RU2843971C2

RU2843971C2 - Способ культивирования популяции клеток и его применение

Info

Publication number: RU2843971C2
Application number: RU2021130806A
Authority: RU
Inventors: Дайсуке САКАИ; Йосихико НАКАМУРА; Эрика МАЦУСИТА
Original assignee: Токай Юниверсити Эдьюкейшнл Систем; Ниппон Дзоки Фармасьютикал Ко., Лтд.
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2025-07-22

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения популяции клеток, содержащей стволовые клетки и/или клетки предшественники, положительные по экспрессии Tie2, происходящие из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, а также к способу получения из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/предшественники, происходящие из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, популяции клеток, содержащей целевые клетки, полученные в результате дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников. Изобретение обеспечивает предоставление средств для эффективного получения популяции клеток, содержащей стволовые клетки и/или клетки предшественники, положительные по Tie2. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 табл., 15 ил., 7 пр.

Description

[Область техники, к которой относится изобретение]

[0001]

Настоящее изобретение относится, среди способов культивирования популяции клеток, например, к способу культивирования популяции клеток, содержащей стволовые клетки и/или клетки-предшественники, положительные по экспрессии поверхностного маркера клеток Tie2 (тирозинкиназы с доменами, гомологичными Ig и EGF 2) (обозначенные в настоящем описании как «положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники»). Более конкретно, настоящее изобретение относится, например, к способу культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, который можно использовать на стадии размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (например, стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра) в популяции клеток и/или на стадии индукции дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в клетки, имеющие данный фенотип (например, экспонирующие коллаген типа II клетки пульпозного ядра).

[Уровень техники]

[0002]

В этой стране, боль в нижней части спины ранжирована как вторая по частоте встречаемости, представляет собой общераспространенное заболевание, так что 2/3 взрослой популяции испытывает его по меньшей мере один раз на протяжении жизни, и оно является причиной связанных с трудовой деятельностью нарушений и/или социальных проблем в медицинской экономике. Повреждение диска, которое считают отвечающим за 20% боли в нижней части спины, вызывает серьезные проблемы, которые могут индуцировать, например, позвоночную грыжу, деформирующий спондилез, спинальный стеноз или спондилолистез. Они обусловлены необратимыми изменениями в ткани диска, и представляют собой патологические состояния, называемые дегенерацией межпозвоночного диска. Межпозвоночный диск представляет собой имеющий тороидальную форму хрящевой орган, содержащий пульпозное ядро (NP) в центре, фиброзное кольцо (AF), а именно, многослойный фиброзный хрящ, окружающий пульпозное ядро, и хрящевую замыкательную пластинку (EP), вертикально соединяющую соседние позвонки. Коллагеновое пульпозное ядро представляет собой бессосудистый орган, богатый внеклеточным матриксом (ECM), состоящий из крупного протеогликана и коллагена, секретированного из клеток пульпозного ядра, происходящих из нотохорда, содержащихся в пульпозном ядре. У некоторых позвоночных, включая человека, происходящие из нотохорда клетки пульпозного ядра, по некоторым данным, исчезают в ранний период жизни. После их исчезновения, пульпозное ядро формируется хондроидными клетками неизвестного происхождения, которые являются морфологически сходными с хондроцитами. Такое фенотипическое изменение клеток влияет на состав ECM, вызывает старение и/или дегенерацию диска, например, уменьшение содержания влаги или фиброз, и по-видимому, в конечном счете, вносит значительный вклад в боль в нижней части спины и/или дегенеративные заболевания поясничного отдела позвоночника. Следует отметить, что многие виды животных, такие как мышь, крыса, кролик и свинья, имеют, на протяжении своей жизни, происходящие из нотохорда клетки пульпозного ядра, и дегенерация межпозвоночного диска является едва заметной. Это может происходить из-за того, что механизм регуляции происходящих из нотохорда клеток пульпозного ядра и других клеток пульпозного ядра отличается от механизма у человека.

[0003]

В качестве примера способа для предотвращения или лечения дегенерации межпозвоночного диска, проводят научно-исследовательские разработки препаратов аллогенных клеток диска, включая препарат клеток, содержащий, например, аллогенные клетки пульпозного ядра и ECM, для введения в ткань межпозвоночного диска. Получение такого препарата клеток требует определенного количества аллогенных клеток пульпозного ядра. Например, ткань пульпозного ядра диска, удаленную у пациента с позвоночной грыжей хирургическим путем, можно использовать в качестве источника клеток пульпозного ядра для использования в таком препарате клеток. Однако, количество ткани пульпозного ядра, которое может быть собрано таким образом, то есть количество клеток пульпозного ядра, содержащихся в ней, является ограниченным. В то же время, например, с учетом риска вирусной инфекции, является желательным избегать использования смеси клеток пульпозного ядра, полученных от множества пациентов (доноров) с позвоночной грыжей, для обеспечения количества клеток пульпозного ядра. Таким образом, является критической разработка технологии для получения популяции клеток, содержащей достаточное количество клеток пульпозного ядра для лечения, посредством культивирования редких стволовых клеток или клеток-предшественников, которые содержатся в небольшом объеме ткани диска (например, пульпозного ядра, AF), происходящей от одного донора, и могут подвергаться дифференцировке в зрелые клетки пульпозного ядра.

[0004]

В Патентном документе 1 описано получение «дискосферы», содержащей стволовые клетки и клетки-предшественники, содержащиеся в популяции клеток, посредством культивирования клеток пульпозного ядра (популяции клеток, происходящих из пульпозного ядра межпозвоночного диска) «в условиях, мешающих прикреплению клеток» (предпочтительно, посредством культивирования в бессывороточной культуральной среде). То есть в Патентном документе 1 описан «способ получения популяции стволовых клеток диска», включающий стадии: выращивания клеток пульпозного ядра в культуральной среде «в условиях, мешающих прикреплению клеток»; (b) концентрирования стволовых клеток диска, клеток-предшественников диска или их комбинации; и (c) получения дискосферы, включающей клетки пульпозного ядра, таким образом, получения популяции стволовых клеток диска (например, пункт формулы изобретения 3). Следует отметить, что «дискосфера» описана как содержащая плавучие стволовые клетки пульпозного ядра и клетки пульпозного ядра, аранжированные в кольцевую-сферическую структуру, такую как свободная in vitro плавучая кольцевая-сферическая структура, содержащая стволовые клетки диска, клетки-предшественники диска или их комбинацию, или шар из клеток, в котором одна стволовая клетка дает начало собственным клонам и клеткам-предшественникам; или описана таким образом, что клетки пульпозного ядра, содержащиеся в дискосфере, присоединены друг к другу (абзацы [0024] и [0039]). В Патентном документе 1, кроме того, описана «выделенная популяция стволовых клеток диска», которую культивируют «в условиях, мешающих прикреплению клеток», и получают посредством обогащения стволовых клеток диска, клеток-предшественников диска или их комбинации (например, пункт формулы изобретения 1); «выделенная дискосфера, содержащая стволовые клетки диска, клетки-предшественники диска или их смесь, обогащенные из клеток пульпозного ядра, и представляющая собой «плавучую in vitro сферическую структуру (например, пункт формулы изобретения 10); «искусственное устройство для замены диска», содержащее каркас диска и дискосферу, содержащую клетки пульпозного ядра, полученные посредством обогащения стволовых клеток диска, клеток-предшественников диска или их комбинации (например, пункта формулы изобретения 11); «способ получения искусственного устройства для замены диска, включающий стадию выращивания, в каркасе диска, дискосфер, содержащих стволовые клетки диска, клетки-предшественники диска или их смесь, обогащенные из клеток пульпозного ядра (например, пункт формулы изобретения 12); способ «получения обогащенной популяции клеток», включающий стадии: культивирования клеток пульпозного ядра, рассеянных при данной низкой плотности, «в условиях, мешающих прикреплению клеток»; и отбор in vitro «плавучей сферической структуры», содержащей стволовые клетки диска, клетки-предшественники диска или их смесь, таким образом, получение обогащенной популяции клеток (например, пункт формулы изобретения 17); «способ размножения популяции, содержащей обогащенные стволовые клетки диска, клетки-предшественники диска или их комбинацию», включающий стадии: диссоциации стволовых клеток диска, клеток-предшественников диска или их комбинации до одной или нескольких диссоциированных клеток диска; и культивирование одной или нескольких диссоциированных клеток диска в среде, которая содержит предопределенные добавки (например, FGF2, EGF) и «мешает прикреплению клеток» (например, пункт формулы изобретения 18); и т.д. Следует отметить, что «диск» в Патентном документе 1 считают являющимся прямым переводом оригинального слова «диск» и обозначающим «межпозвоночный диск».

[0005]

Следующее может быть сказано об объектах, относящихся к культуральному оборудованию или культуральным средам для культивирования гетерогенной популяции клеток (происходящей из пульпозного ядра популяции клеток), включая, например, стволовые клетки диска, клетки-предшественники диска и клетки диска, происходящие из ткани пульпозного ядра диска, как описано в Патентном документе 1.

[0006]

В Патентном документе 1 описан вариант осуществления, в котором, в качестве культивирования «в условиях, мешающих прикреплению клеток», культивирование посредством рассева клеток при низкой плотности в бессывороточной среде, содержащей вещество (конкретно, метилцеллюлозу), мешающее прикреплению клеток, или культивирование с использованием чашки с очень низким прикреплением, проводят для получения дискосферы, а именно, плавучей сферической структуры, из происходящей из пульпозного ядра популяции клеток (например, стволовых клеток, включенных в нее) (см. абзац [0156] и следующие, и Пример 1: абзацы [0170] - [0181], соответствующие пунктам формулы изобретения 3, 17 и другим). Однако в Патентном документе 1 ни описывают, ни предполагают, что происходящую из пульпозного ядра популяцию клеток (например, стволовые клетки, содержащиеся в ней) культивируют в среде, содержащей вещество (например, коллагеназу), осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса, или на адгерентной для клеток культуральной поверхности, и стволовые клетки диска подвергают размножению или дифференцировке без формирования дискосфер (плавучих сферических структур).

[0007]

Кроме того, в Патентном документе 1 описан, в качестве способа размножения популяции клеток, содержащей, например, обогащенные стволовые клетки диска, вариант осуществления, в котором дискосферы (плавучие сферические структуры) сначала подвергают диссоциации до одной или нескольких стволовых клеток диска посредством инкубации в среде, дополненной коллагеназой, и затем диссоциированные клетки повторно рассевают в содержащую метилцеллюлозу среду (см. абзац [0157] и Пример 2: абзацы [0182] - [0184], соответствующие пунктам формулы изобретения 18 и другим). Однако, культивирование в среде, дополненной коллагеназой, в этом варианте осуществления является только временной обработкой для диссоциации однажды сформированных дискосфер, например, до индивидуальных стволовых клеток диска. Обработка не предназначена для индукции дифференцировки стволовых клеток диска и других, и диссоциированные стволовые клетки диска и другие повторно культивируют «в условиях, мешающих прикреплению клеток» (например, в содержащей метилцеллюлозу среде). В Патентном документе 1 ни описывают, ни предполагают, что культивирование начинают в среде, дополненной коллагеназой, с использованием в то же время стволовых клеток диска или других в состоянии, в котором дискосфер не сформировано (до формирования), и стволовые клетки диска или другие размножают (выращивают) или подвергают дифференцировке, или что культивирование продолжают в среде, дополненной коллагеназой, даже после того, как стволовые клетки диска или другие диссоциировали друг от друга, и стволовые клетки диска и другие размножают (выращивают) и подвергают дифференцировке с поддержанием в то же время состояния, в котором дискосферы, т.е. плавучие сферические структуры, не формируются.

[0008]

Следует отметить, что в Патентном документе 1 описано выращивание стволовых клеток диска в бессывороточной среде, содержащей «соединение, ингибирующее созревание клеток» (например, FGF), или «соединение, поддерживающее незрелость клеток» (например, каждый член суперсемейства TGF-β, BMP, IL-6, LIF) (абзацы [0035] - [0037]). Однако в Патентном документе 1 ни описывают, ни предполагают культивирование стволовых клеток диска в среде, содержащей вещество, стимулирующее активацию Tie2.

[0009]

Кроме того, в Патентном документе 1 описан, в качестве способа получения ткани пульпозного ядра для получения происходящей из пульпозного ядра популяции клеток, только общий способ фрагментации ткани пульпозного ядра посредством фрагментации пульпозного ядра (полученного хирургическим способом человеческого материала диска или образца биопсии) и обработки ткани пульпозного ядра, например, коллагеназой II или коллагеназой Clostridium для диссоциации индивидуальных клеток (для получения суспензии отдельных клеток) (например, абзацы [0026], [0029] и [0030], Пример 1: абзацы [0171] - [0174]).

[0010]

В то же время, в Патентном документе 2 и Непатентном документе 1 описано, что среди клеток, содержащихся в ткани межпозвоночного диска (пульпозного ядра), клетки, положительные по Tie2 и/или GD2 в качестве поверхностного маркера клеток, представляют собой клетки, которые могут быть названы стволовыми клетками или клетками-предшественниками клеток пульпозного ядра; в частности, клетки, положительные как по Tie2, так и по GD2 (стволовые клетки пульпозного ядра в активном состоянии), формируют сферические колонии и имеют потенциал для конечной дифференцировки до зрелых клеток пульпозного ядра на протяжении серий каскадов дифференцировки (кроме того, имеют потенциал для дифференцировки в адипоциты, остеоциты, хондроциты и нейроны); и кроме того, имплантация стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра в межпозвоночный диск (пульпозное ядро) делает возможным получение внеклеточного матрикса, такого как коллаген типа II, в ткани, поддержание или реконструкцию ткани межпозвоночного диска, и предотвращение или лечение дегенерации межпозвоночного диска.

[0011]

В качестве более конкретного варианта осуществления, в Патентном документе 2 и Непатентном документе 1 описано, что сферические колонии формировали (вместе с адгерентными колониями) посредством подвергания популяции клеток, содержащейся в ткани межпозвоночного диска (пульпозного ядра), суспензионному культивированию в среде с метилцеллюлозой; такие сферические колонии происходят из положительных по Tie2 (и положительных по GD2) клеток, описанных выше; и коллаген типа II и протеогликан экспрессируются в сферических колониях (некоторых их клетках) (см., например, Примеры, абзацы [0067] и [0070], и другие из Патентного документе 2). Однако, ни в Патентном документе 2, ни в Патентном документе 1 ни описывают, ни предполагают, что стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра (положительные по Tie2- и/или GD2 клетки) подвергают размножению или дифференцировке без формирования сферических колоний в среде, содержащей вещество (например, коллагеназу), осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса, или на адгерентной для клеток культуральной поверхности (с использованием свободной от метилцеллюлозы среды).

[0012]

Кроме того, в Патентном документе 2 и Непатентном документе 1 описан также, в качестве способа получения популяции клеток происходящей из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, только общий способ, в котором ткань фрагментируют, например, с использованием ножниц и затем расщепляют с использованием протеазы (например, TrypLE Экспрессируют, коллагеназы P) (Примеры: абзац [0048]).

[0013]

Следует отметить, что в Патентном документе 2 и Непатентном документе 1 описано, что для поддержания положительных по Tie2 клеток пульпозного ядра (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра диска), необходим механизм передачи сигналов между Tie2 (рецептором) и Ang-1 (ангиопоэтином-1, лигандом); и положительные по Tie2 клетки можно размножать посредством культивирования в присутствии Ang-1 (совместного культивирования с AHESS 5, принудительно экспрессирующими Ang-1), и Ang-1, таким образом, считают фактором ниши, контролирующим иерархию дифференцировки клеток пульпозного ядра (Примеры: абзацы [0049], [0069], [0075] и другие).

[0014]

Впрочем, Tie2 также экспрессируется в эндотелиальных клетках сосудов, и известно, что когда Tie2 активируется, осуществляется созревание, нормализация или стабилизация кровеносных сосудов, например, неорганизованное размножение сосудов (ангиогенез), наблюдаемое, например, при опухолях, ревматоидном артрите, диабетической ретинопатии, гиперлипидемии или гипертензии, можно супрессировать, и морщины можно предотвращать и улучшать. Примеры активатора Tie2, имеющего такое действие, включают экстракт, полученный из растения рода Cinnamomum (который назван порошком корицы, Патентный документ 3) или экстракт плода оливы (Патентный документ 4), так же как различные экстракты, полученные из животных/растений, таких как квилайя, желтое дерево, гинкго, устрицы, куркума, хризантема, ююба, китайская дереза обыкновенная, ромашка аптечная, иглица колючая, боярышник, карамбола, Alpinia speciosa, лотос, ройбос, Tamarindus indica L., китайская айва, Psidium guajava, длинный перец, женьшень сибирский, манго, имбирь, женьшень обыкновенный, Elaeagnus umbellata, Salsola komarovii, Kalopanax pictus, японская клетра, Hemerocallis fulva var. kwanso, Colocasia gigantea, Staphylea pinnata, Clerodendrum trichotomum, Stauntonia hexaphylla, Pellionia minima, Quercus serrata, Quercus acutissima, Lactuca indica, звездное яблоко, псилиум, дикий лук-рокамболь, Myrica rubra, Gleditsia officinalis Hemsl., Polygonatum rhizome, Polygonatum odoratum, семя трихозанта или Morinda officinalis (Патентные документы 5-11). Кроме того, примеры описанного компонента, вызывающего активацию/эффект Tie2, включают урсоловую кислоту, коросоловую кислоту, 3-O-галлоилпроцианидин B-1, линоленовую кислоту, 13-гидрокси-9Z,11E,15E-октадекатриеновую кислоту, процианидин B-2, эпикатехин-(4β-6)-эпикатехин(4β-8)-эпикатехин, процианидин C-1, астрагалозид VIII, сапонин сои I, 3'-O-метилгаллокатехин, пиперноналин, сирингаресинол, 2-метоксициннамальдегид, элеутерозид E, элеутерозид E1, сезамин, эудесмин, силватесмин, пиноресинол, янгамбин, форзитинол или кумарин (Патентные документы 6 и 12-14).

[0015]

Например, в Патентном документе 3 представлен эксперимент (Примеры), относящийся к «активирующему Tie2 средству», такому, что когда «гематопоэтические клетки Baf3, принудительно экспрессирующие Tie2», или «нормальные эндотелиальные клетки пуповинной вены человека (HUVEC)» культивировали в среде, содержащей экстракт палочки корицы в горячей воде, обнаружено, что белок Tie2, экспрессированный в этих клетках, являлся более фосфорилированным, чем в контроле, по Вестерн-блоттингу (например, абзацы [0024] - [0027], Фиг. 1-3).

[0016]

Однако, в Патентных документах 3-14 ни описывают, ни предполагают использование активирующего Tie2 средства в культуре происходящей из пульпозного ядра популяции клеток (включая положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники), полученные из межпозвоночного диска, или какие виды эффектов проявляются таким образом.

