RU2843610C1 - Полинуклеотидная вакцина и способ струйной безыгольной ее доставки в организм - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к полинуклеотидной вакцине, способу струйной безыгольной ее доставки в организм и может быть использовано в генетической инженерии, биотехнологии и медицине. Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение иммуногенности и снижения реактогенности вакцины против инфекции COVID-19 за счет использования оголенных молекул ДНК-RBD или мРНК-C1-RBD и оптимизации параметров струйной безыгольной доставки ее в организм индивидуума. 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 7 пр.

Description

Изобретение относится к полинуклеотидной вакцине, способу струйной безыгольной ее доставки в организм и может быть использовано в иммунологии, генетической инженерии, биотехнологии и медицине.

Распространение высокопатогенных и пандемических опасных вирусов стимулировало разработку ДНК- и мРНК-вакцин. Поскольку такая платформа позволяет очень быстро перейти на выпуск массового производства новой вакцины с учетом актуальных штаммов вируса. Несмотря на все преимущества ДНК- и мРНК-вакцин, они имеют низкую иммуногенность при введении в виде «голой» молекулы. На момент пандемии временным решением стали липидные наночастицы. Однако компоненты липосом дорогие и могут вызывать побочные эффекты, а технология получения, хранения и транспортировки представляют определенные трудности. В попытках найти перспективную альтернативу был изучен широкий спектр стратегий, в частности особый интерес представляет безыгольная инжекция.

Изобретение относится к физическому методу доставки ДНК- и мРНК-вакцин, многократно усиливающая их иммуногенные свойства, и может быть использовано в области медицины и иммунологии.

За последние несколько лет в области вакцин на основе нуклеиновых кислот было достигнуты впечатляющие успехи. ДНК- и мРНК-вакцины становятся перспективной альтернативой другим типам вакцин, основанных на живом или инактивированном вирусе, векторных вакцин, субъединичных белках, вирусоподобных частицах и др. Эти вакцины продемонстрировали высокую эффективность (способность индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунитет) и весьма приемлемую безопасность. Конструирование плазмиды, получение штамма-продуцента, ферментацию и очистку плазмиды можно осуществить в течение 2-4 недель. Технология производства таких вакцин не требует сложных манипуляций или работы с опасными патогенами, что значительно облегчает процесс их создания и снижает его общую стоимость.

Известны безыгольные средства доставки вакцин: патент RU2733424, RU2474437 и US2007/0293447. В частности, в патенте RU2474437 используются средства предотвращения перекрестного инфицирования за счет сдувания потоком газа, что не может в полной мере обезопасить использование устройства, но при этом усложняет и удорожает процедуру. В патентах RU2733424, RU2008932 и US2007/0293447 используется классическая процедура струйной инжекции, не имеющая защиты от перекрестного заражения.

Известна электропорация (ЭП) - это физический метод, который приводит к улучшенной доставке крупных молекул через клеточную мембрану (https://translated.turbopages.org/proxy_u/en-ru.ru.d76332f5-66139600-8f53ba5e-74722d776562/https/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27987151/?_уа_mt_enable_static_t_ranslations=1). В случае плазмидной ДНК и мРНК электропорация усиливает как поглощение, так и экспрессию доставляемых нуклеиновых кислот. Мышца является привлекательной тканью для вакцинации нуклеиновыми кислотами в клинических условиях благодаря доступности и обилию ткани-мишени.

Известно использование липидных наночастиц (патент США №10703789, МПК А61 К 39/395, опубл. 07.07.2020), содержащих мРНК-вакцины против COVID-19, которыми за последние 3 года вакцинировано более миллиарда человек. Несмотря на то, что доставка мРНК с помощью липосом оказалась весьма эффективной, вскрылись их определенные недостатки, связанные как со сложностью хранения и логистики таких вакцин (при -80°С), так и с побочными поствакцинальными явлениями. Считается, что эти явления связаны с природой липидов. В частности, катионные липосомы могут прикрепляться к поверхности клетки, тем самым способствуя невозвратной дестабилизации плазматической мембраны, вызывая побочные эффекты у вакцинированного человека. Они могут вызывать аллергическую реакцию.

Кроме того, описаны случаи реакций, характеризующихся перикардитом, миокардитом, лицевым параличом и другими симптомами.

Вакцины на основе мРНК считаются перспективной платформой, однако имеется альтернатива в виде ДНК-вакцин. Важно признать, что оба подхода имеют определенные преимущества и недостатки, которые могут быть важны для решения различных задач в медицине.

Одним из недостатков вакцин на основе нуклеиновых кислот является их низкая иммуногенность. Внутримышечное введение «оголенных» мРНК и ДНК-вакцин с помощью шприца с иглой, неэффективно, поскольку обеспечивает низкий уровень иммунного ответа. Для повышения иммуногенности используют различные методы доставки, включая липосомы, катионные полимеры, цитокины, белки и др. Доставка с помощью струйной инжекции позволяет избавиться от многих недостатков, имеющихся у химических методов, в частности, касающихся токсичности соединений, используемых для доставки и возникновение проапоптических реакций в клетках. Благодаря использованию метода струйной инжекции, с одной стороны повышается иммуногенность «голых» мРНК и ДНК-вакцин, а с другой стороны уменьшается их реактогенность, поскольку они не содержат дополнительных компонентов, что в свою очередь сказывается на снижении стоимость использования метода.

Принцип струйной инжекции связан с изменением напряжения сдвига, что индуцирует образование пор. Через эти поры происходит усиленное поглощение клеткой нуклеиновой кислоты, что приводит значительному увеличению иммуногенности мРНК-вакцин.

Таким образом, безыгольные струйные инжекторы нового поколения предлагают несколько важных преимуществ по сравнению с традиционной инъекционной доставкой вакцин на основе ДНК и мРНК. Струйная инжекция обычно дает сравнимую с ЭП иммуногенность и повышенный ответ по сравнению с обычной инъекцией, которая иногда может не индуцировать эффективную иммуногенность. Это неудивительно, учитывая, что струйная инжекция может более эффективно доставлять ДНК и мРНК в клетки для производства нужных антигенов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ генетической вакцинации, разработанный немецкой компанией Куревак АГ и включающий введение индивидууму, который нуждается в этом, модифицированной РНК, которая включает одну открытую рамку считывания и модификацию, повышающую экспрессию кодируемого пептида или белка, при этом указанная модификация включает модификацию GC-контента в его кодирующей области по сравнению с кодирующей областью его дикого типа, и заменяют по меньшей мере 5% пригодных для замены кодонов в кодирующей области, кодирующей пептид или белок, повышая тем самым содержание G/C в указанной кодирующей области, но транслируемая аминокислотная последовательность кодирующей области дикого типа сохранена, с помощью безыгольной инъекции (патент РФ №2733424, C12N15/68, опубл. 01.10.2020).

Однако в патенте-прототипе технический результат (повышение экспрессии белка, кодируемого молекулой мРНК, которую используют для генетический вакцинации морских свинок с помощью безыгольной струйной инъекции) достигается в модельном эксперименте на вакцине, содержащей мРНК RSV-F для профилактики респираторно-синцитиальной вирусной инфекции, а параметры струйной инъекции имеют широкий неоптимизированный диапазон:

- скорость выхода струи жидкости от 60-150 м/сек;

- диаметр отверстия насадки составляет от 20 до 600 мкм;

- продолжительность инъекции составляет от 0,1 до 1 сек.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение иммуногенности и снижения реактогенности вакцины против инфекции COVID-19 за счет использования оголенных молекул ДНК-RBD или мРНК-C1-RBD и оптимизации параметров струйной безыгольной доставки ее в организм индивидуума.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагается применение оголенных молекул плазмидной ДНК pVAX-RBD или оголенных молекул мРНК-C1-RBD в качестве полинуклеотидной вакцины для струйной безыгольной доставки в организм.

