RU2844714C1 - Вакцина для защиты от mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области фармацевтики и ветеринарии. 1, 2, 4 и 5 объекты представляют собой вакцину для вакцинации свиней, содержащую наночастицы в ассоциации с бактерином Mycoplasma hyopneumoniae и фармацевтически приемлемый растворитель, где наночастицы содержат катионный полисахарид, который представляет собой пористый полисахарид и получен путем реакции сшитого мальтодекстрина с глицидилтриметиламмонием, и анионный фосфолипид, выбранный из диацилфосфатидилглицерина, диацилфосфатидилсерина и диацилфосфатидилинозитола, применение вакцины для сокращения очагов повреждения в легких вследствие инфекции Mycoplasma hyopneumoniae и для получения соответствующего лекарственного средства и способ профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae у свиней, включающий введение эффективного количества вакцины. 3 и 6 объекты – набор для вакцинации свиней, содержащий вышеуказанную вакцину и вторую вакцину, содержащую живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), и комбинированную вакцину для вакцинации свиней, содержащую смесь вышеуказанной вакцины и второй вакцины, содержащей PRRSV. Технический результат заключается в более высокой эффективности вакцины бактерина Mhyo, ассоциированного с наночастицами, в предотвращении возникновения поражений легких в результате заражения. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей наночастицы в ассоциации с бактерином Mycoplasma hyopneumoniae, а также к применению этой вакцины для профилактики инфекции у свиней.

Уровень техники изобретения

Mycoplasma hyopneumoniae (далее также обозначаемые как Mhyo) представляют собой бактерию без клеточной стенки и являются этиологическим фактором энзоотической пневмонии свиней - контагиозного и хронического заболевания у свиней. Mhyo инфицируют респираторный тракт у свиней и растут в трахее, бронхах и бронхиолах. Они прикрепляются и в конечном итоге уничтожают реснички эпителиальных клеток легких, вызывая очаги повреждения в легких и вторичные инфекции, такие как инфекции другими видами микоплазмы, например, Mycoplasma hyorhinis и Mycoplasma flocculare, а также инфекции PRRSV (вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней) и PCV2 (вирус свиней типа 2).

Данное заболевание передается от свиньи к свинье посредством переносимого воздухом патогена Mhyo, выходящего из легких инфицированных свиней.

В частности, инфекция Mhyo приводит к уменьшению прироста массы тела, ухудшению конверсии корма и, таким образом, приводит к значительным экономическим потерям на коммерческих свинофермах.

Поскольку бактерия Mhyo лишена клеточной стенки, наиболее распространенные антибиотики являются неэффективными, поскольку они направлены на синтез клеточной стенки.

Вакцины для применения против патогена Mhyo являются известными и коммерчески доступными, например RespiSure® (Zoetis), Ingelvac® M. hyo, и MycoFLEX® (Boehringer Ingelheim), Hyoresp® (Merial), Stellamune® Mycoplasma (Elanco Animal Health), Fostera® PCV MH (Zoetis) и M+Pac® и Porcilis® Mhyo (обе доступны от MSD Animal Health).

Все эти вакцины содержат классические адъюванты, содержание несобственные соединения в качестве адъювантов, такие как минеральные и растительные масла, неприродные полимеры и гидроксид алюминия, для усиления иммунного ответа и необязательно также для стабилизации антигена Mhyo. Несобственные соединения усиливают иммунный ответ, но также могут давать начало нежелательным побочным эффектам. В частности, свиньи являются в высокой степени чувствительными к эксципиентам, таким как минеральные масла, частицы квасцов и другие несобственные соединения. Задачей настоящего изобретения было предоставление вакцины, которая является эффективной, но не индуцирует побочные эффекты, обычно ассоциированные с классическими адъювантами.

Кроме того, задачей настоящего изобретения было предоставление вакцины для применения для профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae, которая является удобной, безопасной и эффективной.

Кроме того, коммерческие вакцины часто вводят в качестве режима с двумя инъекциями посредством первичной вакцинации с последующей бустерной вакцинацией в пределах 2 или 3 недель от первого введения для обеспечения успешной иммунизации. Однако такое применение с двумя инъекциями имеет недостатки с точки зрения эффективности и стоимости.

Таким образом, следующей задачей является предоставление вакцины, которая является эффективной в режиме с одной инъекцией.

