетероарильный радикал, как определено выше. Если в описании конкретно не указано иное, гетероарилалкильная группа может быть необязательно замещена.

[111] Используемый в данном документе термин «замещенный» означает любую из указанных выше групп (т. е., алкил, алкилен, алкенил, алкенилен, алкинил, алкинилен, алкокси, алкиламино, алкилкарбонил, тиоалкил, арил, аралкил, карбоциклил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкинил, циклоалкилалкил, галогеналкил, гетероциклил, N-гетероциклил, гетероциклилалкил, гетероарил, N-гетероарил и/или гетероарилалкил), где по меньшей мере один атом водорода заменен связью с атомами, отличными от водорода, согласно списку, приведенному в данном документе. Если список заместителей не включен, заместители могут представлять собой, но не ограничиваются ими: атом галогена, такой как F, Cl, Br и I; атом кислорода в группах, таких как гидроксильные группы, алкоксигруппы и сложноэфирные группы; атом серы в группах, таких как тиоловые группы, тиоалкильные группы, сульфоновые группы, сульфонильные группы и сульфоксидные группы; атом азота в группах, таких как амины, амиды, алкиламины, диалкиламины, ариламины, алкилариламины, диариламины, N-оксиды, имиды и енамины; атом кремния в группах, таких как триалкилсилильные группы, диалкиларилсилильные группы, алкилдиарилсилильные группы и триарилсилильные группы; и другие гетероатомы в различных других группах. «Замещенный» также означает любую из вышеуказанных групп, в которой один или несколько атомов водорода заменены связью более высокого порядка (например, двойной или тройной связью) с гетероатомом, таким как кислород в оксо, карбониле, карбоксиле и сложноэфирные группы; и азот в таких группах, как имины, оксимы, гидразоны и нитрилы. Например, «замещенный» включает любую из вышеуказанных групп, в которой один или более атомов водорода заменены галидом, циано, нитро, гидроксилом, сульфгидрилом, амино, -OR_g, -SR_g, -NR_hR_i, алкилом, алкенилом, алкинилом, галогеналкилом, гидроксиалкилом, аминоалкилом, -алкилциклоалкилом, -алкилгетероциклилом, -алкиларилом, -алкилгетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, арилом, гетероарилом, -C(=O)R_g, -C(=NR_j)R_g, -S(=O)R_g, -S(=O)₂R_g, -S(=O)₂OR_k, -C(=O)OR_k, -OC(=O)R_g, -C(=O)NR_hR_i, -NR_gC(=O)R_g, -S(=O)₂NR_hR_i, -NR_gS(=O)₂R_g, -OC(=O)OR_g, -OC(=O)NR_hR_i, -NR_gC(=O)OR_g, -NR_gC(=O)NR_hR_i, -NR_gC(=NR_j)NR_hR_i, -P(=O)(R_g)₂, -P(=O)(OR_k)R_g, -P(=O)(OR_k)₂, -OP(=O)(R_g)₂, -OP(=O)(OR_k)R_g и -OP(=O)(OR_k)₂, где: в каждом случае R_g независимо выбран из водорода, алкила, галогеналкила, гидроксиалкила, аминоалкила, -алкилциклоалкила, -алкилгетероциклила, -алкиларила, -алкилгетероарила, циклоалкила, гетероциклила, арила или гетероарил; в каждом случае R_h и R_i независимо выбраны из водорода, алкила, галогеналкила, гидроксиалкила, аминоалкила, -алкилциклоалкила, -алкилгетероциклила, -алкиларила, -алкилгетероарила, циклоалкила, гетероциклила, арила или гетероарила, или R_h и R_i вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикличное или гетероарильное кольцо; в каждом случае R_j независимо представляет собой водород, -OR_g, алкил, галогеналкил, гидроксиалкил, аминоалкил, -алкилциклоалкил, -алкилгетероциклил, -алкиларил, -алкилгетероарил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; и в каждом случае R_k независимо представляет собой водород, W, алкил, галогеналкил, гидроксиалкил, аминоалкил, -алкилциклоалкил, -алкилгетероциклил, -алкиларил, -алкилгетероарил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где в каждом случае W независимо представляют собой H⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, Cs⁺, Mg⁺², Ca⁺² или -⁺N(R_g)₂R_hR_i.

[112] «Тиоалкил» относится к радикалу формулы -SR_a, где R_a представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двенадцати атомов углерода. Если в описании конкретно не указано иное, тиоалкильная группа может быть необязательно замещена.

[113] Используемый в данном документе термин «органический радикал» должен включать алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил и замещенный арил.

[114] Используемый в данном документе символ « » (далее может упоминаться как «точка присоединения связи») обозначает связь, которая представляет собой точку присоединения между двумя химическими объектами, один из которых изображен присоединенным к точке присоединения связи, а другой из которых не изображен как присоединенный к точке присоединения связи. Например, « » указывает, что химическое соединение «XY» связано с другим химическим соединением через точку присоединения связи. Кроме того, конкретная точка присоединения к неизображенному химическому объекту может быть указана путем вывода. Например, соединение CH₃-R³, где R³ представляет собой H или « », предполагает, что, когда R³ представляет собой «XY», точка присоединения связи представляет собой ту же связь, что и связь, посредством которой R³ изображен как связанный с CH₃.

[115] «Конденсированный» относится к любой кольцевой структуре, описанной в данном документе, которая конденсирована с существующей кольцевой структурой в соединениях по настоящему изобретению. Если конденсированное кольцо представляет собой гетероциклильное кольцо или гетероарильное кольцо, любой атом углерода в существующей кольцевой структуре, который становится частью конденсированного гетероциклильного кольца или конденсированного гетероарильного кольца, может быть заменен атомом азота.

[116] «Электрофил» и «электрофильная группа» относятся к иону или атому или совокупности атомов, которые могут быть ионными, имеющими электрофильный центр, т.е. центр, который ищет электроны, способный вступать в реакцию с нуклеофилом.

[117] «Нуклеофил» и «нуклеофильная группа» относятся к иону или атому или совокупности атомов, которые могут быть ионными, имеющими нуклеофильный центр, т.е. центр, который ищет электрофильный центр или с электрофилом.

[118] «Физиологически расщепляемая», или «гидролизуемая», или «разлагаемая» связь представляет собой связь, которая вступает в реакцию с водой (т.е. гидролизуется) в физиологических условиях. Склонность связи к гидролизу в воде будет зависеть не только от общего типа связи, соединяющей два центральных атома, но и от заместителей, присоединенных к этим центральным атомам. Подходящие гидролитически нестабильные или слабые связи включают, но не ограничиваются ими, карбамат, сложный карбоксилатный эфир, сложный фосфатный эфир, ангидриды, ацетали, кетали, ацилоксиалкиловый эфир, имины, ортоэфиры, пептиды и олигонуклеотиды.

[119] «Высвобождаемый линкер» относится к линкеру, который соединяет белок с макромолекулами. В результате гидролиза, ферментативных процессов, каталитических процессов или иным образом макромолекула высвобождается, что приводит к образованию неконъюгированного белкового фрагмента. В определенных вариантах осуществления высвобождаемый линкер высвобождает макромолекулу посредством вышеупомянутых процессов, происходящих in vivo.

[120] «Ферментативно расщепляемая связь» означает связь, которая подвергается расщеплению одним или несколькими ферментами.

[121] «Гидролитически стабильная» связь или связь относится к химической связи, обычно ковалентной связи, которая по существу стабильна в воде, то есть не подвергается гидролизу в физиологических условиях в какой-либо заметной степени в течение продолжительного периода времени. Примеры гидролитически стабильных связей включают, но не ограничиваются ими, следующие: углерод-углеродные связи (например, в алифатических цепях), углерод-серные связи, простые эфиры, амиды, уретаны и т.п. Как правило, гидролитически стабильной связью является такая связь, которая демонстрирует скорость гидролиза менее около 1-2% в день в физиологических условиях. Скорости гидролиза типичных химических связей можно найти в большинстве стандартных учебников по химии.

[122] «Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или носитель» относится к вспомогательному веществу, которое необязательно может быть включено в композиции по настоящему изобретению и которое не вызывает значительных неблагоприятных токсикологических эффектов у пациента. Термины «фармакологически эффективное количество», «физиологически эффективное количество» и «терапевтически эффективное количество» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения количества конъюгата белок-макромолекула, которое необходимо для обеспечения желаемого уровня конъюгата (или соответствующего неконъюгированного белка) в кровотоке или в ткани-мишени. Точное количество будет зависеть от множества факторов, например, от конкретного белка, компонентов и физических характеристик терапевтической композиции, предполагаемой популяции пациентов, индивидуальных соображений пациентов и т.п., и может быть легко определено специалистом в данной области техники на основе информации, представленной в данном документе.

[123] Термин «фрагмент IL-2», используемый в данном документе, относится к фрагменту, обладающему активностью человеческого IL-2. Фрагмент IL-2 также будет иметь по меньшей мере одну электрофильную группу или нуклеофильную группу, подходящую для реакции с полимерным реагентом. Кроме того, термин «фрагмент IL-2» охватывает как фрагмент IL-2 до конъюгации, так и остаток фрагмента IL-2 после конъюгации. Как будет более подробно объяснено ниже, специалист в данной области техники может определить, обладает ли какой-либо указанный фрагмент активностью IL-2. Белки, содержащие аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности на фиг. 1, представляют собой фрагмент IL-2, а также любой белок или полипептид, по существу гомологичный ему. Используемый в данном документе термин «фрагмент IL-2» включает такие белки, модифицированные преднамеренно, например, путем сайт-направленного мутагенеза или случайно посредством мутаций. Эти термины также включают аналоги, имеющие от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксиконце белка, где дополнительная(-ые) аминокислота(-ы) включает (включают) по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере один сайт гликозилирования. Термин включает как природные, так и рекомбинантно полученные фрагменты.

[124] Термин «по существу гомологичный» означает, что конкретная рассматриваемая последовательность, например, мутантная последовательность, отличается от эталонной последовательности одной или несколькими заменами, делециями или добавлениями, суммарный эффект которых не приводит к неблагоприятному функциональному несходству между эталонной и рассматриваемой последовательностями. Для целей настоящего изобретения последовательности, имеющие более 80 процентов (более предпочтительно более 85 процентов, еще более предпочтительно более 90 процентов, причем наиболее предпочтительно более 95 процентов) гомологии, эквивалентную биологическую активность (хотя не обязательно эквивалентную силу биологической активности), и эквивалентные характеристики экспрессии считаются по существу гомологичными. В целях определения гомологии усечение зрелой последовательности не следует принимать во внимание.

[125] Термин «фрагмент» означает любой белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность части или участка фрагмента IL-2 и обладающий биологической активностью IL-2. Фрагменты включают белки или полипептиды, полученные в результате протеолитического расщепления фрагмента IL-2, а также белки или полипептиды, полученные в результате химического синтеза способами, общепринятыми в данной области техники.

[126] Термин «пациент» относится к живому организму, страдающему или склонному к состоянию, которое можно предотвратить или лечить путем введения активного средства (например, конъюгата), и включает как людей, так и животных.

[127] «Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное впоследствии обстоятельство может или не может происходить, так что описание включает случаи, когда обстоятельство происходит, и случаи, когда оно не происходит.

[128] «По существу» означает почти полностью или полностью, например, удовлетворяя одному или нескольким из следующих требований: более 50%, 51% или более, 75% или более, 80% или более, 90% или и 95% или более состояния.

[129] Аминокислотные остатки в пептидах обозначаются следующим образом: фенилаланин представляет собой Phe или F; лейцин представляет собой Leu или L; изолейцин представляет собой lie или I; метионин представляет собой Met или M; валин представляет собой Val или V; серин представляет собой Ser или S; пролин представляет собой Pro или P; треонин представляет собой Thr или T; аланин представляет собой Ala или А; тирозин представляет собой Tyr или Y; гистидин представляет собой His или H; глютамин представляет собой Gln или Q; аспарагин представляет собой Asn или N; лизин представляет собой Lys или K; аспарагиновая кислота представляет собой Asp или D; глутаминовая кислота представляет собой Glu или E; цистеин представляет собой Cys или C; триптофан представляет собой Trp или W; аргинин представляет собой Arg или R; и глицин представляет собой Gly или G.

[130] Настоящее изобретение включает все фармацевтически приемлемые меченые изотопами соединения согласно настоящему изобретению, в которых один или несколько атомов заменены атомами, имеющими такой же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличающееся от атомной массы или массового числа, обычно встречающихся в природе. Примеры изотопов, подходящих для включения в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, такие как ²H и ³H, углерода, такие как ¹¹C, ¹³C и ¹⁴C, хлора, такие как ³⁶Cl, фтора, такие как ¹⁸F, йода, такие как ¹²³I и ¹²⁵I, азота, такие как ¹³N и ¹⁵N, кислорода, такие как ¹⁵O, ¹⁷O и ¹⁸O, фосфора, такие как ³²P, и серы, такие как ³⁵S.

[131] Некоторые меченые изотопами соединения по настоящему изобретению, например соединения, включающие радиоактивный изотоп, полезны в исследованиях распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Радиоактивные изотопы тритий, т. е. ³Н, и углерод-14, т. е. ¹⁴С, особенно пригодны для этой цели ввиду простоты их введения и удобных средств обнаружения.

[132] Замена более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, т.е. ²H, может обеспечить определенные терапевтические преимущества, обусловленные большей метаболической стабильностью, например, увеличение периода полувыведения in vivo или снижение требований к дозировке, и, следовательно, может быть предпочтительной в некоторых обстоятельствах.

[133] Замещение позитронно-активными изотопами, такими как ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O и ¹³N, может быть полезным в исследованиях позитронно-эмиссионной топографии (PET) для изучения занятости рецептора субстрата.

[134] Соединения, меченные изотопами, согласно изобретению, как правило, могут быть получены обычными способами, известными специалистам в данной области техники.

[135] Фраза «энантиомер, смесь энантиомеров, смесь двух или более диастереомеров, таутомер, смесь двух или более таутомеров, региоизомер, смесь двух или более региоизомеров или их изотопный вариант; или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или пролекарство» имеет то же значение, что и фраза «(i) энантиомер, смесь энантиомеров, смесь двух или более диастереомеров, таутомер, смесь двух или более таутомеров, региоизомер, смесь двух или более региоизомеров или изотопный вариант соединения, указанного в нем; (ii) фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или пролекарство соединения, указанного в нем; или (iii) фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или пролекарство энантиомера, смеси энантиомеров, смеси двух или более диастереомеров, таутомера, смеси двух или более таутомеров, региоизомера, смеси двух или более региоизомеров, или изотопного варианта соединения, указанного в нем».

Способы получения

[136] Настоящее изобретение обеспечивает способ получения конъюгатов белок-[макромолекула]z для контроля скорости доставки терапевтических белковых средств при введении пациентам, нуждающимся в лечении терапевтическими средствами. Конъюгаты, полученные способами по настоящему изобретению, обеспечивают средства доставки терапевтических средств в течение продолжительного периода времени, контролируемого скоростью высвобождения линкеров и количеством макромолекул.

[137] В одном аспекте изобретение относится к способам получения конъюгатов белок-макромолекула с использованием схемы (I):

(схема I)

где x представляет собой целое число в диапазоне 1-25;

y представляет собой целое число в диапазоне 0-24;

z представляет собой целое число в диапазоне 1-25;

x=y+z;

L представляет собой линкер;

FG⁰ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с нуклеофильной группой активного белкового средства с образованием связи, включая карбаматную связь, тиоловый мостик и т.п.;

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с FG³ посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO));

FG³ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с FG² посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO));

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид;

Цитокин включает GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α или TNF-β.

[138] В определенных вариантах осуществления цитокин представляет собой IL-2.

[139] В определенных вариантах осуществления IL-2 содержит около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1.

[140] Хемокин включает MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-24, MCP-5, CXCL76, I-309 (CCL1), BCA1 (CXCL13), MIG, SDF-1/PBSF, IP-10, I-TAC, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, эотаксин-1, эотаксин-2, GCP-2, Gro-α, Gro-β, Gro-γ, LARC (CCL20), ELC (CCL19), SLC (CCL21), ENA-78, PBP, TECK(CCL25), CTACK (CCL27), MEC, XCL1, XCL2, HCC-1, HCC-2, HCC-3 или HCC-4.

[141] Антитело нацелено на один или несколько из ангиопоэтина 2, AXL, ACVR2B, ангиопоэтина 3, активин-рецептороподобной киназы 1, амилоидного A-белка, β -амилоида, AOC3, BAFF, BAFF-R, B7-H3, BCMAC, A-125 (имитация), C5, CA-125, CCL11 (эотаксин-1), CEA, CSF1R, CD2, CD3, CD4, CD6, CD15, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD54, CD56, CD70, CD74, CD97B, CD125, D134, CD147, CD152, CD154, CD279, CD221, антигена C242, CD276, CD278, CD319, Клостридиум диффициле, клаудина 18 изоформа 2, CSF1R, CEACAM5, CSF2, карбоангидразы 9, CLDN18.2, сердечного миозина, CCR4, CGRP, фактора коагуляции III, c-Met, CTLA-4, DPP4, DR5, DLL3, DLL4, дабигатрана, EpCAM, гликопротеина вируса Эбола, эндоглина, эписиалина, EPHA3, c-Met, FGFR2, бета-цепи фибрина II, FGF 23, рецептора фолата 1, GMCSF, ганглиозида GD2, GDF-8, GCGR, желатиназы B, глипикана 3, GPNMB, рецептора α-цепи GMCSF, калликреина, KIR2D, ICAM-1, ICOS, IGF1, IGF2, рецептора IGF-1, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4Rα, IL-5, IL-6, IL-6 R, IL-9, IL-12, IL-13, IL17A, IL17F, IL-20, IL-22, IL-23, IL-31, IFN-α, IFN- β, IFN-γ, интегрина α4β7, рецептора интерферона α/β, гемаглюттинина гриппа A, ILGF2, HER1, HER2, HER3, HHGFR, HGF, HLA-DR, поверхностного антигена гепатита В, HNGF, Hsp90, HGFR, L-селектина, антигена Lewis-Y, LYPD3, LOXL2, LIV-1, MUC1, MCP-1, MSLN, мезотелина, MIF, MCAM, NCA-90, NCA-90Notch 1, нектина-4, PCDP1, PD-L1, PD-1, PCSK9, PTK7, PCDC1, фосфатидилсерина, RANKL, RTN4, резус-фактора, ROR1, SLAMF7, альфа-токсина Staphylococcus aureus, бикомпонентного лейкоцидина Staphylococcus aureus, SOST, селектина P, SLITRK6, SDC1, TFPI, TRAIL-R2, антигена опухоли CTAA16.88, TNF-α, рецептора TWEAK, TNFRSF8, TYRP1, тау-белка, TAG-72, TSLP, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TGF-β, TAG-72, TRAP, TIGIT, тенасцина C, OX-40, VEGF-A, VWF, VEGFR1 или VEGFR2.

[142] Пептиды включают, но не ограничиваются ими: глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), эксендин-2, эксендин-3, эксендин-4, предсердный натрийуретический фактор (ANF), грелин, вазопрессин, гормон роста, гормон, высвобождающий гормон роста (GHRH), RC-3095, соматостатин, бомбезин, PCK-3145, Phe-His-Ser-Cys-Asn (PHSCN), IGFl, натрийуретический пептид B-типа, пептид YY (PYY), интерфероны, тромбоспондин, ангиопоэтин, кальцитонин, гонадотропин-высвобождающий гормон, гирудин, глюкагон, анти-ФНО-альфа, фактор роста фибробластов, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, обинепитид, гормон гипофиза щитовидной железы (PTH), лейпрорелин, серморелин, праморелин, несиритид, ротигаптид, циленгитид, MBP-8298, AL-108, энфувиртид, тималфазин, даптамицин, HLFI-II, лактоферрин, делмитид, глутатион, Т-клеточный эпитоп PR1, пептиды протеазы-3 1-11, В-клеточный эпитоп P3, лютеинизирующий гормон-высвобождающий гормон (LHRH), вещество P, нейрокинин A, нейрокинин B, CCK-8, энкефалины, включая лейцин-энкефалин и метионин-энкефалин, дермасептин, [des-Ala20, Gln34]-дермасептин, антимикробный анионный пептид, ассоциированный с поверхностно-активным веществом, апидецин IA ; апидецин IB; OV-2; 1025, амид ацетил-адгезинового пептида (1025-1044); теромацин (49-63); пексиганан (MSI-78); индолицидин; апелин-15 (63-77); CFPIO (71-85); летальный фактор (LF), относящийся к ингибитору антраксу; бактенецин; ингибитор 2 протеазы вируса гепатита С NS3; ингибитор 3 протеазы NS3 вируса гепатита С; ингибитор 4 протеазы NS3 вируса гепатита; вирус гепатита С NS4A-NS4B (ингибитор протеазы NS3 I); ВИЧ-1, субстрат протеазы ВИЧ-2; пептид против FM; Bak-ВН3; пептид Bax BH3 (55-74) (дикий тип); Bid BH3-r8; СТТ (ингибитор желатиназы); E75 (Her-2/neu) (369-377); пептидный связующий химерный мотив GRP78; р53(17-26); антагонист EGFR2/KDR; коливелин AGA-(C8R) HNG17 (производное гуманина); зависимый от активности нейротрофический фактор (ADNF); ингибитор бета-секретазы I; ингибитор бета-секретазы 2; ch[бета]-амилоид (30-16); Humanun (HN) sHNG, [Glyl4]-HN, [Glyl4]-Humanin; ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (BPP); ингибитор ренина III; аннексин I (ANXA-I; Ac2-12); противовоспалительный пептид I; противовоспалительный пептид 2; противовоспалительный апелин 12; [D-Phel2, Leul4]-бомбезин; пептид Antennapedia (кислота) (пенетратин); лидерный пептид Antennapedia (CT); мастопаран; [Thr28, Nle31]-холецистокинин (25-33) сульфатный; ноцицептин (1-13) (амид); фактор, ингибирующий фибринолиз; гамма-фибриноген (377-395); ксенин; обестатин (человека); [Hisl, Lys6]-GHRP (GHRP-6); [Ala5, [бета]-Ala8]-нейрокинин A (4-10); нейромедин В; нейромедин С; нейромедин N; зависимый от активности нейротрофический фактор (ADNF-14); ацеталин I (антагонист опиоидных рецепторов I); ацеталин 2 (антагонист опиоидных рецепторов 2); ацеталин 3 (антагонист опиоидных рецепторов 3); ACTH (1-39) (человека); ACTH (7-38) (человека); саувагин; адипокинетический гормон (Locusta Migratoria); миристоилированный фактор 6 рибозилирования ADP, myr-ARF6 (2-13); PAMP (1-20) (проадреномедуллин (1-20) человека); AGRP (25-51); амилин (8-37) (человека); ангиотензин I (человека); ангиотензин II (человека); апстатин (ингибитор аминопептидазы Р); бревинин-I; магаинин I; RL-37; LL-37 (противомикробный пептид) (человека); цекропин А; антиоксидантный пептид А; антиоксидантный пептид В; L-камозин; BcI 9-2; NPVF; нейропептид AF (hNPAF) (человека); пептид Bax BH3 (55-74); ингибиторный пептид bFGF; ингибиторный пептид bFGF II; брадикинин; [Des-Argl OJ-HOE 140; ингибитор II каспазы I; ингибитор VIII каспазы I; белок Smac N7 (пептидный ингибитор I, производный от MEK1; hBD-1 ([бета]-дефенсин-1) (человека); hBD-3 ([бета]-дефенсин-3) (человека); hBD-4 ([бета]-дефенсин-4) (человека); HNP-I (нейтрофильный пептид дефензина человека I); HNP-2 (нейтрофильный пептид дефензина человека 2 динорфин А (1-17)); эндоморфин-I; [бета]-эндорфин (человеческий свиной); эндотелин 2 (человека); пептид ингибитора связывания фибриногена; цикло(-GRGDSP); TP508 (пептид, полученный из тромбина); галанин (человека); GIP (человека); пептид, высвобождающий гастрин (человека); гастрин-1 (человека); грелин (человека); пептид PDGF-BB; [D-Lys3]-GHRP-6; основной белок HCV (1-20); фрагмент пептида интегрина a3Bl (325) (амид); ламинин пентапептид (амид) меланотропин-потенцирующий фактор (MPF); VA-[бета]-MSH, липотропин-Y (производное проопиомеланокортина); предсердный натрийуретический пептид (1-28) (человека); вазонатрина пептид (1-27); [Ala5, B-Ala8]-нейрокинин А (4-10); нейромедин L (NKA); Ac-(Leu28, 31)-нейропептид Y (24-26); алитезин; мозговой нейропептид II; [D-tyrll]-нейротензин; ингибиторный пептид связывающего домена NEMO IKKy (NBD); ингибиторный пептид PTD-p50 (NLS); орексин А (бычий, человеческий, мышиный, крысиный); орексин В (человека); аквапорин-2 (254-267) (панкреастатин человека) (37-52); полипептид поджелудочной железы (человека); нейропептид; пептид YY (3-36) (человека); гидроксиметил-фитохелатин 2; PACAP (I-27) (амид, человеческий, бычий, крысиный); пептид, высвобождающий пролактин (1-31) (человека); салузин-альфа; салузин-бета; сапозин С22; секретин (человека); L-селектин; эндокинин А/В; эндокинин С (человека); эндокинин D (человека); агонист рецептора тромбина (42-48) (человека); LSKL (ингибитор тромбоспондина); тиреотропин-рилизинг-гормон (TRH); фрагмент P55-TNFR; уротензин II (человека); VIP (человека, свиньи, крысы); VIP-антагонист; гелодермин; эксенатид; ZPlO (AVEOOIOO); прамлинитид; AC162352 (PYY)(3-36); PYY; обинепитид; глюкагон; GRP; грелин (GHRP6); лейпролид; гистрелин; окситоцин; атозибан (RWJ22164); серморелин; несиритид; бивалирудин (гирулог); икатибант; авиптадин; ротигаптид (ZP123, GAP486); циленгитид (EMD-121924, пептиды RGD); AlbuBNP; BN-054; ангиотензин II; MBP-8298; пептид лейцин аргинин; зиконотид; AL-208; AL-108; карбетикон; трипептид; SAL; коливен; гуманин; ADNF-14; VIP (вазоактивный кишечный пептид); тималфазин; бацитрацин; грамидицин; пексиганан (MSI-78); Pl 13; PAC-113; SCV-07; HLFl-Il (лактоферрин); DAPTA; TRI-1144; тритрптицин; антифламин 2; Gattex (тедуглутид, ALX-0600); стимувакс (L-BLP25); хризалин (TP508); меланонан II; спантид II; церулетид; синкалид; пентагастин; секретин; пептид эндостатин; Е-селектин; HER2; IL-6; IL-8; IL-10; PDGF; тромбоспондин; uPA (I); uPA (2); VEGF; VEGF (2); пентапептид-3; XXLRR; бета-амилоидный фибриллогенез; эндоморфин-2; TIP 39 (тубероинфундибулярный нейропептид); PACAP (1-38) (амид, человеческий, бычий, крысиный); пептид, активирующий TGFB; инсулинсенсибилизирующий фактор (ISF402); пептид трансформирующего фактора роста BI (TGF-B1); рилизинг-фактор церулеина; IELLQAR (8-branchMAPS); тигапотид PK3145; гозерелин; абареликс; цетрореликс; ганиреликс; дегареликс (трипторелин); барусибан (FE 200440); пралморелин; октреотид; эптифибатид; нетамифтид (INN-00835); даптамицин; спантид II; делмитид (RDP-58); AL-209; энфувиртид; IDR-I; гексапептид-6; цепь инсулина-А; ланреотид; гекса[rho]пептид-3; В-цепь инсулина; цепь гларгин-А; цепь гларгин-В; аналог B-цепи инсулин-LisPro; аналог В-цепи инсулин-аспарта; аналог В-цепи инсулин-глулизин; аналог В-цепи инсулин-детермир; аналог соматостатина, ингибирующий опухоль; панкреастатин (37-52); фрагмент вазоактивного кишечного пептида (KKYL-NH2) и динорфин А. Примеры белков, подходящих для использования в изобретении, включают, но не ограничиваются ими: иммунотоксин SSIP, аденозиндезаминазу, аргининазу и другие.

[143] Макромолекула может представлять собой водорастворимый полимер, липид, белок или полипептид. В некоторых вариантах осуществления макромолекула содержит жирную кислоту, содержащую от около 6 до около 26 атомов углерода, полимер, выбранный из группы, состоящей из 2-метакрилоилоксиэтилфосфоилхолинов, поли(акриловых кислот), поли(акрилатов), поли(акриламидов), поли(N-акрилоилморфолина), поли(алкилокси)полимеров, поли(амидов), поли(амидоаминов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(аспартамидов), поли(масляных кислот), поли(гликолевой кислоты), полибутилентерефталатов, поли(капролактонов), поли(карбонатов), поли(цианоакрилатов), поли(диметилакриламидов), поли(эфиров), поли(этиленов), поли(этиленгликолей), поли(этиленоксидов), поли(этилфосфатов), поли(этилоксазолинов), поли(гликолевых кислот), поли(α-гидроксикислоты), поли(гидроксиэтилакрилатов), поли(гидроксиэтилоксазолинов), поли(гидроксиметакрилатов), поли(гидроксиалкилметакриламидов), поли(гидроксиалкилметакрилатов), поли(гидроксипропилоксазолинов), поли(иминокарбонатов), поли(молочных кислот), поли(молочно-гликолевых кислот), поли(метакриламидов), поли(метакрилатов), поли(метилоксазолинов), поли(органофосфазенов), поли(ортоэфиров), поли(оксазолинов), поли(оксиэтилированного полиола), поли(олефинового спирта), полифосфазена, поли(пропиленгликолей), поли(сахарида), поли(силоксанов), поли(уретанов), поли(виниловых спиртов), поли(виниламинов), поли(винилметиловых эфиров), поли(винилпирролидонов), силиконов, амилозы, целлюлозы, карбометилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, хитинов, хитозанов, декстранов, декстринов, желатинов, гиалуроновых кислот (ГК) и производных, функционализированных гиалуроновых кислот, маннанов, пектинов, гепарина, гепарансульфата (HS), рамногалактуронаны, крахмалов, гидроксиалкилкрахмалов, гидроксиэтилкрахмалов (HES), полисиаловой кислоты (PSA) и других полимеров на основе углеводов, ксиланов и сополимеров.

[144] Макромолекула также может представлять собой белок или полипептид, выбранный из группы, состоящей из альбумина, трансферрина, транстиретина, иммуноглобулина, пептида XTEN, полимера гомоаминокислоты, богатого глицином (HAP), полипептида PAS, эластиноподобного полипептида (ELP), пептида CTP или полимера желатиноподобного белка (GLK).

[145] В определенных вариантах осуществления линкер L представляет собой остаток высвобождаемого линкера (RL).

[146] В определенных вариантах осуществления x или z представляет собой 2 или более. В определенных вариантах осуществления x или z представляет собой 3 или более. В определенных вариантах осуществления x или z представляет собой 4 или более. В определенных вариантах осуществления x или z представляет собой 5 или более. В определенных вариантах осуществления x или z представляет собой 6 или более. В определенных вариантах осуществления x или z представляет собой более 6.

[147] В определенных вариантах осуществления способы получения, описанные в данном документе, относятся к первой стадии, включающей конъюгацию белка с несколькими бифункциональными линкерами. Ожидается, что из-за небольшого размера линкеров процесс конъюгации более эффективен и может быть достигнуто более высокое число конъюгаций по сравнению с конъюгацией белка непосредственно с макромолекулами. Также описанная в данном документе вторая стадия раскрытых способов может включать клик-химию, предназначенную для связывания линкеров с макромолекулами с высокой эффективностью. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считается, что этот метод обеспечивает преимущество минимизации стерических затруднений, что, следовательно, может повысить эффективность реакции. Кроме того, стадии синтеза и очистки упрощены и менее затратны, поэтому этот способ обеспечивает значительное преимущество для крупномасштабного производства и изготовления полимерно-белковых терапевтических средств.

Бифункциональные высвобождаемые линкеры

[148] Конъюгаты по настоящему изобретению могут быть получены из бифункциональных высвобождаемых линкеров.

[149] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к бифункциональным высвобождаемым линкерам формулы (I):

(I),

или их стереоизомеру, таутомеру или их смеси, или их изотопному варианту;

где:

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X² представляет собой второй спейсерный фрагмент;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

a представляет собой целое число от 0 до 4;

b представляет собой целое число от 1 до 3;

c представляет собой целое число от 0 до 1;

FG¹ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием высвобождаемой связи, такой как карбаматная связь; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

[150] В некоторых вариантах осуществления формулы (I) каждый из R¹ и R² независимо представляет собой C_1-5 алкил, замещенный C_1-5 алкил, C_2-6 алкенил, замещенный C_2-6 алкенил, C₂-₆ алкинил, замещенный C₂-₆ алкинил, фенил или замещенный фенил. В определенных вариантах осуществления каждый из R¹ и R² независимо представляет собой C_1-5 алкил или замещенный C_1-5 алкил.

[151] В некоторых вариантах осуществления формулы (I) R^e представляет собой нитро, циано, галоген, -CONH(C_1-5 алкил) или -CONH(фенил), замещенный -CONH(C_1-5 алкил) или -CONH(фенил), - SO₂NH(C_1-5 алкил) или - SO₂NH(фенил), замещенный - SO₂NH(C_1-5 алкил) или - SO₂NH(фенил), - SO₂(C_1-5 алкил) или - SO₂(фенил), замещенный - SO₂(C_1-5 алкил) или -SO₂(фенил), C_1-5 алкокси, замещенный C_1-5 алкокси, C_1-5 алкил или C_3-6 циклоалкил, замещенный C_1-5 алкил или C_3-6 циклоалкил, фенил или 5-6-членный гетероарил или замещенный фенил или 5-6-членный гетероарил.

[152] В некоторых вариантах осуществления формулы (I) a представляет собой целое число от 0 до 3. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой целое число от 0 до 2. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 0. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 1. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 2. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 3. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 4.

[153] В некоторых вариантах осуществления формулы (I) b представляет собой целое число от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 1. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 2. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 3.

[154] В некоторых вариантах осуществления формулы (I), в некоторых вариантах осуществления c представляет собой 0. В некоторых вариантах осуществления c представляет собой 1.

[155] В некоторых вариантах осуществления формулы (I) каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами.

[156] В формуле (I) предусмотрены бифункциональные высвобождаемые линкеры, имеющие более определенные структуры:

(I-B); (I-C)

где каждый из X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент; X² представляет собой второй спейсерный фрагмент; R¹, R², [R^e]_a, FG¹ и FG² определены выше.

[157] В определенных вариантах осуществления формулы (I), (I-B) или (I-C) a представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой H, Me или Et; и R^e представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[158] В определенных вариантах осуществления формулы (I), (I-B) или (I-C) бифункциональный высвобождаемый линкер имеет следующую структуру:

или

.

[159] В другом аспекте настоящее изобретение относится к бифункциональным высвобождаемым линкерам формулы (XVIII):

(XVIII),

или их стереоизомеру, таутомеру или их смеси, или их изотопному варианту;

где:

X¹ представляет собой спейсерный фрагмент;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

a представляет собой целое число от 0 до 4;

c представляет собой 2;

FG¹ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием расщепляемой связи; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии.

