RU2844869C1 - Антитела против ror1 и родственные биспецифичные связывающие белки - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к антителам, распознающим орфанный рецептор 1, подобный рецепторной тирозинкиназе (ROR1), биспецифичным ROR1/CD3-связывающим белкам. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с ROR1 и содержат CDR-H1 с SEQ ID NO: 1, CDR-H2 с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, CDR-H3 с SEQ ID NO: 3, CDR-L1 с SEQ ID NO: 5, CDR-L2 с SEQ ID NO: 6 и CDR-L3 с SEQ ID NO: 7. Также предложены конъюгат, молекула нуклеиновой кислоты и клетка-хозяин для получения биспецифичного связывающего белка, фармацевтическая композиция для лечения расстройства, при котором активность ROR1 является вредоносной. Антитело пригодно для обнаружения ROR1 человека или CD3 человека, для ингибирования сигнального пути ROR1 и/или для подавления опосредованного ROR1 человека роста или метастазирования опухоли. Биспецифичные поливалентные связывающие белки пригодны для индукции ROR1-специфичной Т-клеточной цитотоксичности и/или противоопухолевой активности против ROR1-экспрессирующих злокачественных клеток. 9 н. и 15 з.п. ф-лы, 11 ил., 16 табл., 11 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителам, способным распознавать орфанный рецептор 1, подобный рецепторной тирозинкиназе (ROR1), и к родственным биспецифичным связывающим белкам, например, биспецифичным связывающим белкам ROR1/CD3 (например, связывающим белкам FIT-Ig и MAT-Fab). Антитела и биспецифичные связывающие белки, описанные в настоящей заявке, можно применять для лечения таких заболеваний, как гемопоэтические виды рака и солидные опухоли.

Уровень техники

Орфанный рецептор 1, подобный рецепторной тирозинкиназе (ROR1), представляет собой эволюционно консервативный мембранный белок I типа, принадлежащий к подсемейству ROR. Его аминокислотная (АК) последовательность на 58% идентична последовательности ROR2, второго и последнего члена семейства ROR. ROR1 и ROR2 состоят из отдельной внеклеточной области с одним иммуноглобулин-подобным (Ig-подобным) доменом, одним доменом frizzled (Fz) и одним доменом kringle (Kr), за которой следуют трансмембранная область и внутриклеточная область, содержащая тирозинкиназный домен (Baskar, S., et al., (2008) Clinical Cancer Research, 14(2), 396-404).

Экспрессия ROR1 регулируется в процессе развития и ослабляется во время развития плода. Профилирование экспрессии генов злокачественных В-клеточных новообразований и нормальных В-лимфоцитов привело к открытию ROR1 и его характерной экспрессии в клетках лимфоцитарного лейкоза (см. Baskar et al., 2008, см. выше). При использовании высокочувствительного мАт 6D4 мыши против ROR1 человека ROR1 характеризовали как типично мембранный белок, однородно экспрессируемый в солидных опухолях определенных типов, включая рак яичников, трижды негативный рак молочной железы, аденокарциномы легких и аденокарциномы поджелудочной железы. Кроме того, экспрессию ROR1 на клеточной поверхности наблюдали в некоторых нормальных тканях (например, паращитовидной железе, островках поджелудочной железы и нескольких областях кишечника человека), но не наблюдали в других тканях (например, головном мозге, сердце, легких и печени) (Berger et al., 2016, Clinical Cancer Research, 23(12), 3061-3071).

ROR1 предложен в качестве мишени для лечения рака. Например, в WO 2005100605, WO 2007051077, WO 2008103849 и WO 2012097313 описаны антитела против ROR1 и их применение в качестве терапевтических средств для нацеленного воздействия на опухоли, включая солидные опухоли, например, рак молочной железы, и гематологические опухоли, например, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Цирмтузумаб, полученный путем картирования эпитопа, связанного антителом D10 против ROR1 из WO 2012097313, представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, используемое в клинических исследованиях различных видов раковых заболеваний, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Цирмтузумаб блокирует связывание ROR1 с его лигандом Wnt5a, что может ингибировать стимуляцию активации NF-κВ, индуцированную Wnt5a, и тем самым подавлять аутокринную ИЛ-6-зависимую активацию STAT3 при ХЛЛ (Chen et al., 2019, Blood, 134(13), 1084-1094). Цирмтузумаб может интернализоваться в клетки; выполнена оценка его использования в качестве фрагмента, обеспечивающего нацеленное воздействие, в конъюгатах лекарственных средств с антителами (ADC) против ROR1. Для лечения пациентов с ROR1-положительными злокачественными новообразованиями разработали ADC на основе цирмтузумаба VLS-101, содержащий ММАЕ.

В качестве еще одного способа лечения разработали биспецифичные антитела против ROR1 и второго антигена, например, биспецифичные активаторы, привлекающие Т-клетки (BiTE). В WO 2014/167022 описано биспецифичное антитело с медленно интернализируемым антителом R12 против ROR1 в качестве одного плеча и с антителом против CD3e в качестве другого плеча. Gohil et al., 2017 (Onco Immunology, 6(7), 1-11) использовали одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), мишенью которых являлся домен frizzled ROR1, для получения BiTE, предотвращавшего приживление ксенотрансплантатов опухоли поджелудочной железы в моделях на мышах. В статье Qi et al., 2018 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(24), E5467-E5476) описан scFv с мембранно-проксимальным эпитопом R11, мишенью которого является ROR1 и для которого выявлена мощная и селективная противоопухолевая активность при конструировании в формате scFv-Fc с использованием биспецифичного антитела ROR1×CD3 на основе гетеродимерного и агликозилированного Fc-домена.

BiTE представляют собой биспецифичные антитела против константного компонента комплекса Т-клетка/CD3 и опухолеассоциированного антигена (ТАА). Эти биспецифичные антитела обладают определенными преимуществами, например, способностью перенаправлять цитотоксическую активность Т-клеток на злокачественные клетки без рестриктирования по МНС. Клинический успех блинатумомаба, наблюдаемый в последние годы, вызвал рост интереса к применению BiTE, мишенью которых является CD3, для иммунотерапии рака. Однако возникли проблемы, связанные с эффективностью и токсичностью/безопасностью этого подхода к лечению.

Например, может быть желательным иметь антитело с повышенной аффинностью к антигенам, которые являются строго опухолеспецифичными. Однако в случае опухолеассоциированного антигена, сверхэкспрессирующегося в опухолях, а также экспрессирующегося в нормальных тканях, преимуществом может являться способность антитела различать экспрессию антигена в опухолях и в нормальных тканях. Свойства антитела, касающиеся его интернализации, также могут оказывать влияние на его терапевтическое применение. Сильная интернализация при связывании антитела, например, может быть желательной для конъюгатов антитела для эффективной доставки конъюгированного токсина в клетки-мишени. Тем не менее, интернализация может являться неблагоприятным свойством для активаторов, привлекающих Т-клетки, поскольку сохранение BiTE на поверхности клетки может быть желательным для обеспечения цитотоксической активности путем вовлечения Т-клеток. Кроме того, показано, что на проникновение в солидную опухоль и эффективность препаратов на основе антител может влиять аффинность и способность антитела вызывать интернализацию антигена. Согласно Rudnick et al., 2011 (Rudnick et al., Cancer Res; 71(6); 2250-9), высокая аффинность и быстрая интернализация могут ограничивать проникновение антитела в опухоль, в то время как относительно низкая аффинность и пониженная способность к интернализации могут приводить к более эффективному проникновению в солидные опухоли.

В данной области техники упоминается много факторов, влияющих на активность in vivo и селективность BiTE по отношению опухоли. Для активатора, привлекающего Т-клетки, часто могут быть желательны различные атрибуты в зависимости от природы мишени/эпитопа.

В статье James et al. (Antigen sensitivity of CD22-specific chimeric TCR is modulated by target epitope distance from the cell membrane, J. Immunol. 180 (10) (2008) 7028-7038), например, описано, что модуляция расстояния отэпитопа до мембраны повышает эффективность и/или селективность BiTE по отношению к опухоли. Исследуя нацеленное воздействие на эпитоп CD22 при различном расстоянии до мембраны с CAR-T-клетками, James et al обнаружили, что нацеленное воздействие на промежуточный домен приводило к эффективному лизису линий В-клеток-мишеней, в то время как лизиса нормальных В-клеток не обнаруживали. Аналогичным образом, Qi et al., обнаружили, что расположение эпитопа на ROR1 может влиять на активность биспецифичных антител ROR1×CD3 в формате scFv-Fc (см. Qi et al., 2018, выше). Данные скрининга панели мАт с различными эпитопами на ROR1 в работе Qi et al позволяют предположить, что мембранно-проксимальный эпитоп в Kr-домене ROR1, являющийся мишенью R11, может быть подходящим сайтом для привлечения Т-клеток биспецифичными антителами, в то время как мембранно-дистальный эпитоп на стыке Fz- и Kr-доменов, являющийся мишенью R12, может не являться таким сайтом. Биспецифичное антитело с плечом антитела R12 продемонстрировало лишь слабую противоопухолевую активность in vivo.

Описаны различные подходы к увеличению предпочтительного вовлечения опухолевых клеток путем конструирования формата антитела, в том числе на основе его размера, валентности и геометрии. Slaga et al. (Avidity-based binding to HER2 results inselective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3, Sci. Transl. Med. 10 (463) (2018).) исследовали стратегию на основе авидности с использованием формата поливалентных антител и разработали биспецифичное антитело со значениями аффинности, выбранными для усиления эффективности различения клеток, экспрессирующих HER2 с низкой или высокой плотностью. G.L. Moore, et al. (A robust heterodimeric Fc platform engineered for efficient development of bispecific antibodies of multiple formats, Methods (2018)) сообщили об аналогичной стратегии.

Кроме того, вопросом, который следует учитывать при разработке биспецифичного антитела, является его пригодность для производства. Низкий выход продукции и значительная склонность к образованию агрегатов являются свойствами, которые могут сделать лекарственное средство на основе антитела непрактичным для проведения доклинических и клинических стадий оценки.

В свете вышеизложенного и с учетом того, что ROR1 является перспективной мишенью при лечении рака, в данной области техники по-прежнему существует потребность в разработке разнообразных молекул против ROR1 с различной эффективностью связывания и/или сайтами связывания или свойствами в отношении интернализации, разработке разнообразных форматов антител и расширении и/или улучшении терапевтической ценности и пригодности для производства.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение вышеуказанных потребностей путем обеспечения новых антител против ROR1, антител против CD3 и сконструированных биспецифичных белков, связывающих как ROR1, так и CD3.

В частности, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к антителам против ROR1, например, антителам с высокой связывающей способностью по отношению к клеткам, экспрессирующим ROR1, и с низкой скоростью интернализации. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения также предложены антитела, связывающиеся с CD3, например, антитела, связывающиеся с CD3 с высокой аффинностью. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении также предложен биспецифичный ROR1/CD3-CBfl3biBaron5ift белок в формате иммуноглобулина с тандемными Fab (FIT-Ig), или в формате одновалентного асимметричного биспецифичного антитела с тандемными Fab (MAT-Fab), реагирующего как с ROR1, так и с CD3. В некоторых вариантах реализации антитела согласно настоящему изобретению пригодны для обнаружения ROR1 человека или CD3 человека, для ингибирования сигнального пути ROR1 и/или для подавления опосредованного ROR1 человека роста или метастазирования опухоли, in vitro или in vivo. Кроме того, в некоторых вариантах реализации биспецифичные поливалентные связывающие белки, описанные в настоящей заявке, пригодны для индукции ROR1-специфичной Т-клеточной цитотоксичности и/или мощной противоопухолевой активности против ROR1-экспрессирующих злокачественных клеток in vivo.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении также предложены способы получения и применения антител против ROR1 и антител против CD3 и биспецифичных ROR1/CD3-связывающих белков, описанных в настоящей заявке. Кроме того, описаны различные композиции, например, композиции, которые можно применять в способах обнаружения ROR1 и/или CD3 в образце или в способах лечения или профилактики расстройства у индивида, ассоциированного с активностью ROR1 и/или CD3.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показана активность связывания белка ROR1-ECD моноклональными антителами. Неспецифичный mIgG1 использовали в качестве отрицательного контроля.

На Фигурах 2А-В проиллюстрирована активность связывания моноклональных антител против ROR1 с клетками, экспрессирующими ROR1. Неспецифичный mIgG1 использовали в качестве отрицательного контроля.

На Фигуре 3 показана эффективность связывания CD3 биспецифичными антителами ROR1×CD3 по сравнению с соответствующими исходными моноклональными антителами против CD3. Неспецифичный hIgG использовали в качестве отрицательного контроля.

На Фигурах 4A-D проиллюстрирована эффективность связывания ROR1 биспецифичными белками ROR1×CD3 и их общим исходным моноклональным IgG1-антителом против ROR1 (HuROR1-mAb004-1) по отношению к ROR1-экспрессирующим опухолевым клеткам (A) NCI-Н1975, (В) MDA-MB-231, (С) А549 и (D) RPMI-8226.

На Фигуре 5 показаны результаты анализа репортерного гена при совместном культивировании с измерением перенаправленной активации CD3 за счет ROR1×CD3-биспецифичных FIT-Ig и MAT-Fab антител по сравнению с моноспецифичными IgG против CD3 (HuEM1006-01-24 и HuEM1006-01-27) и неспецифичным FIT-Ig (ЕМВ01).

На Фигуре 6 показаны результаты анализа репортерного гена на основе Jurkat-NFAT-luc, в котором тестировали нецелевую перенаправленную активацию CD3 при воздействии гуманизированными биспецифичными антителами ROR1×CD3 по сравнению с моноспецифичными IgG против CD3 (HuEM1006-01-24 и HuEM1006-01-27) и неспецифичным FIT-Ig (ЕМВ01).

На Фигуре 7 проиллюстрированы результаты анализа перенаправленной цитотоксичности Т-клеток при исследовании различных биспецифичных антител ROR1×CD3. Неспецифичный FIT-Ig (EMB01) использовали в качестве отрицательного контроля.

На Фигуре 8 показан профиль объема опухоли MDA-MB-231 у мышей M-NSG с трансплантированными МПК человека, обработанных биспецифичными антителами ROR1×CD3 или контрольной средой-носителем.

На Фигурах 9А-С показаны результаты анализа интернализации с использованием гуманизированного антитела против ROR1 и биспецифичных антител (A) HuROR-mAb004-1, (В) FIT 1007-12В-17 и (С) МАТ1007-12В-17.

На Фигуре 10А представлена схематическая иллюстрация доменной структуры биспецифичного антитела FIT-Ig в формате LH и формате HL. На Фигуре 10 В представлена схематическая иллюстрация доменной структуры биспецифичного антитела MAT-Fab в формате LH и формате HL.

На Фигуре 11Апоказана связывающая активность молекул FIT-Ig по отношению к клеткам MDA-MB-231, экспрессирующим ROR1. На Фигуре 11 В показана связывающая активность молекул FIT-Ig по отношению к клеткам Jurkat, экспрессирующим CD3. На Фигуре 11С показаны результаты анализа перенаправленной цитотоксичности Т-клеток для сравнения FIT1007-12B-17 с двумя эталонными молекулами FIT-Ig.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам против ROR1, антителам против CD3, их антигенсвязывающим фрагментам и поливалентным биспецифичным связывающим белкам, например, FIT-Ig или MAT-Fab, которые связываются как с ROR1, так и с CD3. Различные аспекты настоящего изобретения относятся к антителам и фрагментам антител против ROR1 и против CD3, связывающим белкам FIT-Ig и MAT-Fab, связывающимся с ROR1 человека и CD3 человека, и их фармацевтическим композициям, а также нуклеиновым кислотам, рекомбинантным экспрессирующим векторам и клеткам-хозяевам для получения таких антител, функциональных фрагментов антител и связывающих белков. Настоящее изобретение также охватывает способы применения антител, функциональных фрагментов антител и биспецифичных связывающих белков согласно настоящему изобретению для обнаружения ROR1 человека и/или CD3 человека; модулирования активности ROR1 человека и/или CD3 человека in vitro или in vivo; и лечения заболеваний, особенно рака, опосредованных связыванием ROR1 и CD3 с соответствующими лигандами.

Определения

Если в настоящей заявке не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, принятые среди специалистов в данной области техники. В случае скрытой неоднозначности определения, приведенные в настоящем изобретении, имеют преимущество перед любым словарным или внешним определением. Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, употребление терминов в единственном числе включает множественное число, а употребление терминов во множественном числе включает единственное число. В настоящей заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включая», а также других форм, например, «включает» и «включал», не является ограничивающим. Кроме того, такие термины, как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы и компоненты, содержащие один блок, так и элементы и компоненты, содержащие более чем один блок, если иное не указано явным образом.

В настоящей заявке положения аминокислот всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепей нумеруют в соответствии с системой нумерации по Kabat, которая описана в Kabat, etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) и упоминается в настоящей заявке как «нумерация по Kabat». В частности, систему нумерации по Kabat (см. стр. 647-660) Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) используют для константного домена легкой цепи CL изотипа каппа и лямбда, а систему нумерации в соответствии с индексом Kabat-EC (см. стр. 661-723) используют для константных доменов тяжелой цепи (СН1, шарнира, СН2 и СН3, что в данном случае дополнительно поясняется ссылкой на «нумерацию в соответствии с индексом Kabat-EC»).

Общие сведения о последовательностях легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека приведены в: Kabat, Е.A., etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Термин «выделенный белок» или «выделенный полипептид» представляет собой белок или полипептид, который в силу своего происхождения или источника получения не ассоциирован с природными компонентами, которые сопровождают его в нативном состоянии, по существу не содержит других белков организма того же вида, экспрессируется клеткой организма другого вида или не встречается в природе. Полипептид, химически синтезированный или синтезированный в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит естественным образом, может быть «выделен» из компонентов, ассоциированных с ним в естественных условиях. Белок также может по существу не содержать компонентов, ассоциированных с ним в естественных условиях, за счет выделения с применением методик очистки белка, хорошо известных в данной области техники.

Термин «специфичное связывание» или «специфично связывающийся» в отношении взаимодействия антитела, связывающего белка или пептида со вторым химическим соединением означает, что указанное взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на втором химическом соединении. Например, антитело распознает и связывается с конкретной структурой белка, а не с белками в целом. В общем случае, если антитело специфично по отношению к эпитопу «А», наличие молекулы, содержащей эпитоп А (или свободного, немеченого А), в реакционной смеси, содержащей меченый «А» и антитело, уменьшит количество меченого А, связанного с антителом.

Термин «антитело» в широком смысле относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig), состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей или любого его функционального фрагмента, мутанта, варианта или производного, который сохраняет существенные эпитоп-связывающие свойства молекулы Ig. Такие форматы мутантных, вариантных или производных антител известны в данной области техники, и неограничивающие варианты реализации обсуждаются ниже.

В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящей заявке как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящей заявке как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на участки гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарно сть (CDR), перемежающиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Первый, второй и третий CDR домена VH обычно нумеруют как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; аналогично, первый, второй и третий CDR домена VL обычно нумеруют как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Молекулы иммуноглобулинов могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.

Термин «Fc-область» используется для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которую можно получить путем гидролиза интактного антитела папаином. Fc-область может представлять собой нативную последовательность Fc-области или вариант Fc-области. Fc-область иммуноглобулина обычно содержит два константных домена, т.е. домен СН2 и домен СН3, и необязательно содержит домен СН4, например, как в случае Fc-областей IgM- и IgE-антител. Fc-область антител IgG, IgA и IgD содержит шарнирную область, СН2-домен и СН3-домен. Напротив, Fc-область антител IgM и IgE не содержит шарнирной области, но содержит СН2-домен, СН3-домен и СН4-домен. Вариантные Fc-области, содержащие замены аминокислотных остатков в Fc-фрагменте для изменения эффекторной функции антитела, известны в данной области техники (см., например, Winter et al., патенты США №5,648,260 и 5,624,821). Fc-фрагмент антитела может опосредовать одну или более эффекторных функций, например, индукцию цитокинов, АЗКЦ, фагоцитоз, комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) и/или скорость полураспад а/выведения антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях эти эффекторные функции желательны для терапевтического антитела, но в других случаях, в зависимости от терапевтических целей, могут быть ненужными или даже вредными. Некоторые изотипы IgG человека, в частности, IgG1 и IgG3, опосредуют АЗКЦ и КЗЦ посредством связывания с FcγR и белком комплемента Clq, соответственно. В еще одном варианте реализации по меньшей мере один аминокислотный остаток в константной области антитела, например, в Fc-области антитела, заменен таким образом, что это влияет на эффекторные функции антитела. Димеризация двух идентичных тяжелых цепей иммуноглобулина опосредуется димеризацией СН3-доменов и стабилизируется дисульфидными связями в шарнирной области, которая соединяет константные домены СН1 с константными доменами Fc (например, СН2 и СН3). Противовоспалительная активность IgG зависит от сиалирования N-связанного гликана Fc-фрагмента IgG. Определены точные требования к гликану для противовоспалительной активности, так что можно создать подходящий Fc-фрагмент IgG1, тем самым получая полностью рекомбинантный сиалированный Fc IgG1 со значительно повышенной активностью (см., Anthony et al., Science, 320: 373-376 (2008)).