Кроме того, комбинированные вакцины сложно разработать, поскольку необходимо гарантировать безопасность и стабильность вакцинных компонентов и разработка комбинированных вакцин является трудоемкой. В частности, комбинирование живой аттенуированной вакцины и вакцины на основе бактерина является вредоносным с точки зрения стабильности, и трудно выбрать эксципиенты, которые стабилизируют оба типа антигенов.

Таким образом, следующей задачей было предоставление комбинированной вакцины, которая является безопасной для применения и/или стабильной.

Сущность изобретения

Эти задачи были неожиданно решены посредством следующих аспектов изобретения:

композиция согласно настоящему изобретению содержит наночастицы в ассоциации с бактерином Mycoplasma hyopneumoniae, где наночастицы содержат катионный полисахарид и анионный фосфолипид.

Неожиданно было обнаружено, что вакцина, содержащая бактерин Mhyo и упомянутые выше наночастицы, содержащие полисахарид (обычное соединение рациона) и фосфолипиды (соединение самого организма, т.е. собственное соединение), является стабильной и эффективной вакциной для профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae без индукции нежелательных побочных эффектов.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к вакцине для применения для профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae у свиней. Далее эта вакцина также может упоминаться как вакцина согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим первую вакцину, вторую вакцину и вкладыш, где первая вакцина представляет собой вакцину согласно настоящему изобретению и вторая вакцина содержит живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae у свиней, включающему введение эффективного количества вакцины.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению вакцины по настоящему изобретению для производства лекарственного средства для профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae у свиней.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к комбинированной вакцине, содержащей во флаконе смесь первой вакцины и второй вакцины, где первая вакцина представляет собой вакцину согласно настоящему изобретению и вторая вакцина содержит живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Комбинированная вакцина может представлять собой так называемую вакцину RTU (готовая для применения), таким образом, доставляемую конечному потребителю в смешанной форме, как произведено производителем, или она, например, может представлять собой вакцину, которую смешивают непосредственно перед введением рассматриваемому животному, например, путем добавления вируса PRRS к вакцине Mhyo.

Подробное описание

Следующие определения имеют отношение к вариантам осуществления настоящего изобретения.

Термин "вакцина" относится к фармацевтической композиции. Композиция способна индуцировать защитный иммунитет у животного против патогенного микроорганизма ("патогена"), т.е. индуцировать эффективное профилактическое лечение против инфекции патогеном и/или нарушения или заболевания, являющегося результатом этой инфекции.

Антигены, в общем, относятся к любому веществу, которое индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина и может включать целый организм, убитый, аттенуированный или живой, субъединицу или часть организма, рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий иммуноген, белок, полипептид, пептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Бактерины представляют собой специфические антигены. Термин "бактерин" относится к суспензии убитых бактерий, например, полученной путем концентрирования бактериальной культуры, которую затем инактивируют химическим агентом, таким как бинарный этиленимин (BEI), хлорокрезол, формалин, или, например, УФ-излучением или другими типами инактивации, не направленными на лизис клеток. В противоположность бактерину, лизат представляет собой антиген, где инактивированную бактерию прямо обрабатывают в процессе лизиса или разрушения клеток, например, посредством циклов замораживания-оттаивания, обработки ультразвуковым излучением, прессования в прессе Френча, разрушения стеклянными бусами и т.д.

"Наночастицы" представляют собой частицы, имеющие размер частиц в нм-области, т.е. средний объемный диаметр частиц (D₅₀) между 1 и 1000 нм. В одном из вариантов осуществления наночастицы имеют средний объемный диаметр частиц (D₅₀) от 1 до 500 нм. Например, средний объемный диаметр частиц составляет от 10 до 400 нм, как например, от 20 до 300 нм и от 30 до 200 нм. Как правило, средний объемный диаметр частиц составляет от 35 до 150 нм. Средний объемный диаметр частиц может быть определен посредством лазерной дифракции. В предпочтительном варианте осуществления размер частиц измеряют посредством динамического рассеяния света с использованием Malvern Autosizer^TM 4700 (Malvern Instruments S.A., Великобритания). Предпочтительно, чтобы измерение проводили с использованием лазерного пучка при 488 нм с фиксированным углом 90°. Водный раствор 15 ммоль NaCl предпочтительно используют в качестве диспергирующего вещества, где наночастицы имеют концентрацию 0,5 мг/мл. Измерение предпочтительно проводят в трех экземплярах.