[160] В определенных вариантах осуществления формулы (XVIII) a представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой водород, Me или Et; и R^e представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[161] В определенных вариантах осуществления формулы (XVIII) бифункциональный высвобождаемый линкер имеет одну из следующих структур:

или

.

[162] В другом аспекте настоящее изобретение относится к бифункциональному высвобождаемому линкеру формулы (II):

(II),

или его стереоизомеру, таутомеру или их смеси, или его изотопному варианту;

где:

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой третий спейсерный фрагмент;

FG¹ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием высвобождаемой связи, такой как карбаматная связь; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

[163] В некоторых вариантах осуществления формулы (II) каждый из R¹ и R² независимо представляет собой C_1-5 алкил, замещенный C_1-5 алкил, C_2-6 алкенил, замещенный C_2-6 алкенил, C₂-₆ алкинил, замещенный C₂-₆ алкинил, фенил или замещенный фенил. В определенных вариантах осуществления каждый из R¹ и R² независимо представляет собой C_1-5 алкил или замещенный C_1-5 алкил.

[164] В некоторых вариантах осуществления формулы (II) каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, галогеналкил (например, -CF₃, -CHF₂, -CH₂F, -CH₂F), -OC_1-5 алкил, -O-галогеналкил (например, -OCF₃, -OCHF₂, -OCH₂F, -OCH₂F), -NH(C_1-5 алкил), -NHCO(C_1-5 алкил), -NHSO₂(C_1-5 алкил), -CONH(C_1-5 алкил) или -SO₂NH(C_1-5 алкил). В определенных вариантах осуществления каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[165] В некоторых вариантах осуществления формулы (II) каждый из X² и X³ независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются разными спейсерными фрагментами.

[166] В определенных вариантах осуществления формулы (II) каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой H, Me или Et; и каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[167] Другие иллюстративные бифункциональные линкеры соответствуют следующей формуле (II-A) или (II-B):

(II-A);

где R^e представляет собой водород или группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила. В определенных вариантах осуществления R^e представляет собой водород или фтор.

(II-B)

[168] Эти реагенты, обеспечивающие высвобождение связи, могут быть получены в соответствии с процедурами, изложенными в US 20060293499A1.

[169] В другом аспекте настоящее изобретение относится к бифункциональным высвобождаемым линкерам формулы (III):

(III),

или их стереоизомеру, таутомеру или их смеси, или их изотопному варианту;

где:

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^p представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)); и

FG⁴ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием амидной связи.

[170] В некоторых вариантах осуществления формулы (III) каждый из R¹, R² и R^p независимо представляет собой C_1-5 алкил, замещенный C_1-5 алкил, C_2-6 алкенил, замещенный C_2-6 алкенил, C₂-₆ алкинил, замещенный C₂-₆ алкинил, фенил или замещенный фенил. В определенных вариантах осуществления каждый из R¹ и R² независимо представляет собой C_1-5 алкил или замещенный C_1-5 алкил.

[171] В некоторых вариантах осуществления формулы (III) каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, галогеналкил (например, -CF₃, -CHF₂, -CH₂F, -CH₂F), -OC_1-5 алкил, -O-галогеналкил (например, -OCF₃, -OCHF₂, -OCH₂F, -OCH₂F), -NH(C_1-5 алкил), -NHCO(C_1-5 алкил), -NHSO₂(C_1-5 алкил), -CONH(C_1-5 алкил) или -SO₂NH(C_1-5 алкил). В определенных вариантах осуществления каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[172] В некоторых вариантах осуществления формулы (III) каждый из X² и X³ независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются разными спейсерными фрагментами.

[173] В определенных вариантах осуществления формулы (III) каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой H, Me или Et; и каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[174] Иллюстративные бифункциональные линкеры соответствуют следующей формуле (III-A)

(III-A).

[175] В другом аспекте настоящее изобретение относится к бифункциональным высвобождаемым линкерам формулы (IV):

(IV),

или их стереоизомеру, таутомеру или их смеси, или их изотопному варианту;

где:

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R³ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R⁴ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

c представляет собой целое число от 0 до 4;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^d представляет собой нитро, циано, галоген, амид, замещенный амид, сульфон, замещенный сульфон, сульфонамид, замещенный сульфонамид, алкокси, замещенный алкокси, алкил или циклоалкил, замещенный алкил или циклоалкил, арил или гетероарил, или замещенный арил или гетероарил;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

FG¹ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием высвобождаемой связи, такой как карбаматная связь; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

[176] В некоторых вариантах осуществления формулы (IV) каждый из R¹, R², R³ и R⁴ независимо представляет собой C_1-5 алкил, замещенный C_1-5 алкил, C_2-6 алкенил, замещенный C_2-6 алкенил, C₂-₆ алкинил, замещенный C₂-₆ алкинил, фенил или замещенный фенил. В определенных вариантах осуществления каждый из R¹, R², R³ и R⁴ независимо представляет собой C_1-5 алкил или замещенный C_1-5 алкил.

[177] В некоторых вариантах осуществления формулы (IV) каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, галогеналкил (например, -CF₃, -CHF₂, -CH₂F, -CH₂F), -OC_1-5 алкил, -O-галогеналкил (например, -OCF₃, -OCHF₂, -OCH₂F, -OCH₂F), -NH(C_1-5 алкил), -NHCO(C_1-5 алкил), -NHSO₂(C_1-5 алкил), -CONH(C_1-5 алкил) или -SO₂NH(C_1-5 алкил). В определенных вариантах осуществления каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[178] В некоторых вариантах осуществления формулы (IV) R^d представляет собой нитро, циано, галоген, -CONH(C_1-5 алкил) или -CONH(фенил), замещенный -CONH(C_1-5 алкил) или -CONH(фенил), - SO₂NH(C_1-5 алкил) или - SO₂NH(фенил), замещенный - SO₂NH(C_1-5 алкил) или - SO₂NH(фенил), - SO₂(C_1-5 алкил) или - SO₂(фенил), замещенный - SO₂(C_1-5 алкил) или -SO₂(фенил), C_1-5 алкокси, замещенный C_1-5 алкокси, C_1-5 алкил или C_3-6 циклоалкил, замещенный C_1-5 алкил или C_3-6 циклоалкил, фенил или 5-6-членный гетероарил или замещенный фенил или 5-6-членный гетероарил.

[179] В некоторых вариантах осуществления формулы (IV) каждый из X² и X³ независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются разными спейсерными фрагментами.

[180] Преимущество использования высвобождаемых линкеров, таких как линкеры формулы (III) и формулы (IV), заключается в возможности улучшения стабильности, которая обеспечивает замедленное высвобождение лекарственного средства и, в конечном счете, обеспечивает пролонгированную терапевтическую эффективность. Таким образом, линкеры по настоящему изобретению обеспечивают преимущества стабильности и хранения полимерно-белковых терапевтических средств по сравнению с линкерами предыдущего уровня техники.

Полимерные реагенты с высвобождаемыми линкерами

[181] Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, которые могут быть получены из полимерных реагентов с высвобождаемыми линкерами.

[182] В некоторых аспектах изобретение относится к полимерному реагенту с высвобождаемыми линкерами формулы (V):

(V),

или его стереоизомеру, таутомеру или их смеси, или его изотопному варианту;

где:

POLY¹ представляет собой первый водорастворимый полимер;

POLY² представляет собой второй водорастворимый полимер;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X² представляет собой второй спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R³ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R⁴ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

a1 представляет собой целое число от 0 до 3;

a2 представляет собой целое число от 0 до 3;

c представляет собой целое число от 0 до 4;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^d представляет собой нитро, циано, галоген, амид, замещенный амид, сульфон, замещенный сульфон, сульфонамид, замещенный сульфонамид, алкокси, замещенный алкокси, алкил или циклоалкил, замещенный алкил или циклоалкил, арил или гетероарил, замещенный арил или гетероарил; и

FG¹ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием высвобождаемой связи, такой как карбаматная связь.

[183] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R³, R⁴, R^e1, R^e2 и R^d определены выше в формуле (IV).

[184] В некоторых вариантах осуществления формулы (V) R^e1 и R^e2 представляют собой одну и ту же группу, изменяющую электронную плотность. В некоторых вариантах осуществления R^e1 и R^e2 представляют собой разные группы, изменяющие электрон.

[185] В некоторых вариантах осуществления формулы (V) каждый из POLY¹ и POLY² независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² являются разными водорастворимыми полимерами.

[186] В некоторых вариантах осуществления формулы (V) каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами. Иллюстративные полимерные реагенты соответствуют следующей формуле (V-A):

(V-A),

где n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500, например, 4, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, включая все диапазоны и значения между ними.

[187] Другие полимерные реагенты с двумя высвобождаемыми связями имеют следующую формулу (VI):

(VI),

или их стереоизомер, таутомер или их смесь, или их изотопный вариант;

где:

POLY¹ представляет собой первый водорастворимый полимер;

POLY² представляет собой второй водорастворимый полимер;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X² представляет собой второй спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

a1 представляет собой целое число в диапазоне 0-3;

a2 представляет собой целое число в диапазоне 0-3;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^p представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил; и

FG⁴ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием высвобождаемой связи, такой как амидная связь.

[188] В некоторых вариантах осуществления формулы (VI) каждый из R¹, R² и R^p независимо представляет собой C_1-5 алкил, замещенный C_1-5 алкил, C_2-6 алкенил, замещенный C_2-6 алкенил, C₂-₆ алкинил, замещенный C₂-₆ алкинил, фенил или замещенный фенил. В определенных вариантах осуществления каждый из R¹, R², R³ и R⁴ независимо представляет собой C_1-5 алкил или замещенный C_1-5 алкил.

[189] В некоторых вариантах осуществления формулы (VI) каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CONH(C_1-5 алкил) или -CONH(фенил), замещенный -CONH(C_1-5 алкил) или -CONH(фенил), - SO₂NH(C_1-5 алкил) или - SO₂NH(фенил), замещенный - SO₂NH(C_1-5 алкил) или - SO₂NH(фенил), - SO₂(C_1-5 алкил) или - SO₂(фенил), замещенный - SO₂(C_1-5 алкил) или -SO₂(фенил), C_1-5 алкокси, замещенный C_1-5 алкокси, C_1-5 алкил или C_3-6 циклоалкил, замещенный C_1-5 алкил или C_3-6 циклоалкил, фенил или 5-6-членный гетероарил или замещенный фенил или 5-6-членный гетероарил.

[190] В некоторых вариантах осуществления формулы (VI) каждый из POLY¹ и POLY² независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² являются разными водорастворимыми полимерами.

[191] В некоторых вариантах осуществления формулы (VI) каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами.

[192] Иллюстративные полимерные реагенты соответствуют следующей формуле (VI-A):

(VI-A),

где n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500, например, 4, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, включая все диапазоны и значения между ними.

Конъюгаты белок-линкер

[193] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен конъюгат, содержащий остаток белка, ковалентно присоединенный к одному или нескольким линкерам, при этом конъюгат имеет структуру формулы (XIX):

Белок-(L)_z

(XIX)

или его стереоизомер, региоизомер, таутомер или их смеси, или его изотопный вариант; или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или пролекарство;

где:

z представляет собой целое число от 1 до 25;

L представляет собой линкер; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[194] Описанные в данном документе конъюгаты являются продуктом синтеза на первой стадии схемы (I). В определенных вариантах осуществления линкер представляет собой невысвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления линкер представляет собой высвобождаемый линкер. В некоторых вариантах осуществления высвобождаемый линкер представляет собой производное бифункционального высвобождаемого линкера (например, линкера формулы (I), формулы (II), формулы (III) или формулы (IV)), описанных в данном документе.

[195] В определенных вариантах осуществления линкер ковалентно присоединен к аминогруппе остатка внутри белка. В определенных вариантах осуществления остаток представляет собой лизин. В определенных вариантах осуществления предусмотрена композиция, содержащая смеси конъюгатов, включающие различное количество линкеров, присоединенных к белку.

[196] Примеры конъюгатов, образованных с использованием бифункциональных реагентов, обеспечивающих высвобождаемую связь, конъюгированных с белком, включают конъюгаты формулы (VII):

(VII),

где:

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

a представляет собой целое число от 0 до 5;

b представляет собой целое число от 0 до 3;

c представляет собой целое число от 0 до 2;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO));

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[197] В некоторых вариантах осуществления R¹, R² и R^e определены выше в формуле (I).

[198] В некоторых вариантах осуществления формулы (VII) a представляет собой целое число от 0 до 4. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой целое число от 0 до 3. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой целое число от 0 до 2. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 0. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 1. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 2. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 3. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 4. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 5.

[199] В некоторых вариантах осуществления формулы (VII) b представляет собой целое число от 0 до 2. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 0. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 1. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 2. В некоторых вариантах осуществления b представляет собой 3.

[200] В некоторых вариантах осуществления формулы (VII) c представляет собой 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления c представляет собой 0. В некоторых вариантах осуществления c представляет собой 1. В некоторых вариантах осуществления c представляет собой 2.

[201] В некоторых вариантах осуществления формулы (VII) z представляет собой целое число от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 15. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 8. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 5.

[202] Специалистам в данной области техники будет понятно, что значения и диапазоны для a, b, c и z, описанные в данном документе, можно комбинировать любым образом для получения конъюгата по настоящему изобретению. Например, в некоторых вариантах осуществления a представляет собой целое число от 0 до 2, b представляет собой 0 или 1, c представляет собой 0 или 1 и z представляет собой целое число от 1 до 25. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 1, b представляет собой 1, c представляет собой 1 и Z представляет собой целое число от 1 до 25. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 1, b представляет собой 0, c представляет собой 1 и z представляет собой целое число от 1 до 25. В некоторых вариантах осуществления a представляет собой 1, b представляет собой 1, c представляет собой 0 и z представляет собой целое число от 1 до 25. Эти и многие другие комбинации рассматриваются в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами.

[203] В формуле (VII) конъюгаты, имеющие более определенную структуру, рассматриваются как формулы (VII-A), (VII-B), (VII-C) или (II-D):

где X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент; X² представляет собой второй спейсерный фрагмент; R¹, R², R^e, a, z, Y¹, Y², FG² и белок определены выше в формуле (VII).

[204] В определенных вариантах осуществления формулы (VII), (VII-A), (VII-B), (VII-C) или (VII-D) a представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой, Me или Et; и R^e представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[205] Другие иллюстративные конъюгаты имеют следующую структуру (VII-A1):

где R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила; z представляет собой целое число в диапазоне 1-25; «-NH-» представляет собой один или несколько линкеров, отдельно присоединенных к белковому фрагменту. В определенных вариантах осуществления, где a представляет собой целое число от 1 до 2; и R^e представляет собой замещение 4-F, 4-Cl, 4-CF₃, 2,4-дифтор или 2-CF₃-4-F.

[206] Другие иллюстративные конъюгаты имеют следующие структуры:

[207] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием бифункциональных реагентов, обеспечивающих высвобождаемую связь, включают конъюгаты следующей формулы (VIII):

где:

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[208] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R^e1 и R^e2 определены выше в формуле (VI).

[209] В определенных вариантах осуществления формулы (VIII) каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой водород, Me или Et; и каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[210] В формуле (VIII) конъюгаты, имеющие более определенную структуру, рассматриваются как формулы (VIII-A):

[211] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием двух реагентов, обеспечивающих высвобождаемую связь, включают конъюгаты следующей формулы (IX):

где:

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^p представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[212] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R^p, R^e1 и R^e2 определены выше в формуле (VI).

[213] В определенных вариантах осуществления формулы (IX), где каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой водород, Me или Et; и каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[214] В формуле (IX) конъюгаты, имеющие более определенную структуру, рассматриваются как следующая формула (IX-A):

[215] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием двух реагентов, обеспечивающих высвобождаемую связь, включают конъюгаты следующей формулы (X):

где:

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R³ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R⁴ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

c представляет собой целое число от 0 до 4;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^d представляет собой нитро, циано, галоген, амид, замещенный амид, сульфон, замещенный сульфон, сульфонамид, замещенный сульфонамид, алкокси, замещенный алкокси, алкил или циклоалкил, замещенный алкил или циклоалкил, арил или гетероарил, замещенный арил или гетероарил;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

Y⁴ представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[216] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R³, R⁴, R^d, R^e1 и R^e2 определены выше в формуле (IV).

[217] В определенных вариантах осуществления формул, раскрытых в данном документе, z представляет собой целое число от 1 до 22, 1 до 20, 1 до 18, 1 до 15, 1 до 12, 1 до 10, 1 до 8, 1 до 5 или от 1 до 3, где z представляет количество высвобождаемых линкеров, конъюгированных с белком.

[218] Конъюгаты белок-макромолекула

[219] В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения предоставлены конъюгаты белок-макромолекула, причем конъюгат содержит белок, по меньшей мере один линкер и по меньшей мере один водорастворимый полимер, где белок ковалентно присоединен к каждому из водорастворимого полимера через линкер, где макромолекула представляет собой линейный или разветвленный водорастворимый полимер. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один линкер представляет собой два или более линкеров. В определенных вариантах осуществления два или более линкеров содержат по меньшей мере один невысвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления два или более линкеров содержат по меньшей мере один высвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления два или более линкеров содержат по меньшей мере один невысвобождаемый линкер и один высвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления два или более линкеров содержат по меньшей мере один невысвобождаемый линкер и от одного до восьми высвобождаемых линкеров.

[220] В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один линкер представляет собой невысвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один линкер представляет собой высвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления каждый из линкеров представляет собой высвобождаемый линкер. В определенных вариантах осуществления одна или несколько макромолекул ковалентно присоединены к белку через один или несколько линкеров. В определенных вариантах осуществления восемь или более макромолекул ковалентно присоединены к белку через восемь или более линкеров.

[221] В определенных вариантах осуществления макромолекула ковалентно присоединена к аминогруппе остатка в белке через линкер. В определенных вариантах осуществления остаток представляет собой лизин. В определенных вариантах осуществления конъюгаты представляют собой смеси конъюгатов, содержащие различное количество макромолекул, присоединенных к белку.

[222] В различных вариантах осуществления макромолекула представляет собой водорастворимый полимер, липид, белок или полипептид. Она может включать любое из следующего: жирную кислоту, содержащую от около 6 до около 26 атомов углерода, один из полимеров, выбранных из группы, состоящей из 2-метакрилоилоксиэтилфосфоилхолинов, поли(акриловых кислот), поли(акрилатов), поли(акриламидов), поли(N-акрилоилморфолина), поли(алкилокси)полимеров, поли(амидов), поли(амидоаминов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(аспартамидов), поли(масляных кислот), поли(гликолевой кислоты), полибутилентерефталатов, поли(капролактонов), поли(карбонатов), поли(цианоакрилатов), поли(диметилакриламидов), поли(эфиров), поли(этиленов), поли(этиленгликолей), поли(этиленоксидов), поли(этилфосфатов), поли(этилоксазолинов), поли(гликолевых кислот), поли(α-гидроксикислоты), поли(гидроксиэтилакрилатов), поли(гидроксиэтилоксазолинов), поли(гидроксиметакрилатов), поли(гидроксиалкилметакриламидов), поли(гидроксиалкилметакрилатов), поли(гидроксипропилоксазолинов), поли(иминокарбонатов), поли(молочных кислот), поли(молочно-гликолевых кислот), поли(метакриламидов), поли(метакрилатов), поли(метилоксазолинов), поли(органофосфазенов), поли(ортоэфиров), поли(оксазолинов), поли(оксиэтилированного полиола), поли(олефинового спирта), полифосфазена, поли(пропиленгликолей), поли(сахарида), поли(силоксанов), поли(уретанов), поли(виниловых спиртов), поли(виниламинов), поли(винилметиловых эфиров), поли(винилпирролидонов), силиконов, амилозы, целлюлозы, карбометилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, хитинов, хитозанов, декстранов, декстринов, желатинов, гиалуроновых кислот (ГК) и производных, функционализированных гиалуроновых кислот, маннанов, пектинов, гепарина, гепарансульфата (HS), рамногалактуронаны, крахмалов, гидроксиалкилкрахмалов, гидроксиэтилкрахмалов (HES), полисиаловой кислоты (PSA) и других полимеров на основе углеводов, ксиланов и сополимеров, альбумина, трансферрина, транстиретина, иммуноглобулина, пептида XTEN, богатого глицином полимера гомоаминокислоты (HAP), полипептида PAS, эластиноподобного полипептида (ELP), пептида CTP или полимера желатиноподобного белка (GLK).

[223] В определенных вариантах осуществления макромолекула представляет собой водорастворимый полимер. В определенных вариантах осуществления водорастворимый полимер представляет собой полимер полиэтиленгликоля. В определенных вариантах осуществления поли(этиленгликоль) заблокирован на замыкающем фрагменте, выбранном из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, замещенного алкокси, алкенокси, замещенного алкенокси, алкинокси, замещенного алкинокси, арилокси и замещенного арилокси.

[224] Что касается водорастворимого полимера, водорастворимый полимер является нетоксичным, не встречающимся в природе и биосовместимым. Что касается биосовместимости, вещество считается биосовместимым, если благоприятные эффекты, связанные с использованием вещества отдельно или с другим веществом (например, с активным средством, таким как фрагмент IL-2) в соединении с живыми тканями (например, введение в пациента) перевешивает любые вредные эффекты, оцененные врачом, например, лечащим врачом. Что касается неиммуногенности, то вещество считается неиммуногенным, если предполагаемое применение вещества in vivo не вызывает нежелательного иммунного ответа (например, образование антител) или, если иммунный ответ возникает, такой ответ не считается клинически значимым или важным по оценке врача. Особенно предпочтительно, чтобы непептидный водорастворимый полимер был биосовместимым и неиммуногенным.

[225] Кроме того, полимер обычно характеризуется наличием от 2 до около 300 концов. Примеры таких полимеров включают, но не ограничиваются ими, поли(алкиленгликоли), такие как полиэтиленгликоль («ПЭГ»), поли(пропиленгликоль) («ППГ»), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поливинилпирролидон), поли(гидроксиалкилметакриламид), поли(гидроксиалкилметакрилат), полисахариды), поли(α-гидроксикислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолины («POZ») (которые описаны в WO 2008/106186), поли(N-ацилоилморфолин) и комбинации любых из вышеперечисленных.

[226] Водорастворимый полимер не ограничивается конкретной структурой и может быть линейным (например, с замыкающим, например, алкокси-ПЭГ или бифункциональным ПЭГ), разветвленным или многоцепочечным (например, раздвоенный ПЭГ или ПЭГ, присоединенный к полиоловому ядру), дендритную (или звездообразную) архитектуру, каждая с одной или несколькими разлагаемыми связями или без них. Кроме того, внутренняя структура водорастворимого полимера может быть организована в виде любого числа различных повторяющихся структур и может быть выбрана из группы, состоящей из гомополимера, чередующегося сополимера, статистического сополимера, блок-сополимера, чередующегося триполимера, статистического триполимера и блок-триполимера.

[227] Активированный ПЭГ и другие активированные водорастворимые полимеры (т.е. полимерные реагенты) активируют подходящей активирующей группой, подходящей для связывания с желаемым участком на белке. Таким образом, полимерный реагент будет иметь реакционноспособную группу для реакции с белковым фрагментом. Типичные полимерные реагенты и способы конъюгации этих полимеров с активным фрагментом известны в данной области техники и дополнительно описаны Zalipsky, S., et al., «Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides» в Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992),, и Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182. Типичные активирующие группы, подходящие для присоединения к белковому фрагменте, включают гидроксил, малеимид, сложный эфир, ацеталь, кеталь, амин, карбоксил, альдегид, гидрат альдегида, кетон, винилкетон, тион, тиол, винилсульфон, гидразин и другие.

[228] Как правило, средневесовая молекулярная масса водорастворимого полимера в конъюгате составляет от около 100 Дальтон до около 150 000 Дальтон. Однако иллюстративные диапазоны включают средневесовые молекулярные массы в диапазоне от около 500 Дальтон до менее 20 000 Дальтон, в диапазоне от около 20 000 Дальтон до менее 85 000 Дальтон, в диапазоне от около 85 000 Дальтон до около 100 000 Дальтон, в диапазоне более чем 5000 Дальтон до около 100 000 Дальтон, в диапазоне от около 6000 Дальтон до около 90 000 Дальтон, в диапазоне от около 10 000 Дальтон до около 85 000 Дальтон, в диапазоне более чем 10 000 Дальтон до около 85 000 Дальтон, в диапазоне от около 20 000 Дальтон до около 85 000 Дальтон, в диапазоне от около 53 000 Дальтон до около 85 000 Дальтон, в диапазоне от около 25 000 Дальтон до около 120 000 Дальтон, в диапазоне от около 29 000 Дальтон до около 120 000 Дальтон, в диапазоне от около 35 000 Дальтон до около 120 000 Дальтон и в диапазоне от около 40 000 Дальтон до около 120 000 Дальтон. Для любого данного водорастворимого полимера предпочтительными являются ПЭГ, имеющие молекулярную массу в одном или нескольких из этих диапазонов.

[229] Типичные средневесовые молекулярные массы водорастворимого полимера включают около 100 Дальтон, около 200 Дальтон, около 300 Дальтон, около 400 Дальтон, около 500 Дальтон, около 600 Дальтон, около 700 Дальтон, около 750 Дальтон, около 800 Дальтон, около 900 Дальтон, около 1000 Дальтон, около 1500 Дальтон, около 2000 Дальтон, около 2200 Дальтон, около 2500 Дальтон, около 3000 Дальтон, около 4000 Дальтон, около 4400 Дальтон, около 4500 Дальтон, около 5000 Дальтон, около 5500 Дальтон, около 6000 Дальтон, около 7000 Дальтон, около 7500 Дальтон, около 8000 Дальтон, около 9000 Дальтон, около 10 000 Дальтон, около 11 000 Дальтон, около 12 000 Дальтон, около 13 000 Дальтон, около 14 000 Дальтон, около 15 000 Дальтон, около 16 000 Дальтон, около 18 000 Дальтон, около 20 000 Дальтон, около 22 500 Дальтон, около 25 000 Дальтон, около 30 000 Дальтон, около 35 000 Дальтон, около 40 000 Дальтон, около 45 000 Дальтон, около 50 000 Дальтон, около 55 000 Дальтон, около 60 000 Дальтон, около 65 000 Дальтон, около 70 000 Дальтон и около 75 000 Дальтон. Также могут быть использованы разветвленные варианты водорастворимого полимера (например, разветвленный водорастворимый полимер 40 000 Дальтон, состоящий из двух полимеров по 20 000 Дальтон), имеющий общую молекулярную массу любого из вышеперечисленных.

[230] При использовании в качестве полимера ПЭГ обычно будут включать ряд мономеров (OCH₂CH₂) [или мономеров (CH₂CH₂O), в зависимости от определения ПЭГ]. Как используется во всем описании, количество повторяющихся звеньев обозначается нижним индексом « n» в «(OCH₂CH₂)_n». Таким образом, значение (n) обычно попадает в один или несколько из следующих диапазонов: от 2 до около 3400, от около 100 до около 2300, от около 100 до около 2270, от около 136 до около 2050, от около 225 до около 1930, от около 450 до около 1930, от около 1200 до около 1930, от около 568 до около 2727, от около 660 до около 2730, от около 795 до около 2730, от около 795 до около 2730, от около 909 до около 2730 и от около 1200 до около 1900. Для любого заданного полимера, молекулярная масса которого известна, можно определить количество повторяющихся звеньев (т. е. «n») путем деления общей средневесовой молекулярной массы полимера на молекулярную массу повторяющегося мономера.

[231] Одним особенно предпочтительным полимером для использования в настоящем изобретении является полимер с блокированными концами, то есть полимер, имеющий по меньшей мере один конец, закрытый относительно инертной группой, такой как низшая C_1-6алкоксигруппа, хотя гидроксильную группу также можно использовать. Когда полимером является ПЭГ, например, предпочтительно использовать метокси-ПЭГ (обычно называемый мПЭГ), который представляет собой линейную форму ПЭГ, в которой один конец полимера представляет собой метокси (-ОСН₃) группу, а другой конец представляет собой гидроксильную или другую функциональную группу, которая может быть необязательно химически модифицирована.

[232] В одной форме, используемой в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, свободный или несвязанный ПЭГ представляет собой линейный полимер, на каждом конце которого имеются гидроксильные группы:

HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH,

где (n) обычно находится в диапазоне от нуля до около 4000.

[233] Вышеупомянутый полимер, альфа-, омега-дигидроксиполи(этиленгликоль), может быть представлен в короткой форме в виде HO-ПЭГ-OH, где понятно, что символ -ПЭГ- может представлять следующую структурную единицу:

-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-,

где (n) описан выше.

[234] Другой тип ПЭГ, используемый в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, представляет собой метокси-ПЭГ-ОН или, вкратце, мПЭГ-ОН, в котором один конец представляет собой относительно инертную метоксигруппу, а другой конец представляет собой гидроксильную группу. Структура мПЭГ-ОН представлена ниже.

CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH

где (n) описан выше.

[235] Другой тип ПЭГ, используемый в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, представляет собой метокси-ПЭГ-NH₂ или, вкратце, мПЭГ-NH₂, в котором один конец представляет собой относительно инертную метоксигруппу, а другой конец представляет собой аминогруппу. Структура мПЭГ-NH₂ представлена ниже.

CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-NH₂

где (n) описан выше.

[236] Другой тип ПЭГ, используемый в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, представляет собой метокси-ПЭГ-CO₂H или, вкратце, мПЭГ-CO₂H, в котором один конец представляет собой относительно инертную метоксигруппу, а другой конец представляет собой группу карбоновой кислоты. Структура мПЭГ-CO₂H представлена ниже.

CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-CO₂H

где (n) описан выше.

[237] Другой тип ПЭГ, используемый в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, представляет собой метокси-ПЭГ-N₃ или, вкратце, мПЭГ-N₃, в котором один конец представляет собой относительно инертную метоксигруппу, а другой конец представляет собой азидную группу. Структура мПЭГ-N₃ представлена ниже.

CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-N₃

где (n) описан выше.

[238] Другой тип ПЭГ, используемый в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения, представляет собой метокси-ПЭГ-DBCO или, вкратце, мПЭГ-DBCO, в котором один конец представляет собой относительно инертную метоксигруппу, а другой конец представляет собой группу дибензоциклооктина (DBCO). Один пример структуры мПЭГ-DBCO представлен ниже.

где (n) описан выше.

[239] Многоцепочечные или разветвленные молекулы ПЭГ, такие как молекулы, описанные в патенте США № 5932462, также могут быть использованы в качестве полимера ПЭГ. Например, ПЭГ может иметь структуру:

где:

poly_a и poly_b представляют собой основные цепи ПЭГ (одинаковые или разные), такие как метоксиполи(этиленгликоль); R’ представляет собой нереакционноспособный фрагмент, такой как Н, метил или основную цепь ПЭГ; и P и Q являются нереакционноспособными связями.

[240] Кроме того, ПЭГ может включать раздвоенный ПЭГ. Пример раздвоенного ПЭГ представлен следующей структурой:

где: X представляет собой спейсерный фрагмент одного или нескольких атомов, и каждый Z представляет собой активированную концевую группу, связанную с CH цепью атомов определенной длины. Публикация международной патентной заявки WO 99/45964 раскрывает различные раздвоенные структуры ПЭГ, которые можно использовать в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения. Цепь атомов, связывающая функциональные группы Z с разветвленным атомом углерода, служит связующей группой и может включать, например, алкильные цепи, простоэфирные цепи, сложноэфирные цепи, амидные цепи и их комбинации.

[241] Полимер ПЭГ может содержать боковую молекулу ПЭГ, имеющую реакционноспособные группы, такие как карбоксильные, ковалентно присоединенные по длине ПЭГ, а не к концу цепи ПЭГ. Боковые реакционноспособные группы могут быть присоединены к ПЭГ непосредственно или через спейсерный фрагмент, такой как алкиленовая группа.

[242] Некоторые гидролитически разлагаемые связи, используемые в качестве разлагаемой связи в основной цепи полимера и/или в качестве разлагаемой связи с белковым фрагментом, включают: сложноэфирные связи, карбонатные связи; иминные связи, возникающие, например, в результате реакции амина и альдегида (см., например, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); фосфатно-эфирные связи, образованные, например, реакцией спирта с фосфатной группой; гидразонные связи, которые обычно образуются реакцией гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые обычно образуются в результате реакции между альдегидом и спиртом; ортоэфирные связи, которые образуются, например, в результате реакции между формиатом и спиртом; амидные связи, образованные аминогруппой, например, на конце полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильной группой другой цепи ПЭГ; уретановые связи, образованные реакцией, например, ПЭГ с концевой изоцианатной группой и спиртом ПЭГ; пептидные связи, образованные аминогруппой, например, на конце полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильной группой пептида; и олигонуклеотидные связи, образованные, например, фосфорамидитной группой, например, на конце полимера, и 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида.

[243] Такие необязательные признаки конъюгата, т. е. введение одной или нескольких разлагаемых связей в полимерную цепь или в белковый фрагмент, могут обеспечить дополнительный контроль над конечными желаемыми фармакологическими свойствами конъюгата при введении. Например, большой и относительно инертный конъюгат (т.е. имеющий одну или несколько цепей ПЭГ с высокой молекулярной массой, присоединенных к нему, например, одну или несколько цепей ПЭГ с молекулярной массой более чем около 10 000, при этом конъюгат по существу не обладает биологической активностью) можно вводить, который высвобождается с образованием биоактивного конъюгата, содержащего часть исходной цепи ПЭГ. Таким образом, свойства конъюгата могут быть более эффективно адаптированы для уравновешивания биологической активности конъюгата с течением времени.

[244] Водорастворимый полимер, связанный с конъюгатом, может быть «высвобождаемым». То есть водорастворимый полимер высвобождается (либо посредством гидролиза, ферментативных процессов, каталитических процессов или иным образом), что приводит к неконъюгированному белковому фрагменту. В некоторых случаях высвобождаемые полимеры отделяются от белкового фрагмента in vivo, не оставляя фрагмента водорастворимого полимера. В других случаях высвобождаемые полимеры отделяются от белкового фрагмента in vivo, оставляя относительно небольшой фрагмент (например, сукцинатную метку) водорастворимого полимера. Иллюстративный расщепляемый полимер включает полимер, который присоединяется к белковому фрагменту посредством карбаматной связи.

[245] Специалистам в данной области техники будет понятно, что приведенное выше обсуждение, касающееся водорастворимого полимера, ни в коем случае не является исчерпывающим и носит лишь иллюстративный характер, и что рассматриваются все полимерные материалы, обладающие описанными выше качествами. Используемый в данном документе термин «полимерный реагент» обычно относится ко всей молекуле, которая может содержать водорастворимый полимерный сегмент и функциональную группу.

[246] Как описано выше, конъюгат по настоящему изобретению может содержать несколько водорастворимых полимеров, ковалентно присоединенных к белковому фрагменту. В некоторых вариантах осуществления несколько водорастворимых полимеров, ковалентно присоединенных к белковому фрагменту, являются одними и теми же. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из множества водорастворимых полимеров, ковалентно присоединенных к белковому фрагменту, отличается. Как правило, для любого данного конъюгата будет один или несколько водорастворимых полимеров, ковалентно связанных с одним или несколькими фрагментами, обладающими белковой активностью. В некоторых случаях конъюгат может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более водорастворимых полимеров, отдельно присоединенных к белковому фрагменту. Любой данный водорастворимый полимер может быть ковалентно присоединен к аминокислоте белкового фрагмента или, если белковый фрагмент представляет собой (например) гликопротеин, к углеводу белкового фрагмента. Присоединение к углеводу может быть осуществлено, например, с помощью метаболической функционализации с использованием химии сиаловой кислоты и азида [Luchansky et al. (2004) Biochemistry 43(38): 12358-123661 или других подходящих подходов, таких как применение глицидола для облегчения введения альдегидных групп [Heldt et al. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433].