Оголенные молекулы плазмидной ДНК pVAX-RBD имеют нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 3710 п. н., молекулярный вес 2,3 МДа, содержащую целевой ген, кодирующий химерный белок 176-RBD, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2:

- векторный фрагмент 1484-754 ДНК-плазмиды pVAX размером 2981 п. н;

- ген устойчивости к неомицину/канамицину (NeoR/KanR) (1944-2738, 795 п. н.) и точка начала репликации ColE1 ori (3064-3652, 589 п. н.), обеспечивающие селекцию и амплификацию целевой плазмиды в клетках бактерий Escherichia coli;

- фрагмент 755-1483 размером 729 п. н., содержащий искусственный ген 176-RBD с инициирующим кодоном ATG.

Молекулы плазмидной ДНК-матрицы для синтеза мРНК pVAX-C1-RBD имеют нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 размером 3864 п. н., молекулярный вес 2,3 МДа, содержащую целевой ген, кодирующий химерный белок 176-RBD, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, перед которым находится промотор РНК-полимеразы фага Т7, обеспечивающий транскрипцию гена, и состоящей из следующих фрагментов:

- векторный фрагмент 1668-641 ДНК-плазмиды pVAX размером 2844 п. н., содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7 (625-641, размером 17 п. н.);

- ген устойчивости к неомицину/канамицину (NeoR/KanR) (2091-2885, 795 п. н.) и точка начала репликации ColE1 ori (3211-3799, 589 п. н.), обеспечивающие селекцию и амплификацию целевой плазмиды в клетках бактерий Escherichia coli;

- фрагмент 642-1661 размером 1020 п. н., содержащий 5'UTR, искусственный ген 176-RBD с инициирующим кодоном ATG, 3'UTR, поли(А)хвост длинной 100 нуклеотидов. Оголенные молекулы мРНК-C1-RBD, индуцирующие SARS-CoV-2-специфические антитела, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, полученные с использованием ДНК-матрицы pVAX-C1-RBD, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, содержащие открытую рамку считывания, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, обеспечивающую синтез и секрецию белка-иммуногена RBD SARS-CoV 2 в организме млекопитающих, и гибридную сигнальную последовательность 176, консенсусную последовательность Козак, 7-метилгуанозиновый кэп на 5'-конце мРНК, полиаденозиновый (поли А) хвост на 3'-конце мРНК, длиной 100 нуклеотидов, и 5'- и 3'-нетранслируемые области (UTR), расположенные перед и после открытой рамки считывания.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе струйной безыгольной инъекции для доставки полинуклеотидной вакцины, усиливающей активацию специфического гуморального и Т-клеточного иммунного ответа, включающем внутримышечное введение полинуклеотидной вакцины в жидкой форме с помощью безыгольного шприца, используя силу упругости упругого элемента для приведения в движение поршня, согласно изобретения, в качестве полинуклеотидной вакцины используют ДНК-вакцину, выполненную в виде оголенных молекул плазмидной ДНК pVAX-RBD, которыми иммунизируют животных в дозе 50-200 мкг, вводимых дважды с интервалом между вакцинациями в 3 недели или мРНК-вакцину по п. 1, выполненную в виде оголенных молекул мРНК-С1-RBD, индуцирующих SARS-CoV-2-специфические антитела, вводимых дважды с интервалом между вакцинациями в 3 недели в дозе 30 мкг мРНК-C1-RBD в 50 мкл PBS с помощью струйного безыгольного инъектора с индивидуальными насадками-соплами, расположенного под прямым углом к участку поверхности для инъекции и обеспечивающего следующие характеристики: скорость струи 220 метров в секунду, давление 6,5 бар, время инжекции 0,33 с.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

На фиг.1, А, Б представлены: (А) нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 молекул плазмидной ДНК pVAX-RBD и (Б) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 химерного белка 176-RBD. На фиг.2, А, Б, В приведены: (А) нуклеотидная последовательность SEQ ID N0:3 молекул ДНК-матрицы pVAX-C1-RBD для синтеза мРНК; (Б) нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:4 молекул мРНК-C1-RBD, кодирующая последовательность белка-иммуногена 176-RBD SARS-COV-2 против SARS-COV-2; (В) аминокислотная последовательность SEQ ID N0:5, обеспечивающая синтез и секрецию белка-иммуногена 176-RBD SARS-CoV 2 в организме млекопитающих. На фиг.3 показаны световые микрофотографии на которых приведены изменения в мышечной ткани мышей, которым вводили ДНК, кодирующую GFP, с использованием различных протоколов струйной инжекции (см. Таблицу 1). Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином: (А) контрольные мыши, (В) протокол №1; (С) Протокол №2; (D) Протокол №3. Мышей, которым инжектировали плазмиду кодирующей GFP, ткань разрезали на срезы толщиной 1 мм. Обозначения: 1 - некроз. На фиг.4 продемонстрированы флуоресцентные микрофотографии мышечной ткани, полученные через 3 дня после иммунизации струйной инжекцией плазмидой GFP. Инъецированные мышцы собирали, а затем разрезали на срезы толщиной 1 мм для визуализации экспрессии GFP: (А) контрольные мыши (без струйной инжекции); (В) Протокол №1; (С) Протокол №2; (D) Протокол №3. На фиг.5 представлено графическое представление интенсивности флуоресценции с использованием компьютерной обработки сигналов. Значимость оценивали с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа Краскала-Уоллиса с поправкой на множественные сравнения и проверки статистических гипотез Данна (** р<0,01, **** р<0,0001). На фиг.6 представлен Анализ иммунного ответа у мышей, иммунизированных разными дозами плазмиды pVAX-RBD (50 мг, 100 мг и 200 мг) с использованием струйного инжектора. (А) Реципрокные титры специфических антител IgG к RBD SARS-CoV-2 определяли с помощью ELISA. (В) Вируснейтрализующую активность определяли с использованием штамма hCoV-19/Australia/VICO 1/2020 и клеток Vero. (С) Количество спленоцитов, высвобождающих IFN-γ, подсчитывали с помощью анализа ELISpot. (D) Пороговый цикл ПНР вирусной нагрузки в тканях легких мышей BALB/c на 4-й день после заражения гамма-вариантом SARS-CoV-2. На всех панелях данные представлены как медиана с размахом. Значимость рассчитывали с использованием непараметрического метода Манна-Уитни (* р<0,01, ** р<0,05). На фиг.7 приведен Анализ иммунного ответа у мышей, иммунизированных разными дозами плазмиды pVAX-RBD (50 мг, 100 мг и 200 мг) с использованием струйного инжектора. (А) Реципрокные титры специфических антител IgG к RBD SARS-CoV-2 определяли с помощью ELISA. (В) Вируснейтрализующую активность определяли с использованием штамма hCoV-19/Australia/VICO 1/2020 и клеток Vero. (В) Пороговый ПЦР-цикл вирусной нагрузки в тканях легких мышей BALB/c на 4-й день после заражения гамма-вариантом SARS-CoV-2. На всех панелях данные представлены как медиана с размахом. Значимость рассчитывалась с использованием непараметрического однофакторного дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса с поправкой на множественные сравнения и критерий статистической гипотезы Данна. (* р<0,01, ** р<0,05). На фиг.8 представлен гуморальный иммунный ответ у мышей BALB/c, иммунизированных мРНК-C1-RBD. А. Титры специфических IgG

антител к RBD в сыворотках иммунизированных животных (данные ИФА). Б. Результаты вируснейтрализации с использованием штамма SARS-CoV-2 nCoV/Victoria/1/2020 (100 TCID50). В. Результаты вируснейтрализации с использованием псевдотипированных вирусов, несущих на своей поверхности S гликопротеин SARS-CoV nCoV/Victoria/1/2020.