Термины «антигенсвязывающая часть» и<антигенсвязывающий фрагмент» или «функциональный фрагмент» антитела используются взаимозаменяемо и относятся к одному или более фрагментам антитела, сохраняющим способность специфично связываться с антигеном, т.е. тем же антигеном (например, ROR1, CD3), что и полноразмерное антитело, из которого получен этот фрагмент.Показано, что фрагменты полноразмерного антитела могут осуществлять антигенсвязываюнгую функцию антитела. Такие варианты реализации антитела также могут быть биспецифичными, обладать двойной специфичностью или являться полиспецифичными форматами, специфично связывающимися с двумя или более различными антигенами (например, ROR1 и другим антигеном, например, CD3). Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL-и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); публикация PCT № WO 90/05144), содержащий один вариабельный домен; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить с помощью рекомбинантных способов посредством синтетического линкера, что позволяет получить их в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области образуют пары с формированием одновалентных молекул (известных как одно цепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Set USA, 85: 5879-5883 (1988)). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также входят в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и эквивалентными терминами, приведенными выше. Этот термин также охватывает и другие формы одноцепочечных антител, например, диатела. Диатела представляют собой двухвалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для обеспечения сопряжения между двумя доменами на одной цепи, что приводит к стимуляции образования пар доменов с комплементарными доменами другой цепи и созданию двух антигенсвязывающих сайтов (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Такие связывающие фрагменты антител известны в данной области техники (Kontermann and Dtibel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001), p.790 (ISBN 3-540-41354-5)). Кроме того, одноцепочечные антитела также включают «линейные антитела», содержащие пару тандемных Fv-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995); и патент США №5,641,870)).

Константный домен иммуноглобулина (С) относится к константному домену тяжелой (СН) или легкой (CL) цепи. Аминокислотные последовательности константного домена тяжелой цепи и легкой цепи IgG мыши и человека известны в данной области техники.

Термин «моноклональное антитело» или «мАт» относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие указанную популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высоко специфичны, их мишенью является единственная антигенная детерминанта (эпитоп). Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела против различных детерминант (эпитопов), мишенью каждого мАт является единственная детерминанта антигена. Модификатор «моноклональный» не следует толковать как требование продукции антитела каким-либо конкретным способом.

Термин «последовательность человека» по отношению к константному домену легкой цепи CL, константному домену тяжелой цепи СН и Fc-области антитела или связывающего белка согласно настоящей заявке означает, что указанная последовательность принадлежит к или получена из последовательности иммуноглобулина человека. Последовательность человека согласно настоящему изобретению может представлять собой нативную последовательность человека или ее вариант, содержащий изменение одного или более (например, до 20, 15, 10) аминокислотных остатков.

Термин «химерное антитело» относится к антителам, содержащим последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи одного вида животных и последовательности константной области другого вида животных, например, антителам, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепи мыши, связанные с константными областями человека.

Термин «антитело с пересаженными CDR» относится к антителам, содержащим последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи одного вида животных, в которых последовательности одного или более из CDR-участков VH и/или VL замещены последовательностями CDR другого вида животных, например, антителам, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, в которых один или более из CDR-участков человека замещены последовательностями CDR мыши.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, содержащим последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи животного, не являющегося человеком (например, мыши), в которых по меньшей мере часть последовательности VH и/или VL изменена с целью увеличения ее «человекоподобности», т.е. сходства с вариабельными последовательностями зародышевой линии человека. Одним из типов гуманизированного антитела является антитело с пересаженными CDR, в котором последовательности CDR животного, не являющегося человеком (например, мыши), внедрены в каркасные последовательности VH и VL человека. Гуманизированное антитело представляет собой антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, иммуноспецифично связывающийся с антигеном, представляющим интерес, и содержащий каркасные участки и константные области, содержащие по существу аминокислотную последовательность антитела человека, при том что участки, определяющие комплементарность (CDR), содержат по существу аминокислотную последовательность антитела нечеловеческого происхождения. В настоящей заявке термин «по существу» в контексте CDR относится к CDR, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности CDR антитела нечеловеческого происхождения. Гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов (Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), в которых все или по существу все CDR-участки соответствуют участкам иммуноглобулина нечеловеческого происхождения (т.е. донорного антитела), и все или по существу все каркасные участки являются участками консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. В одном варианте реализации гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело содержит как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать СН1-, шарнирную, СН2-, СН3- и СН4-области тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В конкретных вариантах реализации гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.

Гуманизированное антитело можно выбрать из иммуноглобулинов любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая, без ограничения, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизированное антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа, и можно выбрать конкретные константные домены для оптимизации желательных эффекторных функций с использованием методик, хорошо известных в данной области техники.

Каркасные участки и CDR-участки гуманизированного антитела не обязательно должны точно соответствовать исходным последовательностям, например, CDR донорного антитела или акцепторный каркас могут быть мутированы путем замены, инсерции и/или делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка, так что остаток CDR или каркасного участка в этом сайте не соответствует ни антителу донора, ни консенсусному каркасу. В типичном варианте реализации такие мутации, однако, не являются обширными. Как правило, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам исходных последовательностей FR и CDR. Для сохранения конкретной петлевой структуры или для правильной ориентации последовательностей CDR для контакта с антигеном-мишенью часто используют обратную мутацию в определенном положении каркасного участка с целью восстановления той же аминокислоты, которая находится в этом положении в донорном антителе.

Термин «CDR» относится к участкам, определяющим комплементарность, в последовательностях вариабельных доменов антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи присутствуют три CDR, обозначаемые как CDR-H1, CDR-H2, CDR-Н3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. В настоящей заявке термин «набор CDR» относится к группе из трех CDR, встречающихся в одной вариабельной области, способной связывать антиген. Точные границы этих CDR задают по-разному в зависимости от различных систем. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) и (1991)), обеспечивает не только однозначную систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но и точные граничные остатки, задающие указанные три CDR.

Термин «нумерация по Kabat» в отношении CDR тяжелой и легкой цепи антитела, общепризнанный в данной области техники, относится к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. См. Kabat et al., Ann. NY Acad. Set, 190: 382-391 (1971); и Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991).

Рост и анализ обширных общедоступных баз данных аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелых и легких цепей за последние двадцать лет привели к пониманию типичных границ между каркасными участками (FR) и последовательностями CDR в пределах последовательностей вариабельных областей и позволили специалистам в данной области техники точно определить CDR в соответствии с нумерацией по Kabat, нумерацией по Chothia или другими системами. См., например, Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Dübel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), chapter 31, pages 432-433.

Термин «поливалентный связывающий белок» обозначает связывающий белок, содержащий два или более антигенсвязывающих сайта. Поливалентный связывающий белок в некоторых случаях сконструирован так, что содержит три или более антигенсвязывающих сайта, и, как правило, не является встречающимся в природе антителом. Термин «биспецифичный связывающий белок» (который можно использовать взаимозаменяемо с термином «биспецифичное антитело», если не указано иное) относится к связывающему белку, способному связывать две мишени с различной специфичностью. Связывающие белки FIT-Ig согласно настоящему изобретению содержат четыре антигенсвязывающих сайта и обычно представляют собой четырехвалентные связывающие белки. Связывающие белки MAT-Fab согласно настоящему изобретению содержат два антигенсвязывающих сайта и обычно представляют собой двухвалентные связывающие белки. FIT-Ig или MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает как ROR1, так и CD3 и является биспецифичным.

Связывающий белок FIT-Ig, содержащий две длинных (тяжелых) полипептидных цепи V-C-V-C-Fc- и четыре коротких (легких) полипептидных цепи V-C, образует гексамер, демонстрирующий четыре антигенсвязывающих сайта Fab (VH-CH1 в паре с VL-CL, иногда обозначаемый как VH-CH1::VL-CL). Каждая половина FIT-Ig содержит полипептид тяжелой цепи и два полипептида легкой цепи, и комплементарное образование пары элементов иммуноглобулина VH-CH1 и VL-CL указанных трех цепей приводит к образованию двух Fab-структурированных антигенсвязывающих сайтов, расположенных в тандеме. В настоящем описании домены иммуноглобулина, содержащие Fab-элементы, предпочтительно непосредственно слиты в полипептиде тяжелой цепи без использования междоменных линкеров. Т.е. N-концевой V-C-элемент длинных (тяжелых) полипептидных цепей непосредственно слит своим С-концом с N-концом другого V-C-элемента, который, в свою очередь, связан с С-концевой Fc-областью. В биспецифичных связывающих белках FIT-Ig тандемные Fab-элементы способны реагировать с различными антигенами. Каждый антигенсвязывающий сайт Fab содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в общей сложности шесть CDR на антигенсвязывающий сайт.

Описание конструкции, экспрессии и исследование характеристик молекул FIT-Ig представлены в публикации РСТ WO 2015/103072. Пример таких молекул FIT-Ig содержит тяжелую цепь и две различные легкие цепи. Тяжелая цепь содержит структурную формулу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, где CL непосредственно слит с VH_B (а именно "формат LH") или VH_A-CH1-VL в -CL-Fc, где СН1 непосредственно слит с VL_B (а именно "формат HL"), а две легкие полипептидные цепи FIT-Ig, соответственно, характеризуются формулами VH_A-CH1 и VL_B-CL (для "формата LH") или VL_A-CL и VH_B-CH1 (для "формата HL"), соответственно; причем VL_A представляет собой вариабельный домен легкой цепи исходного антитела, связывающего антиген A, VL_B представляет собой вариабельный домен легкой цепи исходного антитела, связывающего антиген В, VH_A представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи исходного антитела, связывающего антиген A, VH_B представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи исходного антитела, связывающего антиген В, CL представляет собой константный домен легкой цепи, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, a Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина (например, С-концевой фрагмент «шарнир-СН2-СН3» тяжелой цепи антитела IgG1). В биспецифичных вариантах реализации FIT-Ig антиген А и антиген В представляют собой различные антигены или различные эпитопы одного и того же антигена. В настоящем описании один из А и В представляет собой ROR1, а другой представляет собой CD3, например, А представляет собой ROR1, а В представляет собой CD3.

Связывающий белок MAT-Fab, содержащий одну длинную (тяжелую) полипептидную цепь V-C-V-C-Fc, два коротких (легких) полипептидных цепи V-C и одну иммунологическую полипептидную Fc-цепь, образует тетрамер, демонстрирующий два антигенсвязывающих сайта Fab, расположенных в тандеме (VH-CH1 в паре с VL-CL, иногда обозначаемые как VH-CH1::VL-CL), и один димер Fc:Fc. Часто модификации внедряют в СН3-домен Fc-области тяжелой цепи MAT-Fab (сокращенно CH3m1-домен), а также СН3-домен полипептидной Fc-цепи MAT-Fab (сокращенно CH3m2-домен) в пользу гетеродимеризации двух СН3-доменов. Модификации могут представлять собой мутации «выступ во впадину» (KIH), например, мутацию выполняют для образования структурного выступа в CH3m1-домене тяжелой цепи для образования пары с CH3m2-доменом Fc-цепи, который содержит комплементарную структурную впадину. Тем не менее, другие модификации, например, модификации, внедряемые в домены за счет солевых мостиков или электростатических взаимодействий, также являются полезными. Константные области могут также содержать другие модификации, например, остатки Cys для стабилизации молекулы MAT-Fab и/или мутации для предотвращения или ослабления эффекторных функций Fc. Особенность структуры биспецифичного антитела MAT-Fab, описанного в настоящей заявке, предпочтительно состоит в том, что все смежные вариабельные и константные домены тяжелой и легких цепей иммуноглобулина непосредственно соединены друг с другом без участия промежуточной синтетической аминокислоты или пептидного линкера.

Описание конструкции, экспрессии и исследование характеристик молекул MAT-Fab представлены в публикации РСТ WO 2018/035084. Один пример таких молекул MAT-Fab содержит тяжелую цепь с «выступом» в Fc-области, две различные легкие цепи и одну полипептидную цепь Fc со «впадиной». В некоторых вариантах реализации тяжелая цепь содержит структурную формулу VL_A-CL-VH _В-СН1-шарнир-СН2-CH3m1, где CL непосредственно слит с VH_B (а именно "формат LH"), или VH_A-CH1-VL _B-CL-Fc, где CH1 непосредственно слит с VL_B (а именно "формат HL"), а две легкие полипептидные цепи MAT-Fab, соответственно, характеризуются формулами VH_A-CH1 и VL_B-CL (для "формата LH") или VL_A-CL и VH_B-CH1 (для "формата HL"), соответственно; причем VL_A представляет собой вариабельный домен легкой цепи исходного антитела, связывающего антиген A, VL_B представляет собой вариабельный домен легкой цепи исходного антитела, связывающего антиген В, VH_A представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи исходного антитела, связывающего антиген A, VH_B представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи исходного антитела, связывающего антиген В, CL представляет собой константный домен легкой цепи, СН1 представляет собой константный домен 1 тяжелой цепи, a CH3m1 представляет собой константный домен 3 тяжелой цепи с мутациями «выступа», например, S354C и T366W. Полипептидная Fc-цепь может представлять собой С-концевой фрагмент "шарнир-СН2-СН3" тяжелой цепи иммуноглобулина (например, IgG-антитела) с мутациями впадины, комплементарными мутациям выступа в CH3m2, например, T366S, L368A и Y407V. В биспецифичных вариантах реализации MAT-Fab антиген А и антиген В представляют собой различные антигены или различные эпитопы одного и того же антигена. В настоящем описании один из антигенов А и В представляет собой ROR1, а другой представляет собой CD3, например, А представляет собой ROR1, а В представляет собой CD3.

В настоящей заявке термин «k_on» (также «Kon», «kon») предназначен для обозначения константы скорости ассоциации связывающего белка (например, антитела) с антигеном с образованием ассоциированного комплекса, например, комплекса антитело/антиген, как известно в данной области техники. Термин «k_on» также известен под терминами «константа скорости ассоциации» или «ka», которые взаимозаменяемо используются в настоящей заявке. Это значение означает скорость связывания антитела с антигеном-мишенью или скорость образования комплекса между антителом и антигеном, как показано ниже в уравнении:

Антитело («Ат») + Антиген («Аг») → Ат-Аг.

В настоящей заявке термин «k_off» (также «K_off», «k_off») предназначен для обозначения константы скорости отщепления при диссоциации или «константы скорости диссоциации» связывающего белка (например, антитела) от ассоциированного комплекса (например, комплекса антитело/антиген), как известно в данной области техники. Это значение означает скорость диссоциации антитела от его антигена-мишени или разделение комплекса Ат-Аг с течением времени на свободное антитело и антиген, как показано ниже в уравнении:

Ат+Аг ← Ат-Аг.

В настоящей заявке термин «K_D» (также «Kd») предназначен для обозначения «равновесной константы диссоциации» и относится к значению, полученному при измерении титрования в равновесном состоянии, или путем деления константы скорости диссоциации (k_off) на константу скорости ассоциации (k_on). Константу скорости ассоциации (k_on), константу скорости диссоциации (k_off) и равновесную константу диссоциации (K_D) используют для представления аффинности связывания антитела с антигеном. Способы определения констант скорости ассоциации и диссоциации хорошо известны в данной области техники. Использование флуоресцентных методик обеспечивает высокую чувствительность и возможность исследовать образцы в физиологических буферах в равновесном состоянии. Можно использовать другие экспериментальные подходы и инструменты, например, анализ BIAcore® (анализ биомолекулярного взаимодействия) (например, прибор, доступный в BIAcore International АВ, компании GE Healthcare, Уппсала, Швеция). Биослойная интерферометрия (BLI) с использованием, например, системы Octet® RED96 (Pall FortéBio LLC), является еще одним методом анализа аффинности. Дополнительно можно использовать анализ KinExA® (Kinetic Exclusion Assay, анализ кинетического исключения), доступный в Sapidyne Instruments (Бойсе, штат Айдахо, США).

Термин «выделенная нуклеиновая кислота» означает полинуклеотид (например, геномного, кДНК или синтетического происхождения, или некоторую их комбинацию), который в результате вмешательства человека не ассоциирован со всеми или частью полинуклеотидов, вместе с которыми он встречается в природе; функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе; или не встречается в природе в составе последовательности большего размера.

В настоящей заявке термин «вектор» предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов вектора является «плазмида», которая относится к кольцевой двуцепочечной ДНК-петле, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Еще одним типом вектора является вирусный вектор, в котором в вирусный геном можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они внедрены (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальный сайт начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки-хозяина после внедрения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящей заявке упоминаются как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы»). В общем случае экспрессирующие векторы, пригодные для применения в технологии рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании термины «плазмида» и «вектор» можно использовать взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако предполагается, что настоящее изобретение включает и другие формы экспрессирующих векторов, например, вирусные векторы (например, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы, дефектные по репликации), выполняющие эквивалентные функции.

Термин «функционально связанный» относится к непосредственному соседству, когда описанные компоненты вступают во взаимодействие, позволяющее им функционировать предусмотренным образом. Управляющую последовательность, «функционально связанную» с кодирующей последовательностью, лигируют таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с управляющей последовательностью. «Функционально связанные» последовательности включают как последовательности для контроля экспрессии, которые непосредственно соседствуют с представляющим интерес геном, так и последовательности для контроля экспрессии, которые действуют в транс- положении или на расстоянии, управляя представляющим интерес геном. Термин «последовательность для контроля экспрессии» в настоящей заявке относится к полинуклеотидным последовательностям, необходимым для влияния на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Последовательности для контроля экспрессии включают соответствующие последовательности инициации, терминации, промотор и энхансер транскрипции; эффективные сигналы процессинга РНК, например, сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козака); последовательности, повышающие стабильность белка; и, при необходимости, последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких управляющих последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие управляющие последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие управляющие последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Подразумевается, что термин «управляющие последовательности» включает компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например, лидерные последовательности и последовательности партнеров по формированию слитого белка.

В настоящей заявке «трансформация» относится к любому процессу, посредством которого экзогенная ДНК попадает в клетку-хозяина. Трансформация может происходить в естественных или искусственных условиях с применением различных способов, хорошо известных в данной области техники. Трансформация может быть основана на любом известном способе встраивания чужеродных нуклеотидных последовательностей в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина. Указанный способ выбирают на основе трансформируемой клетки-хозяина, он может включать трансфекцию, вирусную инфекцию, электропорацию, липофекцию и бомбардировку частицами, но не ограничивается ими. Такие «трансформированные» клетки включают стабильно трансформированные клетки, в которых встроенная ДНК способна реплицироваться в виде автономно реплицирующейся плазмиды либо в составе хромосомы хозяина. Они также включают клетки, временно экспрессирующие встроенную ДНК или РНК в течение ограниченного времени.

Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») предназначен для обозначения клетки, в которую внедрена экзогенная ДНК. В одном варианте реализации клетка-хозяин содержит две или более (например, несколько) нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, например, клетки-хозяева, описанные, например, в патенте США №7,262,028. Предполагается, что такие термины относятся не только к конкретной клетке субъекта, но и к потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях возможны определенные модификации из-за мутаций или влияния окружающей среды, такое потомство может, по сути, не быть идентичным родительской клетке, но по-прежнему входит в рамки термина «клетка-хозяин», используемого в настоящей заявке. В одном варианте реализации клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки, выбранные из любого царства живых организмов. В еще одном варианте реализации эукариотические клетки включают клетки простейших, грибов, растений и животных. В еще одном варианте реализации клетки-хозяева включают линию прокариотических клеток Escherichia coli; линии клеток млекопитающих СНО, HEK 293, COS, NS0, SP2 и PER.C6; линию клеток насекомых Sf9; и клетки грибов Saccharomyces cerevisiae, но не ограничиваются ими.

В настоящей заявке термин «эффективное количество» относится к количеству терапевтического средства, достаточному для уменьшения или облегчения тяжести и/или продолжительности расстройства или одного или более из его симптомов; предотвращения прогрессирования расстройства; регрессии расстройства; предотвращения рецидива, развития или прогрессирования одного или более из симптомов, ассоциированных с расстройством; обнаружения расстройства; или усиления или улучшения профилактического (их) или терапевтического(их) эффекта(ов) другого терапевтического средства (например, профилактического или терапевтического агента).