[Документы предшествующего уровня техники]

[Патентные документы]

[0017]

Патентный документ 1: Японский патент No. 5509073 (соответствующий WO 2009/009020)

Патентный документ 2: Японский патент No. 5863639 (соответствующий WO 2011/122601)

Патентный документ 3: Японский патент в открытом доступе No. 2009-263358 (родственный WO 2009/123211)

Патентный документ 4: WO 2016/060249

Патентный документ 5: WO 2012/073627

Патентный документ 6: Японский патент в открытом доступе No. 2012-236795

Патентный документ 7: Публикация японской патентной заявки на национальной фазе No. 2009-154237

Патентный документ 8: Японский патент в открытом доступе No. 2011-201811

Патентный документ 9: Японский патент в открытом доступе No. 2011-102275

Патентный документ 10: Японский патент в открытом доступе No. 2011-102274

Патентный документ 11: Японский патент в открытом доступе No. 2011-102273

Патентный документ 12: Японский патент в открытом доступе No. 2014-97977

Патентный документ 13: Японский патент в открытом доступе No. 2013-241356

Патентный документ 14: Японский патент в открытом доступе No. 2011-102272

[Непатентные документы]

[0018]

Непатентный документ 1: Sakai D et al., Nat Commun. 2012; 3: 1264

[Сущность изобретения]

[Проблема, подлежащая решению посредством изобретения]

[0019]

Как описано выше, для получения аллогенного препарата клеток диска для предотвращения или лечения, например, дегенерации межпозвоночного диска, необходимо иметь некоторое количество функциональных клеток пульпозного ядра, продуцирующих внеклеточный матрикс, такой как коллаген типа II и протеогликан. Для этой цели, большой объем функциональных клеток пульпозного ядра необходимо получать посредством эффективного размножения и дифференцировки положительных по Tie2 клеток, которые рассматривают как стволовые клетки и/или клетки-предшественники клеток пульпозного ядра, включенные в ткань межпозвоночного диска (например, пульпозного ядра), извлеченную, например, из очага повреждения пациента с позвоночной грыжей. В частности, для усиления терапевтического эффекта, когда препарат клеток вводят пациенту, например, с дегенерацией межпозвоночного диска, является важным не просто осуществлять дифференцировку в клетки пульпозного ядра, но осуществлять дифференцировку в функциональные клетки пульпозного ядра, продуцирующие большое количество внеклеточного матрикса, такого как коллаген типа II, настолько эффективно, насколько возможно, когда положительные по Tie2 клетки (стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра), содержащиеся в межпозвоночном диске, подвергают культивированию и дифференцировке. В то же самое время, является также важной эффективное размножение положительных по Tie2 клеток (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра) в популяции клеток, полученных из ткани, заранее, до дифференцировки, как описано выше, для увеличения количества полученных в конечном счете функциональных клеток пульпозного ядра. То есть существует необходимость в практических средствах для эффективного размножения и дифференцировки положительных по Tie2 клеток (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра) из популяции клеток, содержащей определенное количество положительных по Tie2 клеток (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра), таким образом, обогащения функциональных клеток пульпозного ядра в полученном в конечном счете препарате клеток (популяции клеток), подлежащем введению.

[0020]

Кроме того, в типичном варианте осуществления предшествующего уровня техники, как описано в Патентных документах 1 и 2, сферические колонии (дискосферы, сфероиды) формируют посредством культивирования популяций клеток, содержащих стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, включенные в ткань межпозвоночного диска, в содержащей метилцеллюлозу среде, и популяцию клеток затем подвергают дифференцировке в клетки пульпозного ядра. Однако, поскольку метилцеллюлоза является высоковязким веществом, является сложным или требует больших трудозатрат выделение, без отходов, популяции клеток (включающей функциональные клетки пульпозного ядра, которые можно использовать), полученной в содержащей метилцеллюлозу среде. Это является помехой для эффективного получения и практического использования препарата клеток.

[0021]

Настоящее изобретение нацелено на проблему предоставления способов эффективного получения популяции клеток, богатой клетками, имеющими данный фенотип, в зависимости от их использования (например, функциональными клетками пульпозного ядра, продуцирующими внеклеточный матрикс, такой как коллаген типа II), из популяции клеток, содержащей стволовые клетки и/или клетки-предшественники, положительные по экспрессии Tie2 (например, популяции клеток, содержащей стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, происходящие из межпозвоночного диска).

[Средства для решения проблем]

[0022]

Авторы настоящего изобретения провели исследование, сфокусированное на состоянии популяции клеток, подлежащей культивированию, и условиях ее культивирования, когда популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 клетки (стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра), включенные в ткань пульпозного ядра межпозвоночного диска, культивируют, и в результате, обнаружили множество технических признаков, которые могут вносить вклад в предоставление решения вышеуказанных проблем. Среди способов культивирования, имеющих эти технические признаки, один способ культивирования является очень полезным в ступени культивирования на стадии (стадии культивирования для размножения), в основном имеющей целью размножение стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра, и другой способ культивирования является очень полезным в ступени культивирования на стадии (стадии культивирования для дифференцировки), в основном имеющей целью индукцию дифференцировки от стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра до функциональных клеток пульпозного ядра. Кроме того, обнаружено также, что эти способы можно использовать в комбинации последовательно или одновременно, и в частности, эффекты по изобретению можно вызывать синергически, принимая ступень культивирования, в которой эти способы культивирования «объединяют» и осуществляют одновременно.

[0023]

Конкретно, аспект изобретения относится к следующим первому - четвертому способам культивирования, которые можно комбинировать (предпочтительно, объединять) в качестве способа культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, представленные положительными по Tie2 клетками (стволовыми клетками/-предшественниками пульпозного ядра), включенными в ткань межпозвоночного диска.

[0024]

Первый способ культивирования

«Первый способ культивирования» для популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению, представляет собой способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники во время присутствия в нерасщепленной ткани.

[0025]

Общепринятым образом, при попытках культивирования популяции клеток, содержащихся в ткани пульпозного ядра, является общепринятым тонкое измельчение ткани пульпозного ядра собранного межпозвоночного диска, осуществление обработки для расщепления ткани (обработки расщепления) с использованием деградирующего белок фермента (протеазы), такого как коллагеназа, и затем выделение популяции клеток, отделенной от ткани пульпозного ядра посредством обработки, для начала культивирования. Однако, авторы настоящего изобретения обнаружили, что в случае, когда ткань пульпозного ядра тонко измельчают, тонко измельченную ткань пульпозного ядра без обработки для расщепления суспендируют в культуральной среде, и популяцию клеток культивируют в течение определенного периода с поддержанием в то же время в ткани, соотношение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра) в популяции клеток увеличивается, и экспрессия Tie2 в индивидуальных клетках также увеличивается более, чем в случае, когда проводят общепринятую обработку для расщепления. Такие эффекты являются предпочтительными для стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра, поскольку ткань пульпозного ядра не расщепляют. То есть, факторы роста, такие как ангиопоэтин-1 (Ang-1) и VEGF-A, присутствуют, и микроокружение ткани (ниша), в котором положительные по Tie2 клетки поддерживаются, не разрушается (например, без Ang-1, положительные по Tie2 клетки в конечном счете подвергаются апоптозу). Популяцию клеток, содержащую стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, сохраняемые в такой нише, используют для начала культивирования. Это позволяет стволовым/клеткам-предшественникам пульпозного ядра, в которых активность Tie2 сохраняется (т.е., экспрессия Tie2 увеличивается больше, чем посредством общепринятого способа выделения клеток из ниши), быстро начинать расти. Таким образом, частота положительных и уровень экспрессии должны быть увеличенными в популяции клеток, полученных после культивирования.

[0026]

Кроме того, поскольку операция отделения и выделения популяции клеток из ткани пульпозного ядра не является необходимой, ценные положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, содержащиеся в ткани пульпозного ядра, можно использовать без отходов. Например, количество ткани пульпозного ядра, содержащееся в грыжевом очаге, извлеченном у пациента с позвоночной грыжей, составляет приблизительно 1-2 г, самое большее. Количество положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, содержащееся на г ткани пульпозного ядра, меняется, в зависимости, например, от возраста пациента, и составляет, например, приблизительно 50000. Количество лейкоцитов, содержащееся в 1 см³ пуповинной крови составляет порядка 10⁶; и количество клеток злокачественных опухолей, содержащееся на г ткани злокачественной опухоли, составляет порядка 10⁸. С учетом этого сравнения, можно понять, насколько ценными являются положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники в ткани пульпозного ядра. Первый способ культивирования обеспечивает очень большие преимущества, поскольку можно предотвращать уменьшение количества таких положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников из-за операции отделения и выделения популяции клеток из ткани пульпозного ядра, и это является предпочтительным для размножения культуры положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников.

[0027]

Второй способ культивирования

«Второй способ культивирования» для популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению, представляет собой способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один вид усилителя экспрессии Tie2, отличного от факторов роста.

[0028]

Известно, что в положительных по Tie2 стволовых клетках/-предшественниках, ангиопоэтин-1 (Ang-1), лиганд, присущий Tie2 (рецепторной тирозинкиназе), связывается для стимуляции активации (фосфорилирования) Tie2. Способ культивирования положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в содержащей Ang-1 культуральной среде (т.е. способ увеличения экспрессии Tie2) является известной общепринятой технологией (например, в литературных источниках предшествующего уровня техники). Подобным образом, FGF2 (bFGF) также является известным в качестве фактора роста, имеющего действие увеличения экспрессии Tie2, и способ культивирования положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в содержащей FGF2 культуральной среде также является известным.

[0029]

Однако, авторы настоящего изобретения использовали усилитель экспрессии Tie2, вид которого отличается от факторов роста, таких как Ang-1 и FGF2, например, усилитель экспрессии Tie2, представляющий собой растительный экстракт, такой как экстракт порошка корицы, для культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, происходящей из ткани пульпозного ядра, который не был опубликован до настоящего времени. В частности, усилитель экспрессии Tie2, представляющий собой растительный экстракт, использовали в комбинации с фактором(факторами) роста, такими как FGF2. В этом случае, обнаружено, что присутствует примечательный эффект, такой как увеличение соотношения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра) в популяции клеток, полученных посредством культивирования.

[0030]

Авторы настоящего изобретения кроме того, обнаружили, что популяцию клеток, имеющую большое количество клеток или соотношение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра) можно получать синергически из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники (стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра) в ткани пульпозного ядра посредством комбинирования (в частности, объединения) вышеописанных «первого способа культивирования» и «второго способа культивирования».

[0031]

Третий способ культивирования

В то же время «третий способ культивирования» для популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению, представляет собой способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с использованием культурального оборудования с культуральной поверхностью, подвергнутой обработке для увеличения прикрепления клеток.

[0032]

Общепринятым образом, подобно многим другим стволовым/клеткам-предшественникам, популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 клетки (стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра), происходящие из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, также культивировали таким образом, чтобы формировать плавучие сферические колонии «в условиях, мешающих прикреплению клеток», как описано в Патентном документе 1 выше, то есть с использованием культурального оборудования с низким уровнем адгезии или с использованием культуральной среды с метилцеллюлозой. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, предпочтительно, популяцию клеток, содержащую стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, в которых экспрессия Tie2 усилена посредством первого способа культивирования и/или второго способа культивирования, как описано выше, можно культивировать посредством прикрепления к их культуральной поверхности без формирования сферических колоний стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра в двумерном культуральном окружении (без использования, например, метилцеллюлозы), с использованием «культурального оборудования с культуральной поверхностью, подвергнутой обработке для увеличения прикрепления клеток (обработке для прикрепления клеток)», например, культурального оборудования, покрытого покрывающим средством, содержащим полилизин, а не «в условиях, мешающих прикреплению клеток».

[0033]

Такой третий способ культивирования можно осуществлять в ступени на стадии культивирования для дифференцировки, для увеличения эффективности дифференцировки из стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра в функциональные клетки пульпозного ядра (например, положительные по Col2 клетки) более, чем в случае использования культурального оборудования без обработки культуральной поверхности (или, вместо этого, культурального оборудования, подвергнутого обработке для ингибирования прикрепления клеток (обработке для снижения адгезии). Это делает возможным получение популяции клеток, имеющей увеличенное количество или соотношение положительных по Col2 клеток в популяции клеток.

[0034]

Следует отметить, что третий способ культивирования также можно осуществлять в ступени культивирования на стадии культивирования для размножения, в качестве способа, объединенного с вторым способом культивирования, описанным выше. То есть, когда положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники культивируют с использованием культурального оборудования, подвергнутого обработке для прикрепления клеток, в культуральной среде, содержащей активатор Tie2, положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники можно эффективно размножать в подобном двумерной культуре окружении (без использования, например, метилцеллюлозы).

[0035]

Четвертый способ культивирования

«Четвертый способ культивирования» для популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению, представляет собой способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с супрессией в то же время формирования сферических колоний, в культуральной среде, содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса.

[0036]

Общепринятым образом, как описано выше применительно к первому способу культивирования, вещество, имеющее действие деградации внеклеточного матрикса (например, коллагена, протеогликана), такое как коллагеназа или другая протеаза, обычно использовали для выделения клеток из собранной ткани, или временно использовали в способе культивирования, в котором сферические колонии, сформированные стволовыми клетками/-предшественниками, подвергают диссоциации один раз, культуральную среду меняют, и сферические колонии формируются снова.

[0037]

Однако, авторы настоящего изобретения обнаружили, что вещество, имеющее действие деградации внеклеточного матрикса (средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса), такое как коллагеназа, можно использовать для полностью отличных целей (для применений). То есть авторы настоящего изобретения обнаружили, что, в случае положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, таких как стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, способные к дифференцировке в клетки пульпозного ядра (более предпочтительно, клетки, в которых экспрессия Tie2 усилена посредством первого способа культивирования и/или второго способа культивирования), клетки, неожиданно, можно культивировать даже в культуральной среде, содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса, то есть в ситуации, когда сферические колонии, в которых положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники связаны друг с другом посредством внеклеточного матрикса, не могут быть сформированы, и кроме того, клетки во время пролиферации могут подвергаться дифференцировке в клетки, положительные по экспрессии молекул внеклеточного матрикса, таких как коллаген типа II и протеогликан.

[0038]

Авторы настоящего изобретения кроме того, обнаружили, что вышеописанные «третий способ культивирования» и «четвертый способ культивирования» можно комбинировать, предпочтительно, объединять, в то время как тип и концентрацию средства, осуществляющего деградацию внеклеточного матрикса, в культуральной среде и вид покрывающего средства на поверхности культурального оборудования соответствующим образом комбинируют для синергизма и заметного увеличения эффективности дифференцировки из стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра в функциональные клетки пульпозного ядра, например, положительные по коллагену типа II (Col2) клетки, таким образом, возможности получения популяции клеток, имеющей значительно более высокое количество или соотношение положительных по Col2 клеток, чем в общепринятом способе.

[0039]

Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что третий способ культивирования и/или четвертый способ культивирования можно использовать для получения, на стадии, где количество или соотношение, например, положительных по Col2 клеток достигает конкретного уровня, популяции клеток, имеющих конкретный уровень их количества или соотношения, в то время как положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники не полностью исчезают. Такая популяция клеток содержит конкретный уровень количества или соотношения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, и, таким образом, является полезной, поскольку терапевтические эффекты на пульпозное ядро межпозвоночного диска, когда популяцию клеток вводят, например, являются лучшими.

[0040]

На основании каждого способа культивирования, описанного выше, авторы настоящего изобретения разработали способ получения из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники (например, стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра), популяции клеток, содержащей целевые клетки (например, положительные по Col2 клетки пульпозного ядра), полученные в результате дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников. Этот способ получения популяции клеток включает по меньшей мере одну и предпочтительно, обе из стадии культивирования (стадии культивирования для размножения) для размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток посредством размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников с усилением в то же время экспрессии Tie2, и/или стадии культивирования (стадии культивирования для дифференцировки) для индукции дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в целевые клетки. Стадия культивирования для размножения включает стадию осуществления по меньшей мере одного, и предпочтительно, обоих из первого способа культивирования и/или второго способа культивирования (эти способы можно объединять). Стадия культивирования для дифференцировки включает стадию осуществления по меньшей мере одного, и предпочтительно, обоих из третьего способа культивирования и/или четвертого способа культивирования (эти способы можно объединять). Способ получения популяции клеток, включающий стадию культивирования для размножения, включая стадию осуществления как первого способа культивирования, так и второго способа культивирования (предпочтительно, в качестве объединенного способа), и стадию культивирования для дифференцировки, включая стадию осуществления как третьего способа культивирования, так и четвертого способа культивирования (предпочтительно, в качестве объединенного способа), представляет собой отличный вариант осуществления изобретения. Этот способ можно использовать для получения популяции клеток, имеющей значительно более высокое количество или соотношение целевых клеток, имеющих данную функциональность, чем в общеизвестном способе получения. В общепринятом способе получения, общее количество клеток в популяции клеток или количество клеток пульпозного ядра удовлетворяет конкретному уровню. Однако присутствует не так много функциональных клеток пульпозного ядра, например, положительных по экспрессии Col2, среди них. В другом способе, хотя соотношение положительных по Col2 клеток в популяции клеток и уровень экспрессии в индивидуальных клетках удовлетворяют конкретному уровню, абсолютное количество положительных по Col2 клеток является недостаточным (т.е., количество положительных по Col2 клеток, размноженных из ткани пульпозного ядра, которые можно собрать от одного донора, является ограниченным) в этой ситуации. Как описано выше, было сложно достигать как количества положительных по Col2 клеток, так и уровня экспрессии (интенсивности экспрессии) в популяции клеток, включенных в пульпозное ядро. Однако можно сказать, что способ получения по изобретению является инновационным способом получения, который не был предложен до настоящего времени и в котором как количество, так и уровень были успешно достигнуты.

[0041]

С другой стороны, чтобы получить преимущество того свойства, что (положительные по Tie2) стволовые клетки/-предшественники имеют потенциал независимого от заякоривания роста и являются способными формировать сферические колонии, или чтобы избежать потери любой желательной функциональности посредством культивирования клеток, дифференцированных из стволовых клеток/-предшественников, на культуральной поверхности (каркасе), общепринятым является способ, в котором, в то время как популяцию клеток, содержащихся в собранной ткани, культивируют в культуральной среде с метилцеллюлозой или на культуральной поверхности с низким уровнем адгезии, стволовые клетки/-предшественники подвергаются дифференцировке в целевые клетки имеющие данную функциональность. Можно сказать, что авторы настоящего изобретения обнаружили, посредством каждого из вышеописанных способов культивирования (в частности, третьего способа культивирования и четвертого способа культивирования), инновационный способ, способный значительно улучшать эффективность пролиферации (положительных по Tie2) стволовых клеток/-предшественников и дифференцировки из стволовых клеток/-предшественников в целевые клетки, имеющие данную функциональность, без использования метилцеллюлозы, которая делает выделение клеток сложным из-за высокой вязкости, и в окружении, позволяющим клеткам осуществлять адгезию к культуральной поверхности, так чтобы выделять полученную популяцию клеток из культуральной среды легко и без отходов.