Термин "зета-потенциал" относится к электрическому заряду между дисперсной средой и стационарным слоем диспергированной частицы. Таким образом, зета-потенциал является функцией поверхностного заряда частицы, какого-либо адсорбированного слоя на поверхности контакта и природы и композиции окружающей суспензионной среды. В предпочтительном варианте осуществления зета-потенциал определяют посредством фотонно-корреляционной спектроскопии с использованием Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, Франция). Предпочтительно, чтобы измерение проводилось в воде в качестве среды. Предпочтительно измерение проводят в трех экземплярах.

Подразумевается, что термин "эффективное профилактическое лечение" или "профилактика" инфекции охватывает предупреждение, облегчение или смягчение инфекции, или заболевания, или нарушения после лечения при инфицировании после лечения.

Термен введение посредством "одной инъекции" или "в однократной дозе" вакцины для применения в профилактике относится к вакцинации, которая не требует второй или "бустерной" вакцинации и все еще является эффективной в отношении обеспечения защитного иммунитета. Следует отметить, что этот термин не исключает того, что однократную дозу вводят в качестве двух или более отдельных доз, вводимых одновременно.

Значение термина "содержащий" следует интерпретировать как охватывающий все конкретно упомянутые признаки, а также необязательные, дополнительные, неуточненные признаки, в то время как термин "состоящий из" только включает те признаки, которые указаны. Таким образом, "содержащий" включает в предельном случае композицию, указанную как "состоящую из".

Термин "свинья", как используют в настоящем описании, относится к поросятам, свиньям, домашним свиньям, свинообразным, свиноматкам, подсвинкам, боровам, кабанам, т.е. всем представителям семейства Suidae.

Термин "масс.-%" относится к количеству по массе определенного компонента на основе общей массы вакцины, если нет иных указаний.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения определены в настоящем описании далее. Предпочтительные варианты осуществления являются предпочтительными отдельно или в комбинации. Кроме того, следует понимать, что приведенные ниже предпочтительные варианты осуществления относятся ко всем аспектам настоящего изобретения, т.е. вакцине, вакцине для применения, набору, способу лечения, применению для производства лекарственного средства и комбинированной вакцины.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к a вакцине, содержащей наночастицы совместно с бактерином Mycoplasma hyopneumoniae, где наночастицы содержат катионный полисахарид и анионный фосфолипид.

Наночастицы по настоящему изобретению известны, и способы получения указанных частиц описаны, среди прочего, в Paillard et al., Pharm. Res. 2010, vol. 27, p. 126-133, WO 2014/041427 и WO 2018/104762, а также в ссылках, цитированных в них.

В предпочтительном варианте осуществления катионный полисахарид может быть получен путем растворения соответствующего полисахарида (например, мальтодекстрина в 2 Н водном растворе гидроксида натрия) и добавления сшивающего агента (например эпихлоргидрин), с последующим добавлением катионного лиганда (например, глицидил-хлорид триметиламмония; гидроксихолин). Затем значение pH может быть нейтрализовано, предпочтительно уксусной кислотой, и смесь подвергнута гидродинамическому воздействию, предпочтительно под давлением, с получением наночастиц из катионного полисахарида.

Затем полученный катионный полисахарид нагружают анионными фосфолипидами, предпочтительно путем смешения катионного биополимера и анионных фосфолипидов (например, дипальмитоил-фосфатидилглицерин) в подходящем растворителе (например, этаноле, в течение, например, приблизительно 1 часа).

В одном из вариантов осуществления катионный полисахарид представляет собой пористый катионный полисахарид.

Наночастицы могут быть пористыми наночастицами, т.е. имеющими пустоты "объеме" частиц, так что жидкость или воздух могут проходить в частицы. Катионный полисахарид, таким образом, может быть пористым, так что анионный фосфолипид может заполнять поры и анионный фосфолипид присутствует по меньшей мере частично в сердцевине наночастиц.

Как правило, (пористые) частицы имеют BET (удельная площадь поверхности) по меньшей мере 0,1 м²/г, по меньшей мере 0,5 м²/г, 5 м²/г, по меньшей мере 10 м²/г или по меньшей мере 20 м²/г. Предпочтительно, BET наночастиц составляет по меньшей мере 5 м²/г. Определение удельной площади поверхности проводят путем помещения образца в атмосферу азота/гелия при разном давлении. Охлаждение образца вызывает конденсацию молекул азота на поверхности частиц. Количество конденсированного азота определяют по изменению термической проводимости смеси азот/гелий, и площадь поверхности определяют с использованием площади, требуемой для азота. Удельную площадь поверхности вычисляют с использованием этой величины и массы образца. Удельная площадь поверхности может быть определена с использованием сорбтометра BET, такого как Monosorb™, Fa. Quantachrome, в соответствии с DIN ISO 9277 (опубликовано в январе 2014 года).