Антитела, их функциональные фрагменты и связывающие белки согласно настоящему изобретению можно очистить (для предполагаемого применения) с помощью одного или более из различных способов и материалов, доступных в данной области техники для очистки антител и связывающих белков. Такие способы и материалы включают аффинную хроматографию (например, с использованием смол, частиц или мембран, конъюгированных с белком А, белком G, белком L или специфичным лигандом антитела, его функциональным фрагментом или связывающим белком), ионообменную хроматографию (например, с использованием ионообменных частиц или мембран), гидрофобную хроматографию («ГФХ»; например, с использованием гидрофобных частиц или мембран), ультрафильтрацию, нанофильтрацию, диафильтрацию, эксклюзионную хроматографию («ЭХ»), обработку низким рН (для инактивации загрязняющих вирусов) и их комбинации с целью получения приемлемой чистоты для предполагаемого применения, но не ограничиваются ими. Неограничивающий пример обработки низким рН для инактивации загрязняющих вирусов включает снижение рН раствора или суспензии, содержащей антитело, его функциональный фрагмент или связывающий белок согласно настоящему изобретению, до рН 3,5 с помощью 0,5 М фосфорной кислоты при 18°С - 25°С на 60-70 минут.

Для работы с рекомбинантными ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культивирования и трансформации тканей можно применять стандартные методики (например, электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и методики очистки можно осуществлять в соответствии со спецификациями производителя или в соответствии с процедурами, общепринятыми в данной области техники, или описанием, приведенным в настоящей заявке. Вышеуказанные методики и процедуры в общем случае можно выполнять в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных источниках общего характера или более специфичных источниках, которые цитируются и обсуждаются в тексте настоящего описания. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Моноспецифичные антитела против ROR1 и против CD3

Антитела против ROR1 и против CD3 согласно настоящему изобретению можно получать с помощью любого из ряда способов, известных в данной области техники. Например, путем экспрессии в клетках-хозяевах, когда экспрессирующий(е) вектор(ы), кодирующий(е) тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными способами. Предполагается, что различные формы термина «трансфекция» охватывают широкий спектр методик, обычно используемых для внедрения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, осаждение с фосфатом кальция, трансфекцию ДЭАЭ-декстраном и т.п. Хотя антитела согласно настоящему изобретению можно экспрессировать в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках, например, в клетках-хозяевах млекопитающих, специально рассматривается в настоящем изобретении, поскольку такие эукариотические клетки (и, в частности, клетки млекопитающих) осуществляют сборку и секрецию иммунологически активного антитела с правильной трехмерной структурой.

В некоторых вариантах реализации клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител согласно настоящему изобретению представляют собой клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО) (включая клетки dhfr^- СНО, описанные в Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Set USA, 11: 4216-4220 (1980), используемый с маркером селекции DHFR, например, как описано в статье Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol, 159: 601-621 (1982)), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. При внедрении рекомбинантных экспрессирующих векторов, кодирующих гены антител, в клетки-хозяева млекопитающих антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетках-хозяевах или дальнейшей секреции антитела в культуральную среду, в которой растут клетки-хозяева. Антитела можно выделить из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.

Клетки-хозяева также можно применять для получения функциональных фрагментов антител, например, Fab-фрагментов или молекул scFv. Следует понимать, что варианты вышеуказанной процедуры входят в рамки настоящего изобретения. Например, клетку-хозяина может быть желательно трансфицировать ДНК, кодирующей функциональные фрагменты легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению. Технологию рекомбинантных ДНК также можно применять для полного или частичного удаления ДНК, кодирующей одну или обе легкие и тяжелые цепи, которая не является необходимой для связывания с антигенами, представляющими интерес. Молекулы, экспрессируемые с таких укороченных молекул ДНК, входят в рамки термина «антитело» согласно настоящему изобретению. Кроме того, можно получать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепи являются антителом согласно настоящему изобретению, а другая тяжелая и легкая цепи специфичны по отношению к антигену, отличному от антигенов, представляющих интерес, путем перекрестного связывания антитела согласно настоящему изобретению со вторым антителом с помощью стандартных химических способов перекрестного связывания.

В типичной системе для рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr^- СНО путем трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В рекомбинантном экспрессирующем векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепи антитела функционально связан с регуляторными элементами энхансера CMV/промотора AdMLP для стимулирования высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также несет ген DHFR, который позволяет отбирать клетки СНО, трансфицированные вектором, с использованием селекции по метотрексату/амплификации. Выбранные трансфицированные клетки-хозяева культивируют для обеспечения экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела и выделяют интактное антитело из культуральной среды. Для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансфектантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды используют стандартные молекулярно-биологические методики. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения рекомбинантного антитела против ROR1 или антитела против CD3 путем культивирования трансфицированной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению в подходящей культуральной среде до получения рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению. Способ может дополнительно включать выделение рекомбинантного антитела из культуральной среды.

Антитела против ROR1

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены антитела, связывающиеся с ROR1 по С-концу Ig-подобного домена ROR1. Антитела, описанные в настоящей заявке в некоторых вариантах реализации обладают высокой эффективностью связывания с клетками и/или характеризуются низкой скоростью интернализации, например, согласно измерению посредством клеточного анализа.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описано выделенное антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающиеся с ROR1. В дополнительном варианте реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит набор из шести CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-H1 содержит последовательность RSWMN (SEQ ID NO: 1);

- CDR-H2 содержит последовательность RIYPGNGDIKYNGNFKG (SEQ ID NO: 2) или RIYPGNADIKYNANFKG (SEQ ID NO: 4);

- CDR-H3 содержит последовательность IYYDFYYALDY (SEQ ID NO: 3);

- CDR-L1 содержит последовательность KASQDINKYIT (SEQ ID NO: 5);

- CDR-L2 содержит последовательность YTSTLQP(SEQ ID NO: 6);

- CDR-L3 содержит последовательность LQYDSLLWT (SEQ ID NO: 7),

причем указанные CDR определены в соответствии с нумерацией по Kabat.

В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит в положениях Н31-Н35, Н50-Н65 и Н95-Н102 согласно нумерации по Kabat аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, выбранные из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1, 2, 3; или (ii) SEQ ID NO: 1, 4, 3.

В одном варианте реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит в положениях L24-34, L50-56 и L89-97 согласно нумерации по Kabat аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5, 6 и 7 для CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно.

В определенных вариантах реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мутации G55A и G61A в VH-домене согласно нумерации по Kabat. В некоторых вариантах реализации указанные мутации уменьшают склонность к дезамидированию аспарагина в антителе против ROR1 или его антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент с мутациями обладает повышенной стабильностью по сравнению с исходным антителом без мутаций.

В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, но не более пяти модификаций остатков в последовательностях CDR SEQ ID NO: 1-3 и 5-7. В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, но не более пяти модификаций остатков в последовательностях CDR SEQ ID NO: 1, 4, 3 и 5-7. Модификации аминокислот могут представлять собой аминокислотные замены, делеции и/или добавления, например, консервативные замены.

В одном варианте реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 вариабельного VH-домена тяжелой цепи и вариабельного VL-домена легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из следующих пар последовательностей VH/VL: SEQ ID NO: 8/9, 17/9, 10/13, 10/14,10/15, 10/16, 11/13, 11/14, 11/15, 11/16, 12/13, 12/14, 12/15, 12/16 и 21/13. CDR может определить специалист в данной области техники с использованием наиболее широко распространенных схем определения CDR, например, определения по Kabat, Chothia или IMGT.

В одном варианте реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит вариабельный VH-домен тяжелой цепи и вариабельный VL-домен легкой цепи, где:

- VH-домен содержит последовательность SEQ ID NO: 8 или 17, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности, и/или

- VL-домен содержит последовательность SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В еще одном варианте реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит вариабельный VH-домен тяжелой цепи и вариабельный VL-домен легкой цепи, где:

- VH-домен содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10-12 и 21, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности, и/или

- VL-домен содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13-16, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 содержит последовательность VH, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, сохраняя способность связываться с ROR1 с такими же или улучшенными свойствами связывания, например, скоростью диссоциации и/или скоростью интернализации. В некоторых вариантах реализации в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, вставлены и/или удалены в SEQ ID NO: 8, 17 или SEQ ID NO: 10-12 или 21. В определенных вариантах реализации замены, инсерции или делеции происходят в участках за пределами CDR (т.е. в FR). Антитело против ROR1 необязательно содержит последовательность VH SEQ ID NO: 8, 17 или SEQ ID NO: 10-12 или 21, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте реализации VH содержит один, два или три CDR, выбранные из: (a) CDR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (b) CDR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2/4, и (с) CDR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации последовательность VH представляет собой гуманизированную последовательность VH.

В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 содержит последовательность VL, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с эталонной последовательностью, сохраняя способность связываться с ROR1 с такими же или улучшенными свойствами связывания, например, скоростью диссоциации и/или скоростью интернализации. В некоторых вариантах реализации в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, вставлены и/или удалены в SEQ ID NO: 13. В определенных вариантах реализации замены, инсерции или делеции происходят в участках за пределами CDR (т.е. в FR). Антитело против ROR1 необязательно содержит последовательность VL SEQ ID NO: 13, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте реализации последовательность VL содержит один, два или три CDR, выбранные из: (a) CDR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, (b) CDR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (с) CDR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации последовательность VL представляет собой гуманизированную последовательность VL.

В одном варианте реализации антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит вариабельный VH-домен тяжелой цепи, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 21, и вариабельный VL-домен легкой цепи, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 13.

В одном варианте реализации выделенное антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело.

В некоторых вариантах реализации гуманизированное выделенное антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит одну или более обратных мутаций в положениях в каркасных участках для улучшения свойства связывания. В некоторых вариантах реализации VH-домен гуманизированного антитела против ROR1 или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению содержит обратные мутации по сравнению с последовательностью человека по остаткам: Glu в положении 1 (1Е), Tyr в положении 27 (27Y), His в положении 94 (94Н) и, необязательно, одному или более из Lys в положении 38 (38K), Ile в положении 48 (48I), Lys в положении 66K и Ala в положении 67 (67А) согласно нумерации по Kabat. В одном варианте реализации VL-домен гуманизированного антитела против ROR1 или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению содержит обратные мутации по сравнению с последовательностью человека по остаткам: Tyr в положении 71 (71Y) и, необязательно, одному или более из Leu в положении 4 (4L), Arg в положении 69 (69R), His в положении 49 (49Н), Не в положении 58 (58I) согласно нумерации по Kabat.

В одном варианте реализации выделенное антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело, содержащее аминокислотные остатки, подвергшиеся обратным мутациям, в VH-домене, выбранные из группы, состоящей из: (i) 1E, 27Y и 94Н, (ii) 1E, 27Y, 48I, 67А и 94Н, (iii) 1E, 27Y, 38K, 481, 67A, 66K и 94H согласно нумерации по Kabat; и/или аминокислотные остатки, подвергшиеся обратным мутациям, в VL-домене, выбранные из группы, состоящей из: (i) 71Y; (ii) 49Н, 69R и 71Y, (iii) 4L, 69R и 71Y и (iv) 4L, 49Н, 581, 69R и 71Y, согласно нумерации по Kabat.

В одном варианте реализации выделенное антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело, содержащее аминокислотные остатки 1E, 27Y и 94Н в VH-домене и аминокислотный остаток 71Y в VL-домене согласно нумерации по Kabat. В дополнительном варианте реализации выделенное антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению дополнительно содержат мутации G55A и G61A в VH-домене согласно нумерации по Kabat.

В некоторых вариантах реализации выделенное антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению содержит комбинацию последовательностей VH и VL, выбранных из группы, состоящей из:

В некоторых вариантах реализации указанное антитело содержит VH-домен, содержащий или состоящий из последовательности SEQ ID NO: 21, и VL-домен, содержащий или состоящий из последовательности SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах реализации антитела против ROR1 или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит Fc-область, которая может быть нативной или вариантной Fc-областью. В конкретных вариантах реализации Fc-область представляет собой Fc-область человека из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD. В зависимости от полезности антитела может быть желательно использовать вариант Fc-области для изменения (например, уменьшения или устранения) по меньшей мере одной эффекторной функции, например, АЗКЦ и/или КЗЦ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложено антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий Fc-область с одной или более мутациями для изменения по меньшей мере одной эффекторной функции, например, L234A и L235A.

В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающие фрагменты антитела против ROR1 согласно настоящему изобретению могут представлять собой, например, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диатела; линейные антитела; или молекулы одноцепочечного антитела (например, scFv).

В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с внеклеточным доменом ROR1 или его фрагментом. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен ROR1 содержит аминокислотную последовательность Q30-Y406 белка ROR1 человека под идентификатором UniProt Q01973-1 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с ROR1 по С-концу Ig-подобного домена ROR1. В одном варианте реализации антитело связывается с ROR1 по тому же эпитопу, что и антитело с парой последовательностей VH/VL SEQ ID NO: 8 и 9 (например, ROR1-mAb004). В одном варианте реализации антитело конкурирует с антителом с парой последовательностей VH/VL SEQ ID NO: 42 и 43 (например, антителом D10 из WO 2012097313) за связывание с ROR1.

В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются константой скорости ассоциации (k_on) по отношению к ROR1 человека, составляющей по меньшей мере 1×10⁴ M^-1 c^-1, по меньшей мере 3×10⁴ M^-1 c^-1, по меньшей мере 5×10⁴ M^-1 c^-1, по меньшей мере 7×10⁴ M^-1 c^-1, по меньшей мере 9×10⁴ M^-1 c^-1, по меньшей мере 1×10⁵ M^-1 c^-1, согласно измерениям с помощью биослойной интерферометрии или поверхностного плазмонного резонанса.

В еще одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются константой скорости диссоциации (k_off) по отношению к ROR1 человека, составляющей менее 5×10^-3 с^-1, менее 3×10 ×10^-3 c^-1, менее 2×10^-3 с^-1, менее 1×10^-3 с^-1, согласно измерениям с помощью поверхностного плазмонного резонанса или биослойной интерферометрии. В дополнительном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело и характеризуется k_off по отношению к ROR1 человека, составляющей приблизительно 1-100%, например, приблизительно 3-50% от значения k_off антитела с парой последовательностей VH/VL SEQ ID NO: 8 и 9 в том же формате антитела по отношению к ROR1 человека. Скорость диссоциации можно использовать для определения продолжительности связывания антитела с его антигеном. В целом, большее значение скорости диссоциации коррелирует с медленной диссоциацией образованного комплекса, в то время как меньшее значение скорости диссоциации коррелирует с быстрой диссоциацией. В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуется более медленной скоростью диссоциации по сравнению со скоростью диссоциации, наблюдаемой для D10, описанного в WO 2012097313, и остается связанным с ROR1-мишенью в течение большего времени, что может способствовать усилению рекрутирования эффекторных молекул в опухолевые клетки, экспрессирующие ROR1 («ROR1⁺»).

В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуется константой диссоциации (K_D) по отношению к ROR1 в наномолярном (от 10^-7 до 10^-9) диапазоне, например, менее 8×10^-7 М, менее 5×10^-7 М, менее 3×10^-7 М, менее 1×10^-7 М, менее 8×10^-8 М, менее 5×10^-8 М, менее 3×10^-8 М, менее 2×10^-8 М, менее 1×10^-8 М, менее 8×10^-9 М, менее 6×10^-9 М, менее 4×10^-9 М, менее 2×10^-9 М или менее 1×10^-9 М.

В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается с ROR1, экспрессируемым на ROR1⁺-клетках-мишенях, например, клетках линии СНО или ROR1-экспрессирующих клетках миеломных линий. Согласно измерениям с помощью проточной цитометрии в клеточном анализе, антитело против ROR1 демонстрирует сильную связывающую активность по отношению к ROR1⁺-клеткам, более сильную по сравнению со скоростью диссоциации, наблюдаемой для D10, описанного в WO 2012097313. В некоторых вариантах реализации активность связывания с клеткой отражает MFI, обнаруженная при концентрации насыщения антитела или при концентрации антитела приблизительно 100 нМ. В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящей заявке, демонстрирует более высокую эффективность связывания с ROR1, экспрессируемым на клетке-мишени, по сравнению с антителом с парой последовательностей VH/VL SEQ ID NO: 44 и 45 (например, антителом R12 из WO 2014167022) или антителом, связывающим тот же эпитоп, что и R12, на стыке Ig- и Fz-доменов ROR1. В одном варианте реализации связывающую активность антитела по отношению к клеткам, экспрессирующим ROR1, измеряют с помощью клеточного анализа, как описано в Примере 1.3.

В некоторых вариантах реализации, как и ожидалось, антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, с относительно низкой аффинностью к ROR1 в наномолярном диапазоне, но сильной связывающей способностью по отношению к поверхности клетки может способствовать распределению в опухоли и/или приводить к более селективному нацеленному воздействию на опухолевые клетки, экспрессирующие мишень с более высокой плотностью.

В одном варианте реализации антитело против ROR1, описанное в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент демонстрируют минимальную интернализацию при связывании с поверхностью ROR1-экспрессирующих клеток. В одном варианте реализации скорость интернализации составляет не более 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% или 10%, или антитело не подвергается интернализации, согласно измерениям в клеточном анализе. Скорость интернализации может отражать снижение процентной средней интенсивности флуоресценции (MFI), определяемой с помощью проточной цитометрии, при связывании антитела с поверхностью клеток, экспрессирующих ROR1, после двухчасового инкубирования при 37°С по сравнению с контролем, находящимся при 4°С в течение того же периода. В одном варианте реализации интернализацию антитела против ROR1 исследуют с использованием ROR1-экспрессирующих клеток миеломной линии. В одном варианте реализации перед обнаружением MFI выполняют инкубирование тестируемого антитела с клетками, экспрессирующими ROR1, в течение некоторого времени, например, при 4°С в течение 30 минут для обеспечения связывания антитела с ROR1 на поверхности клеток, а затем клетки инкубируют при 37°С в течение 2 часов для обеспечения интернализации, или выдерживают при 4°С в течение того же времени в качестве контроля. В одном варианте реализации скорость интернализации калибруют относительно скорости интернализации, измеренной при инкубировании при 37°С в присутствии ингибитора интернализации, например, оксида фениларсина (РАО). В одном варианте реализации степень интернализации измеряют в клеточном анализе, как описано в Примере 8.

В одном варианте реализации указанное антитело может блокировать связывание ROR1 с его лигандом Wnt5a на поверхности клеток, экспрессирующих ROR. В еще одном варианте реализации указанное антитело можно применять для ингибирования сигнального пути ROR1/wnt5. В дополнительном варианте реализации антитело можно применять для ингибирования роста и метастазирования рака, ассоциированного с путем ROR1/wnt5A.

Антитела против CD3

В настоящем изобретении также предложены антитела, способные связывать CD3 человека.

В некоторых вариантах реализации антитело против CD3 согласно настоящему изобретению содержит: набор из шести CDR, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-H1 содержит последовательность NYYVH (SEQ ID NO: 25);

- CDR-H2 содержит последовательность WISPGSDNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 26);

- CDR-H3 содержит последовательность DDYGNYYFDY (SEQ ID NO: 27);

- CDR-L1 содержит последовательность KSSQSLLNARTRKNYLA (SEQ ID NO: 28);

- CDR-L2 содержит последовательность WASTRES (SEQ ID NO: 29);

- CDR-L3 содержит последовательность KQSYILRT (SEQ ID NO: 30),

причем указанные CDR определены в соответствии с нумерацией по Kabat.

В некоторых вариантах реализации антитело против CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей заявке содержит:

- VH-домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 22 или 23, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%-90% или 95%-99% идентичностью последовательности по отношению к указанной последовательности, и/или

- VL-домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 24, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%-90% или 95%-99% идентичностью последовательности по отношению к указанной последовательности.

В некоторых вариантах реализации антитело против CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 22, и VL-домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 24. В других вариантах реализации антитело против CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH-домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 23, и VL-домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах реализации антитело против ROR1 согласно настоящему изобретению или антитело против CD3 согласно настоящему изобретению можно применять для получения производных связывающих белков, распознающих один и тот же антиген-мишень, с помощью методик, хорошо известных в данной области техники. Такое производное может представлять собой, например, одно цепочечное антитело (scFv), Fab-фрагмент (Fab), Fab' - фрагмент, F(ab')2, Fv и Fv с дисульфидной связью. Такое производное может представлять собой, например, слитый белок или конъюгат, содержащий антитело против ROR1 согласно настоящему изобретению или антитело против CD3 согласно настоящему изобретению. Слитый белок может представлять собой полиспецифичное антитело или молекулу CAR. Конъюгат может представлять собой конъюгат "антитело-лекарственное средство" (ADC) или антитело, конъюгированное с агентом для обнаружения, например, радиоактивным изотопом.

Биспецифичные связывающие белки ROR1×CD3

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены биспецифичные ROR1/CD3-связывающие белки, особенно иммуноглобулины "Fab в тандеме" (FIT-Ig) и одновалентные асимметричные биспецифичные антителам с тандемными Fab (MAT-Fab), способные связываться как с ROR1, так и с CD3. Каждый вариабельный домен (VH или VL) FIT-Ig или MAT-Fab можно получить из одного или более «исходных» моноклональных антител, связывающих один из антигенов-мишеней, т.е. ROR1 или СО3. Связывающие белки FIT-Ig или MAT-Fab можно получить с использованием последовательностей вариабельных доменов моноклональных антител против ROR1 и против CD3, описанных в настоящей заявке. Например, исходные антитела представляют собой гуманизированные антитела.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к отбору исходных антител, обладающих по меньшей мере одним или более свойствами, желательными для молекулы FIT-Ig или MAT-Fab. В одном варианте реализации свойства антитела выбирают из группы, состоящей из специфичности к антигену, аффинности к антигену, скорости диссоциации, связывающей активности по отношению к клеткам, скорости интернализации, биологической функции, распознавания эпитопа, стабильности, растворимости, эффективности продукции, иммуногенности, фармакокинетики, биодоступности, перекрестной реакционной способности по отношению к тканям и связывания ортологичного антигена.