[0042]

В связи со способами культивирования и способами получения, описанными выше, в частности, в связи с первым способом культивирования и ступенью культивирования для размножения, авторы настоящего изобретения обнаружили предпочтительный способ сохранения популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, который можно использовать для поддержания состояния, в котором Tie2 является активированным и/или экспрессированным, или для супрессии уменьшения количества положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток, посредством криоконсервирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, во время присутствия в нерасщепленной ткани. Общепринятым образом, популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, включенную в собранную ткань пульпозного ядра диска, выделяют из ткани посредством обработки для расщепления с использованием, например, коллагеназы, где обработка занимает относительно долгое время, и только популяцию клеток затем подвергают криоконсервированию. Однако немедленное криоконсервирование собранной ткани пульпозного ядра диска делает возможным улучшать применимость в ходе производственного процесса и поддержание популяции клеток с сохранением в то же время благоприятной ниши в ткани (в частности, собранной от молодого донора). После размораживания криоконсервированной ткани, размороженную ткань можно помещать в культуральную среду для культивирования популяции клеток посредством первого способа культивирования, описанного выше, таким образом, обеспечивая возможность эффективного размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников.

[0043]

Если вышеописанную техническую идею осуществляют в комбинации с (предпочтительным) вариантом(вариантами) осуществления, подробно описанными позднее, изобретение можно выражать, например, как изобретение, включающее по меньшей мере следующие пункты.

[0044]

[1]

Способ культивирования популяции клеток, содержащей стволовые клетки и/или клетки-предшественники, положительные по экспрессии Tie2 (тирозинкиназы с доменами, гомологичными Ig и EGF 2) (далее в настоящем описании обозначенные как «положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники»), включающий:

культивирование популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники во время присутствия в нерасщепленной ткани (далее в настоящем описании, способ обозначен как «первый способ культивирования»).

[2]

Первый способ культивирования по пункту 1, где положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники представляют собой положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, происходящие из ткани пульпозного ядра (пульпозного ядра) межпозвоночного диска.

[3]

Первый способ культивирования по пункту 1 или 2, где нерасщепленная ткань представляет собой ткань пульпозного ядра межпозвоночного диска.

[4]

Первый способ культивирования по любому из пунктов 1-3, где нерасщепленная ткань представляет собой ткань, полученную посредством размораживания криоконсервированной ткани.

[5]

Первый способ культивирования по любому из пунктов 1-4, который осуществляют с размножением в то же время положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток.

[0045]

[6]

Способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, включающий:

культивирование популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один вид усилителя экспрессии Tie2, отличного от факторов роста (далее в настоящем описании, способ обозначен как «второй способ культивирования»).

[7]

Второй способ культивирования по пункту 6, где усилитель экспрессии Tie2, отличный от факторов роста, представляет собой животный/растительный экстракт.

[8]

Второй способ культивирования по пункту 7, где растение представляет собой растение рода Cinnamomum.

[9]

Второй способ культивирования по любому из пунктов 6-8, который осуществляют с размножением в то же время положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток.

[0046]

[10]

культивирование популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с использованием культурального оборудования с культуральной поверхностью, подвергнутой обработке для увеличения прикрепления клеток (далее в настоящем описании, способ обозначен как «третий способ культивирования»).

[11]

Третий способ культивирования по пункту 10, где положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники подвергнуты обработке для увеличения экспрессии Tie2.

[12]

Третий способ культивирования по пункту 10 или 11, где обработка для увеличения прикрепления клеток представляет собой обработку нанесения покрывающего средства, содержащего внеклеточный матрикс и/или полиаминокислоту.

[13]

Третий способ культивирования по любому из пунктов 10-12, который осуществляют с подверганием в то же время положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток дифференцировке в целевые клетки.

[14]

Третий способ культивирования по пункту 12 или 13, где внеклеточный матрикс и/или полиаминокислота представляет собой по меньшей мере один вид, выбранный из группы, состоящей из коллагена типа IV, фибронектина и полилизина.

[15]

Третий способ культивирования по любому из пунктов 10-14, который осуществляют с размножением в то же время положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток.

[16]

Третий способ культивирования по любому из пунктов 12-15, где внеклеточный матрикс представляет собой желатин.

[0047]

[17]

культивирование популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с супрессией в то же время формирования сферических колоний, в культуральной среде, содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса (далее в настоящем описании, способ обозначен как «четвертый способ культивирования»).

[18]

Четвертый способ культивирования по пункту 17, где положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники подвергнуты обработке для увеличения экспрессии Tie2.

[19]

Четвертый способ культивирования по пункту 17 или 18, где средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса, содержит по меньшей мере протеазу, имеющую активность для деградации коллагена типа II.

[20]

Четвертый способ культивирования по любому из пунктов 17-19, который осуществляют с подверганием в то же время положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток дифференцировке в целевые клетки.

[0048]

[21]

Способ получения популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, включающий:

стадию культивирования (далее в настоящем описании, обозначенную как «стадия культивирования для размножения»), включающую ступень осуществления первого способа культивирования по пункту 5 и/или второго способа культивирования по пункту 9 для увеличения экспрессии Tie2 в положительных по Tie2 стволовых/клетках-предшественниках и размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток.

[22]

Способ получения по пункту 21, где ступень, осуществляемая на стадии культивирования для размножения, представляет собой ступень одновременного осуществления первого способа культивирования и второго способа культивирования.

[23]

Способ получения по пункту 21 или 22, где стадия культивирования для размножения дополнительно включает ступень культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей, в качестве усилителя экспрессии Tie2, только фактор роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2.

[0049]

[24]

Способ получения из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, популяции клеток, содержащей целевые клетки, полученные в результате дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, включающий:

стадию культивирования (далее в настоящем описании обозначенную как «стадия культивирования для дифференцировки»), включающую ступень осуществления третьего способа культивирования по пункту 13 или 14 и/или четвертого способа культивирования по пункту 20 для индукции дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в целевые клетки.

[25]

Способ получения по пункту 24, где ступень, осуществляемая на стадии культивирования для дифференцировки, представляет собой ступень одновременного осуществления третьего способа культивирования и четвертого способа культивирования.

[26]

Способ получения по пункту 24 или 25, где целевые клетки представляют собой клетки, экспрессирующие по меньшей мере коллаген типа II.

[27]

Способ получения по пункту 26, где клетки, экспрессирующие по меньшей мере коллаген типа II, представляют собой клетки пульпозного ядра.

[28]

Способ получения по любому из пунктов 24-27, где популяцию клеток, в которой остаются положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, получают посредством стадии культивирования для дифференцировки.

[29]

стадию культивирования для размножения по любому из пунктов 21-23; и

стадию культивирования для дифференцировки по любому из пунктов 24-28.

[0050]

[30]

Популяция клеток, полученная способом культивирования по любому из пунктов 1-20.

[31]

Культура, содержащая культуральную среду в способе культивирования по любому из пунктов 1-20 и популяцию клеток, предназначенную для подвергания способу культивирования, культивируемая или получаемая.

[32]

Популяция клеток, полученная посредством стадии культивирования для размножения и/или стадии культивирования для дифференцировки в способе получения по любому из пунктов 21-29.

[33]

Культура, содержащая культуральную среду для стадии культивирования для размножения или культуральную среду для стадии культивирования для дифференцировки и популяцию клеток, предназначенную для подвергания стадии культивирования для размножения или стадии культивирования для дифференцировки, соответственно, культивируемая или получаемая в способе получения по любому из пунктов 21-29.

[0051]

[34]

Композиция для клеточной терапии, содержащая популяцию клеток по пункту 30 или 32.

[35]

Композиция для клеточной терапии по пункту 34 для применения в лечении или предотвращении заболевания, имеющего нарушение, дегенерацию или грыжу межпозвоночного диска в качестве симптома проявления.

[0052]

[36]

Способ консервирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, включающий:

криоконсервирование популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники во время присутствия в нерасщепленной ткани, для поддержания состояния, в котором Tie2 является активированным и/или экспрессированным, или для супрессии уменьшения количества положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток.

[Преимушества изобретения]

[0053]

Богатую целевыми клетками популяцию клеток можно получать способами культивирования положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников по изобретению, предпочтительно, способом культивирования, включающим ступень культивирования для размножения, в основном имеющую целью размножение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, и ступень культивирования для дифференцировки, в основном имеющую целью индукцию дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в зрелые клетки, имеющие данный фенотип. Такую популяцию клеток, полученную на основании способа(способов) культивирования по настоящему изобретению, можно использовать для эффективного получения препарата клеток, эффективного для лечения или предотвращения предопределенного заболевания.

[0054]

Кроме того, по изобретению, не является необходимым добавление, в культуральную среду, высоко вязкого компонента, такого как метилцеллюлоза, использованного на предшествующем уровне техники, описанном, например, в Патентных документах 1 и 2. Это делает возможным выделение, из культуральной среды, без отходов, популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники или целевые клетки, полученные из них в результате дифференцировки.

[0055]

В соответствии с репрезентативным вариантом осуществления изобретения, межпозвоночный диск (пульпозное ядро), которые можно собирать только в небольшом количестве от пациента с позвоночной грыжей посредством хирургического вмешательства, используют для эффективных размножения и дифференцировки положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (например, стволовых клеток пульпозного ядра), содержащихся в них. Соответственно, подходящую популяцию клеток, которая должна оказывать высокий терапевтический эффект после имплантации, то есть, популяцию клеток, богатую функциональными клетками пульпозного ядра, имеющими увеличенную продукцию внеклеточного матрикса, такого как коллаген типа II (и некоторыми остальными положительными по Tie2 стволовыми клетками/-предшественниками), можно легко, эффективно и воспроизводимо получать в больших количествах. Общепринятым образом, было невозможно или сложно получать такую подходящую популяцию клеток. Поскольку изобретение делает это возможным, регенерационная терапия межпозвоночного диска посредством введения (препарата клеток, содержащего) такой популяции клеток очень сильно облегчается, и перевод в промышленное производство становится реалистичным.

[0056]

Выдвинута гипотеза, что причины, почему эффекты четвертого способа культивирования по изобретению проявляются, присутствуют благодаря тому, что принцип, показанный, например, на фиг. 1, работает. Однако эта гипотеза предназначена для облегчения понимания изобретения, и изобретение не обязательно связано с ней. Даже если впоследствии будет обнаружено, что некоторые или все из эффектов изобретения проявляются на основании принципа и/или механизма действия, отличного от проиллюстрированных на фиг. 1, эффекты изобретения, которые можно фактически обнаружить, и элементы изобретения, вследствие этого, не следует определять посредством следующего описания, основанного на фиг. 1.

[0057]

На фиг. 1[A] показано, как выглядят культивируемые клетки, когда популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники (например, стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра), подвергают размножению и дифференцировке посредством двумерной культуры (монослойной статической культуры). Культуральную поверхность культурального оборудования (например, флакона) можно подвергать обработке поверхности для обеспечения прикрепления клеток, например, нанесению покрывающего средства, содержащего внеклеточный матрикс (ECM), заранее. Стволовые клетки/-предшественники проявляют адгезию к культуральной поверхности культурального оборудования и подвергаются дифференцировке во время распределения и роста на культуральной поверхности. В такой двумерной культуре, внутриклеточная передача сигналов, которая в конечном счете останавливает продукцию и секрецию ECM, возникает благодаря взаимодействию между ECM, нанесенным на культуральную поверхность или секретированным из культивируемых клеток, и связывающим белком(белками) (например, интегрином), экспрессированным на поверхности культивируемых клеток. Например, в случае двумерного культивирования происходящей из пульпозного ядра популяции клеток, ECM, такой как коллаген типа II и протеогликан, активно секретируется из зрелых клеток пульпозного ядра, исходно содержащихся в популяции клеток, и зрелых клеток пульпозного ядра, полученных, когда стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, содержащееся в популяции клеток, подвергаются дифференцировке во время пролиферации. Однако по мере прохождения периода культивирования продукция и секреция, например, коллагена типа II, в конечном счете останавливается посредством внутриклеточной передачи сигналов, как описано выше (вместо этого, продукция и секреция коллагена типа I увеличивается). Затем, происходит дедифференцировка зрелых клеток пульпозного ядра до проявления, например, подобного фибробластам фенотипа. Таким образом, в типичной двумерной культуре, считают сложным достигать как увеличения количества клеток в популяции клеток, так и увеличения доли клеток, имеющих специфический фенотип (клеток, не дедифференцированных). Следует отметить, что в третьем способе культивирования по изобретению, предпочтительно, использование положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, имеющих увеличенную экспрессию Tie2, делает возможным относительно простое получение популяции клеток, содержащей конкретную долю клеток пульпозного ядра, экспрессирующих, например, коллаген типа II, даже в двумерной культуре.

[0058]

На фиг. 1[B] и [C] показано, как выглядят культивируемые клетки, когда популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники (например, стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра), подвергают размножению и дифференцировке посредством культивирования с использованием содержащей метилцеллюлозу культуральной среды (свободной от средства, осуществляющего деградацию внеклеточного матрикса (ECM)), или культурального оборудования с низким уровнем адсорбции. В отличие от двумерной культуры из фиг. 1[A], в культуре, как показано на фиг. 1[B], взаимодействие между ECM, например, на культуральной поверхности культурального оборудования, и культивируемыми клетками не возникает, и внутриклеточная передача сигналов, которая останавливает продукцию и секрецию ECM из-за этого взаимодействия, также не возникает. Таким образом, на ранней стадии культивирования, положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники подвергаются пролиферации во время продукции и секреции ECM, и в конечном счете, формируют сферические колонии. Однако в сформированных сферических колониях положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники или клетки, полученные из них в результате дифференцировки (например, клетки пульпозного ядра), вступают в контакт друг с другом посредством секретированного ECM. Соответственно, как показано на фиг. 1[C], взаимодействие между ECM и культивируемыми клетками возникает по мере прохождения периода культивирования, и стоп-сигнал продукции ECM возникает из-за взаимодействия, и индуцируется дедифференцировка, сходная с дедифференцировкой на фиг. 1[A]. Таким образом, в способе культивирования, как показано на фиг. 1[B] и [C], сложно увеличивать процент клеток, положительных по экспрессии данного ECM (например, коллагена типа II), до конкретного уровня или более в популяции клеток, выделяемых в форме сферических колоний.

[0059]

На фиг. 1[D] показано, как выглядят культивируемые положительные по Tie2 клетки, когда популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, подвергают размножению и дифференцировке посредством культивирования с использованием культуральной среды (свободной, например, от метилцеллюлоза), содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса (ECM), в соответствии с четвертым способом культивирования по изобретению. Даже в таком способе культивирования, подобно фиг. 1[B], ECM секретируется из стволовых клеток/-предшественников или клеток, полученных из них в результате дифференцировки. Однако ECM секретированный внеклеточно, постоянно деградирует под действием средства, осуществляющего деградацию ECM, добавленного в культуральную среду. Из-за этого ни сферические колонии не формируются, ни клетки не прикрепляются к культуральной поверхности, даже без использования культурального оборудования с низким уровнем адсорбции. Кроме того, в третьем-четвертом способе культивирования по изобретению, подобно двумерной культуре из фиг. 1[A], прикрепление клеток к культуральной поверхности остается слабым, даже если покрывающее средство, содержащее ECM, наносят заранее на культуральную поверхность культурального оборудования. Таким образом, стоп-сигнал продукции ECM, вызываемый взаимодействием между ECM и культивируемыми клетками, супрессируется, и дедифференцировка, как на фиг. 1[A] или фиг. 1[B] и [C], возникает с меньшей вероятностью. Это делает возможным получение популяции клеток, в которой процент клеток, положительных по экспрессии предопределенной молекулы ECM (например, коллагена типа II), увеличивается более, чем в общепринятой технологии.

[0060]

Следует отметить, что ECM, секретированный внеклеточно, деградирует под действием средства, осуществляющего деградацию ECM в культуральной среде, но внутриклеточный ECM не деградирует и прогрессивно накапливается. В настоящем описании, четвертый способ культивирования по изобретению можно осуществлять в ступени на стадии культивирования для дифференцировки, и полученную популяцию клеток можно затем выделять из культуральной среды для получения препарата клеток. В этом случае, внутриклеточно накопленный ECM быстро секретируется внеклеточно в ткани, в которые введен препарат клеток. Это делает возможным создание окружения, подходящего для выживания популяции клеток. Таким образом, последующую продукцию ECM и секрецию из введенных клеток (т.е. терапевтические эффекты, проявляемые препаратом клеток), должно быть возможно стимулировать.

[Краткое описание фигур]

[0061]

Фиг. 1 представляет собой диаграммы, схематически иллюстрирующие продукцию и деградацию ECM, и взаимодействие между культивированными клетками в каждой из обычной двумерной культуры (монослойной статической культуры), суспензионной культуры с использованием общепринятой культуральной среды, свободной от деградирующего внеклеточный матрикс (ECM) средства, или суспензионной культуры с использованием культуральной среды, содержащей средство, осуществляющее деградацию ECM, в соответствии с четвертым способом культивирования по изобретению, и фотографии соответствующих культивированных клеток. A (Обычная двумерная культура): когда клетки пульпозного ядра (пульпозное ядро) поддаются адгезии посредством молекула (молекулы) адгезии к культуральной поверхности культурального флакона, передается стоп-сигнал продукции ECM. B (Суспензионная культура с использованием, например, флакона с низким уровнем адсорбции, культуральной среды с метилцеллюлозой): из-за отсутствия контакта с культуральной поверхностью флакона, стоп-сигнал продукции ECM не передается (отметка × и пунктирная стрелка). C (Культуральная среда без фермента): собственный продуцированный ECM оказывает действие, эквивалентное действию культуральной поверхности (стрелки), и стоп-сигнал продукции ECM передается в клетки. D (Культуральная среда с ферментом): собственный продуцированный ECM деградирует, и стоп-сигнал продукции ECM не передается в клетки (отметка × и пунктирная стрелка), однако, происходит накопление ECM в клетках.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по Tie2 в Тестовом примере 1 (стадия культивирования для размножения: первая ступень культивирования).

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий результаты средней интенсивности флуоресценции (MFI) Tie2 в Тестовом примере 1 (стадия культивирования для размножения: первая ступень культивирования).

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по Tie2 в Тестовом примере 2 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень).

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результаты количества положительных по Tie2 клеток, полученных на г ткани пульпозного ядра в Тестовом примере 2 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень).