В одном из вариантов осуществления наночастицы содержат катионный полисахарид и анионный фосфолипид в соотношении по массе от 40:1 до 1:20, от 20:1 до 1:10 или от 10:1 до 1:3. В предпочтительном варианте осуществления наночастицы содержат катионный полисахарид и анионный фосфолипид в соотношении по массе от 10:1 до 1:3.

В одном из вариантов осуществления наночастицы имеют зета-потенциал от 0 до 70 мВ, от 5 до 65 мВ или от 10 до 50 мВ. Предпочтительно, чтобы наночастицы имели зета-потенциал от 10 до 50 мВ.

Наночастицы имеют наружную часть, т.е. поверхность, и внутреннюю часть, т.е. сердцевину. В конкретном варианте осуществления может быть установлено, среди прочего, из зета-потенциала наночастиц, что наружная часть по существу свободна от анионного фосфолипида. Таким образом, наружная часть по существу состоит из катионного полисахарида и сердцевина содержит анионный фосфолипид. В предпочтительном варианте осуществления катионный полисахарид является пористым. В этом варианте осуществления анионные фосфолипиды предпочтительно заполняют поры. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления анионный фосфолипид присутствует внутри наночастиц, т.е. в сердцевине. В предпочтительном варианте осуществления наночастицы имеют сердцевину, где анионный фосфолипид присутствует в сердцевине. В одном из вариантов осуществления наночастицы не содержат фосфолипидный слой, окружающий сердцевину. Фосфолипидный слой представляет собой слой, содержащий фосфолипиды.

Бактерин Mhyo является коммерчески доступным, и способы получения бактеринов известны специалисту в данной области, например, посредством культивирования клеток Mhyo и последующей инактивации клеток.

В одном из вариантов осуществления вакцина имеет соотношение масс наночастиц и бактерина Mhyo от 1:10 до 10:1, от 1:5 до 5:1 или от 1:2 до 2:1. В предпочтительном варианте осуществления соотношение масс наночастиц и бактерина Mhyo составляет от 1:1 до 1:3, как например, 1:1.

Бактерин Mhyo и наночастицы находятся в ассоциации, т.е. они образуют композицию, где бактерин связан с наночастицами посредством сил, таких как ван-дер-ваальсовы силы и электростатические силы. Полагают, что бактерин Mhyo ассоциирует с наружной частью наночастицы. В одном из вариантов осуществления наночастицы, ассоциированные с бактерином Mhyo, имеют наблюдаемую величину D₅₀ (с использованием способа лазерной дифракции) от 200 до 1500 нм, или от 300 до 1200 нм, или от 400 до 1100 нм (наблюдаемая величина зависит по большей части от способа измерения).

Предпочтительно, чтобы катионный полисахарид можно было получить из полисахаридов, выбранных из крахмала, декстрана и мальтодекстрина. Более предпочтительно, чтобы сердцевина катионного полисахарида представляла собой сшитый полимер, получаемый путем реакции полисахарида, выбранного из крахмала, декстрана и мальтодекстрина, и лиганда, выбранного из первичных, вторичных и третичных аминов и четвертичных солей аммония. Сшивающие агенты известны специалисту в данной области, и предпочтительным сшивающим агентом является эпихлоргидрин (1-хлор-2,3-эпоксипропан).

В одном из вариантов осуществления анионный фосфолипид выбран из диацилфосфатидилглицерина, диацилфосфатидилсерина и диацилфосфатидилинозитола, где ацил в каждом случае может происходить из карбоновой кислоты. В предпочтительном варианте осуществления анионный фосфолипид представляет собой дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG).

Сердцевина из катионного полисахарида может быть нагружена анионным фосфолипидом путем смешения полисахаридной сердцевины и анионного фосфолипида. Следует понимать, что термин "нагруженный" относится к смеси анионного фосфолипида и катионного полисахарида.

В одном из вариантов осуществления катионный полисахарид представляет собой катионный полимальтодекстрин, получаемый путем реакции сшитого мальтодекстрина с глицидилтриметиламмонием.

