RU2843665C1 - Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения эпидемического рнк-вирусного инфекционного заболевания - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к применению терапевтически эффективного количества пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), где фармацевтически приемлемая соль пиронаридина выбрана из группы, состоящей из фосфата, сульфата, гидрохлорида, ацетата, метансульфоната, бензолсульфоната, толуолсульфоната, малеата и фумарата, также относится к применению терапевтически эффективного количества артемизинина или его производного в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), где производное артемизинина выбрано из группы, состоящей из дигидроартемизинина, артесуната, артеметера и артиэфира, также относится к применению терапевтически эффективного количества пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и артемизинина или его производного в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), где фармацевтически приемлемая соль пиронаридина выбрана из группы, состоящей из фосфата, сульфата, гидрохлорида, ацетата, метансульфоната, бензолсульфоната, толуолсульфоната, малеата и фумарата; и где производное артемизинина выбрано из группы, состоящей из дигидроартемизинина, артесуната, артеметера и артиэфира. Группа изобретений обеспечивает применение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19). 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 10 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к применению пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций. Более конкретно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, в частности, коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), содеращей терапевтически эффективное количество пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/ или артемизинина или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

РНК-вирусы, имеющие РНК-геномы, обладают более высокой частотой мутаций по сравнению с ДНК-вирусами, и легко генерируют мутанты, адаптированные к изменениям в хозяине и окружающей среде. Вследствие этой способности РНК-вирусы трудно контролировать посредством противовирусных средств или профилактических вакцин. Кроме того, РНК-вирусы кодируют РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), которая синтезирует РНК, используя РНК вирусного генома в качестве матрицы, а РНК-полимеразы клеток-хозяев, синтезирующие РНК, но использующие ДНК в качестве матрицы, не способны воздействовать на репликацию РНК-содержащих вирусов (РНК-вирусов). РНК-вирусы делятся на одноцепочечные с положительной (+) смысловой цепью, одноцепочечные с отрицательной (-) смысловой цепью и двухцепочечные вирусы дцРНК-вирусы (dsRNA) в зависимости от полярности генома и от того, имеет ли геномная РНК идентичную полярность с мРНК.

Острые вирусные инфекции, недавно распространившиеся по всему миру и вызвавшие глобальный кризис в области общественного здравоохранения, быстро распространяются посредством транспорта и торговли из страны происхождения вируса в другие страны, что обуславливает значительный глобальный спрос на разработку терапевтических агентов. В частности, эпидемии гриппа H1N1 в 2009 г., лихорадки Эбола в Западной Африке в 2014 г., а также в Демократической Республике Конго в 2019 г. и Зика в 2016 г. представляют собой инфекции, вызванные РНК-вирусом.

Коронавирусы представляют собой вирусы, принадлежащие к семейству вирусов с положительной цепью РНК, например такие как вирус Зика, имеют геном с положительной смысловой цепью одноцепочечной РНК размером 25-32 т.п.н. и представляют собой зоонозные вирусы, способные инфицировать клетки как человека, так и животных, например, клетки птиц и млекопитающих. Коронавирусы имеют структуру, в которой на их внешней оболочке находятся выступающие характерные булавовидные шиповидные белки. Коронавирусы представляют собой семейство вирусов с различными членами, включая SARS-CoV, MERS-CoV или SARS-CoV-2 (2019-nCoV), вызывающих тяжелый острый респираторный синдром (SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome), появившийся в 2003 году, ближневосточный респираторный синдром (MERS, Middle East Respiratory Syndrome), недавно возникший в Саудовской Аравии в 2012 г., или коронавирусную болезнь 2019 г. (COVID-19, инфекция 2019-nCoV), не так давно объявленную Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) чрезвычайной ситуацией международного значения (PHEIC) в области общественного здравоохранения.

