RU2845498C1

RU2845498C1 - Штамм вируса вирусной диареи крупного рогатого скота второго генотипа для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики вирусной диареи крупного рогатого скота

Info

Publication number: RU2845498C1
Application number: RU2024139823A
Authority: RU
Inventors: Светлана Владимировна Кононова; Роман Игоревич Бубякин; Алена Олеговна Кротова; Ольга Петровна Бьядовская; Александр Владимирович Спрыгин; Елена Александровна Бухон; Александр Владимирович Кононов; Ирина Николаевна Шумилова; Елена Александровна Трофимова; Александр Александрович Нестеров
Filing date: 2024-12-26
Publication date: 2025-08-21

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (КРС) второго генотипа семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, вида Pestivirus tauri, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №754 – деп / 24 ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики вирусной диареи КРС. Изобретение обеспечивает расширение арсенала штаммов вируса вирусной диареи, обладающих инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью. 9 ил., 4 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к новому штамму вируса вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота (КРС), который может быть использован при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ВД КРС второго генотипа.

Вирус вирусной диареи вызывает многообразные клинические формы инфекции, приводя к значительным экономическим потерям в мясном и молочном животноводстве во всем мире. Инфекция сопровождается патологией воспроизводства, болезнями респираторного тракта, дисфункцией иммунной системы, эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, хроническими заболеваниями с предрасположенностью к развитию вторичной бактериальной и другой вирусной инфекции. Также, отличительной особенностью вируса является его способность преодолевать плацентарный барьер и в зависимости от сроков стельности коровы, инфицировать плод, что приводит к развитию персистентной инфекции [1]. В результате рождаются иммунотолерантные телята, которые являются постоянным источником патогена для неиммунных животных.

Главной особенностью вируса ВД КРС является генотипическое и фенотипическое разнообразие, лежащее в основе полиморфизма клинического проявления болезни и изменения вирулентности и антигенности вируса.

На сегодняшний день известно 3 генотипа вируса, вызывающих данное заболевание: ВД1, ВД2, ВД3. Одновременно генотипы подразделяются на субтипы: известно о 21 субтипе первого генотипа ВД (1а-1u), шести субтипов второго генотипа (2а-2f) и четырех третьего [2].

Распространение видов и субтипов вируса имеет региональные особенности и зависит от характера ведения животноводства, плотности размещения, продуктивности, частоты ввода новых животных и других факторов.

Первый генотип вируса распространен повсеместно, но чаще очаги возникают в странах Европы. Штаммы вируса ВД КРС второго генотипа встречаются реже, чем штаммы вируса ВД КРС первого генотипа, они объединяют штаммы, вызывающие острое и сверхострое течение болезни с высокой смертностью, тромбоцитопенией и геморрагиями [3].

На территории РФ на протяжении пятнадцати лет уже фиксировали случаи клинического поражения животных, вызванных возбудителем вирусной диареи КРС второго генотипа. Подтип 2с был обнаружен в Тюменской области, подтип 2b – в Новосибирской. Обнаруженные подтипы отображают одну клиническую картину – нарушение воспроизводительных функций (абортированный плод, мертворождение) и инфицирование плода различными степенями тяжести [4, 5, 6].

Для Российской Федерации существует угроза заноса вируса вирусной диареи КРС второго генотипа, а также атипичных вирусов с импортированными из неблагополучных стран восприимчивых животных, а также продуктами биологического происхождения, что требует проведения лабораторного надзора среди импортированного поголовья [7, 8, 9].

Специфический иммунитет играет важную роль в борьбе с вирусной диареей. Ликвидация инфекции без вакцинопрофилактики труднодостижима или невозможна из-за широкой инфицированности, длительного латентного носительства и выделения вируса; высокой численности и плотности поголовья в хозяйстве. Вакцинация должна защитить от виремии и распространения вируса, предотвратить заражение клеток-мишеней репродуктивной и лимфатической систем, с целью недопущения инфицирования плода и развития иммуносупрессии. Несколько десятилетий назад большинство вакцин содержали штаммы вируса первого генотипа. Однако, в связи с антигенной вариабельностью вируса началось внедрение и производство как аттенуированных, так и инактивированных вакцин, изготовленных на основе штаммов двух генотипов вируса [10, 11].

