RU2845571C1

RU2845571C1 - Вакцина на основе аденоассоциированного вектора 9 типа, кодирующего спайк-белок, для профилактики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2

Info

Publication number: RU2845571C1
Application number: RU2024131226A
Authority: RU
Inventors: Мария Евгеньевна Фролова; Анна Владимировна Вахрушева; Артур Александрович Исаев
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Свифтген"
Filing date: 2024-10-17
Publication date: 2025-08-21

Abstract

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине. Описана генетическая конструкция для экспрессии в клетках человека или животного полинуклеотида, кодирующего полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, содержащий мутации: частичная делеция фуринового сайта RRAR с удалением всех входящих в сайт аргининов (R), а также мутации K986Р, V987Р и D614G. Конструкция представлена аденоассоциированным вирусом AAV9, в который клонирован указанный полинуклеотид. Описан рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор AAV9, обеспечивающий экспрессию в клетках человека или животного полинуклеотида, кодирующего полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, имеющий генетическую конструкцию. Представлено применение генетической конструкции или рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора AAV9 для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2. Разработанная генетическая конструкция и вакцина на её основе расширяет арсенал средств для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и может быть использована для эффективной стимуляции гуморального и клеточного ответа с целью профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 16 ил., 6 табл., 5 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для создания вакцины с целью профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-COV-2.

Предшествующий уровень техники

Аденоассоциированные вектора являются наиболее популярным методом генной терапии и доставки терапевтических антител, благодаря их относительно низкой иммуногенности, высокому профилю безопасности, широкому тропизму и тенденции поддерживать долгосрочную экспрессию таргетных генов. В основном, аденоассоциированные вектора используются для лечения глазных и мышечных заболеваний, тем не менее, в последние годы растёт число исследований, в которых данный тип векторов используют в качестве основы для вакцинных препаратов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ, ВПЧ и грипп. Ряд исследований указывают на то, что векторные вакцины на основе аденоассоциированных вирусов могут индуцировать высокий уровень и длительную персистенцию антител уже после однократного введения и без необходимости использования адъюванта [1].

Опубликованы результаты исследований, демонстрирующих высокую иммуногенность и защитную эффективность аденоассоциированных векторов, кодирующих фрагмент RBD вируса SARS-CoV-2 при внутримышечном и интраназальном введении мышам [2]-[4], а также длительное сохранение антител в крови иммунизированных животных на модели макак [5]. Проводятся клинические исследования 1-2 фазы аденоассоциированного вектора 5 типа, кодирующего фрагмент RBD вируса SARS-CoV-2 [6].

Несмотря на формирование популяционного иммунитета благодаря проведённой массовой вакцинации и естественного инфицирования, а также быструю диагностику и имеющиеся подходы к лечению, вирус SARS-CoV-2 продолжает циркулировать во всех странах мира, и он по-прежнему может являться причиной смерти людей с ослабленным здоровьем. Поэтому поиск альтернативных вариантов надёжной, долгосрочной и безопасной профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-COV-2, остаётся актуальной задачей, и использование аденоассоциированных векторов в качестве основы для создания вакцины является перспективным направлением.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка вакцины на основе аденоассоциированного вируса 9 типа для стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа с целью профилактики коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2.

Для решения поставленной задачи разработана генетическая конструкция для экспрессии в клетках целевого организма полинуклеотида, кодирующего полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, содержащий делецию в фуриновом сайте RRAR682A, а также мутации KV986PP и D614G, и характеризующаяся тем, что представлена аденоассоциированным вирусом AAV9, в который клонирован полинуклеотид.

В некоторых вариантах изобретения полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2 включает дополнительные мутации, присущие конкретному варианту вируса. В частных вариантах изобретения вариант вируса SARS-CoV-2 представляет собой Альфа-вариант, Бета-вариант, Дельта-вариант или Омикрон-вариант, но не ограничиваясь ими.

В некоторых частных вариантах изобретения полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2 имеет последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 6.

В некоторых частных вариантах полинуклеотид, кодирующий полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, представлен последовательностью SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 11.

Решение поставленной задачи также достигается в результате разработки рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора AAV9, способного экспрессировать в клетках человека или животного полинуклеотид, кодирующий полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, как описано выше.

В некоторых вариантах изобретения рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор AAV9 представлен последовательностью SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16.

Поставленная задача также решается путём разработки вакцины для профилактики коронавирусной инфекции у человека или животного, содержащей по меньшей мере одну генетическую конструкцию, как описано выше, в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также фармацевтически приемлемый носитель и буферный раствор.

Задача также решается путём применения разработанного рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора AAV9 (разработанной вакцины) для индукции (активации) иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и использования в качестве вакцинного препарата для иммунизации против различных вариантов штаммов вируса SARS-CoV-2, в том числе новых штаммов.

В рамках решения поставленной задачи также предлагается способ профилактики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 путём внутримышечного введения разработанной вакцины субъекту, нуждающемуся в защите от инфекции в эффективной дозе.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:

- разработанная генетическая конструкция и вакцина на её основе расширяет арсенал средств для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и может быть использована для эффективной стимуляции гуморального и клеточного ответа с целью профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2;

- благодаря введённым мутациям, направленным на исключение инфекционности и придания стабильности экспрессируемого антигена, обеспечивающим безопасность и эффективность предлагаемой конструкции, а также благодаря возможности использования конструкций, содержащих дополнительные мутации, присущие различным вариантам вируса SARS-CoV-2, разработанная генетическая конструкция является универсальной основой для разработки вакцин с целью иммунизации против различных вариантов штаммов вируса SARS-CoV-2, в том числе новых штаммов;

- использование в конструкции разработанной вакцины аденоассоциированного вектора 9 типа (AAV9), в совокупности с другими особенностями генетической конструкции, обеспечивает продолжительность экспрессии конструкции в течение более 24 недель после одной инъекции, высокую эффективность трансдукции в мышцах, безопасность, обеспечиваемую локальной продукцией антигена в месте введения, масштабируемость производства, что позволяет использовать разработанную генетическую конструкцию для производства однокомпонентной вакцины для внутримышечного введения.

Краткое описание рисунков

Фиг.1 А - Д - Графическое изображение разработанных конструкций.

Фиг.2 А - Е - Генетические карты разработанных плазмид pAAV-SARS1 - pAAV-SARS5 и pAAV-Luc-control (pAAV-Luc).

Фиг.3 - Генетические карты разработанных плазмид pAAV-SARS1 - pAAV-SARS5 и pAAV-Luc-control по результатам рестрикции: показано схематичное расположение фрагментов плазмид после аналитической рестрикции (Теоретическая карта) и результат проведённого рестрикционного гидролиза полученных плазмид (Результат рестрикции). Карта составлена в программе Benchling, схема длин рестрикционных фрагментов - в программе SerialCloner.

Фиг.4 - Результаты дот-блот анализа лизатов трансдуцированных клеток. Цифрами обозначены: 1-5 - клетки, трансдуцированные векторами rAAV9-SARS1 - rAAV9-SARS5 соответственно; 6 - отрицательный контроль (нетрансдуцированные клетки); 7-9 - положительный контроль (клетки, заражённые коронавирусом линии В.1, коронавирусом линии Дельта B.1.617.3 или коронавирусом линии «русская Дельта» AY.122 соответственно).

Фиг.5 - Динамика массы мышей после иммунизации экспериментальными аденоассоциированными векторами. На графике представлено изменение массы тела мышей в % относительно исходной, приведены средние значения по группе и стандартное отклонение (см. Пример 5).

Фиг.6 - Динамика нейтрализующих антител к варианту Дельта вируса SARS-CoV-2 в сыворотках иммунизированных мышей (см. Пример 5). Точками представлены индивидуальные значения для каждого животного, столбцами представлены средние геометрические титры по группам.

Фиг.7 - Динамика вирус-специфических IgG антител к варианту Дельта вируса SARS-CoV-2 в сыворотках иммунизированных мышей (см. Пример 5). Точками представлены индивидуальные значения для каждого животного, столбцами представлены средние геометрические титры по группам.

Фиг.8 - Срезы лёгкого (А), сердца (Б), печени (В) и почки (Г) мышей 3.11 и 3.12 (см. Пример 6). Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. ×100.

Фиг.9 - Поперечный срез скелетных мышц мышей 3.11 (А, В) и 3.12 (Б), полученный через 24 недели с момента введения векторной вакцины (см. Пример 6). Окраска: гематоксилин и эозин. А, Б - ув. ×100; В - ув. ×400.

Фиг.10. - Иммунофлюоресцентная детекция S-белка: (А) - положительный контроль, (Б) - отрицательный контроль, (В) - опытная группа (см. Пример 6). S-белок обозначен красным, autofluor - зелёным, ядро окрашено DAPI - синим.

Фиг.11 - Динамика массы мышей после иммунизации экспериментальными аденоассоциированными векторами. На графике представлено изменение массы тела мышей в % относительно исходной, приведены средние значения по группе и стандартное отклонение (см. Пример 7).

Фиг.12 - Динамика нейтрализующих антител к варианту Бета вируса SARS-CoV-2 в сыворотках мышей, иммунизированных вакцинами rAAV9-SARS2, rAAV9-SARS3 или rAAV9-SARS4 (см. Пример 7). Точками представлены индивидуальные значения для каждого животного, столбцами представлены средние геометрические титры по группам. **** р < 0.0001, статистически значимое изменение титра между точками 4 и 12 недель (ANOVA, попарный тест Тьюки).

Фиг.13 - Динамика вирус-специфических IgG антител к коронавирусу варианта Бета в сыворотках иммунизированных мышей (см. Пример 7). Точками представлены индивидуальные значения для каждого животного, столбцами представлены средние геометрические титры по группам. **** р < 0.0001, статистически значимое изменение титра между точками 4 и 12 недель, ns - not significant (не значимо) (ANOVA, попарный тест Тьюки).