[247] Конкретная связь внутри белкового фрагмента и полимера зависит от ряда факторов. К таким факторам относятся, например, конкретная используемая химия связывания, конкретный белковый фрагмент, доступные функциональные группы в белковом фрагменте (либо для присоединения к линкеру, полимеру, либо для превращения в подходящий сайт присоединения), наличие дополнительных реакционноспособных функциональных групп внутри белкового фрагмента и т.п.

[248] Конъюгаты по настоящему изобретению могут быть пролекарствами, что означает, что связь между полимером и белковым фрагментом может быть разъединена, что позволяет высвобождать исходный фрагмент. Помимо высвобождаемых линкеров, описанных в настоящем изобретении, другие иллюстративные высвобождаемые связи могут включать сложный карбоксилатный эфир, сложный фосфатный эфир, сложный тиоловый эфир, ангидриды, ацетали, кетали, ацилоксиалкиловый эфир, имины, ортоэфиры, пептиды и олигонуклеотиды. Такие связи могут быть легко получены соответствующей модификацией либо белкового фрагмента (например, карбоксильной группы С-конца белка, либо гидроксильной группы боковой цепи аминокислоты, такой как серин или треонин, содержащейся в белке, или аналогичной функциональной группы в углеводе), и/или полимерного реагента с использованием способов сочетания, обычно применяемых в данной области техники. Однако наиболее предпочтительными являются высвобождаемые связи, которые легко образуются в результате реакции соответствующим образом активированного полимера с немодифицированной функциональной группой, содержащейся в белковом фрагменте.

[249] В качестве альтернативы, гидролитически стабильная связь, такая как амидная, уретановая (также известная как карбаматная), аминная, тиоэфирная (также известная как сульфидная) или мочевинная (также известная как карбамидная) связь, также может быть использована как связь для соединения белкового фрагмента. Предпочтительной гидролитически стабильной связью является амид. В одном подходе водорастворимый полимер, содержащий активированный сложный эфир, может вступать в реакцию с аминогруппой на белковом фрагменте, что приводит к образованию амидной связи. Другой предпочтительной гидролитически стабильной связью является тиоловый мостик.

[250] Конъюгаты (в отличие от неконъюгированного белкового фрагмента) могут обладать или не обладать измеримой степенью белковой активности. То есть конъюгат полимер-белок в соответствии с изобретением будет обладать в пределах от около 0,1% до около 100%, включая около 0,1%, около 0,5%, около 1%, около 5%, около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 55% или около 100%, биоактивности немодифицированного исходного белкового фрагмента. В некоторых случаях конъюгаты полимер-белок могут иметь более чем 100% биологическую активность немодифицированного исходного белкового фрагмента. Предпочтительно конъюгаты, обладающие незначительной белковой активностью или не обладающие ею, содержат гидролизуемую связь, соединяющую полимер с белком, так что, независимо от отсутствия (или относительного отсутствия) активности в конъюгате, активная исходная молекула (или ее производное) высвобождается при индуцированном водой расщеплении гидролизуемой связи. Такую активность можно определить, используя подходящую модель in vivo или in vitro, в зависимости от известной активности конкретного белка.

[251] Для конъюгатов, обладающих гидролитически стабильной связью, которая связывает белок с полимером, конъюгат обычно будет обладать измеримой степенью биологической активности. Например, такие конъюгаты обычно характеризуются как обладающие биологической активностью, удовлетворяющей одному или нескольким из следующих процентных соотношений по отношению к неконъюгированному белку: по меньшей мере 2%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 100% и более 105% (при измерении в подходящей модели, такой как хорошо известные в данной области техники). Предпочтительно конъюгаты, имеющие гидролитически стабильную связь (например, амидную связь, тиоловый мостик), будут обладать по меньшей мере некоторой степенью биологической активности немодифицированного исходного белка.

[252] Присоединение между белком и водорастворимым полимером через линкер может быть прямым, когда между линкером и полимером нет промежуточных атомов, или непрямым, когда между связью и полимером расположены один или несколько атомов. Что касается непрямого присоединения, «спейсерный фрагмент» может служить линкером между остатком связей и водорастворимым полимером. Один или несколько атомов, составляющих спейсерный фрагмент, могут включать один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов кислорода и их комбинаций. Спейсерный фрагмент может включать амидную, вторичную аминовую, карбаматную, тиоэфирную, дисульфидную группу и/или группы продуктов клик-химии. Неограничивающие примеры конкретных спейсерных фрагментов включают фрагменты, выбранные из группы, состоящей из -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, O-CH₂-, -CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-, -C(O)-NH-CH₂-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH₂-, -CH₂-C(O)-O-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-, -C(O)-O-CH₂-CH₂-, -NH-C(O)-CH₂-, -CH₂-NH-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-, -NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -C(O)-NH-CH₂-, -C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -O-C(O)-NH-CH₂-, -O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-, -NH-CH₂-, -NH-CH₂-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-CH₂-NH-CH₂-, -C(O)-CH₂-, -C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-C(O)-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-, -CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-, -O-C(O)-NH-[CH₂]_l-(OCH₂CH₂)_m-, двухвалентной циклоалкильной группы, -O-, -S-, аминокислотыа, -N(R³)- и комбинации двух или более любых из вышеперечисленных, где R³ представляет собой H или органический радикал, выбранный из групп, состоящих из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, (l) составляет от нуля до шести и (m) составляет от нуля до 20. Другие конкретные спейсерные фрагменты имеют следующие структуры: C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)- и -O-C(O)-NH-(CH₂)_1-6-NH-C(O)-, где значения нижнего индекса после каждого метилена указывают количество метиленов, содержащихся в структуре, например, (CH₂)_1-6 означает, что структура может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 метиленов. Кроме того, любой из вышеуказанных спейсерных фрагментов может дополнительно включать олигомерную цепь этиленоксида, содержащую от 1 до 20 мономерных звеньев этиленоксида [т.е. -(CH₂CH₂O)_1-20]. То есть олигомерная цепь этиленоксида может располагаться до или после спейсерного фрагмента и необязательно между любыми двумя атомами спейсерного фрагмента, состоящего из двух или более атомов. Кроме того, олигомерная цепь не будет считаться частью спейсерного фрагмента, если олигомер смежен с полимерным сегментом и просто представляет собой удлинение полимерного сегмента.

[253] Общий конъюгат белок-макромолекула имеет структуру формулы (XX):

Белок-(L-макромолекула)_z

(XX),

или его стереоизомер, региоизомер, таутомер или их смеси, или его изотопный вариант; или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или пролекарство;

где:

z представляет собой целое число от 1 до 25;

L представляет собой линкер;

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид; и

макромолекула представляет собой водорастворимый полимер, липид, белок или полипептид.

[254] В некоторых вариантах осуществления линкер L представляет собой линкер по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления L представляет собой один или несколько невысвобождаемых линкеров и/или один или несколько высвобождаемых линкеров. В некоторых вариантах осуществления один или несколько высвобождаемых линкеров получены из бифункционального высвобождаемого линкера по настоящему изобретению (например, линкера формулы (I), формулы (II), формулы (III) или формулы (IV)) и/или полимерного реагента с высвобождаемым линкером (например, формулы (V) или формулы (VI)).

[255] В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 15. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 8. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой целое число от 1 до 5.

[256] В некоторых вариантах осуществления когда z равно 2 или больше, каждая L-макромолекула, присоединенная к белку, является одинаковой. В некоторых вариантах осуществления когда z равно 2 или больше, по меньшей мере одна L-макромолекула, присоединенная к белку, отличается. В некоторых вариантах осуществления когда z равно 2 или больше, каждая L-макромолекула, присоединенная к белку, отличается.

[257] Иллюстративные конъюгаты белок-макромолекула формулы XX охватываются следующей структурой:

где:

n представляет собой целое число от 2 до 4000;

X представляет собой спейсерный фрагмент;

RL представляет собой высвобождаемый линкер;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[258] В некоторых вариантах осуществления RL представляет собой высвобождаемый линкер по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления высвобождаемый линкер получен из бифункционального высвобождаемого линкера (например, линкера формулы (I), формулы (II), формулы (III) или формулы (IV)) или полимерного реагента с высвобождаемым линкером (например, формулы (V) или формула (VI)), раскрытых в данном документе.

[259] В другом аспекте иллюстративные конъюгаты белок-макромолекула формулы XX охватываются следующей структурой:

где:

n представляет собой целое число от 2 до 4000;

X представляет собой спейсерный фрагмент;

RL¹ представляет собой первый высвобождаемый линкер;

RL² представляет собой второй высвобождаемый линкер;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

Примеры конъюгатов согласно настоящему изобретению, в которых водорастворимый полимер находится в разветвленной форме, включают конъюгаты, в которых водорастворимый полимер имеет следующую структуру:

где Y=O и NH; каждый (n) независимо представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 4000, например, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 , 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 или 4000, включая все значения и диапазоны между ними.

[260] Примеры конъюгатов согласно настоящему изобретению, в которых водорастворимый полимер находится в разветвленной форме, включают конъюгаты, в которых водорастворимый полимер имеет следующую структуру:

где каждый (n) независимо представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 4000, например, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 , 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 или 4000, включая все значения и диапазоны между ними.

[261] Иллюстративные конъюгаты белок-макромолекула, образованные с использованием двух полимерных реагентов, обеспечивающих высвобождаемую связь, включают конъюгаты следующей формулы (XI):

где:

POLY¹ представляет собой первый водорастворимый полимер;

POLY² представляет собой второй водорастворимый полимер;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X² представляет собой второй спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

Y⁴ представляет собой O или S;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R³ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R⁴ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

a1 представляет собой целое число от 0 до 3;

a2 представляет собой целое число от 0 до 3;

c представляет собой целое число от 0 до 4;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^d представляет собой нитро, циано, галоген, амид, замещенный амид, сульфон, замещенный сульфон, сульфонамид, замещенный сульфонамид, алкокси, замещенный алкокси, алкил или циклоалкил, замещенный алкил или циклоалкил, арил или гетероарил, замещенный арил или гетероарил;

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[262] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R³, R⁴, R^e1, R^e2 и R^d определены выше в формуле (IV).

[263] В некоторых вариантах осуществления формулы (XI) каждый из POLY¹ и POLY² независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² являются разными водорастворимыми полимерами.

[264] В некоторых вариантах осуществления формулы (XI) каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами.

[265] Примеры конъюгатов имеют следующую структуру (XI-A):

где n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500 и z представляет собой целое число от 1 до 25.

[266] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием двух полимерных реагентов, обеспечивающих высвобождаемую связь, включают конъюгаты следующей формулы (XII):

где:

POLY¹ представляет собой первый водорастворимый полимер;

POLY² представляет собой второй водорастворимый полимер;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X² представляет собой второй спейсерный фрагмент;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

a1 представляет собой целое число в диапазоне 0-3;

a2 представляет собой целое число в диапазоне 0-3;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность;

R^p представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[267] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R^e1, R^e2 и R^p определены выше в формуле (VI).

[268] В некоторых вариантах осуществления формулы (XII) каждый из POLY¹ и POLY² независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² являются разными водорастворимыми полимерами.

[269] В некоторых вариантах осуществления формулы (XII) каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами.

[270] Примеры конъюгатов имеют следующую структуру (XII-A):

где n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500 и z представляет собой целое число от 1 до 25.

[271] Иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием клик-химии с подходящими полимерными реагентами, включают конъюгаты следующей формулы (XIII):

где:

POLY¹ представляет собой первый водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

POLY² представляет собой второй водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент или -X-FG²;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

T¹ представляет собой первую триазольную функциональную группу;

T² представляет собой вторую триазольную функциональную группу;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила; и -X-FG²;

где:

X представляет собой спейсерный фрагмент; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

a представляет собой целое число от 0 до 5;

b представляет собой целое число от 0 до 3;

c представляет собой целое число от 0 до 2;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[272] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R^e, a, b, c и z определены выше в формуле (I).

[273] В некоторых вариантах осуществления формулы (XIII) каждый из POLY¹ и POLY² независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY¹ и POLY² являются разными водорастворимыми полимерами.

[274] В некоторых вариантах осуществления формулы (XIII) каждый из X¹ и X² независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X¹ и X² являются разными спейсерными фрагментами.

[275] В формуле (XIII) конъюгаты, имеющие более определенную структуру, рассматриваются как формулы (XIII-A), (XIII-B), (XIII-C) или (XIII-D):

где каждый из X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент; X² представляет собой второй спейсерный фрагмент; POLY¹, POLY², T¹, T², R¹, R², R^e, a, z, Y¹, Y² и белок определены выше.

[276] В определенных вариантах осуществления формулы (XIII), (XIII-A), (XIII-B), (XIII-C) или (XIII-D) a представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой, Me или Et; и R^e представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[277] Другие иллюстративные конъюгаты имеют следующую структуру (XIII-A1):

где R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила; n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500; z представляет собой целое число от 1 до 25; и «-NH-» представляет собой аминогруппу остатка в белке и представляет собой один или несколько полимеров, отдельно присоединенных к белку. В определенных вариантах осуществления a представляет собой целое число от 1 до 2; R^e представляет собой замещение 4-F, 4-Cl, 4-CF₃, 2,4-дифтор или 2-CF₃-4-F.

[278] Другие иллюстративные конъюгаты имеют следующую структуру (XIII-B1), (XIII-C1), (XIII-D1) или (XIII-D2):

где:

n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500;

z представляет собой целое число от 1 до 25; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[279] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием клик-химии с подходящими полимерными реагентами, включают конъюгаты следующей формулы (XIV):

где:

POLY² представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

POLY³ представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность; или -X-FG²;

где

X представляет собой спейсерный фрагмент; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

T² представляет собой триазольную функциональную группу;

T³ представляет собой триазольную функциональную группу;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[280] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R^e1 и R^e2 определены выше в формуле (VI).

[281] В некоторых вариантах осуществления формулы (XIV) каждый из POLY² и POLY³ независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY² и POLY³ оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY² и POLY³ являются разными водорастворимыми полимерами.

[282] В некоторых вариантах осуществления формулы (XIV) каждый из X² и X³ независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются разными спейсерными фрагментами.

[283] В определенных вариантах осуществления формулы (XIV) каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой водород, Me или Et; и каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[284] В формуле (XIV) конъюгаты, имеющие более определенную структуру, рассматриваются как формулы (XIV-A):

где n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500; z представляет собой целое число от 1 до 25 и -NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке.

[285] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием клик-химии с подходящими полимерными реагентами, включают конъюгаты следующей формулы (XV):

где:

POLY² представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

POLY³ представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность; или -X-FG²;

где

X представляет собой спейсерный фрагмент; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

R^p представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

T² представляет собой триазольную функциональную группу;

T³ представляет собой триазольную функциональную группу;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[286] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R^p, R^e1 и R^e2 определены выше в формуле (VI).

[287] В некоторых вариантах осуществления формулы (XV) каждый из POLY² и POLY³ независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY² и POLY³ оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY² и POLY³ являются разными водорастворимыми полимерами.

[288] В некоторых вариантах осуществления формулы (XV) каждый из X² и X³ независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются разными спейсерными фрагментами.

[289] В определенных вариантах осуществления формулы (XV) каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 2; каждый из R¹ и R² независимо представляет собой водород, Me или Et; и каждый из R^e1 и R^e2 независимо представляет собой нитро, циано, галоген, -CF₃, -CONHMe, -SO₂NHMe, -OMe, -NHMe, -NHAc, -NHSO₂Me или -OCF₃.

[290] В формуле (XV) конъюгаты, имеющие более определенную структуру, рассматриваются как следующая формула (XV-A):

где n независимо представляет собой целое число от 4 до 1500; z представляет собой целое число от 1 до 25 и -NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке.

[291] Другие иллюстративные конъюгаты, образованные с использованием клик-химии с подходящими полимерными реагентами, включают конъюгаты следующей формулы (XVI):

где:

POLY² представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

POLY³ представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R³ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R⁴ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

каждый из a1 и a2 независимо представляет собой целое число от 0 до 4;

b1 представляет собой 1;

b2 представляет собой целое число от 0 до 1;

c представляет собой целое число от 0 до 4;

z представляет собой целое число от 1 до 25;

R^el, если присутствует, представляет собой первую группу, изменяющую электронную плотность;

R^e2, если присутствует, представляет собой вторую группу, изменяющую электронную плотность; или -X-FG²;

где

X представляет собой спейсерный фрагмент; и

FG² представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию посредством клик-химии, включая, помимо прочего, азидные, алкинильные и циклоалкинильные группы (например, дибензоциклооктин (DBCO)).

R^d представляет собой нитро, циано, галоген, амид, замещенный амид, сульфон, замещенный сульфон, сульфонамид, замещенный сульфонамид, алкокси, замещенный алкокси, алкил или циклоалкил, замещенный алкил или циклоалкил, арил или гетероарил, замещенный арил или гетероарил;

X², если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

X³, если присутствует, представляет собой спейсерный фрагмент;

T² представляет собой триазольную функциональную группу;

T³ представляет собой триазольную функциональную группу;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

Y³ представляет собой O или S;

Y⁴ представляет собой O или S; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка в белке; и

Белок представляет собой хемокин, антагонист хемокина, цитокин, антагонист цитокина, антитело или терапевтический пептид.

[292] В некоторых вариантах осуществления R¹, R², R³, R⁴, R^d, R^e1 и R^e2 определены выше в формуле (IV).

[293] В некоторых вариантах осуществления формулы (XVI) каждый из POLY² и POLY³ независимо выбран из водорастворимых полимеров, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления POLY² и POLY³ оба представляют собой водорастворимый полимер. В некоторых вариантах осуществления POLY² и POLY³ являются разными водорастворимыми полимерами.

[294] В некоторых вариантах осуществления формулы (XVI) каждый из X² и X³ независимо выбран из спейсерных фрагментов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются одинаковым спейсерным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления X² и X³ являются разными спейсерными фрагментами. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой цитокин. Цитокин включает GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α или TNF-β. В определенных вариантах осуществления цитокин представляет собой IL-2. В определенных вариантах осуществления IL-2 содержит около 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1.

[295] В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой хемокин. Хемокин включает MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-24, MCP-5, CXCL76, I-309 (CCL1), BCA1 (CXCL13), MIG, SDF-1/PBSF, IP-10, I-TAC, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, эотаксин-1, эотаксин-2, GCP-2, Gro-α, Gro-β, Gro-γ, LARC (CCL20), ELC (CCL19), SLC (CCL21), ENA-78, PBP, TECK(CCL25), CTACK (CCL27), MEC, XCL1, XCL2, HCC-1, HCC-2, HCC-3 или HCC-4.

[296] В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой антитело. Антитело может быть нацелено на один или несколько из ангиопоэтина 2, AXL, ACVR2B, ангиопоэтина 3, активин-рецептороподобной киназы 1, амилоидного A-белка, β -амилоида, AOC3, BAFF, BAFF-R, B7-H3, BCMAC, A-125 (имитация), C5, CA-125, CCL11 (эотаксин-1), CEA, CSF1R, CD2, CD3, CD4, CD6, CD15, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD54, CD56, CD70, CD74, CD97B, CD125, D134, CD147, CD152, CD154, CD279, CD221, антигена C242, CD276, CD278, CD319, Клостридиум диффициле, клаудина 18 изоформа 2, CSF1R, CEACAM5, CSF2, карбоангидразы 9, CLDN18.2, сердечного миозина, CCR4, CGRP, фактора коагуляции III, c-Met, CTLA-4, DPP4, DR5, DLL3, DLL4, дабигатрана, EpCAM, гликопротеина вируса Эбола, эндоглина, эписиалина, EPHA3, c-Met, FGFR2, бета-цепи фибрина II, FGF 23, рецептора фолата 1, GMCSF, ганглиозида GD2, GDF-8, GCGR, желатиназы B, глипикана 3, GPNMB, рецептора α-цепи GMCSF, калликреина, KIR2D, ICAM-1, ICOS, IGF1, IGF2, рецептора IGF-1, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4Rα, IL-5, IL-6, IL-6 R, IL-9, IL-12, IL-13, IL17A, IL17F, IL-20, IL-22, IL-23, IL-31, IFN-α, IFN- β, IFN-γ, интегрина α4β7, рецептора интерферона α/β, гемаглюттинина гриппа A, ILGF2, HER1, HER2, HER3, HHGFR, HGF, HLA-DR, поверхностного антигена гепатита В, HNGF, Hsp90, HGFR, L-селектина, антигена Lewis-Y, LYPD3, LOXL2, LIV-1, MUC1, MCP-1, MSLN, мезотелина, MIF, MCAM, NCA-90, NCA-90Notch 1, нектина-4, PCDP1, PD-L1, PD-1, PCSK9, PTK7, PCDC1, фосфатидилсерина, RANKL, RTN4, резус-фактора, ROR1, SLAMF7, альфа-токсина Staphylococcus aureus, бикомпонентного лейкоцидина Staphylococcus aureus, SOST, селектина P, SLITRK6, SDC1, TFPI, TRAIL-R2, антигена опухоли CTAA16.88, TNF-α, рецептора TWEAK, TNFRSF8, TYRP1, тау-белка, TAG-72, TSLP, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TGF-β, TAG-72, TRAP, TIGIT, тенасцина C, OX-40, VEGF-A, VWF, VEGFR1 или VEGFR2.

[297] В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой терапевтический пептид. Пептиды включают, но не ограничиваются ими: глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), эксендин-2, эксендин-3, эксендин-4, предсердный натрийуретический фактор (ANF), грелин, вазопрессин, гормон роста, гормон, высвобождающий гормон роста (GHRH), RC-3095, соматостатин, бомбезин, PCK-3145, Phe-His-Ser-Cys-Asn (PHSCN), IGFl, натрийуретический пептид B-типа, пептид YY (PYY), интерфероны, тромбоспондин, ангиопоэтин, кальцитонин, гонадотропин-высвобождающий гормон, гирудин, глюкагон, анти-ФНО-альфа, фактор роста фибробластов, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, обинепитид, гормон гипофиза щитовидной железы (PTH), лейпрорелин, серморелин, праморелин, несиритид, ротигаптид, циленгитид, MBP-8298, AL-108, энфувиртид, тималфазин, даптамицин, HLFI-II, лактоферрин, делмитид, глутатион, Т-клеточный эпитоп PR1, пептиды протеазы-3 1-11, В-клеточный эпитоп P3, лютеинизирующий гормон-высвобождающий гормон (LHRH), вещество P, нейрокинин A, нейрокинин B, CCK-8, энкефалины, включая лейцин-энкефалин и метионин-энкефалин, дермасептин, [des-Ala20, Gln34]-дермасептин, антимикробный анионный пептид, ассоциированный с поверхностно-активным веществом, апидецин IA ; апидецин IB; OV-2; 1025, амид ацетил-адгезинового пептида (1025-1044); теромацин (49-63); пексиганан (MSI-78); индолицидин; апелин-15 (63-77); CFPIO (71-85); летальный фактор (LF), относящийся к ингибитору антраксу; бактенецин; ингибитор 2 протеазы вируса гепатита С NS3; ингибитор 3 протеазы NS3 вируса гепатита С; ингибитор 4 протеазы NS3 вируса гепатита; вирус гепатита С NS4A-NS4B (ингибитор протеазы NS3 I); ВИЧ-1, субстрат протеазы ВИЧ-2; пептид против FM; Bak-ВН3; пептид Bax BH3 (55-74) (дикий тип); Bid BH3-r8; СТТ (ингибитор желатиназы); E75 (Her-2/neu) (369-377); пептидный связующий химерный мотив GRP78; р53(17-26); антагонист EGFR2/KDR; коливелин AGA-(C8R) HNG17 (производное гуманина); зависимый от активности нейротрофический фактор (ADNF); ингибитор бета-секретазы I; ингибитор бета-секретазы 2; ch[бета]-амилоид (30-16); Humanun (HN) sHNG, [Glyl4]-HN, [Glyl4]-Humanin; ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (BPP); ингибитор ренина III; аннексин I (ANXA-I; Ac2-12); противовоспалительный пептид I; противовоспалительный пептид 2; противовоспалительный апелин 12; [D-Phel2, Leul4]-бомбезин; пептид Antennapedia (кислота) (пенетратин); лидерный пептид Antennapedia (CT); мастопаран; [Thr28, Nle31]-холецистокинин (25-33) сульфатный; ноцицептин (1-13) (амид); фактор, ингибирующий фибринолиз; гамма-фибриноген (377-395); ксенин; обестатин (человека); [Hisl, Lys6]-GHRP (GHRP-6); [Ala5, [бета]-Ala8]-нейрокинин A (4-10); нейромедин В; нейромедин С; нейромедин N; зависимый от активности нейротрофический фактор (ADNF-14); ацеталин I (антагонист опиоидных рецепторов I); ацеталин 2 (антагонист опиоидных рецепторов 2); ацеталин 3 (антагонист опиоидных рецепторов 3); ACTH (1-39) (человека); ACTH (7-38) (человека); саувагин; адипокинетический гормон (Locusta Migratoria); миристоилированный фактор 6 рибозилирования ADP, myr-ARF6 (2-13); PAMP (1-20) (проадреномедуллин (1-20) человека); AGRP (25-51); амилин (8-37) (человека); ангиотензин I (человека); ангиотензин II (человека); апстатин (ингибитор аминопептидазы Р); бревинин-I; магаинин I; RL-37; LL-37 (противомикробный пептид) (человека); цекропин А; антиоксидантный пептид А; антиоксидантный пептид В; L-камозин; BcI 9-2; NPVF; нейропептид AF (hNPAF) (человека); пептид Bax BH3 (55-74); ингибиторный пептид bFGF; ингибиторный пептид bFGF II; брадикинин; [Des-Argl OJ-HOE 140; ингибитор II каспазы I; ингибитор VIII каспазы I; белок Smac N7 (пептидный ингибитор I, производный от MEK1; hBD-1 ([бета]-дефенсин-1) (человека); hBD-3 ([бета]-дефенсин-3) (человека); hBD-4 ([бета]-дефенсин-4) (человека); HNP-I (нейтрофильный пептид дефензина человека I); HNP-2 (нейтрофильный пептид дефензина человека 2 динорфин А (1-17)); эндоморфин-I; [бета]-эндорфин (человеческий свиной); эндотелин 2 (человека); пептид ингибитора связывания фибриногена; цикло(-GRGDSP); TP508 (пептид, полученный из тромбина); галанин (человека); GIP (человека); пептид, высвобождающий гастрин (человека); гастрин-1 (человека); грелин (человека); пептид PDGF-BB; [D-Lys3]-GHRP-6; основной белок HCV (1-20); фрагмент пептида интегрина a3Bl (325) (амид); ламинин пентапептид (амид) меланотропин-потенцирующий фактор (MPF); VA-[бета]-MSH, липотропин-Y (производное проопиомеланокортина); предсердный натрийуретический пептид (1-28) (человека); вазонатрина пептид (1-27); [Ala5, B-Ala8]-нейрокинин А (4-10); нейромедин L (NKA); Ac-(Leu28, 31)-нейропептид Y (24-26); алитезин; мозговой нейропептид II; [D-tyrll]-нейротензин; ингибиторный пептид связывающего домена NEMO IKKy (NBD); ингибиторный пептид PTD-p50 (NLS); орексин А (бычий, человеческий, мышиный, крысиный); орексин В (человека); аквапорин-2 (254-267) (панкреастатин человека) (37-52); полипептид поджелудочной железы (человека); нейропептид; пептид YY (3-36) (человека); гидроксиметил-фитохелатин 2; PACAP (I-27) (амид, человеческий, бычий, крысиный); пептид, высвобождающий пролактин (1-31) (человека); салузин-альфа; салузин-бета; сапозин С22; секретин (человека); L-селектин; эндокинин А/В; эндокинин С (человека); эндокинин D (человека); агонист рецептора тромбина (42-48) (человека); LSKL (ингибитор тромбоспондина); тиреотропин-рилизинг-гормон (TRH); фрагмент P55-TNFR; уротензин II (человека); VIP (человека, свиньи, крысы); VIP-антагонист; гелодермин; эксенатид; ZPlO (AVEOOIOO); прамлинитид; AC162352 (PYY)(3-36); PYY; обинепитид; глюкагон; GRP; грелин (GHRP6); лейпролид; гистрелин; окситоцин; атозибан (RWJ22164); серморелин; несиритид; бивалирудин (гирулог); икатибант; авиптадин; ротигаптид (ZP123, GAP486); циленгитид (EMD-121924, пептиды RGD); AlbuBNP; BN-054; ангиотензин II; MBP-8298; пептид лейцин аргинин; зиконотид; AL-208; AL-108; карбетикон; трипептид; SAL; коливен; гуманин; ADNF-14; VIP (вазоактивный кишечный пептид); тималфазин; бацитрацин; грамидицин; пексиганан (MSI-78); Pl 13; PAC-113; SCV-07; HLFl-Il (лактоферрин); DAPTA; TRI-1144; тритрптицин; антифламин 2; Gattex (тедуглутид, ALX-0600); стимувакс (L-BLP25); хризалин (TP508); меланонан II; спантид II; церулетид; синкалид; пентагастин; секретин; пептид эндостатин; Е-селектин; HER2; IL-6; IL-8; IL-10; PDGF; тромбоспондин; uPA (I); uPA (2); VEGF; VEGF (2); пентапептид-3; XXLRR; бета-амилоидный фибриллогенез; эндоморфин-2; TIP 39 (тубероинфундибулярный нейропептид); PACAP (1-38) (амид, человеческий, бычий, крысиный); пептид, активирующий TGFB; инсулинсенсибилизирующий фактор (ISF402); пептид трансформирующего фактора роста BI (TGF-B1); рилизинг-фактор церулеина; IELLQAR (8-branchMAPS); тигапотид PK3145; гозерелин; абареликс; цетрореликс; ганиреликс; дегареликс (трипторелин); барусибан (FE 200440); пралморелин; октреотид; эптифибатид; нетамифтид (INN-00835); даптамицин; спантид II; делмитид (RDP-58); AL-209; энфувиртид; IDR-I; гексапептид-6; цепь инсулина-А; ланреотид; гекса[rho]пептид-3; В-цепь инсулина; цепь гларгин-А; цепь гларгин-В; аналог B-цепи инсулин-LisPro; аналог В-цепи инсулин-аспарта; аналог В-цепи инсулин-глулизин; аналог В-цепи инсулин-детермир; аналог соматостатина, ингибирующий опухоль; панкреастатин (37-52); фрагмент вазоактивного кишечного пептида (KKYL-NH2) и динорфин А. Примеры белков, подходящих для использования в изобретении, включают, но не ограничиваются ими: иммунотоксин SSIP, аденозиндезаминазу, аргининазу и другие.

Конъюгаты IL-2-макромолекула

[298] Обращаясь к одному или нескольким вариантам осуществления настоящего изобретения, предусмотрен более специфический конъюгат белок-макромолекула, причем конъюгат содержит остаток фрагмента IL-2, ковалентно присоединенный через линкеры к множеству водорастворимых полимеров. Конъюгаты по настоящему изобретению будут иметь один или несколько из следующих признаков.

Фрагмент IL-2

[299] Как указывалось ранее, конъюгат обычно содержит остаток фрагмента IL-2, ковалентно присоединенный через высвобождаемые или не высвобождаемые линкеры к одному или нескольким водорастворимым полимерам. Используемый в данном документе термин «фрагмент IL-2» должен относиться к фрагменту IL-2 до конъюгации, а также к фрагменту IL-2 после присоединения к водорастворимым полимерам. Однако следует понимать, что когда исходный фрагмент IL-2 присоединен к водорастворимым полимерам, фрагмент IL-2 слегка изменяется из-за присутствия одной или нескольких ковалентных связей, ассоциируемых со связью с полимером (полимерами). Часто эту слегка измененную форму фрагмента IL-2, присоединенную к другой молекуле, называют «остатком» фрагмента IL-2.

[300] Фрагмент IL-2 может быть получен нерекомбинантными способами и рекомбинантными способами, и описание не ограничивается в этом отношении. Кроме того, часть IL-2 может быть получена из человеческих, животных и растительных источников.

[301] Любой фрагмент IL-2, полученный нерекомбинантным и рекомбинантным способами, может быть использован в качестве фрагмента IL-2 при получении конъюгатов, описанных в данном документе.

[302] В зависимости от системы, используемой для экспрессии белков, обладающих активностью IL-2, фрагмент IL-2 может быть негликозилированным или гликозилированным, и любой из них может быть использован. То есть фрагмент IL-2 может быть негликозилированным или фрагмент IL-2 может быть гликозилированным. В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения фрагмент IL-2 является негликозилированным.

[303] Фрагмент IL-2 можно предпочтительно модифицировать, включив и/или заменив один или несколько аминокислотных остатков, таких как, например, лизин, цистеин, гистидин и/или аргинин, чтобы обеспечить легкое присоединение полимера к атому в боковой цепи аминокислоты. Пример замещения фрагмента IL-2 описан в патенте США № 5206344. Кроме того, фрагмент IL-2 может быть модифицирован для включения не встречающегося в природе аминокислотного остатка. Пример замещения не встречающегося в природе аминокислотного остатка фрагмента IL-2 описан в WO 2019/028419. Методы добавления аминокислотных остатков и не встречающихся в природе аминокислотных остатков хорошо известны специалистам в данной области техники. Делается ссылка на J. March, Advanced Organic IL-2mistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992).

[304] Кроме того, фрагмент IL-2 может быть предпочтительно модифицирован для включения присоединения функциональной группы (кроме добавления аминокислотного остатка, содержащего функциональную группу). Например, фрагмент IL-2 может быть модифицирован для включения тиоловой группы. Кроме того, фрагмент IL-2 может быть модифицирован для включения N-концевого альфа-углерода. Кроме того, фрагмент IL-2 может быть модифицирован для включения одного или нескольких углеводных фрагментов. Кроме того, фрагмент IL-2 может быть модифицирован для включения альдегидной группы. Кроме того, фрагмент IL-2 может быть модифицирован для включения кетоновой группы. В определенных вариантах осуществления изобретения предпочтительно, чтобы фрагмент IL-2 не был модифицирован для включения одной или нескольких из тиоловой группы, N-концевого альфа-углерода, углевода, альдегидной группы и кетоновой группы.

[305] Типичные фрагменты IL-2 описаны в литературе и, например, в патентах США №№ 5116943, 5153310, 5635597, 7101965 и 7567215 и публикациях патентных заявок США №№ 2010/0036097 и 2004/0175337. Предпочтительный фрагмент IL-2 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую фигуре 1.

[306] В некоторых случаях фрагмент IL-2 может быть в «мономерной» форме, где одна экспрессия соответствующего пептида организована в дискретную единицу. В других случаях фрагмент IL-2 может быть в форме «димера» (например, димера рекомбинантного IL-2), в котором две мономерные формы белка связаны (например, дисульфидной связью) друг с другом. Например, в контексте димера рекомбинантного человеческого IL-2 димер может быть в форме двух мономеров, связанных друг с другом дисульфидной связью, образованной из остатка Cys 125 каждого мономера.