За рубежом, в основном в США, в составе вакцин против ВД КРС используют штамм «890» вируса ВД второго генотипа. Данный штамм был первоначально выделен в 1992 году из кишечника телки годовалого возраста, которая погибла от заболевания с признаками поражения ЖКТ. Результаты вскрытия выявили геморрагические воспаления слизистых оболочек кишечника [12]. В 1995 году был проведен филогенетический анализ штамма «890» вместе с изолятами ВД КРС 1 и 2 генотипов, выделенных с 1960 года по 1993 год на территории США и Канады [13]. В той же работе была получена полная последовательность штамма «890» и опубликована в базе данных GenBank.

На территории Северной Америки было выделено множество штаммов второго генотипа. Штаммы 53637-2а, 296-2а, 125-2а и 5912-2а широко используются в качестве компонентов живых (MLV) и инактивированных вакцин зарубежными компаниями (Hipra, Zoetis) [14].

В Китае впервые возбудитель второго генотипа был зафиксирован в 2004 году. Штамм XJ-04 является высоковирулентным с цитопатическим проявлением в культуре клеток. Первоначально изолят выделен от свиньи [15].

Штамм Hokudai-Lab/09 был выделен в Японии в 2011 году. Штамм SD1301 был идентичен японскому штамму Hokudai-Lab/09 и отнесен к группе 2b [16].

На территории РФ изолят вируса вирусной диареи КРС, относящийся ко второму генотипу впервые был выделен на территории Новосибирской области от абортировавшей коровы местного происхождения в 2008 г. (изолят Благодатский) [17].

На сегодняшний день на территории РФ нет официально заявленных штаммов, относящихся ко второму генотипу.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов вируса вирусной диареи КРС, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов.

Указанная задача решена получением нового штамма «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа, который может быть использован для изготовления средств диагностики и специфической профилактики вирусной диареи КРС.

Изолят, послуживший источником для получения штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа был выделен в 2021 году из проб носовых истечений, полученных от теленка.

Для получения штамма «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали субкультуру клеток тестикул ягненка (ТЯ) (Фиг. 1-2). В результате проведения серии последовательных пассажей на данной культуре клеток из ранее выделенного изолята был получен штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа, имеющий стабильные биотехнологические свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовления диагностических препаратов против данной инфекции. Штамм адаптирован также к перевиваемой культуре клеток почки теленка (МDВК) (Фиг. 3-4) и субкультурам клеток тестикул ягненка (ТЯ), почки ягненка (ПЯ) (Фиг. 5-6) и почки козленка (ПК) (Фиг. 7-8), что позволяет получать в промышленных масштабах вирусный материал штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа с цитопатической активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Штамм «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №754 – деп / 24 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Сущность изобретения пояснена на графических изображениях:

Фиг. 1. – Неинфицированный монослой клеток ТЯ;

Фиг. 2. – ЦПД штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа в монослое клеток ТЯ (72 часов культивирования);

Фиг. 3. – Неинфицированный монослой клеток МDBK;

Фиг. 4. – ЦПД штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа в монослое клеток MDBK (72 часов культивирования);

Фиг. 5. - Неинфицированный монослой клеток ПЯ;

Фиг. 6. - ЦПД штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа в монослое клеток ПЯ (72 часов культивирования)

Фиг. 7 - Неинфицированный монослой клеток ПК;

Фиг. 8 - ЦПД штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа в монослое клеток ПК (72 часов культивирования);

Фиг. 9. – Филогенетическая дендрограмма, построенная по результатам секвенирования на основе участка 5’ не транслируемой области (5’UTR) генома вируса диареи КРС.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов участка генома 5’-UTR штамма «Челябинский» вируса ВД КРС.