SARS-CoV вызывает тяжелый острый респираторный синдром, первоначально возникший в Китае в 2002 году и распространившийся по всему миру с зафиксированным уровнем смертности около 10% у 8096 пациентов. Синдром, как правило, сопровождается высокой температурой и миалгией, а через 2-7 дней появляется сухой кашель без мокроты, вызывающий дыхательную недостаточность у 10-20% больных. Поскольку соответствующее лечение еще не разработано, для лечения атипичной пневмонии могут быть применены антибактериальные препараты в сочетании с противовирусными препаратами, такими как осельтамивир или рибавирин, или стероидами.

По предположению, MERS-CoV представляет собой вирус, передающийся от животных-хозяев, таких как верблюды, человеку, вызывая тяжелый острый респираторный синдром и почечную недостаточность, вирус вызывает около 2000 инфекций в 26 странах, включая Ближний Восток, с уровнем смертности 35,6% (ВОЗ, 2016). Инкубационный период составляет около 5 дней, сопровождается лихорадкой, кашлем, одышкой, пневмонией. Вирус преимущественно распространяется при ограниченной передаче среди членов семьи или членов медицинских учреждений и обычно прогрессирует до тяжелой формы у людей с сопутствующими заболеваниями, такими как диабет.

SARS-CoV-2 (2019-nCoV) представляет собой вирус, вызывающий COVID-19, с первым случаем, зафиксированным в Ухане, Китай, в 2019 году. После инкубационного периода от 1 до 14 дней появляются различные респираторные симптомы, от легких до тяжелых, такие как кашель, лихорадка, недомогание, одышка, пневмония или острый респираторный дистресс-синдром, редко мокрота, боль в горле и диарея. Поскольку для данного вируса не существует селективного противовирусного средства, применяется только симптоматическое лечение или в сочетании с лечением противовирусными средствами, ранее показанными для других вирусных заболеваний.

В частности, COVID-19, как показала самая недавняя вирусная вспышка, распространяется очень быстро, так как не существует какого-либо лечения или вакцины, доступных в настоящее время (Li et al., 2020), а подходящая система анализа клеток или животных для этой болезни еще не создана. В настоящее время лекарства, о которых сообщалось как используемых в клинических условиях или предлагаемых в рекомендациях экспертов Китая и Кореи, включают хлорохин, ремдесивир (Wang et al., 2020), лопинавир, фавипиравир, рибавирин, интерферон и т. д., и наряду с этим в настоящее время проводится более 80 клинических испытаний (Maxmen et al., 2020). В частности, поскольку SARS-CoV-2 принадлежит к семейству коронавирусов, то реагенты, включая такие реагенты, как никлозамид (Xu et al., 2020), о которых ранее было известно, что они обладают противовирусным действием против MERS-CoV или SARS-CoV, имеющих примерно 79,5% гомологии нуклеотидной последовательности с SARS-CoV-2, находятся в центре внимания (Zhou et al., 2020).

Отмечается, что в случаях SARS или COVID-19, при тесном контакте с больным риск заражения очень высок: вирусы обладают достаточно высокой трансмиссивностью и передаются значительному количеству людей в густонаселенной среде воздушно-капельным путем. Кроме того, острые вирусные инфекции, вызванные этими коронавирусами, быстро распространяются посредством транспорта и торговли из страны происхождения вируса в другие страны, вызывая тем самым глобальный кризис в области общественного здравоохранения.

Тем не менее, степень разработки соответствующих схем лечения для эффективного ингибирования, лечения или профилактики таких вызывающих эпидемии респираторных вирусных патогенов на сегодняшний день недостаточна. Таким образом, существует острая необходимость в разработке лекарственного средства для противодействия таким заболеваниям для здоровья и благополучия людей во всем мире.

Кроме того, хотя клинические симптомы респираторных инфекций данных вирусов несколько схожи, и вирусы принадлежат к одному и тому же семейству РНК-вирусов, между вирусами все же существуют различия на генетическом и структурном уровнях, и сообщается, что эти различия влияют на чувствительность и эффективность противовирусных препаратов. Помимо этого, эти молекулярно-генетические вирусные различия обуславливают различия в путях передачи, рецепторах хозяина для связывания вируса, скорости передачи, инкубационном периоде и/или способах заражения, что приводит к различным клиническим симптомам и терапевтической эффективности и, таким образом, обуславливает важность разработки и применения соответствующих реагентов против целевого вируса.