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по коллагену типа II (Col2) в Тестовом примере 3 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования).

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий результаты количества положительных по коллагену типа II (Col2) клеток, полученных на г ткани пульпозного ядра в Тестовом примере 3 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования).

Фиг. 8 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по протеогликану (PG) в Тестовом примере 4 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования).

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по коллагену типа II (Col2) в Тестовом примере 4 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования).

Фиг. 10 представляет собой графики, показывающие результаты частоты положительных по протеогликанам (PG) или коллагену II (Col2) в Тестовом примере 5 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования; часть 2). GEL: желатин, Col1: коллаген типа I, Col4: коллаген типа IV, FN: фибронектин, PLL: поли-L-лизин (то же самое применимо к Фиг. 11).

Фиг. 11 представляет собой графики, показывающие результаты частоты положительных по протеогликанам (PG) или коллагену II (Col2) в Тестовом примере 6 (стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования; часть 3).

Фиг. 12 представляет собой оптическую микрофотографию популяции клеток в Тестовом примере 5-12.

Фиг. 13 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по Tie2 в Тестовом примере 7 (стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования).

Фиг. 14 представляет собой график, показывающий результаты общего количества положительных по Tie2 клеток в Тестовом примере 7 (стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования).

Фиг. 15 представляет собой график, показывающий результаты частоты положительных по Col2 в Тестовом примере 7 (стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования).

[Способы осуществления изобретения]

[0062]

-Термины-

Термин «стволовая клетка (клетки)» относится к клетке(клеткам), имеющим способность к самообновлению и потенциал к дифференцировке (т.е. тотипотентным, плюрипотентным, мультипотентым или унипотентным клеткам). Термин «клетка (клетки)-предшественник» относится к клетке(клеткам) без способности к самообновлению в строгом смысле, поскольку все клетки в конечном счете становятся терминально дифференцированными клетками, но с некоторым потенциалом к дифференцировке для дифференцировки в предопределенную клетку(клетки), в то же время с относительно активной пролиферацией. (Идентифицированные) клетки, в общем понимаемые и называемые специалистом в данной области как «стволовые клетки» или «клетки-предшественники», в настоящем описании соответствуют «стволовым клеткам» или «клеткам-предшественникам».

[0063]

В рамках изобретения, фраза «стволовые клетки и/или клетки-предшественники» включает стволовые клетки, клетки-предшественники или и те, и другие, и иногда обозначена как «стволовые клетки/-предшественники». Кроме того, в рамках изобретения, популяция клеток, содержащая стволовые клетки и/или клетки-предшественники, может быть обозначена как «популяция стволовых клеток/-предшественников», и популяция клеток, содержащая зрелые клетки, дифференцированные из стволовых клеток и/или клеток-предшественников (т.е. терминально дифференцированные клетки), может быть обозначена как «популяция зрелых клеток».

[0064]

Как правило, «стволовые клетки» и «клетки-предшественники» можно отличать от других клеток посредством того, является ли экспрессия одного или двух, или более видов специфических генов (маркерных генов или клеточных маркеров) положительной или отрицательной. То есть «стволовые клетки», имеющие способность к самообновлению и/или потенциал к дифференцировке, как описано выше, или «клетки-предшественники», могут быть также определены как термины, которые относятся к клеткам, в которых экспрессия специфического маркерного гена является положительной или отрицательной, соответственно.

[0065]

Является ли экспрессия маркерного гена (клеточного маркера) «положительной» или «отрицательной», можно определять посредством количественного или качественного измерения уровня экспрессии мРНК, транскрибированной с гена (генома), или белка, транслированного с мРНК, в соответствии с общепринятым способом. Если уровень экспрессии составляет конкретный уровень или выше (или выше, чем конкретный уровень), экспрессию можно определять как являющуюся положительной, и если уровень экспрессии составляет конкретный уровень или ниже (или ниже, чем конкретный уровень), экспрессию можно определять как являющуюся отрицательной. Уровень экспрессии белка можно измерять количественно или качественно посредством иммунологического анализа (например, проточной цитометрии, иммунноокрашивания или ELISA), с использованием, например, антитела или метящего средства, специфического для белка. Следует отметить, что белок Tie2 представляет собой белок, экспрессированный на клеточной поверхности, и Col2 представляет собой белок, экспрессированный внутри клетки. Соответствующие способы (например, иммунофлуоресцентное окрашивание) можно использовать для детекции белков, присутствующих на клеточной поверхности или внутри клетки, соответственно. Уровень экспрессии мРНК можно измерять количественно или качественно, например, посредством анализа (например, с использованием RT-ПЦР, микромассива или биочипа) с использованием нуклеиновой кислоты и метящего средства или способа (средств) амплификации нуклеиновой кислоты, специфической (комплементарной) для мРНК. Процент (частоту положительных или частоту отрицательных) клеток, положительных или отрицательных по экспрессии данного маркерного гена (клеточного маркера), в популяции клеток можно рассчитывать посредством подсчета количества всех клеток в популяции клеток и количества клеток, определенных как являющиеся положительными или отрицательными, посредством вышеописанных способов, соответственно, с использованием в то же время вышеуказанных различных способов, таких как проточная цитометрия.

[0066]

В рамках изобретения, фраза «стволовые клетки и/или клетки-предшественники, положительные по экспрессии Tie2», то есть, «положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники», относится к клеткам, характерным для стволовых клеток и/или клеток-предшественников, для которых экспрессия Tie2 (тирозинкиназы с доменами, гомологичными Ig и EGF 2) известна в качестве одного из клеточных маркеров, например, его экспрессию в качестве белка, измеренную посредством проточной цитометрии, определяют как являющуюся положительной. Репрезентативные положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению представляют собой положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, «происходящие из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска», то есть, положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, присутствующие в пульпозном ядре межпозвоночного диска (собранные из пульпозного ядра), или положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники полученные посредством субкультивирования положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, и представляют собой клетки, соответствующие «стволовым клеткам/-предшественникам пульпозного ядра», описанным ниже.

[0067]

В рамках изобретения, термин «целевые клетки» относится к клеткам, полученным из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников посредством индукции дифференцировки данным способом и имеющим функциональность в соответствии с их применением, более конкретно, клеткам, в которых экспрессию данного гена (клеточного маркера) определяют как являющуюся положительной или отрицательной по экспрессии в форме белка, например, посредством проточной цитометрии. Типичные целевые клетки по изобретению находятся среди «клеток пульпозного ядра», описанных ниже, и положительных по экспрессии генов внеклеточного матрикса (ECM), таких как Col2 и аггрекан.

[0068]

«Клетки пульпозного ядра» по изобретению относятся к зрелым и терминально дифференцированным клеткам, которые насчитывают большинство клеток в популяции в межпозвоночном диске (пульпозном ядре), или культивированным клеткам, имеющим эквивалентный фенотип. Конкретно, клетки пульпозного ядра можно определять как клетки, отрицательные по Tie2 и GD2 в качестве маркерных генов (кроме того, обычно положительные по CD 24), и положительные по меньшей мере по коллагену типа II среди белков внеклеточного матрикса (кроме того, обычно также положительные по протеогликану (аггрекану)). Например, клетки, определенные как являющиеся отрицательными по Tie2 и GD2 (и положительными по CD 24), и положительными по коллагену типа II (и также положительными по аггрекану) в качестве белков (клеточных маркеров) посредством проточной цитометрии, соответствуют клеткам пульпозного ядра по изобретению. Для молекул внеклеточного матрикса, таких как коллаген типа II и аггрекан, количество каждого продуцированного белка можно измерять посредством проточной цитометрии, и уровень экспрессии каждой мРНК можно измерять, например, посредством ПЦР с детекцией в реальном времени.

[0069]

В рамках изобретения, термин «стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра» в совокупности относится к клеткам-предшественникам (клеткам-предшественникам пульпозного ядра), имеющим по меньшей мере потенциал к дифференцировке в клетки пульпозного ядра, и к стволовым клеткам (стволовым клеткам пульпозного ядра), имеющим способность к самообновлению и потенциал к дифференцировке в клетки-предшественники, или культивированным клеткам, имеющим эквивалентный фенотип, где клетки насчитывают часть популяции клеток в ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска. Стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра можно специфически определять как клетки, являющиеся положительными по Tie2 и/или GD2 в качестве маркерных генов. Например, клетки, определенные как являющиеся положительными по Tie2 и отрицательными по GD2, положительными по Tie2 и положительными по GD2, или отрицательными по Tie2 и положительными по GD2 в качестве белков (клеточных маркеров), посредством проточной цитометрии, соответствуют стволовым/клеткам-предшественникам пульпозного ядра по изобретению.

[0070]

Следует отметить, что, в Патентном документе 2, описанном выше, клетки, положительные по Tie2, классифицируют на «стволовые клетки диска пульпозного ядра» (среди них, клетки отрицательные по GD2, находятся в спящем состоянии, и клетки, положительные по GD2, находятся в активном состоянии); клетки, отрицательные по Tie2 и положительные по GD2 классифицируют на «клетки-предшественники диска»; и клетки, отрицательные по Tie2 и отрицательные по GD2, классифицируют на «терминально дифференцированные зрелые клетки пульпозного ядра диска», на основании состояний экспрессии Tie2 и GD2 в качестве клеточных маркеров происходящих из пульпозного ядра клеток (абзацы [0024], [0025] и [0032]). Кроме того, в Патентном документе 2, клетки, по мере появления в иерархии дифференцировки клеток пульпозного ядра, сгруппированы в: (i) клетки, которые являются Tie2⁺ и GD2^- (кроме того, CD24^-, CD44^+/-, CD271⁺, Flt1⁺); (ii) клетки, которые являются Tie2⁺ и GD2⁺ (кроме того, CD24^-, CD44⁺, CD271⁺, Flt1⁺); (iii) клетки, которые являются Tie2^- и GD2⁺ (кроме того, CD24^-, CD44⁺, CD271^+/-, Flt1^+/-); (iv) клетки, которые являются Tie2^- и GD2⁺ (кроме того, CD24⁺, CD44⁺, CD271^-, Flt1^-); или (v) клетки, которые являются Tie2^- и GD2^- (кроме того, CD24⁺, CD44⁺, CD271^-, Flt1^-). Вышеуказанные группы (i) - (iii) названы как «стволовые клетки/-предшественники диска пульпозного ядра», и вышеуказанные группы (iii) - (v) названы как «включенные в пульпозное ядро клетки» (см. фиг. 7-2). Хотя терминология является различной, «стволовые клетки диска пульпозного ядра» и «клетки-предшественники диска пульпозного ядра» из Патентного документа 2, то есть, клетки из вышеуказанных групп (i) - (iv) соответствуют «стволовым/клеткам-предшественникам пульпозного ядра» по изобретению; и «терминально дифференцированные зрелые клетки пульпозного ядра диска» из Патентного документа 2, то есть, клетки из вышеуказанной группы (v), соответствуют «зрелым клеткам пульпозного ядра» по изобретению. По необходимости, клетки по изобретению можно заменять клетками, в соответствии с определением, описанным в Патентном документе 2 (в частности, с определением того, являются ли один или два, или более видов клеточных маркеров, таких как CD24, отличных от Tie2 и GD2, положительными или отрицательными).

[0071]

«Сфероидная колония» в настоящем описании относится к сферическому агрегату клеток, который содержит стволовые клетки и/или клетки-предшественники и, кроме того, необязательно содержит клетки, полученные из них в результате дифференцировки. «Сфероидная колония» представляет собой объект, который может быть в общем обозначен как, например, «сфера» или «сфероид» специалистом в данной области, и «дискосфера» или «свободная плавучая кольцевая-сферическая структура» в Патентном документе 2, описанном выше, также представляет собой объект, соответствующий «сфероидной колонии».

[0072]

В рамках изобретения, фраза «экспрессия Tie2 увеличена» (увеличенная экспрессия Tie2) означает, что экспрессия гена Tie2 увеличена в индивидуальных стволовых/клетках-предшественниках, то есть, экспрессия увеличивается больше, чем обычно, и уровень экспрессии мРНК или белка увеличивается. Даже в обычных условиях, в которых экспрессия гена Tie2 почти исчезает, фраза «экспрессия Tie2 увеличена» соответствует сохранению конкретного уровня экспрессии без потери экспрессии, то есть, поддержанию экспрессии Tie2. Кроме того, в результате такой увеличенной экспрессии Tie2 в индивидуальных стволовых/клетках-предшественниках, увеличение количества клеток, как определено, имеющих положительную экспрессию мРНК или белка Tie2 в популяции клеток, то есть, более высокий процент положительных по Tie2 клеток в популяции клеток, чем обычно, также можно понимать, как показатель «увеличенной экспрессии Tie2».

[0073]

Более конкретно, например, белок Tie2 на клеточной поверхности является флуоресцентно меченным для популяции клеток, ранее подвергнутой обработке для увеличения экспрессии Tie2 (группа обработки для увеличения экспрессии Tie2) или популяции клеток, не подвергнутой обработке для увеличения экспрессии Tie2 (контрольная группа). При измерении посредством проточной цитометрии, процент клеток, как определено, имеющих более высокую интенсивность флуоресценции и более положительную экспрессию и/или более высокую среднюю интенсивность флуоресценции на клетку, чем предопределенный уровень, может быть выше в группе обработки для увеличения экспрессии Tie2, чем в контрольной группе. В этом случае, можно сказать, что (экспрессирующие Tie2 клетки, содержащееся в) популяция клеток из группы обработки для увеличения экспрессии Tie2 имеет увеличенную экспрессию Tie2 (иными словами, обработка для увеличения экспрессии Tie2 играет предписанную роль). Кроме того, при морфологическом обследовании, клетки, имеющие увеличенную экспрессию Tie2, также можно отличать как имеющие форму веретена (остальные клетки имеют почти сферическую форму).

[0074]

Средство, проявляющее эффекты «увеличения экспрессии Tie2» как описано выше, обозначено в настоящем описании как «усилитель экспрессии Tie2» по изобретению. Следует отметить, что некоторые факторы роста (например, FGF2) имеют эффект увеличения экспрессии Tie2, и можно сказать, что они соответствуют виду «усилителя экспрессии Tie2». Соответственно, в случае исключения таких факторов роста, средство называют «усилителем экспрессии Tie2, отличным от факторов роста».

[0075]

По изобретению, осуществление первого способа культивирования и/или второго способа культивирования соответствует подверганию популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, «обработке для увеличения экспрессии Tie2».

[0076]

-Способы культивирования-

Первый - четвертый способы культивирования для популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению, являются следующими:

первый способ культивирования: способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, во время присутствия в нерасщепленной ткани;

второй способ культивирования: способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один вид усилителя экспрессии Tie2, отличный от факторов роста;

третий способ культивирования: способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с использованием культурального оборудования с культуральной поверхностью, подвергнутой обработке для увеличения прикрепления клеток; и

четвертый способ культивирования: способ культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с супрессией в то же время формирования сферических колоний, в культуральной среде, содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса.

[0077]

Первый - четвертый способы культивирования по изобретению можно осуществлять отдельно, или можно осуществлять последовательно или одновременно посредством комбинирования множества способов культивирования. Множество способов культивирования, выбранных из первого - четвертого способов культивирования, можно комбинировать и осуществлять одновременно. Это означает, что выбранные способы культивирования объединяют, то есть, осуществляют способ культивирования, в котором пересекаются все технические материалы, включенные в выбранные способы культивирования. Например, первый способ культивирования и второй способ культивирования можно комбинировать (объединять) и осуществлять последовательно или одновременно (способ, в котором эти способы объединяют, может быть обозначен как «первый-второй способ культивирования»). Третий способ культивирования и четвертый способ культивирования можно комбинировать (объединять) и осуществлять последовательно или одновременно (способ, в котором эти способы объединяют, может быть обозначен как «третий-четвертый способ культивирования»).

[0078]

Цель осуществления первого - четвертого способов культивирования по изобретению не является конкретно ограниченной. Каждый из первого - четвертого способов культивирования можно осуществлять на любой из стадии культивирования для размножения (или ступени, соответствующей ей), стадии культивирования для дифференцировки (или ступени, соответствующей ей) или других стадий по изобретению.

[0079]

Если не указано иное, описание относительно первого - четвертого способов культивирования (и первой - четвертой ступеней культивирования из осуществления первого - четвертого способов культивирования) можно читать, по необходимости, в качестве описания, не только в случае, когда каждый способ осуществляют как отдельный способ (ступень), но также в случае, когда каждый способ осуществляют как способ (ступень), объединенный с другим способом (ступенью).

[0080]

Положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, содержащееся в популяции клеток, к которой прилагают четвертый способ культивирования по изобретению, и клетки, дифференцированные из стволовых клеток/-предшественников, могут представлять собой клетки, которые связаны друг с другом посредством внеклеточного матрикса, секретированного внеклеточно, с формированием сферических колоний (сфероидов) в обычной культуральной среде, свободной от любого средства, осуществляющего деградацию внеклеточного матрикса. Если средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса, добавляют в культуральную среду по изобретению, тип клеток не является конкретно ограниченным, при условии, что клетки проявляют эффекты ингибирования формирования сферических колоний (сфероидов).

[0081]

В репрезентативном варианте осуществления изобретения, клетки, полученные в результате дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, представляют собой клетки, которые продуцируют и секретируют более внеклеточного матрикса, чем типичные клетки, например, клетки пульпозного ядра, ответственные за продукцию и секрецию внеклеточного матрикса в ткани пульпозного ядра диска. Зрелые клетки пульпозного ядра экспрессируют по меньшей мере коллаген типа II в качестве внеклеточного матрикса, и также экспрессируют внеклеточный матрикс, такой как протеогликан (аггрекан). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники подвергаются дифференцировке в клетки, экспрессирующие молекулы внеклеточного матрикса, такие как коллаген типа II и протеогликан (аггрекан), в частности, функциональные клетки пульпозного ядра, имеющие превосходный уровень экспрессии (уровень продукции) не только мРНК, но также белка коллагена типа II.

[0082]

- Способ получения (ступень культивирования)-

Способ получения из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, популяции клеток, содержащей целевые клетки, полученные в результате дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников по изобретению, включает следующую стадию культивирования для размножения и/или стадию культивирования для дифференцировки, предпочтительно, как стадию культивирования для размножения, так и стадию культивирования для дифференцировки (в порядке первой стадии культивирования для размножения и следующей стадии культивирования для дифференцировки).

Стадия культивирования для размножения: ступень культивирования для усиления экспрессии Tie2 в положительных по Tie2 стволовых/клетках-предшественниках и размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток; и

стадия культивирования для дифференцировки: стадия культивирования для индукции дифференцировки положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в целевые клетки.