Штамм «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические признаки

Штамм «Челябинский» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus, виду Pestivirus tauri и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя вирусной диареи КРС: сферический вирион диаметром 40-60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК. Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,12÷1,13 г/см³, коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 138S.

Антигенные свойства

После введения антигена животным в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа наиболее устойчив при рН 7,4. Быстро инактивируется при рН 3. При изменении рН среды от 5,7 до 9,3 инфекционность снижается.

Вирус хорошо сохраняется в нативном виде при 4°С, минус 20°С и минус 40°С. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, кислому значению рН (3,0) и дезоксихалату натрия; при 37°С погибает через 5 дней.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Генно-таксономическая характеристика

Штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.

Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 217 н.о. участка 5'-UTR. Филогенетической характеристикой установлена принадлежность генетического фрагмента вируса ко второму генотипу (Фиг. 1) [18].

Биотехнологическая характеристика

Штамм «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа размножается в перевиваемой культуре клеток почки теленка (МDВК), в субкультурах клеток тестикул ягненка (ТЯ), почки ягненка (ПЯ) и почки козленка (ПК). Репродукция вируса сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к округлению клеток и образованием в последствии зернистых очагов пораженных клеток на поверхности монослоя.

При 37°С в течение 72÷96 часов инкубирования вирус накапливается в титрах 4,5÷5,0 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе препаратов для гипериммунизации доноров.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK, ПЯ, ПК, ТЯ в течение 5 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Биологические и вирусологические исследования штамма.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса к культурам клеток ТЯ, МDВК, ПЯ и ПК.

Для получения расплодки штамма «Челябинский» вируса ВД КРС, вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа при температуре (37,0±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду полусинтетическую (ПСП). Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде агрегатов разного размера, тотальной деструкции и отслоение монослоя клеток от субстрата не происходило (Фиг. 1-8). При поражении не менее 60% площади монослоя клеток, культуральные матрасы промораживали при минус (80,0±4,0)°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса методом микротитрования в культуре клеток ТЯ.

Титрование проводили в стерильных 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах в объеме 0,1 см³/лунку. Предварительно, во все лунки культурального планшета вносили по 0,2 cм³ клеточной суспензии, приготовленной на питательной среде ПСП с концентрацией клеток
0,3-0,4×10⁶кл/cм³ после чего планшет инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С с содержанием 5% СО₂ в течение 24 ч, с ежедневным контролем конфлюентности монослоя: лунки планшета должны были содержать полностью сформированный монослой клеток без признаков дегенерации. Далее готовили десятикратные разведения вируссодержащего материала на среде ПСП, начиная с 10^-1до 10^-8. Подготовленные разведения вируса переносили, начиная с наивысшего разведения, по 0,1 cм³ в предварительно отмытые от ростовой среды лунки культурального планшета. Планшет инкубировали в СО₂-инкубатор с содержанием 5% СO₂при температуре (37,0±0,5)°С. Заключительный учет результатов титрования вируса проводили через 120-144 ч инкубирования при условии сохранения целостности монослоя клеток в контрольных лунках. Расчет инфекционной активности проводили по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД₅₀/см³.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1. Инфекционная активность вируса варьировала в пределах от 5,05±0,13 до 5,3±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Пример 2. Видовая принадлежность штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа.

Для определения видовой принадлежности штамма «Челябинский» вируса ВД КРС применяли олигонуклеотидные праймеры: BD1 по штамму «NADL» - позиции 188-205 н., BD4 по штамму «NADL» - позиции 383-366 н., BD2 по штамму «890» - позиции 204-223 н., BD3 по штамму «890» - позиции 320-301 н., фланкирующих консервативный регион вирусного генома размером 261 пар оснований и методику выявления и штаммовой дифференциации возбудителя по участку 5’-UTR генома, в программируемом амплификаторе «Rotor-Gene 6000» [19].