Фиг.14 - Динамика вирус-специфических IgG антител к капсидному белку AAV9 в сыворотках иммунизированных мышей (см. Пример 7). Точками представлены индивидуальные значения для каждого животного, столбцами представлены средние геометрические титры по группам. ** р < 0.01, статистически значимое изменение титра между точками 4 и 12 недель, ns - not significant (ANOVA, попарный тест Тьюки).

Фиг.15 - Совокупная антиген-специфическая продукция цитокинов CD4+ и CD8+ эффекторными Т-клетками памяти в ответ на иммунизацию исследуемыми препаратами. На графиках представлены индивидуальные значения совокупной доли цитокин-продуцирующих Т-лимфоцитов от общего числа эффекторных CD4+ (A) и CD8+ (Б) Т-клеток (CD4/8+CD44+CD62L-) при стимуляции PepTivator S. Группы сравнивали при помощи однофакторного ANOVA с последующим сравнением исследуемых групп с группой интактных животных с использованием теста Даннета, * p <0,05, ** р <0,001; *** р <0.0001; ns p >0.05.

Фиг.16 - Субпопуляционный состав цитокинпродуцирующих CD4+ и CD8+ Tem в селезёнках мышей в ответ на иммунизацию исследуемыми препаратами. На графиках представлены данные, отражающие процент различных субпопуляций CD4+ и CD8+ клеток, продуцирующих цитокины, в общей популяции CD4/8+CD44+CD62L-Tem. Группы сравнивали с использованием ANOVA с последующим попарным сравнением при помощи теста Тьюки. *: р<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001.

Термины и определения

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известных специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Термины «целевой организм» («субъект») и «пациент» подразумевают человека или животного (млекопитающего), подверженного инфицированию вирусом SARS-CoV-2.

Термины «лечение», «терапия» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения (облегчение тяжести заболевания). В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.

Термин «профилактика», «предотвращение» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у пациента, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Первичная профилактика определяется как профилактический приём композиции у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

«Вакцина» («вакцинная композиция») по изобретению содержит разработанную в рамках изобретения генетическую конструкцию в качестве активного агента в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор. Фармацевтически приемлемые носители и буферные растворы хорошо известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных руководствах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Номера последовательностей нуклеотидов и аминокислот, упоминаемых в настоящей заявке, соответствуют номеру в Перечне последовательностей (SEQ ID NO) согласно Стандарту ST.26, являющемуся частью настоящего описания изобретения. В случае наличия разночтений в структуре последовательностей между упоминанием в тексте описания и соответствующей последовательностью в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, приоритетными являются данные, приведённые в тексте описания.

Подробное описание изобретения и его осуществления

В рамках осуществления изобретения разработаны рекомбинантные аденоассоциированные вектора, способные продуцировать в клетках человека и млекопитающих антигены, в ответ на которые формируется защитный иммунитет против вируса SARS-CoV-2, и которые таким образом могут быть использованы в качестве векторной вакцины для профилактики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. За счёт того, что действующим началом вакцины является именно генетическая конструкция, с которой осуществляется синтез антигена, а также благодаря особенностям разработанной генетической конструкции, использование разработанной вакцины позволяет получить профиль иммунного ответа, включающий как цитотоксический, так и антительный иммунный ответ, с формированием иммунологической памяти.

Для осуществления настоящего изобретения на первом этапе были разработаны варианты конструкций антигена. За основу конструкции был взят S-белок (Spike, спайк-белок) вируса SARS-CoV-2. При этом, с целью повышения стабильности экспрессируемого антигена, в его конструкцию были внесены направленные мутации. Как известно, S-белок вируса SARS-CoV-2 содержит сайт расщепления (так называемый фуриновый сайт), узнаваемый клеточной протеазой фурином, расположенный на стыке субъединиц S1 и S2 и представленный аминокислотами RRAR, (соответствующих положениям 682-685 последовательности SEQ ID NO: 1 S-белка вируса SARS-CoV-2 штамма Wuhan (Ухань)). Расщепление S-белка фурином активирует вирус в процессе его взаимодействия с клеткой. Установлено, что отсутствие сайта расщепления значительно ограничивает распространение вируса в организме, поэтому известно множество вариантов направленных мутаций этого сайта, целью которых является его инактивация для расщепления фурином (см., например [7], [8]). Большинство таких направленных мутаций представляет собой частичную или полную замену аминокислот RRAR, некоторые варианты также предлагают полную делецию сайта расщепления. В рамках настоящего изобретения предлагается использование частичной делеции сайта расщепления, а именно удаление всех входящих в сайт аргининов. Таким образом, конструкция по изобретению содержит мутацию в фуриновом сайте RRAR682A. Благодаря наличию такой направленной мутации, повышается стабильность антигена, экспрессируемого в результате проведения иммунизации, а также сохраняются важные антигенные детерминанты для формирования гуморального иммунитета.,

С целью придания антигену стабильности, в его конструкцию была также внесена направленная мутация, состоящая в замене аминокислот в положениях 986 и 987 SEQ ID NO: 1 на пролин - KV986PP (так называемая двойная мутация на пролин), широко используемая в стратегии стабилизации S-белка при разработке вакцин (см., например, [9]). Ещё одна направленная мутация представляет собой мутацию D614G, для многих штаммов являющуюся природной [10], но придающую антигену дополнительную стабильность. Благодаря наличию в разработанной конструкции нескольких мутаций, обеспечивающих стабильность, экспрессируемый в результате вакцинации антиген обладает повышенной стабильностью.

В рамках разработки вакцины были исследованы как полноразмерные сконструированные S-белки различных штаммов вируса SARS-CoV-2 (т.е. белок, состоящий из 1270 аминокислотных остатков), так и усечённые варианты S-белка, такие как только субъединица S1 (аминокислотные остатки 14-685) и рецептор-связывающий домен, RBD-белок (аминокислотные остатки 319-541). Графическое изображение разработанных конструкций антигена приведено на Фиг.1.

Как показали проведённые эксперименты (см. подробнее в разделе Примеры), несмотря на то, что использование субъединицы S1 и рецептор-связывающего домена RBD показало свою эффективность в ранее разработанных вакцинах другого типа против вируса SARS-CoV-2, эти конструкции неожиданно оказались недостаточно эффективными в разрабатываемых векторных вакцинах.

Как известно, различные штаммы (варианты) вируса SARS-CoV-2 отличаются друг от друга наличием мутаций, в том числе в структуре S-белка. Специалисту в данной области понятно, что при производстве вакцины по изобретению могут быть использованы различные штаммы (варианты) вируса SARS-CoV-2, что будет определять эффективность вакцинопрофилактики против конкретного штамма (варианта), но не влияет на подход к конструированию генетической конструкции на основе аденоассоциированного вируса по изобретению. В ходе разработки вакцины были проанализированы конструкции, содержащие мутации, характерные для различных вариантов вируса SARS-CoV-2, такие как штамм Wuhan (Ухань), Бета-вариант и Дельта-вариант. Проведённый анализ показал, что эффективность иммунизации не зависит от наличия в конструкции мутаций, присущих конкретному варианту вируса. Таким образом, предлагаемый подход к конструированию может быть использован при разработке вакцины против вируса SARS-CoV-2 различных штаммов (вариантов), таких как например известные варианты (Альфа-вариант, Бета-вариант, Дельта-вариант, Омикрон-вариант и др.) или потенциально новые штаммы (варианты) вируса SARS-CoV-2.

В качестве вектора при разработке вакцины был использован аденоассоциированный вирус 9 серотипа (AAV9, ААВ9), имеющий высокую тропность к мышцам и хорошую масштабируемость при производстве [11].

Получение препаратов на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) осуществляют с помощью методов, основанных на временной (транзиентной) трансфекции клеток. Такие методы обеспечивают наибольший выход продукта, а также позволяют получить безопасный и эффективный препарат rAAV, экспрессирующий трансген [12]. Данный метод включает трансфекцию клеток HEK293 двумя или тремя плазмидами (образующими так называемую плазмидную систему): первая кодирует целевой ген, вторая несёт гены rep и cap AAV, третья содержит гены-помощники адено- или герпесвирусов. Производство AAV может осуществляться в больших масштабах с помощью ряда производственных методов, которые хорошо зарекомендовали себя в отрасли для производства десятков продуктов, которые в настоящее время находятся в клинической разработке и доступны на коммерческой основе [13], [14].

Для осуществления настоящего изобретения были получены плазмидные системы, необходимые для сборки rAAV согласно разработанным вариантам конструкций антигена, включающие плазмиды: плазмиду, кодирующую целевой ген (выбранные из pAAV-SARS1 - pAAV-SARS5), плазмиду pAAV-RC2/9 (несущую ген rep серотипа AAV2 и ген cap серотипа AAV9) и плазмиду pHelper. Необходимые рекомбинантные плазмиды получали в препаративных количествах путём трансформации клеток E. coli штамма Stbl3. Специалистам в данной области известно, что для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора можно использовать любые другие плазмидные системы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген по изобретению.

Далее для получения вектора rAAB9, экспрессирующего антиген вируса SARS-CoV-2 по изобретению, полученными плазмидами трансфецировали клетки линии HEK293T, в которых происходила продукция и сборка рекомбинантного аденоассоциированного вируса, несущего мутированный ген полноразмерного S-белка вируса SARS-CoV-2, согласно различным вариантам конструкции по изобретению. Очистку рекомбинантного аденоассоциированного вируса осуществляли при помощи тангенциальной фильтрации и аффинной хроматографии. Специалистам в данной области понятно, что в целях осуществления настоящего изобретения для продукции и сборки рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.

Специалистам также понятно, что полученные генетические конструкции включают, помимо полинуклеотида, кодирующего антиген вируса SARS-CoV-2, все необходимые элементы, позволяющие реализовать указанное назначение - осуществить экспрессию полинуклеотида в целевых клетках.

Подробная информация о получении вакцины на основе аденоассоциированного вектора 9 серотипа, кодирующего S-белок, для профилактики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2, приведена в нижеследующих подробных примерах.