В некоторых вариантах реализации биспецифичные белки FIT-Ig и MAT-Fab согласно настоящему изобретению сконфигурированы без использования междоменного пептидного линкера. При этом в данной области техники существует распространенное мнение, что смежные сайты связывания в поливалентных рекомбинантных форматах иммуноглобулинов, содержащих тандемные сайты связывания, должны мешать друг другу, если не использовать гибкий линкер для пространственного разделения этих сайтов связывания. Однако для ROR1/CD3 FIT-Ig и MAT-Fab согласно настоящему изобретению обнаружено, что расположение доменов иммуноглобулина в соответствии с формулами цепей, описанными в настоящей заявке, приводит к образованию полипептидных цепей, хорошо экспрессирующихся в трансфицированных клетках млекопитающих, надлежащим образом собираются и секретируются в виде биспецифичных поливалентных иммуноглобулиноподобных белков, связывающих антигены-мишени ROR1 и CD3. См. раздел "Примеры" ниже. Кроме того, исключение синтетических линкерных последовательностей из связывающих белков позволяет избежать создания антигенных сайтов, распознаваемых иммунными системами млекопитающих, и, таким образом, исключение линкеров снижает возможную иммуногенность FIT-Ig и MAT-Fab и приводит к тому, что их период полувыведения из кровотока подобен периоду полувыведения природного антитела, т.е. FIT-Ig и MAT-Fab не подвергаются быстрому выведению посредством иммунной опсонизации и захвата в печени.

В некоторых вариантах реализации биспецифичный ROR1×CD3 связывающий белок согласно настоящей заявке содержит:

a) первый антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий ROR1; и

b) второй антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий CD3.

В одном варианте реализации биспецифичные связывающие белки, описанные в настоящей заявке, содержат набор из шести CDR, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, полученных из любого антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанных в настоящей заявке, с образованием сайта связывания ROR1 указанного биспецифичного связывающего белка. В некоторых дополнительных вариантах реализации биспецифичные связывающие белки, описанные в настоящей заявке, содержат пару VH/VL, полученную из любого антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанную в настоящей заявке, с образованием сайта связывания ROR1 указанного биспецифичного связывающего белка.

В одном варианте реализации биспецифичные связывающие белки, описанные в настоящей заявке, дополнительно содержат набор из шести CDR, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, полученных из любого антитела против CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанных в настоящей заявке, с образованием сайта связывания CD3 указанного биспецифичного связывающего белка. В некоторых дополнительных вариантах реализации биспецифичные связывающие белки, описанные в настоящей заявке, содержат пару VH/VL, полученную из любого антитела против CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанную в настоящей заявке, с образованием CD3-связывающего сайта указанного биспецифичного связывающего белка.

В одном варианте реализации сайт связывания ROR1 и сайт связывания CD3 в биспецифичном ROR1/CD3-связывающем белке согласно настоящей заявке являются гуманизированными, содержащими гуманизированные последовательности VH/VL, соответственно.

Биспецифичные связывающие белки FIT-Ig

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1×CD3-связывающий белок согласно настоящей заявке представляет собой биспецифичный связывающий белок FIT-Ig, способный связывать ROR1 и CD3. Связывающий белок-иммуноглобулин типа «Fab в тандеме» (FIT-Ig) представляет собой мономерный четырехвалентный связывающий белок с двойной специфичностью, содержащий шесть полипептидных цепей и четыре функциональных связывающих Fab-области - две внешних связывающих Fab-области и две внутренние связывающие Fab-области. Как показано на Фигуре 10А, связывающий белок принимает формат (внешний Fab-внутренний Fab-Fc)×2 и связывается как с антигеном А, так и с антигеном В. В одном аспекте биспецифичный ROR1×CD3-связывающий белок согласно настоящей заявке представляет собой биспецифичный связывающий белок FIT-Ig, причем два Fab-домена белка FIT-Ig образуют первый антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий ROR1; а два других Fab-домена белка FIT-Ig образуют второй антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий CD3. В некоторых вариантах реализации связывающий белок FIT-Ig согласно настоящему изобретению не использует линкер между доменами иммуноглобулина.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен биспецифичный связывающий белок-иммуноглобулин типа «Fab в тандеме» (FIT-Ig), содержащий первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь и третью полипептидную цепь, где

(i) в формате LH первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL-VH_В-CH1-Fc, причем CL слит непосредственно с VH_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_B-CL; или

(ii) в формате HL первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1-VL_B-CL-Fc, причем CH1 слит непосредственно с VL_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_B-CH1;

причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, например, FcIgG1 (например, Fc-фрагмент, содержащий от N-конца к С-концу шарнир-СН2-СН3),

где VL_A-CL образует пару с VH_A-CH1 с образованием первого Fab, специфично связывающего первый антиген A, a VL_B-CL образует пару с VH_B-CH1 с образованием второго Fab, специфично связывающего второй антиген В, и

где первый антиген А представляет собой ROR1, а второй антиген В представляет собой CD3, или где первый антиген А представляет собой CD3, а второй антиген В представляет собой ROR1,

причем две из первых полипептидных цепей, две из вторых полипептидных цепей и две из третьих полипептидных цепей ассоциируют с образованием связывающего белка FIT-Ig.

В некоторых вариантах реализации биспецифичного связывающего белка FIT-Ig согласно настоящей заявке первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, причем антиген А представляет собой ROR1, а антиген В представляет собой CD3, или антиген А представляет собой CD3, а антиген В представляет собой ROR1.

В некоторых вариантах реализации изобретения Fab, связывающийся с ROR1, образованный путем образования пары VL-CL с VH-CH1 в связывающем белке FIT-Ig (например, образованный VL_A-CL и VH_A-CH1, когда А представляет собой ROR1; или образованный VL_B-CL и VH_B-CH1, когда В представляет собой ROR1), содержит набор из шести CDR, а именно CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, полученных из любого антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанных в настоящей заявке, с образованием сайта связывания ROR1 биспецифичного связывающего белка. В некоторых дополнительных вариантах реализации CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат, соответственно, последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 5, 6, 7; или последовательности SEQ ID NO: 1, 4, 3 и 5, 6, 7.

В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с ROR1 в связывающем белке FIT-Ig, содержит пару VH/VL, полученную из любого антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанную в настоящей заявке. В некоторых дополнительных вариантах реализации пара VH/VL содержит последовательности, выбранные из группы, состоящей из следующих пар последовательностей VH/VL: SEQ ID NO: 8/9, 17/9, 10/13, 10/14, 10/15, 10/16, 11/13, 11/14, 11/15, 11/16, 12/13, 12/14, 12/15, 12/16 и 21/13, или последовательностей, идентичных им по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с ROR1 в связывающем белке FIT-Ig, содержит последовательность VH SEQ FD NO: 21 и последовательность VL SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с CD3, образованный путем образования пары VL-CL с VH-CH1 в связывающем белке FIT-Ig (например, образованный VL_A-CL и VH_A-CH1, когда А представляет собой CD3; или образованный VL_B-CL и VH_B-CH1, когда В представляет собой CD3), содержит набор из шести CDR, а именно CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, полученных из любого антитела против CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанных в настоящей заявке, с образованием сайта связывания CD3 биспецифичного связывающего белка. В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с CD3, образованный путем образования пары VL-CL с VH-CH1 в связывающем белке FIT-Ig, содержит набор из шести CDR, причем CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат последовательности SEQ ID NO: 25, 26, 27 и 28, 29, 30, соответственно. Согласно некоторым дополнительным вариантам реализации Fab, связывающийся с CD3, содержит пару VH/VL, содержащую последовательности SEQ ID NO: 22 и 24 или последовательности, которые имеют по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности по отношению к указанным последовательностям; или последовательности SEQ ID NO: 23 и 24 или последовательности, которые имеют по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности по отношению к указанным последовательностям.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен биспецифичный связывающий белок-иммуноглобулин типа «Fab в тандеме» (FIT-Ig), содержащий первую, вторую и третью полипептидные цепи,

где:

(i) в формате LH первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, причем CL слит непосредственно с VH_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_B-CL; или

(ii) в формате HL первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1-VL_B-CL-Fc, причем CH1 слит непосредственно с VL_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_B-CH1;

причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, А представляет собой эпитоп ROR1, а В представляет собой эпитоп CD3, или А представляет собой эпитоп CD3, а В представляет собой эпитоп ROR1. В соответствии с настоящим изобретением такие связывающие белки FIT-Ig связываются как с ROR1, так и с CD3.

В некоторых вариантах реализации Fab-фрагменты таких связывающих белков FIT-Ig содержат домены VL_A-CL и VH_A-CH1 из исходного антитела, связывающегося с одним из антигенов ROR1 и CD3, и домены VL_B-CL и VH_B-CH1 из другого исходного антитела, связывающегося с другим из антигенов ROR1 и CD3. В некоторых вариантах реализации образование пары VH-CH1::VL-CL приводит к образованию тандемных фрагментов Fab, распознающих как ROR1, так и CD3.

В соответствии с настоящим изобретением ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig содержит первую, вторую и третью полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_ROR1-CL-VH_CD3-СН1-шарнир-СН2-СН3, причем CL непосредственно слит с VH_CD3, причем вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_ROR1-CH1; и причем третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_CD3-CL. В альтернативных вариантах реализации ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig содержит первую, вторую и третью полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_ROR1-CH1-VL_CD3-CL-шарнир-CH2-CH3, причем СН1 непосредственно слит с к VL_CD3, причем вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_ROR1-CL; и причем третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_CD3-CH1. В некоторых вариантах реализации VL_ROR1 представляет собой вариабельный домен легкой цепи антитела против ROR1, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH_ROR1 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи антитела против ROR1, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, VL_CD3 представляет собой вариабельный домен легкой цепи антитела против CD3, VH_CD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи антитела против CD3; и, необязательно, домены VL_CD3-CL являются такими же, как и легкая цепь исходного антитела против CD3, домены VH_CD3-CH1 являются такими же, как и вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен тяжелой цепи исходного антитела против CD3, домены VL_ROR1-CL являются такими же, как и легкая цепь исходного антитела против ROR1, и домены VH_ROR1-CH1 являются такими же, как и вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен тяжелой цепи исходного антитела против ROR1.

В вышеприведенных формулах для связывающего белка FIT-Ig Fc-область может быть нативной или вариантной Fc-областью. В конкретных вариантах реализации Fc-область представляет собой Fc-область человека из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD. В конкретных вариантах реализации Fc представляет собой Fc человека из IgG1 или модифицированную Fc человека, содержащую одну или более мутаций для ослабления или устранения по меньшей мере одной эффекторной функции Fc, например, связывания Fc с FcγR, АЗКЦ и/или КЗЦ. Мутации могут представлять собой, например, L234A/L235A (нумерация согласно индексу Kabat-EC). В одном варианте реализации Fc-область получена из IgG1 человека с мутациями L234A и L235A, например, представленными ниже в Таблице 8 (от АК 104 до АК 227 SEQ ID NO: 31). В одном варианте реализации Fc-область содержит последовательность АК 104 - АК 227 SEQ ID NO: 31 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В некоторых вариантах реализации связывающего белка FIT-Ig согласно настоящему изобретению домены CH1, CL и Fc представляют собой последовательности человека или получены из них. В некоторых вариантах реализации связывающего белка FIT-Ig согласно настоящему изобретению СН1 представляет собой константный домен CH1 IgG1 человека, например, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 33, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности. В вышеуказанных формулах для связывающего белка FIT-Ig CL представляет собой константный каппа-домен CL человека, например, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 32, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В одном варианте реализации связывающие белки FIT-Ig согласно настоящему изобретению сохраняют одно или более свойств исходных антител. В некоторых вариантах реализации FIT-Ig сохраняет аффинность связывания с антигенами-мишенями (т.е. CD3 и ROR1), сопоставимое с аффинностью связывания исходных антител, что означает, что аффинность связывания FIT-Ig с антигенами-мишенями ROR1 и CD3 изменено не более чем в 10 раз по сравнению с аффинностью связывания исходных антител с соответствующими антигенами-мишенями, согласно измерениям с помощью поверхностного плазмонного резонанса или биослойной интерферометрии.

В одном варианте реализации связывающий белок FIT-Ig согласно настоящему изобретению связывает ROR1 и CD3 и состоит из первой полипептидной цепи, второй полипептидной цепи и третьей полипептидной цепи, где:

- первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 37 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности,

- вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности, и

- третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В одном варианте реализации связывающий белок FIT-Ig в соответствии с настоящим изобретением связывает ROR1 и CD3 и состоит из первой полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 34 или 37; второй полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 35; и третьей полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36.

Биспецифичный связывающий белок MAT-Fab

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1×СО3-связывающий белок согласно настоящей заявке представляет собой биспецифичный связывающий белок MAT-Fab, способный связывать ROR1 и CD3. Биспецифичный связывающий белок с одновалентным асимметричным тандемным Fab (MAT-Fab) представляет собой мономерный двухвалентный связывающий белок с двойной специфичностью, содержащий четыре полипептидные цепи и две функциональные Fab-области связывания в тандеме. Как показано на Фигуре 10 В, связывающий белок использует формат внешний Fab-внутренний Fab-димер Fc:Fc и связывает как антиген А, так и антиген В. В некоторых вариантах реализации биспецифичный ROR1×CD3-связывающий белок согласно настоящей заявке представляет собой биспецифичный связывающий белок MAT-Fab, причем один Fab-домен белка MAT-Fab образует первый антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий ROR1; а другой Fab-домен белка MAT-Fab образует второй антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий CD3.

В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения предложен биспецифичный связывающий белок с одновалентным асимметричным тандемным Fab (MAT-Fab), содержащий первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь, третью полипептидную цепь и четвертую полипептидную цепь, где

(i) в формате LH первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, где CL слит непосредственно с VH_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_B-CL; и четвертая полипептидная цепь содержит Fc; или

(ii) в формате FTL первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1-VL_B-CL-Fc, где CH1 присоединен непосредственно к VL_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_B-CH1; и четвертая полипептидная цепь содержит Fc;

причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, например, Fc IgG1 (например, Fc-фрагмент, содержащий от N-конца к С-концу шарнир-СН2-СН3),

где VL_A-CL образует пару с VH_A-CH1 с образованием первого Fab, специфично связывающего первый антиген A, a VL_B-CL образует пару с VH_B-CH1 с образованием второго Fab, специфично связывающего второй антиген В, и

где первый антиген А представляет собой ROR1, а второй антиген В представляет собой CD3, или где первый антиген А представляет собой CD3, а второй антиген В представляет собой ROR1,

где первая полипептидная цепь, вторая полипептидная цепь, третья полипептидная цепь и четвертая полипептидная цепь ассоциируют с образованием связывающего белок MAT-Fab.

В некоторых вариантах реализации связывающего белка MAT-Fab согласно настоящему изобретению Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, содержащую от N-конца к С-концу шарнир-СН2-СН3, причем шарнир-СН2 представляет собой область шарнир-СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина, причем область шарнир-СН2 слита непосредственно с СН3, и причем Fc-область первой полипептидной цепи содержит первый СН3-домен (домен CH3m1), а Fc-область четвертой полипептидной цепи содержит второй СН3-домен (домен CH3m2). В дополнительных вариантах реализации Fc-области первой и четвертой полипептидных цепей, особенно в их СН3-доменах, содержат гетеродимеризующие модификации, которые способствуют гетеродимеризации по сравнению с гомодимеризацией двух указанных Fc-областей. В некоторых вариантах реализации для содействия гетеродимеризации цепей используют технологию гетеродимеризации "выступ во впадину". Связывающий белок MAT-Fab необязательно дополнительно содержит мутацию в первом СН3-домене (домене CH3m1) и во втором СН3-домене (домене CH3m2), приводящие к внедрению остатка цистеина, способствующего образованию дисульфидной связи при образовании пары двух указанных СН3-доменов.

В некоторых вариантах реализации в первый СН3-домен (домен CH3m1) первой цепи и второй СН3-домен (домен CH3m2) четвертой цепи внедряют одну или более мутаций типа "выступ во впадину" (KiH). В дополнительном варианте реализации, когда первый СН3-домен (домен CH3m1) первой цепи мутируют с образованием структурного выступа, второй СН3-домен (домен CH3m2) четвертой цепи мутируют с образованием комплементарной структурной впадины, что способствует образованию пары первого СН3-домена со вторым СН3-доменом; или когда первый СН3-домен (домен CH3m1) первой цепи мутируют с образованием структурной впадины, второй СН3-домен (домен CH3m2) четвертой цепи мутируют с образованием комплементарного структурного выступа, что способствует образованию пары первого СН3-домена со вторым СН3-доменом. В некоторых вариантах реализации мутация "выступа" представляет собой замену T366W, а комплементарные мутации "впадины" представляют собой замены T366S, L368A и Y407V.

В некоторых вариантах реализации биспецифичный связывающий белок согласно настоящему изобретению представляет собой белок MAT-Fab с типичной заменой выступа (T366W) в первом СН3-домене и соответствующей заменой впадины (T366S, L368A и Y407V) во втором СН3-домене и необязательно с двумя дополнительными внедренными остатками цистеина S354C/Y349C (содержащимися в соответствующих последовательностях СН3). Например, первый СН3-домен (домен CH3m1) может содержать замену выступа T366W и внедренный остаток цистеина S354C, а второй СН3-домен (домен CH3m2) содержит T366S, L368A и Y407V в качестве замен впадины и внедренный остаток цистеина Y349C.

Модули димеризации "выступ во впадину" и их применение при конструировании антител хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в статье Ridgway et al., 1996, Protein Engineering 9(7) 617-621. О внедрении дополнительного дисульфидного мостика в СН3-домен сообщается, например, в статье Merchant, А.М., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681.

В некоторых вариантах реализации биспецифичного связывающего белка MAT-Fab согласно настоящей заявке первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, причем антиген А представляет собой ROR1, антиген В представляет собой CD3 или антиген А представляет собой CD3, антиген В представляет собой ROR1.

В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с ROR1, образованный путем образования пары VL-CL с VH-CH1 в связывающем белке MAT-Fab (например, образованный VL_A-CL и VH_A-CH1, когда Апредставляет собой ROR1), содержит набор из шести CDR, а именно: CDR-H1, CDR-H2, CDR-Н3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, полученных из любого антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанных в настоящей заявке, с образованием сайта связывания ROR1 биспецифичного связывающего белка. В некоторых вариантах реализации CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 5, 6, 7, соответственно; или содержат последовательности SEQ ID NO: 1, 4, 3 и 5, 6, 7, соответственно. В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с ROR1 в связывающем белке MAT-Fab, содержит пару VH/VL, полученную из любого антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанную в настоящей заявке, с образованием сайта связывания ROR1 биспецифичного связывающего белка. В некоторых вариантах реализации пара VH/VL содержит последовательности, выбранные из группы, состоящей из следующих пар последовательностей VH/VL: SEQ ID NO: 8/9, 17/9, 10/13, 10/14, 10/15, 10/16, 11/13, 11/14, 11/15, 11/16, 12/13, 12/14, 12/15,12/16 и 21/13, или последовательности, идентичные им по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с ROR1 в связывающем белке MAT-Fab, содержит последовательность VH SEQ ID NO: 21 и последовательность VL SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с CD3, образованный путем образования пары VL-CL с VH-CH1 в связывающем белке MAT-Fab (например, образованный VL_B-CL и VH_B-CH1, когда В представляет собой CD3), содержит набор из шести CDR, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, полученных из любого антитела против CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей заявке и описанных в настоящей заявке, с образованием сайта связывания CD3 биспецифичного связывающего белка. В некоторых вариантах реализации Fab, связывающийся с CD3, образованный путем образования пары VL-CL с VH-CH1 в связывающем белке MAT-Fab, содержит набор из шести CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащий соответственно последовательности SEQ FD NO: 25, 26, 27 и 28, 29, 30. В некоторых дополнительных вариантах реализации Fab, связывающийся с CD3, содержит пару VH/VL, содержащую последовательности SEQ ID NO: 22 и 24 или последовательности, идентичные им по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 99%; или последовательности SEQ ID NO: 23 и 24 или последовательности, идентичные им по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.