Проведенный филогенетический анализ вируса показал, что штамм «Челябинский» принадлежит ко второму генотипу и имеет 98% гомологию с референтным штаммом «890» субтипа 2а вируса ВД КРС (Фиг. 9).

Пример 3. Контроль стабильности биологической активности штамма

Контроль стабильности биологической активности штамма определяли в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ТЯ и МDBK. Результаты изучения стабильности штамма по его биологической активности в течение 5 пассажей представлены в таблице 2.

В ходе проведенных исследований установлено, что штамм «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ТЯ и МDBK проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах 5,0±0,19 - 5,56±0,08 lg ТДЦ₅₀/см³.

Пример 4. Получение антигена штамма «Челябинский» вируса ВД КРС.

Для приготовления антигена штамм «Челябинский» вируса ВД КРС двухсуточную культуру клеток ТЯ, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражали вируссодержащей суспензией в дозе не менее 0,01 ТЦД₅₀/кл. Матрасы помещали на один час в термостат при температуре (37±0,5)°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСП. Инфицированную культуру клеток инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С до появления ЦПД вируса. При поражении не менее 60% площади монослоя культуральные матрасы подвергали троекратному промораживанию при температуре минус (80,0±1,0)°С и оттаивали.

Полученную вируссодержащую культуральную жидкость очищали от балластных белков и фрагментов клеток низкоскоростным центрифугированием при 4800 g в течение 40 минут.

Надосадок отбирали (элюат 1), а осадок ресуспендировали в TNE – буфера до конечного объема суспензии, равного 1% объема исходного вируссодержащего материала. Для высвобождения оставшегося вируса из клеток проводили двухкратное замораживание-оттаивание осадка, после чего его центрифугировали при тех же режимах и получали 2-й, 3-й и 4-й элюаты.

Далее полученные надосадки (элюаты 1,2,3,4) объединяли и центрифугировали при 6000 g в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 1/100 исходного объема TNE – буфера. Под полученную суспензию подслаивали 20% сахаразу и центрифугировали при 10000 g в течение 2 ч. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в TNE – буфере.

Данные об оценке активности материала на каждом этапе очистки и концентрирования отображены в таблице 3.

В результате был получен очищенный препарат антигена штамма «Челябинский» вируса ВД КРС с инфекционной активностью 7,1 lg ТЦД₅₀/см³.

Полученный данным способом антиген штамма «Челябинский» вируса ВД КРС использовали в качестве биопрепарата, для получения гипериммунных вирусспецифических сывороток крови кроликов, содержащих антитела против штамма «Челябинский» вируса ВД КРС.

Пример 5. Получение вирусспецифических сывороток крови против вируса штамма «Челябинский» вирусной диареи КРС

Для получения специфических сывороток крови против вируса штамма «Челябинский» вирусной диареи КРС использовали 5 кроликов массой 2,0-2,5 кг. Для гипериммунизации животных применяли антиген штамма «Челябинский» вируса ВД КРС, полученный как описано в примере 3, из которого готовили сложную эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-70 («Seppic», Р. Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 70/30 по массе).

Полученным вакцинным препаратом иммунизировали кроликов в дозе 2 см³ трехкратно по схеме:

1) 1 иммунизация - в мякиши подушечки задних лапок;

2) через 10 дней после первой иммунизации в подколенные лимфоузлы;

3) через 21 день после первой – внутримышечно.

Перед каждой иммунизацией осуществлялся забор крови из ушной вены. Пробирки с кровью помещали в термостат при 37°С до образования кровяного сгустка. Сгусток крови отделяли и ставили на ночь на +4°С. На следующий день отбирали надосадочную фракцию – сыворотку крови и центрифугировали на 2 000 обор/мин в течение 30 минут. Полученные сыворотки крови использовали ИФА для определения уровня антител против штамма «Челябинский» ВД КРС.