В одном из вариантов осуществления вакцина содержит фармацевтически приемлемый растворитель, тем самым обеспечивая вакцины в качестве так называемой готовой для применения вакцины. Предпочтительно, растворитель включает воду и бактерин разбавляют таким образом, что он все еще сохраняет свою эффективность. В предпочтительном варианте осуществления растворитель содержит водный солевой раствор и/или фосфатно-солевой буфер (PBS). В другом варианте осуществления вакцина может быть предоставлена в качестве лиофилизата, который смешивают с фармацевтически приемлемым растворителем перед введением.

В одном из вариантов осуществления вакцина является по существу свободной от классических адъювантов, таких как масло, и/или гидроксид алюминия, и/или сапонины, и/или карбопол.

"По существу свободный" относится к концентрации ниже 0,1% (об./об.) в расчете на общий состав вакцины.

Адъюванты, главным образом, могут быть классифицированы в соответствии с иммунологическими событиями, которые они индуцируют. Первый класс, включающий, среди прочего, ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), сапонины (или их фракции и производные, такие как Quil A), гидроксид алюминия, липосомы, кохлеаты, сополимер молочная/гликолевая кислота, способствует всасыванию антигена, транспортировке и презентации посредством APC (антигенпредставляющие клетки). Второй класс, включающий, среди прочих, масляные эмульсии, гели, полимерные микросферы, неионные блок-сополимеры и, наиболее вероятно, также гидроксид алюминия, обеспечивают депо-эффект. Третий класс, включающий, среди прочего, CpG-богатые мотивы, монофосфориллипид A, микобактерии (мурамилдипептид), дрожжевые экстракты, холерный токсин, основан на распознавании консервативных микробных структур, так называемых патоген-ассоциированных микробных паттернов (PAMP), определяемых как сигнал 0. Четвертый класс, включающий, среди прочего, масляную эмульсию, поверхностно-активные вещества, гидроксид алюминия, гипоксию, основан на стимуляции способности иммунной системы различать опасное и безвредное (что не обязательно является тем же самым, что и свое и не свое). Пятый класс, включающий, среди прочего, цитокины, основан на активации костимулирующих молекул, сигнала 2, на APC. Адъювант помогает обеспечивать адекватный иммунный ответ. Хотя настоящие наночастицы не могут быть явно идентифицированы как относящиеся к одному из этих классов, по-видимому, в некоторых конкретных обстоятельствах адъювантный эффект, тем не менее, может достигаться.

Вакцина необязательно может содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, pH-буферные вещества, повышающие вязкость добавки и консерванты. Подходящие вспомогательные вещества описаны, например, в "Pharmaceutical Preformulation and Formulation", Mark Gibson, 2-е издание.

Следует понимать, что вакцина содержит бактерин Mhyo в иммунологически эффективном количестве. Такое количество может быть без труда установлено, исходя из общего знания, и может представлять собой, например, количество бактерина Mhyo, присутствующее в коммерческом продукте Porclis Mhyo ID ONCE (MSD Animal Health), или любых других продуктах на основе бактеринов, доступных в продаже.

В одном из вариантов осуществления вакцину вводят целевому животному в объеме от 0,1 до 3 мл на дозу, предпочтительно от 0,2 до 2 мл на дозу. В одном из вариантов осуществления вакцина содержит от 2 мкг до 10 мг, от 10 мкг до 5 мг, от 20 мкг до 2000 мкг или от 200 мкг до 2000 мкг наночастиц на дозу вакцины. Как правило, вакцина содержит от 1 до 5 мг наночастиц на дозу вакцины.

В одном из вариантов осуществления вакцину используют для профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae у свиней.

В одном из вариантов осуществления вакцину для применения вводят между 1 неделей и 5 неделей, например, между 2 неделей и 4 неделей жизни свиньи (после рождения). В другом варианте осуществления вакцину для применения вводят между 1 неделей и 5 неделей жизни в режиме с одной инъекцией.

В другом варианте осуществления вакцину вводят системным путем. В противоположность местному введению (например, такому как интраназальное или интрагастральное введение), системное введение означает, что вакцину доставляют в кровеносную систему индивидууму и, таким образом, она естественным образом воздействует на весь организм. Примеры системного введения включают внутримышечное (в/м), внутривенное (в/в), интрадермальное (и/д), трансдермальное (т/д) и подкожное (п/к).