Следует понимать, что приведённые в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Дизайн конструкции антигена

В качестве антигенов для вакцины были сконструированы следующие варианты конструкций:

1) Полноразмерный S-белок штамма Ухань, содержащий делецию в фуриновом сайте RRAR682A и мутации на пролин в аминокислотах KV986PP, а также мутацию D614G (см. последовательность SEQ ID NO: 2 и Фиг.1А);

2) Полноразмерный S-белок, содержащий делецию в фуриновом сайте RRAR682A и мутации на пролин в аминокислотах KV986PP, а также мутацию D614G и две дополнительные мутации в RBD-домене, характерные для Бета-варианта вируса SARS-CoV-2 (см. последовательность SEQ ID NO: 3 и Фиг.1Б);

3) Субъединица S1 S-белка, содержащая мутацию D614G, а также две дополнительные мутации в RBD-домене, характерные для Бета-варианта вируса SARS-CoV-2 (см. последовательность SEQ ID NO: 4 и Фиг.1В);

4) RBD-белок, содержащий мутацию D614G, а также две дополнительные мутации в RBD-домене, характерные для Бета-варианта (см. последовательность SEQ ID NO: 5 и Фиг.1Г);

5) Полноразмерный S-белок, содержащий делецию в фуриновом сайте RRAR682A и мутации на пролин в аминокислотах KV986PP, а также мутацию D614G, и три дополнительные мутации в RBD-домене, характерные для Дельта-варианта вируса SARS-CoV-2 (K417N, L452R, T478K) (см. последовательность SEQ ID NO: 6 и Фиг.1Д).

После разработки конструкций антигенов были синтезированы кодирующие их нуклеотидные последовательности (SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 11 соответственно), которые в дальнейшем были использованы для получения целевых плазмид.

Пример 2. Получение плазмидных конструкций

Для получения целевых плазмид pAAV-SARS1 - pAAV-SARS5, а также контрольной плазмиды pAAV-Luc-control был использован метод безлигазного клонирования. Для этого были использованы праймеры с перекрывающимися последовательностями, как указано в Таблице 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров для клонирования

Название конструкции	Название праймера	Последовательность праймеров 5’-3’	SEQ ID NO:
pAAV-SARS1- pAAV-SARS4	Var1F	agacgctagactagcatgcgactcttcgcgatgtacgggccag	17
	Var1R	caattgttgttgttttgctgtccataaaaccgcccagtagaag	18
	VecVar1F	tatggacagcaaaacaacaacaattggatctgcgctgattttgt	19
	VecVar1R	gtcgcatgctagtctagcgtctaaacgcgt	20
pAAV-SARS5	Var5F	ATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGg	21
pAAV-SARS5	Var5VecR	CCCTGCTTGCCTTCCAGGTCCATC	22
pAAV-Luc-control	LucF	ctgGCTAGCCGCCACCatggaagacgccaaaaacataaagaaagg	23
	LucVecR	GGTGGCGGCTAGCcagcttg	24
	LucVecF	tgtaagggcccgtttaaacccg	25
	LucR	cgggtttaaacgggcccttacacggcgatctttccgcc	26

Для клонирования кодирующих последовательностей использовали конструкцию pAAV-CMV в качестве вектора. Вставки амплифицировали из плазмид pVax1-Var1-5. Карты полученных плазмид pAAV-SARS1 - pAAV-SARS5 и контрольной плазмиды pAAV-Luc-control представлены на Фиг.2.

Полученные конструкции трансфецировали в клетки E. coli, штамма Stbl3. Для трансфекции на чашках Петри (150 см²) использовали посевную плотность 50000 клеток/см². Рост клеток до трансфекции на чашках занимал 48 часов. Состав среды для культивирования: DMEM c добавлением 4,5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, стрептомицина, пенициллина и заменимых аминокислот. За 3 часа до добавления трансфецирующей смеси среду полностью заменяли на обеднённую. На контрольной чашке Петри контролировали морфологию и конфлюентность клеточной культуры. На момент трансфекции плотность клеточной культуры не превышала 75-80%. Для трансфекции на чашке объём среды на время трансфекции составлял 20 мл. Далее проводили отбор клонов-трансформантов на селективной питательной среде и культивирование отобранного клона с получением препаративных количеств плазмид, несущих целевые гены. После лизирования клеток плазмиды выделяли с использованием хроматографической очистки.

Для проверки полученных плазмид проводили рестрикционный гидролиз с использованием специфических эндонуклеаз рестрикции. Генетическая карта полученных плазмид - схематичное расположение фрагментов плазмиды после аналитической рестрикции и результат проведённого рестрикционного гидролиза полученных плазмид - приведена на Фиг.3. Карта составлена в программе Benchling, схема длин рестрикционных фрагментов - в программе SerialCloner. Как показал проведённый анализ, все полученные в результате рестрикционного гидролиза фрагменты полностью соответствуют теоретически расчётным. Проверку плазмид проводили также секвенированием по Сэнгеру.

Пример 3. Продукция rAAV в культуре клеток линии HEK293T

Для получения генетических конструкций, необходимых для сборки и продукции рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора был использован метод транзиентной трансфекции клеток HEK293T. Для этого были использованы плазмидные системы, необходимые для сборки rAAV согласно разработанным вариантам конструкций антигена, и включающие плазмиды: (1) плазмида, несущая целевой ген, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 11 (соответственно, плазмида, выбранная из pAAV-SARS1 - pAAV-SARS5) (или pAAV-Luc-control - для контрольного вектора), полученные как описано в Примере 2; (2) плазмида pAAV-RC2/9 (несущая ген rep серотипа AAV2 и ген cap серотипа AAV9); и (3) плазмида pHelper.

При проведении транзиентной трансфекции клеток HEK293T готовили смесь трёх плазмид в среде DMEM в следующих количествах: (1) целевая (0,056 мкг/см²), (2) pAAV-RC2/9 (0,055 мкг/см²) и (3) pHelper (0,089 мкг/см²) в среде для трансфекции общим объемом 200 мл (0,005 мл/см²) с получением смеси “ДНК/DMEM”. В качестве трансфецирующего реагента использовали линейный полиэтиленимин (ЛПЭИ) 25 кДа. Смеси “ДНК/DMEM” и “ЛПЭИ/DMEM” смешивали в стерильных условиях и тщательно перемешивали в течение 1 минуты. Готовую смесь инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Для трансфекции на чашках Петри объём смеси “ЛПЭИ/DMEM” и смеси “ДНК/DMEM” составлял 1,5 мл для каждой чашки, готовили премикс в 50 мл пробирках на 10 чашек. Для трансфекции на чашках Петри объём среды не изменялся, к 20 мл среды добавляли 3 мл трансфекционной смеси покапельно и распределяли покачиванием.

Через 72 часа после трансфекции непосредственно к суспензии клеток добавляли 0,5% Тритон Х-100. Собирали асептически в стеклянную бутыль. Лизат центрифугировали в 0,25 л стаканах при 3000 g, 10 мин, +4°С. Отбирали осветлённый лизат (полупродукт), забирали образцы для количественной оценки (50 мкл) и замораживали при -20°С. Контроль вирусной продукции проводили путём оценки титра вируса rAAV в лизате методом количественной ПЦР в реальном времени. Приемлемым считали результат более 5Е+11 геномных копий в 1 мл.

Выделение вирусных частиц проводили методом ультрацентрифугирования в градиенте йодиксанола. Для этого в пробирки Ultra-clear 16x76mm (Beckman Coulter) для ротора 70Ti наслаивали поочерёдно: 2 мл фракция “60%” (58,6% йодиксанола), 2 мл фракция “40%” (40% йодиксанола), 2,75 мл фракция “25%” (25% йодиксанола) и 4,5 мл полученного вирусного препарата. Центрифугирование проводили в градиенте плотности йодиксанола при 350000 g и +18°С в течение 1 часа на ультрацентрифуге Beckman Optima-XPN или Optima-XE. Далее собирали фракции 60%+½ 40%.

Образец диализировали в диализных мешках с размером пор 100 кДа (Spectrum, #0867140) против буфера 1xPBS/ 350 мМ NaCl / 0,001% Pluronic F-68 при температуре +4°С. В течение 14-18 ч производили от 2 до 3 смен буфера. При этом отслеживали, чтобы объём буфера для диализа минимум в 200 раз превышал объём образца. Концентрирование осуществляли на центрифужных концентраторах с размером пор 100 кДа до расчётной концентрации 3E+13 геномных копий в 1 мл. Полученный вирусный препарат стерилизовали через спин-колонки с размером пор 0,22 мкм и замораживали в буфере для хранения вирусных препаратов (1х PBS, 350мМ NaCl, 0,001% Pluronic F-68) в пробирках типа эппендорф по 0,5 мл. Концентрацию вирусов определяли количественной ПЦР в реальном времени с использованием зондов и праймеров к инвертированным повторам. В результате проведённого эксперимента были собраны и очищены рекомбинантные аденоассоциированные вирусные вектора rAAV9-SARS1 - rAAV9-SARS5, несущие целевые гены и имеющие последовательности, представленные SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 16 соответственно, пригодные для in vitro и in vivo тестов, с концентрацией 1х10¹² геномных копий в 1 мл каждого, а также контрольный люциферазный вектор rAAV9-Luc, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO: 27.

Пример 4. Исследование экспрессии таргетных белков (антигенов) экспериментальными аденоассоциированными векторами при трансдукции клеток in vitro

Экспрессию таргетных белков, включающих разные конструкции S-белка вируса SARS-CoV-2, оценивали путём трансдукции экспериментальными аденоассоциированными векторами rAAV9-SARS1 - rAAV9-SARS5 клеток HEK293T. После проведения трансдукции клетки лизировали, лизаты клеток наносили на мембрану и затем исследовали с использованием метода окрашивания RBD-специфическими антителами к домену RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 - XR-06, XR-25 (ООО «Хема») или их смесью. В качестве отрицательного контроля использовали нетрансдуцированные клетки HEK293T, а положительным контролем были клетки HEK293T, заражённые коронавирусом линии В.1, коронавирусом линии Дельта B.1.617.3 или коронавирусом линии «русская Дельта» AY.122.