Кроме того, учитывая быструю передачу, высокую смертность и глобальные риски для здоровья и экономики, вызванные респираторными инфекционными заболеваниями, в дополнение к разработке новых лекарств и вакцин, занимающих от одного года до нескольких лет, подходы, основанные на лекарственной репозиции препаратов, безопасность которых гарантирована предыдущими клиническими испытаниями и опытом практического применения такие разработки могут оказаться очень эффективной и бюджетной стратегией для изучения возможности профилактики, улучшения или лечения РНК-вирусных инфекций, в частности, коронавирусных респираторных заболеваний.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

Целью настоящего изобретения является обеспечение применения пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций.

Другой целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа профилактики или лечения эпидемических инфекций, вызванных РНК-вирусом, с использованием пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, содержащую терапевтически эффективное количество пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного.

Настоящее изобретение подробно описано ниже.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, содержащая терапевтически эффективное количество пиронаридина, имеющего Формулу 1 (ниже) или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем:

[Формула 1]

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения эпидемических инфекций, вызванных РНК-вирусом, включающая терапевтическую эффективное количество артемизинина, имеющего Формулу 2 (ниже) или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем:

[Формула 2]

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предоствляется фармацевтическая композиция для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, содержащая терапевтически эффективное количество пиронаридина вышеуказанной Формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли и артемизинина вышеуказанной Формулы 2 или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном варианте осуществления согласно настоящему изобретению примеры фармацевтически приемлемой соли пиронаридина могут включать кислотно-аддитивную соль, образуемую из фосфорной кислоты, серной кислоты, соляной кислоты, уксусной кислоты, метансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, малеиновой кислоты или фумаровой кислоты, без ограничения таковыми. В другом варианте осуществления согласно настоящему изобретению фармацевтически приемлемая соль пиронаридина может представлять собой тетрафосфат пиронаридина.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения примеры производного артемизинина могут включать дигидроартемизинин, артесунат, артеметер и артиэфир, без ограничения таковыми. В другом варианте осуществления настоящего изобретения производное артемизинина может представлять собой артесунат.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения в фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и артемизинина или его производного в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, приемлемое весовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному может составлять от 10:1 до 1:10. В другом варианте осуществления настоящего изобретения весовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному может составлять от 1:1 до 6:1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения весовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному может составлять от 1:1 до 4:1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения весовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному может составлять 3:1.

Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый» относится к степени токсичности, которая физиологически приемлема, не ингибирует действие активного ингредиента при введении человеку, и обычно не вызывает желудочно-кишечных расстройств, аллергических реакций, таких как головокружение, или подобных реакций. Фармацевтическая композиция с фармацевтически приемлемым носителем по настоящему изобретению может быть составлена различными способами в зависимости от пути введения, известными в данной области техники. Способ введения, может быть пероральным или парентеральным, без ограничения таковыми. Парентеральные пути введения включают различные пути, такие как трансдермальный, назальный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, внутривенный и т.п.

Когда фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят перорально, фармацевтическая композиция вместе с подходящим носителем для перорального введения по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде порошка, гранулы, таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, геля, сиропа, суспензии, облатки, инъекции, суппозитория и т.п. в соответствии со способом, известным в данной области техники. Примеры подходящих носителей включают сахара, включая лактозу, глюкозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит и мальтит; крахмалы, включая кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал и картофельный крахмал; целлюлозы, включая целлюлозу, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и низкозамещенную гидроксиметилцеллюлозу; и наполнители, такие как желатин и поливинилпирролидон. Кроме того, при необходимости в качестве разрыхлителя могут быть добавлены кросповидон, крахмалгликолят натрия, кроскармеллоза натрия, натрий карбоксиметилцеллюлоза, агар, альгиновая кислота или альгинат натрия. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно включать глидант, антиагрегант, пластификатор, смазку, смачивающий агент, ароматизатор, эмульгатор, консервант и т.п.