[307] Кроме того, в качестве фрагмента IL-2 можно использовать формы-предшественники IL-2. Укороченные версии, гибридные варианты и пептидные миметики любой из вышеуказанных последовательностей также могут служить фрагментом IL-2. Биологически активные фрагменты, варианты делеции, варианты замены или варианты добавления любого из вышеперечисленных, которые сохраняют по меньшей мере некоторую степень активности IL-2, также могут служить в качестве фрагмента IL-2.

[308] Для любого данного пептидного или белкового фрагмента можно определить, обладает ли этот фрагмент активностью IL-2. Различные способы определения активности IL-2 in vitro описаны в данной области техники. Типичным подходом является анализ пролиферации клеток CTLL-2, описанный в приведенном ниже эксперименте. Иллюстративный подход описан в Moreau et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056). Другие методики, известные в данной области, также могут быть использованы для оценки функции IL-2, включая электрометрию, спектрофотометрию, хроматографию и радиометрические методики.

[309] Теперь будут описаны более конкретные иллюстративные конъюгаты в соответствии с изобретением. Как правило, ожидается, что такой фрагмент IL-2 будет иметь (по меньшей мере частично) схожую аминокислотную последовательность с последовательностью, представленной на фиг. 1. Таким образом, хотя будет сделана ссылка на конкретные положения или атомы в последовательности, представленной на фиг. 1, такая ссылка дана только для удобства, и специалист в данной области техники сможет легко определить соответствующее положение или атом в других молекулах, обладающих активностью IL-2. В частности, приведенное в данном документе описание нативного человеческого IL-2 часто применимо к фрагментам, вариантам делеции, вариантам замены или вариантам добавления любого из вышеперечисленных.

Сборка конъюгата

[310] Аминогруппы фрагментов IL-2 обеспечивают точку присоединения между фрагментом IL-2 и водорастворимым полимером. Используя аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1, становится очевидным, что имеется несколько остатков лизина, каждый из которых содержит ε-аминокислоту, которая может быть доступна для конъюгации. Кроме того, N-концевой амин любого белка также может служить точкой присоединения.

[311] Существует ряд примеров подходящих реагентов, пригодных для образования ковалентных высвобождаемых связей с доступными аминами фрагмента IL-2. Неограничивающие конкретные примеры вместе с соответствующими конъюгатами представлены в таблице 1 ниже. В таблице переменная «n» представляет собой количество повторяющихся мономерных звеньев, z представляет собой целое число от 1 до 25, а «-NH-IL-2» представляет собой остаток фрагмента IL-2 после конъюгации с полимерными реагентами или линкерами и образующий один или несколько водорастворимых полимеров, отдельно присоединенных к фрагменту IL-2, или одним или несколькими линкерами, отдельно присоединенными к фрагменту IL-2. Хотя каждая полимерная часть [например, (OCH₂CH₂)_n или (CH₂CH₂O)_n], представленная в таблице 1, заканчивается группой «CH₃», ее можно заменить другими группами (такими как H и бензил).

Таблица 1

Примеры реагентов аминоселективного сочетания и фрагмента IL-2

Образованный из них конъюгат

Реагент сочетания	Соответствующий конъюгат

[312] Конъюгацию реагента с аминогруппой фрагмента IL-2 можно осуществить различными методами. В одном подходе фрагмент IL-2 может быть конъюгирован с реагентом сочетания, функционализированным с помощью сукцинимидильного производного (или другой активированной сложноэфирной группой, при этом могут быть использованы подходы, подобные тем, которые описаны для этих альтернативных реагентов, содержащих активированную сложноэфирную группу). В этом подходе реагент, несущий сукцинимидильное производное, может быть присоединен к фрагменту IL-2 в водной среде при рН от 7 до 9,0, хотя и с использованием других условий реакции (например, более низкий рН, такой как 6-7, или различные температуры и/или менее 15°C) может привести к присоединению реагента к другому месту фрагмента IL-2.

[313] Поскольку на IL-2 имеется несколько аминосайтов, можно добиться более чем одной функционализации фрагмента IL-2 с помощью описанных реагентов сочетания с использованием избытка эквивалентов реагентов. Требуются очень высокие эквиваленты полимерных реагентов (например, 100 экв.) для конъюгации с несколькими аминогруппами фрагмента IL-2. Использование бифункциональных линкерных реагентов может более эффективно обеспечить высокую функционализацию фрагмента IL-2.

[314] Бифункциональный линкерный реагент, как правило, может нести сукцинимидильное производное и реакционноспособную группу, подходящую для клик-химии. Конъюгация бифункционального реагента с аминогруппами фрагмента IL-2 посредством сочетания NHS может обеспечить высокие степени функционализации фрагмента IL-2. Впоследствии клик-химия с подходящими полимерными реагентами может обеспечить высокополимеризованный IL-2. Некоторые неограничивающие конкретные примеры вместе с соответствующим конъюгатом представлены в таблице 2 ниже. В таблице переменная (n) представляет собой количество повторяющихся мономерных звеньев, z представляет собой целое число от 1 до 25, а «-NH-IL-2» представляет собой остаток IL-2 с одним или несколькими водорастворимыми полимерами, присоединенными отдельно. Хотя каждая полимерная часть [например, (OCH₂CH₂)_n или (CH₂CH₂O)_n], представленная в таблице 2, заканчивается группой «CH₃», ее можно заменить другими группами (такими как H и бензил).

Таблица 2

Конъюгат линкера IL-2 и образованный из него полимерный конъюгат IL-2

Конъюгат IL-2-линкер	Соответствующий полимерный конъюгат

[315] Клик-химия используется для сайт-специфического пегилирования. Сайт-специфическое пегилирование достигается за счет включения азидсодержащей неприродной аминокислоты, т. е. гомоазидоаланина, в рекомбинантный белок, который обеспечивает сайт-специфическую конъюгацию с молекулой алкин-ПЭГ.

[316] Одним из основных недостатков клик-реакции, катализируемой медью, является потребность в высокотоксичном Cu(I), а также Cu(II). Даже в небольших количествах медь может повреждать белки, в частности, флуоресцентные белки, такие как GFP. Кроме того, может потребоваться присутствие восстановителей, лигандов и бескислородных условий.

[317] Способ достижения сайт-специфического пегилирования с эффективностью, аналогичной клик-реакциям, катализируемым медью, при сохранении жизнеспособности белка заключается во введении циклооктинов, где штамм в восьмичленном кольце позволяет реакции с азидами протекать в отсутствие катализаторов при 4°С или при комнатной температуре. Дибензилциклооктины, так называемые DBCO, относятся к этому классу реакционноспособных циклооктинов.

[318] Молекулы DBCO-ПЭГ делают возможным пегилирование без меди азидсодержащего белка в мягких условиях реакции. При этом ковалентное присоединение молекулы ПЭГ к азидному остатку является эффективным и весьма сайт-специфичным из-за унаследованной селективности клик-химии.

[319] Клик-пегилирование применяли для превращения множества IL-2, функционализированных азидом (конъюгаты IL-2-линкер), во множественные пегилированные конъюгаты (конъюгаты IL-2-полимер) с высокой эффективностью. Когда происходит клик-реакция между азидом и несимметричным 1,2-дизамещенным алкином, таким как DBCO, специалисту в данной области техники будет понятно, что в качестве продуктов могут быть получены два региоизомерных соединения. Региоизомеры различаются положением образующейся связи C-N.

[320] Тиоловые группы, содержащиеся в фрагменте IL-2, могут служить эффективными местами присоединения водорастворимого полимера. В фрагменте IL-2 имеется один доступный для растворителя дисульфид. Обычно он способствует стабильности белка, а не его структуре или функции. Как сообщается в Bioconjugate Chem. 2007, 18, 61-76, после мягкого восстановления доступной нативной дисульфидной связи для высвобождения цистеиновых тиолов может следовать пегилирование бис(тиол)-специфическим реагентом. Это приводит к связыванию двух цистеиновых тиолов с присоединенным ПЭГ.

[321] Типичный конъюгат в соответствии с изобретением, использующий пегилирование с тиоловым мостиком, может включать следующую формулу (XVII):

(XVII),

или его стереоизомер, таутомер или их смесь, региоизомер или их смесь, или его изотопный вариант; или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, гидрат или пролекарство;

где X представляет собой спейсерный фрагмент, POLY представляет собой водорастворимый полимер с прямой или разветвленной цепью, а «-S-» представляет собой группу серы остатка в пределах фрагмента IL-2. В определенных вариантах осуществления водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль.

[322] Что касается полимерных реагентов, то те, что описаны в данном документе и в других источниках, могут быть приобретены из коммерческих источников или получены из коммерчески доступных исходных материалов. Кроме того, в литературе описаны способы получения полимерных реагентов.

Клик-химия

[323] В определенных вариантах осуществления конъюгаты, линкеры и формулы, раскрытые в данном документе, содержат функциональную группу, способную реагировать посредством клик-химии. Как используется в данном документе, клик-химия относится к 1,3-диполярному циклоприсоединению или [3+2] циклоприсоединению между азидом и алкином с образованием 1,2,3-триазола. Термины «1,3-диполярное циклоприсоединение» и «[3+2] циклоприсоединение» также охватывают «не содержащие меди» 1,3-диполярные циклоприсоединения между азидами и циклооктинами.

[324] Таким образом, если не указано иное, описание любого триазолового соединения в данном документе подразумевает включение региоизомеров соединения, а также их смесей.

[325] Например, [3+2] циклоприсоединение азида и алкина может давать два региоизомерных триазола следующим образом:

[326] В определенных вариантах осуществления алкин представляет собой напряженный циклоалкинил или гетероциклоалкинил, и реакцию циклоприсоединения можно проводить в присутствии или в отсутствие катализатора. В определенных вариантах осуществления, например, реакция циклоприсоединения может протекать самопроизвольно в результате реакции, называемой промотируемым штаммом азид-алкиновым циклоприсоединением (SPAAC), которая известна в данной области техники как «клик-химия без использования металлов». В определенных вариантах осуществления напряженный циклоалкинил или гетероциклоалкинил является таким, как описано в данном документе.

[327] Такие не содержащие катализатор [3+2] циклоприсоединения можно использовать в способах, описанных в данном документе, для образования конъюгатов по настоящему изобретению. Алкины могут быть активированы деформацией кольца, например, только в качестве примера, восьмичленные кольцевые структуры, присоединением электроноакцепторных групп к таким алкиновым кольцам, или алкины могут быть активированы добавлением кислоты Льюиса, такой как Au(l) или Au(lll). Описаны алкины, активированные кольцевой деформацией. Например, циклооктины и дифторциклооктины, описанные Agard et al., J. Am. Chem. Soc, 2004, 126 (46):15046-15047, дибензоциклооктины, описанные Boon et al., WO2009/067663 A1 (2009), и аза-дибензоциклооктины, описанные Debets et al., Chem. Comm., 2010, 46:97-99.

[328] В определенных вариантах осуществления конъюгаты по настоящему изобретению могут быть получены путем взаимодействия функционализированной макромолекулы, содержащей алкиновую группу, с функционализированным белком, содержащим азидную группу, с образованием конъюгата, как описано в данном документе. В других вариантах осуществления функционализированный белок может содержать активированный алкиновый фрагмент, а функционализированная макромолекула содержит азидный фрагмент.

[329] В определенных вариантах осуществления функционализированная макромолекула представляет собой функционализированный ПЭГ. В определенных вариантах осуществления функционализированный белок представляет собой функционализированный IL-2. В определенных вариантах осуществления азид в функционализированном IL-2 вступает в реакцию с алкином в функционализированном ПЭГ с образованием триазольного фрагмента (например, посредством 1,3-диполярного циклоприсоединения). В определенных вариантах осуществления азид в функционализированном ПЭГ вступает в реакцию с алкином в функционализированном IL-2 с образованием триазольного фрагмента.

[330] В определенных вариантах осуществления группы продуктов клик-химии по настоящему изобретению содержат группу триазола.

[331] В определенных вариантах осуществления группы продуктов клик-химии выбраны из группы , состоящей из: ; ; ; ; ; ; и .

[332] В определенных вариантах осуществления соединений, конъюгатов и формулы, раскрытой в данном документе, Т выбран из:

; ; ; ; ;

или .

[333] В определенных вариантах осуществления соединений, конъюгатов и формул, раскрытых в данном документе, содержащих триазольную функциональную группу (Т), триазольная функциональная группа может существовать в виде смеси региоизомеров, что приводит к тому, что соединения или конъюгаты существуют в виде смеси региоизомеров.

[334] Используемая в данном документе структура

представляет собой смесь региоизомеров следующих структур:

; и .

[335] Когда представленный в данном документе конъюгат содержит кислотный или основной фрагмент, он также может быть предоставлен в виде фармацевтически приемлемой соли.См., Berge et al., J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, и Use, 2nd ed.; Stahl и Wermuth Eds.; John Wiley & Sons, 2011.В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемая соль соединения, предусмотренного в данном документе, представляет собой сольват.В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемая соль соединения, предусмотренного в данном документе, представляет собой гидрат.

[336] Подходящие кислоты для использования при получении фармацевтически приемлемых солей соединения, представленного в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, уксусную кислоту, 2,2-дихлоруксусную кислоту, ацилированные аминокислоты, адипиновую кислоту, альгиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, L-аспарагиновую кислоту, бензолсульфокислоту, бензойную кислоту, 4-ацетамидобензойную кислоту, борную кислоту, (+)-камфорную кислоту, камфорсульфокислоту, (+)-(1S)-камфор-10-сульфокислоту, каприновую кислоту, капроновую кислоту, каприловую кислоту, коричную кислоту, лимонную кислоту, цикламовую кислоту, циклогексансульфаминовую кислоту, додецилсерную кислоту, этан-1,2-дисульфокислоту, этансульфокислоту, 2-гидроксиэтансульфокислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, галактаровую кислоту, гентизиновую кислоту, глюкогептоновую кислоту, D-глюконовую кислоту, D-глюкуроновую кислоту, L-глутаминовую кислоту, α-оксоглутаровую кислоту, гликолевую кислоту, гиппуровую кислота, бромистоводородную кислоту, хлористоводородную кислоту, йодистоводородную кислоту, (+)-L-молочную кислоту, (±)-DL-молочную кислоту, лактобионовую кислоту, лауриновую кислоту, малеиновую кислоту, (-)-L-яблочную кислоту, малоновую кислоту, (±)-DL-миндальную кислоту, метансульфокислоту, нафталин-2-сульфокислоту, нафталин-1,5-дисульфокислоту, 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту, никотиновую кислоту, азотную кислоту, олеиновую кислоту, оротовую кислоту, щавелевую кислоту, пальмитиновую кислоту, памовую кислоту, хлорную кислоту, фосфорную кислоту, L-пироглутаминовую кислоту, сахарную кислоту, салициловую кислоту, 4-аминосалициловую кислоту, себациновую кислоту, стеариновую кислоту, янтарную кислоту, серную кислоту, дубильную кислоту, (+)-L-винную кислоту, тиоциановую кислота, п-толуолсульфокислоту, ундециленовую кислоту и валериановую кислоту.

[337] Подходящие основания для использования при получении фармацевтически приемлемых солей соединения, представленного в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, неорганические основания, такие как гидроксид магния, гидроксид кальция, гидроксид калия, гидроксид цинка или гидроксид натрия; и органические основания, такие как первичные, вторичные, третичные и четвертичные, алифатические и ароматические амины, включая, помимо прочего, L-аргинин, бенетамин, бензатин, холин, деанол, диэтаноламин, диэтиламин, диметиламин, дипропиламин, диизопропиламин, 2-(диэтиламино)-этанол, этаноламин, этиламин, этилендиамин, изопропиламин, N-метил-глюкамин, гидрабамин, 1H-имидазол, L-лизин, морфолин, 4-(2-гидроксиэтил)-морфолин, метиламин, пиперидин, пиперазин, пропиламин, пирролидин, 1-(2-гидроксиэтил)-пирролидин, пиридин, хинуклидин, хинолин, изохинолин, триэтаноламин, триметиламин, триэтиламин, N-метил-D-глюкамин, 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол и трометамин.

[338] Конъюгат, представленный в данном документе, также может быть предоставлен в виде пролекарства, которое является функциональным производным соединения и легко превращается в исходное соединение in vivo.Пролекарства часто полезны, потому что в некоторых ситуациях их легче вводить, чем исходное соединение.Например, они могут быть биодоступными при пероральном введении, в то время как исходное соединение - нет.Пролекарство также может иметь повышенную растворимость в фармацевтических композициях по сравнению с исходным соединением.Пролекарство может быть превращено в исходное лекарственное средство с помощью различных механизмов, включая ферментативные процессы и метаболический гидролиз.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

[339] Конъюгаты обычно являются частью композиции. Как правило, композиция содержит множество конъюгатов. В определенных вариантах осуществления каждый конъюгат состоит из одного и того же белка (т. е. во всей композиции обнаружен только один тип белка). Кроме того, композиция может содержать множество конъюгатов, где любой данный конъюгат состоит из фрагмента, выбранного из группы, состоящей из двух или более различных белков (т.е. во всей композиции обнаруживаются два или более различных белка). В других вариантах осуществления по сути все конъюгаты в композиции (например, 85% или более от множества конъюгатов в композиции) содержат один и тот же белок. Более конкретно, этот белок представляет собой IL-2.

[340] Композиция может содержать один вид конъюгата (например, монопегилированный конъюгат, в котором единственный полимер присоединен в одном и том же месте для практически всех конъюгатов в композиции) или смесь видов конъюгата (например, смесь монопегилированных конъюгатов, где присоединение полимера происходит в разных местах и/или в смеси монопегилированных, дипегилированных, трипегилированных и множественных пегилированных конъюгатов). Композиции могут также включать другие конъюгаты, имеющие четыре, пять, шесть, семь, восемь или более полимеров, присоединенных к любому данному белку. Кроме того, изобретение включает случаи, когда композиция содержит множество конъюгатов, причем каждый конъюгат содержит один водорастворимый полимер, ковалентно присоединенный к одному белку, а также композиции, содержащие два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или больше водорастворимых полимеров, ковалентно присоединенных к одному белку. Более конкретно, этот белок представляет собой IL-2.

[341] Что касается конъюгатов в композиции, композиция обычно будет удовлетворять одной или нескольким из следующих характеристик: по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до десяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до девяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до восьи полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до семи полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до шести полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до пяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до четырех полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до трех полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до двух полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 85% конъюгатов в композиции будут иметь один полимер, присоединенный к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до десяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до девяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до восьми полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до семи полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до шести полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до пяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до четырех полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до трех полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до двух полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 95% конъюгатов в композиции будут иметь один полимер, присоединенный к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до десяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до девяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до восьми полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до семи полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до шести полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до пяти полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до четырех полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до трех полимеров, присоединенных к белку; по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь от одного до двух полимеров, присоединенных к белку и по меньшей мере 99% конъюгатов в композиции будут иметь один полимер, присоединенный к белку. Понятно, что ссылка на диапазон полимеров, например, «полимеры от x до y», предполагает количество полимеров от x до y включительно (то есть, например, «от одного до трех полимеров» подразумевает один полимер, два полимеры и три полимера, «от одного до двух полимеров» подразумевает один полимер и два полимера и так далее). Более конкретно, этот белок представляет собой IL-2.

[342] Контроль желаемого количества полимеров для любого данного фрагмента может быть достигнут путем выбора надлежащего полимерного реагента, отношения полимерного реагента к белку, температуры, условий pH и других аспектов реакции конъюгации. Кроме того, уменьшение или удаление нежелательных конъюгатов может быть достигнуто с помощью средств очистки.

[343] Например, конъюгаты полимер-белковый фрагмент могут быть очищены для получения/выделения различных конъюгированных видов. В частности, смесь продуктов может быть очищена для получения в среднем одного, двух, трех, четырех, пяти или более ПЭГ на фрагмент IL-2. Стратегия очистки конечной реакционной смеси конъюгата будет зависеть от ряда факторов, включая, например, молекулярную массу используемого полимерного реагента, конкретный белок, желаемый режим дозирования, а также остаточную активность и свойства in vivo отдельного конъюгата(-ов).

[344] При желании конъюгаты, имеющие различные молекулярные массы, могут быть выделены с использованием гель-фильтрационной хроматографии и/или ионообменной хроматографии. Другими словами, гель-фильтрационная хроматография используется для фракционирования полимерных и белковых фрагментов с разными номерами (например, 1-мер, 2-мер, 3-мер и т. д., где «1-мер» означает 1 полимер к белковому фрагменту, «2-мер» указывает два полимера к белковому фрагменту и т. д.) на основе их различной молекулярной массы (где разница по существу соответствует средней молекулярной массе водорастворимой полимерной части). Например, в типичной реакции, в которой белок с молекулярной массой 15 000 Дальтон случайным образом конъюгируют с полимерным реагентом, имеющим молекулярную массу около 20 000 Дальтон, полученная реакционная смесь может содержать немодифицированный белок (с молекулярной массой около 15 000 Дальтон), монопегилированный белок (с молекулярной массой около 35 000 Дальтон), дипегилированный белок (с молекулярной массой около 55 000 Дальтон) и так далее.

[345] Хотя этот подход можно использовать для разделения ПЭГ и других конъюгатов полимер-белок, имеющих разную молекулярную массу, этот подход, как правило, неэффективен для разделения позиционных изоформ, имеющих разные сайты связывания полимера в белке. Например, гель-фильтрационная хроматография может быть использована для отделения друг от друга смесей 1-меров, 2-меров, 3-меров ПЭГ и т. д., хотя каждая из выделенных композиций конъюгатов может содержать ПЭГ, присоединенные к различным реакционноспособным группам (например, остаткам лизина) внутри белка.

[346] Выбор конкретной колонки для гель-фильтрации будет зависеть от желаемого диапазона фракционирования. Элюирование обычно проводят с использованием подходящего буфера, такого как фосфатный, ацетатный и т.п. Собранные фракции могут быть проанализированы с помощью ряда различных методов, например, (i) поглощение при 280 нм на содержание белка, (ii) анализ белка на основе красителя с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта, (iii) тестирование йодом на содержание ПЭГ (Sims et al. (1980) Anal. BioIL-2m, 107:60-63), (iv) электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS PAGE) с последующим окрашиванием йодидом бария и (v) высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

[347] Разделение позиционных изоформ проводят с помощью обращенно-фазовой хроматографии с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием подходящей колонки (например, колонки С18 или колонки С3) или с помощью ионообменной хроматографии с использованием ионнообменной колонки. Любой подход можно использовать для разделения изомеров полимер-активное средство, имеющих одинаковую молекулярную массу (т.е. позиционные изоформы).

[348] Что касается конъюгатов IL-2-полимер, композиции предпочтительно практически не содержат белков, не обладающих активностью IL-2. Кроме того, композиции предпочтительно практически не содержат всех других нековалентно присоединенных водорастворимых полимеров. Однако в некоторых случаях композиция может содержать смесь конъюгатов полимер-фрагмент IL-2 и неконъюгированного фрагмента IL-2.

[349] Необязательно, композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. При желании фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может быть добавлено к конъюгату для образования композиции.

[350] Примеры вспомогательных веществ включают, без ограничения, вспомогательные вещества, выбранные из группы, состоящей из углеводов, неорганических солей, противомикробных средств, антиоксидантов, поверхностно-активных веществ, буферов, кислот, оснований, аминокислот и их комбинаций.

[351] В качестве вспомогательного вещества может присутствовать углевод, такой как сахар, дериватизированный сахар, такой как альдит, альдоновая кислота, этерифицированный сахар и/или полимер сахара. Конкретные углеводные вспомогательные вещества включают, например: моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелецитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит), пиранозилсорбит, миоинозитол, циклодекстрины и т.п.

[352] Вспомогательное вещество также может включать неорганическую соль или буфер, такой как лимонная кислота, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, нитрат калия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия и их комбинации.

[353] Композиция также может включать противомикробное средство для предотвращения или сдерживания микробного роста. Неограничивающие примеры противомикробных средств, подходящих для одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения, включают хлорид бензалкония, хлорид бензетония, бензиловый спирт, хлорид цетилпиридиния, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, нитрат фенилртути, тимеросал и их комбинации.

[354] В композиции также может присутствовать антиоксидант. Антиоксиданты используются для предотвращения окисления, тем самым предотвращая порчу конъюгата или других компонентов препарата. Подходящие антиоксиданты для использования в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения включают, например, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, фосфорноватистую кислоту, монотиоглицерин, пропилгаллат, бисульфит натрия, формальдегидсульфоксилат натрия, метабисульфит натрия и их комбинации.

[355] Поверхностно-активное вещество может присутствовать в качестве вспомогательного вещества. Примеры поверхностно-активных веществ включают: полисорбаты, такие как «Tween 20» и «Tween 80», и плюроники, такие как F68 и F88; сложные эфиры сорбитана; липиды, такие как фосфолипиды, такие как лецитин и другие фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины (хотя предпочтительно не в липосомальной форме), жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот; стероиды, такие как холестерин; и IL-2-средства, такие как ЭДТА, цинк и другие подобные подходящие катионы.

[356] Кислоты или основания могут присутствовать в композиции в качестве вспомогательного вещества. Неограничивающие примеры кислот, которые можно использовать, включают кислоты, выбранные из группы, состоящей из хлористоводородной кислоты, уксусной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты, муравьиной кислоты, трихлоруксусной кислоты, азотной кислоты, хлорной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, фумаровой кислоты и их комбинаций. Примеры подходящих оснований включают без ограничения основания, выбранные из группы, состоящей из гидроксида натрия, ацетата натрия, гидроксида аммония, гидроксида калия, ацетата аммония, ацетата калия, фосфата натрия, фосфата калия, цитрата натрия, формиата натрия, сульфата натрия, сульфата калия, фумарата калия и их комбинаций.

[357] Одна или несколько аминокислот могут присутствовать в качестве вспомогательного вещества в композициях, описанных в данном документе. Типичные аминокислоты в этом отношении включают аргинин, лизин и глицин.

[358] Количество конъюгата (т.е. конъюгата, образованного между активным средством и полимерным реагентом) в композиции будет варьироваться в зависимости от ряда факторов, но оптимально будет терапевтически эффективной дозой, когда композиция хранится в контейнере с единичной дозой (например, сосуд). Кроме того, фармацевтический препарат может быть помещен в шприц. Терапевтически эффективную дозу можно определить экспериментально путем многократного введения возрастающих количеств конъюгата, чтобы определить, какое количество приводит к клинически желаемому результату.

[359] Количество любого отдельного вспомогательного вещества в композиции будет варьироваться в зависимости от активности вспомогательного вещества и конкретных потребностей композиции. Как правило, оптимальное количество любого отдельного вспомогательного вещества определяют с помощью обычных экспериментов, т. е. путем приготовления композиций, содержащих различные количества вспомогательного вещества (от низкого до высокого), изучения стабильности и других параметров, а затем определения диапазона, при котором достигается оптимальная эффективность без существенных побочных эффектов.

[360] Однако, как правило, вспомогательное вещество будет присутствовать в композиции в количестве от около 1% до около 99% по весу, предпочтительно от около 5% до около 98% по весу, более предпочтительно от около 15 до около 95% по весу вспомогательного вещества, наиболее предпочтительны концентрации менее 30% по весу.

[361] Эти вышеуказанные фармацевтические вспомогательные вещества вместе с другими вспомогательными веществами описаны в «Remington: The Science & Practice of Pharmacy», 19th ed., Williams & Williams, (1995), the «Physician’s Desk Reference», 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), и Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.

Способы лечения

[362] Конъюгаты и их композиции можно использовать для лечения любого состояния, которое можно исправить или предотвратить введением конъюгата. Специалисты в данной области техники понимают, какие состояния может эффективно лечить конкретный конъюгат. Например, конъюгаты можно использовать либо отдельно, либо в комбинации с другой фармакотерапией для лечения рака, инфекционного заболевания (например, вирусного) и/или аутоиммунных заболеваний.

[363] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак крови. В некоторых вариантах осуществления рак крови представляет собой множественную миелому, лимфому или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления рак крови представляет собой острый миелоидный лейкоз, неходжкинскую лимфому, кожную Т-клеточную лимфому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак в виде солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак в виде солидной опухоли представляет собой почечно-клеточную карциному, меланому, рак молочной железы или рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления меланома представляет собой метастатическую меланому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак, который можно лечить с помощью IL-2, выбранный из группы, состоящей из саркомы, хордомы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака, базальноклеточного рака, аденокарциномы, рака потовых желез, рака сальных желез, папиллярного рака, папиллярной аденокарциномы, цистаденокарциномы, медуллярного рака, бронхогенного рака, почечно-клеточного рака, гепатомы, рака желчных протоков, хориокарциномы, семиномы, эмбрионального рака, опухоли Вильмса, рака шейки матки, рака яичка, рака желудка, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, почечно-клеточного рака, уротелиального рака, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, медуллобластомы, краниофарингиомы, эпендимомы, пинеаломы, гемангиобластомы, акустической невромы, олигодендроглиомы, менингиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза и видов лейкоза.

[364] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления инфекционное заболевание представляет собой вирусное заболевание. В некоторых вариантах осуществления вирусное заболевание представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С (HCV). В некоторых вариантах осуществления инфекционное заболевание представляет собой ВИЧ. В некоторых вариантах осуществления инфекционное заболевание представляет собой HCV.

[365] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, красную волчанку, воспалительное заболевание кишечника (IBD) или атопический дерматит. В некоторых вариантах осуществления ревматоидный артрит представляет собой ювенильный ревматоидный артрит.

[366] В определенных вариантах осуществления пациенты страдают заболеванием, выбранным из группы, состоящей из почечно-клеточной карциномы, метастатической меланомы, вируса гепатита С (HCV), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), острого миелоидного лейкоза, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, ювенильного ревматоидного артрита, атопического дерматита, рака молочной железы и рака мочевого пузыря.

[367] Преимущественно конъюгат можно вводить пациенту до, одновременно с или после введения другого активного средства. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты можно комбинировать с антителами против опухолевого антигена для получения синергетического врожденного и адаптивного иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты можно комбинировать с противоопухолевыми антителами, которые обладают своей противоопухолевой активностью за счет функций антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Конъюгаты ПЕГ-IL-2, описанные в данном документе, могут стимулировать CD8+ Т-клетки. Стимуляция CD8+ T-клеток обеспечивает не только прямое уничтожение опухоли, но и модуляцию полиморфноядерных нейтрофилов (PMN) для антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), например, за счет высвобождения цитокинов, таких как IFNγ, которые, как известно, способствуют активности нейтрофилов. (Pelletier et al., J. Leukoc. Biol. 2010; 88:1163-1170). Комбинированная терапия конъюгатами ПЭГ-IL-2 с противоопухолевыми антителами, обладающими функциями ADCC, потенциально может усилить противоопухолевую активность этих антител.

Состав/введение

[368] Описанные в данном документе конъюгаты и композиции, которые вводят нуждающимся в этом пациентам, охватывают все типы составов, в частности те, которые подходят для инъекций, например, порошки или лиофилизаты, которые можно восстанавливать, а также жидкости. Примеры подходящих разбавителей для восстановления твердых композиций перед инъекцией включают бактериостатическую воду для инъекций, 5% раствор декстрозы в воде, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера, физиологический раствор, стерильную воду, деионизированную воду и их комбинации. Что касается жидких фармацевтических композиций, то предусмотрены растворы и суспензии.

[369] Композиции по одному или нескольким вариантам осуществления настоящего изобретения обычно, хотя и не обязательно, вводят посредством инъекции и, следовательно, обычно представляют собой жидкие растворы или суспензии непосредственно перед введением. Фармацевтический препарат может также принимать другие формы, такие как сиропы, кремы, мази, таблетки, порошки и т.п. Также включены другие способы введения, такие как легочный, ректальный, трансдермальный, чресслизистый, пероральный, интратекальный, внутриопухолевый, перитуморальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутриартериальный и так далее.

[370] В изобретении также предусмотрен способ введения конъюгата, как предусмотрено в данном документе, пациенту, страдающему от состояния, поддающегося лечению конъюгатом. Способ включает введение пациенту, обычно путем инъекции, терапевтически эффективного количества конъюгата (предпочтительно в виде части фармацевтической композиции). Как описано ранее, конъюгаты можно вводить инъекцией (например, внутримышечно, подкожно и парентерально). Подходящие типы составов для парентерального введения включают готовые к инъекциям растворы, сухие порошки для комбинации с растворителем перед применением, суспензии, готовые для инъекций, сухие нерастворимые композиции для комбинации со средой-носителем перед применением, а также, среди прочего, эмульсии и жидкие концентраты для разбавления перед применением.

[371] Способ введения конъюгата (предпочтительно в виде части фармацевтической композиции) может необязательно осуществляться таким образом, чтобы локализовать конъюгат в конкретной области. Например, жидкие, гелеобразные и твердые составы, содержащие конъюгат, могут быть имплантированы хирургическим путем в пораженную область (например, в опухоль, рядом с опухолью, в воспаленную область и вблизи воспаленной области). Для удобства также можно визуализировать органы и ткани, чтобы убедиться, что желаемое место лучше подвержено для конъюгата.

[372] Фактическая вводимая доза будет варьироваться в зависимости от возраста, веса и общего состояния субъекта, а также тяжести состояния, подлежащего лечению, решения медицинского работника и вводимого конъюгата. Терапевтически эффективные количества известны специалистам в данной области техники и/или описаны в соответствующих справочных текстах и литературе. Как правило, терапевтически эффективное количество находится в диапазоне от около 0,001 мг до 100 мг, предпочтительно в дозах от 0,01 до 75 мг/день и более предпочтительно в дозах от 0,10 мг/день до 50 мг/день. Данную дозу можно вводить периодически, пока, например, не уменьшатся и/или полностью не исчезнут симптомы заболевания.

[373] Стандартная доза любого данного конъюгата (опять же, предпочтительно предоставляемая как часть фармацевтического препарата) может вводиться по различным схемам дозирования в зависимости от решения врача, потребностей пациента и так далее. Конкретная схема дозирования известна специалистам в данной области техники или может быть определена экспериментально с использованием обычных методов. Примерные схемы дозирования включают, без ограничения, введение один раз в день, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые три недели, два раза в месяц, один раз в месяц и любую их комбинацию. После достижения клинического результата дозирование композиции прекращают.

[374] Следует понимать, что, хотя раскрытие было описано в связи с его предпочтительными конкретными вариантами осуществления, предшествующее описание, а также последующие примеры предназначены для иллюстрации, а не ограничения объема изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации в пределах объема изобретения будут очевидны специалистам в области техники, к которой относится изобретение.

[375] Все статьи, книги, патенты и другие публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, настоящим полностью включены посредством ссылки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

[376] Реализация на практике настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, обычные методы органического синтеза, биохимии, очистки белков и т.п., которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе. См., например, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992), выше.

[377] В следующих примерах были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температур и т. д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, температура указывается в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному давлению на уровне моря. Все реагенты коммерчески доступны от Sigma-Aldrich или Thermo Fisher Scientific, если не указано иное. Все генерируемые ЯМР получены из ЯМР-спектрометра 300 или 400 МГц. Обработку полностью проводят в стеклянных или эмалированных сосудах, избегая контакта с металлосодержащими сосудами или оборудованием.