Как показали результаты дот-блот анализа, все варианты экспериментальных аденоассоциированных векторов экспрессировали RBD-фрагмент, при этом уровень экспрессии различался и был наибольшим у вариантов rAAV9-SARS4 и rAAV9-SARS3 (см. Фиг.4).

Пример 5. Исследование экспрессии таргетного Spike-белка варианта SARS-CoV-2 Дельта экспериментальными аденоассоциированными векторами и их иммуногенности in vivo

Исследование проводили на мышах линии BALB/c, самки, возраст 6-8 недель. Мыши были получены из питомника «Столбовая» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России, Московская область. Все эксперименты с участием лабораторных животных были согласованы с комиссией по биоэтике ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, протокол № 55 от 04 апреля 2022.

Животных (всего 45 животных) после окончания карантина вакцинировали, вводя внутримышечно в заднюю лапу 100 мкл препарата. Группам №№1-3 вводили rAAV Дельта-варианта вируса SARS-CoV-2 (rAAV9-SARS5) в дозах 10⁹ геномных копий (ГК), 10¹⁰ ГК и 0.75*10¹¹ ГК, соответственно. Группе контроля (№4) вводили люциферазный вектор (rAAV9-Luc; Luc-контроль) в дозе 0.75*10¹¹ ГК. Группу №5 составляли интактные животные (см. Таблицу 2).

В течение 2х недель следили за массой тела и состоянием животных, проводя взвешивание 1 раз в 2-3 дня. Через 4, 12 и 24 недели у всех животных (живых на момент эксперимента) проводили прижизненный забор сыворотки крови для выявления вирус-специфических IgG антител и нейтрализующих антител.

Через 4, 12 и 24 недели у пяти животных из групп №3 (rAAV9-SARS5) и №4 (rAAV9-Luc), через 4 и 24 недели у пяти животных из группы 5 (интактные), проводили забор органов и тканей (сыворотка, лёгкие, печень, почки, мышцы, сердце) для выявления экспрессии таргетных белков. Органы от 2/5 животных после извлечения помещали в 10% формалин для передачи на гистологический анализ.

Таблица 2. Дизайн исследования in vivo

№ гр.	Препарат	Доза	Кол-во мышей	Наблюдения и манипуляции по дням
№ гр.	Препарат	Доза	Кол-во мышей	0	1-2 неделя	4 неделя	12 неделя	24 неделя
1	rAAV9-SARS5	10⁹ ГК	5	В, И (5)	В	С (5)	С (5)	С (5)
2	rAAV9-SARS5	10¹⁰ ГК	5	В, И (5)	В	С (5)	С (5)	С (5)
3	rAAV9-SARS5	0.75*10¹¹ ГК	15	В, И (15)	В	С (15), О (3+2)	С (10), О (3+2)	С (5), О (3+2)
4	rAAV9-Luc	0.75*10¹¹ ГК	15	В, И (15)	В	С (15), О (3+2)	С(10), О (3+2)	С (5), О (3+2)
5	Интакт-ные	-	10	В	В	С (10), O (3+2)	-	С (5), O (3+2)

Примечание: ГК - геномных копий, И - иммунизация, В - взвешивание (1 раз в 2-3 дня, 2 недели), С - забор сывороток, О - забор органов и тканей для ПЦР (3 животных) и ИГХ (2 животных). В скобках указано количество животных.

В течение 2х недель после иммунизации масса мышей стабильно возрастала (см. Фиг.5). Исключение составило кратковременное падение веса мышей в группе 3 (rAAV9-SARS5, максимальная доза), наблюдаемое в день 13. При этом у большинства мышей этой группы вес восстановился уже к 14 дню наблюдения.

Наличие вируснейтрализующих антител определяли в сыворотках животных методом классической РМН (реакции микронейтрализации) [15], [16] с использованием вируса SARS-CoV-2 варианта Дельта (штамм hCoV-19/Russia/SPE-RII-32759V3/2021, линия B.1.617.3, номер в базе данных GISAID: EPI_ISL_8112510) в дозе 100 ТЦИД50 на лунку (ТЦИД50 - тканевая цитопатическая инфекционная доза, при которой происходит 50% поражение). Нейтрализующим титром считали наибольшее разведение сыворотки, при котором в лунке полностью отсутствовали признаки ЦПД (цитопатического действия). Исследование антительного ответа у животных, привитых rAAV9-SARS5, показало, что у мышей формируются вируснейтрализующие антитела уже через 4 недели после иммунизации. Титры антител возрастают к 12 неделе после иммунизации и имеют чёткую дозозависимость (см. Фиг.6). Как видно на Фиг.6, в группе максимальной дозы (0.75*10¹¹ ГК/мышь) через 4 недели после иммунизации наблюдали формирование вируснейтрализующих антител у 85% животных, при более низких иммунизирующих дозах вируснейтрализующие антитела через 4 недели формировались только у 10-20% животных. Через 12 недель после иммунизации формирование вируснейтрализующих антител наблюдали у 100% животных из групп максимальной и средней дозы (10¹⁰ ГК/мышь), при этом в группе самой низкой дозы (10⁹ ГК/мышь) вируснейтрализующие антитела через 12 недель были обнаружены у 4/5 животных. Через 24 недели после иммунизации вируснейтрализующие антитела наблюдали у 100% привитых животных с чёткой дозозависимостью среднегеометрического титра (см. Таблицу 3).

Таблица 3. Средние геометрические значения титров антител в группах иммунизированных животных

	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 4	Группа 5
Точка	10⁹ ГК/мышь	10¹⁰ ГК/мышь	0,75х10¹¹ ГК/мышь	Luc-контроль	Интактные
Образование вируснейтрализующих антител
4 недели	6.6*	8.7	25*	5	5
12 недель	52.8**	279**	557**	5
24 недели	45.9***	80	422***	5	5
ИФА
4 недели	151****	696	1600****	66	76
12 недель	1838*****	6400*****	13719****	76
24 недели	919****	3200******	12800******	115	115

Примечание: Звёздочками показаны статистически значимые различия между соответствующими группами животных, получивших аденоассоциированные вектора в различных дозах: *p=0.0109; **p =0.0003; ***p=0.0074; ****р<0.0001; *****p=0.0312; ******p=0.264

Наличие вирус-специфических IgG антител определяли в ИФА с образцами цельных сывороток животных. В качестве антигена использовали препарат инактивированного очищенного в градиенте сахарозы вируса SARS-CoV-2 варианта Дельта.

Похожую динамику как в случае с вируснейтрализующими антителами наблюдали для вирус-специфических IgG антител, выявляемых в ИФА с цельным инактивированным вирусом SARS-CoV-2 в качестве антигена (см. Фиг.7). Поскольку, в отличие от реакции нейтрализации, ИФА обладает большей чувствительностью, титры антител и процент животных с вирус-специфическими антителами по данным ИФА были выше. Так, уже через 12 недель после иммунизации у 100% животных сформировались вирус-специфические IgG антитела.

Через 24 недели после иммунизации наблюдали падение среднегеометрического титра антител у иммунизированных животных по сравнению с точкой 12 недель, как по данным реакции нейтрализации, так и по данным ИФА.

Пример.6. Морфологическая и иммунофлюоресцентная характеристика тканей и органов и мышей после внутримышечного введения векторной вакцины, кодирующей Spike-белок вируса SARS-CoV-2

Для работы использовался материал, фиксированный в 10% забуференном формалине, полученный в эксперименте, описанном в Примере 5: исследованию подверглись ткани животных групп №3 (вакцинация rAAV9-SARS5 в дозе 0,75х10¹¹ ГК), №4 (иммунизация rAAV9-Luc) и №5 (интактные мыши). Подготовленный материал был распределен по группам, представленным в Таблице 4.

Таблица 4. Распределение образцов животных по группам

Группы	№	Срок	Органы
rAAV9-SARS5	3.1	4 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	3.2	4 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	3.7	12 недель	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	3.8	12 недель	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	3.11	24 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	3.12	24 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
rAAV9-Luc	4.1	4 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	4.2	4 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	4.7	12 недель	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	4.8	12 недель	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	4.11	24 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	4.12	24 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
Интактные	5.1	4 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	5.2	4 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	5.6	24 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки
	5.7	24 недели	Скелетные мышцы, сердце, лёгкие, печень, почки

Примечание: № - номер, присвоенный конкретному животному.

Фиксированный материал укладывали в гистологические кассеты, промывали в течение 30 минут в проточной воде. Затем кассеты обрабатывали в батарее спиртов и парафинов в соответствии с протоколом ручной проводки, по окончанию которой материал заливали в парафиновые блоки и микротомировали. Микротомия осуществлялась на санном микротоме ThermoFisher HM430 с получением срезов толщиной 3-5 мкм. Срезы переносились на предметные стекла (Biovitrum, Россия) c предварительно нанесённой на поверхность адгезивной жидкостью (Biovitrum, Россия). Срезы на предметных стеклах сушили в термостате при 37°С в течение 12 часов, после чего проводили их депарафинизацию, регидратацию с последующей окраской в растворе гематоксилина (Biovitrum, Россия), эозина (Biovitrum, Россия), дегидратацией, просветлением и заключением в монтирующую среду на основе полистерола под покровное стекло.

В качестве контроля использовали аутопсийный материал (лёгкие) пациентов, умерших от верифицированной инфекции SARS-CoV-2. Препараты изготавливали аналогичным образом, а также классическим иммуногистохимическим методом с докраской препаратов гематоксилином и изучением в «светлом поле».

Как показало гистохимическое исследование внутренних органов животных, включённых в эксперимент, в лёгких, сердце, печени и почках патологических изменений во всех группах животных и на всех временных точках от 4 до 24 недель не обнаружено. На Фиг.8 приведены срезы лёгкого (А), сердца (Б), печени (В), почки (Г) мышей 3.11 и 3.12 (животные из экспериментальной группы, 24 недели после введения вирусного вектора). Патологических изменений не выявлено.