На фиг.9 представлены результаты анализа ELISpot специфического для SARS-CoV-2 Т-клеточного опосредованного ответа у иммунизированных мышей BALB/c. М - контрольные (неиммунизированные) мыши; мРНК-С1-RBD - мыши, иммунизированные IM, мРНК-C1-RBD inj - мыши, иммунизированные плазмидой с использованием струйной инжекции. (А) Количество клеток, экспрессирующих IFN-γ в ответ на стимуляцию пулом RBD-специфических пептидов, на 1×10⁶ спленоцитов. (В) Репрезентативные изображения лунок ELISpot (верхний ряд: спленоциты, не стимулированные пептидами; нижний ряд: спленоциты, стимулированные пулом пептидов или митогеном). Значимость оценивали с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса с поправкой на множественные сравнения и проверки статистической гипотезы Данна (* р<0,05). На фиг.10 представлена вирусная нагрузка в тканях легких мышей BALB/c на 4-е сутки после заражения гамма-вариантом SARS-CoV-2. Индивидуальные значения Ct в ОТ-ПЦР реального времени представлены точками; медианы в группах - вершинами гистограмм, с указанием числовых значений Ct в основании гистограмм; границы 95% доверительных интервалов отмечены вертикальными линиями. Статистический анализ проведен с использованием теста Краскела-Уоллиса (** р<0,01, **** р<0,0001).

Ниже приведены примеры конкретного выполнения изобретения.

Пример 1. Дизайн плазмиды pVAX-RBD и наработка и очистка рекомбинантной плазмиды pVAX-RBD.

Дизайн плазмиды pVAX-RBD. Для конструирования иммуногенов использовали последовательность гена, кодирующего полноразмерный белок S SARS-CoV-2 (GenBank Асе. No. MN908947). Для оптимизации состава кодонов, а также вторичной структуры РНК для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих использовали программу GeneOptimizer (https://www.thermofisher.com/ru/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html). Полученную нуклеотидную последовательность синтезировали в ООО "ДНК-синтез" (Россия) и клонировали в составе вектора pGH. Для амплификации фрагмента, кодирующего RBD белка S (320V-542N) и сигнальную последовательность 176 (MMRTLILAVLLVYFCATVHC) на 5'-конце, использовали праймеры: 5'-TAATACGACTCACTATAGGCTAGCCT-3' (прямой) и 5'-AAAAAAGCGGCCGCTCATTAGTTGAAGTTCACGCATTTGTTCTTC-3' (обратный), - и матрицу, содержащую указанный фрагмент. Продукт амплификации встраивали в вектор pVAX ("Thermo Fisher Scientific", США) по сайтам NheI и NotI под немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV). Структуру полученной конструкции подтверждали секвенированием по методу Сэнгера в ЦКП "Геномика" (Россия). В результате была получена ДНК-конструкция pVAX-RBD, кодирующая RBD с сигнальной последовательностью 176, обеспечивающей секрецию нарабатываемого белка из клетки.

Наработка и очистка рекомбинантной плазмиды pVAX-RBD. Клетки Escherichia coli Stb13 трансформировали плазмидами pVAX и pVAX-RBD с помощью хлористого кальция. Наработку плазмидной ДНК для иммунизации проводили в 2.7 л питательной среды LB с добавлением канамицина (25 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяли и очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit ("QIAGEN", Германия) согласно рекомендациям производителя. Данный набор позволяет очень эффективно очистить препарат плазмидной ДНК от бактериальных эндотоксинов. После очистки структуру плазмиды проверяли рестрикционным анализом и спектрофотометрией. В результате, были получена оголенные молекулы плазмидной ДНК pVAX-RBD, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 (фиг.1, А), содержащую целевой ген, кодирующий химерный белок 176-RBD, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (фиг.1, Б). Более подробная информация о рекомбинантной плазмиде pVAX-RBD представлена в патенте РФ №2781294.

Пример 2. Дизайн матрицы для синтеза мРНК pVAX-C1-RBD и наработка и очистка рекомбинантной плазмиды pVAX-C1-RBD.

Дизайн плазмиды pVAX-C1-RBD. Для получения ДНК-матрицы использовали вектор pVAX ("Thermo Fisher Scientific", США). В него встраивали последовательность, содержащую 3'UTR и поли(А)хвост длинной 100 нуклеотидов, необходимые для получения мРНК. Синтез олигонуклеотида, содержащего данные элементы проводили в ООО «БИОССЕТ» (Новосибирск, Россия). Встраивание в плазмиду pVAX проводили по сайтам Psp124BI и PspOMI, в результате получили вектор pVAX-C1.

Для конструирования иммуногенов использовали последовательность гена, кодирующего полноразмерный белок S SARS-CoV-2 (GenBank Асе. No. MN908947). Для оптимизации состава кодонов, а также вторичной структуры РНК для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих использовали программу GeneOptimizer (https://www.thermofisher.com/ru/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html). Полученную нуклеотидную последовательность синтезировали в ООО "ДНК-синтез" (Россия) и клонировали в составе вектора. Для амплификации фрагмента, кодирующего RBD белка S (320V-542N) и сигнальную последовательность 176 (MMRTLILAVLLVYFCATVHC) на 5'-конце, использовали праймеры: 5'- (обратный), - и матрицу, содержащую указанный фрагмент. Прямой праймер содержал в своем составе последовательности Т7 промотора и 5'UTR.

Продукт амплификации встраивали в вектор pVAX-C1 по сайтам Psp124BI и BamHI. Структуру полученной конструкции подтверждали секвенированием по методу Сэнгера в ЦКП "Геномика" (Россия). В результате была получена ДНК-конструкция pVAX-C1-RBD, кодирующая RBD с сигнальной последовательностью 176, обеспечивающей секрецию нарабатываемого белка из клетки. Данная конструкция является ДНК-матрицей для синтеза мРНК.

Наработка и очистка рекомбинантной плазмиды pVAX-C1-RBD. Клетки Escherichia coli StbB трансформировали плазмидами pVAX и pVAX-C1-RBD с помощью хлористого кальция. Наработку плазмидной ДНК для иммунизации проводили в 2.7 л питательной среды LB с добавлением канамицина (25 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяли и очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit ("QIAGEN", Германия) согласно рекомендациям производителя. Данный набор позволяет очень эффективно очистить препарат плазмидной ДНК от бактериальных эндотоксинов. После очистки структуру плазмиды проверяли рестрикционным анализом и спектрофотометрией.

В результате, были получена оголенные молекулы плазмидной ДНК pVAX-C1-RBD, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 (фиг.2, А), содержащую целевой ген, кодирующий химерный белок 176-RBD, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (фиг.2, В). Пример 3. Получение mPHK-CI-RBD

Синтез мРНК кодирующей RBD SARS-COV-2 проводили с линеаризованной и очищенной ДНК-матрицы pVAX-C1-RBD, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 (фиг.2, А), и содержащей промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, 5'UTR, целевой ген RBD, 3'UTR и поли(А)хвост длинной 100 нуклеотидов.