В одном из вариантов осуществления вакцину вводят внутрикожным путем. Предпочтительным является введение вакцины посредством безыгольной инъекции с использованием инъекционной системы IDAL^TM (внутрикожное применение жидкостей). IDAL представляет собой систему применения на основе давления (от MSD Animal Health).

В одном из вариантов осуществления вакцину для применения вводят в качестве однократной дозы. Таким образом, вакцину вводят в качестве введения посредством одной инъекции в противоположность многократному введению (например, применение посредством двух инъекций, включающее первичную и бустерную вакцинацию).

В предпочтительном варианте осуществления вакцину для применения вводят целевому животному внутрикожно в качестве одной дозы.

Как правило, вакцину используют для уменьшения количества очагов повреждения в легких вследствие инфекции Mycoplasma hyopneumoniae. Было обнаружено, что очаги повреждения в легких уменьшаются на 10-100% и даже на 50-100% по сравнению с вакцинированными имитирующей вакциной контрольными свиньями.

Показатель очагов повреждения в легких (LLS) при использовании распространенной системы оценки может снижаться на 10-100%, как правило, на 50-100% по сравнению с контрольными свиньями без введения.

LLS определяют через три недели после заражения, как более подробно описано в примере 1. Сокращение очагов повреждения в легких и LLS относится к сравнению свиней, которым вводили вакцину по настоящему изобретению, и свиней без введения. LLS является полезным индикатором эффективности иммунизации вакциной. LLS можно определять путем измерения процента очагов повреждения в легких и преобразования его в показатель Goodwin & Whittlestone (Goodwin et al. Veterinary Record, "The detection of enzootic pneumonia in pig herds. I. Eight years general experience with a pilot control scheme"), с получением LLS.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к наборам, содержащим первую вакцину, вторую вакцину и вкладыш, где первая вакцина представляет собой вакцину в соответствии с настоящим изобретением и вторая вакцина содержит живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Вкладыш содержит инструкции по применению. Кроме того, набор может содержать иглу и/или шприц.

Живой аттенуированный патоген представляет собой жизнеспособную компетентную в отношении репликации форму патогена, имеющую сниженную вирулентность. В процессе аттенуации инфекционный патоген изменяют так, чтобы он стал безвредным или менее вирулентным, например, посредством многократного пассирования патогена через клеточные системы или посредством генной модификации патогена.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к комбинированной вакцине, содержащей смесь первой вакцины и второй вакцины, где первая вакцина представляет собой вакцину в соответствии с настоящим изобретением и вторая вакцина содержит живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV).

Альтернативно введению совместно, первая и вторая вакцина также могут быть предоставлены в качестве ассоциированных несмешанных вакцин для одновременного введения. Таким образом, вакцины не смешивают перед введением, а вводят по-отдельности свинье в пределах периода времени 1 час, предпочтительно в пределах 30 мин, 25 мин, 20 мин, 15 мин, 10 мин, 9 мин, 8 мин, 7 мин, 6 мин, 5 мин, 4 мин, 3 мин, 2 мин или 1 мин.

Однако комбинация двух вакцин, как правило, является преимущественной для минимизации количества инъекций, проводимых каждой свинье, и, кроме того, повышает эффективность. Однако, когда две или более вакцин смешивают, являются частыми проблемы стабильности, поскольку каждая вакцина может требовать отдельных эксципиентов, что, таким образом, приводит к нестабильности, снижению активности и/или деградации одной из вакцин. Неожиданно, стабильность живого аттенуированного PRRSV возрастает в присутствии наночастиц по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления комбинированную вакцину согласно изобретению используют для профилактики инфекции Mhyo и профилактики инфекции PRRSV.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к флакону, содержащему вакцину в соответствии с настоящим изобретением или комбинированную вакцину в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, чтобы флаконы представляли собой флаконы из PET. Предпочтительно, чтобы флаконы содержали 2 мл, 20 мл, 50 мл, 100 мл, 200 мл или 500 мл вакцины или комбинированной вакцины.

Изобретение далее объяснено с использованием следующих примеров.

Примеры

Пример 1: Показатель очагов повреждения в легких

Материалы для заражения:

Использовали бактерин M. hyopneumoniae, штамм 98, замороженный аликвотами 1 мл и хранившийся при <-50°C.