В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения предложен биспецифичный связывающий белок с одновалентным асимметричным тандемным Fab (MAT-Fab), содержащий первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь, третью полипептидную цепь и четвертую полипептидную цепь, где

(i) в формате LH первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, где CL непосредственно слит с VH_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_B-CL; и четвертая полипептидная цепь содержит Fc; или

(ii) в формате HL первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_A-CH1-VL_B-CL-Fc, где СН1 слит непосредственно с VL_B; вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_A-CL; третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VHr-CH1; и четвертая полипептидная цепь содержит Fc;

причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, содержащую от N-конца к С-концу шарнир-СН2-СН3, А представляет собой эпитоп ROR1, а В представляет собой эпитоп CD3, или А представляет собой эпитоп CD3, а В представляет собой эпитоп ROR1. В соответствии с настоящим изобретением такие связывающие белки MAT-Fab связываются как с ROR1, так и с CD3.

В некоторых вариантах реализации Fab-фрагменты таких связывающих белков MAT-Fab содержат домены VL_A-CL и VH_A-CH1 из исходного антитела, связывающегося с одним из антигенов ROR1 и CD3 (например, антитела против ROR1 или антитела против CD3, описанных в настоящей заявке), и домены VL_B-CL и VH_B-CH1 из другого исходного антитела, связывающегося с другим из антигенов ROR1 и CD3 (например, антитела против ROR1 или антитела против CD3, описанных в настоящей заявке). В некоторых вариантах реализации образование пары VH-CH1::VL-CL приводит к образованию тандемных фрагментов Fab, распознающих как ROR1, так и CD3.

В соответствии с настоящим изобретением ROR1/CD3-связывающий белок MAT-Fab содержит первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_ROR1-CL-VH_CD3-СН1-шарнир-СН2-CH3m1, причем CL слит непосредственно с VH_CD3; причем вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_ROR1-CH1; причем третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_CD3-CL; и причем четвертая полипептидная цепь представляет собой полипептидную цепь Fc, содержащую нгарнир-СН2-CH3m2. В альтернативных вариантах реализации ROR1/CD3-связывающий белок MAT-Fab содержит первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_ROR1-CH1-VL_CD3-CL-шарнир-СН2-CH3m1, причем СН1 непосредственно слит с VL_CD3; причем вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VL_ROR1-CL; причем третья полипептидная цепь содержит от N-конца к С-концу VH_CD3-CH1; и причем четвертая полипептидная цепь представляет собой полипептидную цепь Fc, содержащую шарнир-СН2-CH3m2. В некоторых вариантах реализации VL_ROR1 представляет собой вариабельный домен легкой цепи антитела против ROR1, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH_ROR1 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи антитела против ROR1, СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, VL_CD3 представляет собой вариабельный домен легкой цепи антитела против CD3, VH_CD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи антитела против CD3, и в домены CH3m1 и CH3m2 внедрена одна или более мутаций "выступ во впадину", способствующих гетеродимеризации доменов CH3m1 и CH3m2; и домены VL_CD3-CL являются такими же, как и легкая цепь исходного антитела против CD3, домены VH_CD3-CH1 являются такими же, как и вариабельный и константный домены тяжелой цепи исходного антитела против CD3, домены VL_ROR1-CL являются такими же, как и легкая цепь исходного антитела против ROR1, и домены VH_ROR1-CH1 являются такими же, как и вариабельный и константный домены тяжелой цепи исходного антитела против ROR1.

В вышеприведенных формулах для первой полипептидной цепи связывающего белка MAT-Fab Fc-область может быть нативной или вариантной Fc-областью. В конкретных вариантах реализации Fc-область представляет собой Fc-область человека из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE или IgD. В конкретных вариантах реализации Fc представляет собой Fc IgG человека или ее вариант. В некоторых вариантах реализации Fc-область представляет собой вариантную Fc-область, содержащую мутации для ослабления или устранения по меньшей мере одной эффекторной функции Fc-области, например, связывания Fc с FcγR, АЗКЦ и/или КЗЦ. Мутации могут представлять собой, например, L234A и L235A (нумерация согласно индексу Kabat ЕС). В одном варианте реализации указанная Fc-область представляет собой область IgG1 человека с мутациями L234A и L235A.

В некоторых вариантах реализации связывающего белка MAT-Fab согласно настоящему изобретению домены CH1, CL и Fc представляют собой или получены из последовательностей человека. В некоторых вариантах реализации связывающего белка MAT-Fab согласно настоящему изобретению СН1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, например, константный домен CH1 IgG1 человека, например, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 33, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности. В вышеуказанных формулах для связывающего белка MAT-Fab CL представляет собой константный домен легкой цепи, например, константный каппа-домен CL человека, например, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 32, или последовательностью, которая имеет по меньшей мере 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В некоторых вариантах реализации связывающий белок MAT-Fab согласно настоящему изобретению не использует линкер между доменами иммуноглобулина.

Согласно одному из вариантов реализации связывающие белки MAT-Fab согласно настоящему изобретению сохраняют одно или более из свойств исходных антител. В некоторых вариантах реализации MAT-Fab сохраняет аффинность связывания с антигенами-мишенями (т.е. CD3 и ROR1), сопоставимое с аффинностью связывания исходных антител, что означает, что аффинность связывания MAT-Fab с антигенами-мишенями ROR1 и CD3 изменено не более чем в 10 раз по сравнению с аффинностью связывания исходных антител с соответствующими антигенами-мишенями, согласно измерениям с помощью поверхностного плазмонного резонанса или биослойной интерферометрии.

В одном варианте реализации связывающий белок MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает ROR1 и CD3 и состоит из первой полипептидной цепи, второй полипептидной цепи и третьей полипептидной цепи и четвертого полипептида, где:

- первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38 или 40 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности,

- вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности,

- третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности; и

- четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39 или последовательность, которая имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к указанной последовательности.

В одном варианте реализации связывающий белок MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает ROR1 и CD3 и состоит из первой полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQID N0:38 или 40; второй полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 35; третьей полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36; и четвертой полипептидной цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.

Свойства биспецифичных связывающих белков

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или MAT-Fab, способный связывать как CD3, так и ROR1, описанный в настоящей заявке, содержит гуманизированный сайт связывания ROR или химерный сайт связывания ROR1, например, гуманизированный сайт связывания ROR. В одном варианте реализации гуманизированный сайт связывания ROR1 в формате белка FIT-Ig или MAT-Fab характеризуется пониженной скоростью диссоциации в отношении связывания ROR1 по сравнению с химерным сайтом связывания ROR1 в том же формате FIT-Ig или MAT-Fab, состоящем из пары VH и VL SEQ ID NO: 8 и 9. В дополнительном варианте реализации отношение скорости диссоциации гуманизированного сайта связывания ROR1 по сравнению с химерным сайтом связывания ROR1 составляет менее 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, согласно измерениям с помощью поверхностного плазмонного резонанса или биослойной интерферометрии. В одном варианте реализации скорость диссоциации связывающего белка FIT-Ig, описанного в настоящей заявке, по отношению к ROR1 составляет менее 2×10^-3 с^-1, 1×10^-3 с^-1, 8×10^-4 с^-1, 6×10^-4 с^-1, 5×10^-4 с^-1, 4×10^-4 с^-1, 3×10^-4 с^-1, 2×10^-4 с^-1, 1×10^-4 с^-1, 8×10^-5 с^-1, 6×10^-5 с^-1, согласно измерениям с помощью поверхностного плазмонного резонанса или биослойной интерферометрии. В одном варианте реализации связывающий белок-антитело FIT-Ig, описанный в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуется константой диссоциации (K_D) по отношению к ROR1 в диапазоне от 10^-8 до 10^-10, например, менее 8×10^-8 М, менее 5×10^-8 М, менее 3×10^-8 М, менее 2×10^-8 М, менее 1×10^-8 М, менее 1×10^-8 М, менее 8×10^-9 М, менее 6×10^-9 М, менее 4×10^-9 М, менее 2×10^-9 М или менее 1×10^-9 М, менее 8×10^-10 М, менее 6×10^-10 М, менее 4×10^-10 М, менее 2×10^-10 М или менее 1×10^-10 М. В одном варианте реализации связывающий белок-антитело FIT-Ig, описанный в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются скоростью диссоциации в отношении связывания ROR1 в диапазоне от 1×10^-3 с^-1 до 1×10^-4 с^-1, например, менее 2×10^-4 с^-1, и K_D в диапазоне от 1×10^-9 с^-1 до 1×10^-10 с^-1, например, менее 6×10^-10 с^-1.

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или связывающий белок MAT-Fab, способный связывать CD3 и ROR1, описанный в настоящей заявке, можно экспрессировать в культурах трансфицированных клеток-хозяев млекопитающих, например, клеток СНО или клеток HEK293, в концентрациях, превышающих 10 мг ROR1/CD3-связывающего белка FIT-Ig или связывающего белка MAT-Fab на литр клеточной культуры (>10 мг/л). В одном варианте реализации уровень экспрессии связывающего белка FIT-Ig или MAT-Fab составляет более 15 мг/л, например, от 15 мг/л до 100 мг/л или более. В еще одном варианте реализации уровень экспрессии связывающего белка FIT-Ig или MAT-Fab превышает 20 мг/л.

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig, или связывающий белок MAT-Fab, способный связывать CD3 и ROR1, описанный в настоящей заявке, после одноэтапной очистки от среды для культивирования клеток с использованием аффинной хроматографии с белком А характеризуется чистотой не менее 90%, как обнаружено с помощью ЭХ-ВЭЖХ. В одном варианте реализации связывающие белки, подвергавшиеся одноэтапной очистке, характеризуются чистотой не менее 91%, 92%, 93%, 95%, 97%, 99%, как обнаружено с помощью ЭХ-ВЭЖХ.

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, демонстрирует минимальную интернализацию при связывании клеток с поверхностью ROR1-экспрессирующих клеток. В одном варианте реализации скорость интернализации составляет не более 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, или связывающий белок не интернализируется, согласно клеточному анализу.

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, способен связывать как CD3-экспрессирующие клетки, так и ROR1-экспрессирующие клетки. В одном варианте реализации CD3-экспрессирующие клетки представляют собой клетки линий СНО, трансфицированные комплексом TCR/CD3 человека, или Т-клетки человека. В одном варианте реализации ROR1-экспрессирующие клетки представляют собой опухолевые клетки, экспрессирующие ROR1, например, клетки немелкоклеточного рака легкого человека, клетки рака молочной железы человека, клетки карциномы легкого или клетки миеломы.

В одном варианте реализации эффективность связывания биспецифичного связывающего белка FIT-Ig-c ROR1-экспрессирующими клетками, измеренная с помощью проточной цитометрии в клеточном анализе, эквивалентна или сопоставима с эффективностью соответствующего исходного моноклонального IgG-антитела против ROR1, содержащего те же пары последовательностей VH/VL для связывания ROR1, что и биспецифичный белок FIT-Ig. В одном варианте реализации эффективность связывания биспецифичного связывающего белка FIT-Ig с CD3-экспрессируюшими клетками, измеренная с помощью проточной цитометрии, например, в анализе, описанном в Примере 4, эквивалентна или относительно ниже (но не более чем в 10 раз, например, не более чем в 2 раза, 1 раз или на 50% ниже) эффективности соответствующего исходного моноклонального антитела против CD3, содержащего те же пары последовательностей VH/VL для связывания CD3, что и биспецифичный связывающий белок.

В одном варианте реализации биспецифичный связывающий белок, описанный в настоящей заявке, может модулировать биологическую функцию ROR1 и/или CD3. В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig, или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, может активировать сигнальный путь CD3 с учетом зависимости от ROR1. В одном варианте реализации биспецифичные связывающие белки согласно настоящему описанию демонстрируют ROR1-зависимую активацию Т-клеток. В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, демонстрирует ROR1-перенаправленную Т-клеточную цитотоксичность. В одном варианте реализации биспецифичные связывающие белки согласно настоящему изобретению применяют для перенаправления цитотоксической активности Т-клеток по отношению к ROR1-экспрессирующим клеткам без ограничений со стороны МНС.

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, демонстрирует ROR1-зависимую активацию CD3. В одном варианте реализации при связывании с ROR1-экспрессирующими клетками ROR1/CD3-биспецифичные антитела индуцируют перекрестное связывание комплекса CD3/TCR на Т-клетках и активацию сигнального пути CD3. В одном варианте реализации отношение ROR1-экспрессирующих клеток-мишеней к эффекторным Т-клеткам составляет приблизительно 1:1. В дополнительном варианте реализации изобретения биспецифичные ROR1/CD3-связывающие белки демонстрируют повышенную активацию Т-клеток в присутствии ROR1-экспрессирующих клеток-мишеней и значительно бболее слабую неспецифичную перенаправленную активацию CD3 в отсутствие ROR1-экспрессирующих клеток-мишеней по сравнению с соответствующими исходными моноклональными антителами против CD3, содержащими те же пары последовательностей VH/VL для связывания CD3, что и биспецифичные белки FIT-Ig или MAT-Fab, например, как измерено при соотношении клеток-мишеней к эффекторным Т-клеткам, приблизительно равном 1:1.

В одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, перенаправляет цитотоксичность Т-клеток на опухолевые клетки, экспрессирующие ROR1. В еще одном варианте реализации биспецифичный ROR1/CD3-связывающий белок FIT-Ig или связывающий белок MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, демонстрируют противоопухолевую активность, например, снижение опухолевой нагрузки, ингибирование роста опухоли или подавление размножения опухолевых клеток.

Фармацевтические композиции

В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или биспецифичный поливалентный связывающий белок согласно настоящему изобретению (т.е. первичный активный ингредиент) и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте реализации указанная композиция содержит одно или более из антител или связывающих белков согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие комбинацию антител против ROR1 и против CD3, описанных в настоящей заявке, или их антигенсвязывающих фрагментов и фармацевтически приемлемый носитель. В частности, в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один связывающий белок FIT-Ig, способный связывать ROR1 и CD3, и фармацевтически приемлемый носитель. В частности, в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один связывающий белок MAT-Fab, способный связывать ROR1 и CD3, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент. В некоторых вариантах реализации такой дополнительный ингредиент включает профилактический и/или терапевтический агент, агент для обнаружения, например, противоопухолевое лекарственное средство, цитотоксический агент, антитело с другой специфичностью или его функциональный фрагмент, обнаружимую метку или репортер, но не ограничивается ими. В одном варианте реализации фармацевтическая композиция содержит один или более из дополнительных профилактических или терапевтических агентов, т.е. агентов, отличных от антител или связывающих белков согласно настоящему изобретению, для лечения расстройства, при котором активность ROR1 является вредоносной. В одном варианте реализации дополнительные профилактические или терапевтические агенты заведомо пригодны для применения, применялись или применяются в настоящее время для профилактики, лечения, контроля или облегчения расстройства или одного или более его симптомов.

Фармацевтические композиции, содержащие белки согласно настоящему изобретению, предназначены, в числе прочего, для применения при диагностике, обнаружении или мониторинге расстройства, лечении, ведении или облегчении расстройства или одного или более его симптомов; и/или в исследовательских целях. В некоторых вариантах реализации композиция может также содержать носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Вспомогательное вещество в общем случае представляет собой любое соединение или комбинацию соединений, придающее композиции желательное свойство, помимо свойства основного активного ингредиента (т.е., не являющееся антителом, его функциональным фрагментом или связывающим белком согласно настоящему изобретению).

Нуклеиновая кислота, вектор и клетки-хозяева

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие одну или более из аминокислотных последовательностей антитела против ROR1 согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента; выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие одну или более из аминокислотных последовательностей антитела против CD3 согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента; и выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие одну или более из аминокислотных последовательностей биспецифичного связывающего белка, включая иммуноглобулин Fab в тандеме (FIT-Ig) и связывающий белок MAT-Fab, способный связывать как ROR1, так и CD3. Такие нуклеиновые кислоты можно вставить в вектор для выполнения различных генетических анализов или для экспрессии, исследования или улучшения одного или более свойств антитела или связывающего белка, описанных в настоящей заявке. Вектор может содержать одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих одну или более из аминокислотных последовательностей антитела или связывающего белка, описанных в настоящей заявке, причем указанные одна или более молекул нуклеиновой кислоты функционально связаны с соответствующими транскрипционными и/или трансляционными последовательностями, обеспечивающими экспрессию антитела или связывающего белка в конкретной клетке-хозяине, несущей вектор. Примеры векторов для клонирования или экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотные последовательности связывающих белков, описанных в настоящем документе, включают pcDNA, рТТ, рТТ3, pEFBOS, pBV, pJV и pBJ и их производные, но не ограничиваются ими.

В настоящем изобретении также предложена клетка-хозяин, экспрессирующая или способная экспрессировать вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более из аминокислотных последовательностей антитела или связывающего белка, описанных в настоящей заявке. Клетки-хозяева, которые можно применять в настоящем изобретении, могут быть прокариотическими или эукариотическими. Типичной прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli. Эукариотические клетки, которые можно применять в качестве клеток-хозяев согласно настоящему изобретению, включают клетки простейших, клетки животных, клетки растений и клетки грибов. Типичная грибковая клетка представляет собой дрожжевую клетку, включая Saccharomyces cerevisiae. Типичная клетка животного, которую можно использовать в качестве клетки-хозяина согласно настоящему изобретению, включает клетку млекопитающего, клетку птицы и клетку насекомого, но не ограничивается ими. Типичные клетки млекопитающих включают клетки СНО, клетки НЕK и клетки COS, но не ограничиваются ими.

Способы продукции

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продукции антитела против ROR1 или его функционального фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, кодирующий антитело или функциональный фрагмент, в культуральной среде в условиях, достаточных для экспрессии антитела или фрагмента, способного связывать ROR1, клеткой-хозяином.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продукции антитела против CD3 или его функционального фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, кодирующий антитело или функциональный фрагмент, в культуральной среде в условиях, достаточных для экспрессии антитела или фрагмента, способного связывать CD3, клеткой-хозяином.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продукции биспецифичного поливалентного связывающего белка, способного связывать ROR1 и CD3, в частности, связывающего белка FIT-Ig или MAT-Fab, связывающего ROR1 и CD3, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, кодирующий связывающий белок FIT-Ig или MAT-Fab, в культуральной среде в условиях, достаточных для экспрессии связывающего белка, способного связывать ROR1 и CD3, клеткой-хозяином. Белки, полученные способами, описанными в настоящей заявке, можно выделять и применять в различных композициях и способах, описанных в настоящей заявке.

Применение антител и связывающих белков

Учитывая способность антител, описанных в настоящей заявке, их функциональных фрагментов и биспецифичных поливалентных связывающих белков, описанных в настоящей заявке, связываться с ROR1 и/или CD3 человека, их можно использовать для обнаружения ROR1 и/или CD3, например, в биологическом образце, содержащем клетки, экспрессирующие один или оба этих антигена-мишени. Антитела, функциональные фрагменты и связывающие белки согласно настоящему изобретению можно использовать в обычном иммуноанализе, например, твердофазном иммуноферментном анализе (тИФА), радиоиммуноанализе (РИА) или иммуно гистохимическом анализе тканей. В настоящем изобретении предложен способ обнаружения ROR1 или CD3 в биологическом образце, включающий приведение биологического образца в контакт с антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или связывающим белком согласно настоящему изобретению и обнаружение наличия или отсутствия связывания с антигеном-мишенью, что позволяет обнаружить присутствие или отсутствие мишени в биологическом образце. Антитело, функциональный фрагмент или связывающий белок могут быть непосредственно или косвенно мечены обнаружимым соединением с целью облегчения обнаружения связанного или несвязанного антитела/фрагмента/связывающего белка. Подходящие обнаружимые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, р-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу. Примеры комплексов подходящих простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; и примеры подходящих радиоактивных материалов включают ³Н, ¹⁴С, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho или ¹⁵³Sm.

В некоторых вариантах реализации антитела, их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению способны нейтрализовать активность ROR1 человека как in vitro, так и in vivo. Соответственно, антитела, их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению можно применять для ингибирования активности ROR1 человека, например, ингибирования сигнальных путей, опосредованных ROR1, в культуре клеток, содержащей ROR1-экспрессирующие клетки, у субъектов-людей или у других млекопитающих, у которых есть ROR1, с которым взаимодействует антитело, его функциональный фрагмент или связывающий белок согласно настоящему изобретению.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложено антитело или биспецифичный связывающий белок согласно настоящему изобретению для применения при лечении субъекта, страдающего от заболевания или расстройства, при котором активность ROR1 является вредоносной, причем указанное антитело или связывающий белок вводят указанному субъекту, что приводит к снижению активности, опосредованной ROR1, у указанного субъекта. В настоящей заявке подразумевается, что термин «расстройство, при котором активность ROR1 является вредоносной» включает заболевания и другие расстройства, при которых взаимодействие ROR1 с его лигандом (Wnt-5A) у субъекта, страдающего этим расстройством, обуславливает патофизиологию расстройства либо является фактором, вносящим вклад в усугубление расстройства. Соответственно, расстройство, при котором активность ROR1 является вредоносной, представляет собой расстройство, при котором ожидается, что ингибирование активности ROR1 должно облегчить симптомы и/или прогрессирование расстройства. В одном варианте реализации антитело против ROR1, его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению применяют в способе, ингибирующем рост или выживаемость злокачественных клеток или снижающем опухолевую нагрузку.