[378] МАТЕРИАЛЫ. Если не указано иное, все органические растворители и реагенты (безводный CH₂Cl₂, 2-пропанол, ацетон, NMM и DBCO-амин) были приобретены у Sigma Aldrich и использовались в готовом виде. PyClocK был приобретен у Novabiochem®. Реактив Y-PEG-NHS 15 кДа, 17 кДа

[379] и 20 кДа был приобретен у JenKem Technology USA и использован в том виде, в котором он был получен. Реагенты TheraPEG™ 5 кДа, 10 кДа и 20 кДа получали с использованием методов, адаптированных из опубликованных процедур (Brocchini et al, Nat. Protoc. 2006, 1:5, 2241-2252). DL-дитиотреитол (DTT) был приобретен у Melford, и перед использованием был приготовлен 0,1 М раствор в воде для клеточных культур (GE Healthcare). Материалы для приготовления буфера получали от Thermo Fisher Scientific, Merck и Sigma-Aldrich и использовали в том виде, в каком они были получены. PBS, pH 7,4, получали из DPBS (Sigma-Aldrich) путем доведения pH с использованием 2 М NaOH (VWR). Все остальные материалы были приобретены у VWR, Sigma-Aldrich, GE Healthcare, Thermo Fisher Scientific и Merck и использовались в том виде, в каком они были получены.

[380] Все исходные полимерные реагенты, упомянутые в этих примерах, являются коммерчески доступными, если не указано иное. Лиофилизированный порошок IL-2 («rIL-2») соответствует аминокислотной последовательности на фиг. 1.

[381] Массу и молярное количество конъюгатов IL-2-ПЭГ рассчитывали исходя из количества IL-2.

Анализ с помощью SDS-PAGE

[382] Образцы анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Образцы получали, наносили на гель и проводили электрофорез, как описано производителем.

Хроматография с эксклюзивным размером

[383] Для очистки полученных конъюгатов ПЭГ-rIL-2 используют метод хроматографии с эксклюзивным размером. Подробности процесса очистки описаны ниже.

Анализ с помощью ОФ-ВЭЖХ

[384] Образцы анализируют методом обращенно-фазовой хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), проводимым на системе ВЭЖХ. Аналитический анализ ОФ-ВЭЖХ проводили на системе ВЭЖХ Dionex 2 с колонкой ACE Excel 2superC18 (размеры: внутренний диаметр 75×2,1 мм, размер частиц 2 мкм). Использовали линейный градиент 0-100% буфера B (99,95% MeCN, 0,05% TFA) в буфере A (94,95% H₂O, 5,0% MeCN, 0,05% TFA) в течение 10 мин при скорости потока 0,8 мл/мин. Загрузка образца составляла 10 мкг.

Пример 1

7-Азидо-1-((4-фторфенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (8)

Получение 6-азидогексан-1-ола (2)

[385] К раствору 6-хлоргексан-1-ола (75 г, 0,549 моль, 1,0 экв.) в H₂O (750 мл) добавляли NaN₃ (97,5 г, 1,50 моль, 2,73 экв.). Смесь перемешивали при 105°C в течение 16 ч. Анализ с помощью ЖХМС реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 2 (75 г, 95%).

Получение 6-азидогексаналя (3)

[386] К раствору соединения 2 (75 г, 0,523 моль, 1,0 экв.), TEMPO (817 мг, 5,23 ммоль, 0,01 экв.) и NaHCO₃ (52,7 г, 0,628 моль, 1,2 экв.) в ДХМ/H₂O (750 мл/ 75 мл) добавляли TCCA (45 г, 0,194 моль, 0,37 экв.) 3 порциями при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 0,5 ч. Анализ с помощью ЖХМС реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь фильтровали и разбавляли водой. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 3 (70 г, 94%).

Получение (4-фторфенил)(метил)сульфана (5)

[387] К раствору соединения 4 (30 г, 0,234 моль, 1,0 экв.) в DMF (250 мл) добавляли MeI (40 г, 0,281 моль, 1,2 экв.) и K₂CO₃ (97 г, 0,702 моль, 3,0 экв.) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Анализ с помощью ТСХ реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали с помощью 5% LiCl (водн.), сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 5 (45 г, 100%).

Получение 1-фтор-4-(метилсульфонил)бензола (6)

[388] К раствору соединения 5 (45 г, 0,317 моль, 1,0 экв.) в ТГФ/ H₂O (450 мл/ 450 мл) добавляли оксон (487 г, 0,792 моль, 2,5 экв.) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Анализ с помощью ЖХМС реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь фильтровали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 6 (35 г, 63%).

Получение 7-азидо-1-((4-фторфенил)сульфонил)гептан-2-ола (7)

[389] К раствору соединения 6 (20 г, 0,115 моль, 1,0 экв.) в безводном ТГФ (200 мл) добавляли n-BuLi (2,5 M в гексане, 60 мл, 0,149 моль, 1,3 экв.) по каплям при -78°C. Охлаждающую баню удаляли и обеспечивали нагревание смеси до 0°C. После перемешивания в течение 30 мин соединение 3 (21 г, 0,149 моль, 1,3 экв.) добавляли при -78°C. После перемешивания в течение 15 мин обеспечивали нагревание смеси. Затем в смесь добавляли водный насыщенный раствор NH₄Cl (смесь становилась прозрачной) и экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением соединения 7 (26 г, 71%).

Получение 7-азидо-1-((4-фторфенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (8)

[390] К перемешиваемому раствору соединения 7 (15 г, 47,62 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (24 г, 80,95 ммоль, 1,7 экв.) в безводном ТГФ (200 мл) добавляли пиридин (7,5 г, 95,24 ммоль, 2,0 экв.) по каплям при комнатной температуре в атмосфере азота. После перемешивания в течение 10 мин смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в безводном ТГФ (100 мл) и последовательно обрабатывали NHS (16,4 г, 0,143 моль, 3,0 экв.) и пиридином (11,3 г, 0,143 ммоль, 3,0 экв.). После перемешивания в течение 10 мин смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в этилацетате (100 мл) и промывали с помощью 0,1 н. HCl, воды, насыщенного водн. раствора NaHCO₃ и солевого раствора. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением соединения 8 (12 г, 55%) в виде твердого вещества. ¹ H ЯМР (400 МГц, d₆-ДМСО) δ 7,95-7,92 (m, 2H), 7,46 (t, J=8,8 Гц, 2H), 5,10-5,09 (m, 1H), 4,04-3,97 (m, 1H), 3,84 (dd, J=15,2, 2,0 Гц, 1H), 3,27-3,24 (m, 2H), 2,77 (s, 4H), 1,65-1,64 (m, 2H), 1,44-1,42 (m, 2H), 1,23-1,22 (m, 4H).

Пример 2

7-Азидо-1-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (13)

Получение метил(4-(трифторметил)фенил)сульфана (10)

[391] К раствору соединения 9 (24,5 г, 0,138 моль, 1,0 экв.) в DMF (200 мл) добавляли MeI (23,4 г, 0,165 моль, 1,2 экв.) и K₂CO₃ (57 г, 0,413 моль, 3,0 экв.) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Анализ с помощью ТСХ реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали с помощью 5% LiCl (водн.), сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 10 (24 г, 90%).

Получение 1-(метилсульфонил)-4-(трифторметил)бензола (11)

[392] К раствору соединения 10 (24 г, 0,125 моль, 1,0 экв.) в ТГФ/ H₂O (200 мл/ 200 мл) добавляли оксон (171 г, 0,264 моль, 2,1 экв.) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Анализ с помощью ЖХМС реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь фильтровали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 11 (30,6 г, 100%).

Получение 7-азидо-1-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептан-2-ола (12)

[393] К раствору соединения 11 (15 г, 66,96 ммоль, 1,0 экв.) в безводном ТГФ (150 мл), добавляли n-BuLi (2,5 M в гексане, 35 мл, 87,05 ммоль, 1,3 экв.) по каплям при -78 °C. Охлаждающую баню удаляли и обеспечивали нагревание смеси до 0°C. После перемешивания в течение 30 мин соединение 3 (12,5 г, 87,05 ммоль, 1,3 экв.) добавляли при -78°C. После перемешивания в течение 15 мин обеспечивали нагревание смеси. Затем в смесь добавляли водный насыщенный раствор NH₄Cl (смесь становилась прозрачной) и экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением неочищенного соединения 12 (19 г, 77%).

Получение 7-азидо-1-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (13)

[394] К перемешиваемому раствору соединения 12 (19 г, 52,05 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (26,3 г, 88,49 ммоль, 1,7 экв.) в безводном ТГФ (200 мл) добавляли пиридин (8 мл, 0,104 моль, 2,0 экв.) по каплям при комнатной температуре в атмосфере азота. После перемешивания в течение 10 мин смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в безводном ТГФ (100 мл) и последовательно обрабатывали с помощью NHS (17,95 г, 0,156 моль, 3,0 экв.) и пиридина (12,5 мл, 0,156 ммоль, 3,0 экв.). После перемешивания в течение 10 мин смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в этилацетате (100 мл) и промывали с помощью 0,1 н. HCl, воды, насыщенного водн. раствора NaHCO₃ и солевого раствора. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением соединения 13 (12,5 г, 47%) в виде твердого вещества. ¹H ЯМР (400 МГц, d₆-ДМСО) δ 8,10 (d, J=8,4 Гц, 2H), 8,01 (d, J=8,4 Гц, 2H), 5,16-5,15 (m, 1H), 4,16-4,09 (m, 1H), 3,95-3,92 (m, 1H), 3,26 (t, J=6,8 Гц, 2H), 2,77 (s, 4H), 1,66-1,65 (m, 2H), 1,44-1,42 (m, 2H), 1,24-1,23 (m, 4H).

Пример 3

7-Азидо-1-((4-хлорфенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (18)

Получение (4-хлорфенил)(метил)сульфана (15)

[395] К раствору соединения 14 (30 г, 0,207 моль, 1,0 экв.) в DMF (250 мл) добавляли MeI (35,3 г, 0,249 моль, 1,2 экв.) и K₂CO₃ (85,8 г, 0,622 моль, 3,0 экв.) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Анализ с помощью ТСХ реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали с помощью 5% LiCl (водн.), сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 15 (44 г, 100%) в виде оранжевого масла. TLC: PE: EA=10:1, Rf ₍₁₄₎ =0,5, Rf ₍₁₅₎ =0,7.

Получение 1-хлор-4-(метилсульфонил)бензола (16)

[396] К раствору соединения 15 (60 г, 0,380 моль, 1,0 экв.) в ТГФ/ H₂O (400 мл/ 400 мл) добавляли оксон (583 г, 0,948 моль, 2,5 экв.) при комнатной температуре в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Анализ с помощью ЖХМС реакционной смеси показал полное превращение в необходимый продукт. Затем смесь фильтровали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 16 (57,8 г, 80%) в виде белого твердого вещества.

Получение 7-азидо-1-((4-хлорфенил)сульфонил)гептан-2-ола (17)

[397] К раствору соединения 16 (20 г, 0,105 моль, 1,0 экв.) в безводном ТГФ (300 мл) добавляли n-BuLi (2,5 M в гексане, 55 мл, 0,137 моль, 1,3 экв.) по каплям при -78°C. Охлаждающую баню удаляли и обеспечивали нагревание смеси до 0°C. После перемешивания в течение 30 мин соединение 3 (19 г, 0,137 моль, 1,3 экв.) добавляли при -78°C. После перемешивания в течение 15 мин обеспечивали нагревание смеси. Затем в смесь добавляли водный насыщенный раствор NH₄Cl (смесь становилась прозрачной) и экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением соединения 17 (26 г, 74%) в виде желтого твердого вещества.

Получение 7-азидо-1-((4-хлорфенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (18)

[398] К перемешиваемому раствору соединения 17 (31 г, 93,42 ммоль, 1,0 экв.) и трифосгена (47 г, 0,159 моль, 1,7 экв.) в безводном ТГФ (500 мл) добавляли пиридин (15 мл, 0,187 моль, 2,0 экв.) по каплям при комнатной температуре в атмосфере азота. После перемешивания в течение 10 мин смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в безводном ТГФ (500 мл) и последовательно обрабатывали с помощью NHS (32 г, 0,280 моль, 3,0 экв.) и пиридина (22 мл, 0,280 ммоль, 3,0 экв.). После перемешивания в течение 10 мин смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в этилацетате (300 мл) и промывали с помощью 0,1 н. HCl, воды, насыщенного водн. раствора NaHCO₃ и солевого раствора. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с получением соединения 18 (26 г, 59%) в виде твердого вещества. ¹H ЯМР (400 МГц, d₆-ДМСО) δ 7,87 (d, J=8,8 Гц, 2H), 7,69 (d, J=8,8 Гц, 2H), 5,11-5,10 (m, 1H), 4,06-4,00 (m, 1H), 3,86 (dd, J=15,6, 2,4 Гц, 1H), 3,26 (t, J=6,8 Гц, 2H), 2,77 (s, 4H), 1,66-1,62 (m, 2H), 1,45-1,42 (m, 2H), 1,23-1,22 (m, 4H).

Пример 4

7-Азидо-1-((2,4-дифторфенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (19)

[399] В соответствии с процедурой получения, аналогичной примеру 1, соединение из примера 4 было получено с использованием 2,4-дифторбензолтиола. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,01-7,94 (m, 1H), 7,12-7,05 (m, 1H), 7,05-6,97 (m, 1H), 5,24 (d, J=6,6 Гц, 1H), 3,78 (dd, J=15,2, 8,4 Гц, 1H), 3,46 (dd, J=15,2, 3,4 Гц, 1H), 3,26 (t, J=6,8 Гц, 2H), 2,80 (s, 4H), 1,79 (s, 2H), 1,63-1,56 (m, 2H), 1,43-1,33 (m, 4H).

Пример 5

7-Азидо-1-((4-фтор-2-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (20)

[400] В соответствии с процедурой получения, аналогичной примеру 1, соединение из примера 5 было получено с использованием 4-фтор-2-(трифторметил)бензолтиола. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,31 (dd, J=8,8, 5,2 Гц, 1H), 7,60 (dd, J=8,8, 2,6 Гц, 1H), 7,54-7,46 (m, 1H), 5,36-5,26 (m, 1H), 3,79 (dd, J=15,2, 8,8 Гц, 1H), 3,47 (dd, J=15,2, 3,2 Гц, 1H), 3,25 (t, J=6,8 Гц, 2H), 2,81 (s, 4H), 1,83-1,70 (m, 2H), 1,61-1,52 (m, 2H), 1,45-1,34 (m, 4H).

Пример 6

(2,7-бис((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (24)

Получение N2,N7-бис(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-9-(гидроксиметил)-9H-флуорен-2,7-дикарбоксамида (23)

[401] 9-(Гидроксиметил)-9H-флуорен-2,7-дикарбоновую кислоту (82,5 мг, 0,24 ммоль) растворяли в безводном пиридине (1,0 мл) и к раствору добавляли HATU (273,8 мг, 0,72 ммоль) и 2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этан-1-амин (117,1 мг, 0,54 ммоль) при к. т. Затем реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. Продукт очищали посредством ВЭЖХ в 0-70% MeCN/H₂O (с 0,1% муравьиной кислоты) с получением соединения 23 (47,4 мг, 30%).ЖХМС: m/z 685 (M+1)⁺.

Получение (2,7-бис((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (24)

[402] Соединение 23 (47,4 мг, 0,069 ммоль) растворяли в ДХМ (0,2 мл) и обрабатывали с помощью DSC (35,47 мг, 0,14 ммоль) и пиридина (16,7 мкл, 0,21 ммоль) при к. т. в атмосфере N₂. Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч. и затем разбавляли с помощью ДХМ и промывали с помощью 1 н. HCl и солевого раствора. Органическую фазу сушили над Na₂SO₄ и концентрировали. Остаток очищали посредством ВЭЖХ в MeCN/H₂O (с 0,1% TFA) с получением необходимого продукта 24 (31,7 мг, 56%, светло-желтое масло).ЖХМС: m/z 826 (M+1)⁺.

Пример 7

(2-((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (31)

Получение метил 9H-флуорен-2-карбоксилата (26)

[403] Смесь соединения 25, 2-бром-9H-флуорена (128 г, 522 ммоль), триэтиламина, TEA (106 г, 1,04 моль, 145 мл) и Pd(dppf)Cl₂ (38,2 г, 52,2 ммоль) в MeOH (890 мл) дегазировали и продували с помощью CO (50 Psi) 3 раза, и затем смесь перемешивали при 80°C в течение 5 ч. в атмосфере N₂. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=10/1) показывала образование новой точки (Rf=0,42). Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат=от 100/1 до 10/1) с получением соединения 26 (120 г, неочищенное) в виде белого твердого вещества.

Получение 9H-флуорен-2-карбоновой кислоты (27)

[404] К смеси соединения 26 (120 г, 535 ммоль) в MeOH (840 мл) добавляли NaOH (2 M), и затем смесь перемешивали при 20°C в течение 5 ч. в атмосфере N₂. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=10/1) демонстрировала полное поглощение исходного материала и образование новой точки (Rf=0,01). В раствор добавляли воду (50 мл) и затем его экстрагировали с помощью EtOAc (100 мл). pH водной фазы регулировали до 3 с помощью 3 M HCl, затем ее экстрагировали с помощью EtOAc (100 мл). Органическую фазу концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 27 (40,0 г, 190 ммоль, выход 35,6%) в виде желтого твердого вещества.

Получение 9-формил-9H-флуорен-2-карбоновой кислоты (28)

[405] В смесь соединения 27 (6,00 г, 28,5 ммоль) в DMF (196 мл) медленно добавляли этилформиат (276 г, 3,73 моль) и t-BuOK (25,6 г, 228 ммоль). Смесь перемешивали при 45°C в течение 0,5 ч., затем охлаждали до 25°C в течение 2,5 ч. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=0 /1) демонстрировала полное поглощение исходного материала и новая точка (Rf=0,48) образовывалась. pH раствора регулировали до 3 с помощью 1 M HCl. Затем смесь экстрагировали с помощью EtOAc (50,0 мл). Органическую фазу отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 28 (7,00 г, неочищенное) в виде коричневого твердого вещества.

Получение 9-(гидроксиметил)-9H-флуорен-2-карбоновой кислоты (29)

[406] К смеси соединения 28 (7,00 г, 29,4 ммоль) в MeOH (42,0 мл) добавляли NaBH₄ (2,78 г, 73,5 ммоль). Реакционную смесь дегазировали и продували с помощью N₂ 3 раза, и затем смесь перемешивали при 25°C в течение 16 ч. в атмосфере N₂. ЖХМС (продукт: RT=0,863 мин) показывала необходимое соединение МС. В раствор добавляли воду (120 мл) и затем его экстрагировали с помощью EtOAc (100 мл). pH водной фазы регулировали до 3 с помощью 1 M HCl, затем ее экстрагировали с помощью EtOAc (100 мл). Органическую фазу отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали, и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 29 (4,00 г, 16,7 ммоль, выход 56,7%) в виде желтого твердого вещества.

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-9-(гидроксиметил)-9H-флуорен-2-карбоксамида (30)

[407] К раствору соединения 29 (1,00 г, 4,16 ммоль,) и 2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этан-1-амина (908 мг, 4,16 ммоль) в DMF (7,00 мл) добавляли HOBt (619 мг, 4,58 ммоль), EDCl (878 мг, 4,58 ммоль) и DIPEA (1,24 г, 9,57 ммоль) при 25°C. Смесь перемешивали при 25°C в течение 12 ч. ЖХМС (продукт: RT=1,002 мин) демонстрировала полное поглощение исходного материала. Реакционную смесь разбавляли водой (10,0 мл), экстрагировали с помощью EtOAc (10,0 мл x 2). Объединенную органическую фазу промывали с помощью воды (10,0 мл x 2) и солевого раствора (10,0 мл). Органическую фазу отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (колонка: Welch Xtimate C18 250*50 мм*10 мкм; подвижная фаза: [вода (10 мМ NH₄HCO₃)-ACN]; B%: 18%-48%, 26 мин) с получением соединения 30 (1,40 г, 3,17 ммоль, выход 76,2%, чистота 99,8%) в виде желтого масла. ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ 8,10 (s, 1H), 7,88-7,76 (m, 3H), 7,63 (d, J=7,2 Гц, 1H), 7,46-7,34 (m, 2H), 6,98 (s, 1H), 4,18-4,08 (m, 2H), 4,02-3,92 (m, 1H), 3,76-3,56 (m, 14H), 3,32 (t, J=5,2 Гц, 2H), 2,37 (s, 1H); ЖХ-МС: m/z 441,1 (M+1)⁺.

Получение (2-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (31)

[408] Раствор 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (0,5 г, 1 экв.) в ДХМ (5 мл) охлаждали до -30°C. В раствор добавляли по каплям трихлорметилхлорформиат (860 мг, 1 экв.) и затем добавляли по каплям DIPEA (561 мг, 1 экв.) при -30°C. Смесь нагревали до 0°C и перемешивали в течение 3 ч. Ее нагревали до 25°C и продолжали перемешивание в течение 6 ч. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=0/1, Rf=0,3) демонстрировала полное поглощение исходного материала. Реакционную смесь фильтровали с получением фильтрата (ДХМ-раствор 2,5-диоксопирролидин-1-илхлорформиата), который использовали непосредственно без дополнительной очистки.

[409] К раствору соединения 30 (0,1 г, 1 экв.) и Py (17,96 мг, 1 экв.) в ДХМ (1 мл) добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-илхлорформиат (10 экв., ДХМ-раствор с предыдущей стадии) при 0°C. Смесь перемешивали при 25°C в течение 12 ч. ЖХМС (исходный материал: RT=0,992 мин, продукт: RT=1,059 мин) показывала остаток 3,71% исходного материала и 40,2% обнаружение необходимого соединения. Реакционную смесь гасили водой (2,0 мл), затем регулировали pH до 6 насыщенным водным раствором лимонной кислоты. Смесь экстрагировали с помощью ДХМ (2 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (5,0 мл) и затем сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (колонка: Welch Ultimate AQ-C18 150*30 мм*5 мкм; подвижная фаза: [вода (0,1%TFA)-ACN]; B%: 30%-60%, 12 мин). После очистки посредством препаративной ВЭЖХ фракцию лиофилизировали с получением соединения 31 в виде бесцветного масла. ЖХ-МС: m/z 582,2 (M+1)⁺.

Пример 8

(2-((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-7-фтор-9H-флуорен-9-ил)метил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (39)

Получение 2-фтор-7-йод-9H-флуорена (33)

[410] Смесь 2-фтор-9H-флуорена 32 (24,4 г, 132 ммоль), I₂ (14,1 г, 55,6 ммоль) и KIO₃ (7,08 г, 33,1 ммоль) в CH₃COOH (408 мл), H₂SO₄ (9,60 мл) и H₂O (19,2 мл) дегазировали и продували с помощью N₂ 3 раза. Смесь перемешивали при 80°C в течение 5 ч. в атмосфере N₂. ВЭЖХ (продукт: RT=3,515 мин) демонстрировала обнаружение необходимого соединения. Водный раствор экстрагировали с помощью EtOAc (50,0 мл). Органический слой промывали с помощью H₂O (20,0 мл), солевого раствора (10,0 мл), отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 33 (38,0 г, 123 ммоль, выход 92,6%) в виде коричневого твердого вещества. ¹H ЯМР (400 МГц, MeOD): 7,87 (s, 1H), 7,70-7,67 (m, 2H), 7,48-7,46 (m, 1H), 7,27-7,22 (m, 1H), 7,17-7,09 (m, 1H), 3,86 (s, 2H).

Получение метил-7-фтор-9H-флуорен-2-карбоксилата (34)

[411] Смесь соединения 33 (38,0 г, 123 ммоль), TEA (31,0 г, 306 ммоль), Pd(dppf)Cl₂ (8,97 г, 12,3 ммоль) в MeOH (200 мл) дегазировали и продували с помощью CO (50 Psi) 3 раза. Смесь перемешивали при 80°C в течение 24 ч. в атмосфере CO. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=100/1) демонстрировала полное поглощение исходного материала и новые точки (R_f=0,40) образовывались. Раствор концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 34 (40,0 г, неочищенное) в виде коричневого твердого вещества.

Получение 7-фтор-9H-флуорен-2-карбоновой кислоты (35)

[412] К смеси соединения 34 (40,0 г, 165 ммоль) в MeOH (280 мл) добавляли водный раствор NaOH (2 M, 206 мл, 2,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 100°C в течение 2 ч. в атмосфере N₂. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=0/1) демонстрировала полное поглощение исходного материала и новая точка (R_f=0,03) образовывалась. В реакционный раствор добавляли H₂O (150 мл). Затем его экстрагировали с помощью EtOAc (250 мл). Водный слой отделяли и pH регулировали до 3 с помощью 1 M HCl. Его экстрагировали с помощью EtOAc (200 мл). Органический слой промывали солевым раствором (20,0 мл), отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 35 (33,0 г, 145 ммоль, выход 87,6%) в виде коричневого твердого вещества.

Получение 7-фтор-9-формил-9H-флуорен-2-карбоновой кислоты (36)

[413] В смесь соединения 35 (33,0 г, 145 ммоль) в DMF (210 мл) добавляли этилформиат (507 г, 6,84 моль). Затем t-BuOK (130 г, 1,16 моль) добавляли медленно. Смесь перемешивали при 45°C в течение 0,5 ч., затем смесь охлаждали до 25°C в течение 2,5 ч. ЖХМС (продукт: RT=0,889) демонстрировала обнаружение необходимого соединения. В реакционный раствор добавляли воду (150 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (500 мл). pH водной фазы регулировали до 3 с помощью 1 M HCl, затем его экстрагировали с помощью EtOAc (500 мл). Органический слой промывали солевым раствором (120 мл), отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 36 (30,0 г, неочищенное) в виде желтого твердого вещества.

Получение 7-фтор-9-(гидроксиметил)-9H-флуорен-2-карбоновой кислоты (37)

[414] К смеси соединения 36 (30,0 г, 117 ммоль) в MeOH (210 мл) добавляли NaBH₄ (31,0 г, 820 ммоль) и затем смесь перемешивали при 25°C в течение 24 ч. в атмосфере N₂. ЖХМС (продукт: RT=0,906 мин) демонстрировала обнаружение необходимого соединения. В реакционный раствор добавляли воду (150 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (450 мл). pH водной фазы регулировали до 3 с помощью 1 M HCl. Затем его экстрагировали с помощью EtOAc (300 мл). Органический слой промывали солевым раствором (120 мл), отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 37 (35,0 г, неочищенное) в виде желтого твердого вещества.

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-7-фтор-9-(гидроксиметил)-9H-флуорен-2-карбоксамида (38)

[415] Смесь соединения 37 (2,00 г, 7,74 ммоль), HOBt (1,15 г, 8,52 ммоль), EDCl (1,63 г, 8,52 ммоль) и DIPEA (2,50 г, 19,4 ммоль) в DMF (14,0 мл) перемешивали при 25°C в течение 0,5 ч. Затем в смесь добавляли 2-[2-[2-(2-азидоэтокси)этокси]этокси]этанамин (1,86 г, 8,52 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 3 ч. ЖХМС (продукт: RT=1,171 мин) демонстрировала обнаружение необходимого соединения. Реакционный раствор разбавляли водой (20 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (20 мл). Органический слой промывали солевым раствором (20,0 мл), отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали посредством препаративной ВЭЖХ (колонка: Phenomenex luna c18 250 мм*100 мм*10 мкм; подвижная фаза: [вода (0,1%TFA)-ACN]; B%: 15%-53%, 25 мин) с получением соединения 38 (1,00 г, 2,12 ммоль, выход 48,7%, чистота 97,4%) в виде желтого масла. ¹H ЯМР: (400 МГц CDCl₃): δ 8,07 (s, 1H), 7,85 (d, J=7,8 Гц, 1H), 7,76-7,70 (m, 2H), 7,35 (d, J=7,2 Гц, 1H), 7,39-7,31 (m, 1H), 7,18-7,08 (m, 1H), 7,02 (s, 1H), 4,16-3,96 (m, 3H), 3,76-3,56 (m, 14H), 3,33 (t, J=4,8 Гц, 2H); ЖХ-МС: m/z 459,1 (M+1)⁺.

Получение (2-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (39)

[416] К раствору соединения 38 (0,1 г, 1 экв.) в ДХМ (1 мл) добавляли соединение 2,5-диоксопирролидин-1-илхлорформиата (10 экв., ДХМ-раствор) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 12 ч. ЖХМС (исходный материал: RT=1,026 мин, продукт: RT=1,084 мин) показывала остаток 6,33% исходного материала и 28,3% обнаружение необходимого соединения. pH реакционной смеси регулировали до 6 с помощью насыщенного водного раствора лимонной кислоты. Смесь экстрагировали с помощью ДХМ (2 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (5,0 мл), отделяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (колонка: Phenomenex Luna C18 200*40 мм*10 мкм; подвижная фаза: [вода (0,1%TFA)-ACN]; B%: 25%-55%, 10 мин). После очистки посредством препаративной ВЭЖХ раствор лиофилизировали с получением соединения 39 в виде бесцветного масла. ЖХ-МС: m/z 600,2 (M+1)⁺.

Пример 9

2,5-Диоксопирролидин-1-ил-N-(2-ацетоксиэтил)-N-(2-((((2,7-бис((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этил)глицинат (44)

Получение трет-бутил-N-(2-ацетоксиэтил)-N-(2-аминоэтил)глицината (41)

[417] К раствору трет-бутил-N-(2-ацетоксиэтил)-N-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)этил)глицината 40 (75,0 мг, 0,19 ммоль, 1,0 экв.) в этилацетате (0,6 мл) Pd/C (40 мг, 10%, сухой) добавляли при комнатной температуре. Реакционную смесь заменяли три раза с помощью H₂. Затем смесь перемешивали в течение 2 ч. в атмосфере H₂ при комнатной температуре. Реакцию отслеживали посредством ¹H ЯМР и ТСХ. (PE:EA= 1:1) соединение 40: Rf=0,3; соединение 41: Rf=0,05, Реакционный раствор фильтровали через слой целита. Органический слой концентрировали с получением продукта 41 (48,4 мг, 98%) в виде светло-желтого масла.

Получение N-(2-ацетоксиэтил)-N-(2-((((2,7-бис((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)-этокси)этокси)-этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этил)глицина (43)

[418] Полученное выше соединение 41 повторно растворяли в EtOAc (0,6 мл). К нему добавляли соединение 24 (161,0 мг, 0,19 ммоль) в ДХМ (1 мл) и затем добавляли пиридин (20 мкл). Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 1 ч. и отслеживали с помощью ЖХМС. Реакционную смесь поглощали в EtOAc (5 мл) и промывали с помощью 1 н. HCl (2 мл), и органическую фазу сушили над Na₂SO₄ и фильтровали. Затем растворитель удаляли in vacuo.

[419] В неочищенный продукт 42 добавляли HCO₂H (4 мл) и нагревали до 60°C в течение 3 ч. Продукт очищали с помощью ВЭЖХ в 10-100% MeCN/H₂O (0,1% TFA) с получением необходимого соединения 43 (31,4 мг, 18% за 3 стадии).

Получение 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-(2-ацетоксиэтил)-N-(2-((((2,7-бис((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)-амино)этил)глицината (44)

[420] Соединение 43 (9,7 мг, 0,011 ммоль) растворяли в ДХМ (0,037 мл) и обрабатывали с помощью HOSu (2,56 мг, 0,022 ммоль) и DCC (4,54 мг, 0,022 ммоль) в ДХМ (0,04 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение в течение ночи при к. т. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали. Добавляли 3-5-кратный объем Et₂O, раствор становился мутным и мутный раствор центрифугировали. Прозрачный раствор верхнего слоя фильтровали, а маслянистое твердое вещество в нижней части промывали Et₂O (2Х) и сушили в высоком вакууме с получением соединения 44 (7,2 мг, 65%). ЖХМС: 1012 (M+1)⁺; ВЄЖХ 96% (UV254); ¹H ЯМР (300 МГц, Хлороформ-d) δ 8,09 (p, J=0,7 Гц, 2H), 7,84 (тд, J=8,3, 1,1 Гц, 4H), 6,92 (с, 3H), 4,43 (д, J=6,9 Гц, 2H), 4,31 (м, 1H), 4,16 (т, J=5,3 Гц, 2H), 3,81 (с, 2H), 3,79-3,55 (м, 47H), 3,38-3,24 (м, 8H), 3,00-2,78 (м, 11H), 2,01 (с, 3H).

Пример 10

20 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[421] В высушенную круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием, добавляли 20 кДа Y-ПЭГ-NHS (1,08 г, 50,0 мкмоль, 1,0 экв.) и PyClocK (0,033 г, 60,0 мкмоль, 1,2 экв.). Колбу закрывали резиновой пробкой и помещали в инертную атмосферу аргона. Безводный CH₂Cl₂ (5,0 мл) добавляли, затем N-метилморфолин (6,10 мкл, 55,0 мкмоль, 1,1 экв.) и реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин DBCO-амин (0,028 мг, 100 мкмоль, 2,0 экв.) добавляли одной порцией в виде твердого вещества и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 3 ч. Неочищенную реакционную смесь переносили в стеклянную пипетку и добавляли по каплям к 2-пропанолу (100 мл) при интенсивном перемешивании. Получали белый осадок (материал ПЭГ), и полученную суспензию охлаждали до 4°С и фильтровали (вакуумная фильтрация), промывая ледяным 2-пропанолом (3×50 мл). Выделенный осадок переносили в предварительно взвешенные пробирки Falcon (×2) и растворяли в теплом (40°C) ацетоне (90 мл). Растворы охлаждали на бане со льдом в течение 15 мин, чтобы вызвать осаждение материала ПЭГ. Суспензии осаждали центрифугированием (10500 об/мин, 20 мин, 4°С) и осторожно удаляли супернатант. Осадки повторно растворяли в свежем теплом ацетоне (40°С), охлаждали на бане со льдом для индуцированного осаждения и подвергали еще одному циклу центрифугирования/фильтрации. Этот процесс повторялся в общей сложности 4 раза. Осадки сушили in vacuo. Выделенное белое твердое вещество, масса=1,08 г (99%). Время удержания ОФ-ВЭЖХ=6,9 мин.

Пример 11

мПЭГ2-Fmoc-Bn-20K-NHS

[422] Пример 11 мПЭГ2-Fmoc-Bn-20K-NHS получали в соответствии с модифицированными литературными процедурами из US20060293499A1 и Bioconjugate Chemistry 2003, 14, 395-403, ¹H ЯМР (300 МГц, d₆-ДМСО) δ 9,14 (br, 1H), 8,56 (m, 2H), 8,25-8,17 (m, 2H), 8,04-7,97 (m, 4H), 7,44 (m, 2H), 7,33 (m, 2H), 5,77 (s, 2H), 4,69 (m, 2H), 4,46 (m, 1H), 3,51 (br, 1800H), 2,81 (s, 4H).

ВЭЖХ: чистота 94,7%; GPC: чистота 91,2%; MALDI/GPC: 21048 Да.

Пример 12

мПЭГ2-Fmoc-Bi-20K-NHS

[423] Пример 12 мПЭГ2-Fmoc-Bi-20K-NHS получали в соответствии с модифицированными литературными процедурами из US20060293499A1 и Bioconjugate Chemistry 2006, 17, 341-351.