Получение материалов для заражения:

M. hyopneumoniae штамма 98 разбавляли в 2000 раз в FRIIS+20% сыворотка SPF. Культуру инкубировали при 37°C (50 об/мин) в течение от четырех до пяти суток. После инкубации в течение четырех и пяти суток проводили взятие образцов этой культуры для заражения. Подсчет жизнеспособных клеток проводили до и после заражения посредством инокуляции 4,5 мл среды FRIIS +20% сыворотка SPF (свободной от конкретного патогена) с 0,5 мл культуры, перемешивания и переноса 0,5 мл культуры из одной пробирки в следующую до 10^-10. Пробирки для CCU (единицы изменения цвета) инкубировали при 37°C в течение трех недель.

Процедура заражения:

Семьдесят две свиньи SPF в возрасте трех недель (±3 суток) распределяли на 6 групп по 12 животных в каждой. К группам 1-4 добавляли всего четыре животных на группу чтобы всего было 16 животных на группу. Всем животным проводили интратрахеальное заражение с использованием катетера с 10 мл чистой культуры в течение двух дней подряд.

Дозировка и введение:

Вакцина содержала пористые наночастицы из катионного мальтодекстрина, нагруженные дипальмитоилфосфатидилглицерином, имеющие величину D₅₀ 37 нм и зета-потенциал +37 мВ, в количестве 2,9 мг частиц на дозу 0,4 мл. Тестируемые вакцины изготавливали с бактерином Mhyo и лизатом Mhyo, причем последний тип антигена, как правило, был более эффективным при применении с наночастицами в данной области. Вакцину на основе бактерина получали путем смешения частиц и состава бактерина (BEI-инактивированные бактерии Mhyo) в соотношении масс 1:1 (частицы: антиген Mhyo) и выдерживания смеси в течение 24 часов в покое для обеспечения ассоциации частиц и антигена. Вакцину на основе лизата получали соответствующим образом с тем отличием, что бактерин подвергали процедуре обработки ультразвуком для лизиса клеток. Зета-потенциал частиц после ассоциации с антигеном Mhyo составлял +14,9 мВ для вакцины на основе бактерина и +15,6 мВ для вакцины на основе лизата.

В возрасте трех и пяти недель поросят вакцинировали локально (интраназально) или системно (с использованием вакцинатора IDAL®, депонирующего вакцину частично в дерме и частично в мышечной ткани) в шею согласно таблице 1. В качестве положительного контроля использовали коммерческий продукт Porcilis® Mhyo ID ONCE в соответствии с инструкциями изготовителя.

Новая вакцина не индуцировала нежелательных побочных эффектов и считалась безопасной. Свиней умерщвляли через 21 сутки после заражения для определения показателя очагов повреждения в легких вследствие пневмонии. В ходе некропсии определяли процент очагов повреждения в легких и этот показатель преобразовывали в показатель Goodwin & Whittlestone (выше) с получением показателя очагов повреждения в легких. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Срединный показатель очагов повреждения в легких

	Положительный контроль	NP без антигена Mhyo	NP+и/н бактерин	NP+в/к бактерин	NP+и/н лизат	NP+в/к лизат
Срединный LLS	1,5	8	11,5	2,5	9	9

*NP=наночастицы; и/н= интраназальный; в/к=внутрикожный

Как может быть установлено из таблицы 1, показатель очагов повреждения в легких является значимо более низким для системного введения вакцины, содержащей бактерин Mhyo и наночастицы, по сравнению с местным применением. Также вакцина на основе бактерина была существенно более эффективной, чем лизат Mhyo. Это является неожиданным относительно уровня техники, где настоящие наночастицы обычно используют для местной вакцинации с использованием лизата в качестве антигена.

Пример 2: Введение посредством однократной против двукратной дозы

По аналогии с примером 1, описанным выше, LLS был определен для четырех групп свиней, каждая из которых содержала 20 свиней.

В группе 1 (одна инъекция в/к), свиней вакцинировали внутрикожным путем на 4 неделе посредством вакцинации однократной дозой (одна инъекция) 0,2 мл вакцины. В группе 2 (две инъекции в/к) свиней вакцинировали внутрикожно на 1 неделе посредством первичной вакцинации 0,2 мл с последующей бустерной вакцинацией 0,2 мл на 4 неделе. В группе 3 свиней вакцинировали внутрикожно на 4 неделе посредством однократной дозы (одна инъекция) 0,4 мл вакцины. В группе 4 вакцинацию не проводили. Вакцины в группах 1-3 были идентичными и содержали наночастицы и бактерин Mhyo (соотношение масс 1:1), где каждая доза 0,2 мл содержала 2,18 мг наночастиц. Зета-потенциал составленных частиц составлял +15,2 мВ.