Для конструирования плазмиды использовали фрагмент гена S, соответствующий RBD (320-542 а.о.) (GenBank MN908947). Оптимизацию кодонного состава последовательности проводили с помощью программы GeneOptimizer. science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html). Для обеспечения эффективного транспорта синтезированного белка из клетки к 5'-концу гена был добавлен фрагмент, кодирующий сигнальную последовательность MMRTLILAVLLVYFCATVHC. Реакцию транскрипции проводили с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т7 (БиоЛабМикс, Новосибирск, Россия). Реакционная смесь включала в себя 1 мкг линеаризованной матрицы, Т7 полимеразу с буфером, смесь рибонуклеотидов, в которой уридин был заменен на псевдоуридин или метилпсевдоуридин, аналог структуры кэпа m7GmAmG (БиоЛабМикс, Новосибирск, Россия), ингибитор РНКаз и безнуклеазную воду. Смесь инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С. После инкубации в смесь добавляли 1 мкл ДНКазы, и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С для разрушения ДНК матрицы. Анализ полученного продукта производили с использованием электрофореза в 2% агарозном геле.

В результате, была получена мРНК имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 (фиг.2, Б), которая была способна обеспечить синтез в эукариотической клетке целевого белка RBD с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:5 (фиг.2, В).

Более подробная информация о получении молекул мРНК-C1-RBD содержится в Диссертации автора данной заявки на изобретение Шарабрина С.В. «Разработка экспериментальных мРНК-вакцин против гриппа и COVID-19», на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 1.5.3 - молекулярная биология, биологические науки. Опубликовано на сайте заявителя ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора 01.03.2024.

Пример 4. Способ струйной безыгольной инъекции для доставки полинуклеотидной вакцины

Способ струйной безыгольной инъекции для доставки полинуклеотидной вакцины включает внутримышечное введение полинуклеотидной вакцины в жидкой форме с помощью безыгольного шприца, используя силу упругости упругого элемента для приведения в движение поршня.

4.1. В качестве полинуклеотидной вакцины используют ДНК-вакцину. Вакцина представляет собой оголенные молекулы плазмидной ДНК pVAX-RBD, которыми иммунизируют животных в дозе 50-200 мкг, вводимая дважды с интервалом между вакцинациями в 3 недели. Вакцину вводят с помощью струйного безыгольного инъектора с индивидуальными насадками-соплами, расположенного под прямым углом к участку поверхности для инъекции и обеспечивающего следующие характеристики: скорость струи 220 метров в секунду, давление 6,5 бар, время инжекции 0,33 с.

4.2. В качестве полинуклеотидной вакцины используют мРНК-вакцину. Вакцина представляет собой оголенные молекулы mPHK-C1-RBD, индуцирующие SARS-CoV-2-специфические антитела, вводимая дважды с интервалом между вакцинациями в 3 недели в дозе 30 мкг мРНК-C1-RBD в 50 мкл PBS. Вакцину вводят также с помощью струйного безыгольного инъектора с индивидуальными насадками-соплами, расположенного под прямым углом к участку поверхности для инъекции и обеспечивающего следующие характеристики: скорость струи 220 метров в секунду, давление 6,5 бар, время инжекции 0,33 с.

4.3. Разработка протокола струйной инжекции

Оптимальные параметры доставки ДНК- или мРНК-вакцины определили на примере модельной плазмиды phMGFP с помощью устройства безыгольного струйного инжектора. Для выбора оптимального протокола доставки плазмиды phMGFP было выделено 4 группы мышей, состоящих из 10 животных: 3 экспериментальные группы и одна контрольная (таблица 1).

Плазмиду вводили в мышцу левой задней лапы мышей (30 мкг в 50 мкл PBS/доза/мышь) с использованием опытного образца безыгольного струйного инжектора. Струйную инжекцию предлагается проводить с использованием образца инжектора (многоразовый, компактный, с пружинным механизмом, кнопкой впрыска, имеющий размеры 13*2*7,17 см и весом 110 г ±5%) с оптимальными характеристиками: скорость струи 220 метров в секунду, давление 6,5 бар, время инжекции 0,33 сек используя индивидуальные насадки-сопло (одноразовая упаковка, стерилизация гамма-лучами, одноразовое использование, диаметр 0,95 см, длина 4,7 см, вес 3,8 г. ). В настоящем примере использован струйный инжектор COMFORT-IN (Mika Medical, Китай).

Для оценки степени поражения проводили гистологический анализ препаратов кожи с прилежащими мышцами; образцы брали в месте инъекции на 2-й день после струйной инжекции.

Степень гистопатологических изменений зависела от используемого протокола показано на фиг.3А-Г (Световые микрофотографии образцов мышиной ткани, показывающие гистологические изменения с различными протоколами струйной инжекции). Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином: (а) контрольные мыши, (б) протокол №1; (в) Протокол №2; (г) Протокол №3. Мышей, которым инжектировали плазмиду GFP и ткань разрезали на срезы толщиной 1 мм. Обозначения: 1 - умеренная инфильтрация.

В группе животных, иммунизированных по протоколу №1 и №2, как и в контроле, патогистологические изменения отсутствовали. В группе животных, вакцинированных по протоколу №3, после струйной инжекции наблюдали умеренную инфильтрацию подкожно-жирового слоя.

Флуоресценцию GFP оценивали на 3-й сутки после струйной инжекции с помощью УФ-микроскопии тонких срезов мышечной ткани животных, поскольку именно в этот период начинается интенсивная флуоресценция GFP. Репрезентативные микрофотографии показаны на фиг.4а-г (Флуоресцентные микрофотографии мышечной ткани, полученные через 3 дня после иммунизации струйной инжекцией плазмидой GFP). Инжектированные мышцы собирали, а затем разрезали на срезы толщиной 1 мм для визуализации экспрессии GFP: (а) контрольные мыши (без струйной инжекции); (б) Протокол №1; (в) Протокол №2; (г) Протокол №3.

Для количественной оценки флуоресценции GFP провели компьютерную обработку для определения интенсивности флуоресценции зеленого флуоресцентного белка в срезах мышц мышей BALB/c с использованием условного значения GFP+волокон, как описано ранее фиг.3 (Графическое представление интенсивности флуоресценции с использованием компьютерной обработки сигналов). Значимость оценивали с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа Краскала-Уоллиса с поправкой на множественные сравнения и проверки статистических гипотез Данна (** р<0,01, **** р<0,0001).

Как показано на фиг.4 и фиг.5, наибольшее количество волокон с флуоресценцией GFP было зарегистрировано у мышей, иммунизированных по протоколу №3. Интенсивность сигнала GFP в этой группе мышей статистически значимо отличалась от группы контрольных животных и протокола №1. Но с учетом, что протокол №3 вызывал незначительные гистологические повреждения, было решено выбрать протокол №2.

В результате экспериментов были определены следующие условия струйной инжекции, а именно давление в инжекторе 6,5 бар, которое обеспечивало скорость струи 220 метров в секунду и время инжекции 50 мкл раствора 0,33 мс. Инжекция РНК в таких условиях не приводила к возникновению серьезного поражения ткани и последующей воспалительной реакции и обеспечивала высокий уровень экспрессии GFP.

Пример 5. Иммунизация мышей ДНК-вакциной pVAX-RBD с использованием струйной инъекции значительно повышающей иммунный ответ против SARS-COV-2.