Пример 13

Получение rIL-2

[424] Ген IL-2, кодирующий полипептид, как показано на фиг. 1, был синтезирован и клонирован в вектор экспрессии pET21a (+) в виде фрагмента Ndel/ Xhol. Последовательности синтетических праймеров, используемых для клонирования, представляли собой: прямой праймер: 5’-aatcatatggcacctacttcaagttctacaaa-3’ (SEQ ID NO: 4) и обратный праймер: 5’-aatttatcaagttagtgttgagatgat-3’ (SEQ ID NO: 5). Положительные клоны идентифицировали расщеплением рестрикционными ферментами (Ndel и Xhol) и секвенировали с использованием стандартных протоколов секвенирования.

[425] Положительный клон отбирали и трансформировали в клетки E. Coli (BL21DE3). Следовали стандартной процедуре индукции белка IL-2, Вкратце, одну колонию инокулировали в 5 мл питательной среды Луриа (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали в течение ночи при 37°C, 200 об/мин. Ночную культуру разводили в 100 раз в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали при 37°C, 200 об/мин. Когда поглощение при 600 нм достигало примерно 0,8, культуру индуцировали с помощью 1 мМ IPTG. Температуру культуры повышали до 42°C для периода индукции. Ферментация закончилась через 4 часа индукции.

[426] После ферментации клетки собирали центрифугированием. Осадок клеточной массы хранили при температуре -80°C для будущей гомогенизации. Осадок замороженной клеточной массы повторно суспендировали в буфере для промывки клеток (20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) до концентрации 10% (вес/объем) и центрифугировали при 15600 x g, 4°C в течение 30 минут. Супернатант отбрасывали. Промытый осадок повторно суспендировали в буфере для гомогенизации (20 мМ Трис, 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 0,5% Trition-X100, pH 8,0) и гомогенизировали с помощью ультразвукового аппарата (SCIENTZ-IID от SCIENTZ, Нинбо, Чжэцзян, КНР) при 4-15°C за три прохода. Гомогенат центрифугировали при 15600×g, 4°C в течение 30 минут. Супернатант отбрасывали. Осадок внутриклеточных телец промывали в буфере (20 мМ Трис, 0,1 М NaCl, 2 М мочевины, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и центрифугировали при 15600×g, 4°C в течение 30 минут. Супернатант отбрасывали. После центрифугирования получали неочищенные внутриклеточные тельца IL-2.

[427] Неочищенные внутриклеточные тельца IL-2 растворяли в буфере, 6 М гуанидина, 100 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола (DTT), рН 8,0. Смесь инкубировали при 50°C в течение 30 минут. После восстановления к смеси добавляли воду для снижения концентрации гуанидина до 4,8 М. После одного часа центрифугирования при 15600×g полученный гелеобразный осадок отбрасывали. Концентрацию гуанидина в супернатанте дополнительно снижали до 3,5 М добавлением воды. pH доводили до 5 титрованием 100% уксусной кислоты. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут и центрифугировали при 15600 x g в течение одного часа. Полученный осадок суспендировали в 3,5 М гуанидине, 20 мМ ацетате, 5 мМ DTT, буфере с рН 5 и центрифугировали при 15600 × g в течение одного часа. Эту стадию промывания повторяли еще раз.

[428] Чистые и восстановленные внутриклеточные тельца IL-2 растворяли в 6 М гуанидина, 100 мМ трис-буфера, рН 8, Добавляли 100 мМ исходного раствора CuCl₂ для достижения конечной концентрации Cu²⁺ 0,1 мМ. Смесь инкубировали при 4°C в течение ночи.

[429] Экспрессированный раствор IL-2 помещали в диализные мешки (имеющие размер пор молекулярной массы 3 кДа). Диализные мешки помещали в резервуар, содержащий 4,8 М гуанидина, 0,1 М Трис, буфер с pH 8. После трехчасового уравновешивания концентрацию гуанидина в резервуаре сначала медленно снижали до 2 М путем закачки воды в резервуар в течение 15 часов, а затем снижали до уровня менее 10 мМ путем закачивания в резервуар 20 мМ буфера PB pH 6,0 в течение 8 часов. Весь процесс рефолдинга завершался при 4°С. Рефолдированный IL-2 проверяли с помощью SEC-ВЭЖХ.

[430] Рефолдированный IL-2 центрифугировали при 15600 × g в течение 60 минут для удаления осадка. Супернатант концентрировали с помощью мембранной системы Mini Pellicon TFF (Millipore Corporation, США).

[431] Рефолдированный и концентрированный IL-2 наносили на колонку XK (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Уппсала, Швеция), заполненную смолой FF SP Sepharose. Подвижный буфер представлял собой 20 мМ PB, pH 6,0, и скорость потока составляла 10 мл/мин. Фракции под пиком мономера IL-2 объединяли.

[432] Объединенный элюент FF SP Sepharsoe был обессолен путем загрузки в колонку XK (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Уппсала, Швеция), заполненную смолой Sephadex G25, Подвижный буфер представлял собой 20 мМ PB, pH 6,0, и скорость потока составляла 25 мл/мин. Фракции под пиком мономера IL-2 объединяли.

[433] Обессоленную совокупность мономеров IL-2 загружали в колонку XK (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Уппсала, Швеция), заполненную смолой Q Sepharose FF. Подвижный буфер представлял собой 20 мМ PB, pH 6,0, и скорость потока составляла 25 мл/мин. Поток через пик был объединен. Следует отметить, что также могут быть использованы другие подходящие методы очистки, такие как эксклюзионная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC-хроматография).

[434] Совокупность мономерной фракции IL-2 концентрировали примерно до 1-2 мг/мл с использованием мембранной системы TFF Mini Pellicon (Millipore Corporation, США) при 4°C и рабочем давлении 10-22 psi. Концентрированный раствор мономера IL-2 подвергали диализу в буферном растворе, используемом для приготовления конечного лекарственного состава (10 мМ ацетат-Na, 5% трегалоза, pH 4,5) при 4°C. Составленный раствор IL-2 был обеззаражен путем пропускания через фильтр 0,22 мкм и хранился при температуре -80°C для дальнейшего использования.

Получение лиофилизированного rIL-2 для конъюгации

[435] Шестнадцать сосудов rIL-2 (16×5 мг) нагревали до комнатной температуры от -80°C. На каждый сосуд лиофилизированного материала добавляли 0,1% водн. раствор SDS (21 мл), содержимое сосудов перемешивали до полного растворения. Раствор rIL-2 заменяли буфером на 100 мМ бората натрия, pH 8, и концентрировали с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 5 кДа MWCO PES). Белковый раствор с замененным буфером фильтровали стерилизацией (0,22 мкм PVDF) и количественно определяли с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (3,19 мг/мл).

Получение IL-2 на основе раствора для конъюгации в буфере с рН 8,0

[436] IL-2 (15 мг, 10 мл) был заменен буфером на 100 мМ бората натрия, pH 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS с использованием колонки P100 в соответствии с инструкциями производителя. Раствор IL-2 концентрировали с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 5 кДа MWCO PES). Белковый раствор с замененным буфером фильтровали стерилизацией (0,22 мкм PVDF) и количественно определяли с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (2,67, или 2,5, или 3,0 мг/мл соответственно).

Получение IL-2 на основе раствора для конъюгации в буфере с рН 9,0,

[437] IL-2 (15 мг, 10 мл) был заменен буфером на 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS с использованием колонки P100 в соответствии с инструкциями производителя. Раствор IL-2 концентрировали с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 5 кДа MWCO PES). Белковый раствор с замененным буфером фильтровали стерилизацией (0,22 мкм PVDF) и количественно определяли с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (2,9 мг/мл).

Пример 14

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 1

Получение [rIL-2]-[F-Ph-SO ₂ -N ₃ ] _z

[438] Перед конъюгацией IL-2 разбавляли до 3,09 мг/мл с помощью 100 мМ бората натрия, рН 8.

[439] Соединение 8 (4,4 мг) растворяли в DMF (0,885 мл) с получением раствора реагента 4,97 мг/мл. В сосуд rIL-2 (10 мг, 3,24 мл) соединение 8 (1,79 мг, 360 мкл, 6 экв.) добавляли, реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C в течение 1 ч. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2 в виде [rIL-2]-[F-Ph-SO₂-N₃]_z.

[440] На фиг. 2 показано распределение [rIL-2]-[F-Ph-SO₂-N₃]_z с центром вокруг 6, определенное с помощью ЖХ-МС.

Пример 15

Клик-пегилирование [rIL-2]-[F-Ph-SO ₂ -N ₃ ] _z с помощью 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[441] 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (143,7 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,419 мл). К раствору [rIL-2]-[F-Ph-SO₂-N₃]_z соединение из примера 14 (9,5 мг, 3,42 мл), 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (134 мг, 1,33 мл, 10 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 ч. Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[442] Образец количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect (8,8 мг, выход 92%). Соотношение ПЭГ:IL-2 определяли с помощью SDS-PAGE.

[443] На фиг. 3 показан SDS-анализ конъюгатов [20К мПЭГ-(F-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] с соотношением ПЭГ:IL-2, равным 4,9.

Пример 16

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 2

Получение [rIL-2]-[CF ₃ -Ph-SO ₂ -N ₃ ] _z

[444] Перед конъюгацией IL-2 разбавляли до 3,09 мг/мл с помощью 100 мМ бората натрия, рН 8.

[445] Соединение 13 (7,5 мг) растворяли в DMF (0,816 мл) с получением раствора реагента 9,19 мг/мл. В сосуд rIL-2 (10 мг, 3,24 мл), соединение 13 (3,31 мг, 360 мкл, 10 экв.) добавляли, реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C в течение 1 ч. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2 в виде [rIL-2]-[CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z.

[446] На фиг. 1 показано образование распределения [rIL-2]-[CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z с центром вокруг 6, определенное с помощью ЖХ-МС.

Пример 17

Клик-пегилирование [rIL-2]-[CF ₃ -Ph-SO ₂ -N ₃ ] _z с помощью 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[447] 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (210,9 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,388 мл). К раствору [rIL-2]-[CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z соединение из примера 16 (9,7 мг, 3,49 мл), 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (207 мг, 1,36 мл, 15 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 ч. Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[448] Образец количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect (7,9 мг, выход 81%). Соотношение ПЭГ:IL-2 определяли с помощью SDS-PAGE.

[449] На фиг. 3 показан SDS-анализ конъюгатов [20K мПЭГ-(CF₃-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] с соотношением ПЭГ:IL-2, равным 5,4.

Пример 18

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 3

Получение [rIL-2]-[Cl-Ph-SO ₂ -N ₃ ] _z

[450] Перед конъюгацией IL-2 разбавляли до 3,09 мг/мл с помощью 100 мМ бората натрия, pH 8, Соединение 18 (5,0 мг) растворяли в DMF (0,971 мл) с получением раствора реагента 5,15 мг/мл. В сосуд rIL-2 (10 мг, 3,24 мл), соединение 18 (1,85 мг, 360 мкл, 6 экв.) добавляли, реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C в течение 1 ч. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2 в виде [rIL-2]-[Cl-Ph-SO₂-N₃]_z .

[451] На фиг. 1 показано образование распределения [rIL-2]-[Cl-Ph-SO₂-N₃]_z с центром вокруг 5, определенное с помощью ЖХ-МС.

Пример 19

Клик-пегилирование [rIL-2]-[Cl-Ph-SO ₂ -N ₃ ] _z с помощью 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[452] 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (213,2 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,403 мл). К раствору [rIL-2]-[Cl-Ph-SO₂-N₃]_z соединение из примера 18 (9,7 мг, 3,49 мл), 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (207 мг, 1,36 мл, 15 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 ч. Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[453] Образец количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect (8,2 мг, 84%). Соотношение ПЭГ:IL-2 определяли с помощью SDS-PAGE.

[454] На фиг. 3 показан SDS-анализ конъюгатов [20K мПЭГ-(Cl-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] с соотношением ПЭГ:IL-2, равным 4,9.

Пример 20

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 4 и клик-пегилирование с помощью 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[455] Соединение из примера 4 (5,8 мг) растворяли в DMF (0,677 мл) с получением раствора реагента 8,57 мг/мл. В сосуд IL-2 (7 мг, 0,458 мкмоль, 2,265 мл) соединение из примера 4 (2,16 мг, 4,55 мкмоль, 252 мкл, 10 экв.) добавляли, реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C в течение 1 ч. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[456] 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (406,4 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (2,00 мл) с получением раствора 203 мг/мл. К [rIL-2]-[F, F-Ph-SO₂-N₃]_z (7,0 мг, 0,458 мкмоль, 2,52 мл) 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (199 мг, 9,15 мкмоль, 0,98 мл, 20 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °C. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 ч. и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF). Соединение из примера 20 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect в виде [20K мПЭГ-(F, F-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (5,2 мг, выход 74%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 4,8.

Пример 21

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 5 и клик-пегилирование с помощью 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[457] Соединение из примера 5 (4,5 мг) растворяли в DMF (0,528 мл) с получением раствора реагента 8,52 мг/мл. В сосуд IL-2 (7 мг, 0,458 мкмоль, 2,265 мл) соединение из примера 5 (2,15 мг, 4,10 мкмоль, 252 мкл, 9 экв.) добавляли, реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C в течение 1 ч. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[458] 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (406,4 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (2,00 мл) с получением раствора 203 мг/мл. К [rIL-2]-[F, CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z (7,0 мг, 0,458 мкмоль, 2,52 мл) 20 кДа Y-ПЭГ-DBCO (199 мг, 9,15 мкмоль, 0,98 мл, 20 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °C. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 ч. и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF). Соединение из примера 21 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect в виде [20K мПЭГ-(F, CF₃-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (2,9 мг, выход 41%). Анализ с помощью SDS-PAGE конъюгата показывал соотношение ПЭГ:IL-2, равное 4,5.

Пример 22

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 6 и клик-пегилирование с помощью 10 кДа ПЭГ-DBCO

[459] Перед конъюгацией IL-2 разбавляли до 3,09 мг/мл с помощью 100 мМ бората натрия, pH 8, Соединение 24 (16,5 мг) растворяли в DMF (1,107 мл) с получением раствора реагента 14,9 мг/мл. В сосуд IL-2 (10 мг, 3,24 мл) соединение 24 (5,96 мг, 400 мкл, 11 экв.) добавляли, реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C в течение 1 ч. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2 в виде [rIL-2]-[Fmoc-(N₃)₂]_z.

[460] 10 кДа ПЭГ-DBCO (Iris Biotech, 276,3 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,439 мл). К раствору [rIL-2]-[Fmoc-(N₃)₂]_z. (10 мг, 3,64 мл) 10 кДа ПЭГ-DBCO (262 мг, 1,36 мл, 40 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 ч. Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 мкг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[461] Образец количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect. Соотношение ПЭГ:IL-2 определяли с помощью SDS-PAGE.

[462] На фиг. 3 показан SDS-анализ конъюгатов [мПЭГ₂-T₂-Fmoc-20K]_z-[rIL-2] с соотношением ПЭГ:IL-2, равным 4,9.

Пример 23

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 9 и клик-пегилирование с помощью 10 кДа ПЭГ-DBCO

[463] Согласно аналогичной процедуре получения, как для примера 14 и 15, пример 23 получали в виде [мПЭГ₂-T₂-Fmoc-Bi-20K]_z-[rIL-2] с использованием примера 9.

Пример 24

Пегилирование rIL-2 с помощью примера 11

[464] Перед конъюгацией IL-2 разбавляют до 1,5 мг/мл с помощью 100 мМ бората натрия, рН 8, mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS из примера 11 растворяют в 100 мМ бората натрия, рН 8, и добавляют к rIL-2 (10 мг) в количестве, достаточном для достижения молярного отношения mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS к rIL-2 100:1, Реакции конъюгации дают возможность протекать в течение одного часа при 22°C с получением конъюгатов [mPEG2-Fmoc-Bn-20K]_z-[rIL-2]. Неочищенную реакционную смесь затем очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 мкг. Образец изократически элюируют 50 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[465] [мПЭГ2-Fmoc-Bn-20K]_z-[rIL-2] определяют количественно с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect. Соотношение ПЭГ:IL-2 определяют с помощью SDS-PAGE.

Пример 25

Пегилирование rIL-2 с помощью примера 12

[466] При использовании условий пегилирования и очистки, сходных с примером 24, пегилирование rIL-2 с помощью соединения примера 12 mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS дает конъюгат [mPEG2-Fmoc-Bi-20K]_z-[rIL-2].

Пример 26

Пегилирование дисульфидной связи rIL-2 с помощью 10 кДа бис(сульфон) ПЭГ 45

[467] К раствору r-IL-2 (4,2 мг, 0,25 мг/мл) в буфере 100 мМ бората натрия, pH 8, добавляли 10 мМ DTT. Раствор инкубировали в течение часа при 22°C. Избыток DTT удаляли гель-фильтрацией с использованием буфера 100 мМ бората натрия, рН 8, содержащего 20 мМ ЭДТА. К раствору с восстановленным белком добавляли 1,3 экв. 10 кДа ПЭГ-бис(сульфона) 45, 0,05% вес./об. SDS, и обеспечивали вступление в реакцию раствора в течение 16 ч. при 22 °С. Реакционный раствор фильтровали через фильтр Vivapure Q Mani H для удаления SDS. Затем в нем заменяли буфер путем ультрафильтрации со спин-фильтрами MWCO 5 кДа в 50 мМ ацетата натрия, pH 4,0. Затем раствор загружали в колонку со смолой MacroCapSP объемом 5 мл. Конъюгат элюировали при промывании колонки линейным градиентом 0-1 М хлорида натрия в буфере 50 мМ ацетата натрия, рН 4, Конъюгат дополнительно выделяли эксклюзионной хроматографией (SEC) с получением 1,4 мг продукта. Чистота по SDS-PAGE: 97%. Чистота по аналитической SEC: 87,3%

Пример 27

Пегилирование rIL-2 с помощью реагента ПЭГ 46

[468] Раствор реагента ПЭГ 405 мг/мл 46 (1,50 г) получали в 2 мМ HCl (3,702 мл). К rIL-2 (10 мг, 3,135 мл) реагент ПЭГ 405 мг/мл 46 (1,43 г, 3,535 мл, 100 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°C. Через 1 ч. неочищенную реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE и очищали с помощью SEC.Неочищенный продукт IL-2-(ПЭГ)_z очищали с помощью SEC с использованием колонки HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали 50 мМ ацетатом натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF). Концентрацию белка количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect (6,6 мг, 66%), а соотношение ПЭГ:IL-2 определяли с помощью SDS-PAGE. SDS-анализ конъюгатов [мПЭГ₂-Fmoc-20K]_z-[rIL-2] показал соотношение ПЭГ:IL-2, равное 5,1.

Пример 28

1-((3-((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)фенил)сульфонил)-5-метоксипентан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (52)

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-3-(метилсульфонил)бензамида (48)

[469] К раствору соединения 47 (1,0 г, 5,0 ммоль) в DMF (15 мл) добавляли соединение 22 (1,3 г, 6,0 ммоль), HATU (2,47 г, 6,5 ммоль) и TEA (1,01 г, 10,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь концентрировали и растворяли этилацетатом и водой. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали посредством ротационного выпаривания. Полученный остаток очищали посредством колоночной хроматографии с получением соединения 48 (900 мг) в виде желтого масла.

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-3-((2-гидрокси-5-метоксипентил)сульфонил)бензамида (50)

[470] К раствору соединения 48 (400 мг, 1 ммоль) и соединения 49 (560 мг, 5,5 ммоль) в сухом ТГФ (30 мл) добавляли KHMDS (5,5 мл, 5,5 ммоль) медленно при -78°C в атмосфере N₂. Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором NH₄Cl. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали посредством ротационного выпаривания. Полученный остаток очищали посредством колоночной хроматографии с элюированием 2% CH₃OH в CH₂Cl₂ с получением соединения 50 (168 мг) в виде желтого масла.

Получение 1-((3-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-карбамоил)фенил)сульфонил)-5-метоксипентан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (51)

[471] К раствору соединения 50 (100 мг, 0,2 ммоль) и трифосгена (89 мг, 0,3 ммоль) в сухом ТГФ (5 мл) добавляли пиридин (64 мг, 0,8 ммоль) медленно. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 20 мин. Затем ее фильтровали и концентрировали посредством ротационного выпаривания. Полученный остаток использовали на следующей стадии.

[472] К раствору полученного остатка (117 мг, 0,2 ммоль) и HOSu (69 мг, 0,6 ммоль) в сухом ТГФ (5 мл) добавляли пиридин (64 мг, 0,8 ммоль) медленно. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×10 мл). Объединенные органические вещества промывали солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали посредством ротационного выпаривания. Полученный остаток очищали посредством препаративной ТСХ (CH₂Cl₂: CH₃OH=30 : 1) с получением соединения 51 (55 мг) в виде бесцветного масла.

[473] LCMS: m/z 644,25 [M+1].

[474] ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,32 (с, 1H), 8,18 (д, J=7,6 Гц, 1H), 8,04 (д, J=7,7 Гц, 1H), 7,68 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,37 (шир. с, 1H), 5,30-5,24 (м, 1H), 3,77-3,55 (м, 15H), 3,45-3,31 (м, 5H), 3,27 (с, 3H), 2,81 (с, 4H), 1,94-1,78 (м, 2H), 1,66-1,58 (м, 2H).

Пример 29

1-((3-((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-4-(трифторметил)фенил)сульфонил)-5-метоксипентан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (61)

Получение метил 5-((4-метоксибензил)тио)-2-(трифторметил)бензоата (54)

[475] К раствору соединения 52 (5,0 г, 17,66 ммоль, 1,0 экв.), соединения 53 (4,09 г, 26,5 ммоль, 1,5 экв.), Pd₂(dba)₃ (1,62 г, 1,76 ммоль, 0,1 экв.), Xant-phose (2,04 г, 3,52 ммоль, 0,2 экв.) и DIEA (6,84 г, 52,99 моль, 3,0 экв.) в диоксане (50 мл) перемешивали при 80°C в течение 2 ч. Полученную смесь охлаждали до к. т. и фильтровали через слой целита. Фильтрат концентрировали и остаток растворяли в EtOAc (100 мл). Смесь промывали с помощью воды (100 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (100 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 100/1 до 80/1 до 50/1) с получением соединения 54 (6,2 г, 98%) в виде светло-желтого масла.

[476] ТСХ: PE/EA=10/1, УФ, R_f (соединение 52)=0,80, R_f (соединение 54)=0,60.

[477] ЖХ-МС: 379,10 [M+23]⁺.

Получение метил 5-меркапто-2-(трифторметил)бензоата (55)

[478] К раствору соединения 54 (1,0 г, 2,80 ммоль, 1,0 экв.) и TES (0,98 г, 8,42 ммоль, 3,0 экв.) в TFA (15 мл) проводили посредством микроволновой печи, 120°C в течение 1 ч. Полученную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток выливали в ледяную воду (20 мл) и pH смеси регулировали до 7~8 водным раствором бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали с помощью EtOAc (30 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 55 (800 мг) в виде серого масла, которое использовали на следующей стадии непосредственно без дополнительной очистки.

[479] ТСХ: PE/EA =5:1, УФ, R_f (соединение 54)=0,80, R_f (соединение 55)=0,30.

Получение метил-5-(метилтио)-2-(трифторметил)бензоата (56)

[480] К раствору соединения 55 (4,8 г, 20,32 ммоль, 1,0 экв.) в MeCN (50 мл) добавляли K₂CO₃ (8,5 г, 60,96 ммоль, 3,0 экв.) и CH₃I (14,4 г, 101,6 ммоль, 5,0 экв.) по каплям при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. В полученную смесь добавляли воду и экстрагировали с помощью EtOAc (50 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE) с получением соединения 56 (4,0 г, 78%) в виде желтого твердого вещества.

[481] ТСХ: PE/EA =5:1, УФ, R_f (соединение 55)=0,30, R_f (соединение 56)=0,85.

[482] ЖХ-МС: 251,00 [M+1]⁺.

Получение метил-5-(метилсульфонил)-2-(трифторметил)бензоата (57)

[483] К раствору соединения 56 (4,7 г, 18,78 ммоль, 1,0 экв.) в ДХМ (50 мл) добавляли m-CPBA (19,5 г, 112,68 ммоль, 6,0 экв.) порциями при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 16 ч. Реакционную смесь гасили раствором бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали с помощь ДХМ (50 мл x 3), промывали с помощью раствора NaCl (100 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 100/1 до 50/1 до 20/1 до 10/1) с получением соединения 57 (2,97 г, 56%) в виде белого твердого вещества.

[484] ТСХ: PE/EA =5:1, УФ, R_f (соединение 56)=0,85, R_f (соединение 57)=0,10.

Получение метил-5-((2-гидрокси-5-метоксипентил)сульфонил)-2-(трифторметил)бензоата (58)

[485] К раствору соединения 57 (0,9 г, 3,543 ммоль, 1,0 экв.) и 4-метоксибутаналя (0,724 мг, 7,086 ммоль, 2,0 экв.) в ТГФ (10 мл) добавляли KHMDS (5,4 мл, 5,315 ммоль, 1,5 экв.) по каплям при -78°C, реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили водным раствором NH₄Cl при 0°C и экстрагировали с помощью EtOAc (30 мл x 3). Органическую фазу промывали с помощью насыщенного раствора NaCl (100 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 20/1 до 5/1 до 2/1) с получением соединения 58 (520 мг, 40%) в виде желтого масла.

[486] ТСХ: PE/EA =2:1, УФ, R_f (соединение 57)=0,60, R_f (соединение 58)=0,20.

[487] ЖХ-МС: 385,10 [M+1]⁺.

Получение 5-((2-гидрокси-5-метоксипентил)сульфонил)-2-(трифторметил)бензойной кислоты (59)

[488] К раствору соединения 58 (510 мг, 1,327 ммоль, 1,0 экв.) в MeOH/ТГФ=1/1 (6 мл) добавляли 5% LiOH (63,6 мг, 2,654 ммоль, 2,0 экв.) по каплям при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 2 ч. pH реакционной смеси регулировали до 2 с помощью 1 н. HCl. Смесь экстрагировали с помощью EtOAc (20 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 59 (505 мг, неочищенное, 100%) в виде желтого масла.

[489] ЖХ-МС: 393,10 [M+23]⁺.

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-5-((2-гидрокси-5-метоксипентил)сульфонил)-2-(трифторметил)бензамида (60)

[490] К раствору соединения 59 (1,0 г, 3,24 ммоль, 1,0 экв.), соединения 22 (0,849 г, 3,89 ммоль, 1,2 экв.), HATU (1,6 г, 4,21 ммоль, 1,3 экв.) и TEA (0,982 г, 9,72 моль, 3,0 экв.) в DMF (12 мл) перемешивали при к. т. в течение 16 ч. В реакционную смесь добавляли воду (50 мл) и экстрагировали этилацетатом (30 мл x 3). Органическую фазу промывали с помощью водного раствора NaCl (50 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 20/1 до 10/1, до 5/1, до 2/1, до 1/1) и посредством ТСХ с получением соединения 60 (520 мг, 34%) в виде светло-желтого масла.

[491] ЖХ-МС: 571,35 [M+1]⁺.

Получение 1-((3-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-4-(трифторметил)фенил)сульфонил)-5-метоксипентан-2-ил (2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (61)

[492] К раствору соединения 60 (0,3 г, 0,5258 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (3 мл) добавляли пиридин (0,166 г, 2,103 ммоль, 4,0 экв.) и трифосген (0,39 г, 1,3145 ммоль, 2,5 экв.) порциями при 0°C. Смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в ТГФ (3 мл). В смесь добавляли пиридин (0,166 г, 2,103 ммоль, 4,0 экв.) и HOSU (0,182 г, 1,5774 ммоль, 3,0 экв.) порциями при 0°C. Смесь перемешивали при к. т. в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили водой при 0°C и экстрагировали с помощью EtOAc (20 мл x 3). Органическую фазу сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (0,1% HCOOH). Элюируемый раствор экстрагировали с помощью EtOAc. Органическую фазу сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 61 (150 мг, 40%) в виде бесцветного масла.

[493] ЖХ-МС: 712,35 [M+1]⁺.

[494] ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,11 (д, J=9,5 Гц, 2H), 7,94 (д, J=8,1 Гц, 1H), 6,94 (с, 1H), 5,31 (д, J=6,9 Гц, 1H), 3,65 (д, J=6,3 Гц, 8H), 3,59 (к, J=5,0 Гц, 6H), 3,36 (дт, J=18,4, 5,4 Гц, 4H), 3,29 (д, J=1,0 Гц, 3H), 2,83 (с, 4H), 1,90 (к, J=7,2 Гц, 2H), 1,65 (д, J=8,5 Гц, 2H).

Пример 30

1-((3-((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-4-хлорфенил)сульфонил)-5-метоксипентан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (68)

Получение метил-2-хлор-5-(метилтио)бензоата (63)

[495] К раствору соединения 62 (10,0 г, 49,53 ммоль, 1,0 экв.), CH₃I (7,73 г, 54,48 ммоль, 1,1 экв.) добавляли K₂CO₃ (7,5 г, 54,48 ммоль, 1,1 экв.) при к. т. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 3 ч. В полученную смесь добавляли воду (200 мл) и EtOAc (200 мл). Органический слой отделяли, промывали с помощью 5% водного раствора LiCl пять раз, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 63 (11,0 г, неочищенное) в виде желтого масла.

[496] ТСХ: PE/EA=3/1, УФ, R_f (соединение 62)=0,05, R_f (соединение 63)=0,85.

[497] ¹ H ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ 7,61 (д, J=2,3 Гц, 1H), 7,44-7,32 (м, 2H), 3,88 (с, 3H), 2,48 (с, 3H).

Получение метил-2-хлор-5-(метилсульфонил)бензоата (64)

[498] К раствору соединения 63 (6,0 г, 27,78 ммоль, 1,0 экв.) в ДХМ (60 мл) добавляли m-CPBA (28,7 г, 166,67 ммоль, 6,0 экв.) порциями при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 16 ч. Реакционную смесь гасили водным раствором бикарбоната натрия, экстрагировали с помощью ДХМ (100 мл x 3), промывали с помощью водного раствора NaCl (100 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 40/1 до 20/1, до 3/1) с получением соединения 64 (5,6 г, 81%) в виде белого твердого вещества.

[499] ТСХ: PE/EA=3/1, УФ, R_f (соединение 63)=0,85, R_f (соединение 64)=0,45.

[500] ¹ H ЯМР (CD₃OD, 400 МГц) δ 8,39 (д, J=2,4 Гц, 1H), 7,96 (дд, J=8,4, 2,4 Гц, 1H), 7,66 (д, J=8,4 Гц, 1H), 3,96 (с, 3H), 3,07 (с, 3H).

Получение 2-хлор-5-(метилсульфонил)бензойной кислоты (65)

[501] К раствору соединения 64 (2,5 г, 1,327 ммоль, 1,0 экв.) в MeOH/ТГФ =1/1 (6 мл) добавляли 5% водный раствор LiOH (63,6 мг, 2,654 ммоль, 2,0 экв.) по каплям при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при к. т. в течение 2 ч. pH реакционной смеси регулировали до=3-4 с помощью 1 н. HCl, концентрировали. Водный слой экстрагировали с помощью EtOAc (20 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 65 (2,1 г, неочищенное) в виде светло-желтого твердого вещества.

[502] ТСХ: PE/EA =3:1, УФ, R_f (соединение 64)=0,45, R_f (соединение 65)=0,05.

[503] ¹ H ЯМР (CD₃OD, 400 МГц) δ 8,36 (д, J=2,3 Гц, 1H), 8,02 (дд, J=8,4, 2,3 Гц, 1H), 7,76 (д, J=8,4 Гц, 1H), 3,15 (с, 3H).

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-2-хлор-5-(метилсульфонил)бензамида (66)

[504] Суспензию соединения 65 (879 мг, 3,74 ммоль, 1,0 экв.), соединения 22 (900 мг, 4,12 ммоль, 1,1 экв.), HATU (1,85 г, 4,87 ммоль, 1,3 экв.) и TEA (1,14 г, 11,24 моль, 3,0 экв.) в DMF (8 мл) перемешивали при к. т. в течение 16 ч. В реакционную смесь добавляли воду (20 мл) и экстрагировали этилацетатом (30 мл x 3), промывали с помощью водного раствора NaCl (50 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 100/1 до 10/1, до 5/1, до 2/1, до 1/1) с получением соединения 66 (995 мг, 61%) в виде бесцветного масла.

[505] ТСХ: PE/EA =0:1, УФ, R_f (соединение 65)=0,25, R_f (соединение 66)=0,55.

[506] ¹ H ЯМР (CD₃OD, 400 МГц) δ 8,04-7,96 (м, 2H), 7,73 (д, J=8,3 Гц, 1H), 3,70-3,53 (м, 14H), 3,33 (с, 2H), 3,15 (с, 3H).

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-2-хлор-5-((2-гидрокси-5-метоксипентил)сульфонил)бензамида (67)

[507] К раствору соединения 66 (700 мг, 1,609 ммоль, 1,0 экв.) и 4-метоксибутаналя

[508] (657 мг, 6,44 ммоль, 4,0 экв.) в ТГФ (7 мл) добавляли KHMDS (5,4 мл, 5,315 ммоль, 1,5 экв.) по каплям при -78°C. Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили водным раствором NH₄Cl при 0°C, экстрагировали этилацетатом (30 мл x 3), промывали с помощью водного раствора NaCl (100 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (PE/EA=от 20/1 до 5/1 до 2/1) с получением соединения 67 (205 мг, 25%) в виде светло-желтого масла.

[509] ТСХ: PE/EA =0:1, УФ, R_f (соединение 66)=0,55, R_f (соединение 67)=0,50.

[510] ¹ H ЯМР (CD₃OD, 400 МГц) δ 8,01-7,92 (м, 2H), 7,71 (д, J=8,4 Гц, 1H), 4,16-4,01 (м, 2H), 3,72-3,53 (м, 12H), 3,42-3,35 (м, 3H), 3,31-3,25 (м, 5H), 1,73-1,39 (м, 4H).

Получение 1-((3-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-4-хлорфенил)сульфонил)-5-метоксипентан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (68)

[511] К раствору соединения 67 (200 мг, 0,372 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (2 мл) добавляли пиридин (117,5 мг, 1,49 ммоль, 4,0 экв.) и трифосген (221 мг, 0,744 ммоль, 2,0 экв.) порциями при 0°C. Смесь перемешивали при к. т. в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в ТГФ (3 мл). В смесь добавляли пиридин (117,5 мг, 1,49 ммоль, 4,0 экв.) и HOSU (128 мг, 1,12 ммоль, 3,0 экв.) порциями при 0°C. Смесь перемешивали при к. т. в течение 1 ч. Реакционную смесь гасили водой при 0°C, экстрагировали этилацетатом (20 мл x 3), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (0,1% HCOOH) и экстрагировали этилацетатом, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 68 (101 мг, 27%) в виде светло-желтого масла.

[512] ТСХ: PE/EA=0/1, УФ, R_f (соединение 67)=0,50, R_f (соединение 68)=0,55.

[513] ЖХ-МС: 678,25 [M+1]⁺.

[514] ¹ H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,09 (с, 1H), 7,94-7,86 (м, 1H), 7,64 (д, J=8,4 Гц, 1H), 7,00 (с, 1H), 5,29 (с, 1H), 3,74-3,52 (м, 15H), 3,44-3,31 (м, 5H), 3,28 (с, 3H), 2,82 (с, 4H), 1,87 (д, J=7,4 Гц, 2H), 1,61 (с, 2H).