В некоторых вариантах реализации биспецифичные связывающие белки (FIT-Ig или MAT-Fab) согласно настоящему изобретению способны перенаправлять цитотоксичность Т-клеток на ROR-экспрессирующие клетки как in vitro, так и in vivo. Соответственно, биспецифичные связывающие белки согласно настоящему изобретению можно использовать для ингибирования роста или размножения ROR1-экспрессирующих злокачественных клеток у субъектов-людей или у других субъектов-млекопитающих, у которых есть ROR1, с которым перекрестно реагирует антитело, его функциональный фрагмент или биспецифичный связывающий белок согласно настоящему изобретению.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен биспецифичный CD3/ROR1-связывающий белок (FIT-Ig или MAT-Fab) для применения при лечении злокачественного новообразования, экспрессирующего ROR1, у субъекта, причем указанный связывающий белок вводят указанному субъекту. В некоторых вариантах реализации злокачественное новообразование представляет собой солидную опухоль или гемопоэтическое злокачественное новообразование.

Антитела (включая их функциональные фрагменты) и связывающие белки согласно настоящему изобретению можно включать в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Как правило, фармацевтическая композиция содержит антитело или связывающий белок согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание, и т.п.физиологически совместимые вещества. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из воды, физиологического раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, углеводы, многоатомные спирты (например, маннит или сорбит) или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных веществ, например, увлажнителей или эмульгаторов, консервантов или буферов, которые увеличивают срок годности или эффективность антитела или связывающего белка, присутствующих в композиции. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена так, что она является совместимой с предполагаемым путем введения.

Способ согласно настоящему изобретению может включать введение композиции, составленной для парентерального введения, путем инъекции (например, путем болюсной инъекции или непрерывного вливания). Составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы (например, в ампулах или в многодозовых контейнерах) с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах-носителях, и могут содержать рецептурные агенты, например, суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В качестве альтернативы, основной активный ингредиент может находиться в форме порошка для разведения в подходящей среде-носителе (например, стерильной апирогенной воде) перед применением.

Применение настоящего изобретения может включать введение композиций, составленных в виде препаратов-депо. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Например, можно составлять композиции с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных (например, в виде умеренно растворимой соли).

Антитело, его функциональный фрагмент или связывающий белок согласно настоящему изобретению также можно вводить с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, пригодными для лечения различных заболеваний. Антитела, их функциональные фрагменты и связывающие белки, описанные в настоящей заявке, можно использовать отдельно или в комбинации с дополнительным агентом, например, дополнительным терапевтическим агентом, причем дополнительный агент выбирает специалист в данной области техники согласно его назначению. Например, дополнительный агент может представлять собой терапевтический агент, признанный в данной области техники пригодным для лечения заболевания или состояния, подвергаемого лечению антителом или связывающим белком согласно настоящему изобретению. Дополнительный агент также может представлять собой агент, придающий терапевтической композиции полезное свойство, например, агент, влияющий на вязкость композиции.

Способы лечения и варианты медицинского применения

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложены способы лечения расстройства, при котором активность сигнального пути, опосредованного ROR1, ассоциирована или вредоносна (например, солидных ROR⁺-опухолей или гемопоэтических злокачественных новообразований), у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение указанному субъекту антитела против ROR1 или его ROR1-связывающего фрагмента, описанного в настоящей заявке, причем указанное антитело или связывающий фрагмент способны связывать ROR1 и ингибировать сигнальный путь, опосредованный ROR1, в клетке, экспрессирующей ROR1. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложено применение эффективного количества антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящей заявке, при лечении такого расстройства. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложено применение антитела против ROR1 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящей заявке, для получения композиции для лечения такого расстройства. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложено антитело против ROR1 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке, для применения при лечении такого расстройства.

В дополнительном варианте реализации способа или применения, описанных в настоящей заявке, антитело против ROR1 или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению связывает ROR1 и содержит VH-домен, содержащий, состоящий по существу из или состоящий из последовательности SEQ ID NO: 10 или 21, и VL-домен, содержащий, состоящий по существу из или состоящий из последовательности SEQ ID NO: 13.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложены способы лечения расстройства, при котором активность сигнального пути, опосредованного ROR1, ассоциирована или вредоносна (например, солидных ROR⁺-опухолей или гемопоэтических злокачественных новообразований), у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение указанному субъекту биспецифичного связывающего белка FIT-Ig или MAT-Fab, способного связывать CD3 и ROR1, описанного в настоящей заявке, причем связывающий белок способен связывать CD3 и ROR1 и индуцировать перенаправленную цитотоксичность Т-клеток на опухолевые клетки, экспрессирующие ROR1. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложено применение эффективного количества биспецифичного связывающего белка FIT-Ig или MAT-Fab, описанного в настоящей заявке, для лечения такого расстройства. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложено применение биспецифичного связывающего белка FIT-Ig или MAT-Fab, описанного в настоящей заявке, для получения композиции для лечения такого расстройства. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложен биспецифичный связывающий белок FIT-Ig или MAT-Fab, описанный в настоящей заявке, для применения при лечении такого расстройства.

В еще одном варианте реализации способа или применения, описанных в настоящей заявке, связывающий белок FIT-Ig согласно настоящему изобретению связывает ROR1 и CD3 и состоит из первой полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 34 или 37; второй полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 35; и третьей полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36. В дополнительном варианте реализации связывающий белок MAT-Fab согласно настоящему изобретению связывает ROR1 и CD3 и состоит из первой полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 38 или 40; второй полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 35; третьей полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36; и четвертой полипептидной цепи, содержащей, состоящей по существу из или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 39.

В некоторых вариантах реализации расстройства, которые можно лечить с помощью антитела или связывающего белка согласно настоящему изобретению, включают различные гемопоэтические и солидные злокачественные новообразования, экспрессирующие ROR1 на поверхности злокачественных клеток. В еще одном варианте реализации антитело или связывающий белок ингибирует рост или выживаемость злокачественных клеток. В еще одном варианте реализации указанное антитело или указанный связывающий белок снижают опухолевую нагрузку. В еще одном варианте реализации рак представляет собой рак молочной железы, например, трижды негативную аденокарциному молочной железы, или лейкоз, например, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).

Способы лечения, описанные в настоящей заявке, могут дополнительно включать введение нуждающемуся в этом субъекту дополнительного активного ингредиента, надлежащим образом присутствующего в комбинации с настоящим антителом или связывающим белком для предполагаемых целей лечения, например, другого лекарственного средства, обладающего противоопухолевой активностью. В способе лечения согласно настоящему изобретению дополнительный активный ингредиент можно включить в композицию, содержащую антитело или связывающий белок согласно настоящему изобретению, и композицию, вводимую субъекту, нуждающемуся в лечении. В еще одном варианте реализации способ лечения согласно настоящему изобретению может включать этап введения субъекту, нуждающемуся в лечении, антитела или связывающего белка, описанного в настоящей заявке, и отдельный этап введения дополнительного активного ингредиента субъекту до, одновременно или после этапа введения указанному субъекту антитела или связывающего белка согласно настоящему изобретению.

После приведения подробного описания настоящего изобретения это описание будет более понятным за счет отсылки к следующим примерам, которые включены исключительно в целях иллюстрации и не направлены на ограничение настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Для получения моноклональных антител для нацеленного воздействия на ROR1 с улучшенными свойствами получали антитела против ROR1 с помощью обычной гибридомной технологии. Затем выбрали и исследовали характеристики антитела ROR1-mAb004, связывающегося с ROR1 по С-концу Ig-подобного домена ROR1. Последовательность ROR1-mAb004 дополнительно гуманизировали обычным способом пересадки CDR. Разработали гуманизированные последовательности. Некоторые из этих последовательностей экспрессировали как рекомбинантные FIT-Ig и исследовали их аффинность связывания.

Сконструировали белок FIT-Ig FIT1007-12B-17, а также получили его аналог MAT-Fab, МАТ1007-12В-17, а также белок сравнения с низкой аффинностью к CD3, FIT1007-12B-18. В целом, при наличии одинаковых вариабельных последовательностей Ig формат FIT-Ig демонстрировал превосходную эффективность уничтожения опухолевых клеток in vitro и более интенсивное высвобождение цитокинов по сравнению с MAT-Fab. Снижение аффинности к CD3 также приводило к снижению эффективности перенаправленной цитотоксичности Т-клеток (RTCC).

Как FIT-Ig, так и MAT-Fab продемонстрировали активацию Т-клеток, зависимую от мишени ROR1, в анализе репортерных генов при совместном культивировании. Это указывает на возможную неэффективность активации Т-клеток при отсутствии мишени ROR1. Это явление согласуется с различием в активности связывания CD3 между FIT-Ig и исходным моноклональным антителом против CD3.

FIT-Ig и MAT-Fab продемонстрировали выраженную эффективность in vivo на модели ксенотрансплантата трижды негативного рака молочной железы.

Пример 1. Получение антител против ROR1

Антитела против ROR1 получали путем иммунизации мышей Balb/c или SJL Q30-Y406 ROR1 человека - рекомбинантного внеклеточного домена ROR1 человека (идентификатор UniProt: Q01973-1):

>HUMAN_ROR1_ECD

(SEQ ID NO: 41)

Мышей иммунизировали с 2-недельными интервалами и отслеживали титр сыворотки раз в неделю после второй инъекции. После 4-6 иммунизаций спленоциты собирали и сливали с клетками миеломы мыши с образованием гибридомных линий клеток. Продукты слияния высевали в селективную среду, содержащую гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT), в 96-луночные планшеты при плотности 1×10⁵ клеток селезенки на лунку. Через семь-десять дней после слияния наблюдали макроскопические колонии гибридом. Затем супернатанты клеток гибридом подвергали скринингу и отбору для выявления линий клеток, продуцирующих ROR1-специфичные антитела мыши. После предварительного исследования характеристик отобрали и секвенировали одно антитело против ROR1 - ROR1-mAb004.

Пример 1.1 Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей

Для амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепи общую РНК каждого клона гибридомы выделяли из более чем 5×10⁶ клеток с помощью реагента для выделения РНК TRIzol™ (bivitrogen, № в каталоге 15596018). кДНК синтезировали с использованием набора Invitrogen™ Superscript™ III First-Strand Synthesis SuperMix (ThermoFisher Scientific, № в каталоге 18080) в соответствии с инструкциями производителя; к ДНК, кодирующие вариабельные области легких и тяжелых цепей иммуноглобулина мыши, амплифицировали с использованием набора MilliporeSigma™ Novagen™ Mouse Ig-Primer Set (Fisher Scientific, № в каталоге 698313). Продукты ПНР анализировали с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле с красителем для геля SYBR™ Safe DNA(ThermoFisher, № в каталоге S33102). Фрагменты ДНК с правильным размером очищали с помощью набора для очистки геля и ПЦР NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel, № в каталоге 740609) в соответствии с инструкциями производителя и субклонировали в вектор pMD18-T по отдельности. После каждой трансформации отбирали пятнадцать колоний и анализировали последовательности вставленных фрагментов посредством секвенирования ДНК. Белковые последовательности вариабельных областей мАт мыши анализировали путем выравнивания гомологичных последовательностей.

Последовательность вариабельного домена для выбранного антитела против ROR1 приведена ниже в таблице. Участки, определяющие комплементарность (CDR), подчеркнуты на основе нумерации по Kabat.

Пример 1.2 Кинетика связывания антител против ROR1

Аффинность связывания и константы кинетики антител против ROR1 определяли при 25°С с использованием биослойной интерферометрии Octet®RED96 (Pall ForteBio LLC) после стандартных процедур. Вкратце, для захвата очищенных антител против ROR1 применяли биосенсоры для захвата Fc IgG мыши (АМС). Затем сенсоры погружали в растворы, содержащие рекомбинантный белок ROR1-ECD человека для обнаружения связывания белка-мишени с захваченными антителами. Кинетические константы определяли путем обработки и аппроксимации данных моделью связывания 1:1 с использованием программного обеспечения для анализа Fortebio. Ниже в Таблице 2 приведены результаты, полученные для ROR1-mAb004 по сравнению с двумя ранее описанными моноклональными антителами против ROR1; ROR1-Tab1 представляет собой клон R12, описанный в WO 2014167022, a ROR1-Tab2 представляет собой клон D10, описанный в WO 2012097313.

Пример 1.3 Характеристика связывания антител против ROR1 с поверхностью клеток

Специфичность и эффективность связывания антител против ROR1 исследовали с помощью твердофазного ИФА белка и проточно-цитометрического анализа связывания с поверхностью клеток. Рассчитывали ЕС50 связывания, значения показаны ниже в Таблице 3. Вкратце, связывающие свойства антител против ROR1 измеряли с помощью твердофазного ИФА следующим образом: рекомбинантный белок ROR1-ECD иммобилизовали в концентрации 1 мкг/мл на 96-луночных планшетах при температуре 4°С в течение ночи. Планшеты однократно промывали буфером для промывки (PBS, содержащим 0,05% твин-20) и блокировали блокирующим буфером для твердофазного ИФА (1% БСА в PBS, содержащем 0,05% твин-20) при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем добавляли антитела против ROR1 и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Планшеты трижды промывали буфером для промывки. Добавляли вторичное антитело против IgG мыши, меченое ПХ (Sigma, № в каталоге А168) и инкубировали планшеты при 37°С в течение 30 минут, затем 5-кратно промывали буфером для промывки. В каждую лунку добавляли 100 мкл хромогенного раствора тетраметилбензидина (ТМБ). После изменения окраски реакцию останавливали с помощью 1-нормальной HCl и измеряли оптическую плотность при 450 нм на ридере для микропланшетов Varioskan™ LUX (ThermoFisher Scientific). Сигналы связывания наносили на график в зависимости от концентрации антитела с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0, ЕС50 рассчитывали соответствующим образом. Результаты показаны на Фигуре 1. На Фигуре 1 показана активность связывания белка ROR1-ECD моноклональными антителами ROR1-mAb004 и ROR1-Tab1, а неспецифичный mIgG1 использовали в качестве отрицательного контроля.

Активность антител против ROR1 в отношении связывания клеток измеряли с помощью линии клеток СНО, трансфицированных ROR1 человека (CHO-ROR1) и ROR1-экспрессирующих клеток миеломной линии (RPMI8226). Вкратце, 5×10⁵ клеток высевали в каждую лунку 96-луночного планшета. Клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 минут, надосадочную жидкость выбрасывали. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл последовательно разбавленных антител и смешивали их с клетками. После 40 минут инкубирования при 4°С планшеты несколько раз промывали для удаления избытка антител. Затем добавляли вторичное антитело козы против IgG мыши, конъюгированное с флуорохромом, и инкубировали его с клетками при комнатной температуре в течение 20 минут. После очередного цикла центрифугирования и этапа промывки клетки ресуспендировали в буфере для FACS для считывания на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter). Показания медианной интенсивности флуоресценции (MFI) наносили на график в зависимости от концентрации антитела и анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0. Результаты, показанные на Фигурах 2А-В, иллюстрируют активность связывания моноклональных антител ROR1-mAb004 и ROR1-Tab1 с клетками, экспрессирующими ROR1. Неспецифичный mIgG1 использовали в качестве отрицательного контроля.

Пример 1.4. Исследование интернализации антител против ROR1

Интернализацию антител против ROR1 при связывании исследовали с помощью ROR1-экспрессирующих клеток миеломной линии RPMI8226. Клетки отбирали и ресуспендировали в буфере FACS при плотности 3 миллиона на мл. Разбавленные антитела добавляли в пробирки и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После первого инкубирования клетки трижды промывали холодным PBS для удаления несвязанного антитела. Затем клетки каждого антитела разделили на две группы для «контроля» и «интернализации», соответственно. Клетки в группе «интернализации» ресуспендировали в предварительно нагретой среде и инкубировали при 37°С в течение 2 часов для обеспечения интернализацию, в то время как клетки в группе «контроля» хранили при 4°С в течение того же периода. После второго инкубирования клетки однократно промывали холодным PBS и инкубировали с вторичным антителом, меченым флуоресцеином, в течение 30 мин при 4°С. После очередного цикла центрифугирования и этапа промывки клетки ресуспендировали в буфере для FACS для считывания на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter). Для калибровки фона использовали неспецифичное контрольное IgG мыши (MFI_фон). Разность между показаниями MFI в группах «контроля» и «интернализации» (ΔMFI) отражает интернализацию антител против ROR1, и такое различие по сравнению с калиброванным MFI «контроля» отражает процент интернализации антител, который рассчитывали следующим образом и привели в Таблице 4 ниже,

Процент интернализации (ΔMFI) = [1 - (MFI_{интернализация} - MFI_фон) / (MFI_{контроль} MFI_фон] × 100%

Пример 1.5. Связывание антител против ROR1 с эпитопами.

Эпитоп связывания антител против ROR1 идентифицировали с помощью конкурентного твердофазного ИФА. Вкратце, на 96-луночных планшетах иммобилизовали 1 мкг/мл очищенных антител и инкубировали в течение ночи при 4°С. После промывки PBS, содержащим 0,05% твин-20, планшеты блокировали блокирующим буфером (PBS, содержащим 0,05% твин-20 и 2% БСА) при 37°С в течение 2 часов. Биотинилированный белок ROR1-ECD человека, предварительно смешанный с антителом против ROR1 (образец) или неспецифичным IgG мыши (исходный уровень), добавляли в лунки планшета и инкубировали при 37°С в течение 1 часа перед 3-кратной промывкой. Затем в каждую лунку добавляли стрептавидин-ПХ (разведение 1:5000) и инкубировали при 37°С в течение 1 часа перед повторной 3-кратной промывкой. Добавляли хромогенный раствор тетраметилбензидина (ТМБ) для окрашивания в течение 5 минут, затем реакцию останавливали с помощью 1 М HCl. Поглощение при 450 нм (OD₄₅₀) измеряли на ридере для микропланшетов. OD450_исх представляет уровень связывания ROR1-ECD человека с антителами против ROR1 при отсутствии конкуренции, в то время как разность между OD450_исх и OD450_{образца} отражает конкуренцию между антителом против ROR1, иммобилизованным на планшете, и антителом в растворе. Процент ингибирования рассчитывали с помощью следующего уравнения:

% Ингибирования = (1 - OD450_{образец} / OD450_исх) × 100%

Ниже в Таблице 5 показаны результаты конкурентного твердофазного ИФА в показателях процентного ингибирования, что указывает на то, что ROR1-mAb004 конкурирует с ROR1-Tab2, но не конкурируете ROR1-Tab1.

Пример 2. Проектирование гуманизации ROR1-mAb004

Гены вариабельной области ROR1-mAb004 использовали для проектирования гуманизации. На первом этапе этого процесса аминокислотные последовательности доменов VH и VL ROR1-mAb004 сравнивали с доступной базой данных последовательностей V-генов Ig человека с целью поиска последовательностей, в целом наиболее соответствующих V-гену Ig зародышевой линии человека. Кроме того, сегмент каркасного участка 4 VH или VL сравнивали с базой данных J-областей с целью поиска каркасного участка человека, максимально гомологичного по отношению к областям VH и VL мыши, соответственно. Ген 018 наиболее соответствовал V-гену легкой цепи человека, а ген VH1-69 - V-гену тяжелой цепи. Затем сконструировали гуманизированные последовательности вариабельных доменов, в которых CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 VL-домена легкой цепи ROR1-mAb004 пересадили на каркасные последовательности гена 018 с последовательностью каркасного участка 4 JK4 после CDR-L3, соответственно; a CDR-H1, CDR-Н2 и CDR-H3 VH-домена тяжелой цепи ROR1-mAb004 пересадили на каркасные последовательности VH1-69 с последовательностью каркасного участка 4 JH6 после CDR-H3. Затем получили трехмерную модель Fv ROR1-mAb004 с целью определить возможное наличие каких-либо положений в каркасном участке, в которых аминокислоты мыши участвовали в поддержке петлевых структур или интерфейса VH/VL. Для сохранения аффинности/активности эти остатки в гуманизированных последовательностях можно обратно мутировать в остатки, характерные для антитела мыши, в тех же положениях. В VH и VL ROR1-mAb004 выявили несколько желательных обратных мутаций и сконструировали альтернативные схемы VH и VL, показанные ниже в Таблице 6.

Кроме того, с целью избежать потенциального дезамидирования аспарагина, введенного за счет двух аминокислот "NG" (Asn-Gly) в CDR-H2 ROR1-mAb004, сконструировали 4 последовательности VH мыши с различными точечными мутациями, которые показаны в последних 4 последовательностях VH в Таблице 6. Информацию о дезамидировании аспарагина, индуцированного аминокислотами «NG» (Asn-Gly) в CDR-H2 антитела, и его влиянии на стабильность антитела см., например, в Qingrong Yan et al., (2018) Structure Based Prediction of Asparagine Deamidation Propensity in Monoclonal Antibodies, mAb, 10: 6, 901-912.