Через 10-15 дней после окончания иммунизации доноров обескровливали и получали сыворотку крови для исследования на наличие антител в ИФА. Результаты исследования сывороток крови в ИФА представлены в таблице 4.

Анализируя результаты ИФА в таблице 4, можно сделать вывод, что на 35 день после проведения трехкратной иммунизации наблюдается выработка специфических антител у животных, титр специфических антител составляет 1:6400-1:12800.

Проведенные исследования показали возможность применения штамма «Челябинский» вируса ВД КРС в качестве биопрепарата для получения диагностических сывороток с активностью антител не ниже 1:6400-1:12800.

Полученный в ходе исследований объем специфических антител против вируса вирусной диареи КРС второго генотипа показывает, что биопрепараты, изготовленные с использованием штамма «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС потенциально могут быть применены для создания специфического иммунитета против вирусной диареи КРС у естественно-восприимчивых животных.

Таким образом, штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной активностью, пригоден для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики, и расширяет арсенал новых отечественных производственных штаммов вируса вирусной диареи КРС.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ВД КРС»

1. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Котенева С.В. Генетический полиморфизм и распространение пестивирусов (Flaviviridae: Pestivirus) крупного рогатого скота в мире и в Российской Федерации. Вопросы вирусологии. 2022; 67 (1): 18–26.

2. Нефедченко А.В., Глотов А.Г., Глотова Т.И., Кунгурцева О.В. Выявление животных, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС крупного рогатого скота, методом ПЦР. Ветеринария. 2011; 12: 21–5.

3. Giammarioli M., Ceglie L., Rossi E., Bazzucchi M., Casciari C., Petrini S., De Mia GM. Increased genetic diversity of BVDV-1: recent findings and implications thereof. Virus Genes, 2015, 50(1): 147-151 (doi: 10.1007/s11262-014-1132-2).

4. Глотов А.Г. Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота Ветеринария. 2008; 6: 56–60.

1. P.S.B. de Oliveira, J.V.J. Silva Jr, R. Weiblen, E.F. Flores - Subtyping bovine viral diarrhea virus (BVDV): Which viral gene to choose? – Infect. Genet. Evol. 2021 Aug; 92:104891. doi: 10.1016/j.meegid.2021.104891.

2. Бубякин Р.И., Кононова С.В., Бьядовская О.П., Бирюченков Д.А., Кононов А.В. Вирусная диарея крупного рогатого скота: распространение, характеристика, профилактика, диагностика и меры борьбы с заболеванием. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2022; 18: 99–121. DOI: 10.29326/9785907612136_2022_18_99.

3. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Котенева С.В., Нефедченко А.В., Семенова О.В. Вспышка заболевания крупного рогатого скота, вызванная вирусов диареи второго вида. Ветеринария. 2019; 3: 3–8. DOI:10.30896/0042-4846.2019.22.3.03-08.

4. Семенова О.В., ГлотовА.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В. Частота выявления посредством ОТ-ПЦР и выделения в культуре клеток вируса диареи крупного рогатого скота в Сибири. Российский ветеринарный журнал. 2017; 1: 24–27. eLIBRARY ID: 28421531.

5. Урываев Л.В., Ионова К.С., Дедова А.В., Дедова Л.В., Селиванова Т.К., Парасюк Н.А. и др. Анализ контаминации клеточных культур пестивирусом BVDV и микоплазмами. Вопросы вирусологии. 2012; 5: 15–21. eLIBRARY ID: 18751652.

6. Genome analysis of an atypical bovine pestivirus from fetal bovine serum/ Gao S., Du J., Tian Z. et al.// Virus Genes, 2016, 52, 4, 561-563.

7. S. R. Bolin 1, J. F. Ridpath., Differences in virulence between two noncytopathic bovine viral diarrhea viruses in calves // Am J Vet Res 1992 Nov;53(11):2157-63.