[0083]

-Ступень, включающая стадию культивирования для размножения

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, первый способ культивирования и второй способ культивирования осуществляют в ступени на стадии культивирования для размножения. Можно осуществлять любой один из первого способа культивирования или второго способа культивирования, или можно осуществлять оба из них. Можно осуществлять как первый способ культивирования, так и второй способ культивирования. В этом случае, на стадии культивирования для размножения, ступень осуществления первого способа культивирования (обозначенная в настоящем описании как «первая ступень культивирования») и ступень осуществления второго способа культивирования (обозначенная в настоящем описании как «вторая ступень культивирования») могут представлять собой отдельные ступени, которые осуществляют последовательно (первую ступень культивирования осуществляют сначала, и вторую ступень культивирования осуществляют позднее). Два способа культивирования можно представлять как одну ступень (обозначенную в настоящем описании как «первая-вторая ступень культивирования») (в которой первый и второй способы культивирования объединяют и осуществляют). То есть, ступень может представлять собой ступень культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, во время присутствия в нерасщепленной ткани и в содержащей усилитель экспрессии Tie2 культуральной среде.

[0084]

«Ступень на стадии культивирования для размножения» в основном предназначена для размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников посредством культивирования в предписанных условиях, и обозначает ступень, в которой проявляются эффекты благодаря ей (относительно более сильные, чем другие эффекты). То есть, если количество и/или процент положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников выше в популяции клеток после культивирования, чем в популяции клеток до культивирования, можно сказать, что ступень культивирования представляет собой «ступень на стадии культивирования для размножения». В настоящем описании, находится в пределах допустимого то, что положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники подвергаются дифференцировке в другие клетки (целевые клетки).

[0085]

Экспрессия Tie2 в индивидуальных положительных по Tie2 стволовых/клетках-предшественниках (например, стволовых/клетках-предшественниках пульпозного ядра) по изобретению увеличена (включая случай, когда экспрессия Tie2 сохраняется). Также количество и/или процент положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, содержащихся в популяции клеток, увеличиваются. Такие эффекты можно синергически увеличивать. Таким образом, является особенно предпочтительным, что первый-второй способ культивирования осуществляют как ступень на стадии культивирования для размножения (т.е., осуществляют первую-вторую ступень культивирования).

[0086]

- Ступень, включающая стадию культивирования для дифференцировки

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, третий способ культивирования и четвертый способ культивирования осуществляют в ступени на стадии культивирования для дифференцировки. Можно осуществлять любой один из третьего способа культивирования или четвертого способа культивирования, или можно осуществлять оба из них. В настоящем описании, можно осуществлять оба из третьего способа культивирования и четвертого способа культивирования. В этом случае, на стадии культивирования для дифференцировки, ступень осуществления третьего способа культивирования (обозначенная в настоящем описании как «третья ступень культивирования») и ступень осуществления четвертого способа культивирования (обозначенная в настоящем описании как «четвертая ступень культивирования») могут представлять собой отдельные ступени, которые осуществляют последовательно. Два способа культивирования можно представлять как одну ступень (обозначенную в настоящем описании как «третья-четвертая ступень культивирования») (в которой третий и четвертый способы культивирования объединяют и осуществляют). То есть ступень может представлять собой ступень культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, посредством использования культурального оборудования с культуральной поверхностью, подвергнутой обработке для увеличения прикрепления клеток, и посредством супрессии формирования сферических колоний в культуральной среде, содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса.

[0087]

«Ступень на стадии культивирования для дифференцировки» в основном предназначена для дифференцировки положительных по Tie2 стволовые клетки/-предшественники в предопределенные клетки посредством культивирования в предписанных условиях, и обозначает ступень, в которой проявляются эффекты благодаря ей (относительно более сильные, чем другие эффекты). То есть, если количество и/или процент целевых клеток выше в популяции клеток после культивирования, чем в популяции клеток до культивирования, можно сказать, что ступень культивирования представляет собой «ступень на стадии культивирования для дифференцировки».

[0088]

Следует отметить, что как описано выше, ступень временной обработки, в культуральной среде, содержащей коллагеназу, сферических колоний (сфероидов, дискосфер, плавучих сферических структур), описанная в Патентном документе 1, для их диссоциации не соответствует четвертому способу культивирования по изобретению, как определено выше, или четвертой ступени культивирования как ступени на стадии культивирования для дифференцировки. Кроме того, способ (ступень) обработки популяции клеток, содержащейся в собранной ткани, с использованием, например, коллагеназы, для выделения или способ (ступень) подвергания клеток, выращенных в типичной двумерной культуре, обработке трипсином для диссоциации клеток от культуральной поверхности для субкультивирования, также не соответствует четвертому способу культивирования по изобретению, как определено выше, или четвертой ступени культивирования как ступени на стадии культивирования для дифференцировки.

[0089]

Данные функциональные клетки (например, положительные по Col2 клетки пульпозного ядра), дифференцированные из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (например, стволовых клеток/-предшественники пульпозного ядра), содержащиеся в популяции клеток по изобретению, должны иметь увеличенное количество и/или процент клеток. С другой стороны, является возможным синергическое увеличение эффектов, например, сохранения на конкретном уровне количества и/или процента положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников. С учетом вышеуказанного, является особенно предпочтительным, что третий-четвертый способ культивирования осуществляют как ступень на стадии культивирования для дифференцировки (т.е. осуществляют третью-четвертую ступень культивирования).

[0090]

Стадия культивирования для размножения может, кроме того, необязательно, включать ступень в дополнение к первой ступени культивирования и/или второй ступени культивирования, которая соответствует цели ступени размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников. Примеры такой ступени включают ступень культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей, в качестве усилителя экспрессии Tie2, только фактор роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2 (эта ступень обозначена в настоящем описании как «дополнительная ступень культивирования для размножения»). Примеры фактора роста, имеющего эффект увеличения экспрессии Tie2 в дополнительной ступени культивирования для размножения, включают FGF и/или EGF. Дополнительную ступень культивирования для размножения, предпочтительно, осуществляют после первой ступени культивирования и/или второй ступени культивирования, в частности, первой ступени культивирования или первой-второй ступени культивирования. Также в дополнительной ступени культивирования для размножения является подходящим, чтобы первый способ культивирования не осуществляли, то есть, популяция клеток, содержащая положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, находится не в состоянии присутствия в нерасщепленной ткани, но в состоянии, когда клетки разделены посредством обработки для расщепления. В «первом способе культивирования», осуществляемом на первой ступени культивирования или первой-второй ступени культивирования по изобретению, популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, культивируют во время присутствия в нерасщепленной ткани. Однако, если культура достигает конкретного уровня, присутствие в ткани может влиять на клетки. Тогда предотвращают размножение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (даже если период культивирования расширяют, положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники не размножаются). Таким образом, после первой ступени культивирования или первой-второй ступени культивирования, ткань расщепляют, разделенную популяцию клеток выделяют, и осуществляют дополнительную ступень размножения. Это позволяет дополнительное размножение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников.

[0091]

<Популяция клеток>

Популяция клеток, содержащая положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, подлежащая подверганию каждому способу культивирования или каждой ступени культивирования по изобретению (в общем обозначенная в настоящем описании как «популяция клеток до культивирования»), включает положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники и другие клетки (например, клетки, дифференцированные из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников), в основном в любом соотношении и/или количествах. Кроме того, в основном любое соотношение между положительными по Tie2 стволовыми клетками и положительными по Tie2 клетками-предшественниками также допустимо. Состав популяции клеток до культивирования можно корректировать, по необходимости, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, с учетом эффектов в каждом способе культивирования или на каждой ступени культивирования.

[0092]

Популяцию клеток до культивирования можно предоставлять или получать в соответствии с общепринятым способом, за исключением случая подвергания первому способу культивирования или первой ступени культивирования. Например, популяцию клеток, включенную в собранную in vivo ткань пульпозного ядра диска, можно использовать в качестве популяции клеток до культивирования. В этом случае, ткань пульпозного ядра сначала тонко нарезали с использованием инструмента, такого как ножницы, на фрагменты подходящего размера (например, нарубали на кубики по несколько мм). Затем, полученные клетки обрабатывали с использованием протеазы, такой как коллагеназа, диспергировали и необязательно, фильтровали, центрифугировали, промывали и т.д. Эти обработки позволяют изоляцию и выделение популяции клеток, включенной в ткань пульпозного ядра. Полученную популяцию клеток можно использовать в качестве популяции клеток до культивирования, отличной от используемых в первом способе культивирования или на первой ступени культивирования.

[0093]

С другой стороны, в первом способе культивирования или на первой ступени культивирования по изобретению, вышеуказанную процедуру останавливали на ступени тонкого нарезания ткани пульпозного ядра (обработку с использованием протеазы не проводят). Затем, популяцию клеток, включенную в то же время в тонко нарезанную ткань пульпозного ядра, используют в качестве популяции клеток до культивирования.

[0094]

Популяцию клеток, отделенную от ткани, или популяцию клеток (содержащую популяцию клеток ткань), включенную в то же время в ткань, полученную, как описано выше, можно подвергать криоконсервированию, в соответствии с общепринятым способом, до подвергания следующему способу культивирования или ступени культивирования. Криоконсервированую популяцию клеток или ткань можно размораживать в соответствии с общепринятым способом, когда начинают следующий способ культивирования или ступень культивирования. В ходе криоконсервирования и размораживания, обработки, подходящие для популяции клеток или ткани, можно комбинировать. Например, криопротектор (например, DMSO) можно добавлять в ходе криоконсервирования, и в этом случае, криопротектор можно удалять в подходящих условиях в ходе размораживания.

[0095]

Популяция клеток, содержащая положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, полученные посредством каждого способа культивирования или каждой ступени культивирования по изобретению (в общем обозначенная в настоящем описании как «популяция клеток после культивирования»), включает положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники и другие клетки (например, клетки, дифференцированные из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников), в основном в любом соотношении и/или количествах. Кроме того, в основном любое соотношение между положительными по Tie2 стволовыми клетками и положительными по Tie2 клетками-предшественниками также допустимо. Состав популяции клеток после культивирования можно корректировать, по необходимости, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, с учетом в то же время применения популяции клеток, полученной посредством каждого способа культивирования или каждой ступени культивирования.

[0096]

Популяцию клеток после культивирования можно выделять из культуральной среды в соответствии с общепринятым способом и подвергать следующему способу культивирования или ступени культивирования, или подвергать другому способу или ступени, таким как получение препарата клеток.

[0097]

Популяция клеток, содержащая положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в ходе процесса каждого способа культивирования или каждой ступени культивирования по изобретению (в общем обозначенная в настоящем описании как «популяция клеток во время культивирования»), включает положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники и другие клетки (например, клетки, дифференцированные из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников), в основном в любом соотношении. Кроме того, в основном любое соотношение между положительными по Tie2 стволовыми клетками и положительными по Tie2 клетками-предшественниками также допустимо. Состав популяции клеток во время культивирования представляет собой состав в процессе перехода от популяции клеток до культивирования к популяции клеток после культивирования. Например, соотношение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников по отношению к популяции клеток во время культивирования (обозначенное в настоящем описании как «частота положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников») представляет собой количество в диапазоне (включительном) между частотой положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток до культивирования и частотой положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток после культивирования. Однако, для количества допустимо временное нахождение вне диапазона. Состав популяции клеток во время культивирования меняется в зависимости от варианта осуществления изобретения и в зависимости, например, от количества суток и количества пассажей в каждом способе культивирования или на каждой ступени культивирования.

[0098]

«Человека или другое животное» (донора), из которого происходит каждая популяция клеток, можно выбирать с учетом, например, применения популяции клеток, в конечном счете полученной посредством способа культивирования положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников по изобретению, или применения популяции клеток, полученной посредством каждого способа культивирования или каждой ступени культивирования, включенной в способ. В иллюстративном варианте осуществления изобретения, возможно получение популяции клеток для получения препарата клеток, чтобы предотвращать или лечить, например, данное заболевание или симптом. В этом случае, «человек или другое животное» представляет собой организм того же вида, что и субъект (реципиент), которому вводят препарат клеток, и, предпочтительно, представляет собой человека.

[0099]

Популяция клеток, включенная в стадию культивирования для размножения

Популяция клеток по изобретению (в общем обозначенная в настоящем описании как «популяция клеток до культивирования для размножения»), подлежит подверганию первому способу культивирования и/или второму способу культивирования или первой ступени культивирования, и/или второй ступени культивирования на стадии культивирования для размножения. Популяция клеток, как правило, представляет собой популяцию клеток (популяцию клеток первичной культуры), содержащуюся в ткани (межпозвоночном диске), собранной из организма человека или другого животного, или популяцию клеток (популяцию клеток субкультуры), полученную посредством субкультивирования популяции клеток первичной культуры.

[0100]

Например, популяцию клеток, включенную в межпозвоночный диск, собранный от человека, можно использовать в качестве популяции клеток до культивирования для размножения. В этом случае, предпочтительной является популяция клеток, включенная в межпозвоночный диск, собранный от человека в подростковом возрасте или в возрасте от двадцати до двадцати девяти лет, когда межпозвоночный диск, вероятно, имеет, как правило, увеличенную частоту и превосходную нишу положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников. Кроме того, популяция клеток до культивирования для размножения, предпочтительно, представляет собой популяцию клеток, имеющую частоту положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, настолько высокую, насколько возможно, например, 30% или более, 40% или более, 50% или более, или 60% или более.

[0101]

Следует отметить, что в некоторых вариантах осуществления, популяция клеток до культивирования для размножения необязательно представляет собой популяцию клеток, содержащуюся в собранной ткани из организма человека или другого животного. Например, популяция клеток может представлять собой популяцию клеток, содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, полученные посредством индукции дифференцировки плюрипотентных или мультипотентых клеток, таких как клетки iPS или клетки ES, полученную с использованием клеток от человека или другого животного.

[0102]

По изобретению, применение популяции клеток, полученной посредством первого способа культивирования и/или второго способа культивирования, или применение популяции клеток, полученной посредством первой ступени культивирования и/или второй ступени культивирования на стадии культивирования для размножения (в общем обозначенной в настоящем описании как «популяция клеток после культивирования для размножения»), не является конкретно ограниченным. Состав полученной популяции клеток можно корректировать, по необходимости, в зависимости от ее применения.

[0103]

В типичном варианте осуществления изобретения, популяцию клеток после культивирования для размножения используют в качестве популяции клеток, подлежащей подверганию третьему способу культивирования и/или четвертому способу культивирования, или популяции клеток, подлежащей подверганию третьей ступени культивирования и/или четвертой ступени культивирования на стадии культивирования для дифференцировки. Популяция клеток после культивирования для размножения в таком варианте осуществления (применения), предпочтительно, имеет соотношение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников и/или количество клеток, настолько высокое, насколько возможно. Соотношение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток после культивирования для размножения меняется в зависимости, например, от индивидуальных различий популяции клеток до культивирования для размножения и ткани пульпозного ядра, из которой происходит популяция клеток до культивирования для размножения. Таким образом, соотношение зависит от ситуации, но составляет, например, 5% или более, предпочтительно, 7% или более, 9% или более, 11% или более, 13% или более, или 15% или более. Количество положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток после культивирования для размножения меняется в зависимости, например, от индивидуальных различий популяции клеток до культивирования для размножения и ткани пульпозного ядра, из которой происходит популяция клеток до культивирования для размножения. Таким образом, соотношение зависит от ситуации, но количество клеток составляет, например, 5-кратное или более, предпочтительно 10-кратное или более, 15-кратное или более, 20-кратное или более, 25-кратное или более, или 30-кратное или более количество в популяции клеток до культивирования для размножения.

[0104]

Популяция клеток, включенная в стадию культивирования для дифференцировки

Популяция клеток, подлежащая подверганию третьему способу культивирования и/или четвертому способу культивирования, или популяция клеток, подлежащая подверганию третьей ступени культивирования и/или четвертой ступени культивирования на стадии культивирования для дифференцировки по изобретению (обозначенная в настоящем описании как «популяция клеток до культивирования для дифференцировки»), предпочтительно, представляет собой популяцию клеток, полученную посредством обогащения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников заранее. Частота положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток до стадии культивирования для дифференцировки меняется в зависимости, например, от индивидуальных различий популяции клеток до культивирования для размножения или после культивирования для размножения, и/или ткани пульпозного ядра, из которой происходит популяция клеток. Таким образом, соотношение зависит от ситуации, но составляет, например, 5% или более, предпочтительно 7% или более, 9% или более, 11% или более, 13% или более, или 15% или более.

[0105]

В типичном варианте осуществления изобретения, популяция клеток до культивирования для дифференцировки представляет собой популяцию клеток (популяцию клеток после культивирования для размножения), полученную посредством стадии культивирования для размножения по изобретению. Например, популяцию клеток, содержащую размноженные положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, разделяют на подходящие количества клеток, в зависимости от варианта осуществления стадии культивирования для дифференцировки (например, типа и/или размера культурального оборудования), для получения представляющей интерес популяции клеток. Популяция клеток, полученная посредством стадии культивирования для размножения по изобретению, содержит положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники в соотношении и/или количестве клеток, как описано выше. Кроме того, экспрессия Tie2 в положительных по Tie2 стволовых/клетках-предшественниках увеличена (экспрессия Tie2 сохраняется). Таким образом, с точки зрения усиления эффектов на стадии культивирования для дифференцировки, вышеуказанная популяция клеток является предпочтительной в качестве популяции клеток до культивирования для дифференцировки.

[0106]

Следует отметить, что в некоторых вариантах осуществления, популяцию клеток до культивирования для дифференцировки необязательно получают посредством стадии культивирования для размножения (первой ступени культивирования и/или второй ступени культивирования) по изобретению. Например, популяция клеток может представлять собой популяцию клеток, включенную в собранную ткань из организма человека или другого животного, или популяцию клеток, содержащую целевые клетки, полученные посредством индукции дифференцировки (через положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники) плюрипотентных или мультипотентых клеток, таких как клетки iPS или клетки ES, полученных с использованием клеток от человека или другого животного.

[0107]

По изобретению, применение популяции клеток, полученной посредством третьего способа культивирования и/или четвертого способа культивирования, или применение популяции клеток, полученной посредством третьей ступени культивирования и/или четвертой ступени культивирования на стадии культивирования для дифференцировки (в общем обозначенной в настоящем описании как «популяция клеток после культивирования для дифференцировки»), не является конкретно ограниченным. Состав полученной популяции клеток можно корректировать, по необходимости, в зависимости от ее применения. Например, популяция клеток, используемая для получения препарата клеток для имплантации, содержит так много целевых клеток, насколько возможно (например, клеток пульпозного ядра, продуцирующих коллаген типа II: положительных по Col2 клеток), имеющих функциональность, которую можно использовать для оказания терапевтического или профилактического эффекта посредством имплантации. В то же самое время, является предпочтительным, чтобы популяция клеток содержала некоторое количество положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (например, стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра), которые остаются способными к образованию таких целевых клеток.