Работа с животными проводилась в соответствии с «Методическими указаниями по уходу и использованию лабораторных животных». Протоколы одобрены Институциональной комиссией по уходу и использованию животных (IACUC) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (номер разрешения: НИЦ ВБ «Вектор»/02-03.2023, режим доступа: 03.04.2023). Для оценки иммуногенности созданных конструкций использовали самок мышей BALB/c массой 16-18 г.

Для эксперимента мышей разделили на три группы по 16 животных в каждой и иммунизировали следующим образом: группа pVAX-RBD, 100 мкг pVAX-RBD вводили внутримышечно; группа pVAX-RBD для инъекций: 100 мкг pVAX-RBD, вводимый с помощью струйного инжектора; интактная группа, без иммунизации. Мышей иммунизировали дважды с интервалом 3 недели между иммунизациями. Через четырнадцать дней после второй иммунизации у шести мышей из каждой группы брали кровь для анализа гуморального иммунного ответа и собирали селезенку для анализа клеточного ответа. Десять мышей из каждой группы заражали живым вирусом.

ИФА сыворотки. В качестве антигенов для ELISA использовали эукариотический белок RBD, любезно предоставленные лабораторией иммунохимии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора (Россия). Белок RBD (1 мкг / мл) адсорбировали в лунках 96-луночного планшета в PBS (Greiner_bio one, Германия) при 4 ⁰ С в течение 12 часов, затем промывали PBST и блокировали с 1% раствором казеина в промывочном буфере в течение 60 минут при комнатной температуре. После этого образцы сыворотки добавляли в трехкратном серийном разведении, начиная с 1:50, и инкубировали в течение 60 минут при 37°С. После промывания добавляли кроличьи антитела против мышиного IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США), и инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Планшет промывали и добавляли к нему раствор субстрата ТМВ (Amresco, США). После остановки реакции стоп-раствором оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм с помощью считывающего устройства для ELISA (ChroMate Awareness Technology inc., США).

Нейтрализующая активность иммунных сывороток. В работе использован штамм коронавируса 2019-nCoV nCoV / Victoria / 1/2020 (Государственная коллекция возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН, ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора, РФ). Рабочая доза вируса составила 100 ЦПД₅₀. Для оценки эффективности нейтрализующей активности сывороток готовили их серийные двукратные разведения, начиная с разведения от 1:10 до 1: 1000. Для разведения сывороток использовали среду MEM с глутамином и добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ЕД / мл, стрептомицин-100 мкг / мл). Смесь разведений сыворотки и рабочего разведения вируса готовили в равных объемах. Смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем добавляли в лунки 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток Vero Е6. Чашки инкубировали в течение 4 дней при 37°С, 5% CO2. Для окрашивания клеток в каждую лунку планшета добавляли 150 мкл 0,2% раствора генцианвиолета (добавляли 1 г генцианвиолета в 20 мл 96% этанола, 120 мл 40% формалина и 350 мл раствора Хенкса). Через 30 минут жидкость из лунок удалили и промыли водой. Результаты регистрировались визуально. Любое специфическое повреждение клеточной культуры в лунке считалось цитопатическим эффектом вируса. Нейтрализующую активность сывороток иммунизированных животных оценивали по титру (разведению) сывороток, при котором регистрировали защиту в 50% лунок с культурой клеток от цитопатического действия вируса. Титр нейтрализующих антител рассчитывали по формуле Рида-Мюнха Клеточный ответ исследовали с помощью ELISpot анализа с использованием набора Mouse IFN-gamma ELISpot kit (BD, США). Спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, стимулировали пулом из 9 RBD-пептидов SARS-CoV-2 (по 20 мкг/мл каждого пептида), рестриктируемых МНС I и МНС II класса. Число IFN-γ-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью ELISpot-ридера (Carl Zeiss, Германия).

Анализ IFN-γ ELISpot. Анализ проводился с использованием наборов Mabtech (США, Цинциннати) в соответствии с рекомендациями производителя. Спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, стимулировали пулом из 13 RBD-пептидов SARS-CoV-2 (по 20 мкг/мл каждого пептида), распознаваемых главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I (H-2-Dd, H-2-Kd, H-2-Ld) и молекулы класса II (H2-IAd, Н2-IEd) для мышей BALB/c. Пептиды синтезированы фирмой AtaGenix Laboratories (Китай, г. Ухань), чистота пептидов > 80%. Количество клеток, продуцирующих ИФН-у, подсчитывали с помощью анализатора ELISpot фирмы Carl Zeiss (Германия, г. Оберкохен).

Анализ протективных свойств. Протективность вакцины оценивали в отношении Гамма-варианта вируса SARS-CoV-2. В работе использован штамм hCoV-19/Russia/SA-17620-080521 /2021.

На 35-й день после первой иммунизации животных интраназально инфицировали дозой 50 ИД₅₀ (3,8 log₁₀ ЦПД₅₀) вируса SARS-CoV-2.

Статистика. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического анализа Манна-Уитни в программе GraphPad Prism 9.0, при р<0.05 различия считали статистически значимыми.

Ранее разработанная в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» ДНК-вакцина pVAX-RBD описана в работе Borgoyakova, М.В et al [26]. Было показано, что pVAX-RBD вызывает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ после традиционного внутримышечного введения шприцами. Так как струйная инжекция имеет ряд преимуществ, мы решили в этом исследовании изучить специфический иммунный ответ и защитную способность ДНК-вакцины pVAX-RBD после иммунизации мышей линии BABL/c с использованием струйной инжекции.

Сыворотку тестировали методом ИФА на наличие RBD-специфичных антител, а также на способность нейтрализовать живой вирус. По результатам RBD-специфического ИФА в конце эксперимента наблюдалось 80-кратное увеличение медианных титров специфических IgG у животных, иммунизированных ДНК-вакциной струйным способом, по сравнению с группой, иммунизированной традиционным введением (3633 против 291600, значение р=0,0022, фиг.6А).

Нейтрализующие свойства сывороток анализировали с использованием штамма hCoV-19/Australia/VICO 1/2020 (линия Wuhan) в культуре клеток in vitro. Результаты коррелируют с результатами ИФА: сыворотки животных, иммунизированных струйным введением, показали значительно более высокую активность в ингибировании цитопатического действия вируса. Медианные нейтрализующие титры увеличились более чем в 35 раз по сравнению с группой, иммунизированной традиционной инъекцией (12 против 453, значение р=0,0022, фиг.6 В).

Для оценки Т-клеточного ответа в анализе IFN-γ-ELISpot спленоциты, выделенные от иммунизированных и контрольных мышей, стимулировали смесью пептидов белка RBD. Разница между группами, получавшими pVAX-RBD внутримышечно или путем струйной инъекции, составила около 3,5 (238 СОЕ против 875 СОЕ, значение р=0,0022, рисунок 6С).

Для оценки защитной эффективности вакцины pVAX-RBD животным вводили интраназально 50 ИД₅₀ (штамм hCoV-19/Poccra/SA-17620-080521/2021). Конечной точкой стал четвертый день после испытания. Анализ защитной эффективности, проведенный с помощью ПЦР в реальном времени в гомогенатах легких, показал снижение вирусной нагрузки в экспериментальных группах (медиана Ct 31,53 и 32,17 соответственно для групп, получавших pVAX-RBD внутримышечно и струйной инъекцией, рисунок 6D).

Таким образом, исследование иммуногенности ДНК-вакцины pVAX-RBD, вводимой различными путями, подтверждает, что струйная инжекция позволяет значительно усилить как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ, индуцированный ДНК-вакциной. При этом были обнаружены достоверные различия в значениях Ct в обеих экспериментальных группах (значение р=0,0084).

Пример 6. Исследование дозозависимого эффекта pVAX-RBD с использованием струйного инжектора

Работа с животными проводилась в соответствии с «Методическими указаниями по уходу и использованию лабораторных животных». Протоколы одобрены Институциональной комиссией по уходу и использованию животных (IACUC) Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (номер разрешения: НИЦ ВБ «Вектор»/02-03.2023, режим доступа: 03.04.2023). Для оценки иммуногенности созданных конструкций использовали самок мышей BALB/c массой 16-18 г.

Для эксперимента по исследованию дозозависимого эффекта pVAX-RBD с использованием струйного инжектора для оценки иммуногенности использовали самок мышей BALB/c массой 16-18 г. Мышей разделили на четыре группы по 10 животных в каждой и иммунизировали путем струйной инъекции следующим образом: первая группа - 50 мкг pVAX-RBD; вторая группа - 100 мкг pVAX-RBD; третья группа - 200 мкг pVAX-RBD; интактная группа, без иммунизации. Мышей иммунизировали дважды с интервалом 3 недели между иммунизациями. Через четырнадцать дней после второй иммунизации у мышей из каждой группы брали кровь для анализа гуморального иммунного ответа и перенесли на заражение вирусом hCoV-19/Australia/VICO 1/2020.

ИФА сыворотки. В качестве антигенов для ELISA использовали эукариотические белки RBD, любезно предоставленные лабораторией иммунохимии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора (Россия). Белок RBD (1 мкг / мл) адсорбировали в лунках 96-луночного планшета в PBS (Greiner_bio one, Германия) при 4°С в течение 12 часов, затем промывали PBST и блокировали с 1% раствором казеина в промывочном буфере в течение 60 минут при комнатной температуре. После этого образцы сыворотки добавляли в трехкратном серийном разведении, начиная с 1:50, и инкубировали в течение 60 минут при 37°С. После промывания добавляли кроличьи антитела против мышиного IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США), и инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Планшет промывали и добавляли к нему раствор субстрата ТМВ (Amresco, США). После остановки реакции стоп-раствором оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм с помощью считывающего устройства для ELISA (ChroMate Awareness Technology inc., США).

Нейтрализующая активность иммунных сывороток. В работе использован штамм коронавируса 2019-nCoV nCoV / Victoria / 1/2020 (Государственная коллекция возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН, ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора, РФ). Рабочая доза вируса составила 100 ЦПД₅₀. Для оценки эффективности нейтрализующей активности сывороток готовили их серийные двукратные разведения, начиная с разведения от 1:10 до 1: 1000. Для разведения сывороток использовали среду MEM с глутамином и добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ЕД / мл, стрептомицин 100 мкг / мл). Смесь разведений сыворотки и рабочего разведения вируса готовили в равных объемах. Смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем добавляли в лунки 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток Vero Е6. Чашки инкубировали в течение 4 дней при 37 ⁰ С, 5% СО₂. Для окрашивания клеток в каждую лунку планшета добавляли 150 мкл 0,2% раствора генцианвиолета (добавляли 1 г генцианвиолета в 20 мл 96% этанола, 120 мл 40% формалина и 350 мл раствора Хенкса). Через 30 минут жидкость из лунок удалили и промыли водой. Результаты регистрировались визуально. Любое специфическое повреждение клеточной культуры в лунке считалось цитопатическим эффектом вируса. Нейтрализующую активность сывороток иммунизированных животных оценивали по титру (разведению) сывороток, при котором регистрировали защиту в 50% лунок с культурой клеток от цитопатического действия вируса. Титр нейтрализующих антител рассчитывали по формуле Рида-Мюнха. Клеточный ответ исследовали с помощью ELISpot анализа с использованием набора Mouse IFN-gamma ELISpot kit (BD, США). Спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, стимулировали пулом из 9 RBD-пептидов SARS-CoV-2 (по 20 мкг/мл каждого пептида), рестриктируемых МНС I и МНС II класса. Число IFN-γ-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью ELISpot-ридера (Carl Zeiss, Германия).

Анализ IFN-γ ELISpot. Анализ проводился с использованием наборов Mabtech (США, Цинциннати) в соответствии с рекомендациями производителя. Спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, стимулировали пулом из 13 RBD-пептидов SARS-CoV-2 (по 20 мкг/мл каждого пептида), распознаваемых главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I (H-2-Dd, H-2-Kd, H-2-Ld) и молекулы класса II (H2-IAd, Н2-IEd) для мышей BALB/c. Пептиды синтезированы фирмой AtaGenix Laboratories (Китай, г. Ухань), чистота пептидов>80%. Количество клеток, продуцирующих ИФН-γ, подсчитывали с помощью анализатора ELISpot фирмы Carl Zeiss (Германия, г. Оберкохен).

Анализ протективных свойств. Протективность вакцины оценивали в отношении Гамма-варианта вируса SARS-CoV-2. В работе использован штамм hCoV-19/Russia/SA-17620-080521 /2021.

На 35-й день после первой иммунизации животных интраназально инфицировали дозой 50 ИД₅₀ (3,8 log₁₀ ЦПД₅₀) вируса SARS-CoV-2.

Статистика. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического анализа Манна-Уитни в программе GraphPad Prism 9.0, при р<0.05 различия считали статистически значимыми.

Вакцину вводили дважды с трехнедельным интервалом в трех разных дозах: 50, 100 и 200 мкг, используя струйный инжектор. Через десять дней после второй иммунизации у животных собирали сыворотку с последующим контрольным заражением.

Связывание IgG с рекомбинантным белком RBD увеличивалось дозозависимым образом, достигая среднего титра 1:83700, 1:539040 и 1:876450 для групп, получавших 50, 100 и 200 мкг соответственно (фиг.7А). Аналогичным образом наблюдалось дозозависимое увеличение нейтрализующей активности, измеренной с живым вирусом SARS-CoV-2. Животные, вакцинированные 50 мкг pVAX-RBD, имели реципрокный средний титр ИД50, равный 43, тогда как сыворотки групп, получивших 100 и 200 мкг, имели титр нейтрализации в 11 и 16 раз выше (495 и 704 соответственно, фиг.7 В). Следует отметить, что разница между титрами в группах, получавших 100 и 200 мкг, была недостоверной (значение р>0,9999).

Медиана Cts составила 31,27, 32,17 и 32,02 для групп, получивших 50, 100 и 200 мкг ДНК-вакцины, соответственно (без существенной разницы между собой, фиг.7С). Это достоверное (в 5-10 раз) снижение по сравнению с интактным контролем, у которого Ct составил 28,81 (значение р 0,0125; 0,0004; 0,0018 для доз 50, 100 и 200 соответственно).

Таким образом, снижение дозы до 50 мкг приводит к значительному снижению нейтрализующей активности сывороток, но не приводит к сильному снижению эффективности защиты. В то же время увеличение дозы плазмиды до 200 мкг приводит к незначительному усилению протективных свойств.