8. J. F. Ridpath 1, S. R. Bolin. The genomic sequence of a virulent bovine viral diarrhea virus (BVDV) from the type 2 genotype: detection of a large genomic insertion in a noncytopathic BVDV // Virology 1995 Sep 10;212(1):39-46.

9. Ridpath J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26 (1): 105–21.

10. Инструкция по применению вакцины Бови-шилд Голд FP5 L5 для профилактики инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной инфекции и лептоспироза крупного рогатого скота. (Организация-разработчик: «Zoetis Inc», 100 Campus Drive , Florham Park, New Jersey, 07932, США).

11. Jie Tao 1, Yin Wang, Juan Wang, Jian-ye Wang, Guo-qiang Zhu , Identification and genetic characterization of new bovine viral diarrhea virus genotype 2 strains in pigs isolated in China. Virus Genes. 2013 Feb;46(1):81-7. doi: 10.1007/s11262-012-0837-3. Epub 2012 Oct 21.

12. Wei Wang, Xinchuan Shi, Chaoyang Chen, Hua Wu. Genetic characterization of a noncytopathic bovine viral diarrhea virus 2b isolated from cattle in China. Virus Genes. 2014 Oct;49(2):339-41. doi: 10.1007/s11262-014-1067-7. Epub 2014 May 9.

13. Кунгурцсва Ольга Владимировна. / Особенности распространения вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, молеулярно-биологические свойства изолятов вируса // Дис. на соискание уч.ст. к.б.н., Новосибирск – 2010 г.

14. Бубякин Р.И., Кононова С.В., Шумилова И.Н., Бьядовская О.П., Кротова А.О., Кононов А.В. Изучение и идентификация изолятов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, выделенных на территории России с 2019 по 2022 г. Ветеринария сегодня. 2023; 12 (4): 315–321. DOI: 10.29326/2304-196X-2023-12-4-315-321.

15. Шульпин М.И., Мищенко В.А., Аянот П.К. Методика выявления и штаммовая дифференциация вируса диареи КРС с помощью амплификации и секвенирования фрагмента 5’-нетранслируемой области генома. Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ»; 2004. 10 с.

16.

Таблица 1

Биологические свойства штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа

n=3

Система репродукции вируса	Время проявления биологической активности (часы)	Количество адаптационных пассажей	Характеристика адаптированного материала
Система репродукции вируса		Количество адаптационных пассажей	Титр вируса, lgТЦД ₅₀ /см ³
ТЯ	72	5	5,3±0,14
МDBK	96	2	5,25±0,11
ПЯ	72	2	5,05±0,13
ПК	72	2	5,15±0,16

Таблица 2

Стабильность штамма «Челябинский» вируса ВД КРС второго генотипа при репродукции в культурах клеток

n=3

№ пассажа	Титр вируса, lg ТЦД ₅₀ /см ³
	Культура клеток
	ТЯ	МDBK
1	5,1±0,16	5,0±0,19
2	5,3±0,14	5,25±0,14
3	5,25±0,11	5,35±0,11
4	5,34±0,17	5,48±0,12
5	5,37±0,15	5,56±0,08

Таблица 3

Оценка активности вирусного материала ВД КРС на различных этапах очистки

№ пробы	Характеристика исследуемого материала	Титр инфекционной активности (lg ТЦД ₅₀ /см ³ )	ПЦР
1	исходный, культуральный вирус ВД КРС (4 пассаж в кк ТЯ)	5,0	+
2	клеточный детрит	4,0	+
3	объединенные надосадки (элюаты)	3,5	+
4	концентрат элюатов после 30% сахарозы	7,1	+

Claims

Штамм «Челябинский» вируса вирусной диареи КРС второго генотипа семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, вида Pestivirus tauri, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №754 – деп / 24 ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики вирусной диареи КРС.