[0108]

Соотношение положительных по Col2 клеток (пульпозного ядра) в популяции клеток после культивирования для дифференцировки меняется в зависимости, например, от индивидуальных различий популяции клеток до культивирования для дифференцировки и ткани пульпозного ядра, из которой происходит популяция клеток до культивирования для дифференцировки. Таким образом, соотношение зависит от ситуации, но составляет, например, 5% или более, предпочтительно 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, или 30% или более.

[0109]

Соотношение положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников (пульпозного ядра) в популяции клеток после культивирования для дифференцировки меняется в зависимости, например, от индивидуальных различий популяции клеток до культивирования для дифференцировки и ткани пульпозного ядра, из которой происходит популяция клеток до культивирования для дифференцировки. Таким образом, соотношение зависит от ситуации, но составляет, например, 1% или более, предпочтительно, 2% или более, 4% или более, 6% или более, 8% или более, или 10% или более.

[0110]

Следует отметить, что в ступени культивирования для дифференцировки, количество клеток, содержащееся в популяции клеток, обычно увеличивается. Количество клеток (например, каждых из положительных по Col2 клеток или положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников) в популяции клеток после культивирования для дифференцировки меняется в зависимости, например, от индивидуальных различий популяции клеток до культивирования для дифференцировки и/или ткани пульпозного ядра, из которой происходит популяция клеток до культивирования для дифференцировки. Таким образом, соотношение зависит от ситуации, но количество клеток составляет, например, 2-кратное или более, 5-кратное или более, 10-кратное или более, 20-кратное или более, 50-кратное или более, или 100-кратное или более количество в популяции клеток до культивирования для дифференцировки.

[0111]

<Культуральная среда>

Культуральная среда, используемая в каждом способе культивирования или на каждой ступени культивирования по изобретению, может представлять собой любую культуральную среду, при условии, что она является пригодной для культивирования положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников и клеток, полученных из них в результате дифференцировки. Подходящую базовую культуральную среду и подходящие дополнительный компонент(ы) можно выбирать с учетом цели способа культивирования или ступени культивирования. Дополнительный компонент(ы) может представлять собой дополнительный компонент(ы), пригодный для размножения культуры положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, если способ культивирования осуществляют во время размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, то есть, когда ступень культивирования присутствует на стадии культивирования для размножения. Дополнительный компонент(ы) , пригодный для индукции дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в целевые клетки, можно выбирать, если способ культивирования осуществляют во время индукции дифференцировки положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, то есть, когда ступень культивирования присутствует на стадии культивирования для дифференцировки.

[0112]

В третьем способе культивирования и четвертом способе культивирования по изобретению, или на третьей ступени культивирования и четвертой ступени культивирования, включающей ступень осуществления этих способов, не является необходимым добавление в культуральную среду компонента (например, метилцеллюлозы), который предотвращает прикрепление положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников и клеток, полученных из них в результате дифференцировки, к культуральной поверхности культурального оборудования. То есть культуральная среда в третьем способе культивирования и четвертом способе культивирования по изобретению или на третьей ступени культивирования и четвертой ступени культивирования, включающей ступень осуществления этих способов, обычно является свободной от любого компонента (например, метилцеллюлозы) для предотвращения адгезии клеток к культуральной поверхности культурального оборудования.

[0113]

В репрезентативном варианте осуществления изобретения, стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра и клетки пульпозного ядра, полученные из них в результате дифференцировки, можно культивировать. В этом случае культуральную среду для каждой ступени на стадии культивирования для размножения или стадии культивирования для дифференцировки можно получать, например, с использованием соответствующих количеств следующих базовой культуральной среды, дополнительного компонента(компонентов), фактора(факторов) роста и другого компонента(компонентов).

[0114]

Примеры базовой культуральной среды включают DMEM (среду Игла в модификации Дульбекко, в отсутствие или в присутствии глюкозы), αMEM (α-модифицированную минимальную эссенциальную среду Игла), среду Хэма F-10, среду Хэма F-12 или их смесь.

[0115]

Примеры дополнительного компонента(компонентов) для культивирования для размножения или для культивирования для дифференцировки включают FBS (эмбриональную бычью сыворотку), BSA (бычий сывороточный альбумин), L-аскорбиновую кислоту (например, в форме соли L-аскорбиновой кислоты фосфата магния), селенистую кислоту (например, в форме инсулина-трансферрина-селенита натрия (ITS: инсулин-трансферрин-селен)), и/или 2-меркаптоэтанол. По необходимости, антибиотики, такие как пенициллин и стрептомицин, и другой компонент(ы) можно дополнительно добавлять в культуральную среду. Следует отметить, что культуральная среда для размножения культуры необязательно содержит L-аскорбиновую кислоту в качестве дополнительного компонента.

[0116]

Примеры фактора (факторов) роста включают FGF (фактор роста фибробластов), EGF (эпидермальный фактор роста), и/или Ang-1 (ангиопоэтин-1). В одном варианте осуществления изобретения, является предпочтительным использование по меньшей мере FGF в качестве фактора роста для добавления в культуральную среду, является более предпочтительным использование как FGF, так и EGF, и является еще более предпочтительным необязательное использование Ang-1 в дополнение к FGF и EGF.

[0117]

Примеры FGF, который можно использовать, включают bFGF (основный фактор роста фибробластов, иногда также обозначаемый как FGF-2). Концентрация FGF в культуральной среде обычно может лежать в диапазоне от 1 до 50 нг/мл и предпочтительно, в диапазоне от 5 до 15 нг/мл, например, приблизительно 10 нг/мл.

[0118]

Ang-1 предпочтительно добавляют в бессывороточную культуральную среду. Ang-1, предпочтительно, солюбилизирован в воде (растворимый Ang-1, рекомбинантный Ang-1). Концентрация Ang-1 (предпочтительно, растворимого Ang-1) в культуральной среде обычно может лежать в диапазоне от 100 до 1000 нг/мл, например, приблизительно 500 нг/мл.

[0119]

Следует отметить, что вышеуказанные факторы роста, такие как FGF, EGF и Ang-1, представляют собой «факторы роста, имеющие эффект увеличения экспрессии Tie2», и могут также быть интерпретированы как соответствующие «усилителю экспрессии Tie2» в широком смысле, однако, способ манипуляции с этими факторами роста по изобретению отдельно описан в настоящем описании.

[0120]

<Усилитель экспрессии Tie2>

Во втором способе культивирования по изобретению, по меньшей мере один вид «усилителя экспрессии Tie2», отличного от факторов роста, имеющих эффект увеличения экспрессии Tie2, добавляют в культуральную среду. В частности, когда второй способ культивирования осуществляют в ступени на стадии культивирования для размножения, можно добавлять усилитель экспрессии Tie2. Это добавление проявляет эффект увеличения количества положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, в то время как клетки остаются незрелыми. Кроме того, когда популяцию клеток, полученную на стадии культивирования для размножения, подвергают ступени культивирования для дифференцировки, добавление может проявлять, например, эффект улучшения скорости увеличения количества клеток в популяции клеток, полученных после ступени культивирования для дифференцировки, и/или соотношения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников и соотношения функциональных целевых клеток, и т.д. Можно использовать любой один вид усилителя экспрессии Tie2, или два или более их видов можно использовать в комбинации. Усилитель можно добавлять в культуральную среду в количестве, посредством которого проявляются активность и эффект Tie2, как описано выше.

[0121]

Примеры «фактора (факторов) роста, имеющего эффект увеличения экспрессии Tie2», включают ангиопоэтин-1 (Ang-1) и/или FGF2 (bFGF). Во втором способе культивирования по изобретению, добавляют по меньшей мере один вид «усилителя экспрессии Tie2», отличного от факторов роста, имеющих эффект увеличения экспрессии Tie2. Однако фактор(ы) роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2, можно, необязательно, использовать в комбинации. В частности, второй способ культивирования осуществляют в ступени на стадии культивирования для размножения. В этом случае, фактор роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2, и другой усилитель экспрессии Tie2, например, экстракт(ы), полученный из животного(животных) или растения(растений), как описано ниже, более предпочтительно экстракт(ы), полученный из растения(растений), можно использовать в комбинации. Это может проявлять синергический эффект. Следует отметить, что примеры ступени на стадии культивирования для размножения включают ступень, требующую использования по меньшей мере усилителя экспрессии Tie2, отличного от факторов роста (фактор(ы) роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2, можно использовать в комбинации в качестве необязательного компонента(компонентов)). Кроме того, можно также осуществлять ступень, на которой только фактор(ы) роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2, в основном используют в качестве усилителя экспрессии Tie2 (ступень, по существу без какого-либо усилителя экспрессии Tie2, отличного от факторов роста).

[0122]

Усилитель экспрессии Tie2, который является отличным от факторов роста и может быть использован, представляет собой каждый животный/растительный экстракт, известный как «активатор Tie2» в данной области. Примеры такого животного/растительного экстракта(экстрактов) включают экстракт(ы) из Elaeagnus umbellata, Lactuca indica, Tamarindus indica L., куркумы, желтого дерева, Polygonatum rhizome, псилиума, Salsola komarovii, плода оливы, устриц, ромашки аптечной, китайской айвы, семени трихозанта, Morinda officinalis, хризантемы, Polygonatum odoratum, квилайи, гинкго, Clerodendrum trichotomum, китайской дерезы обыкновенной, Quercus acutissima, Alpinia speciosa, женьшеня обыкновенного, Quercus serrata, боярышника, Pellionia minima, Psidium guajava, женьшеня сибирский, звездного яблока, карамболы, Gleditsia officinalis Hemsl., ююбы, корицы, дикого лука-рокамболя, лотоса, Colocasia gigantea, Kalopanax pictus, длинного перца, иглицы колючей, манго, имбиря, Staphylea pinnata, Stauntonia hexaphylla, Hemerocallis fulva var. kwanso, Myrica rubra, японской клетры или ройбоса (см. Патентные документы 3-10). Кроме того, компонент(ы), содержащийся в таком экстракте, представляет собой, например, такое соединение(соединения), как урсоловая кислота, коросоловая кислота, 3-O-галлоилпроцианидин B-1, линоленовая кислота, 13-гидрокси-9 Z,11E,15E-октадекатриеновая кислота, процианидин B-2, эпикатехин-(4β-6)-эпикатехин(4β-8)-эпикатехин, процианидин C-1, астрагалозид VIII, сапонин сои I, 3'-O-метилгаллокатехин, пиперноналин, сирингаресинол, 2-метоксициннамальдегид, элеутерозид E, элеутерозид E1, сезамин, эудесмин, силватесмин, пиноресинол, янгамбин, форзитинол, кумарин (см. Патентные документы 6 и 12-14). Их можно использовать в качестве усилителя экспрессии Tie2, отличного от факторов роста. Для каждого экстракта или компонента, например, применения, при котором известен эффект увеличения экспрессии Tie2, часть (материала) растения/животного и способ экстракции, пригодный для получения, и/или способ очистки конкретного компонента компонентов) можно также устанавливать на основании способов, общеизвестных специалисту в данной области, по необходимости.

[0123]

С производственной точки зрения, обеспечивает преимущество использование, в качестве усилителя экспрессии Tie2 на второй ступени культивирования по изобретению, одного или двух, или более видов, выбранных из вышеуказанных животных/растительных экстрактов, более предпочтительно, одного или двух, или более видов, выбранных из вышеуказанных растительных экстрактов, которые являются менее дорогими, чем факторы роста, такие как Ang-1 и FGF2, предпочтительно, имеют лучший эффект увеличения экспрессии Tie2, чем эти факторы роста, и более предпочтительно, проявляют синергический эффект при использовании в комбинации с этими факторами роста.

[0124]

Экстракт, полученный из растения рода Cinnamomum

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, экстракт, полученный из растения рода Cinnamomum, можно использовать в качестве усилителя экспрессии Tie2. Род Cinnamomum включает 300 или более видов, таких как Cinnamomumcassia Blume, C. camphora, C. daphnoides, C. doederleinii, C. japonicum, C. pseudo-pedunculatum, C. sieboldii, C. verum, или C. zeylanicum. Например, экстракт ветвей корицы, представляющих собой молодые ветви корицы, или коры корицы, или продукт, изготавливаемый и продаваемый как порошок корицы, полученный посредством переработки их в порошок, можно использовать в качестве экстракта, полученного из растения рода Cinnamomum по изобретению.

[0125]

Экстракт, полученный из растения рода Cinnamomum, можно получать общепринятым способом, и можно получать, например, посредством погружения или нагрева, с обратным холодильником, растительного организма (например, порошка корицы) в качестве сырьевого материала при нормальной температуре или посредством нагрева вместе с растворителем для экстракции, и затем выделения супернатанта, или посредством фильтрации фильтрата и необязательно, концентрирования фильтрата. Используемый растворитель для экстракции может представлять собой растворитель, обычно используемый для экстракции. Примеры включают водный растворитель, такой как вода, солевой раствор, фосфатный буфер, или боратный буфер. Альтернативно, примеры включают органический растворитель, такой как спиртовое соединение (например, этанол, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, глицерин), водное спиртовое соединение, хлороформ, дихлорэтан, тетрахлорметан, ацетон, этилацетат или гексан. Их можно использовать отдельно или можно использовать в комбинации. Предпочтительно, воду используют в качестве растворителя. Экстракт, полученный посредством экстракции с использованием вышеуказанного растворителя, можно использовать как есть в форме экстракционной жидкости. Однако, с точки зрения удобства, экстракт можно отверждать (измельчать в порошок), например, посредством сушки или лиофилизации, хранить, необязательно, разводить или повторно растворять (повторно диспергировать) с использованием подходящего растворителя при использовании, затем, необязательно подвергать обработке, такой как фильтрация, и затем использовать. Экстракт, полученный из растения рода Cinnamomum, может представлять собой экстракт (очищенный продукт), полученный посредством удаления примесей, например, посредством способа адсорбции с использованием ионообменной смолы (например, пористого полимера, такого как амберлит XAD-2), по необходимости.

[0126]

Концентрацию экстракта, полученного из растения рода Cinnamomum, в культуральной среде можно корректировать, по необходимости, в зависимости от свойств экстракта, подлежащего использованию, и с учетом, например, степени эффектов в качестве усилителя экспрессии Tie2. Например, экстракт, полученный посредством экстракции 1 мг порошка корицы с использованием 1 мл воды (дистиллированной воды) можно использовать в качестве экстракта, полученного из растения рода Cinnamomum. В этом случае, вышеуказанный экстракт можно добавлять в количестве приблизительно от 1 до 50 об./об. %, например, приблизительно 20 об./об. %, на основании культуральной среды. Даже если вариант осуществления экстракции и добавления изменяют, активный ингредиент в качестве усилителя экспрессии Tie2 можно сделать сопоставимым с этим вариантом осуществления экстракции и добавления, описанным выше.

[0127]

<Средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса (средство, осуществляющее деградацию ECM)>

В четвертом способе культивирования по изобретению, для дифференцировки положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, с супрессией в то же время формирования сферических колоний, «средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса (средство, осуществляющее деградацию ECM)», добавляют в культуральную среду.

[0128]

Как правило, примеры внеклеточного матрикса (ECM), секретированного из стволовых клеток/-предшественников или клеток, полученных из них в результате дифференцировки, включают коллаген, протеогликан, фибронектин, ламинин, тенасцин, энтактин, эластин, фибриллин или гиалуроновую кислоту. Коллаген включает тип I, тип II, тип III, тип IV, тип IX (a2) или другие типы коллагена. Примеры протеогликана включают аггрекан, версикан, перлекан (в настоящем описании выше, классификация основана на размере корового белка и количество сахарных цепей), протеогликан хондроитинсульфат, протеогликан гепарансульфат, протеогликан кератансульфат или протеогликан дерматансульфат (в настоящем описании выше, классификация основана на гликозаминогликане, связанным с коровым белком).

[0129]

Таким образом, можно использовать, в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM по изобретению, вещество (средство), имеющее активность деградации ECM, как проиллюстрировано выше, и способное к ингибированию формирования сферических колоний в соответствии с вариантом осуществления четвертого способа культивирования, то есть в ответ на ECM секретированный из культивированных положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников или клеток, полученных из них в результате дифференцировки. Можно использовать любой один вид средства, осуществляющего деградацию ECM, или два или более их видов можно использовать в комбинации.

[0130]

Примеры типичного средства, осуществляющего деградацию ECM, включают протеазы, имеющие активность для деградации белковой части (частей), составляющих ECM, такие как коллагеназы, которые представляют собой протеазы, имеющие активность для деградации коллагена. Примеры каждой коллагеназы включают коллагеназу класса I, имеющую высокую активность по отношению к высокомолекулярному коллагену, или коллагеназу класса II, имеющую высокую активность по отношению к низкомолекулярным фрагментам коллагена. В то же время, коллагеназы из позвоночных расщепляют коллаген в природной области тройной спирали (в очень ограниченном участке α-цепи). В отличие от этого, коллагеназы, происходящие из бактерий, действуют почти на все типы коллагена, и могут расщеплять коллаген во многих участках в области тройной спирали. Препарат коллагеназы, полученный посредством концентрирования бактериального культурального супернатанта, содержит, в дополнение к коллагеназе (например, коллагеназе I, коллагеназе II), протеазу (например, нейтральную протеазу, клострипаин, трипсин, эластазу, аминопептидазу), отличную от коллагеназы, и/или не протеолитический фермент. Можно также получать препарат, из которого конкретный компонент(ы) удален, например, посредством очистки. По изобретению, можно выбирать подходящие, например, из (препаратов) различных известных коллагеназ или протеаз, и можно использовать в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM.

[0131]

В репрезентативном варианте осуществления четвертого способа культивирования по изобретению, положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники представляют собой стволовые клетки/-предшественники пульпозного ядра, и клетки (целевые клетки), полученные посредством индукции дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, представляют собой клетки пульпозного ядра. Клетки пульпозного ядра экспрессируют, в качестве ECM, коллаген типа II, например, коллаген типа IX, коллаген типа XI и/или протеогликан. Таким образом, в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM, в этом варианте осуществления, можно выбирать средство, имеющее активность для деградации ECM, например, коллагеназу, имеющую активность для деградации, например, коллагена типа II, (или содержащий ее препарат). Примеры (препарата) коллагеназы включают «коллагеназу P» (полученную из Clostridium histolyticum; Roche Inc.) или «либеразу» (смесь коллагеназ I и II и нейтральной протеазы; Roche Inc.).

[0132]

Следует отметить, что репрезентативное средство, осуществляющее деградацию ECM, может представлять собой фермент (белок), такой как протеаза, который имеет специфическую активность для деградации белков, содержащихся в ECM, но имеет низкую цитотоксичность. В настоящем описании, является возможным использования, в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM, вещество (например, низкомолекулярное соединение), отличное от ферментов (белков), где вещество имеет конкретный уровень или более активности для деградации ECM и конкретный уровень или менее цитотоксичности.