Гистохимическое исследование области введения вакцины (скелетные мышцы) было проведено на материале, представленном поперечным сечением нескольких скелетных мышц. На 4й неделе исследования при использовании окраски гематоксилином и эозином на препарате у одного животного были выявлены как мышцы с множественными очагами эндомизиальной инфильтрации, так и интактные мышцы без признаков патологических процессов. Очаги эндомизиальной инфильтрации представляют собой скопления гистиоцитов и лимфоцитов вокруг жизнеспособного мышечного волокна с интернализованным ядром. Скелетные мышцы с признаками эндомизиального воспаления также характеризуются наличием выраженного регенераторного паттерна - высокой долей мышечных волокон с интернализованными ядрами (70-90%), округлой формой мышечных волокон и эндомизиальным липоматозом, что в значительно степени отличает их от интактных скелетных мышц этого же животного.

На 12й неделе в препаратах мыши 3.7 также определялись как мышцы с множественными очагами эндомизиальной инфильтрации, так и интактные. При этом характерно меньшее число очагов эндомизиальной инфильтрации, уменьшение их выраженности, снижение числа мышечных волокон с интернализованным ядром, снижение числа фокусов эндомизиального липоматоза. У мыши 3.8. очагов воспалительной инфильтрации обнаружено не было.

На 24й неделе в препаратах скелетных мышц мышей 3.11 и 3.12 отсутствуют признаки, наблюдаемые на более ранних сроках, резидуальные явления представлены единичными адипоцитами в эндо- и перимизии (см. Фиг.9А - единственный очаг воспаления, располагающийся вокруг артериолы, выявленный у мыши 3.11), а также одной периартериолярной лимфогистицитарной муфтой в препарате мыши 3.11 (см. Фиг.9Б - скелетная мышца мыши 3.12 без патологических изменений и Фиг.9В - периартериолярная муфта из лимфоцитов и гистиоцитов).

В препаратах скелетных мышц группы мышей №4 (иммунизация rAAV9-Luc) и №5 (интактные мыши) патологические изменения не были выявлены.

Таким образом, в мышцах мышей (3.1, 3.2, 3.7, 3.8, 3.11, 3.12), которым вводилась векторная вакцина, определяются множественные очаги эндомизиального воспаления, повреждение и гиперрегенераторный паттерн реактивных изменений мышцы - превалирование волокон с центральным расположением ядра на ранних сроках эксперимента (реакция на повреждение при остром воспалении), эндомизиальный липоматоз - замещение некротизированных мышечных волокон. Выраженность перечисленных признаков снижается с увеличением срока от момента введения векторной вакцины.

Признаки местного повреждения и воспаления не обнаружены в группах с введением вирусного вектора с люциферазой (№4) и группе интактного контроля (№5), что указывает на взаимосвязь обнаруженных реактивных изменений с введением векторной вакцины и свидетельствует о том, что введение вакцины приводит к синтезу протеина-иммуногена, который вызывает местные проявления проходящей воспалительной реакции.

Воспалительная реакция определялась только в зоне введения векторной вакцины - в скелетных мышцах, оставляя интактными соседние группы мышц. У всех животных всех групп патологических изменений внутренних органов выявлено не было, что позволяет утверждать об отсутствии диссеминации вирусного вектора за пределы вводимой зоны и развития каких-либо значимых и стойких осложнений, ассоциированных с использованием вакцины.

Иммунофлюоресцентная детекция наличия S-белка в тканях и органах мышей показала его присутствие у мышей опытной группы (см. Фиг.10В - скелетные мышцы мыши 3.1, выведенной из эксперимента на 4й неделе с момента введения вакцины), также как и в ткани положительного контроля (см. Фиг.10А - ткань лёгких пациента, умершего от верифицированной инфекции SARS-CoV-2), и отсутствие в группе отрицательного контроля (см. Фиг.10Б - скелетные мышцы мыши 5.6, которой вакцина не вводилась), что является прямым доказательством синтеза S-белка в результате введения векторной вакцины, кодирующей S-белок вируса SARS-CoV-2, по изобретению.

Пример 7. Исследование иммуногенности экспериментальных аденоассоциирован-ных векторов вариантов модификации Spike-белка 2, 3 и 4 in vivo

Исследование проводили на мышах линии BALB/c, самки, возраст 6-8 недель. Мыши были получены из питомника «Столбовая» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России, Московская область. Все эксперименты с участием лабораторных животных были согласованы с комиссией по биоэтике ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, протокол № 02 от 24 января 2023.

Животных (всего 50 животных) после окончания карантина иммунизировали, вводя внутримышечно в заднюю лапу 100 мкл препарата, содержащего 10¹⁰ или 10¹¹ ГК аденоассоциированных векторов в соответствии с дизайном исследования. Все животные были разделены на 7 групп (см. подробнее Таблицу 5):

1-2 - иммунизация с помощью вакцины rAAV9-SARS2 (Spike) в дозе 10¹⁰ или 10¹¹ ГК,

3-4 - иммунизация с помощью вакцины rAAV9-SARS3 (S1) в дозе 10¹⁰ или 10¹¹ ГК,

5-6 - иммунизация с помощью вакцины rAAV9-SARS4 (RBD) в дозе 10¹⁰ или 10¹¹ ГК,

7 - иммунизация не проводилась (интактные).

В течение 2х недель следили за массой тела и состоянием животных, проводя взвешивание 1 раз в 2-3 дня. Через 4 и 12 недель у всех животных проводили прижизненный забор сыворотки крови для выявления вирус специфических IgG антител и нейтрализующих антител.

Таблица 5. Дизайн исследования на лабораторных мышах

№ гр	Препарат	Доза	Кол-во мышей	Наблюдения и манипуляции по дням
№ гр	Препарат	Доза	Кол-во мышей	0	1-2 неделя	4 неделя	12 неделя
1	Spike	10¹¹ ГК	7	В, И (7)	В(7)	С(7)	С(7), Т(7)
2	Spike	10¹⁰ ГК	7	В, И (7)	В(7)	С(7)	С(7), Т(7)
3	S1	10¹¹ ГК	7	В, И (7)	В(7)	С(7)	С(7), Т(7)
4	S1	10¹⁰ ГК	7	В, И (7)	В(7)	С(7)	С(7), Т(7)
5	RBD	10¹¹ ГК	7	В, И (7)	В(7)	С(7)	С(7), Т(7)
6	RBD	10¹⁰ ГК	7	В, И (7)	В(7)	С(7)	С(7), Т(7)
7	Интактные	-	8	В (8)	В (8)	С (8)	С(8), Т(8)

Примечание: ГК - геномных копий, И - иммунизация, В - взвешивание (1 раз в 2-3 дня), С - забор сывороток, О - забор органов и тканей для ИГХ, Т - забор селезенок для Т-клеточного ответа. В скобках указано количество животных.

В течение 2х недель после иммунизации масса мышей колебалась в пределах ±5% от исходной. Исключение составило кратковременное падение веса у 3/7 мышей в группе 6 (RBD, доза 10¹⁰), наблюдаемое в дни 13, 14 (см. Фиг.11).

Наличие вируснейтрализующих антител определяли в сыворотках животных методом классической РМН [15], [16] с использованием вируса SARS-CoV-2 варианта Дельта (штамм hCoV-19/Russia/SPE-RII-27029V3/2021, линия B.1.617.3, номер в базе данных GISAID: EPI_ISL_8112507) в дозе 100 ТЦИД50 на лунку. Нейтрализующим титром считали наибольшее разведение сыворотки, при котором в лунке полностью отсутствовали признаки ЦПД. Исследование антительного ответа у привитых животных показало, что вируснейтрализующие антитела формируются только у мышей, привитых конструкцией rAAV9-SARS2 (Spike) в обеих дозах и у части мышей (2/7), привитых конструкцией rAAV9-SARS4 (RBD) в высокой дозе. У мышей, привитых конструкцией rAAV9-SARS3 (S1), вируснейтрализующие антитела не формируются. При этом титры антител у мышей, привитых конструкцией rAAV9-SARS2 (Spike), статистически значимо возрастали к 12й неделе после иммунизации и имели прямую дозозависимость (см. Фиг.12 и Таблицу 6).

Таблица 6. Средние геометрические значения титров антител в группах иммунизированных животных

Группа		Нейтрализация		ИФА_SARS-CoV-2		ИФА_AAV9
Группа		4 недели	12 недель	4 недели	12 недель	4 недели	12 недель
1	Spike 10¹¹	97.5*	640.0*	3901	28265	689*	312**
2	Spike 10¹⁰	5.0*	59.4*	181	4755	95*	78**
3	S1 10¹¹	5.0*	5.0*	221	362	689*	172*
4	S1 10¹⁰	5.0	5.0	100	110	14*	13*
5	RBD 10¹¹	6.7*	6.7*	221	328	464*	128*
6	RBD 10¹⁰	5.0	5.0	100	100	20*	32*
7	Интактные	5.0	5.0	100	100	8	8

Примечание: Звёздочками показаны избранные статистически значимые различия при сравнении доз: *p<0.0001; **p=0.0271;

Наличие вирус-специфических IgG антител определяли в ИФА с образцами цельных сывороток животных. В качестве антигена использовали препарат инактивированного очищенного в градиенте сахарозы вируса SARS-CoV-2 варианта Бета или очищенные капсиды аденоассоциированного вектора 9 типа (AAV9 empty capsid, Progen).

Инактивированный коронавирус сорбировали в концентрации 5 мкг/мл, очищенный AAV9 в концентрации 3*10⁸ капсидов/мл в PBS (Биолот, Россия) в течение ночи при +4°С в 96-луночных планшетах Maxosorp (Nunc) (по 100 мкл/лунку).

В отличие от нейтрализующих антител, вирус-специфические IgG антитела наблюдали у животных, привитых всеми тремя конструкциями, но для векторов rAAV9-SARS3 (S1) и rAAV9-SARS4 (RBD) - только в высокой дозе (см. Фиг.13 и Таблицу 6). Титры антител имели прямую зависимость от длины вставки: наиболее высокий уровень антител наблюдали у мышей, привитых rAAV9-SARS2 (Spike), наименьший - у мышей, привитых rAAV9-SARS4 (RBD). Титры антител возрастали в период 4-12 недель, разница была статистически значима для конструкции rAAV9-SARS2 (Spike).

Гуморальный ответ на капсидный антиген AAV9 через 4 недели после вакцинации имел прямую дозозависимость, при этом группы различных векторов не отличались друг от друга (см. Фиг.14 и Таблицу 6). Через 12 недель после иммунизации наблюдалось статистически значимое снижение антител к AAV9 в группах мышей, привитых в высокой дозе конструкциями rAAV9-SARS3 (S1) и rAAV9-SARS4 (RBD). В группе мышей, привитых конструкцией rAAV9-SARS2 (Spike) в высокой дозе, также наблюдалось снижение титра антител, но оно не было статистически значимым. В остальных группах титры антител к AAV9 практически не изменились в период 4-12 недель.

Пример 8. Исследование Т-клеточного иммунного ответа экспериментальных белков в контексте вакцины на основе AAV9 при иммунизации мышей in vivo

Исследование проводили на группах животных, как описано в Примере 7. Системный антиген-специфический Т-клеточный ответ определяли через 12 недель после вакцинации. У всех животных был проведен забор селезёнок с последующим выделением спленоцитов.

Специфическую стимуляцию проводили посредством PepTivator S (Miltenyi Biotec, коктейль перекрывающихся пептидов, состоящий из 11 пептидов, охватывающих полную последовательность мембранного гликопротеина SARS-CoV-2 (GenBank MN908947.3)) в течение 24 часов при 37°С и 5% CO₂ в присутствии ингибитора клеточного транспорта брефельдин А (GolgiPlug входит в состав набора реагентов для внутриклеточного окрашивания CytoFix/CytoPerm (BD)) и ко-стимулирующих антител к CD28 (Biolegend).

В качестве нестимулированного контроля использовали полную культуральную среду, содержащую брефельдин А и ко-стимулирующие антитела к CD28, в качестве положительного контроля стимуляции использовали смесь РМА (Sigma) и йономицина (Sigma).

Ответ оценивали по относительному количеству IFNγ/IL2/TNFα цитокин-продуцирующих CD4+ и CD8+ эффекторных Т-клеток памяти, измеряемых методом проточной цитометрии, после in vitro стимуляции спленоцитов коктейлем перекрывающихся пептидов S-белка (PepTivator S).

Иммунизация исследуемыми препаратами вызывала преимущественно ответ CD8+ эффекторных Т-клеток, интенсивность которого определялась размером вставки, экспрессируемой аденоассоциированным вектором (Фиг.15А, Б).

При этом основную долю антигенспецифичных эффекторных CD8+ Т-лимфоцитов составила популяция двойных (IFNγ+IL-2-TNFα+) продуцентов (Фиг.16Б, Г, Е). CD4+ антиген-специфический Т-клеточный ответ наблюдался только в группе, иммунизированной аденоассоциированным вектором rAAV9-SARS2, экспрессирующим полноразмерный Spike-белок, и характеризовался преобладанием монофункциональных IFNγ+IL-2-TNFα- Tem клеток (см. Фиг.16А, В, Д).

Анализ совокупной продукции цитокинов (IFNγ/IL2/TNFα) не выявил выраженного дозозависимого эффекта для всех исследуемых конструкций. Различия отмечались при анализе доли IFNγ+IL-2-TNFα+ CD8+ Tem лимфоцитов. При этом в группах, иммунизированных аденоассоциированным вектором rAAV9-SARS2, экспрессирующим полноразмерный Spike-белок, наблюдалась прямая зависимость между величиной дозы и относительным количеством IFNγ+IL-2-TNFα+ CD8+ Tem клеток, а в группах, иммунизированных конструкциями rAAV9-SARS3 (S1) и rAAV9-SARS4 (RBD), обратная.

Таким образом, по итогам проведённого исследования было установлено, что препараты векторной вакцины характеризуются различным уровнем иммуногенности в зависимости от конструкции и вводимой дозы. Более высокая доза препарата и более длинный антиген-вставка были ассоциированы с более высоким уровнем как гуморального, так и Т-клеточного ответа к S-белку вируса SARS-CoV-2.

Вируснейтрализующие антитела были обнаружены только у животных, привитых конструкцией, несущей полноразмерный спайк-белок rAAV9-SARS2 (Spike), титр антител возрастал в период 4-12 недель после вакцинации и имел прямой дозозависимый эффект. Вирус-специфические IgG антитела наблюдали у животных, привитых всеми тремя вариантами конструкций, но для векторов, несущих усечённые варианты S-белка (rAAV9-SARS3 (S1) и rAAV9-SARS4 (RBD)) - только в высокой дозе. Титры IgG антител имели прямую зависимость от длины вставки и возрастали в период 4-12 недель. Уровень IgG антител к вектору (капсид AAV9) через 4 и 12 недель после иммунизации прямо зависел от введённой дозы и не зависел от конструкции.

Также было установлено, что иммунизация животных разработанными препаратами векторной вакцины приводит к формированию выраженного CD8+ Т-клеточного ответа на пептиды S-белка вируса SARS-CoV-2, интенсивность которого не имеет чёткой дозозависимости, но прямо зависит от размера вставки. В популяции антиген-специфичных CD8+ эффекторных клеток памяти преобладали двойные позитивные клетки (IFNg+TNFa+). Антиген-специфический CD4+ T-клеточный ответ был зафиксирован только у мышей, привитых конструкцией, несущей полноразмерный спайк-белок rAAV9-SARS2 (Spike), при этом в популяции преобладали клетки, продуцирующие IFNg.

Проведённые эксперименты свидетельствуют о том, что несмотря на то, что использование субъединицы S1 и RBD-домена показали свою эффективность в ранее разработанных вакцинах против вируса SARS-CoV-2, эти конструкции оказались недостаточно эффективны в разрабатываемых векторных вакцинах и не могут быть использованы для эффективной профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2. В то же время, вакцина на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, кодирующего полноразмерный S-белок, способна вызывать активацию не только гуморального, но и клеточного иммунного ответа после однократного внутримышечного введения, при этом после одной инъекции экспрессия конструкции продолжается в течение более 24 недель. Безопасность разработанной векторной вакцины обеспечивается локальной продукцией антигена в месте введения.

Таким образом, в результате проведённых исследований разработана вакцина на основе аденоассоциированного вируса 9 серотипа, обеспечивающая эффективную стимуляцию гуморального и клеточного ответа, которая может быть использована для профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-COV-2.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объём изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Цитируемые документы:

[1] Travieso T. et al., “The use of viral vectors in vaccine development,” pp. 1-10, 2022, doi: 10.1038/s41541-022-00503-y.

[2] Qin X. et al., “Development of an SARS-CoV-2 Vaccine and Its Immunogenicity in Mice,” vol. 12, no. March, pp. 1-10, 2022, doi: 10.3389/fcimb.2022.802147.

[3] Wu F. et al., “Since January 2020 Elsevier has created a COVID-19 resource centre with free information in English and Mandarin on the novel coronavirus COVID- research that is available on the COVID-19 resource centre - including this Single-shot AAV-vectored vaccine against SARS-CoV-2 with fast and long-lasting immunity,” no. January, 2020.

[4] Maciorowski D. et al., “Immunogenicity of an AAV-Based COVID-19 Vaccine in Murine Models of Obesity and Aging,” pp. 1-12, 2022.

[5] Zabaleta N. et al., “Durable immunogenicity, adaptation to emerging variants, and low-dose efficacy of an AAV-based COVID-19 vaccine platform in macaques,” vol. 30, no. 9, pp. 2952-2967, 2022, doi: 10.1016/j.ymthe.2022.05.007.

[6] NCT05037188, “Clinical Study of the Safety and Immunogenicity of a Recombinant Viral Vector AAV5 (Adeno-Associated Virus Type 5)-RBD (Receptor Binding Domain)-S Vaccine for the Prevention of Coronavirus Infection (COVID-19) (COVER).” [Online]. Available: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05037188?term=Adeno-Associated&cond=COVID-19&draw=2&rank=1

[7] Xia S. et al., “The role of furin cleavage site in SARS-CoV-2 spike protein-mediated membrane fusion in the presence or absence of trypsin”, Sig Transduct Target Ther 5, 92 (2020). https://doi.org/10.1038/s41392-020-0184-0

[8] Zhang Y. et al., “A second functional furin site in the SARS-CoV-2 spike protein”, Emerg Microbes Infect. 2022; 11(1): 182-194, Published online 2022 Jan 4. doi: 10.1080/22221751.2021.2014284

[9] Pedenko B. et al., “SARS-CoV-2 S Glycoprotein Stabilization Strategies”, Viruses 2023, 15(2), 558. https://doi.org/10.3390/v15020558

[10] Zhang J. et al., “Structural impact on SARS-CoV-2 spike protein by D614G substitution”, Science, 16 Mar 2021, 372(6541): pp.525-530, doi: 10.1126/science.abf2303

[11] Zincarelli C. et al. “Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection”, Mol Ther. 2008 Jun; 16(6):1073-80. doi: 10.1038/mt.2008.76. Epub 2008 Apr 15.

[12] Rajendra Y. et al., “Transcriptional and post-transcriptional limitations of highyielding, PEI-mediated transient transfection with CHO and HEK-293E cells”. Biotechnol Prog. 2015;31(2):541-9. https://doi.org/10.1002/btpr.2064

[13] Joshi P.R.H. et al., “Advancements in molecular design and bioprocessing of recombinant adeno-associated virus gene delivery vectors using the insect-cell baculovirus expression platform”, Biotechnol. J. 2020;16

[14] Robert M.A. et al., “Manufacturing of recombinant adeno-associated viruses using mammalian expression platforms”, Biotechnol. J. 2017;12. doi: 10.1002/biot.201600193.