Пример 31

7-((3-(2,7-бис((2-(2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-карбазол-9-ил)пропил)амино)-7-оксо-1-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (82)

Получение трет-бутил-6-гидроксигексаноата (70)

[515] Смесь соединения 69 (100 г, 876 ммоль) и t-BuOK (108 г, 964 ммоль) в t-BuOH (600 мл) дегазировали и продували с помощью N₂ 3 раза, и затем смесь перемешивали при 120°C в течение 2,5 ч. в атмосфере N₂. ТСХ (планшет 1, дихлорметан/метанол=10/1, соединение 69, R_f=0,60, соединение 70 R_f=0,50) указывала на то, что соединение 69 было полностью поглощено и образовывалась одна новая точка. Согласно ТСХ, реакция была селективной. Реакционную смесь разделяли между дихлорметан (600 мл) и водой (1,20 л). Органическую фазу отделяли, промывали солевым раствором (300 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка с получением соединения 70 (127 г, выход 77,2%) в виде желтого масла и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

[516] ¹ H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д. 3,66-3,63 (м, 2H), 2,25-2,21 (м, 2H), 1,66-1,57 (м, 5H), 1,44 (с, 9H), 1,40-1,39 (м, 2H).

Получение трет-бутил-6-оксогексаноата (71)

[517] К раствору соединения 70 (64,0 г, 340 ммоль) в ДХМ (400 мл) добавляли реагент Десса-Мартина (159 г, 374 ммоль, 116 мл). Смесь перемешивали при 20°C в течение 2 ч. ТСХ (планшет 1, петролейный эфир/этилацетат=1/1, соединение 70 R_f=0,40, соединение 71 R_f=0,50) указывала на то, что соединение 70 было полностью поглощено. Реакционную смесь гасили добавлением водного раствора NaHCO₃ (200 мл) и экстрагировали с помощью ДХМ (100 мл x 3). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (100 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат=от 10/1 до 1/1, планшет 2, петролейный эфир/этилацетат=1/1, соединение 71 R_f=0,50) с получением соединения 71 (26,8 г, выход 42,3%) в виде желтого масла.

[518] ¹ H ЯМР: ( 400 МГц CDCl₃) δ м.д. 2,44-2,21 (м, 4H), 1,65-1,60 (м, 4H), 1,43 (с, 9H).

Получение трет-бутил-6-гидрокси-7-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептаноата (72)

[519] К раствору соединения 11 (7,15 г, 31,9 ммоль) в ТГФ (30,0 мл) добавляли по каплям n-BuLi (2,5 M, 11,60 мл), смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин. Затем раствор соединения 71 (5,40 г, 29,0 ммоль) в ТГФ (5,00 мл) добавляли при -78°C. Смесь перемешивали при -78°C в течение 1,5 ч. ТСХ (планшет 1, петролейный эфир/этилацетат=1/1, соединение 71 R_f=0,70, соединение 72 R_f=0,40) указывала на то, что соединение 71 было полностью поглощено. Реакционную смесь гасили добавлением водного раствора NH₄Cl (50,0 мл) и затем экстрагировали с помощью EtOAc (20,0 мл x 3). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (30,0 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат=от 30/1 до 1/1, планшет 2, петролейный эфир/этилацетат=1/1, соединение 72 R_f=0,40) с получением соединения 72 (8,57 г, выход 72,0%) в виде желтого твердого вещества.

[520] ¹ H ЯМР: (400 МГц CDCl₃) δ м.д. 8,10-8,08 (д, J=8,4Гц, 2H), 7,88-7,86 (д, J=8Гц, 2H), 4,21-4,20 (м, 1H), 3,31-3,16 (м, 3H), 2,23-2,18 (м, 2H), 1,61-1,35 (м, 15H).

Получение 6-гидрокси-7-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептанoвой кислоты (73)

[521] Соединение 72 (1,00 г, 2,44 ммоль) переносили в пробирке для микроволновой обработки в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле (15,0 мл). Герметичную пробирку нагревали при 110°C в течение 1 ч. в атмосфере микроволнового излучения. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=1/1, соединение 72: R_f=0,5, соединение 73: R_f=0,2) указывала на то, что соединение 72 было полностью поглощено. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт использовали непосредственно для следующей стадии без очистки с получением соединения 73 (0,860 г, 2,43 ммоль, выход 99,6%) в виде желтой смолы.

[522] ¹ H ЯМР: (400 МГц ДМСО) δ м.д. 11,93 (с, 1H), 8,00-8,13 (м, 4H), 5,11-5,17 (м, 1H), 4,85 (д, J=5,2 Гц, 1H), 3,90 (с, 1H), 3,43-3,48 (м, 2H), 2,16 (т, J=8,0 Гц, 2H), 1,33-1,46 (м, 6H).

Получение диметил-2-нитро-[1,1’-бифенил]-4,4’-дикарбоксилата (75)

[523] Раствор соединения 74 (33,0 г, 122 ммоль) в H₂SO₄ (330 мл) охлаждали до -5°C, и смесь HNO₃ (13,8 г, 127 ммоль, 9,85 мл, чистота 58%) и H₂SO₄ (22,8 г, 232 ммоль, 12,4 мл) добавляли по каплям в течение периода 1 ч. с перемешиванием, поддерживая температуру при -5-0 °C. Смесь затем перемешивали в течение 1 ч. при -5-0 °C. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=3/1, продукт R_f=0,50) показывала поглощение соединения 74 (R_f=0,60), образование основной новой точки с большей полярностью. Смесь разбавляли водой (300 мл) и экстрагировали этилацетатом (50,0 мл x 2). Экстракт промывали солевым раствором (50,0 мл) и раствором гидрокарбоната натрия (100 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и выпаривали. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат=от 50/1 до 0/1) с получением соединения 75 (16,0 г, 50,6 ммоль, выход 41,4%, чистота 99,6%) в виде белого твердого вещества.

[524] ¹ H ЯМР: (400 МГц, CDCl₃) δ 8,57 (с, 1H), 8,31-8,29 (д, J=8,0 Гц, 1H), 8,14-8,12 (д, J=8,4 Гц, 2H), 7,56-7,54 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,42-7,40 (д, J=8,4 Гц, 2H), 4,01 (с, 3H), 3,96 (с, 3H).

Получение диметил-9H-карбазол-2,7-дикарбоксилата (76)

[525] Смесь соединения 75 (20 г, 63,4 ммоль), PPh₃ (41,6 г, 159 ммоль) в 1,2-дихлорбензоле (112 мл) дегазировали при 25°C и продували с помощью N₂ 3 раза, и затем смесь перемешивали при 210°C в течение 1,5 ч. в атмосфере N₂. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=1/1, соединение 75: R_f=0,43) показывала, что соединение 75 было полностью поглощено и образовалась одна новая основная точка. Реакционная смесь была прозрачной согласно ТСХ. Реакционную смесь охлаждали до 25°C, метанол (200 мл) добавляли. Через 15 мин полученную суспензию твердых вещества собирали фильтрацией с получением соединения 76 (12,0 г, 42,4 ммоль, выход 66,8%) в виде серого твердого вещества.

[526] ¹ H ЯМР: (400 МГц, ДМСО)δ 11,81 (с, 1H), 8,33 (д, J=4,2 Гц, 2H), 8,17 (с, 2H), 7,82 (д, J=7,6 Гц, 2H), 3,91 (с, 6H).

Получение диметил-9-(3-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропил)-9H-карбазол-2,7-дикарбоксилата (77)

[527] К раствору NaH (2,30 г, 57,6 ммоль, чистота 60%) в DMF (80,0 мл) добавляли соединение 76 (13,6 г, 48,0 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. и затем трет-бутил-N-(3-бромпропил)карбамат (22,9 г, 96,0 ммоль) добавляли, смесь перемешивали при 40°C в течение 3 ч. ТСХ (петролейный эфир/этилацетат=5/1, соединение 76: R_f=0,2, продукт: R_f=0,7) указывала на то, что соединение 76 было полностью поглощено. Реакционную смесь разбавляли водным раствором NH₄Cl (100 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (150 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (100 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (SiO₂, петролейный эфир/этилацетат=от 10/1 до 1/1) с получением соединения 77 (16,4 г, 37,2 ммоль, выход 77,6%) в виде желтого твердого вещества.

[528] ¹ H ЯМР: (400 МГц, ДМСО) δ 8,36 (д, J=8,4 Гц, 2H), 8,31 (с, 2H), 7,80 (д, J=8,4 Гц, 2H), 7,03 (т, J=4,8 Гц, 1H), 4,56 (т, J=6,4 Гц, 2H), 3,74 (с, 6H), 2,99-3,00 (м, 2H), 1,87-1,98 (м, 2H), 1,22-1,36 (м, 9H).

Получение 9-(3-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропил)-9H-карбазол-2,7-дикарбоновой кислоты (78)

[529] Смесь соединения 77 (8,00 г, 18,2 ммоль) и NaOH (2,18 г, 54,5 ммоль) в ТГФ (30,0 мл), MeOH (30,0 мл) и H₂O (10,0 мл) дегазировали и продували с помощью N₂ 3 раза, и затем смесь перемешивали при 80°C в течение 12 ч. в атмосфере N₂. ТСХ (дихлорметан/метанол=10/1, соединение 77: R_f=0,8) указывала на то, что соединение 77 было полностью поглощено. Реакционную смесь выливали в 100 мл ледяной воды осторожно и разбавляли с помощью 1 н. HCl до pH=4, реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали с помощью 20,0 мл воды, сушили в вакууме. Неочищенный продукт использовали непосредственно для следующей стадии без дополнительной очистки с получением соединения 78 (5,00 г, 12,1 ммоль, выход 66,8%) в виде светло-желтого твердого вещества.

[530] ¹ H ЯМР: (400 МГц, CDCl₃) δ 13,01 (с, 2H), 8,34 (д, J=8,0 Гц, 2H), 8,25 (с, 2H), 7,85 (к, J=8,0 Гц, 2H), 4,56 (т, J=6,4 Гц, 2H), 2,97-3,00 (м, 2H), 1,89-1,99 (м, 2H), 1,37 (м, 8H).

Получение трет-бутил-(3-(2,7-бис((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-карбазол-9-ил)пропил)карбамата (79)

[531] К раствору соединения 78 (5,00 г, 12,1 ммоль) в DMF (50,0 мл) добавляли HATU (11,5 г, 30,3 ммоль) и DIPEA (6,27 г, 48,5 ммоль) и 2-[2-[2-(2-азидоэтокси)этокси]этокси]этанамин (5,29 г, 24,3 ммоль). Смесь перемешивали при 15°C в течение 3 ч. ЖХ-МС демонстрировала один новый пик (соединение 79: Rt=0,752 мин) с необходимой обнаруженной МС. Реакционную смесь разбавляли водой (90,0 мл) и экстрагировали с помощью 2-Me-ТГФ (50,0 мл x 2). Объединенные органические слои промывали водой (50,0 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт очищали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ (условие 0,1% NH₄HCO₃) с получением соединения 79 (4,00 г, 4,92 ммоль, выход 40,6%) в виде белого твердого вещества.

[532] ¹ H ЯМР: (400 МГц, ДМСО) δ 8,68 (т, J=5,2 Гц, 2H), 8,31 (д, J=8,4 Гц, 2H), 8,19 (с, 2H), 7,79 (д, J=8,4 Гц, 2H), 7,03 (т, J=4,8 Гц, 2H), 4,53 (т, J=7,2 Гц, 2H), 3,54-3,65 (м, 26H), 3,40-3,41 (м, 4H), 3,38-3,40 (м, 2H), 3,03-3,05 (м, 2H), 1,99-2,02 (м, 2H), 1,40 (с, 9H).

Получение 9-(3-аминопропил)-N2,N7-бис(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-9H-карбазол-2,7-дикарбоксамида (80)

[533] К раствору соединения 79 (3,00 г, 3,69 ммоль) в ДХМ (25,0 мл) добавляли HCl/MeOH (5,00 мл). Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. ТСХ (дихлорметан/метанол=10/1, соединение 79: R_f=0,6, соединение 80: R_f=0,05) указывала на то, что соединение 79 было полностью поглощено. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Неочищенный продукт использовали непосредственно для следующей стадии без дополнительной очистки с получением соединения 80 (2,70 г, 3,60 ммоль, выход 97,7%, соль HCl) в виде желтого твердого вещества.

[534] ¹ H ЯМР: (400 МГц, ДМСО) δ 8,78 (т, J=5,6 Гц, 2H), 8,36 (с, 2H), 8,27 (д, J=8,0 Гц, 2H), 8,05 (с, 3H), 7,77 (д, J=8,4 Гц, 2H), 4,63 (т, J=6,8 Гц, 2H), 3,65-3,60 (м, 17H), 3,50-3,56 (м, 5H), 3,36-3,37 (м, 5H), 2,88-2,91 (м, 2H), 2,14-2,18 (м, 2H).

Получение N2,N7-бис(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-9-(3-(6-гидрокси-7-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептанамидо)пропил)-9H-карбазол-2,7-дикарбоксамида (81)

[535] Смесь соединения 80 (1,80 г, 2,40 ммоль, HCl), соединения 73 (851 мг, 2,40 ммоль), HOBt (487 мг, 3,60 ммоль), EDCI (691 мг, 3,60 ммоль) и Et₃N (2,19 г, 21,6 ммоль) в ДХМ (15,0 мл) дегазировали и продували с помощью N₂ 3 раза, и затем смесь перемешивали при 25°C в течение 2 ч. в атмосфере N₂. ЖХ-МС демонстрировала один новый пик (соединение 81: Rt=1,21 мин) с необходимой обнаруженной МС. Реакционную смесь разбавляли водой (30,0 мл) и экстрагировали с помощью EtOAc (20,0 мл x 3). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (30,0 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (колонка: Xtimate C18 10 мкм, 250 мм x 80 мм; подвижная фаза: [вода (10 мМ NH₄HCO₃) - ACN]; B%: 35% - 65%, 21 мин) с получением соединения 81 (1,00 г, 953 мкмоль, выход 39,7%) в виде светло-желтого твердого вещества.

[536] ¹ H ЯМР: (400 МГц, ДМСО) δ 8,71 (т, J=5,6 Гц, 2H), 8,33 (д, J=8,4 Гц, 2H), 8,20 (с, 2H), 8,16 (д, J=8,0 Гц, 2H), 8,05 (д, J=8,4 Гц, 2H), 7,92-7,93 (м, 1H), 7,81 (д, J=8,4 Гц, 2H), 4,89 (д, J=7,0 Гц, 1H), 4,55 (т, J=7,2 Гц, 2H), 3,93 (с, 1H), 3,56-3,67 (м, 30H), 3,40-3,42 (м, 5H), 3,15-3,16 (м, 2H), 2,01-2,11 (м, 4H), 1,27-1,51 (м, 7H).

Получение 7-((3-(2,7-бис((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)-9H-карбазол-9-ил)пропил)амино)-7-оксо-1-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (82)

[537] К раствору соединения 81 (500 мг, 477 мкмоль) и N, N’-дисукцинимидилкарбоната (977 мг, 3,81 ммоль) в ACN (6,00 мл) добавляли пиридин (188 мг, 2,38 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали при 15°C в течение 1 ч. ЖХ-МС демонстрировала один новый пик (продукт: Rt=2,26 мин) с необходимой обнаруженной МС. Реакционную смесь разбавляли водой (20,0 мл) и экстрагировали с помощью ДХМ (10,0 мл x 5). Объединенные органические слои промывали водой (20,0 мл), сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ (колонка: Phenomenex luna C18 250×50 мм x 10 мкм; подвижная фаза: [вода (0,04% HCl) -ACN]; B% : 50% - 70%, 10 мин) с получением 82 (0,102 г, 79,4 мкмоль, выход 16,7%, чистота 92,7%) в виде желтого твердого вещества.

[538] ¹ H ЯМР: (400 МГц, ДМСО) δ 8,6 (т, J=5,6 Гц, 2H), 8,26 (д, J=8,0 Гц, 2H), 8,13-8,17 (м,4H), 8,01-8,11 (м, 3H), 7,96 (д, J=5,6 Гц, 2H), 5,16-5,18 (м, 1H), 4,49 (т, J=6,4 Гц, 2H), 3,91-4,12 (м, 13H), 3,55-3,59 (м, 14H), 4,49-4,53 (м, 4H), 3,34-3,36 (м, 4H), 3,09-3,10 (м, 2H), 2,79 (с, 4H), 1,97-2,06 (м, 4H), 1,61-1,68 (м, 2H), 1,42-1,44 (м, 2H), 1,23-1,25 (м, 2H).

[539] ВЭЖХ: время удержания: 2,632 мин, процент площади: 92,0%.

[540] ЖХМС: время удержания: 2,630 мин, M+H⁺=1190,4.

Пример 32

7-Азидо-1-((3-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)карбамоил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (86)

Получение N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-3-(метилсульфонил)бензамида (84)

[541] К раствору соединения 83 (2,0 г, 10 ммоль, 1,0 экв.) и соединения 22 (2,18 г, 10 ммоль, 1,0 экв.) в диметилформамиде (40 мл) добавляли 2-(7-аза-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (4,56 г, 12 ммоль, 1,2 экв.) и N, N-диизопропилэтиламин (2,0 г, 20 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию отслеживали посредством ЖХМС и ТСХ. Смесь разбавляли водой (50 мл), экстрагировали этилацетатом (5×150 мл) и промывали солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (дихлорметан: метанол, 97:3) с получением соединения 84 (2,5 г, 63%).

[542] ТСХ: дихлорметан: метанол=10: 1, УФ 254 нм, с помощью I_2, R _f : ( соединение 83 )=0,3; R _f : ( соединение 84 )=0,5.

Получение 3-((7-азидо-2-гидроксигептил)сульфонил)-N-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)бензамида (85)

[543] К раствору соединения 84 (2,0 г, 5,0 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли раствор калия бис(триметилсилил)амида (1,0 M, 15 мл, 15 ммоль, 3,0 экв.) медленно при -78°C. Затем соединение 3 (2,1 г, 15 ммоль, 3,0 экв.) добавляли к смеси. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакцию отслеживали посредством ТСХ. Затем смесь гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония (30 мл), экстрагировали этилацетатом (2×30 мл). Органические слои промывали солевым раствором (20 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (дихлорметан: метанол, 97:3) с получением соединения 85 (400 мг, 15%).

[544] ТСХ: дихлорметан: метанол=10: 1, УФ 254 нм, R _f : ( соединение 84 )=0,5; R _f : ( соединение 85 )=0,5.

Получение 7-азидо-1-((3-((2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-этокси)этил)карбамоил)фенил)сульфонил)гептан-2-ил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (86)

[545] К смеси соединения 85 (400 мг, 0,74 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (4 мл) добавляли трифосген (372 мг, 1,25 ммоль, 1,7 экв.) и пиридин (117 мг, 1,48 ммоль, 2,0 экв.). После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь фильтровали. К фильтрату добавляли пиридин (117 мг, 1,48 ммоль, 2,0 экв.) и N-гидроксисукцинимид (176 мг, 0,89 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакцию отслеживали посредством ЖХМС. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×5 мл) и промывали солевым раствором (5 мл). Затем органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 86 (270 мг, 54%) в виде бесцветного масла.

[546] ЖХМС: [M+1]⁺=683.

[547] ¹ H ЯМР (400 МГц, CD ₃ OD): δ 8,32 (с, 1H), 8,17 (д, J=8,0 Гц, 1H), 8,04 (д, J=7,6 Гц, 1H), 7,68 (т, J=7,6 Гц, 1H), 7,29 (с, 1H), 5,25 (с, 1H), 3,59-3,66 (м, 16H), 3,37-3,32 (м, 2H), 3,25 (т, J=6,8 Гц, 2H), 2,81 (с, 4H), 1,79 (с, 2H), 1,57 (с, 2H), 1,39 (с, 4H).

Пример 33

1-Азидо-12-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-13-оксо-19-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)-3,6,9-триокса-12-азанонадекан-18-ил-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (89)

[548] Получение N, N-бис(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-6-гидрокси-7-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)гептанамида (88)

[549] К раствору соединения 73 (102 мг, 0,3 ммоль, 1,2 экв.) в диметилформамиде (3 мл) добавляли 2-(7-аза-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (136 мг, 0,76 ммоль, 1,5 экв.) и N, N-диизопропилэтиламин (124 мг, 0,96 ммоль, 4,0 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем в смесь добавляли соединение 87 (100 мг, 0,24 ммоль, 1,0 экв.) и перемешивали в течение 2 ч. Реакцию отслеживали посредством ЖХМС и ТСХ. Смесь разбавляли водой (10 мл), экстрагировали этилацетатом (5×10 мл) и промывали солевым раствором (10 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле (дихлорметан: метанол, 98:2) с получением соединения 88 (50 мг, 28%).

[550] ТСХ: дихлорметан: метанол=10: 1, УФ 254 нм, с помощью I_2, R _f : ( соединение 87 )=0,5; R _f : ( соединение 88 )=0,4.

Получение 1-азидо-12-(2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этил)-13-оксо-19-((4-(трифторметил)фенил)сульфонил)-3,6,9-триокса-12-азанонадекан-18-ил-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (89)

[551] К смеси соединения 88 (400 мг, 0,53 ммоль, 1,0 экв.) в тетрагидрофуране (4 мл) добавляли трифосген (267 мг, 0,9 ммоль, 1,7 экв.) и пиридин (84 мг, 1,06 ммоль, 2,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. Реакционную смесь фильтровали. К фильтрату добавляли пиридин (84 мг, 1,06 ммоль, 2,0 экв.) и N-гидроксисукцинимид (73 мг, 0,64 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакцию отслеживали посредством ЖХМС. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×5 мл) и промывали солевым раствором (5 мл). Затем смесь сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 89 (85 мг, 18%) в виде желтого масла.

[552] ЖХМС: [M+1]⁺=897.

[553] ¹ H ЯМР (400 МГц, CD ₃ OD): δ 8,15-8,13 (д, J=8,0 Гц, 2H), 7,96-7,94 (д, J=8,8 Гц, 2H), 5,27 (м, 1H), 3,89 (м, 1H), 3,73 (м, 1H), 3,59-3,61 (м, 26H), 3,35 (м, 6H), 2,81 (с, 4H), 3,46-3,42 (м, 2H), 1,79-1,77 (м, 2H), 1,58 (м, 2H) и 1,39-1,37 (м, 2H).

Пример 34

15 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[554] В высушенную круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием, добавляли 15 kDa Y-PEG-NHS (1,13 г, 74,9 мкмоль, 1,0 экв.) и PyClocK (0,082 г, 148 мкмоль, 2,0 экв.). Колбу закрывали резиновой пробкой и помещали в инертную атмосферу аргона. Безводный CH₂Cl₂ (18 мл) добавляли, затем N-метилморфолин (18 мкл, 164 мкмоль, 2,2 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. DBCO-амин (52 мг, 188 мкмоль, 2,5 экв.) добавляли одной порцией в виде раствора в CH₂Cl₂ (2 мл) с N-метилморфолином (18 мкл, 164 мкмоль, 2,2 экв.) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 5 ч. Неочищенную реакционную смесь концентрировали в вакууме и затем обрабатывали горячим 2-пропанолом (120 мл). Полученный раствор охлаждали на ледяной бане с образованием осадка. Выделенный осадок переносили в предварительно взвешенные пробирки Falcon (×3) и осадок осаждали центрифугированием (12000 об/мин, 30 мин, -3°С). Осаждение повторяли один раз 2-пропанолом (120 мл) и три раза ацетоном (3×120 мл). Гранулы сушили in vacuo. Выделенное белое твердое вещество, масса=995 мг (88%).Время удержания ОФ-ВЭЖХ=6,9 мин.

Пример 35

17 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[555] В высушенную круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой с тефлоновым покрытием, добавляли 17 кДа Y-PEG-NHS (1,0 г, 57,2 мкмоль, 1,0 экв.) и CH₂Cl₂ (18,0 мл). Колбу закрывали резиновой пробкой и помещали в инертную атмосферу аргона. DBCO-амин (40 мг, 145 мкмоль, 2,5 экв.), затем N-метилморфолин (19 мкл, 173 мкмоль, 3,0 экв.) добавляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Неочищенную реакционную смесь концентрировали в вакууме и затем обрабатывали горячим ацетоном (90 мл). Полученный раствор охлаждали на бане со льдом в течение 30 мин с образованием осадка, который осаждали центрифугированием (11000 об/мин, 30 мин, -8°С). Растворитель сливали и повторяли процесс осаждения один раз 2-пропанолом (90 мл) и два раза ацетоном (2×90 мл). Полученное твердое вещество сушили in vacuo. Выделенное белое твердое вещество, масса=910 мг (91%). Время удержания ОФ-ВЭЖХ=6,7 мин.

Пример 36

7,5 кДа ПЭГ-DBCO

[556] Реагент ПЭГ-DBCO 7,5 кДа был приобретен у JenKem Technology USA. ВЭЖХ: чистота 98,0%; GPC: чистота 99,1%; MALDI: 7481 Да.

ПРИМЕР 37

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 2 и клик-пегилирование с помощью 15 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[557] Соединение из примера 2 (3,2 мг) растворяли в DMF (439 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 7,29 мг/мл. IL-2 (8,0 мг, 0,523 мкмоль, 2,76 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (841 мкл) и соединение из примера 2 (2,92 мг, 5,77 мкмоль, 400 мкл, 11 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[558] 15 кДа Y-PEG-DBCO (125 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (500 мкл) с получением раствора с концентрацией 250 мг/мл. К [rIL-2]-[CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z (7,6 мг, 0,497 мкмоль, 3,80 мл) добавляли 15 кДа Y-PEG-DBCO (114 мг, 7,47 мкмоль, 455 мкл, 15 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[559] Соединение из примера 37 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [15K мПЭГ-(CF₃-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (5,55 мг, выход 73%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 6,7.

ПРИМЕР 38

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 3 и клик-пегилирование с помощью 15 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[560] Соединение из примера 3 (3,0 мг) растворяли в DMF (607 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 4,94 мг/мл. IL-2 (8,0 мг, 0,523 мкмоль, 2,67 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (933 мкл) и соединение из примера 3 (1,98 мг, 4,19 мкмоль, 400 мкл, 8 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[561] 15 кДа Y-PEG-DBCO (150 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,00 мл) с получением раствора с концентрацией 150 мг/мл. К [rIL-2]-[Cl-Ph-SO₂-N₃]_z (7,7 мг, 0,503 мкмоль, 3,65 мл) добавляли 15 кДа Y-PEG-DBCO (138 мг, 9,06 мкмоль, 921 мкл, 18 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[562] Соединение из примера 38 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [15K мПЭГ-(Cl-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (6,39 мг, выход 83%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5,4.

ПРИМЕР 39

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 4 и клик-пегилирование с помощью 15 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[563] Соединение из примера 4 (4,0 мг) растворяли в DMF (269 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 14,9 мг/мл. В сосуд с IL-2 (8 мг, 0,523 мкмоль, 4,00 мл) добавляли соединение из примера 4 (2,98 мг, 6,28 мкмоль, 200 мкл, 12 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[564] 15 кДа Y-PEG-DBCO (125 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (833 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 150 мг/мл. К [rIL-2]-[F,F-Ph-SO₂-N₃]_z (8,0 мг, 0,523 мкмоль, 4,20 мл) добавляли 15 кДа Y-PEG-DBCO (120 мг, 7,87 мкмоль, 798 мкл, 15 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[565] Соединение из примера 39 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [15K мПЭГ-(F, F-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (7,26 мг, выход 91%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5,9.

ПРИМЕР 40

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 5 и клик-пегилирование с помощью 15 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[566] Соединение из примера 5 (4,5 мг) растворяли в DMF (438 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 10,3 мг/мл. IL-2 (7 мг, 0,458 мкмоль, 2,33 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (817 мкл) и соединение из примера 5 (3,61 мг, 6,88 мкмоль, 350 мкл, 15 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[567] 15 кДа Y-PEG-DBCO (120 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (800 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 150 мг/мл. К [rIL-2]-[F, CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z (7,0 мг, 0,458 мкмоль, 3,50 мл) добавляли 15 кДа Y-PEG-DBCO (105 мг, 6,88 мкмоль, 698 мкл, 15 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[568] Соединение из примера 40 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [15K мПЭГ-(F, CF₃-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (6,73 мг, выход 96%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5,9.

ПРИМЕР 41

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 30 и клик-пегилирование с помощью 15 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[569] Соединение из примера 30 (101 мг) растворяли в DMF (2,02 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 50 мг/мл. В сосуд с IL-2 (12 мг, 0,784 мкмоль, 4,88 мл) добавляли соединение из примера 30 (21,3 мг, 31,4 мкмоль, 425 мкл, 40 экв.) и DMF (28,3 мкл). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакцию анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[570] 15 кДа Y-PEG-DBCO (578 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (2,09 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 277 мг/мл. К [rIL-2]-[Cl, CONH-Ph-SO₂-N₃]_z (11,6 мг, 0,758 мкмоль, 5,16 мл) добавляли 15 кДа Y-PEG-DBCO (578 мг, 37,89 мкмоль, 2,09 мл, 50 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22°С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[571] Соединение из примера 41 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [15K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (5,37 мг, выход 46%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5,4.

ПРИМЕР 42

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 31 и клик-пегилирование с помощью 7,5 кДа ПЭГ-DBCO

[572] Соединение из примера 31 (50 мг) растворяли в DMF (1,00 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 50 мг/мл. IL-2 (12 мг, 0,784 мкмоль, 4,8 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (0,6 мл) и соединение из примера 31 (14 мг, 11,8 мкмоль, 280 мкл, 15 экв.) и DMF (320 мкл) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2.

[573] 7,5 кДа ПЭГ-DBCO (250 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,67 мл) с получением раствора с концентрацией 150 мг/мл. К [rIL-2]-[CF₃-Ph-Ar-SO₂-N₃]_z (12 мг, 0,784 мкмоль, 6,0 мл) добавляли 7,5 кДа ПЭГ-DBCO (206 мг, 27,5 мкмоль, 1,37 мкл, 35 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF). Соединение из примера 42 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [2×7,5K мПЭГ-(CF₃-Ph-Ar-SO₂)]_z-[rIL-2] (10 мг, выход 84%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5-7.

ПРИМЕР 43

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 32 и клик-пегилирование с помощью 7,5 кДа ПЭГ-DBCO

[574] Соединение из примера 32 (99 мг) растворяли в DMF (1,98 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 50 мг/мл. IL-2 (12 мг, 0,784 мкмоль, 4,0 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,40 мл) и соединение из примера 32 (9,1 мг, 13,4 мкмоль, 181 мкл, 17 экв.) и DMF (419 мкл) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2.

[575] 7,5 кДа ПЭГ-DBCO (250 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,67 мл) с получением раствора с концентрацией 150 мг/мл. К [rIL-2]-[CONH-Ph-R-SO₂-N₃]_z (11,8 мг, 0,771 мкмоль, 5,9 мл) добавляли 7,5 кДа ПЭГ-DBCO (231 мг, 30,9 мкмоль, 1,54 мл, 40 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF). Соединение из примера 43 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [2×7,5K мПЭГ-(CONH-Ph-R-SO₂)]_z-[rIL-2] (10,23 мг, выход 87%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5-7.

ПРИМЕР 44

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 33 и клик-пегилирование с помощью 7,5 кДа ПЭГ-DBCO

[576] Соединение из примера 33 (11,3 мг) растворяли в DMF (0,226 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 50 мг/мл. IL-2 (10,8 мг, 0,706 мкмоль, 3,60 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 8, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,26 мл) и соединение из примера 33 (9,50 мг, 10,6 мкмоль, 190 мкл, 15 экв.) и DMF (0,35 мл) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Через 1 час реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения распределения функционализированных видов IL-2.

[577] 7,5 кДа ПЭГ-DBCO (240 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 8 (1,60 мл) с получением раствора с концентрацией 150 мг/мл. К [rIL-2]-[CF₃-Ph-R-SO₂-N₃]_z (10,5 мг, 0,686 мкмоль, 3,85 мл) добавляли 7,5 кДа ПЭГ-DBCO (205 мг, 27,4 мкмоль, 1,37 мл, 40 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 2 часа, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF). Соединение из примера 44 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [2×7,5K мПЭГ-(CF₃-Ph-R-SO₂)]_z-[rIL-2] (10,45 мг, выход 99%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 5,6.

ПРИМЕР 45

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 2 и клик-пегилирование с помощью 17 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[578] Соединение из примера 2 (5,0 мг) растворяли в DMF (687 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 7,28 мг/мл. IL-2 (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 4,14 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,26 мл) и соединение из примера 2 (4,37 мг, 8,63 мкмоль, 600 мкл, 11 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 15 мин. Через 15 минут реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2. В реакционную смесь добавляли дополнительное соединение из примера 2 (1,99 мг, 3,93 мкмоль, 273 мкл, 5 экв.) для повышения уровня функционализации. После еще 15-минутной инкубации при 22°C реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[579] 17 кДа Y-PEG-DBCO (302 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,21 мл) с получением раствора с концентрацией 250 мг/мл. К [rIL-2]-[CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 6,00 мл) добавляли 17 кДа Y-PEG-DBCO (277 мг, 15,7 мкмоль, 1,11 мкл, 20 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 15 мин, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

ПРИМЕР 46

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 3 и клик-пегилирование с помощью 17 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[580] Соединение из примера 3 (4,2 мг) растворяли в DMF (679 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 6,18 мг/мл. IL-2 (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 4,14 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,26 мл) и соединение из примера 3 (3,71 мг, 7,84 мкмоль, 600 мкл, 10 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 15 мин. Через 15 минут реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[581] 17 кДа Y-PEG-DBCO (185 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (740 мкл) с получением раствора с концентрацией 250 мг/мл. К [rIL-2]-[Cl-Ph-SO₂-N₃]_z (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 6,00 мл) добавляли 17 кДа Y-PEG-DBCO (173 мг, 9,80 мкмоль, 692 мкл, 12,5 экв.) и 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (165 мкл). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 15 мин, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[582] Соединение из примера 46 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [17K мПЭГ-(Cl-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (9,7 мг, выход 81%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 6,2.

ПРИМЕР 47

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 4 и клик-пегилирование с помощью 17 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[583] Соединение из примера 4 (6,0 мг) растворяли в DMF (645 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 9,30 мг/мл. IL-2 (10,5 мг, 0,686 мкмоль, 3,62 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,10 мл) и соединение из примера 4 (4,88 мг, 10,3 мкмоль, 525 мкл, 15 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 15 мин. Через 15 минут реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[584] 17 кДа Y-PEG-DBCO (260 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (1,04 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 250 мг/мл. К [rIL-2]-[F, F-Ph-SO₂-N₃]_z (10,5 мг, 0,686 мкмоль, 5,25 мл) добавляли 17 кДа Y-PEG-DBCO (242 мг, 13,7 мкмоль, 968 мкл, 20 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 15 мин, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[585] Соединение из примера 47 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [17K мПЭГ-(F, F-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (9,5 мг, выход 91%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 6,5.