[0133]

Концентрация средства, осуществляющего деградацию ECM в культуральной среде, может представлять собой любую концентрацию, которая может супрессировать формирование сферических колоний из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники. В зависимости от типа используемого средства, осуществляющего деградацию ECM, четвертый способ культивирования можно осуществлять в ступени на стадии культивирования для дифференцировки (осуществляемой в качестве четвертой ступени культивирования). В этом случае, концентрацию можно корректировать, по необходимости, с учетом скорости увеличения количества целевых клеток и/или действия на уровень экспрессии или частоты положительных по предопределенному гену (генам) (маркерному гену (генам)), и других. Например, если концентрация средства, осуществляющего деградацию ECM, является слишком высокой, обеспечивающие преимущество эффекты вышеуказанного действия можно не наблюдать в достаточной степени (и наоборот, они могут являться неблагоприятными). Таким образом, является предпочтительным корректировать концентрацию в пределах предписанного диапазона, в зависимости от вида средства, осуществляющего деградацию ECM.

[0134]

В способе (третьем-четвертом способе культивирования), в котором третий способ культивирования и четвертый способ культивирования объединяют, или ступени (третьей-четвертой ступени культивирования), в которой третью ступень культивирования и четвертую ступень культивирования объединяют, эффекты скорости увеличения количества целевых клеток, уровня экспрессии или частоты положительных по предопределенному гену (генам) (маркерному гену (генам)), или другие, могут меняться в зависимости от комбинации типа и концентрации средства, осуществляющего деградацию ECM в культуральной среде, и вида покрывающего средства на культуральной поверхности. Специалист в данной области может устанавливать каждое из вышеуказанных условий, подходящее для помещения в практическое осуществление изобретения, посредством, например, предварительного теста, с учетом в то же время также свойств предварительно подвергнутой дифференцировке популяции клеток и других вариантов осуществления, в зависимости от того, с какой точки зрения ожидают эффекты.

[0135]

Как описано выше, концентрация средства, осуществляющего деградацию ECM в культуральной среде, в общем не определена, и может быть скорректирована в пределах диапазона, например, от 0,0025 до 5,0% масс., от 0,005 до 2,0% масс., или от 0,01 до 1,0% масс. в зависимости от комбинации с видом покрывающего средства на культуральной поверхности. В одном варианте осуществления изобретения, когда «коллагеназу P» используют в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM, ее концентрация в культуральной среде может быть скорректирована в пределах диапазона, например, от 0,005 до 0,05% масс. или от 0,0125 до 0,025% масс., и составляет, например, приблизительно 0,0125% масс. В одном варианте осуществления изобретения, когда «либеразу» используют в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM, ее концентрация в культуральной среде может быть скорректирована в пределах диапазона, например, от 0,25% до 2,0% масс. или от 0,5 до 1,0% масс., и составляет, например, приблизительно 1,0% масс.

[0136]

<Период культивирования и другие условия>

В основном, период и другие условия (например, pH, уровень CO₂, уровень O₂) каждого способа культивирования или каждой ступени культивирования по изобретению можно корректировать, по необходимости, чтобы получать популяцию клеток, имеющую желательный состав клеток (тип и количество/соотношение), в соответствии с целью (стадии культивирования, включающей) ступени культивирования. pH может являться слабо щелочным (например, приблизительно 7,15). Уровень CO₂ может составлять, например, приблизительно 5%. Уровень O₂ может составлять 5% или менее (например, приблизительно 2%). В коде периода каждого способа культивирования или каждой ступени культивирования, культуральную среду можно, необязательно, менять, по необходимости, на свежую в каждые предопределенные сутки. Также культуральную среду можно модифицировать, или атмосферу можно менять посредством добавления компонента или увеличения или уменьшения концентрации компонента или pH после прохождения предопределенного количества суток.

[0137]

Период каждой из первой ступени культивирования, второй ступени культивирования, или первой-второй ступени культивирования, на которой эти ступени объединяют, на стадии культивирования для размножения по изобретению, обычно составляет приблизительно 1-3 недели, например, приблизительно 2 недели. Кроме того, периоды других ступеней, которые можно, необязательно, включать на стадии культивирования для размножения по изобретению, также являются сходными. Например, период ступени культивирования с использованием содержащей FGF культуральной среды составляет приблизительно одну неделю. Когда желательная популяция клеток после культивирования для размножения получена, стадию культивирования для размножения можно прекращать. Следует отметить, что культивирование (обработка), проведенное в течение короткого периода или короткого времени (например, 24 час или короче), так что цели размножения культуры невозможно достигнуть, не может соответствовать каждой ступени, осуществляемой на стадии культивирования для размножения по изобретению.

[0138]

Период каждой из третьей ступени культивирования, четвертой ступени культивирования, или третьей-четвертой ступени культивирования, на которой эти ступени объединяют, на стадии культивирования для дифференцировки по изобретению, обычно составляет приблизительно 1-3 недели, например, приблизительно 1-2 недели. Кроме того, периоды других ступеней, которые можно, необязательно, включать на стадии культивирования для размножения по изобретению, также являются сходными. Например, период ступени культивирования с использованием содержащей FGF культуральной среды составляет приблизительно одну неделю. Кроме того, периоды других ступеней, которые можно, необязательно, включать на стадии культивирования для дифференцировки по изобретению, также являются сходными. Когда желательная популяция клеток после культивирования для дифференцировки получена, стадию культивирования для дифференцировки можно прекращать. Следует отметить, что культивирование (обработка), проведенное в течение короткого периода или короткого времени (например, 24 час или короче), так что цели дифференцировки культуры невозможно достигнуть, не может соответствовать каждой ступени, осуществляемой на стадии культивирования для дифференцировки по изобретению.

[0139]

<Культуральное оборудование>

В основном, культуральное оборудование, устройство для культивирования, и другие, используемые в каждом способе культивирования, или на каждой ступени культивирования по изобретению, можно выбирать, по необходимости, в соответствии с целью (стадии культивирования, включающей) способа культивирования или ступени культивирования для получения популяции клеток, имеющей желательный состав клеток (тип и количество/соотношение).

[0140]

Используемое культуральное оборудование может представлять собой культуральное оборудование, имеющее общепринятую форму, такую как флакон, чашка, планшет или пакет, и может иметь лунку (лунки), способные вмещать клетки. Используемое культуральное оборудование может представлять собой культуральное оборудование, изготовленное из общепринятого материала, такого как стекло, пластик или резина. Поверхность (культуральная поверхность) культурального оборудования может являться необработанной, или может быть подвергнута обработке, связанной с прикреплением клеток, или другой обработке (обработкам). Размер (площадь или объем) культурального оборудования и, если культуральное оборудование включает лунки, размер (отверстие и глубина) и количество лунок, например, также можно выбирать, по необходимости. По необходимости, культуральное оборудование можно встряхивать или вращать, и популяцию клеток можно культивировать, с перемешиванием в то же время культуральной среды.

[0141]

В одном варианте осуществления третьего способа (ступени) культивирования и четвертого способа (ступени) культивирования по изобретению, культуральное оборудование и устройство для культивирования можно устанавливать в соответствии с двумерным культивированием (плоскостной культурой). Кроме того, первый способ (ступень) культивирования по изобретению можно также назвать трехмерной культурой с точки зрения культивирования популяции клеток во время присутствия в ткани. Содержащую популяцию клеток ткань (небольшой фрагмент) помещают во время суспендирования в культуральную среду. Второй способ (ступень) культивирования по изобретению может представлять собой вариант осуществления в соответствии с трехмерным культивированием, когда его осуществляют отдельно. Однако, второй способ (ступень) культивирования можно объединять с первым способом (ступенью) культивирования, так что их осуществляют как первый-второй способ (ступень) культивирования. В этом случае, подобно вышеуказанному первому способу (ступени) культивирования, содержащую популяцию клеток ткань помещают во время суспендирования в культуральную среду. В этих способах (ступенях), можно использовать культуральное оборудование, подвергнутое обработке поверхности для увеличения прикрепления клеток, как в третьем способе (ступени) культивирования. Однако, не составляет проблемы, даже если используют обычное культуральное оборудование без обработки поверхности.

[0142]

<Обработка для прикрепления клеток>

В третьем способе (ступени) культивирования по изобретению, используют культуральное оборудование, подвергнутое обработке поверхности для увеличения прикрепления клеток (иногда обозначенной в настоящем описании как «обработка для прикрепления клеток»). Типичные примеры обработки для прикрепления клеток включают обработку, при которой покрывающее средство, содержащее внеклеточный матрикс (ECM) или другое биологическое вещество, наносят на культуральную поверхность. Примеры обработки для прикрепления клеток также включают плазменную обработку для модификации и придания гидрофильности культуральному оборудованию, сформованному из материала с низким прикреплением клеток, например, сильно гидрофобного полистирола.

[0143]

Примеры ECM, содержащегося в покрывающем средстве для обработки для прикрепления клеток, включают различные известные молекулы ECM, такие как коллаген (например, коллаген типа I, типа II, типа IV) или желатин в качестве его обработанного нагреванием продукта, хондроитинсульфат A, фибронектин, желатин, ламинин, тромбоспондин, витронектин или протеогликан (например, аггрекан, протеогликан гепаринсульфат). Примеры биологической молекулы, отличной от ECM, включают полиаминокислоту, такую как полилизин (поли-L-лизин или поли-D-лизин). Примеры других покрывающих средств для обработки для прикрепления клеток включают полигликолевую кислоту, PLGA (сополимер полимолочной кислоты-гликолевой кислоты), полигидроксиалкановую кислоту (PHA), поли-ε-капролактон, полиортоэфир, ангидрид поликислоты, полифосфазен, полидиметилсилоксан, полиуретан, политетрафторэтилен, полиэтилен, полисульфон, полиметилметакрилат, поли-2-гидроксиэтилметакрилат, полиамид, полипропилен, поливинилхлорид, полистирол, поливинилпирролидон или полиорнитин. Покрывающее средство для обработки для прикрепления клеток может содержать любое одно из вышеупомянутых веществ, или может содержать два или более их видов.

[0144]

В настоящем описании, в третьем-четвертом способе (ступени) культивирования, как описано выше, эффекты (например, скорость увеличения количества клеток в популяции клеток, соотношение целевых клеток) по изобретению могут меняться, в зависимости от комбинации вида покрывающего средства для обработки для прикрепления клеток, и типа и концентрации средства, осуществляющего деградацию ECM, добавленного в культуральную среду. Причиной этого, вероятно, может являться то, что ECM или другие биологические вещества, содержащиеся в покрывающем средстве для обработки для прикрепления клеток, могут подвергаться влиянию активности деградации средства, осуществляющего деградацию ECM, добавленного в культуральную среду. Однако, вариант осуществления, в котором покрывающее средство для обработки для прикрепления клеток и средство, осуществляющее деградацию ECM, где средства могут взаимодействовать таким образом, используют в комбинации, также является приемлемым, при условии, что эффекты изобретения проявляются до определенной степени (не являются полностью блокированными). Например, (препарат) коллагеназы, имеющей активность для деградации коллагена типа II, можно добавлять в предопределенной концентрации в качестве средства, осуществляющего деградацию ECM, в культуральную среду. В этом случае, покрывающее средство для обработки для прикрепления клеток маловероятно подвергается влиянию типа и концентрации средства, осуществляющего деградацию ECM. Альтернативно, покрывающее средство можно использовать для индукции дифференцировки в целевые клетки (например, положительные по Col2 клетки), так что можно достигать дифференцировки на конкретном уровне. Предпочтительно, является предпочтительным включение полилизина (поли-L-лизина или поли-D-лизина) или фибронектина, не представляющих собой коллаген, или коллагена типа IV.

[0145]

Третий способ культивирования по изобретению также можно осуществлять на стадии культивирования для размножения. Например, третий способ культивирования можно осуществлять на ступени (дополнительной ступени культивирования для размножения) культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники в культуральной среде, содержащей только фактор роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2, в качестве усилителя экспрессии Tie2, описанный выше применительно к стадии культивирования для размножения. Предпочтительные примеры ECM, содержащегося в покрывающем средстве для обработки для прикрепления клеток, в таком варианте осуществления включают желатин.

[0146]

-Композиция для клеточной терапии-

Композиция для клеточной терапии по изобретению содержит популяцию клеток, которая получена способом культивирования или способом получения по изобретению, как описано выше, и может, необязательно, содержать другой фармацевтически приемлемый компонент(ы).

[0147]

В репрезентативном варианте осуществления изобретения, композиция для клеточной терапии представляет собой композицию для клеточной терапии, содержащую положительные по Col2 клетки пульпозного ядра, полученные в результате дифференцировки из стволовых клеток/-предшественников пульпозного ядра (предпочтительно также содержащую положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники). Примеры показания, для которого показана композиция для клеточной терапии в этом варианте осуществления, то есть, заболевания, которое можно предотвращать или лечить посредством введения этой композиции, включают заболевание, проявляющееся как нарушение или дегенерация межпозвоночного диска (пульпозного ядра), или грыжа. Конкретные его примеры включают дископатию поясничного или шейного отдела позвоночника, позвоночную грыжу, шейный спондилез, радикулопатию, спондилолиз/спондилолистез, поясничный спинальный стеноз, поясничный дегенеративный спондилолистез или поясничный дегенеративный сколиоз.

[0148]

Лекарственная форма композиции для клеточной терапии по изобретению может представлять собой любую форму, при условии, что популяцию клеток можно трансплантировать или доставлять в участок-мишень (например, пульпозное ядро межпозвоночного диска). В настоящем описании, лекарственная форма может представлять собой, например, препарат для инъекции и предпочтительно, препарат для инъекции для местного введения в межпозвоночный диск (пульпозное ядро) или около них. Альтернативно, лекарственная форма может представлять собой препарат для инъекции для введения в кровеносный сосуд, что делает возможным нацеливание.

[0149]

Примеры фармацевтически приемлемого компонента (компонентов) включают воду для инъекций или физиологический солевой раствор, используемые в случае препарата в форме для инъекции, культуральную жидкость для популяции клеток, другой пригодный растворитель/дисперсионную среду и/или другую добавку(добавки).

[0150]

Композицию для клеточной терапии по изобретению можно вводить в количестве, эффективном для оказания желательного терапевтического или профилактического эффекта. В то время как ингредиент(ы) композиции для клеточной терапии, лекарственная форма, субъект для введения, способ введения и другие варианты осуществления предусмотрены, такое эффективное количество можно корректировать, по необходимости, например, посредством дозы на введение, количества введений и/или интервала дозирования (количества введений в пределах конкретного периода). Лечение с использованием композиции для клеточной терапии по изобретению можно осуществлять для людей или не относящихся к человеку позвоночных.

[0151]

-Способ консервирования-

Способ консервирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники по изобретению, представляет собой криоконсервирование популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники во время присутствия в нерасщепленной ткани. Это делает возможным поддержание состояния, в котором Tie2 является активированным и/или экспрессированным, или предотвращение уменьшения количества положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток.

[0152]

По существу такие же технические материалы, как описанные выше применительно к первому способу культивирования, являются применимыми к техническим материалам, включенным в способ консервирования по изобретению. Например, способ криоконсервирования и/или необязательно используемый криопротектор можно использовать для нерасщепленной ткани, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники. В основном и по существу то же самое является применимым к общепринятой популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, выделенные из ткани посредством обработки для расщепления.

[Примеры]

[0153]

Культуральная среда, используемая для каждой ступени на «стадии культивирования для размножения» в примерах (что обозначено как «культуральная среда для стадии культивирования для размножения» в следующих примерах), представляла собой культуральную среду, полученную посредством смешивания 60 мл DMEM (без глюкозы, Wako) и 40 мл MEMα (Nacalai Tesque), и посредством добавления 20% FBS непосредственно перед использованием, в то время как дополнительный компонент(ы), показанный в каждой таблице в примерах, дополнительно добавляли (+) или не добавляли (-).

[0154]

Культуральная среда, используемая для каждой ступени на «стадии культивирования для дифференцировки» в примерах (что обозначено как «культуральная среда для стадии культивирования для дифференцировки» в следующих примерах), представляла собой культуральную среду, полученную посредством смешивания 60 мл DMEM (без глюкозы, Wako) и 40 мл F10 (Gibco), посредством добавления 1 мкл 2-меркаптоэтанола, 6 мкл селенистой кислоты (0,01%), 1,5 мл аскорбиновой кислоты (5 мг/мл) и 5 мл 30% BSA, и посредством дополнительного добавления 30% FBS непосредственно перед использованием, в то время как дополнительный компонент(ы), обозначенный в каждой таблице в примерах, добавляли (+) или не добавляли (-).

[0155]

[Тестовый пример 1] стадия культивирования для размножения: первая ступень культивирования (способ WTC)

[Таблица 1]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения (7 суток)
Тестовый пример	Дополнительный компонент для получения культуральной среды	Способ культивирования
1-1	10 нг/мл bFGF	Способ WTC
1-2	-	Способ WTC
1-3	10 нг/мл bFGF	Способ двумерного культивирования
1-4	-	Способ двумерного культивирования

[0156]

Ткань пульпозного ядра межпозвоночного диска, вырезанную из пораженной части каждого пациента с позвоночной грыжей (женщины в возрасте 32 лет, женщины в возрасте 28 лет или мужчины в возрасте 20 лет) тонко нарезали на кубики размером несколько мм с использованием ножниц и других инструментов. Затем, 0,1-0,5 г тонко нарезанной ткани пульпозного ядра, содержащей популяцию клеток, суспендировали в 3 мл культуральной среды, полученной таким образом, что дополнительный компонент, обозначенный в таблице 1, добавляли в культуральную среду для стадии культивирования для размножения. Впоследствии, смесь распределяли по одной лунке 6-луночного культурального планшета (культуральная поверхность являлась необработанной), и культивировали в течение 7 суток (посредством способа WTC). В качестве контроля, измельченную ткань пульпозного ядра не культивировали, как ранее, но расщепляли с использованием коллагеназы, в соответствии с общепринятым способом. Полученную в результате выделенную популяцию клеток собирали. Затем, популяцию клеток культивировали, в то время как остальные условия являлись по существу такими же, как в способе WTC.

[0157]

После культивирования, популяцию клеток собирали, и количество клеток и интенсивность флуоресценции клеток, положительных по экспрессии Tie2 на клеточной поверхности, измеряли посредством проточной цитометрии (FCM). Затем рассчитывали соотношение (частоту положительных по Tie2) количества клеток в полной популяции клеток и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). В способе FCM, использовали флуоресцентно меченное средство, которое представляло собой комплекс антитела против Tie2 человека и флуоресцентного красителя аллофикоцианина (Anti-Tie-2, Human, Mouse-Mono (87315); Allophicocyanin, кат. #: FAB 3131A; R&D Inc.).