[15] Amanat F. et al., “An In Vitro Microneutralization Assay for SARS-CoV-2 Serology and Drug Screening,” Curr. Protoc. Microbiol., vol. 58, no. 1, pp. 1-15, 2020, doi: 10.1002/cpmc.108.

[16] Manenti A. et al., “Evaluation of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies using a CPE-based colorimetric live virus micro-neutralization assay in human serum samples,” J. Med. Virol., vol. 92, no. 10, pp. 2096-2104, 2020, doi: 10.1002/jmv.25986.

This XML file does not appear to have any style information associated with it. The document tree is shown below.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="11.10.2024_Перечень

последовательностей.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-10-11">

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью "Свифтген"</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Swiftgen LLC</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина на основе

аденоассоциированного вектора 9 типа, кодирующего Spike-белок, для

профилактики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2</InventionTitle>

<INSDSeq_length>1273</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1273</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Betacoronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQ

DLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNN

ATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF

VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA

AAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNI

TNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI

RGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEI

YQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFN

FNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY

QDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPR

RARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNL

LLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLL

FNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGA

ALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTL

VKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSEC

VLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHW

FVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGI

NASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCS

CLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1270</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1270</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQ

DLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNN

ATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF

VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA

AAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNI

TNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI

RGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEI

YQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFN

FNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY

QGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPA

SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQ

YGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNK

VTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQ

IPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ

LSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLG

QSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVT

QRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINAS

VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLK

GCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1270</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1270</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQ

DLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNN

ATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF

VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA

AAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNI

TNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI

RGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEI

YQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFN

FNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY

QGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPA

SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQ

YGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNK

VTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQ

IPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ

LSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLG

QSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVT

QRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINAS

VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLK

GCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>677</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..677</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQ

DLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNN

ATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF

VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA

AAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNI

TNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI

RGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEI

YQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFN

FNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY

QGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQ</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>393</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..393</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MFVFLVLLPLVSSQTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFG

EVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQ

IAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTP

CNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGT

GVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTE

VPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNS</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1270</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1270</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQ

DLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNN

ATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREF

VFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGA

AAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNI

TNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVI

RGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEI

YQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFN

FNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLY

QGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPA

SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQ

YGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNK

VTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQ

IPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ

LSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLG

QSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVT

QRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINAS

VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLK

GCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>3813</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3813</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacc

tgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa

ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctgg

ttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacg

acggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactgga

cagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccag

ttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttcc

gggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg

caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctac

agcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtgg

atctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacc

tggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacc

ttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcg

agacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgcc

accagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgc

tgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtg

cttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacag

acaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaaca

gcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaa

ggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccct

acagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcac

caatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagag

agcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagag

atccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg

caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccatt

cacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccg

gctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctg

tgccagctaccagacacagacaaacagccctgcttctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatg

tctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatca

gcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcgg

cgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctg

acagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaaga

cccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaa

gcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtat

ggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgc

tgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaag

cggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaac

ggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgcca

tcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaacca

gaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctg

aacgatatcctgagcagactggaccctccggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggc

tgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatct

ggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctac

cacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctc

aagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgt

gttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccacc

gacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctc

tgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgt

ggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaac

gaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatca

agtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgct

gtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgac

gaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacatga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>3813</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3813</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacc

tgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa

ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctgg

ttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacg

acggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactgga

cagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccag

ttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttcc

gggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg

caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctac

agcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtgg

atctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacc

tggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacc

ttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcg

agacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgcc

accagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgc

tgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtg

cttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacag

acaggcaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaaca

gcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtgaaa

ggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccct

acagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcac

caatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagag

agcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagag

atccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg

caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccatt

cacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccg

gctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctg

tgccagctaccagacacagacaaacagccctgcttctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatg

tctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatca

gcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcgg

cgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctg

acagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaaga

cccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaa

gcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtat

ggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgc

tgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaag

cggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaac

ggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgcca

tcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaacca

gaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctg

aacgatatcctgagcagactggaccctccggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggc

tgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatct

ggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctac

cacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctc

aagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgt

gttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccacc

gacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctc

tgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgt

ggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaac

gaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatca

agtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgct

gtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgac

gaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacatga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>2034</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2034</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacc

tgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa

ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctgg

ttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacg

acggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactgga

cagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccag

ttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttcc

gggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg

caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctac

agcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtgg

atctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacc

tggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacc

ttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcg

agacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgcc

accagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgc

tgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtg

cttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacag

acaggcaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaaca

gcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtgaaa

ggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccct

acagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcac

caatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagag

agcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagag

atccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg

caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccatt

cacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccg

gctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctg

tgccagctaccagacacagtga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1182</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1182</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagaccctgaagt

ccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcg

gttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtac

gcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttca

gcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccga

cagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaacatcgccgactac

aactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaag

tcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacat

ctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtgaaaggcttcaactgctacttccca

ctgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagct

tcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatg

cgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgcca

ttccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcc

tggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggt

ggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacct

acatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagc

acgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagac

aaacagctga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>3813</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3813</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacc

tgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa

ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctgg

ttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacg

acggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactgga

cagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccag

ttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttcc

gggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg

caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctac

agcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtgg

atctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacc

tggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacc

ttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcg

agacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgcc

accagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgc

tgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtg

cttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacag

acaggcaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaaca

gcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacaggtaccggctgttccggaagtccaatct

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaaaccttgtaacggcgtggaa

ggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccct

acagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcac

caatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagag

agcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagag

atccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg

caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccatt

cacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccg

gctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctg

tgccagctaccagacacagacaaacagccctgcttctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatg

tctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatca

gcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcgg

cgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctg

acagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaaga

cccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaa

gcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtat

ggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgc

tgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaag

cggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaac

ggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgcca

tcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaacca

gaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctg

aacgatatcctgagcagactggaccctccggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggc

tgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatct

ggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctac

cacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctc

aagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgt

gttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccacc

gacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctc

tgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgt

ggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaac

gaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatca

agtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgct

gtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgac

gaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacatga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7641</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7641</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtttagacg

ctagactagcatgcgactcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagtt

attaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttac

ggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc

atagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttgg

cagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg

gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgct

attaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttc

caagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatg

tcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga

gctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactataggcgag

acccaagctggctagccgccaccatgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgt

gaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactacccc

gacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtga

cctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgccctt

caacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccaca

ctggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagt

tccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcga

gttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctg

gaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaaga

tctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccct

ggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctg

acacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagccta

gaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctct

gagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgg

gtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttca

atgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactc

cgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgac

ctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctg

gacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctg

gaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtcc

aatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcg

tggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatca

gccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaa

agcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctga

cagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgt

tagagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacc

cctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtgg

ccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccag

agccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggc

atctgtgccagctaccagacacagacaaacagccctgcttctgtggccagccagagcatcattgcctaca

caatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcac

catcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatc

tgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagag

ccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatcta

caagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagccc

agcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagc

agtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgac

agtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatc

acaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggt

tcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacag

cgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtc

aaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctg

tgctgaacgatatcctgagcagactggaccctccggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccgg

aaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgcc

aatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagg

gctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcc

cgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaa

ggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatca

ccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacga

ccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaagcccc

gacgtggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggc

tgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagta

catcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatc

atgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagt

tcgacgaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacatgagggcccgtttaaac

ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttcc

ttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctga

gtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatag

caggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagcaaaacaacaac

aattggatctgcgctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgatgg

agttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgccc

gggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggcttggatcccaatggcg

cgccgagcttggctcgagcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccaca

caacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaatt

gcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaac

gcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggt

cgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggat

aacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctgg

cgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaa

cccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgacc

ctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgct

gtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcc

cgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactg

gcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggt

ggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcgg

aaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaag

cagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctc

agtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcct

tttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaa

aactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaa

gccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtc

tgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagt

gagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagactt

gttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtga

ttgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaac

cggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctgga

atgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgat

ggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacg

ctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcac

ctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcg

cggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatt

tatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttc

cgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataa

aaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatg

cagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgt

cagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgca

ccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcccctgcaggcag

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccgg

cctcagtgagcgagcgagcgcgcagagag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7640</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7640</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcccctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaa

agcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggc

caactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtttagacgctagactagcatgcgactcttcgcga

tgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtca

ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcca

ttgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcca

agtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat

gggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggca

gtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat

gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc

aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccac

tgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccgccaccatgt

tcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcc

tccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctg

cactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccg

gcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcac

cgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctg

atcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgg

gcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaa

ctgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaac

ctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacc

tcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacat

cacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatgg

acagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgaga

acggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtc

cttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcgg

ttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacg

cctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcag

caccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgac

agcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaacatcgccgactaca

actacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagt

cggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatc

tccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtgaaaggcttcaactgctacttcccac

tgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagctt

cgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgc

gtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccat

tccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcct

ggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtg

gcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacaccta

catggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagca

cgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagaca

aacagccctgcttctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcg

tggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcc

tgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaac

ctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacagg

acaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcgg

cggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctg

ctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattg

ccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatga

gatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggc

gccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatg

tgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcct

gagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacacc

ctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgatatcctgagcagactgg

accctccggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgt

tacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgag

tgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagt

ctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgc

tccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccat

tggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggca

actgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagctt

caaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgatatcagcgga

atcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacg

agagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggct

gggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgt

agctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgc

tgaagggcgtgaaactgcactacacatgagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttc

tagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccact

gtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtg

gggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctc

tatggcttctactgggcggttttatggacagcaaaacaacaacaattggatctgcgctgattttgtaggt

aaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctc

gctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgag

cgagcgagcgcgcagctgcctgcaggcttggatcccaatggcgcgccgagcttggctcgagcatggtcat

agctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtg

taaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccag

tcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattg

ggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagc

tcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaa

ggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctg

acgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggc

gtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc

tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcg

ttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaacta

tcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagc

agagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaa

cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccgg

caaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaagga

tctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaaggga

ttttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatc

aatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgc

aatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaact

caccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaat

acaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaa

tccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgt

catcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcg

atcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatca

acaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtgg

tgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcag

ccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaac

tctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagccc

atttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttg

aatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgga

tacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac

ctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcg

tctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgt

ctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggct

ggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacag

atgcgtaaggagaaaataccgcatcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>5861</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5861</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcccctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaa

agcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggc

caactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtttagacgctagactagcatgcgactcttcgcga

tgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtca

ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcca

ttgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcca

agtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat

gggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggca

gtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat

gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc

aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccac

tgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccgccaccatgt

tcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcc

tccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctg

cactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccg

gcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcac

cgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctg

atcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgg

gcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaa

ctgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaac

ctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacc

tcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacat

cacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatgg

acagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgaga

acggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtc

cttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcgg

ttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacg

cctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcag

caccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgac

agcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaacatcgccgactaca

actacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagt

cggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatc

tccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtgaaaggcttcaactgctacttcccac

tgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagctt

cgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgc

gtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccat

tccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcct

ggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtg

gcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacaccta

catggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagca

cgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagtga

gggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccct

cccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgc

atcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggat

tgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggac

agcaaaacaacaacaattggatctgcgctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcagga

acccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaag

gtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggctt

ggatcccaatggcgcgccgagcttggctcgagcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccg

ctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagct

aactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatta

atgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgac

tcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatcca

cagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaa

ggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagt

cagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgct

ctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttc

tcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa

ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacg

acttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacaga

gttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaag

ccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtt

tttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctac

ggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatc

ttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggt

ctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaatacc

atatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaaga

tcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaa

taaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcat

ttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccg

ttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacag

gaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattc

ttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacgg

ataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaa

catcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcg

atagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatg

ttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactcttcctttttcaat

attattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataa

acaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatg

acattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaa

acctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagc

ccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagatt

gtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagg<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>5009</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5009</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcccctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaa

agcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggc

caactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtttagacgctagactagcatgcgactcttcgcga

tgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtca

ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcca

ttgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcca

agtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat

gggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggca

gtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat

gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc

aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccac

tgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccgccaccatgt

tcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgtccagccagaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcat

ctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctg

tgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatca

gcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgt

gtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagat

gaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgact

tcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacct

gtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggcc

ggcagcaccccttgtaacggcgtgaaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagc

ccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgc

cacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggc

ctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggata

tcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagctt

cggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtg

aactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccg

gcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtg

cgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagctgagggcccgtttaa

acccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcctt

ccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtct

gagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaat

agcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagcaaaacaaca

acaattggatctgcgctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgat

ggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgc

ccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggcttggatcccaatgg

cgcgccgagcttggctcgagcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcca

cacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaa

ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcca

acgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcg

gtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcagggg

ataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgct

ggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcga

aacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccga

ccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacg

ctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcag

cccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccac

tggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg

gtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttc

ggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca

agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgc

tcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatc

cttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaga

aaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaa

aagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcgg

tctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaa

gtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagac

ttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgt

gattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgca

accggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctg

gaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttg

atggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaa

cgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgc

acctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaat

cgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagca

tttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggt

tccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctat

aaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacaca

tgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgc

gtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtg

caccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagg</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7626</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7626</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcccctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaa

agcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggc

caactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtttagacggactcttcgcgatgtacgggccagat

atacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc

atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgc

ccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatggg

tggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctat

tgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctact

tggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggc

gtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttg

gcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtagg

cgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggctta

tcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagccgccaccatgttcgtgtttctggtg

ctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacacca

acagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccagga

cctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcacc

aagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaaca

tcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgc

caccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcac

aagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagt

acgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgt

gttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctg

cctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcaga

cactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgc

cgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcacc

gacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaa

agggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcac

caatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaag

cggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgct

acggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccg

gggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaacatcgccgactacaactacaagctgccc

gacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactaca

attacaggtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatcta

tcaggccggcagcaaaccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggc

tttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatg

cccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaactt

caacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggc

cgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcctggacatcacccctt

gcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtacca

gggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtac

tccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagct

acgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagccctgcttc

tgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaac

aactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgacca

agaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagta

cggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaa

gaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttca

gccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagt

gacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctg

atttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagt

acacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagat

cccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaac

cagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaa

gcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagct

gtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgatatcctgagcagactggaccctccggaagcc

gaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctga

tcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggcca

gagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggc

gtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgcc

acgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgaccca

gcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtg

atcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactgg

ataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgt

cgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgac

ctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccg

gactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaaggg

ctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaa

ctgcactacacatgagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccat

ctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaata

aaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggac

agcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactg

ggcggttttatggacagcaaaacaacaacaattggatctgcgctgattttgtaggtaaccacgtgcggac

cgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgag

gccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgca

gctgcctgcaggcttggatcccaatggcgcgccgagcttggctcgagcatggtcatagctgtttcctgtg

tgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtg

cctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtc

gtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgct

tcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcgg

taatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggc

caggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaa

aatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaa

gctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggg

aagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctg

ggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtcca

acccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgt

aggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatc

tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccg

ctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcc

tttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaga

ttatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatat

atgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatc

aggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttc

cataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatt

tcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatgg

caaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactc

gcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaag

gacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacc

tgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgcagtggtgagtaaccatgca

tcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctga

ccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcggg

cttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatat

aaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatac

tcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatg

tatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaa

accattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcg

gtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgc

cgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcg

gcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaa

aataccgcatcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agacgctagactagcatgcgactcttcgcgatgtacgggccag</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caattgttgttgttttgctgtccataaaaccgcccagtagaag</INSDSeq

_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>44</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tatggacagcaaaacaacaacaattggatctgcgctgattttgt</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcgcatgctagtctagcgtctaaacgcgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggacctggaaggcaagcaggg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccctgcttgccttccaggtccatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>45</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..45</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggctagccgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaagg</INSDS

eq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtggcggctagccagcttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtaagggcccgtttaaacccg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>38</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..38</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgggtttaaacgggcccttacacggcgatctttccgcc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>5514</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5514</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaat

acgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcg

catcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccagggatcgc

agtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattcc

gtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaa

acaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcg

agcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcc

cgttgaatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatga

gcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagt

gccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccc

tttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacag

cttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcg

gggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccg

cacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcccctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactg

aggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcg

cagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtttagacgctagactagca

tgcgactcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgcgcgttgtatgccaagtacgccccctattgacgt

caatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcag

tacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggat

agcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcacca

aaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta

cggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagtggatccaaagaattc

gggcctccgaaaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaaga

tggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgctttt

acagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaag

ctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctt

tatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgt

gaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaa

ttttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattacca

gggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtg

ccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgccta

aaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaa

tcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactaca

ctcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgagga

gccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcac

tctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaa

gtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagacta

catcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttt

tgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtg

agaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatg

gatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaa

gtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacacccc

aacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttg

ttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgc

gaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgca

agaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaacccgggtggggta

ccaggtaagtgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgt

cgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggc

gtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggagatc

caatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattcacagtccca

aggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtaga

ggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgtt

gttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata

aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaactggcttctac

tgggcggttttatggacagcaagaacaacaacaattggatctgcgctgattttgtaggtaaccacgtgcg

gaccgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcact

gaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgc

gcagctgcctgcaggcttggatcccaatggcgcgccgagcttggctcgagcatggtcatagctgtttcct

gtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggg

gtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacct

gtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcc

gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaagg

cggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaa

ggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcac

aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctg

gaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttc

gggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaag

ctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagt

ccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggta

tgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggt

atctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaacca

ccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaaga

tcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatg

agattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagta

tatatgagtaaacttggtctgacagttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcat

atcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcag

ttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctatta

atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaa

tggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatca

ct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Генетическая конструкция для экспрессии в клетках человека или животного полинуклеотида, кодирующего полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, содержащий мутации: частичная делеция фуринового сайта RRAR с удалением всех входящих в сайт аргининов (R), а также мутации K986Р, V987Р и D614G,

характеризующаяся тем, что представлена аденоассоциированным вирусом AAV9, в который клонирован указанный полинуклеотид.

2. Генетическая конструкция по п.1, в которой полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2 включает дополнительные мутации, присущие конкретному варианту вируса.

3. Генетическая конструкция по п.1, в которой вариант вируса SARS-CoV-2 представляет собой альфа-вариант, бета-вариант, дельта-вариант или омикрон-вариант.

4. Генетическая конструкция по п.1, в которой полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2 имеет последовательность SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 6.

5. Генетическая конструкция по п.1, в которой полинуклеотид, кодирующий полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, представлен последовательностью SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 8, или SEQ ID NO: 11.

6. Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор AAV9, обеспечивающий экспрессию в клетках человека или животного полинуклеотида, кодирующего полноразмерный спайк-белок вируса SARS-CoV-2, имеющий генетическую конструкцию согласно любому из пп.1-5.

7. Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор AAV9 по п.6, представленный последовательностью SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 16.

8. Применение генетической конструкции по любому из пп.1-5 или рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора AAV9 по любому из пп.6, 7 для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.

9. Применение по п.8 путём внутримышечного введения.