Пример 3. Получение и исследование характеристик гуманизированного антитела против CD3

Моноклональное антитело mAbCD3-001 против CD3, продуцированное гибридомой, получали и отбирали с использованием обычной гибридомной технологии, а затем гуманизировали с помощью обычного способа пересадки CDR. Затем в гуманизированные последовательности VH вводили обратные мутации и вводили мутацию NS для замены NA в гуманизированной каппа-цепи с целью устранения склонности к дезамидированию аспарагина (подробное описание представлено в PCT/CN/120991, которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки). Полученные гуманизированные конструкты VH и VL показаны в Таблице 7 (ниже).

Образование пары последовательностей VH человека и VK человека позволило создать 2 гуманизированных антитела, обозначенных как HuEM0006-01-24 (с парой VH/VL SEQ ID NO: 22 и 24) и HuEM0006-01-27 (с парой VH/VL SEQ ID NO: 23 и 24) (Таблица 7). Рекомбинантные гуманизированные мАт временно экспрессировали в клетках НЕK293 и очищали с помощью хроматографии с белком А.

Активность связывания гуманизированных антител против CD3 исследовали с помощью проточной цитометрии с использованием линии Т-клеток Jurkat, экспрессирующих CD3 человека. 5×10⁵ клеток Jurkat в буфере для FACS высевали в каждую лунку 96-луночного планшета. Клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 минут, надосадочную жидкость выбрасывали. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл последовательно разбавленных антител и смешивали их с клетками. После 40 минут инкубирования при 4°С планшеты несколько раз промывали для удаления избытка антител. Затем добавляли вторичное антитело, конъюгированное с флуорохромом (Alexa Fluor® 647, антитело козы против IgG1 человека H&L; Jackson ImmunoResearch, № в каталоге 109-606-170) и инкубировали с клетками при комнатной температуре в течение 20 минут. После очередного цикла центрифугирования и этапа промывки клетки ресуспендировали в буфере для FACS для считывания на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter). Показания медианной интенсивности флуоресценции (MFI) наносили на график в зависимости от концентрации антитела и анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5.0. Антитело HuEMO006-01-24 продемонстрировало более высокую аффинность связывания CD3 по сравнению с антителом HuEM0006-01-27.

Пример 4. Получение FIT-Ig против ROR1/CD3

Группу белков FIT-Ig, распознающих как ROR1 человека, так и CD3 человека, сконструировали с использованием последовательностей VH/VL в Таблице 6 в качестве группы против ROR1, последовательностей VH/VL в Таблице 7 в качестве группы против CD3 и последовательностей константной области человека в Таблице 8.

Молекулы FIT-Ig конструировали в соответствии с общими процедурами, описанными в публикации РСТ WO 2015/103072. Каждый FIT-Ig состоял из трех полипептидных цепей со следующими структурами:

Цепь №1 (длинная цепь): VL_A-CL-VH_B-СН1-шарнир-СН2-СН3;

Цепь №2 (первая короткая цепь): VH_A-CH1;

Цепь №3 (вторая короткая цепь): VL_B-CL;

где А означает ROR1, В означает CD3, a VL_ROR1 представляет собой вариабельный домен легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела, распознающего ROR1, VH_CD3 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела, распознающего CD3, VL_CD3 представляет собой вариабельный домен легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела, распознающего CD3, VH_ROR1 представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела, распознающего ROR1, каждый CL представляет собой константный домен легкой цепи (SEQ ID NO: 32), каждый CH1 представляет собой первый константный домен тяжелой цепи (SEQ ID NO: 33), а CH1-шарнир-СН2-СН3 представляет собой С-концевую константную область тяжелой цепи от СН1 до конца Fc-области (SEQ ID NO: 31).

Для конструирования вектора для длинной цепи кДНК, кодирующую сегмент VL_ROR1-CL-VH_CD3, синтезировали de novo и вставляли в сайт множественного клонирования (MCS) вектора, включающего кодирующие последовательности СН1-шарнир-СН2-СН3 человека. Последовательность MCS в полученном векторе удаляли во время гомологичной рекомбинации с целью убедиться, что все фрагменты домена находились в правильной рамке считывания. Аналогичным образом, для конструирования первой и второй коротких цепей структурные гены VH_ROR1 и VL_CD3 синтезировали de novo и вставляли в MCS соответствующих векторов, включающих кодирующие сегменты для доменов СН1 и CL человека, соответственно.

Образование пары гуманизированной VH и гуманизированной VL позволило создать гуманизированные ROR1/CD3-связывающие белки FIT-Ig, перечисленные в Таблице 9 ниже. Кроме того, получили химерное антитело (FIT1007-12B) с исходными последовательностями VH/VL мыши ROR1-mAb004 и константными последовательностями человека в качестве положительного контроля для ранжирования гуманизированных связывающих белков.

Рекомбинантные белки FIT-Ig, перечисленные в Таблице 10, получали путем временной экспрессии и очищали в соответствии с описанием в настоящей заявке. 3 плазмиды для 3 полипептидных цепей каждого конструкта FIT-Ig, соответственно, совместно трансфицировали в клетки HEK 293F. Через приблизительно шесть дней культивирования клеток после трансфекции надосадочную жидкость собирали и подвергали аффинной хроматографии с белком А. Состав и чистоту очищенных антител анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенное антитело в PBS наносили на колонку для ЭХ TSKgel SuperSW3000, 300×4,6 мм (TOSOH). Прибор для ВЭЖХ DIONEX™ UltiMate 3000 (Thermo Scientific) использовали для ЭХ с использованием УФ-обнаружения при 280 нм и 214 им. Результаты экспрессии и ЭХ-ВЭЖХ представлены ниже в Таблице 10.

Белки ROR1/CD3 FIT-Ig анализировали и ранжировали по константе скорости диссоциации (k_off, «скорость диссоциации») с использованием биослойной интерферометрии Octet®RED96 (Pall FortéBio LLC). Биосенсоры для захвата Fc hIgG (АНС) (Pall) сначала подвергали воздействию антитела в концентрации 100 нМ в течение 30 секунд для захвата антитела, затем погружали в рабочий буфер (1X рН 7,2 PBS, 0,05% твин-20, 0,1% БСА) на 60 секунд для проверки исходного уровня. Сенсоры с захваченным антителом погружали в рекомбинантный белок ROR1 ECD человека в концентрации 10 мкг/мл на 5 минут для измерения ассоциации, затем погружали в рабочий буфер на 1200 секунд для измерения диссоциации. Кривые ассоциации и диссоциации аппроксимировали моделью связывания Ленгмюра 1:1 с использованием программного обеспечения для анализа данных FortéBio (Pall). Результаты показаны ниже в Таблице 10. Отношения скорости диссоциации рассчитывали по скорости диссоциации антитела по отношению к скорости диссоциации FIT 1007-12В. Более низкое отношение указывает на более медленную диссоциацию антитела по сравнению с исходным химерным антителом FIT 1007-12В.

Проект гуманизации VH/VL для FIT1007-12B-1 выбирали из расчета максимальной связывающей активности. Кроме того, проект точечной мутации CDR-H2 FIT 1007-12В-13 демонстрировал более высокий титр экспрессии и связывающую активность по сравнению с другим проектом. Проект мутации "ROR1-mAb004VH (АА)" (SEQ ID NO: 17) выбрали для комбинирования с проектом гуманизации VH "ROR1-mAb004VH.1a" (SEQ ID NO: 10) для получения молекул-кандидатов. Гуманизированная последовательность VH, а именно ROR1-mAb004VH.1а(АА), представлена ниже:

>ROR1-mAb004VH.la(AA) (SEQ ID NO: 21)

Пример 5. Конструирование и экспрессия ROR1/CD3 FIT-Ig и MAT-Fab

При конструировании FIT-Ig использовали способ, показанный в Примере 4. Линкеры между доменами иммуноглобулина не использовали. Полные последовательности связывающих белков FIT-Ig представлены в информации о последовательностях в Таблице 11.

Кроме того, сконструировали группу белков ROR1/CD3 MAT-Fab с такой же комбинацией последовательностей VH/VL согласно процедуре, описанной в WO 2018/035084. Каждый MAT-Fab состоял из четырех полипептидных цепей со следующими структурами:

Цепь №1 (длинная цепь с «выступом»): VL_A-CL-VH_B-CH1-шарнир-CH2-CH3;

Цепь №2 (первая короткая цепь): VH_A-CH1;

Цепь №3 (вторая короткая цепь): VL_B-CL;

Цепь №4 (Fc «впадина»): шарнир-СН2-СН3;

где цепь №1 включает мутантный константный IgG1 человека с мутацией S354C, T366W в качестве «выступа», цепь №4 представляет собой цепь Fc с мутацией Y349C, T366S, L368A, Y407V в качестве «впадины», причем А означает ROR1, а В означает CD3.

Посредством способа клонирования, аналогичного показанному ранее для FIT-Ig, синтетически получали гены VH/VL полипептидных цепей MAT-Fab, а затем, соответственно, клонировали их в векторы, содержащие соответствующие константные домены. Полные последовательности белков MAT-Fab представлены в информации о последовательностях в Таблице 12.

Рекомбинантные белки FIT-Ig и MAT-Fab получали путем временной экспрессии и очищали в соответствии с описанием в настоящей заявке. 3 или 4 плазмиды, кодирующие соответствующие полипептидные цепи каждого FIT-Ig или MAT-Fab, соответственно, совместно трансфицировали в клетки HEK 293F. Через приблизительно шесть дней культивирования клеток после трансфекции надосадочную жидкость собирали и подвергали аффинной хроматографии с белком А. Состав и чистоту очищенных антител анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенное антитело в PBS наносили на колонку для ЭХ TSKgel SuperSW3000, 300×4,6 мм (TOSOH). Прибор для ВЭЖХ DIONEX™ UltiMate 3000 (Thermo Scientific) использовали для ЭХ с использованием УФ-обнаружения при 280 нм и 214 им. Результаты экспрессии и ЭХ-ВЭЖХ показаны ниже в Таблице 13.

Аффинность/кинетику связывания ROR1 гуманизированного кандидата FIT1007-12B-17 и исходного химерного FIT-Ig FIT1007-12B измеряли, используя способ, описанный в Примере 3. Для каждого антитела измерения титровали с помощью 6 концентраций антигена, т.е. при 3-кратном разбавлении, начиная с 500 нМ. Кинетика и аффинность связывания приведены ниже в Таблице 14. Кинетика связывания FIT1007-12B-18, МАТ1007-12В-17 и МАТ1007-12В-18 аналогична кинетике связывания FIT1007-12B-17. Эти кандидаты содержат один и тот же Fab, связывающий ROR1.

Пример 6. Исследование характеристик связывания гуманизированного FIT-Ig и MAT-Fab

Связывающую активность антител ROR1×CD3 по отношению к клеткам измеряли с помощью линии клеток СНО, трансфицированных комплексом TCR/CD3 человека (CHO-CD3-TCR) и линий опухолевых клеток, экспрессирующих ROR1 (NCI-H1975, MDA-MB-231, А549 и RPMI8226). Вкратце, 5×10⁵ клеток высевали в каждую лунку 96-луночного планшета. Клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 минут, надосадочную жидкость выбрасывали. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл последовательно разбавленных антител и смешивали их с клетками. После 40 минут инкубирования при 4°С, планшеты несколько раз промывали для удаления избытка антител. Затем добавляли вторичное антитело козы против IgG человека, конъюгированное с флуорохромом, и инкубировали его с клетками при комнатной температуре в течение 20 минут.После очередного цикла центрифугирования и этапа промывки клетки ресуспендировали в буфере для FACS для считывания на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter). Показания медианной интенсивности флуоресценции (MFI) наносили на график в зависимости от концентрации антитела и анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0.

Как показано на Фигуре 3, активность связывания CHO-CD3-TCR коррелировала с аффинностью связывания CD3 и валентностью каждой молекулы. При сравнении FIT-Ig с исходным моноклональным IgG1-антителом против CD3, т.е. FIT1007-12B-17 с HuEM0006-01-24 (последовательности VH/VL: SEQ ID NO: 22 и 24, Таблица 7) или FIT1007-12B-18 с HuEM0006-01-27 (последовательности VH/VL: SEQ ID NO: 23 и 24, Таблица 7), FIT-Ig продемонстрировал относительно более низкую эффективность связывания, что может быть связано со стерическими помехами.

Как показано на Фигуре 4A-D, активность связывания с ROR1-экспрессирующими опухолевыми клетками относительно сходна у FIT-Ig и их общего исходного моноклонального антитела против ROR1 (HuROR1-mAb004-1, с последовательностями ROR1-mAb004VH.1a (АА) и ROR1-mAb004VK.1a, SEQ ID NO: 21 и 13). Кривая связывания MAT-Fab отличается от кривой связывания FIT-Ig и исходного моноклонального антитела против ROR1, что может быть связано с различной валентностью связывания с мишенью.

Пример 7. Перенаправленная активация CD3 за счет гуманизированного FIT-Ig и MAT-Fab

Для измерения перенаправленной активации CD3 с помощью ROR1×CD3-биспецифичных антител FIT-Ig и MAT-Fab использовали анализ репортерного гена при совместном культивировании. При этом анализе клетки Jurkat-NFAT-luc активировали последующий люциферазный сигнал при активации CD3 на поверхности клетки. Клетки RPMI8226 использовали в качестве ROR1-экспрессирующей клетки-мишени, способной перекрестно связывать комплекс CD3/TCR на Т-клетках за счет ROR1×CD3-биспецифичных антител при связывании ROR1. Клетки Jurkat-NFAT-luc и RPMI8226 промывали и ресуспендировали в среде для анализа (RPMI1640 с 10% FBS) по отдельности. Клетки обоих типов высевали в 96-луночные планшеты (Costar #3903) по 1×10⁵ клеток на лунку в соотношении 1:1. Добавляли антитела FIT-Ig или MAT-Fab, смешивали их с клетками и инкубировали в течение 4 часов при 37°С. По окончании инкубирования подготавливали набор для анализа люминесценции ONE-Glo™ (Promega, № в каталоге Е6130) и добавляли его в лунки в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты считывали на предмет люминесцентных сигналов с помощью ридера для микропланшетов Varioskan™ LUX (ThermoFisher Scientific). Результаты показаны на Фигуре 5.

Кроме того, протестировали один неспецифичный отрицательный контрольный FIT-Ig, биспецифичную молекулу на основе антител против EGFR×сМЕТ (ЕМВ01) и два моноклональных антитела против CD3, а именно HuEM0006-01-24 и HuEM0006-01-27. Все биспецифичные ROR1×CD3-связывающие белки приводили к повышенной активации Т-клеток в присутствии клеток-мишеней, экспрессирующих ROR1, по сравнению с моноспецифичными связывающими белками против CD3, не обладающими связывающей активностью против ROR1.

Неспецифичную перенаправленную активацию CD3 тестировали с использованием анализа репортерного гена на основе Jurkat-NFAT-luc в отсутствие клеток-мишеней. Результаты показаны на Фигуре 6. Этот анализ выполняли в отсутствие клеток, экспрессирующих совместную мишень для биспецифичных связывающих белков, в данном случае ROR1. Биспецифичные антитела против ROR1×CD3 демонстрировали менее выраженную неспецифичную перенаправленную активацию, чем антитело только против CD3 в отсутствие клеток-мишеней, экспрессирующих ROR1.

Пример 8. Перенаправленная Т-клеточная цитотоксичность гуманизированного FIT-Ig и MAT-Fab

Эффективность уничтожения опухолевых клеток за счет биспецифичных ROR1×CD3-связывающих белков измеряли в анализе перенаправленной цитотоксичности Т-клеток с использованием линии клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 в качестве клеток-мишеней и Т-клеток человека в качестве эффекторных клеток. Вкратце, клетки собирали, промывали и ресуспендировали в среде для анализа (RPMI1640 с 10% FBS). Клетки MDA-MB-231 высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Corning, № в каталоге 3599) по 5×10⁴ клеток на лунку. Т-клетки очищали от МКПК человека с помощью коммерческого набора для выделения МКПК (EasySep™, Stemcell Technologies, № в каталоге 17951) и добавляли в лунки по 2×10⁵ клеток на лунку. Добавляли тестируемые антитела и инкубировали их со смесью клеток в течение 48 часов при 37°С. Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) измеряли с помощью набора для анализа цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, № в каталоге G1780). Показания OD490 получали в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, оценивали максимальный и минимальный лизис в соответствии с инструкцией набора CytoTox (Promega, №G1780). Максимальный лизис получали путем добавления лизирующего буфера к образцам, содержавшим только опухолевые клетки. Минимальный лизис получали из фоновой культуральной среды. Минимальный лизис вычитали из показаний всех образцов. В качестве знаменателя для нормировки использовали максимальный лизис клеток-мишеней MDA-MB-231 (100%) минус минимальный лизис (0%). Процент высвобождения ЛДГ наносили на график зависимости от концентрации биспецифичных антител. Как показано на Фигуре 7, биспецифичные ROR1×CD3-связывающие белки демонстрировали перенаправленную цитотоксичность Т-клеток по отношению к опухолевым клеткам MDA-MB-231, в то время как биспецифичный EGFR×сМЕТ-связывающий FIT-Ig ЕМВ01 демонстрировал низкую цитотоксическую активность.

Пример 9. Объем опухоли MDA-MB-231 у мышей M-NSG с трансплантированными МКПК человека, получавших ROR1×CD3-биспецифичные антитела

Противоопухолевую эффективность оценивали на мышах M-NSG, которые представляли собой линию с иммунодефицитом, у которой отсутствовали Т-клетки, В-клетки и естественные киллеры. Клетки MDA-MB-231 (5×10⁶) вводили подкожно в правую дорсально-боковую область. Через пять дней после инокуляции опухолевых клеток мыши получали однократную внутрибрюшинную дозу 3,5×10⁶ МКПК человека. Животных рандомизировали на основании размера опухоли (~150-300 мм³) на 15 день, и на следующий день начинали лечение. Рост опухоли контролировали путем измерений с помощью штангенциркуля. Исследование прекратили на 16 день после первого введения, мышей умерщвляли, когда появлялись признаки РТПХ. Мышей обрабатывали раз в неделю в течение 3 недель (1 р/нед × 3) 1 мг/кгПТ1007-12В-17, FIT1007-12B-18, МАТ 1007-12В-17 или средой-носителем путем внутрибрюшинной (в/б) инъекции. Как показано на Фигуре 8, мыши экспериментальной группы, получавшие FIT-Ig и MAT-Fab, демонстрировали значимое ингибирование роста опухоли по сравнению с группой, получавшей среду-носитель (****Р<0,0001; по сравнению с группой, получавшей среду-носитель, двусторонний дисперсионный анализ в комбинации с критерием Даннетта).

Пример 10. Исследование характеристик интернализации гуманизированных антител против ROR1

Интернализацию гуманизированных антител против ROR1 при связывании исследовали с помощью ROR1-экспрессирующих клеток миеломной линии RPMI8226 способом, аналогичным описанному ранее в Примере 1.4. Вкратце, клетки собирали и ресуспендировали в буфере для FACS при плотности 3 миллиона на мл. Разбавленные антитела добавляли в пробирки и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После первого инкубирования клетки трижды промывали холодным PBS для удаления несвязанного антитела. Затем клетки, обработанные каждым антителом, разделяли на три группы - 4°С, 37°С и 37°С + РАО, соответственно. Клетки в группе «интернализации» при 37°С ресуспендировали в предварительно нагретой среде и инкубировали при 37°С в течение 2 часов для обеспечения интернализацию, в то время как клетки в группе «контроля» при 4°С хранили при 4°С в течение того же периода. Клетки в группе «37°С + РАО» ресуспендировали в предварительно нагретой среде и инкубировали в присутствии 3 мкМ оксида фениларсина (ингибитора эндоцитоза для предотвращения интернализации мембранных белков) при 37°С в течение 2 часов. Экспериментальная группа 37°С + РАО служила для калибровки эффекта диссоциации антител. После второго инкубирования клетки однократно промывали холодным PBS и инкубировали с вторичным антителом, меченым флуоресцеином, в течение 30 мин при 4°С. После очередного цикла центрифугирования и этапа промывки клетки ресуспендировали в буфере для FACS для считывания на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter). Рассчитывали показания для неспецифичного контрольного IgG мыши (MFI_фон) и использовали для калибровки фона. Разность между показаниями MFI в группах «контроля» и «интернализации» (ΔMFI) отражает интернализацию антител против ROR1, и такое различие по сравнению с калиброванным MFI «контроля» отражает процент интернализации антител, который рассчитывали следующим образом и привели в Таблице 15 ниже, Как показано на Фигуре 9, при 100 нМ концентрации антитело HuROR1-mAb004-l и соответствующий ему FIT-Ig/MAT-Fab демонстрировали ограниченную интернализацию. Рассчитанные процентные значения интернализации антител HuROR-mAb004-1 и FIT1007-12B-17 согласуются с результатами, показанными в Примере 1.4, Таблица 4.