ПРИМЕР 48

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 5 и клик-пегилирование с помощью 17 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[586] Соединение из примера 5 (6,6 мг) растворяли в DMF (600 мкл) с получением раствора реагента с концентрацией 11,0 мг/мл. IL-2 (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 4,49 мл) разбавляли 100 мМ бората натрия, рН 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (906 мкл) и соединение из примера 5 (6,20 мг, 11,8 мкмоль, 560 мкл, 15 экв.) добавляли. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 15 мин. Через 15 минут реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[587] 17 кДа Y-PEG-DBCO (235 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (0,94 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 250 мг/мл. К [rIL-2]-[F, CF₃-Ph-SO₂-N₃]_z (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 6,00 мл) добавляли 17 кДа Y-PEG-DBCO (228 мг, 12,9 мкмоль, 912 мкл, 16,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 15 мин, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[588] Соединение из примера 48 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [17K мПЭГ-(F, CF₃-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (9,4 мг, выход 78%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 7,3.

ПРИМЕР 49

Конъюгация NHS rIL-2 с соединением из примера 30 и клик-пегилирование с помощью 17 кДа Y-ПЭГ-DBCO

[589] Соединение из примера 30 (101 мг) растворяли в DMF (2,02 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 50 мг/мл, перед конъюгацией этот раствор разбавляли до концентрации 35,5 мг/мл с помощью DMF. IL-2 (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 4,49 мл) разбавляли с помощью 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (906 мкл) и добавляли соединение из примера 30 (21,3 мг, 31,4 мкмоль, 600 мкл, 40 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 15 мин. Через 15 минут реакционную смесь анализировали с помощью ЖХ-МС для определения средней степени функционализации IL-2.

[590] 17 кДа Y-PEG-DBCO (700 мг) растворяли в 100 мМ бората натрия, pH 9, 20 мМ ЭДТА, 0,05% SDS (2,80 мл) с получением раствора реагента с концентрацией 250 мг/мл. К [rIL-2]-[Cl, CONH-Ph-SO₂-N₃]_z (12,0 мг, 0,784 мкмоль, 6,00 мл) добавляли 17 кДа Y-PEG-DBCO (692 мг, 39,2 мкмоль, 2,77 мл, 50 экв.). Реакционную смесь перемешивали и инкубировали при 22 °С. Реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE через 15 мин, и неочищенную реакционную смесь очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 26/600 Superdex 200 пг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 3 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции концентрировали/заменяли буфером в 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) с помощью УФ/ДФ (Vivaspin20, 50 кДа MWCO PES) и, наконец, подвергали фильтрации стерилизацией (0,22 мкм PVDF).

[591] Соединение из примера 49 количественно определяли с помощью ИК с использованием прибора DirectDetect как [17K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO₂)]_z-[rIL-2] (9,3 мг, выход 77%). Анализ конъюгата с помощью SDS-PAGE показал соотношение ПЭГ: IL-2, равное 7,0.

ПРИМЕР 50

Пегилирование дисульфидной связи rIL-2 с помощью 20 кДа бис(сульфон) ПЭГ

[592] Перед конъюгацией в растворе IL-2 (10 мМ ацетата натрия, pH 4,5, 5% трегалозы) заменяли буфер с помощью гель-фильтрации с использованием колонок CentriPure P100, уравновешенных с помощью 100 мМ бората натрия, pH 8 (0,05% SDS), как в соответствии с инструкциями производителя. Белковый раствор с замененным буфером определяли количественно с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (1,34 мг/мл).

[593] IL-2 (12 мг, 8,96 мл) разбавляли до 9 мл с помощью 100 мМ бората натрия, pH 8 (0,05% SDS), и к этому раствору добавляли 0,1 М DTT (1,0 мл, 100 мкмоль, 127 экв.), получая конечную концентрацию IL-2 1,2 мг/мл. Полученную реакционную смесь восстановления осторожно перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Восстановленный IL-2 был заменен буфером на свежий 100 мМ борат натрия, pH 8 (0,05% SDS) с использованием колонки CentriPure P100 в соответствии с инструкциями производителя, и было определено количество восстановленного белка (10,5 мг в 21,08 мл реакционного буфера) посредством УФ-А280. Готовили раствор реагента TheraPEG™ 20 кДа (19,5 мг) в воде (3,59 мл). К восстановленному IL-2 (10,5 мг, 0,686 мкмоль, 21,08 мл), 100 мМ бората натрия, pH 8 (0,05% SDS) (17,71 мл) и раствору 5,44 мг/мл добавляли 20 кДа TheraPEG™ (3,37 мл, 0,892 мкмоль, 1,3 экв.), что дает конечную концентрацию IL-2 0,25 мг/мл. Реакционную смесь конъюгации осторожно перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 16 часов. Неочищенную реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE и аналитической SEC, а затем очищали с помощью препаративной SEC.

[594] Неочищенную реакционную смесь заменяли буфером на 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) и концентрировали с помощью УФ/ДФ (Vivapsin20, 5 кДа MWCO PES). SDS удаляли из образца пегилированного IL-2 с использованием спин-колонок для удаления детергента объемом 4 мл (Pierce®) в соответствии с инструкциями производителя. Пегилированный продукт IL-2 затем очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 16/600 Superdex 200 мкг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 2 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этого метода, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции фильтровали посредством стерилизации (0,22 мкм PVDF).

[595] Образец количественно определяли с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 и анализировали с помощью SEC и SDS-PAGE. Образец 50 был получен в виде 0,9 мг (выход 8%) в растворе. Чистота по SDS-PAGE: >99%. Чистота по аналитической SEC: 96,1%.

ПРИМЕР 51

Пегилирование дисульфидной связи rIL-2 с помощью 5 кДа бис(сульфон) ПЭГ

[596] Перед конъюгацией в растворе IL-2 (10 мМ ацетата натрия, pH 4,5, 5% трегалозы) заменяли буфер с помощью гель-фильтрации с использованием колонок CentriPure P100, уравновешенных с помощью 100 мМ бората натрия, pH 8 (0,05% SDS), как в соответствии с инструкциями производителя. Белковый раствор с замененным буфером определяли количественно с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 (1,34 мг/мл).

[597] IL-2 (12 мг, 8,96 мл) разбавляли до 9 мл с помощью 100 мМ бората натрия, pH 8 (0,05% SDS), и к этому раствору добавляли 0,1 М DTT (1,0 мл, 100 мкмоль, 127 экв.), получая конечную концентрацию IL-2 1,2 мг/мл. Полученную реакционную смесь восстановления осторожно перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 1 часа. Восстановленный IL-2 был заменен буфером 100 мМ борат натрия, pH 8 (0,05% SDS) с использованием колонки CentriPure P100 в соответствии с инструкциями производителя, и было определено количество восстановленного белка (11,6 мг в 14,26 мл реакционного буфера) посредством УФ-А280. Готовили раствор реагента TheraPEG™ 5 кДа (16,1 мг) в воде (11,03 мл). К восстановленному IL-2 (11,6 мг, 0,758 мкмоль, 14,26 мл), 100 мМ бората натрия, pH 8 (0,05% SDS) (28,24 мл) и раствору 1,5 мг/мл добавляли 5 кДа TheraPEG™ (3,37 мл, 0,981 мкмоль, 1,3 экв.). Реакционную смесь конъюгации осторожно перемешивали и инкубировали при 22 °С в течение 16 часов. Неочищенную реакционную смесь анализировали с помощью SDS-PAGE и аналитической SEC, а затем очищали с помощью препаративной SEC.

[598] Неочищенную реакционную смесь заменяли буфером на 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) и концентрировали с помощью УФ/ДФ (Vivapsin20, 5 кДа MWCO PES). SDS удаляли из образца пегилированного IL-2 с использованием спин-колонок для удаления детергента объемом 4 мл (Pierce®) в соответствии с инструкциями производителя. Пегилированный продукт IL-2 затем очищали с помощью SEC с использованием HiLoad 16/600 Superdex 200 мкг. Образец изократически элюировали с помощью 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5 (150 мМ NaCl) при скорости потока 2 мл/мин. Фракции, собранные с помощью этих методов, анализировали с помощью SDS-PAGE, и фракции высокой чистоты объединяли. Объединенные фракции фильтровали посредством стерилизации (0,22 мкм PVDF).

[599] Образец количественно определяли с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop 2000 и анализировали с помощью SEC и SDS-PAGE. Образец 51 был получен в виде 1,7 мг (выход 14%) в растворе. Чистота по SDS-PAGE: >99%. Чистота по аналитической SEC: 98,3%.

ПРИМЕР 52

Активность иллюстративных конъюгатов rIL-2-[ПЭГ] _z

[600] Активность алдеслейкина (контроль), примеры 15, 17, 19, 20, 22, 26, 27, 37-49, оценивали в анализе клеточной пролиферации с использованием клеток CTLL-2.

[601] Клетки CTLL-2 (клеточная линия цитотоксических Т-лимфоцитов мыши) поддерживали в полной среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 10% культуральной добавки IL-2 (T-STIM™ с ConA (конканавалин-A)) при 37°C в атмосфере с 5% CO₂. Клетки культивировали в суспензии до тех пор, пока они не достигали плотности клеток 2-3×10⁵ клеток/мл перед расщеплением.

[602] Для анализа активности через 3-4 дня после последнего расщепления клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко. Затем клетки повторно суспендировали в дополненной среде без T-STIM™ при плотности клеток ~ 5×10⁵ клеток/мл и высевали в 96-луночные микропланшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 90 мкл/лунку. Эксперименты также проводились с использованием дополненной среды (без T-STIM™) с доведенным до pH 6,7-7, чтобы свести к минимуму высвобождение конъюгатов в ходе инкубации. Затем добавляли 10 мкл 10-кратных концентраций тестируемого соединения, разведенного в среде с добавками без T-STIM™. Клетки инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% CO₂ в течение 48 часов. После инкубации в течение 48 часов добавляли реагент CCK8 (20 мкл/лунка) и инкубировали в течение 2 часов при 37°C, 5% CO₂. Затем планшет считывали при 450 нМ и 630 нМ, используя молекулярные устройства Spectra Max i3X.

[603] Тестировали активность как высвобождаемого IL-2, так и невысвобождаемых конъюгатов. Тестируемые соединения хранили в кислых условиях (10 мМ буфер ацетата натрия, рН 4) для стабилизации конъюгации. Для проверки активности конъюгатов образец разводили из буфера для хранения в дополненную среду примерно за час до анализа. Для проверки активности высвобождаемого IL-2 высвобождаемые конъюгаты разбавляли в десять раз в 100 мМ (конечная концентрация) бикарбонатно-натриевом буфере, pH 9, и предварительно инкубировали при 37°C в течение восьми часов до начала анализа.

[604] Значения EC₅₀ (концентрация тестируемого соединения, необходимая для проявления 50% максимального ответа) для клеточной пролиферации получали из нелинейного регрессионного анализа кривых доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.01.

[605] Активность IL-2 и конъюгатов измеряли с использованием анализа клеточной пролиферации, и обобщение результатов представлено в таблице 3. Все тестируемые препараты индуцировали рост клеток CTLL-2 дозозависимым образом, как некоторые примеры были показаны на фиг. 4A-4E. Как показано в таблице 3 и на фиг. 4A-4E, после предварительной инкубации конъюгатов из примеров 15, 17, 19, 20, 22, 27, 37-49 в условиях, вызывающих высвобождение IL-2, активность восстанавливалась. IL-2, высвобождаемый из этих конъюгатов, проявлял относительную эффективность по сравнению с контрольным IL-2.

Таблица 3. Общие данные о пролиферации клеток CTLL-2 в ответ на IL-2 и конъюгаты ПЭГ-IL-2

Тестируемое соединение	EC50 (нг/мл)
Контроль IL-2	3,96
Пример 15: [20K мПЭГ-(F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	58,17
Пример 15: [20K мПЭГ-(F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,71
Пример 17: [20K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	50,80
Пример 17: [20K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,54
Пример 19: [20K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	40,87
Пример 19: [20K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	2,45
Пример 22: [мПЭГ2-T2-Fmoc-20K]z-[rIL-2] (не высвобожден)	5,12
Пример 22: [мПЭГ2-T2-Fmoc-20K]z-[rIL-2] (высвобожден)	8,94
Пример 27: [мПЭГ2-Fmoc-20K]z-[rIL-2] (не высвобожден)	3,40
Пример 27: [мПЭГ2-Fmoc-20K]z-[rIL-2] (высвобожден)	2,59
Пример 20: [20K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	50,82
Пример 20: [20K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,30
Пример 37: [15K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 37: [15K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	0,85
Пример 38: [15K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 38: [15K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	2,08
Пример 39: [15K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 39: [15K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,51
Пример 40: [15K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 40: [15K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,28
Пример 41: [15K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	116,0
Пример 41: [15K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	0,90
Пример 42: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-Ar-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 42: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-Ar-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	2,53
Пример 43: [2×7,5K мПЭГ-(CONH-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 43: [2×7,5K мПЭГ-(CONH-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,85
Пример 44: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 44: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	0,71
Пример 45: [17K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 45: [17K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,87
Пример 46: [17K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 46: [17K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	7,52
Пример 47: [17K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 47: [17K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	0,85
Пример 48: [17K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	N.A.
Пример 48: [17K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,21
Пример 49: [17K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (не высвобожден)	176
Пример 49: [17K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2] (высвобожден)	1,48
Пример 26 (10K-тиомостик)-IL-2	2,73

Пример 53

Исследование высвобождения pH иллюстративных конъюгатов rIL-2-[ПЭГ] _z

[606] Тестируемый образец был заменен буфером на 100 мМ PBS, pH 7,4, с использованием колонки P2. Элюат из колонки стерильно фильтровали (0,2 мкм фильтр из PVDF) и количественно определяли с помощью УФ-А280 с использованием спектрофотометра Nanodrop. Образец разбавляли до концентрации 0,1 мг/мл с помощью 100 мМ PBS, pH 7,4. В четырнадцать сосудов (семь временных точек в двух повторностях) загружали тестируемый образец (100 мкл). Два сосуда сразу же гасили 2 М уксусной кислотой и замораживали при -80°C (t=0 ч.). Остальные двенадцать сосудов инкубировали при 37 °C. В заранее определенные моменты времени (t=6, 24, 48, 72, 96 и 120 ч.) два сосуда извлекали из хранилища при 37 °C, центрифугировали (1,5 мин, 4000 g), гасили 2 М уксусной кислотой и затем замораживали при -80°С. После того, как все образцы в момент времени были собраны, образцы оттаивали и анализировали с помощью SDS-PAGE. Средние соотношения ПЭГ:IL-2 определяли с помощью денситометрического анализа геля, эти данные преобразовывали и наносили на график в зависимости от времени с использованием GraphPad Prism v7.04, определяли период полувыведения при расщеплении линкера и обобщали в таблице 4. T_1/2 определяли как время высвобождения половины количества ПЭГ из IL-2 в конъюгате.

Таблица 4. Период полувыведения конъюгатов ПЕГ-IL-2 при расщеплении линкера

Тестируемое соединение	T1/2 (ч.)
Пример 15: [20K мПЭГ-(F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	299
Пример 17: [20K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	69
Пример 19: [20K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	183
Пример 22: [мПЭГ2-T2-Fmoc-20K]z-[rIL-2]	44
Пример 20: [20K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	86
Пример 21: [20K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	57
Пример 37: [15K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	82
Пример 38: [15K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	179
Пример 39: [15K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	60
Пример 40: [15K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	53
Пример 41: [15K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	37
Пример 42: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-Ar-SO2)]z-[rIL-2]	84
Пример 43: [2×7,5K мПЭГ-(CONH-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2]	257
Пример 44: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2]	55
Пример 45: [17K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	89
Пример 46: [17K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	184
Пример 47: [17K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	74
Пример 48: [17K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	58
Пример 49: [17K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	30

Пример 54

Исследования эффективности подкожной меланомы B16F10

[607] 1×10⁵ клеток B16F10 имплантировали подкожно каждой 7-9-недельной изогенной мыши C57BL/6 в среднюю область спины. Опухолям давали вырасти до ощутимого размера, т.е. 70-120 мм3, перед рандомизацией и распределением по группам (n=8) в соответствии с планом. Мышам вводили тестируемые соединения, т.е. rIL-2, конъюгаты rIL-2-полимер или среду-носитель в различных концентрациях доз и схемах дозирования, как указано в таблицах 5-9. Значения веса тела и объема опухоли измеряли каждые два или три дня. Результатом этого исследования было время достижения среднего объема опухоли 2000 мм3 для данной группы.

Таблица 5. Распределения по группам для примера 54, фиг. 5

Тестируемое соединение	Концентрация дозы (мг/кг)	Путь введения	Доза
Среда-носитель: 10 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 4,5	0	IV	q1d
контроль rIL-2	3	IP	b.i.d. x 5
Пример 15 [20K мПЭГ-(F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	5	IV	q1d
Пример 17 [20K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	5	IV	q1d
Пример 19 [20K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	5	IV	q1d
Пример 22 [мПЭГ2-T2-Fmoc-20K]z-[rIL-2]	5	IV	q1d
Пример 27 [мПЭГ2-Fmoc-20K]z-[rIL-2]	5	IV	q1d

Примечание: «b.i.d x 5» означает два раза в день в течение пяти дней; «q1d» означает одну дозу в течение одного дня.

Таблица 6. Распределения по группам для примера 54, фиг. 6

Тестируемое соединение	Концентрация дозы (мг/кг)	Путь введения	Доза
Среда-носитель: 10 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 4,5	0	IV	q1d
контроль rIL-2	3	IP	b.i.d. x 5
Пример 27 [мПЭГ2-Fmoc-20K]z-[rIL-2]	4	IV	q1d
Пример 26 (10K-тиомостик)-IL-2	4	IV	q1d
Пример 20: [20K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	4	IV	q1d
Пример 21: [20K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	4	IV	q1d

Примечание: «b.i.d x 5» означает два раза в день в течение пяти дней; «q1d» означает одну дозу в течение одного дня.

Таблица 7. Распределения по группам для примера 54, фиг. 7

Тестируемое соединение	Концентрация дозы (мг/кг)	Путь введения	Доза
Среда-носитель: 10 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 4,5	0	IV	qd, доза в день 13, день 21 и день 29
контроль rIL-2	3	IP	b.i.d. x 5, 2 цикла, доза в день 13 (PM), 14, 15, 16, 17, 18 (AM) и день 19 (PM), 20, 21, 22, 23, 24 (AM)
Пример 17 [20K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	qd, доза в день 13, день 21 и день 29
Пример 37: [15K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	qd, доза в день 13, день 21 и день 29
Пример 38: [15K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	qd, доза в день 13, день 21 и день 29
Пример 39: [15K мПЭГ-(F,F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	qd, доза в день 13, день 21 и день 29
Пример 40: [15K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	qd, доза в день 13, день 21 и день 29

Примечание: «b.i.d x 5» означает два раза в день в течение пяти дней; «qd» означает одну дозу в течение одного дня.

Таблица 8. Распределения по группам для примера 54, фиг. 8

Тестируемое соединение	Концентрация дозы (мг/кг)	Путь введения	Доза
Среда-носитель: 10 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 4,5	0	IV	Q1w x 2
контроль rIL-2	3	IP	b.i.d. x 5, 2 цикла
Пример 43: [2×7,5K мПЭГ-(CONH-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2]	3	IV	Q1w x 2
Пример 41: [15K мПЭГ-(Cl,CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	3	IV	Q1w x 2
Пример 44: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2]	3	IV	Q1w x 2
Пример 40: [15K мПЭГ-(F,CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	3	IV	Q1w x 2

Примечание: «b.i.d x 5» означает два раза в день в течение пяти дней; «q1w x 2» означает один раз в неделю в течение трех циклов.

Таблица 9. Распределения по группам для примера 54, фиг. 9

Тестируемое соединение	Концентрация дозы (мг/кг)	Путь введения	Доза
Среда-носитель: 10 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 4,5	0	IV	Q1w x 3
контроль rIL-2	3	IP	b.i.d. x 5, 2 цикла
Пример 42: [2×7,5K мПЭГ-(CF3-Ph-Ar-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	Q1w x 3
Пример 45: [17K мПЭГ-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	Q1w x 3
Пример 46: [17K мПЭГ-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	Q1w x 3
Пример 47: [17K мПЭГ-(F, F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	Q1w x 3
Пример 48: [17K мПЭГ-(F, CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	Q1w x 3
Пример 49: [17K мПЭГ-(Cl, CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2]	2	IV	Q1w x 3

Примечание: «b.i.d x 5» означает два раза в день в течение пяти дней; «q1w x 3» означает один раз в неделю в течение трех циклов.

[608] Ингибирование роста опухоли после введения rIL-2 и конъюгатов rIL-2-полимер при различных схемах введения представлено на фиг. 5-9. Эти результаты показывают, что оцениваемые конъюгаты rIL-2-полимер продемонстрировали лучшую эффективность при пониженной дозе по сравнению с rIL-2, который вводили в дозе 3 мг/кг два раза в день в течение пяти дней. В мышиной модели конъюгатов IL-2-ПЭГ не наблюдалось видимой токсичности, в то время как у мышей группы IL-2 наблюдались симптомы летаргии и озноба. Конъюгаты IL-2-ПЭГ, присоединенные через разные линкеры, обладали разной противоопухолевой активностью. Конъюгаты со скоростью гидролиза 30-80 часов показали оптимальную противоопухолевую эффективность.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Beijing Xuanyi PharmaSciences Co., Ltd.

<120> КОНЪЮГАТЫ БЕЛОК-МАКРОМОЛЕКУЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> CSPL-008/01WO 332638-2065

<150> US 62/908,435

<151> 2019-09-30

<160> 5

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 132

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> рекомбинантный IL-2

<400> 1

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 2

<211> 402

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> рекомбинантный IL-2

<400> 2

atgccaacct cctcctctac caagaaaact caactgcaac tggaacacct gctgctggat 60

ctgcaaatga ttctgaacgg cattaacaac tacaagaacc cgaaactgac ccgtatgctg 120

accttcaaat tctatatgcc gaagaaagct accgaactga aacacctgca atgcctggaa 180

gaggagctga aaccgctgga ggaggttctg aacctggctc agagcaagaa ctttcatctg 240

cgtccacgtg acctgatttc caacatcaac gttatcgttc tggaactgaa aggtagcgaa 300

accactttca tgtgcgagta cgctgacgaa accgctacca tcgttgaatt tctgaaccgc 360

tggatcacct tctctcagtc cattatctct actctgacct aa 402

<210> 3

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> рекомбинантный IL-2

<400> 3

Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 4

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> передний праймер

<400> 4

aatcatatgg cacctacttc aagttctaca aa 32

<210> 5

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер

<400> 5

aatttatcaa gttagtgttg agatgat 27

<---

Claims (221)

1. Конъюгат линкера, содержащий белок, ковалентно присоединенный к по меньшей мере одному линкеру, где конъюгат линкера содержит структуру формулы (XIX):

Белок-(L)z (XIX),

или его фармацевтически приемлемая соль или гидрат;

где:

z представляет собой целое число от 1 до 10,

L представляет собой линкер, где по меньшей мере один линкер является высвобождаемым линкером; и

белок представляет собой IL-2,

где конъюгат линкера используется как фармацевтическое промежуточное соединение,

где конъюгат линкера содержит:

структуру формулы (VII-A):

(VII-A); или

структуру формулы (VII-B):

(VII-B); или

структуру формулы (VII-C):

(VII-C); или

структуру формулы (VII-D):

(VII-D);

где

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

где каждый из первого спейсерного фрагмента и второго спейсерного фрагмента независимо друг от друга содержат линкер, который содержит один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов фосфора, атомов кислорода и их комбинаций;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

алкил является полностью насыщенным углеводородным радикалом с прямой (линейной) или разветвленной цепью, имеющим от одного до двадцати атомов углерода;

алкенил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных двойных связей;

алкинил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных тройных связей;

арил является радикалом углеводородной кольцевой системы, содержащим атом водорода, от 6 до 18 атомов углерода и по меньшей мере одно ароматическое кольцо;

амид является -NH(COR), где R независимо выбран из H, алкила, алкокси, амино или арила;

алкокси относятся к радикалу формулы -OR_a1, где R_a1 представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двадцати атомов углерода;

циклоалкил относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому полностью насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода;

гетероарил представляет собой оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиридил, пиримидинил;

замещенный относится к группе, замещенной одним или несколькими не мешающими заместителями, включающими галоген, алкил, галогеналкил, циклоалкил, алкокси (-OR), галогеналкокси, амино, амидо, сульфонил, ацил, циано, нитро, фенил и гетероарил;

a представляет собой целое число от 0 до 5;

z представляет собой целое число от 1 до 10;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из азидных и циклоалкинильных групп, где циклоалкинильная группа представлена дибензоциклооктином (DBCO); и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка лизина в белке;

где конъюгат линкера имеет следующую структуру:

(VII-A1),

где a представляет собой целое число от 1 до 2; и Re представляет собой 4-F, 4-Cl, 4-CF₃, 2,4-дифтор, или 2-CF₃-4-F;

2. Конъюгат, имеющий структуру согласно формуле (XX):

Белок-(L-Макромолекула)_z (XX),

или его фармацевтически приемлемая соль или гидрат,

где:

z является целым числом от 1 до 10;

L представляет собой линкер;

белок представляет собой IL-2, и

макромолекула представляет собой метокси-ПЭГ, где средняя молекулярная масса метокси-ПЭГ находится в диапазоне от 7,5 кДа до 20 кДа;

где конъюгат используется в качестве лекарственного средства;

где конъюгат содержит структуру формулы (XIII-A), формулы (XIII-B), формулы (XIII-C) или формулы (XIII-D):

(XIII-A);

(XIII-B);

(XIII-C);

где:

POLY¹ представляет собой метокси-ПЭГ, где средняя молекулярная масса метокси-ПЭГ находится в диапазоне от 7,5 кДа до 20 кДа;

POLY² представляет собой метокси-ПЭГ, где средняя молекулярная масса метокси-ПЭГ находится в диапазоне от 7,5 кДа до 20 кДа;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

где каждый из первого спейсерного фрагмента и второго спейсерного фрагмента независимо друг от друга содержат линкер, который содержит один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов фосфора, атомов кислорода и их комбинаций;

T¹ представляет собой первую триазольную функциональную группу;

T² представляет собой вторую триазольную функциональную группу;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

алкил является полностью насыщенным углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от одного до двадцати атомов углерода;

алкенил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных двойных связей;

алкинил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных тройных связей;

арил является радикалом углеводородной кольцевой системы, содержащим атом водорода, от 6 до 18 атомов углерода и по меньшей мере одно ароматическое кольцо;

амид является -NH(COR), где R независимо выбран из H, алкила, алкокси, амино или арила;

алкокси относятся к радикалу формулы -OR_a1, где R_a1 представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двадцати атомов углерода;

циклоалкил относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому полностью насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода;

гетероарил представляет собой оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиридил, пиримидинил;

замещенный относится к группе, замещенной одним или несколькими не мешающими заместителями, включающими галоген, алкил, галогеналкил, циклоалкил, алкокси (-OR), галогеналкокси, амино, амидо, сульфонил, ацил, циано, нитро, фенил и гетероарил;

a представляет собой целое число от 0 до 5;

z представляет собой целое число от 1 до 10;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка лизина в белке,

где конъюгат имеет структуру формулы (XIII-B1), формулы (XIII-A1), формулы (XIII-C1), формулы (XIII-D1), формулы (XIII-D2):

(XIII-B1),

(XIII-A1),

(XIII-C1),

(XIII-D1),

(XIII-D2),

где:

a представляет собой целое число от 1 до 2;

R^e представляет собой 4-F, 4-Cl, 4-CF₃, 2,4-дифтор, или 2-CF₃-4-F;

z представляет собой целое число от 1 до 10.

3. Способ получения конъюгатов белок-макромолекула согласно схеме (I):

(схема I),

где x представляет собой целое число от 1 до 10;

y представляет собой целое число от 0 до 9;

z представляет собой целое число от 1 до 10, где x=y+z;

L представляет собой линкер;

FG⁰ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с нуклеофильной амино группой активного белкового средства с образованием связи, содержащей карбаматную связь;

FG² представляет собой функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из азидных и циклоалкинильных групп, где циклоалкинильная группа представлена дибензоциклооктином (DBCO);

FG³ представляет собой функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из азидных и циклоалкинильных групп, где циклоалкинильная группа представлена дибензоциклооктином (DBCO);

белок представляет собой IL-2;

макромолекула представляет собой метокси-ПЭГ, где средняя молекулярная масса метокси-ПЭГ находится в диапазоне от 7,5 кДа до 20 кДа,

где белок-(L-FG²)x содержит

(a) структуру формулы (VII-A):

(VII-A) или

(b) структуру формулы (VII-B):

(VII-B); или

(c) структуру формулы (VII-C):

(VII-C); или

(d) структуру формулы (VII-D):

(VII-D);

где:

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

где каждый из первого спейсерного фрагмента и второго спейсерного фрагмента независимо друг от друга содержат линкер, который содержит один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов фосфора, атомов кислорода и их комбинаций;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

алкил является полностью насыщенным углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от одного до двадцати атомов углерода;

алкенил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных двойных связей;

алкинил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных тройных связей;

арил является радикалом углеводородной кольцевой системы, содержащим атом водорода, от 6 до 18 атомов углерода и по меньшей мере одно ароматическое кольцо;

амид является - NH(COR), где R независимо выбран из H, алкила, алкокси, амино или арила;

алкокси относятся к радикалу формулы -OR_a1, где R_a1 представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двадцати атомов углерода;

циклоалкил относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому полностью насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода;

гетероарил представляет собой оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиридил, пиримидинил;

замещенный относится к группе, замещенной одним или несколькими не мешающими заместителями, включающими галоген, алкил, галогеналкил, циклоалкил, алкокси (-OR), галогеналкокси, амино, амидо, сульфонил, ацил, циано, нитро, фенил и гетероарил;

a представляет собой целое число от 0 до 5;

z представляет собой целое число от 1 до 10;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S;

FG² представляет собой функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из азидных и циклоалкинильных групп, где циклоалкинильная группа представлена дибензоциклооктином (DBCO); и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка лизина в белке,

где белок-(L-FG²)x имеет следующую структуру:

(VII-A1),

где a представляет собой целое число от 1 до 2; и Re представляет собой 4-F, 4-Cl, 4-CF₃, 2,4-дифтор, или 2-CF₃-4-F;

;

где (FG²-L)y-белок-(L-макромолекула)z содержит:

(a) структуру формулы (XIII-A):

(XIII-A); или

(b) структуру формулы (XIII-B):

(XIII-B); или

(c) структуру формулы (XIII-C):

(XIII-C); или

(d) структуру формулы (XIII-D):

(XIII-D),

где

POLY¹ представляет собой метокси-ПЭГ, где средняя молекулярная масса метокси-ПЭГ находится в диапазоне от 7,5 кДа до 20 кДа;

POLY² представляет собой метокси-ПЭГ, где средняя молекулярная масса метокси-ПЭГ находится в диапазоне от 7,5 кДа до 20 кДа;

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X², если присутствует, представляет собой второй спейсерный фрагмент;

где каждый из первого спейсерного фрагмента и второго спейсерного фрагмента независимо друг от друга содержат линкер, который содержит один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов фосфора, атомов кислорода и их комбинаций;

T¹ представляет собой первую триазольную функциональную группу;

T² представляет собой вторую триазольную функциональную группу;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

алкил является полностью насыщенным углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от одного до двадцати атомов углерода;

алкенил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных двойных связей;

алкинил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных тройных связей;

арил является радикалом углеводородной кольцевой системы, содержащим атом водорода, от 6 до 18 атомов углерода и по меньшей мере одно ароматическое кольцо;

амид является -NH(COR), где R независимо выбран из H, алкила, алкокси, амино или арила;

алкокси относятся к радикалу формулы -OR_a1, где R_a1 представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двадцати атомов углерода;

циклоалкил относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому полностью насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода;

гетероарил представляет собой оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиридил, пиримидинил;

замещенный относится к группе, замещенной одним или несколькими не мешающими заместителями, включающими галоген, алкил, галогеналкил, циклоалкил, алкокси (-OR), галогеналкокси, амино, амидо, сульфонил, ацил, циано, нитро, фенил и гетероарил;

a представляет собой целое число от 0 до 5;

z представляет собой целое число от 1 до 10;

Y¹ представляет собой O или S;

Y² представляет собой O или S; и

-NH- представляет собой аминогруппу остатка лизина в белке,

где (FG²-L)y-белок-(L-макромолекула)z имеет структуру формулы (XIII-B1), формулы (XIII-A1), формулы (XIII-C1), формулы (XIII-D1), формулы (XIII-D2):

(XIII-B1),

(XIII-A1),

(XIII-C1),

(XIII-D1),

(XIII-D2),

где:

a представляет собой целое число от 1 до 2;

R^e представляет собой 4-F, 4-Cl, 4-CF₃, 2,4-дифтор, или 2-CF₃-4-F;

z представляет собой целое число от 1 до 10.

4. Композиция, содержащая смесь конъюгатов по п.2, для использования в качестве активного средства терапевтической композиции.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по п.2 и одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, для использования в лечении рака, инфекции или аутоиммунного заболевания при ее введении.

6. Высвобождаемый линкер, имеющий структуру формулы (I-B), формулы (I-C) или формулы (VIII):

(I-B), или

(I-C), или

(XVIII),

где:

X¹ представляет собой первый спейсерный фрагмент;

X² представляет собой второй спейсерный фрагмент;

где каждый из первого спейсерного фрагмента и второго спейсерного фрагмента независимо друг от друга содержат линкер, который содержит один или несколько атомов углерода, атомов азота, атомов серы, атомов фосфора, атомов кислорода и их комбинаций;

R¹ представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R² представляет собой водород, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил или замещенный арил;

R^e представляет собой группу, изменяющую электронную плотность, выбранную из нитро, циано, галогена, амида, замещенного амида, сульфона, замещенного сульфона, сульфонамида, замещенного сульфонамида, алкокси, замещенного алкокси, алкила, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;

алкил является полностью насыщенным углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от одного до двадцати атомов углерода;

алкенил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных двойных связей;

алкинил является углеводородным радикалом с прямой или разветвленной цепью, имеющим от двух до двадцати атомов углерода и имеющим одну или несколько углерод-углеродных тройных связей;

арил является радикалом углеводородной кольцевой системы, содержащим атом водорода, от 6 до 18 атомов углерода и по меньшей мере одно ароматическое кольцо;

амид является -NH(COR), где R независимо выбран из H, алкила, алкокси, амино или арила;

алкокси относятся к радикалу формулы -OR_a1, где R_a1 представляет собой алкильный, алкенильный или алкинильный радикал, как определено выше, содержащий от одного до двадцати атомов углерода;

циклоалкил относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому полностью насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, который может включать конденсированные или мостиковые кольцевые системы, содержащие от трех до двадцати атомов углерода;

гетероарил представляет собой оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиридил, пиримидинил;

замещенный относится к группе, замещенной одним или несколькими не мешающими заместителями, включающими галоген, алкил, галогеналкил, циклоалкил, алкокси (-OR), галогеналкокси, амино, амидо, сульфонил, ацил, циано, нитро, фенил и гетероарил;

a представляет собой целое число от 0 до 4;

c представляет собой 2;

FG¹ представляет собой функциональную группу, способную вступать в реакцию с аминогруппой активного средства с образованием расщепляемой карбаматной связи; и

FG² представляет собой функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из азидных и циклоалкинильных групп, где циклоалкинильная группа представлена дибензоциклооктином (DBCO);

где соединение имеет следующую структуру:

;

; или