Кроме того, при парентеральном введении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в форме инъекции, суппозитория, препарата для трансдермального введения и назальной ингаляции в соответствии со способами, известными в данной области техники, в комбинации с подходящим носителем для парентерального введения. В случае инъекции композиция должна быть стерилизована и защищена от заражения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки. Примеры подходящих носителей для инъекций включают, без ограничения таковыми, растворитель или дисперсионную среду, содержащую воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), смесь таковых и/или растительное масло. Более предпочтительно подходящие носители включают раствор Хенкса, раствор Рингера, фосфатно-солевой буфер (PBS) или стерильную воду для инъекций, содержащую триэтаноламин, 10% этанол, 40% пропиленгликоль и изотонические растворы, такие как 5% глюкоза. Для защиты инъекции от микробного загрязнения она может дополнительно содержать различные антибактериальные и противогрибковые агенты, такие как парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал и т.п. Кроме того, в большинстве случаев инъекция может дополнительно содержать изотонический агент, такой как сахар или хлорид натрия.

Эти составы описаны в документе (Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania), общеизвестном справочнике фармацевтической химии.

В случае ингаляционного введения соединение по настоящему изобретению может быть удобно доставлено посредством аэрозольного спрея из упаковки под давлением или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлорфторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае использования аэрозольного спрея из упаковки под давлением стандартная дозировка может быть определена путем предоставления клапана для подачи отмеренного количества. Например, капсулы и картриджи для использования в ингаляторах или инсуффляторах могут содержать порошковую смесь на подходящей порошковой основе.

В качестве примера других фармацевтически приемлемых носителей можно привести носители, описанные в следующем документе (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, 1995 Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения пиронаридин или его фармацевтически приемлемая соль были приготовлены в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями.