MAT-Fab демонстрировал снижение связывания при 37°С, что может быть связано с его более низкой валентностью связывания и более высокой скоростью связывания при 37°С. Кривая связывания для расчета интернализации MAT-Fab не достигла плато связывания при 100 нМ.

Процент интернализации (ΔMFI) = [1 - (MFI_{интернализация} - MFI_фон) / (MFI_{контроль} - MFI_фон)] × 100%

Пример 11. Получение эталонного FIT-Ig и сравнение активности in vitro с FIT1007-12В-17

Последовательности антитела против CD3, показанные в Таблице 7, применяли для получения FIT-Ig с последовательностями VH/VL одного из двух эталонных антител против ROR1-антител - ROR1-Tab1 (клон R12) и ROR1-Tab2 (клон D10). Конструирование и получение эталонного FIT-Ig выполняли, как описано в Примере 3. Линкеры между доменами иммуноглобулина не использовали. Полные последовательности связывающих белков FIT-Ig представлены в информации о последовательностях в Таблицах 16 и 17. Связывающую активность эталонного FIT-Ig по отношению к поверхности клеток оценивали с использованием способа, описанного в Примере 1.3, а активность перенаправленной цитотоксичности оценивали с использованием способа, описанного в Примере 6.

Последовательности VH/VL одного из двух эталонных антител ROR1, ROR1-Tab1 (клон R12) и ROR1-Tab2 (клон D10), используемых в данном Примере, приведены далее: Последовательность VH антитела D10 (SEQ ID NO: 42)

Последовательность VL антитела D10 (SEQ ID NO: 43)

Последовательность VH антитела R12 (SEQ ID NO: 44)

Последовательность VL антитела R12 (SEQ ID NO: 45)

На Фигуре 11 показано сравнение FIT1007-12B-17 с эталонными молекулами FIT-Ig, представленными в Таблице 16. На Фигурах 11А и 11В проиллюстрированы FIT1007-12B-17 и эталонные FIT-Ig, демонстрировавшие сходное связывание с поверхностью как ROR1-экспрессирующих клеток MDA-MB-231, так и CD3-экспрессирующих клеток Jurkat. Однако, как показано на Фигуре 11С для перенаправленной цитотоксичности Т-клеток в отношении клеток MDA-MB-231, FIT1007-12B-17 позволял достигать более выраженной цитотоксичности, чем эталонные молекулы FIT-Ig.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> EpimAb Biotherapeutics (HK) Limited

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ ROR1 И РОДСТВЕННЫЕ БИСПЕЦИФИЧНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ

<130> PF 210390PCT

<160> 51

<170> Версия PatentIn 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 1

Arg Ser Trp Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 2

Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Gly Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 3

Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 4

Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Ala Asp Ile Lys Tyr Asn Ala Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 5

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 6

Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 7

Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp Thr

1 5

<210> 8

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 9

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 15

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 16

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Ala Asp Ile Lys Tyr Asn Ala Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Asp Ile Lys Tyr Gln Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Ala Asp Ile Lys Tyr Gln Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Ala Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Ala Asp Ile Lys Tyr Asn Ala Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 25

Asn Tyr Tyr Val His

1 5

<210> 26

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 26

Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 27

Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 28

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 29

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 29

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 30

Lys Gln Ser Tyr Ile Leu Arg Thr

1 5

<210> 31

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 32

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 32

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 33

<211> 103

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 34

<211> 663

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

210 215 220

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

225 230 235 240

Phe Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly

245 250 255

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr

260 265 270

Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr

275 280 285

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp

290 295 300

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe

305 310 315 320

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

325 330 335

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

355 360 365

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

370 375 380

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

385 390 395 400

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

405 410 415

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

420 425 430

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

435 440 445

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

450 455 460

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

465 470 475 480

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

485 490 495

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

500 505 510

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

515 520 525

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

530 535 540

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

545 550 555 560

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

565 570 575

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

580 585 590

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

595 600 605

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

610 615 620

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

625 630 635 640

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

645 650 655

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660

<210> 35

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Ala Asp Ile Lys Tyr Asn Ala Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala His Ile Tyr Tyr Asp Phe Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 36

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 36

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 37

<211> 663

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

210 215 220

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

225 230 235 240

Phe Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly

245 250 255

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr

260 265 270

Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr

275 280 285

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp

290 295 300

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe

305 310 315 320

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

325 330 335

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

355 360 365

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

370 375 380

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

385 390 395 400

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

405 410 415

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

420 425 430

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

435 440 445

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

450 455 460

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

465 470 475 480

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

485 490 495

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

500 505 510

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

515 520 525

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

530 535 540

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

545 550 555 560

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

565 570 575

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

580 585 590

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

595 600 605

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

610 615 620

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

625 630 635 640

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

645 650 655

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660

<210> 38

<211> 663

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

210 215 220

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

225 230 235 240

Phe Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly

245 250 255

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr

260 265 270

Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr

275 280 285

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp

290 295 300

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe

305 310 315 320

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

325 330 335

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

355 360 365

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

370 375 380

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

385 390 395 400

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

405 410 415

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

420 425 430

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

435 440 445

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

450 455 460

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

465 470 475 480

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

485 490 495

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

500 505 510

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

515 520 525

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

530 535 540

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

545 550 555 560

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys

565 570 575

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

580 585 590

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

595 600 605

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

610 615 620

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

625 630 635 640

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

645 650 655

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660

<210> 39

<211> 231

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 39

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 40

<211> 663

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

210 215 220

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

225 230 235 240

Phe Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly

245 250 255

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr

260 265 270

Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr

275 280 285

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp

290 295 300

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe

305 310 315 320

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

325 330 335

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

340 345 350

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

355 360 365

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

370 375 380

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

385 390 395 400

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

405 410 415

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

420 425 430

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

435 440 445

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

450 455 460

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

465 470 475 480

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

485 490 495

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

500 505 510

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

515 520 525

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

530 535 540

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

545 550 555 560

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys

565 570 575

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

580 585 590

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

595 600 605

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

610 615 620

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

625 630 635 640

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

645 650 655

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660

<210> 41

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 41

Gln Glu Thr Glu Leu Ser Val Ser Ala Glu Leu Val Pro Thr Ser Ser

1 5 10 15

Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Asn Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp

20 25 30

Glu Pro Met Asn Asn Ile Thr Thr Ser Leu Gly Gln Thr Ala Glu Leu

35 40 45

His Cys Lys Val Ser Gly Asn Pro Pro Pro Thr Ile Arg Trp Phe Lys

50 55 60

Asn Asp Ala Pro Val Val Gln Glu Pro Arg Arg Leu Ser Phe Arg Ser

65 70 75 80

Thr Ile Tyr Gly Ser Arg Leu Arg Ile Arg Asn Leu Asp Thr Thr Asp

85 90 95

Thr Gly Tyr Phe Gln Cys Val Ala Thr Asn Gly Lys Glu Val Val Ser

100 105 110

Ser Thr Gly Val Leu Phe Val Lys Phe Gly Pro Pro Pro Thr Ala Ser

115 120 125

Pro Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gln Pro Tyr

130 135 140

Arg Gly Ile Ala Cys Ala Arg Phe Ile Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met

145 150 155 160

Glu Ser Leu His Met Gln Gly Glu Ile Glu Asn Gln Ile Thr Ala Ala

165 170 175

Phe Thr Met Ile Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gln

180 185 190

Phe Ala Ile Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu

195 200 205

Thr Ser Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu

210 215 220

Ile Leu Glu Asn Val Leu Cys Gln Thr Glu Tyr Ile Phe Ala Arg Ser

225 230 235 240

Asn Pro Met Ile Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu

245 250 255

Pro Gln Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys Ile Arg Ile Gly Ile

260 265 270

Pro Met Ala Asp Pro Ile Asn Lys Asn His Lys Cys Tyr Asn Ser Thr

275 280 285

Gly Val Asp Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val Thr Lys Ser Gly Arg Gln

290 295 300

Cys Gln Pro Trp Asn Ser Gln Tyr Pro His Thr His Thr Phe Thr Ala

305 310 315 320

Leu Arg Phe Pro Glu Leu Asn Gly Gly His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro

325 330 335

Gly Asn Gln Lys Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Asp Glu Asn Phe

340 345 350

Lys Ser Asp Leu Cys Asp Ile Pro Ala Cys Asp Ser Lys Asp Ser Lys

355 360 365

Glu Lys Asn Lys Met Glu Ile Leu Tyr

370 375

<210> 42

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 42

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Gly Ser Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 43

Glu Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Asn Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Thr Ser Pro Arg Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln

100 105

<210> 44

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 44

Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 45

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser

1 5 10 15

Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr

20 25 30

Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro

65 70 75 80

Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly

100 105 110

<210> 46

<211> 662

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 46

Glu Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Asn Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Thr Ser Pro Arg Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

210 215 220

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe

225 230 235 240

Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln

245 250 255

Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly Ser Asp Asn Thr Lys

260 265 270

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser

275 280 285

Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr

290 295 300

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Asn Tyr Tyr Phe Asp

305 310 315 320

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

325 330 335

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

340 345 350

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

355 360 365

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

370 375 380

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

385 390 395 400

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

405 410 415

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

420 425 430

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

435 440 445

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

450 455 460

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

465 470 475 480

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

485 490 495

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

500 505 510

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

515 520 525

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

530 535 540

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

545 550 555 560

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

565 570 575

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

580 585 590

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

595 600 605

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

610 615 620

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

625 630 635 640

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

645 650 655

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660

<210> 47

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 47

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Gly Ser Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 48

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 49

<211> 667

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 49

Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser

1 5 10 15

Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr

20 25 30

Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro

65 70 75 80

Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly

100 105 110

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

130 135 140

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

145 150 155 160

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

180 185 190

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Glu Val Gln Leu Val Gln

210 215 220

Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys

225 230 235 240

Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Met Arg

245 250 255

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Gly

260 265 270

Ser Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met

275 280 285

Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu

290 295 300

Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Gly

305 310 315 320

Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

325 330 335

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

340 345 350

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

355 360 365

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

370 375 380

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

405 410 415

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

420 425 430

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

435 440 445

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

450 455 460

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

465 470 475 480

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

485 490 495

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

500 505 510

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

515 520 525

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

530 535 540

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

545 550 555 560

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

565 570 575

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

580 585 590

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

595 600 605

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

610 615 620

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

625 630 635 640

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

645 650 655

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665

<210> 50

<211> 224

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 50

Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 51

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> искусственный конструкт

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<---

Claims (84)

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с орфанным рецептором 1, подобным рецепторной тирозинкиназе, (ROR1), и содержат набор из шести CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем:

CDR-H1 содержит последовательность RSWMN (SEQ ID NO: 1);

CDR-H2 содержит последовательность RIYPGNGDIKYNGNFKG (SEQ ID NO: 2) или RIYPGNADIKYNANFKG (SEQ ID NO: 4);

CDR-H3 содержит последовательность IYYDFYYALDY (SEQ ID NO: 3);

CDR-L1 содержит последовательность KASQDINKYIT (SEQ ID NO: 5);

CDR-L2 содержит последовательность YTSTLQP (SEQ ID NO: 6); и

CDR-L3 содержит последовательность LQYDSLLWT (SEQ ID NO: 7),

причем указанные CDR определены в соответствии с нумерацией по Kabat.

2. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что указанное антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи VH и вариабельный домен легкой цепи VL, причем:

указанный домен VH содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 10-12 и 21, и/или указанный домен VL содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 13-16; или

указанный домен VH содержит последовательность SEQ ID NO:8 или 17, и/или указанный домен VL содержит последовательность SEQ ID NO:9.

3. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное антитело,

причем необязательно указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело,

и при этом домен VH указанного антитела содержит аминокислотные остатки 1E, 27Y и 94H и от 0 до 4 остатков, выбранных из 38K, 48I, 66K и 67A, согласно нумерации по Kabat; и указанный домен VL содержит аминокислотный остаток 71Y и от 0 до 4 остатков, выбранных из 4L, 49H, 58I и 69R, согласно нумерации по Kabat.

4. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что указанное антитело содержит комбинацию последовательностей VH и VL, выбранных из группы, состоящей из:

комбинации последовательность VH последовательность VL 15 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 13 16 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 14 17 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 15 18 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 16 1 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 2 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 9 3 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 13 4 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 14 5 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 15 6 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 16 7 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 8 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 14 9 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 15 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 16 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 12 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 14 13 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 15 14 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 16

указанное антитело необязательно содержит домен VH, содержащий последовательность SEQ ID NO: 21, и домен VL, содержащий последовательность SEQ ID NO: 13.

5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, отличающиеся тем, что указанное антитело обладает одной или более из следующих характеристик:

(i) при связывании с поверхностью ROR1-экспрессирующих клеток, указанное антитело интернализуется не более чем на 20%, необязательно не более чем на 15% или 14%, 13%, 12%, 11%, согласно измерению в клеточном анализе, причем интернализацию может отражать снижение процента медианной интенсивности флуоресценции (MFI), обнаруженного с помощью проточной цитометрии, при связывании указанного антитела с поверхностью ROR1-экспрессирующих клеток после двухчасового инкубирования при 37°C по сравнению с контролем, поддерживаемым при 4°C в течение того же периода;

(ii) указанное антитело связывается с ROR1 человека по C-концу Ig-подобного домена ROR1 и необязательно конкурирует с антителом с парой последовательностей VH/VL SEQ ID NO: 42 и 43 за связывание с ROR1;

(iii) связывание указанного антитела с ROR1 индуцирует противоопухолевую активность.

6. Конъюгат для специфичного связывания с ROR1, содержащий выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, конъюгированное с лекарственным средством или с агентом для обнаружения.

7. Способ обнаружения ROR1 в биологическом образце, включающий:

приведение указанного биологического образца в контакт с выделенным антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-5 или конъюгатом по п. 6, и

определение того, присутствует или отсутствует связывание с антигеном-мишенью, с получением вывода о присутствии или отсутствии мишени в биологическом образце.

8. Биспецифичный связывающий белок, который специфично связывает ROR1 и CD3, содержащий:

а) первый антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий ROR1; и

b) второй антигенсвязывающий сайт, специфично связывающий CD3,

причем указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит набор из шести CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем:

CDR-H1 содержит последовательность RSWMN (SEQ ID NO:1),

CDR-H2 содержит последовательность RIYPGNGDIKYNGNFKG (SEQ ID NO: 2) или RIYPGNADIKYNANFKG (SEQ ID NO: 4),

CDR-H3 содержит последовательность IYYDFYYALDY (SEQ ID NO: 3),

CDR-L1 содержит последовательность KASQDINKYIT (SEQ ID NO: 5),

CDR-L2 содержит последовательность YTSTLQP (SEQ ID NO: 6), и

CDR-L3 содержит последовательность LQYDSLLWT (SEQ ID NO: 7),

причем указанные CDR определены в соответствии с нумерацией по Kabat.

9. Биспецифичный связывающий белок по п. 8, отличающийся тем, что указанный первый антигенсвязывающий сайт содержит VH-домен и VL-домен, определенные в любом из пп. 2-4.

10. Биспецифичный связывающий белок по п. 8 или 9, отличающийся тем, что указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит набор из шести CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем:

CDR-H1 содержит последовательность NYYVH (SEQ ID NO:25);

CDR-H2 содержит последовательность WISPGSDNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 26);

CDR-H3 содержит последовательность DDYGNYYFDY (SEQ ID NO: 27);

CDR-L1 содержит последовательность KSSQSLLNARTRKNYLA (SEQ ID NO: 28);

CDR-L2 содержит последовательность WASTRES (SEQ ID NO: 29); и

CDR-L3 содержит последовательность KQSYILRT (SEQ ID NO: 30),

причем указанные CDR определены в соответствии с нумерацией по Kabat.

11. Биспецифичный связывающий белок по п. 10, отличающийся тем, что указанный второй антигенсвязывающий сайт содержит:

домен VH, содержащий последовательность SEQ ID NO: 22 или 23, и/или

домен VL, содержащий последовательность SEQ ID NO: 24.

12. Биспецифичный связывающий белок по любому из пп. 8-11, содержащий первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь и третью полипептидную цепь,

причем

(i) указанная первая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, причем CL слит непосредственно с VH_B; указанная вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VH_A-CH1; указанная третья полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VL_B-CL; или

(ii) указанная первая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VH_A-CH1-VL _B-CL-Fc, причем CH1 слит непосредственно с VL_B; указанная вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VL_A-CL; указанная третья полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VH_B-CH1;

причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, CH1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, необязательно содержащую от N-конца к C-концу шарнир-CH2-CH3,

причем VL_A-CL образует пару с VH_A-CH1 с образованием первого Fab, специфично связывающего первый антиген A, и VL_B-CL образует пару с VH_B-CH1 с образованием второго Fab, специфично связывающего второй антиген B, и

причем указанный первый антиген A представляет собой ROR1, а указанный второй антиген B представляет собой CD3,

причем две из указанных первых полипептидных цепей, две из указанных вторых полипептидных цепей и две из указанных третьих полипептидных цепей ассоциируют с образованием белка FIT-Ig.

13. Биспецифичный связывающий белок по п. 12, отличающийся тем, что:

указанная первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 37,

указанная вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и

указанная третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

14. Биспецифичный связывающий белок по любому из пп. 8-11, содержащий первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь, третью полипептидную цепь и четвертую полипептидную цепь,

причем

(i) указанная первая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc, причем CL слит непосредственно с VH_B; указанная вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VH_A-CH1; указанная третья полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VL_B-CL; указанная четвертая полипептидная цепь содержит Fc; или

(ii) указанная первая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VH_A-CH1-VL _B-CL-Fc, где CH1 слит непосредственно с VL_B; указанная вторая полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VL_A-CL; указанная третья полипептидная цепь содержит от N-конца к C-концу VH_B-CH1; указанная четвертая полипептидная цепь содержит Fc;

причем VL представляет собой вариабельный домен легкой цепи, CL представляет собой константный домен легкой цепи, VH представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи, CH1 представляет собой константный домен тяжелой цепи, Fc представляет собой Fc-область иммуноглобулина, необязательно содержащую от N-конца к C-концу шарнир-CH2-CH3,

причем VL_A-CL образует пару с VH_A-CH1 с образованием первого Fab, специфично связывающего первый антиген A, и VL_B-CL образует пару с VH_B-CH1 с образованием второго Fab, специфично связывающего второй антиген B, и

причем указанный первый антиген A представляет собой ROR1, а указанный второй антиген B представляет собой CD3,

причем указанная первая полипептидная цепь, указанная вторая полипептидная цепь, указанная третья полипептидная цепь и указанная четвертая полипептидная цепь ассоциируют с образованием белка MAT-Fab,

причем Fc указанной первой полипептидной цепи и Fc указанной четвертой полипептидной цепи необязательно содержат гетеродимеризующие модификации, особенно в CH3-домене, способствующие гетеродимеризации, а не гомодимеризации указанных двух цепей,

дополнительно указанная первая полипептидная цепь необязательно содержит Fc-область IgG1 человека с мутацией T366W в качестве «выступа», а указанная четвертая полипептидная цепь содержит Fc-область IgG1 человека с мутациями T366S, L368A и Y407V в качестве «впадины»; и/или указанная первая полипептидная цепь содержит Fc-область IgG1 человека с S354C, и указанная четвертая полипептидная цепь содержит Fc-область IgG1 человека с мутацией Y349C с получением дополнительного дисульфидного мостика в CH3-домене.

15. Биспецифичный связывающий белок по п. 14, отличающийся тем, что:

указанная первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38 или 40,

указанная вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35,

указанная третья полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и

указанная четвертая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.

16. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифичный связывающий белок по любому из пп. 8-15.

17. Клетка-хозяин для экспрессии биспецифичного связывающего белка, который специфично связывает ROR1 и CD3, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16.

18. Фармацевтическая композиция для лечения расстройства, при котором активность ROR1 является вредоносной, содержащая выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, конъюгат по п. 6, биспецифичный связывающий белок по любому из пп. 8-15, нуклеиновую кислоту по п. 16 или клетку-хозяина по п. 17, и фармацевтически приемлемый носитель.

19. Применение выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, конъюгата по п. 6 или биспецифичного связывающего белка по любому из пп. 8-15 для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства, при котором активность ROR1 является вредоносной.

20. Способ лечения расстройства, при котором активность ROR1 является вредоносной, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 18.

21. Применение по п. 19 или способ по п. 20, отличающиеся тем, что указанный субъект представляет собой человека.

22. Применение по п. 19 или способ по п. 20, отличающиеся тем, что указанное расстройство представляет собой рак.

23. Применение по п. 19 или способ по п. 20, отличающиеся тем, что указанное расстройство представляет собой ROR1-положительные гематологические злокачественные новообразования или ROR1-положительную солидную опухоль.

24. Применение по п. 19 или способ по п. 20, отличающиеся тем, что указанное расстройство представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), рак легкого, рак молочной железы или трижды негативный рак молочной железы.