Результаты представлены в таблице 2 настоящего описания ниже.

Таблица 2: LLS после вакцинации

	Одна инъекция в/к (0,2 мл)	Две инъекции в/к ID: каждая по 0,2 мл	Одна инъекция в/к (0,4 мл)	Отрицательный контроль (без вакцина)
Срединный LLS	1,5	2,7	1,0	10,0

Как можно видеть, введение однократной дозы, совершенно неожиданно, не приводит к повышению LLS относительно введения посредством двух инъекций. Более того, LLS, по-видимому, даже снижался. Это означает, что с использованием данной вакцины можно применять однодозовую вакцинацию для обеспечения эффективной защиты от Mhyo.

Пример 3: Стабильность вакцины PRRSV

Для определения стабильности живой аттенуированной вакцины против PRRSV в присутствии и в отсутствии наночастиц PRRSV смешивали в обычном разбавителе для вакцин Diluvac Forte® (MSD Animal Health) с наночастицами или без них. TCID50 (доза 50, инфицирующая культуру ткани) PRRSV на клетках MARC определяли через 0, 45, 90 и 150 мин. TCID50 соответствует эффективности антигена PRRSV. Для эксперимента в каждом случае 1,67 мг наночастиц (см. пример 1) добавляли в пробирку eppendorf, в которую добавляли дозу живого вируса PRRS в разбавителе с целью достигнуть приблизительно 7,2*10^5 TCID50 на пробирку. Как можно видеть из таблицы 3 ниже и величин TCID50 (*10^5) в каждый измеренный временной интервал, стабильность PRRSV возрастала в присутствии наночастиц по сравнению с составом без наночастиц.

Таблица 3. Стабильность PRRSV

	TCID50 в момент времени 0 мин	TCID50 в момент времени 45 мин	TCID50 в момент времени 90 мин	TCID50 в момент времени 150 мин
Разбавитель	6,75	5,75	5,15	3,15
Разбавитель+NP	6,75	6,35	5,55	4,75

* NP=наночастицы; TCID50=доза 50, инфицирующая культуру ткани

Как можно видеть из результатов, представленных в таблице 3, стабильность PRRSV в разбавителе неожиданно возрастает в присутствии наночастиц, что означает, что эффективность комбинированной вакцины также возрастает в отношении компонента PRRSV.

Claims (10)

1. Вакцина для вакцинации свиней, содержащая наночастицы в ассоциации с бактерином Mycoplasma hyopneumoniae, где наночастицы содержат катионный полисахарид и анионный фосфолипид, где катионный полисахарид представляет собой пористый полисахарид, где анионный фосфолипид выбран из диацилфосфатидилглицерина, диацилфосфатидилсерина и диацилфосфатидилинозитола, где катионный полисахарид получен путем реакции сшитого мальтодекстрина с глицидилтриметиламмонием, причем вакцина содержит фармацевтически приемлемый растворитель.

2. Вакцина по п. 1, где вакцина не содержит масла и/или гидроксида алюминия, и/или сапонинов, и/или карбопола.

3.Применение вакцины по п.1 или 2 для сокращения очагов повреждения в легких вследствие инфекции Mycoplasma hyopneumoniae.

4. Применение по п. 3, где вакцину вводят системным путем.

5. Применение по п. 3 или 4, где вакцину вводят внутрикожным путем.

6. Применение по любому из пп. 3-5, где вакцину вводят в виде однократной дозы.

7. Набор для вакцинации свиней, содержащий первую вакцину, вторую вакцину и вкладыш, где первая вакцина представляет собой вакцину по п. 1 или 2 и вторая вакцина содержит живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV).

8. Способ профилактики инфекции Mycoplasma hyopneumoniae у свиней, включающий введение эффективного количества вакцины по п. 1 или 2.

9. Применение вакцины по п. 1 или 2 для получения лекарственного средства для сокращения очагов повреждения в легких вследствие инфекции Mycoplasma hyopneumoniae.

10. Комбинированная вакцина для вакцинации свиней, содержащая смесь первой вакцины и второй вакцины, где первая вакцина представляет собой вакцину по п. 1 или 2, и вторая вакцина содержит живой аттенуированный вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV).