RU2845997C1 - Способ определения вероятности антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, акушерству и гинекологии, и может быть использовано для определения вероятности антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности. В образцах ткани плаценты определяют уровень экспрессии микроРНК-126, микроРНК-451, микроРНК-125b с последующим вычислением индекса d. При d > 0 определяют вероятность антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности. Способ позволяет определить вероятность антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности за счет оценки уровня экспрессии микроРНК-126, микроРНК-451, микроРНК-125b в плаценте. 1 ил., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к области патологической анатомии, акушерства и гинекологии. Представляется способ определения роли эпигенетического программирования в возникновении антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности на основе оценки уровня экспрессии микроРНК-126, микроРНК-451, микроРНК-125b в плаценте для оценки предотвратимости наступления данного неблагоприятного исхода.

Согласно данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется около 2,6 млн. случаев мертворождения, данный показатель остается стабильным и не имеет тенденции к снижению. Около 80% приходится на антенатальные потери, характеризующиеся полиэтиологичностью, разнообразием факторов риска, не до конца изученным танатогенезом. При этом доля антенатальной смерти плода по неуточненной причине (внезапная смерть плода) составляет от 30% до 60% [Бюллетень. Рекомендации ВОЗ «Важен каждый ребенок. Аудит и анализ случаев мертворождения и неонатальной смерти». 2016; О.В. Ремнева, Е.Г. Ершова, А.Е Чернова. Антенатальная гибель доношенного плода: факторы риска, возможности телемедицины в ее прогнозировании. Современные проблемы науки и образования. 2018; 5: 33-36]. Важно, что частота внезапной смерти плода увеличивается со сроком гестации с 26% до 50% [Е.А. Сонченко, А.Ф. Михельсон, Е.Ю. Лебеденко. «Загадочная» антенатальная гибель плода (обзор литературы). Здоровье и образование в XXI веке. 2017; 10: 154-156].

Антенатальная смерть доношенного плода - это смерть плода, возникшая внутриутробно на сроке беременности 37 недель 0 дней - 41 неделя 6 дней до момента развития регулярной родовой деятельности [Г.В. Матрохина. Антенатальная гибель доношенного плода: факторы риска, возможности телемедицины в ее прогнозировании. Бюллетень медицинской науки. 2019; 4 (16)].

В отношении «синдрома внезапной смерти плода», представляющего собой смерть плода, наступившую без диагностированных клинических проявлений внутриутробной гипоксии, причины которой не определены даже после проведения патологоанатомического исследования, в настоящее время имеется недостаточное количество литературных данных. В России данный термин введен в 2011 году М.А. Курцером и соавт. [М.А. Курцер, Ю.Ю. Кутакова, Е.Н. Сонголова, А.В. Белоусова, Л.Н. Каск, А.С. Чемезов. Синдром внезапной смерти плода. Акушерство и гинекология. 2011; 7(1)]. Более современные исследования синдрома внезапной смерти плода описывают воздействие определенных факторов, влияющих на повышение частоты встречаемости данного синдрома. В исследовании N. Bednarczuk et al. (2020) табакокурение матери рассматривается как одна из причин внезапной смерти плода вследствие аномальной реакции на гипоксию и гиперкарбию и сниженного ответа на возбуждение, опосредованное влиянием угарного газа и никотина на развитие ядер ствола головного мозга, коры головного мозга и вегетативной нервной системы плода [Bednarczuk N., Milner A., Greenough A. The Role of Maternal Smoking in Sudden Fetal and Infant Death Pathogenesis. Front Neurol. 2020; 23(11)]. В 2022 году A.M. Gatti et al. провели углубленное обследование головного мозга мертворожденного плода, при котором выявили различные аномалии развития мозговых центров, контролирующих вегетативные и кардиореспираторные функции [Gatti A.M., Ristic M., Stanzani S., Lavezzi A.M. Novel chemical-physical autopsy investigation in sudden infant death and sudden intrauterine unexplained death syndromes. Nanomedicine (Lond). 2022; 17(5):275-288]. Авторами исследования были обнаружены наноразмерные частицы, загрязняющие окружающую среду (NEP), способные проникать через гематоэнцефалический барьер и нарушать нормальное развитие жизненно важных центров головного мозга плода и, следовательно, участвовать в танатогенезе внутриутробной смерти плода. Интересные данные были представлены коллективом российских авторов, показавшим взаимосвязь увеличенной толщины воротникового пространства у плода при отсутствие хромосомных аномалий с повышенным риском антенатальной смерти плода даже при нормальном течении беременности [Е.В. Кудрявцева, В.В. Ковалев, И.И. Баранов, К.С. Вшивцев, Э.В. Аребьев, Н.Н. Баязитова. Взаимосвязь показателей пренатального скрининга I триместра с риском осложнений беременности. Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2020; 8(1):38-46].

В течение последних 50 лет проводились различные исследования по обнаружению генетических аберраций в клетках плода: от цитогенетических методов (кариотипирование, флуоресцентная гибридизация) до молекулярной генетики (количественная флуоресцентно-полимеразная цепная реакция, анализ хромосомных микрочипов, технологии секвенирования следующего поколения) [Silver R.M., Varner M.W., Reddy U. Work-up of stillbirth: a review of the evidence. Am J Obstet Gynecol.2007; 196(5): 433-444; Bauld R., Sutherland G.R., Bain A.D. Chromosome studies in investigation of stillbirths and neonatal deaths. Arch Dis Child. 1974; 49(10): 782-788; Sahlin E., Gustavsson P., Liedén A. Molecular and Cytogenetic Analysis in Stillbirth: Results from 481 Consecutive Cases. Fetal diagnosis and therapy. 2014; 36(4): 326-332]. При этом каждый метод имеет свои ограничения, так, анализ кариотипа возможен только при наличии жизнеспособных клеток, а нарушения в хромосомах размером менее 5-10 Мб на данном этапе технически невозможно обнаружить.

Технологии секвенирования следующего поколения (NGS) позволят обнаружить потенциальные «самостоятельные» причины при различных патологических процессах, включая мертворождение [Sahlin E., Gréen A., Gustavsson P. Identification of putative pathogenic single nucleotide variants (SNVs) in genes associated with heart disease in 290 cases of stillbirth. PLoS One. 2019; 14(1)]. Более того, анализ всего экзома позволит выявить гены, которые в настоящее время не связаны с заболеванием человека, но потенциально могут влиять на потенцирование антенатальной смерти плода. К сожалению, на данном этапе развития медицинской науки проведено недостаточное количество исследований в когортах пациенток с мертворождением в анамнезе с использованием данных технологий [Wilkins-Haug L. Genetic innovations and our understanding of stillbirth. Human Genetics. 2020; 139(9): 1161-1172; Hays T., Wapner J.R. Genetic testing for unexplained perinatal disorders. Curr Opin Pediatr. 2021; 33(2): 195-202].

Важно отметить, что более 60% генов, кодирующих белки человека, содержат как минимум один сайт связывания микроРНК, следовательно, экспрессия этих генов зависит от уровня экспрессии микроРНК [Gonzalez T.L., Eisman L.E., Joshi N.V., Flowers A.E., Wu D., Wang Y., Santiskulvong C., Tang J., Buttle R.A., Sauro E., Clark E.L., DiPentino R., Jefferies C.A., Chan J.L., Lin Y., Zhu Ya., Afshar Ya., Tseng H-R., Taylor K., Williams III J., Pisarska M.D. High-throughput miRNA sequencing of the human placenta: expression throughout gestation. Epigenomics. 2021; 13: 995-1012].

Известно, что формирование плаценты контролируется различными видами микроРНК, изменения уровней экспрессии которых приводит к дисфункции плаценты, что напрямую связано с осложнениями беременности [Gillet V., Ouellet A., Stepanov Y., Rodosthenous R.S., Croft E.K., Brennan K., Abdelouahab N., Baccarelli A., Takser L. MiRNA profiles in extracellular vesicles from serum early in pregnancies. Complicated by gestational diabetes mellitus. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2019; 104(11): 5157-5169; Vaiman D. Genes, epigenetics and miRNA regulation in the placenta. Placenta 2017; 52:127-133; Ardekani A.M., Naeini M.M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J. Med. Biotechnol. 2010; 2(4):161-179].

МикроРНК - это некодирующие РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, которые осуществляют посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов, чаще всего посредством обратной отрицательной связи [Ali A., Hadlich F., Abbas M.W. MicroRNA-mRNA networks in pregnancy complications: a com- prehensive downstream analysis of potential biomarkers. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22(5): 2313; Ezhilarasan D. MicroRNA interplay between hepatic stellate cell quiescence and activation. Eur. J. Pharmacol. 2020; 885:173-507; Hayder H., O'Brien J., Nadeem U., Peng C. MicroRNAs: Crucial regulators of placental development. Reproduction. 2018; 155:259-271]. В настоящее время обнаружено 762 плацентоспецифичных микроРНК, экспрессирующихся трофобластами плаценты [Morales-Prieto D.M., Ospina-Prieto S., Schmidt A., Chaiwangyen W., Markert U.R. Elsevier trophoblast research award lecture: origin, evolution and future of placenta miRNAs. Placenta. 2014; 35:39-45; Morales-Prieto D.M., Chaiwangyen W., Ospina-Prieto S., Schneider U., Herrmann J., Gruhn B., Markert U.R. MicroRNA expression profiles of trophoblastic cells. Placenta. 2012; 33: 725-734; Chen P.S., Chiu W.T., Hsu P.L., Lin S.C., Peng I.C., Wang C.Y., Tsai S.J. Pathophysiological implications of hypoxia in human diseases. Journal of Biomedical Science. 2020; 27(1)].

Таким образом, микроРНК играет роль эпигенетического фактора, являясь посредником влияния окружающей среды на развитие и функционирование плаценты и одним из основных регуляторов течения беременности [Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) method. Methods. 2001; 25(4): 402]. В связи с этим логично предположить, что антенатальная смерть плода на доношенном сроке беременности также может быть непосредственно либо опосредованно связана с дисрегуляцией экспрессии ряда плацентарных микроРНК.

Недавние исследования выявили микроРНК, оказывающие влияние на пролиферацию, апоптоз, миграцию и инвазию плацентарного трофобласта. В частности, аберрантная экспрессия микроРНК-125b в клетках трофобласта приводит к торможению их пролиферации и неадекватной инвазии, что нарушает процессы реконструкции спиральных артерий и ангиогенеза [Ю.К. Гусак, В.Г. Чикин, А.В. Хованов, А.В. Новикова, Н.Ю. Гусак. Антенатальная гибель плода: клинико-биохимические параллели и особенности родоразрешения. Главврач Юга России. 2020; 5(75): 18-23; 35. Wong S.T.K., Tse W.T., Lau S.L., Sahota D.S., Leung T.Y. Stillbirth rate in singleton pregnancies: a 20-year retrospective study from a public obstetric unit in Hong Kong. Hong Kong Med J. 2022; 28(4): 285-293; Wilkins-Haug L. Genetic innovations and our understanding of stillbirth. Hum Genet. 2020; 139(9): 1161-1172]. В свою очередь, активная экспрессия микроРНК-126, наоборот, оказывает положительное влияние на пролиферацию, миграцию, инвазию и дифференцировку плацентарного трофобласта и усиливает антиапоптозные эффекты [Yan T., Liu Y., Cui K., Hu B., Wang F., Zou L. MicroRNA-126 regulates EPCs function: implications for a role of miR-126 in preeclampsia. J. Cell Biochem. 2013; 114: 2148-2159], а микроРНК-451 опосредованно регулирует метаболизм глюкозы [Guo H., Nan Y., Zhen Y. Zhang Y., Guo L., Yu K., Huang Q., Zhong Yu. MiRNA-451 inhibits glioma cell proliferation and invasion by downregulating glucose transporter 1. Tumour Biol. 2016; 37(10):13751-13761].

Аналогом предлагаемого изобретения является «Способ прогнозирования антенатальной гибели плода», патент RU22009140816A, представленный Сагамоновой К.Ю. и соавт. (2011). Способ представлен определением в сыворотке крови беременной женщины, начиная с 22-23 недель гестации, уровня Д-димера: при его значении 400-740 нг/мл прогнозируют антенатальную гибель плода.

Данный метод рассматривает нарушение гемостаза во время беременности как причину антенатальной смерти плода, не учитывая срок наступления данного неблагоприятного исхода. Кроме того, в настоящее время доказано, что изменение уровня Д-димера во время беременности не имеет диагностической или прогностической значимости [To M.S., Hunt B.J. Obstetric case reports a negative D-dimer does not exclude venous thromboembolism (VTE) in pregnancy Early fundoscopy, magnetic resonance imaging and venometry in the diagnosis of venous sinus thrombosis. 2008; 28; Damodaram M. D-dimers as a screening test for venous thromboembolism in pregnancy: Is it of any use? 2009; 29: 101-103].

Другим аналогом является способ раннего прогнозирования потерь в I триместре беременности, патент RU2014102019A, предложенный Коротовой С.В. и соавт. (2015), в основе которого лежит определение ряда признаков, имеющих взаимосвязь с формированием первичной фето-плацентарной недостаточности, следствием которой является антенатальная гибель плода, а именно: хронический эндометрит, носительство TORCH-инфекции, рубец на матке, группа крови, ВЗОМТ, хламидиоз, самопроизвольный выкидыш, Rh-фактор, заболевания ССС. При расчете прогностических коэффициентов пациентка относится либо к группе высокого риска репродуктивных потерь, либо к группе с физиологическим течением беременности.

Предложенный метод основан на ряде клинико-анамнестических признаков, которые не являются специфическими и косвенно свидетельствуют о вероятности наступления неблагоприятного исхода беременности. Кроме того, риск оценивается только для I триместра беременности и не оценивает риски антенатальной смерти плода на сроке доношенной беременности.

Прототипом данного изобретения является изобретение «Способ прогнозирования задержки роста плода» Кузнецовой Н.Б. и соав. (патент RU2738674C1, 15.12.2020), основанное на исследовании венозной крови у беременных женщин в 18-22 недели гестации методом количественной ПЦР с определением экспрессии трех плацентоспецифичных микроРНК: микроРНК -103а-3р, микроРНК -26а-5р, микроРНК -125b-5р. Заявляемый способ обеспечивает повышение точности и специфичности прогнозирования задержки роста плода на доклинической стадии.

Недостаток метода: в данном изобретении также используется микроРНК-125b, но лишь в качестве инструмента прогнозирования задержки роста плода, как одного из предикторов антенатальной смерти плода на доношенном сроке беременности, но не являющегося инструментом непосредственного прогнозирования антенатальной смерти плода на сроке доношенной беременности. Кроме того, в данном методе не уточняется срок беременности, на который прогнозируется наступление антенатальной смерти плода. Использование крови в качестве субстрата для определение уровня экспрессии микроРНК в отношении прогнозирования какой-либо патологии в настоящее время является спорным: затруднительно определить специфическую направленность микроРНК, циркулирующих в крови, и доказать, что аберрантные уровни экспрессии обнаруженных микроРНК свидетельствуют о развитии именно исследуемого процесса, а не параллельно протекающего явления.

Раскрытие сущности изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа определения вероятности антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности.

Технический результат: позволяет установить роль эпигенетического программирования в возникновении антенатальной смерти доношенного плода по неуточненной причине.

Заявляется способ определения вероятности антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности, включающий определение уровня экспрессии микроРНК-126, микроРНК-451, микроРНК-125b в образцах ткани плаценты с последующим вычислением индекса d по формуле:

где:

d - вероятность наступления смерти доношенного плода по неуточненной причине;

х₁ - уровень экспрессии микроРНК-126, нг/мкл;

х₂ - уровень экспрессии микроРНК-451, нг/мкл;

х₃ - уровень экспрессии микроРНК-125b, нг/мкл;

11,318 - постоянная величина,

при d > 0 определяют вероятность антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности.

На Фиг. 1 представлена ROC-кривая определения чувствительности и специфичности способа определения эпигенетического программирования антенатальной смерти плода на доношенном сроке беременности.

Прогностическая точность полученных прогностических правил оценивалась методом скользящего экзамена.

На основании ROC-анализа, проведенного с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS 22, определена чувствительность правила, которая составила 96,7%, специфичность соответственно 96,2% (Фиг. 1).

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом. Проводят определение уровня экспрессии микроРНК-126, микроРНК-451, микроРНК-125b в образцах ткани плаценты, при этом последовательно проводят депарафинизацию фрагмента ткани плаценты, экстракцию РНК, реакцию обратной транскрипции и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени.

Депарафинизацию плацентарной ткани проводят с использованием минерального масла: в полуторамиллилитровую пробирку с двумя парафиновыми срезами толщиной 5 мкм добавляют 1 мл минерального масла и тщательно перемешивают в течение 10 секунд. Затем пробирки в течение 2 минут инкубируют в термошейкере при температуре 65°С и частотой вращения 1300 об/мин и центрифугируют при 13000-15000 оборотах в течение 4 минут. После удаления надосадочной жидкости в осадок добавляют по 1 мл 96% этанола и снова перемешивют в течение 10 секунд, затем центрифугируют в тех же условиях, что и предыдущий раз. После чего вновь удаляют надосадочную жидкость, вносят в осадок 1 мл 70% этанола и центрифугировали при 13000-15000 оборотах в течение 2 минут. Из полученной депарафинизированной ткани плаценты в дальнейшем выделяют нуклеиновые кислоты с использованием набора реагентов «РеалБест экстракция 100» (АО «Вектор-Бест», Россия). К образцам добавляют 700 мкл лизирующего раствора, тщательно перемешивают в термошейкере TS-20 (Biosan, Latvijas Republika) при температуре 90°С в течение 60 минут на 1300 об/мин. Затем пробирки помещают в центрифугу (ротор угловой F-45-12-11 MiniSpin Eppendorf, Germany) на 2 минуты при 15000 об/мин. В новые пробирки переносят 600 мкл супернатанта, добавляют еще 600 мкл изопропанола и 10 мкл суспензии магнитных частиц. Затем перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут. После этого пробирки центрифугируют при 13000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сливают, а осадок промывают сначала 500 мкл 70% этанола, а затем - 300 мкл ацетона. Выделенный осадок высушивают и растворяют в 300 мкл элюирующего раствора, далее пробирки помещают в термошейкер и инкубируют в течение 5 минут при температуре 65°C с частотой вращения 1300 об/мин. Затем пробирки центрифугируют при 13000-15000 об/мин в течение 1 минуты. Концентрация РНК определяют на спектрофотометре NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, USA). Концентрация РНК выделенных препаратов находилась в диапазоне 75,6-123,6 нг/мкл.

Для получения комплементарной ДНК проводят реакцию обратной транскрипции в пробирках объемом 30 мкл с помощью готовых реакционных смесей «РеалБест Мастер микс ОТ» (АО «Вектор-Бест», Россия). Смешивают 3 мкл выделенной ранее РНК, 25,5 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции, 1,5 мкл 10 мкМ раствора соответствующего праймера для обратной транскрипции определенной РНК. Реакционную смесь в объеме 3 мкл используют в качестве матрицы для проведения Real-time PCR на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad, USA) с целью измерения уровней экспрессии микроРНК.

В пробирки объемом 30 мкл последовательно вносят 3 мкл полученной комплементарной ДНК, 14 мкл H2O, 3 мкл 10х буфера для ПЦР, 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10% раствора BSA, 1 мкл Taq-полимеразы в комплексе с моноклональными антителами к ее активному центру (Clontech, USA), 3 мкл раствора прямого и обратного праймеров (5 мкМ) и зонда (2,5 мкМ). Системы праймеров и зондов разработаны компанией АО «Вектор-Бест» (Россия), эффективность реакции составляет 90-100%. Анализ полученных данных пороговых циклов ПЦР в реальном времени проводят 2(-ΔCt) методом. Выбор референсного гена осуществляют при помощи алгоритма geNorm, позволяющего выявить наиболее стабильные гены в исследуемой выборке. При этом в качестве референсного гена используют среднее геометрическое как минимум трех самых стабильных генов.

Полученные результаты анализируют с вычислением индекса d по формуле:

где:

d - индекс эпигенетического программирования антенатальной смерти плода на доношенном сроке беременности; уровень экспрессии микроРНК-126, нг/мкл; уровень экспрессии микроРНК-451, нг/мкл; уровень экспрессии микроРНК-125b, нг/мкл;

11,318 - постоянная величина.

Принятие решения осуществляется следующим образом: при d > 0 определяют вероятность антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности.

Клинический пример 1.

Пациентка П., 31 года, первобеременная. Соматический анамнез не отягощен.

Течение настоящей беременности осложнилось развитием умеренной преэклампсии на сроке беременности 38 недель, зарегистрировано повышение АД 140и90 мм рт.ст., суточная протеинурия - 0,3 г/л. Назначена антигипертензивная терапия, начата подготовка шейки матки антипрогестинами. Состояние плода по данным КТГ, допплерометрии было компенсировано. В течение суток зарегистрирована антенатальная смерть доношенного плода.

При проведении патологоанатомического исследования последа были выявлены изменения, характерные для доношенного срока беременности, при этом непосредственной причины смерти плода выявлено не было. В связи с чем было проведено молекулярно-биологическое исследование плаценты с определением уровней экспрессии микроРНК-126, - 451 и 125b.

По формуле определен индекс d:

d = 2,02

Учитывая, что d > 0, то есть вероятность антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности.

Клинический пример 2.

Пациентка С., повторнородящая 34 лет. Акушерский анамнез: предстоят II роды от II беременности. Первые роды завершились самопроизвольными своевременными родами, без осложнений. Соматический анамнез отягощен, ожирением I степени, хроническим пиелонефритом в ремиссии.

Течение настоящей беременности осложнилось плацентарной недостаточностью (нарушение маточно-плодового кровотока II степени), зарегистрированной во время проведения II ультразвукового скрининга на сроке 20 недель беременности. При допплерометрии в динамике наблюдалось нарушение маточно-плодового кровотока IA-IБ степени. На сроке беременности 38 недель пациентка доставлена в стационар бригадой скорой медицинской помощи в связи с отсутствием шевеления плода в течение 6 часов. При поступлении зафиксирована антенатальная смерть плода.

Проведение патологоанатомического исследования последа не выявило каких-либо характерных гистологических изменений, в связи с чем дополнительно было проведено молекулярно-биологическое исследование плаценты с определением уровней экспрессии микроРНК-126, -451 и 125b.

По формуле определен индекс d:

d= -5,3×3,18-0,5×6,91-5,387×2,691+11,318

d = -23,4

Учитывая, что d > 0, то нет вероятности антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности.

Claims (9)

1. Способ определения вероятности антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности, включающий определение уровня экспрессии микроРНК-126, микроРНК-451, микроРНК-125b в образцах ткани плаценты с последующим вычислением индекса d по формуле:
2. d = -5,3 × x₁ – 0,5 × x₂ - 5,387 × x₃ + 11,318,
3. где:
4. d - вероятность наступления смерти доношенного плода по неуточненной причине;
5. x₁ – уровень экспрессии микроРНК-126, нг/мкл;
6. x₂ – уровень экспрессии микроРНК-451, нг/мкл;
7. x₃ – уровень экспрессии микроРНК-125b, нг/мкл;
8. 11,318 - постоянная величина,
9. при d > 0 определяют вероятность антенатальной смерти плода по неуточненной причине на сроке доношенной беременности.