Пример 7. Доставка экспериментальной мРНК-вакцины, кодирующей RBD SARS-CoV-2 с помощью струйной инжекции

Для исследования иммуногенности мРНК-вакцины были использованы мыши линии Balb/c (самки) массой 16-18 г. Эксперименты с животными проводили с соблюдением принципов гуманности в соответствии с протоколами, утвержденными Биоэтическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор»/02-03.2023, Протокол БЭК №2 от 03.04.2023 г. ). Было сформировано 3 группы по 8 животных в каждой. Волосы удаляли с волосистой части лапы с помощью геля для депиляции. Иммунизацию мышей проводили в четырехглавую мышцу задней левой лапы дважды на 0 и 21 дни. Первой группе животных вводили внутримышечно (в/м) 30 мкг мРНК-C1-RBD в 50 мкл PBS; второй группе - в/м 30 мкг мРНК-C1-RBD в 50 мкл PBS, с помощью струйной инжекции; третьей группе вводили в/м 50 мкл физиологического раствора с помощью струйной инжекции. Струйную инжекцию проводили с использованием собственного опытного образца инжектора с характеристиками: скорость струи 220 метров в секунду, давление 6,5 бар, время инжекции 0,33 с. используя индивидуальные насадки-сопло. На 10-й день после второй инъекции у мышей брали кровь, умерщвляли и собирали их кровь и селезенки для дальнейшего анализа иммуногенности

ИФА сыворотки. В качестве антигенов для ELISA использовали эукариотические белки RBD, любезно предоставленные лабораторией иммунохимии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора (Россия). Белок RBD (1 мкг / мл) адсорбировали в лунках 96-луночного планшета в PBS (Greiner_bio one, Германия) при 4°С в течение 12 часов, затем промывали PBST и блокировали с 1% раствором казеина в промывочном буфере в течение 60 минут при комнатной температуре. После этого образцы сыворотки добавляли в трехкратном серийном разведении, начиная с 1:50, и инкубировали в течение 60 минут при 37°С. После промывания добавляли кроличьи антитела против мышиного IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США), и инкубировали в течение 60 минут при 37°С. Планшет промывали и добавляли к нему раствор субстрата ТМВ (Amresco, США). После остановки реакции стоп-раствором оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм с помощью считывающего устройства для ELISA (ChroMate Awareness Technology inc., США).

Нейтрализующая активность иммунных сывороток. В работе использован штамм коронавируса 2019-nCoV nCoV / Victoria / 1/2020 (Государственная коллекция возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН, ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора, РФ). Рабочая доза вируса составила 100 ЦПД₅₀. Для оценки эффективности нейтрализующей активности сывороток готовили их серийные двукратные разведения, начиная с разведения от 1:10 до 1: 1000. Для разведения сывороток использовали среду MEM с глутамином и добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ЕД / мл, стрептомицин-100 мкг / мл). Смесь разведений сыворотки и рабочего разведения вируса готовили в равных объемах. Смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем добавляли в лунки 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток Vero Е6. Чашки инкубировали в течение 4 дней при 37°С, 5% СО₂. Для окрашивания клеток в каждую лунку планшета добавляли 150 мкл 0,2% раствора генцианвиолета (добавляли 1 г генцианвиолета в 20 мл 96% этанола, 120 мл 40% формалина и 350 мл раствора Хенкса). Через 30 минут жидкость из лунок удалили и промыли водой. Результаты регистрировались визуально. Любое специфическое повреждение клеточной культуры в лунке считалось цитопатическим эффектом вируса. Нейтрализующую активность сывороток иммунизированных животных оценивали по титру (разведению) сывороток, при котором регистрировали защиту в 50% лунок с культурой клеток от цитопатического действия вируса. Титр нейтрализующих антител рассчитывали по формуле Рида-Мюнха Клеточный ответ исследовали с помощью ELISpot анализа с использованием набора Mouse IFN-gamma ELISpot kit (BD, США). Спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, стимулировали пулом из 9 RBD-пептидов SARS-CoV-2 (по 20 мкг/мл каждого пептида), рестриктируемых МНС I и МНС II класса. Число IFN-γ-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью ELISpot-ридера (Carl Zeiss, Германия).

Анализ IFN-γ ELISpot. Анализ проводился с использованием наборов Mabtech (США, Цинциннати) в соответствии с рекомендациями производителя. Спленоциты, выделенные от иммунизированных животных, стимулировали пулом из 13 RBD-пептидов SARS-CoV-2 (по 20 мкг/мл каждого пептида), распознаваемых главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I (H-2-Dd, H-2-Kd, H-2-Ld) и молекулы класса II (H2-IAd, Н2-IEd) для мышей BALB/c. Пептиды синтезированы фирмой AtaGenix Laboratories (Китай, г. Ухань), чистота пептидов > 80%. Количество клеток, продуцирующих ИФН-γ, подсчитывали с помощью анализатора ELISpot фирмы Carl Zeiss (Германия, г. Оберкохен).

Анализ протективных свойств. Протективность вакцины оценивали в отношении Гамма-варианта вируса SARS-CoV-2. В работе использован штамм hCoV-19/Russia/SA-17620-080521 /2021.

На 35-й день после первой иммунизации животных интраназально инфицировали дозой 50 ИД₅₀ (3,8 log₁₀ ЦПД₅₀) вируса SARS-CoV-2.

Статистика. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического анализа Манна-Уитни в программе GraphPad Prism 9.0, при р 0.05 различия считали статистически значимыми.

Для анализа иммуногенности была проведена иммунизация лабораторных животных, которым вводили по 30 мкг мРНК-C1-RBD с помощью струйной инжекции, а в качестве группы сравнения использовали животных, иммунизированных мРНК-C1-RBD в/м. ИФА анализ сывороток животных, показал, что титр RBD-специфических антител у мышей, иммунизированных с помощью инжекции, значительно превышают титр антител у мышей контрольной группы (фиг.8А).

Важным критерием эффективности вакцины является ее способность индуцировать антитела, способные нейтрализовать вирус. В нашем исследовании сыворотка мышей, иммунизированных мРНК-C1-RBD, продемонстрировала способность нейтрализовать как штамм вируса SARS-CoV-2 nCoV/Victoria/1/2020 на культуре клеток Vero in vitro в реакции вирус нейтрализации (фиг.8Б), так и псевдотипированные вирусы, несущие на своей поверхности S гликопротеины SARS-CoV-2 (фиг.8С).

Результаты анализа вирус нейтрализации коррелировали с результатами ИФА: сыворотки животных, иммунизированных мРНК-C1-RBD с помощью струйной инжекции, показали более высокую активность в отношении ингибирования цитопатического действия вируса.

Клеточный ответ анализировали с помощью метода ELISpot. Было показано, количество спленоцитов, продуцирующих IFN-γ в ответ на стимуляцию RBD-специфическими пептидами, в группе мРНК-C1-RBD, введенной с использованием струйной инжекции, в два раза превышал таковой в группе мРНК-C1-RBD в/м. В группе мышей, иммунизированных мРНК-C1-RBD без струйной инжекции, был зарегистрирован более низкий ответ (р>0,05, фиг.9).

В контрольных группах животных, иммунизированных физиологическим раствором, клеточный ответ был на уровне фона. Эти данные свидетельствуют об увеличении специфического поствакцинального Т-клеточного ответа при использовании струйной инжекции, что коррелирует с усилением гуморального иммунного ответа.