[0158]

На фиг. 2 и 3 показаны результаты. Например, сравнивают Тестовые примеры 1-1 и 1-3. Оба результата показывают, что Тестовый пример 1-1 имел значимо более высокие значения (фиг. 2: p < 0,05; фиг. 3: p < 0,01; t-критерий использовали для обоих). Обнаружено, что способ WTC проявляет эффект увеличения экспрессии Tie2.

[0159]

[Тестовый пример 2] Стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень

[Таблица 2]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения
	Ступень 1 (14 суток)		Ступень 2 (7 суток)
	Дополнительный компонент	Способ культивирования	Дополнительный компонент
2-1	10 нг/мл bFGF	Способ WTC	10 нг/мл bFGF
2-2	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF

[0160]

Сначала, 1 мг коммерчески доступного порошка корицы суспендировали в 1 мл дистиллированной воды и экстрагировали в течение ночи при 37°C. Полученный в результате экстракт (экстракт корицы) использовали в этом тексте.

[0161]

По существу такую же ступень культивирования, как в [Тестовом примере 1] (Тестовые примеры 1-1 и 1-2) повторяли, за исключением того, что пациенты с позвоночной грыжей, от которых собирали ткань пульпозного ядра межпозвоночного диска, представляли собой женщину в возрасте 16 лет, женщину в возрасте 28 лет и женщину в возрасте 38 лет, культуральную среду получали таким образом, что дополнительный компонент, обозначенный в таблице 2, добавляли в культуральную среду для стадии культивирования для размножения, и использовали на первой ступени на стадии культивирования для размножения, и период культивирования составлял 14 суток.

[0162]

После первой ступени культивирования, «коллагеназу-P» (конечная концентрация: 0,025%), изготовленную в Roche, добавляли в культуральную среду для диспергирования ткани пульпозного ядра. Популяцию клеток, выделенную из ткани пульпозного ядра, собирали и суспендировали при плотности 1,0×10⁴/3 мл в содержащей 20% FBS MEM α. Затем, смесь распределяли по одной лунке 6-луночного культурального планшета (культуральная поверхность являлась необработанной), и затем добавляли 10 нг/мл bFGF. Затем, популяцию клеток дополнительно культивировали в течение 7 суток (всего 21 суток).

[0163]

После культивирования, популяцию клеток собирали. Способ FCM, подобно [Тестовому примеру 1], использовали для измерения каждого из частоты клеток, положительных по экспрессии Tie2 на клеточной поверхности, или количества клеток, полученных из 1 г ткани. На фиг. 4 и 5 показаны результаты.

[0164]

[Тестовый пример 3] Стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования

[Таблица 3]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения			Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Ступень 1 (14 суток)		Ступень 2 (7 суток)	Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Дополнительный компонент	Способ культивирования	Дополнительный компонент	Культуральное оборудование
3-1	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL
3-2	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Без покрытия

[0165]

Две ступени на стадии культивирования для размножения осуществляли в течение всего 21 суток посредством по существу такого же способа, как в Тестовом примере 2, за исключением того, что пациенты с позвоночной грыжей, от которых собирали ткань пульпозного ядра межпозвоночного диска, представляли собой женщину в возрасте 16 лет, мужчину в возрасте 30 лет и женщину в возрасте 30 лет. После культивирования, популяцию клеток собирали. В ступени на стадии культивирования для дифференцировки, осуществляли монослойное культивирование в течение 14 суток на культуральной чашке, покрытой поли-L-лизином (PLL) (Тест 3-1) или культуральной чашке без покрытия PLL (Тестовый пример 3-2).

[0166]

После культивирования, популяцию клеток собирали. Затем, проточную цитометрию (FCM) использовали для измерения количества клеток, положительных по внутриклеточному коллагену типа II (Col2). Затем рассчитывали соотношение (частоту положительных по Col2) количества клеток в полной популяции клеток. Популяцию клеток обрабатывали заранее с использованием реагента для обработки мембраны для повышения проницаемости «IntraPrep» (Beckman Coulter, Inc.), так что Col2 в клетках можно было флуоресцентно метить. В способе флуоресцентного мечения Col2, антитело мыши против Col2 человека (Anti-hCL (II) (очищенный IgG), кат. #: F-57; KYOWA PHARMA CHEMICAL CO., LTD. (ранее First Fine Chemical, Inc.)) использовали в качестве первичного антитела. Комплекс антитела козы против IgG мыши и флуоресцентного красителя FITC (BD, Goat Anti-Mouse Ig FITC, кат. #: 349031) использовали в качестве вторичного антитела. На фиг. 6 показаны результаты. Кроме того, принимали, что все происходящие из 1 г ткани пульпозного ядра клетки подвергали культивированию/размножению в соответствии с Тестовым примером 2, и затем культивированию/дифференцировке в соответствии с Тестовым примером 3. Рассчитывали количество положительных по Col2 клеток в этом случае. На фиг. 7 показаны результаты. Когда использовали третью ступень культивирования (Тест 3-1), количество положительных по Col2 клеток было приблизительно в 3 раза выше, чем в случае, когда третью ступень культивирования не использовали (Тест 3-2).

[0167]

Следует отметить, что способ FCM использовали для измерения количества клеток, положительных по экспрессии внутриклеточного протеогликана (PG). Затем рассчитывали соотношение (частоту положительных по PG) количества клеток в полной популяции клеток. В способе флуоресцентного мечения PG, антитело мыши против PG человека (Anti-Cartilage Proteoglycan Antibody, adult, clone EFG-4, кат. #: MAB 2015; EMD Millipore) использовали в качестве первичного антитела. Комплекс антитела козы против IgG мыши и флуоресцентного красителя FITC (BD, Goat Anti-Mouse Ig FITC, кат. #: 349031) использовали в качестве вторичного антитела. В результате, независимо от использования третьей ступени культивирования (покрытия PLL), частота положительных по PG была близкой к 100% в обоих случаях, и значимого различия не наблюдали (не показано). В отличие от случая протеогликана, в случае функциональных клеток пульпозного ядра, экспрессирующих коллаген типа II, являлось сложным увеличивать количество клеток в конечной популяции клеток общепринятыми способами. В отличие от этого, это делали возможным посредством комбинирования первой-второй ступени культивирования и третьей ступени культивирования по изобретению. Показано, что этот способ культивирования являлся превосходным.

[0168]

[Тестовый пример 4] Стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования

[Таблица 4]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения			Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Ступень 1 (14 суток)		Ступень 2 (7 суток)	Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Дополнительный компонент	Способ культивирования	Дополнительный компонент	Культуральное оборудование	Дополнительный компонент
4-1	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Коллагеназа-P 0,0125%
4-2	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Либераза 0,5%
4-3	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Нет

[0169]

Две ступени на стадии культивирования для размножения осуществляли в течение всего 21 суток посредством по существу такого же способа, как в Тестовом примере 2. После культивирования, популяцию клеток собирали. В ступени на стадии культивирования для дифференцировки, популяцию клеток культивировали в течение 14 суток в пробирке, покрытой поли-L-лизином (PLL), в то время как используемая культуральная среда представляла собой культуральную среду для стадии культивирования для дифференцировки, где в среду добавляли дополнительный компонент, обозначенный в таблице 4.

[0170]

После культивирования, популяцию клеток собирали. Затем частоту положительных по PG рассчитывали по существу таким же способом, как в [Тестовом примере 3]. На фиг. 8 показаны результаты. Частота положительных по PG была значимо выше в случаях добавления любой из двух различных коллагеназ, чем в случае без добавления какой-либо коллагеназы.

[0171]

Для каждого из Тестовых примеров 4-1-4-3, дополнительно получали 6 образцов (пациенты с позвоночной грыжей, от которых собирали ткань пульпозного ядра межпозвоночного диска, представляли собой женщину в возрасте 32 лет, женщину в возрасте 28 лет, мужчину в возрасте 20 лет, женщину в возрасте 16 лет, женщину в возрасте 28 лет и женщину в возрасте 38 лет). Частоту положительных по Col2 затем рассчитывали по существу таким же способом, как в [Тестовом примере 3]. На фиг. 9 показаны результаты. Присутствовало различие между образцами (различие между индивидуумами, от которых собирали ткань пульпозного ядра диска). Обнаружено, что частота положительных по Col2 была выше в 4 из 6 образцов, то есть, в случаях добавления любой одной или обеих из двух различных коллагеназ, чем в случае без добавления какой-либо коллагеназы.

[0172]

[Тестовый пример 5] Стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования; часть 2

[Таблица 5]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения			Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Ступень 1 (14 суток)		Ступень 2 (7 суток)	Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Дополнительный компонент	Способ культивирования	Дополнительный компонент	Культуральное оборудование	Дополнительный компонент
5-1	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Без покрытия	Коллагеназа-P 0,025%
5-2	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие GEL	Коллагеназа-P 0,025%
5-3	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col1	Коллагеназа-P 0,025%
5-4	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col4	Коллагеназа-P 0,025%
5-5	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие FN	Коллагеназа-P 0,025%
5-6	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Коллагеназа-P 0,025%
5-7	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Без покрытия	Коллагеназа-P 0,0125%
5-8	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие GEL	Коллагеназа-P 0,0125%
5-9	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col1	Коллагеназа-P 0,0125%
5-10	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col4	Коллагеназа-P 0,0125%
5-11	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие FN	Коллагеназа-P 0,0125%
5-12	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Коллагеназа-P 0,0125%

[0173]

Ступени на стадии культивирования для размножения и стадии культивирования для дифференцировки осуществляли по существу таким же способом, как в Тестовом примере 4, за исключением того, что покрывающее средство для культурального оборудования и/или дополнительный компонент (коллагеназу P), добавляемый в культуральную среду на стадии культивирования для дифференцировки, меняли, как обозначено в таблице 5. Затем измеряли частоту положительных по PG и частоту положительных по Col2. На фиг. 10 показаны результаты. Например, в случае добавления «коллагеназы P» в культуральную среду, обнаружено, что использование покрывающего средства, содержащего Col4 (коллаген типа IV), FN (фибронектин) или PLL (поли-L-лизин), в качестве покрывающего средства, в частности, покрывающего средства, содержащего PLL, предпочтительно увеличивало частоту положительных по Col2, хотя и в зависимости от концентрации.

[0174]

[Тестовый пример 6] Стадия культивирования для размножения (две ступени): первая-вторая ступень культивирования+дополнительная ступень -> стадия культивирования для дифференцировки: третья-четвертая ступень культивирования; часть 3

[Таблица 6]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения			Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Ступень 1 (14 суток)		Ступень 2 (7 суток)	Стадия культивирования для дифференцировки (14 суток)
	Дополнительный компонент	Способ культивирования	Дополнительный компонент	Культуральное оборудование	Дополнительный компонент
6-1	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Без покрытия	Либераза 1,0%
6-2	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие GEL	Либераза 1,0%
6-3	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col1	Либераза 1,0%
6-4	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col4	Либераза 1,0%
6-5	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие FN	Либераза 1,0%
6-6	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Либераза 1,0%
6-7	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Без покрытия	Либераза 0,5%
6-8	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие GEL	Либераза 0,5%
6-9	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col1	Либераза 0,5%
6-10	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие Col4	Либераза 0,5%
6-11	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие FN	Либераза 0,5%
6-12	Экстракт корицы	Способ WTC	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL	Либераза 0,5%

[0175]

Ступени на стадии культивирования для размножения и стадии культивирования для дифференцировки осуществляли по существу таким же способом, как в Тестовом примере 4, за исключением того, что покрывающее средство для культурального оборудования и/или дополнительный компонент (либеразу), добавляемый в культуральную среду на стадии культивирования для дифференцировки, меняли, как обозначено в таблице 6. Затем измеряли частоту положительных по PG и частоту положительных по Col2. На фиг. 11 показаны результаты. Например, в случае добавления «либеразы» в культуральную среду, обнаружено, что использование покрывающего средства, содержащего Col4 (коллаген типа IV) или PLL (поли-L-лизин), в качестве покрывающего средства, предпочтительно увеличивало частоту положительных по Col2, хотя и в зависимости от концентрации.

[0176]

[Тестовый пример 7] Стадия культивирования для дифференцировки: третья ступень культивирования

[Таблица 7]

Тестовый пример	Стадия культивирования для размножения			Стадия культивирования для дифференцировки (6-7 суток)
	Ступень 1 (8-9 суток)		Ступень 2 (6-8 суток)	Стадия культивирования для дифференцировки (6-7 суток)
	Дополнительный компонент	Способ культивирования	Дополнительный компонент	Культуральное оборудование
7-1	10 нг/мл bFGF	Способ двумерного культивирования	10 нг/мл bFGF	Покрытие PLL
7-2	10 нг/мл bFGF	Способ двумерного культивирования	10 нг/мл bFGF	Без покрытия

[0177]

В этом тесте, подобно контролю из Тестового примера 1 (т.е. первому способу культивирования по изобретению: способ WTC не использовали), использовали популяцию клеток, выделенную из ткани пульпозного ядра от каждого пациента с позвоночной грыжей посредством обработки для расщепления с использованием коллагеназы. Эту популяцию клеток культивировали в содержащей 10 нг/мл bFGF культуральной среде для стадии культивирования для размножения (второй способ культивирования по изобретению не использовали, и экстракт корицы, как в Тестовом примере 2, не добавляли) в течение 8-9 суток (в ходе первой ступени) и 6-8 суток (в ходе второй ступени).

[0178]

Затем, популяцию клеток, содержащую положительные по Ti2 стволовые клетки/-предшественники, полученные из пульпозного ядра и размноженные и культивированные, как описано выше (первый и/или второй способ(ы) культивирования по изобретению не использовали на стадии культивирования для размножения), подвергали ступени на основании третьего способа культивирования на стадии культивирования для дифференцировки по изобретению. На этой ступени, как, например, в примере 3, осуществляли монослойное культивирование на культуральной чашке, покрытой поли-L-лизином, в течение 6-7 суток.

[0179]

После культивирования, популяцию клеток собирали. Частоту положительных по Tie2 и общее количество положительных по Tie2 клеток измеряли по существу таким же способом, как в Тестовых примерах 1 и 2. Кроме того, частоту положительных по Col2 измеряли по существу таким же способом, как, например, в Тестовом примере 3. Результаты показаны на фиг. 13 (частота положительных по Tie2), фиг. 14 (общее количество положительных по Tie2 клеток) и фиг. 15 (частота положительных по Col2). Обнаружено, что третий способ культивирования по изобретению проявляет эффект увеличения частоты положительных по Tie2, общего количества положительных по Tie2 клеток и частоты положительных по Col2, даже в варианте осуществления, в котором третий способ культивирования не используют в комбинации с первым и/или вторым способами культивирования.

Claims

1. Способ получения популяции клеток, содержащей стволовые клетки и/или клетки-предшественники, положительные по экспрессии Tie2 (тирозинкиназы с доменами, гомологичными Ig и EGF 2) (далее обозначенные как «положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники»), происходящие из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, включающий:

стадию культивирования для размножения для усиления экспрессии Tie2 в положительных по Tie2 стволовых клетках/-предшественниках и размножения положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток,

при этом стадия культивирования для размножения включает ступень осуществления способа культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники во время присутствия в нерасщепленной ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, в которой сохранены факторы роста, такие как ангиопоэтин-1 (Ang-1) и VEGF-A (далее способ обозначен как «первый способ культивирования»), и

где стадия культивирования для размножения дополнительно включает ступень выделения популяции клеток после культивирования, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники.

2. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что стадия культивирования для размножения дополнительно включает ступень осуществления способа культивирования популяции клеток, включающей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей по меньшей мере один тип усилителя экспрессии Tie2, отличный от факторов роста (далее способ обозначен как «второй способ культивирования»),

где усилитель экспрессии Tie2, отличный от факторов роста, представляет собой экстракт, полученный из растения рода Cinnamomum, и/или экстракт плода оливы.

3. Способ получения по п.1, в котором ткань получена посредством размораживания криоконсервированной ткани.

4. Способ получения по п.1, в котором сохраняется состояние, при котором положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники являются активированными и/или экспрессированными, или подавляется уменьшение количества положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в популяции клеток в криоконсервированной ткани нерасщепленной ткани.

5. Способ получения из популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, происходящие из ткани пульпозного ядра межпозвоночного диска, популяции клеток, содержащей целевые клетки, полученные в результате дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников, включающий по меньшей мере:

где стадия культивирования для размножения дополнительно включает ступень выделения популяции клеток после культивирования, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники; и

стадию культивирования для дифференцировки для индукции дифференцировки из положительных по Tie2 стволовых клеток/-предшественников в целевые клетки после стадии культивирования для размножения.

6. Способ получения по п.5, в котором стадия культивирования для размножения дополнительно включает ступень культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, в культуральной среде, содержащей, в качестве усилителя экспрессии Tie2, только фактор роста, имеющий эффект увеличения экспрессии Tie2.

7. Способ получения по п.5, в котором стадия культивирования для размножения дополнительно включает ступень осуществления способа культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с использованием культурального оборудования с культуральной поверхностью, подвергнутой обработке для увеличения прикрепления клеток (далее способ обозначен как «третий способ культивирования»).

8. Способ получения по п.7, в котором обработка для увеличения прикрепления клеток третьего способа культивирования на стадии культивирования для размножения представляет собой обработку нанесения покрывающего средства, содержащего внеклеточный матрикс и/или полиаминокислоту.

9. Способ получения по п.5, в котором стадия культивирования для дифференцировки включает ступень осуществления третьего способа культивирования и/или осуществления способа культивирования популяции клеток, содержащей положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, с супрессией в то же время формирования сферических колоний, в культуральной среде, содержащей средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса (далее способ обозначен как «четвертый способ культивирования»).

10. Способ получения по п. 9, в котором обработка для увеличения прикрепления клеток в третьем способе культивирования на стадии культивирования для дифференцировки представляет собой обработку нанесением покрывающего средства, содержащего внеклеточный матрикс и/или полиаминокислоту.

11. Способ получения по п.8 или 10, в котором внеклеточный матрикс и/или полиаминокислота в третьем способе культивирования, выбрана из группы, состоящей из коллагена, фибронектина, желатина, ламинина и полилизина.

12. Способ получения по п.9, в котором средство, осуществляющее деградацию внеклеточного матрикса, в четвертом способе культивирования содержит по меньшей мере протеазу, имеющую активность для деградации коллагена типа II.

13. Способ получения по п.5, в котором целевые клетки представляют собой клетки, экспрессирующие по меньшей мере коллаген типа II.

14. Способ получения по п.5, в котором клетки, экспрессирующие по меньшей мере коллаген типа II, представляют собой клетки пульпозного ядра.

15. Способ получения по п.9, в котором популяцию клеток, в которой остаются положительные по Tie2 стволовые клетки/-предшественники, получают посредством стадии культивирования для дифференцировки.