Протективность вакцины оценивали в отношении Гамма-варианта вируса SARS-CoV-2. В работе использован штамм hCoV-19/Russia/SA-17620-080521/2021. На 35-й день после первой иммунизации животных интраназально инфицировали дозой 50 ИД₅₀ (3,8 log₁₀ ЦПД₅₀) вируса SARS-CoV-2. На 4-е сутки после заражения животных выводили из эксперимента. Количественное определение вируса в тканях легких проводили методом ОТ-ГЕЦР реального времени в 10% гомогенате. Значения пороговых циклов (Ct) представлены в графическом виде на фиг.10 (Вирусная нагрузка в тканях легких мышей BALB/c на 4-е сутки после заражения Гамма-вариантом SARS-CoV-2). Индивидуальные значения Ct в ОТ-ГТЦР реального времени представлены точками; медианы в группах - вершинами гистограмм, с указанием числовых значений Ct в основании гистограмм; границы 95% доверительных интервалов отмечены вертикальными линиями. Статистический анализ проведен с использованием теста Краскела-Уоллиса (**р<0,01,****р<0,0001).

В результате проведенного исследования протективности в отношении Гамма-варианта SARS-CoV-2 на модели мышей BALB/c было показано, что вакцина мРНК-С1-RBD оказывает протективный эффект при введении в дозе 30 мкг, достоверно снижая вирусную нагрузку в тканях легких в сравнении внутримышечным введением (р<0,01) и контролем (р<0,0001).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Приложение_Вакцина

и способ ее доставки_09.04.2024.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-09">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>123456</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-03-16</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1234</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1234567</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-03-06</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki

&quot;Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr virusologii i biotekhnologii

&quot;Vektor&quot; Federalnoj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity

prav potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN GNTS VB

&quot;Vektor&quot; Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Полинуклеотидная вакцина и способ

струйной безыгольной ее доставки в организм</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>3710</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3710</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattg

actagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacat

aacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgta

tgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcc

cacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggc

ccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagt

catcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgg

ggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttc

caaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatat

aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactat

agggagacccaagctggctagcctcgagaattcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccg

ccaccatgatgcggacactgatcctggctgtgctgctggtgtacttctgtgccaccgtgcactgtgtgca

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgcc

accagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgc

tgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtg

cttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacag

acaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaaca

gcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaa

ggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccct

acagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcac

caatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaactaatgagcggccgctcgagtctagagggcccgttta

aacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcct

tccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtc

tgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaa

tagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagcaagcgaac

cggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttctc

gccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatg

attgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactggg

cacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttt

tgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggcc

acgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgg

gcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctga

tgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatc

gagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggc

tcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgaccca

tggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccgg

ctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcg

aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcg

ccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcat

ctgtgcggtatttcacaccgcatacaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgttt

atttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatag

cacgtgctaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgacca

aaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttg

agatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgt

ttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaata

ctgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgc

tctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaaga

cgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagc

gaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggag

aaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggga

aacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgct

cgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctg

gccttttgctcacatgttctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>244</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..244</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>VEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRK

RISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLP

DDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYG

FQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFHHHHHHHHHH</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>3874</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3874</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gactcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattg

actagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacat

aacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgta

tgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcc

cacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggc

ccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagt

catcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgg

ggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttc

caaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatat

aagcagagctcaaattaatacgactcactataagagaataaactagtattcttctggtccccacagactc

agagagaacccgccaccatgatgcggacactgatcctggctgtgctgctggtgtacttctgtgccaccgt

gcactgtgtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgag

gtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccg

actactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagct

gaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagatt

gcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtga

ttgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccg

gaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgt

aacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgg

gctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccc

taagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaactaaggatccgctggagcctcggtg

gcctagcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtc

tttgaataaagtctgagtgggcggcgaattcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatga

ctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

aaaaaaagagaccgggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatct

gttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaa

atgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacag

caagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactggg

cggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctg

caaagtaaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagag

acaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtgg

agaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtc

agcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgag

gcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaag

cgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgc

cgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattc

gaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatg

atctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccga

cggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttt

tctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtg

atattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccga

ttcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctg

atgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacaggtggcacttttcggggaaa

tgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataa

ccctgataaatgcttcaataatagcacgtgctaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaaga

tcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgt

agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaa

ccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggct

tcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactc

tgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg

tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggtt

cgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgaga

aagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag

cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgac

ttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctt

tttacggttcctgggcttttgctggccttttgctcacatgttctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>909</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..909</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaaccc

gccaccatgatgcggacactgatcctggctgtgctgctggtgtacttctgtgccaccgtgcactgtgtgc

agcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgc

caccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtg

ctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgt

gcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggaca

gacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaac

agcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatc

tgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtgga

aggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccc

tacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagca

ccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaactaaggatccgctggagcctcggtggcctagcttct

tgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaag

tctgagtgggcggcgaattc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>240</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..240</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MRTLILAVLLVYFCATVHCVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFAS

VYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIA

DYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCY

FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (6)

1. Способ струйной безыгольной инъекции для доставки полинуклеотидной вакцины, усиливающий активацию специфического гуморального и Т-клеточного иммунного ответа, включающий внутримышечное введение полинуклеотидной вакцины в жидкой форме с помощью безыгольного шприца, используя силу упругости упругого элемента для приведения в движение поршня, отличающийся тем, что в качестве полинуклеотидной вакцины используют ДНК-вакцину, выполненную в виде оголенных молекул плазмидной ДНК pVAX-RBD, которыми иммунизируют животных в дозе 50-200 мкг, вводимых дважды с интервалом между вакцинациями в 3 недели или мРНК-вакцину, выполненную в виде оголенных молекул мРНК-C1-RBD, индуцирующих SARS-CoV-2-специфические антитела, вводимых дважды с интервалом между вакцинациями в 3 недели в дозе 30 мкг мРНК-C1-RBD в 50 мкл PBS с помощью струйного безыгольного инъектора с индивидуальными насадками-соплами, расположенного под прямым углом к участку поверхности для инъекции и обеспечивающего следующие характеристики: скорость струи 220 метров в секунду, давление 6,5 бар, время инжекции 0,33 с.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оголенные молекулы плазмидной ДНК pVAX-RBD имеют нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 3710 п.н., молекулярный вес 2,3 МДа, содержащую целевой ген, кодирующий химерный белок 176-RBD, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, перед которым находится промотор PНК-полимеразы фага Т7, обеспечивающий транскрипцию гена, и состоящей из следующих фрагментов:

векторный фрагмент 1484-754 ДНК-плазмиды pVAX размером 2981 п.н., содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7 размером 19 п.н., имеющий координаты 664-682;

ген устойчивости к неомицину/канамицину (NeoR/KanR) размером 795 п.н., имеющий координаты 1944-2738, и точка начала репликации ColE1 ori размером 589 п.н., имеющая координаты 3064-3652, обеспечивающие селекцию и амплификацию целевой плазмиды в клетках бактерий Escherichia coli;

фрагмент 755-1483 размером 729 п.н., содержащий искусственный ген 176-RBD с инициирующим кодоном ATG.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оголенные молекулы мРНК-С1-RBD по п. 1 получены с использованием ДНК-матрицы pVAX-C1-RBD, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и имеют нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, содержащую открытую рамку считывания, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, обеспечивающую синтез и секрецию белка-иммуногена 176-RBD SARS-CoV 2 в организме млекопитающих, гибридную сигнальную последовательность 176, консенсусную последовательность Козак, расположенную перед рамкой считывания, 7-метилгуанозиновый кэп на 5'-конце мРНК, полиаденозиновый (поли А) хвост на 3'-конце мРНК длиной 100 нуклеотидов, и 5'- и 3'-нетранслируемые области (UTR), расположенные перед и после открытой рамки считывания.