Как описано выше, «фармацевтически приемлемый носитель», который можно использовать в настоящем изобретении, может быть любым, обычно используемым в области фармацевтики. Репрезентативные примеры могут включать лактозу, декстрин, крахмал, предварительно желатинизированный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, диоксид кремния, гидроталькит, алюмосиликат магния, гидроксид алюминия, алюмосиликат, алюмометасиликат магния, бентонит и смесь таковых. В дополнение к носителю фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать разрыхлитель для быстрой дезинтеграции и растворения при контакте с водной средой при введении in vivo; солюбилизатор или поверхностно-активное вещество для увеличения растворения или абсорбции; а также глидант или лубрикант для улучшения скольжения или увеличения текучести. Примеры разрыхлителя могут включать кросповидон, гликолят крахмала натрия, кроскармеллозу натрия, карбоксиметилцеллюлозу натрия, агар, альгиновую кислоту или альгинат натрия. Примеры глиданта или лубриканта могут включать коллоидный диоксид кремния, диоксид кремния, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеарат фумарат натрия, стеариновую кислоту или диоксид кремния, без ограничения таковыми. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая от 40 до 80% по массе пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли, от 1 до 30% по массе микрокристаллической целлюлозы, от 0,1 до 5% по массе диоксида кремния. , от 1 до 10% по массе гидроксипропилцеллюлозы, от 1 до 10% по массе низкозамещенной гидроксипропилцеллюлозы, от 2 до 20% по массе гликолята крахмала натрия и от 1 до 10% по массе стеарата магния.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения артемизинин или его производное вводят в состав в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями. В дополнение к носителю фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать разрыхлитель для быстрой дезинтеграции и растворения при контакте с водной средой при введении in vivo, солюбилизатор или поверхностно-активное вещество для увеличения растворения или абсорбции, а также глидант или лубрикант для улучшения скольжения или увеличения текучести. Примеры носителя могут включать микрокристаллическую целлюлозу, гидрат лактозы, маннит, крахмал, прежелатинизированный крахмал, низкозамещенную гидроксицеллюлозу, гидроксицеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу или гидроксипропилметилцеллюлозу. Примеры разрыхлителя могут включать кросповидон, крахмалгликолят натрия, кроскармеллозу натрия, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, агар, альгиновую кислоту или альгинат натрия. Примеры глиданта или лубриканта могут включать коллоидный диоксид кремния, диоксид кремния, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеарилфумарат натрия, стеариновую кислоту. или диоксид кремния. Репрезентативные примеры поверхностно-активного вещества могут включать лаурилсульфат натрия и его производное, полоксамер и его производное, насыщенный полигликолизированный глицерид (также известный как гелюцир), лабразол, различные полисорбаты (например, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана (далее Твин 20), полиоксиэтиленсорбитан монопальмитат (далее Tween 40), полиоксиэтиленсорбитанмоностеарат (далее Tween 60), полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (далее Tween 80)), сложные эфиры сорбитана (например, сорбитанмонолаурат (далее Span 20), сорбитанмонопальмитат (далее Span 40), сорбитана моностеарат (далее Span 60), сорбитана моноолеат (далее Span 80), сорбитана трилаурат (далее Span 25), сорбитана триолеат (далее Span 85), сорбитана тристеарат (далее Span 65)), кремофор, гидрогенизированное касторовое масло ПЭГ-60, гидрогенизированное касторовое масло ПЭГ-40, лаурилглутамат натрия или кокоамфодиацетат динатрия, без ограничения таковыми. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая от 10 до 50% по массе артемизинина или его производного, от 30 до 70% по массе микрокристаллической целлюлозы, от 2 до 20% по массе низкозамещенного гидроксипропилцеллюлозы, от 2 до 20% по массе гликолята крахмала натрия, от 0,1 до 5% по массе диоксида кремния, от 0,5 до 15% по массе лаурилсульфата натрия и от 0,1 до 5% по массе стеарата магния.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения пиронаридин или его фармацевтически приемлемая соль и артемизинин или его производное были приготовлены в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями. В дополнение к носителю фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать разрыхлитель для быстрой дезинтеграции и растворения при контакте с водной средой при введении in vivo, солюбилизатор или поверхностно-активное вещество для увеличения растворения или абсорбции, а также глидант или лубрикант для улучшения скольжения или увеличения текучести. Примеры носителя могут включать лактозу, декстрин, крахмал, прежелатинизированный крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, диоксид кремния, гидроталькит, алюмосиликат магния, гидроксид алюминия, силикат алюминия, метасиликат магния-алюминия, бентонит, бутилгидрокситолуол и смесь таковых. Репрезентативные примеры поверхностно-активного вещества могут включать лаурилсульфат натрия и его производное, полоксамер и его производное, насыщенный полигликолизированный глицерид (также известный как гелюцир), лабразол, различные полисорбаты (например, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана (далее Твин 20), полиоксиэтиленсорбитан монопальмитат (далее Tween 40), полиоксиэтиленсорбитанмоностеарат (далее Tween 60), полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (далее Tween 80)), сложные эфиры сорбитана (например, сорбитанмонолаурат (далее Span 20), сорбитанмонопальмитат (далее Span 40), сорбитана моностеарат (далее Span 60), сорбитана моноолеат (далее Span 80), сорбитана трилаурат (далее Span 25), сорбитана триолеат (далее Span 85), сорбитана тристеарат (далее Span 65)), кремофор , ПЭГ-60 гидрогенизированное касторовое масло, ПЭГ-40 гидрогенизированное касторовое масло), лаурилглутамат натрия или кокоамфодиацетат динатрия, без ограничения таковыми. Примеры разрыхлителя могут включать кросповидон, гликолят крахмала натрия, кроскармеллозу натрия, карбоксиметилцеллюлозу натрия, агар, альгиновую кислоту или альгинат натрия. Примеры глиданта или лубриканта могут включать коллоидный диоксид кремния, диоксид кремния, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеарат фумарат натрия, стеариновую кислоту или диоксид кремния, без ограничения таковыми. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая от 15 до 60% по массе пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли, от 5 до 20% по массе артемизинина или его производного, от 5 до 30% по массе микрокристаллической целлюлозы, от 10 до 40% по массе кросповидона, от 2 до 15% по массе низкозамещенной гидроксипропилцеллюлозы, от 1 до 10% по массе лаурилсульфата натрия, от 5 до 30% по массе полиэтиленгликоля, от 0,1 до 5% по массе гидроксипропилцеллюлозы, от 0,001 до 1% по весу бутилгидрокситолуола, от 0,1 до 5% по весу диоксида кремния и от 0,5 до 10% по весу стеарата магния.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде порошка, гранул, таблеток, капсул, сухого сиропа, препарата для наружного введения, инъекций, суппозиториев, препарата для трансдермального введения, ингаляционного введения и т.п.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными средствами, обладающими противовирусной эффективностью, для профилактики и лечения эпидемических инфекций, вызванных РНК-вирусом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения примеры других противовирусных агентов могут включать ингибиторы вирусной репликации, ингибиторы геликазы, ингибиторы вирусной протеазы и ингибиторы проникновения вируса в клетку, без ограничения таковыми. В другом варианте осуществления настоящего изобретения другим противовирусным агентом может быть, например, рибавирин, интерферон, никлозамид или их комбинация, без ограничения таковыми.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения примеры эпидемического инфекционного заболевания, вызванного РНК-вирусом, могут включать, без ограничения таковыми, инфекцию, вызванную вирусом Зика, инфекцию, вызванную вирусом Эбола, и респираторные заболевания, вызванные новым вирусом гриппа и коронавирусной инфекцией. В другом варианте осуществления настоящего изобретения примеры респираторных заболеваний, вызванных коронавирусными инфекциями, могут включать, помимо прочего, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), ближневосточный респираторный синдром (MERS) или коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19). В другом варианте осуществления настоящего изобретения респираторное заболевание, вызванное коронавирусной инфекцией, может представлять собой коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19).

В настоящем изобретении термин «профилактика» относится к любому действию, ингибирующему или задерживающему возникновение, распространение и рецидив эпидемических РНК-вирусных инфекций путем введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, а термин «лечение» относится к любому действию, при котором симптомы заболевания улучшаются или благотворно изменяются при введении фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Кроме того, используемый здесь термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, при котором наблюдается значимый ответ по сравнению с отрицательным контролем, и предпочтительно относится к количеству, достаточному для предотвращения или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций. Терапевтическая доза для пациента обычно составляет от 50 до 2000 мг/день и более предпочтительно от 100 до 1000 мг/день, в зависимости от тяжести состояния и от того, вводят ли соединение отдельно или в комбинации, или в комбинации с другими лекарственными средствами. Это количество можно вводить один раз в день или в разделенных дозах пероральным или парентеральным путем. Однако терапевтически эффективное количество может соответствующим образом изменяться в зависимости от различных факторов, таких как тип и тяжесть заболевания, возраст, масса тела, состояние здоровья и пол пациента, способ введения и период лечения.

Хотя настоящее изобретение описывает профилактику и лечение эпидемических РНК-вирусных инфекций у людей, предпочтительно респираторных заболеваний человека, вызванных коронавирусными инфекциями, и более предпочтительно COVID-19 человека, настоящее изобретение может быть полезным для лечения инфекций, вызванных РНК-вирусами, в частности, вирусами Coronaviridae, вызывающими респираторные заболевания, и, более конкретно, вирусом, вызывающий COVID-19, у животных и человека.

Задачи настоящего изобретения не ограничиваются техническими проблемами, упомянутыми выше, а другие технические задачи, не упомянутые выше, будут понятны специалисту в данной области техники из следующего описания. Кроме того, вышеприведенное описание никоим образом не ограничивает заявленное изобретение, более того, конкретное сочетание обсуждаемых признаков не является абсолютно необходимым для предлагаемого изобретения.

ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для профилактики или лечения эпидемических РНК-вирусных инфекций, содержащую терапевтически эффективное количество пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и/или артемизинина или его производного в качестве активного ингредиента(ов). Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть эффективно использована для профилактики или лечения путем эффективного ингибирования эпидемических РНК-вирусных инфекций, например респираторных заболеваний, таких как COVID-19, вызванных коронавирусами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет собой кривую «концентрация-ответ» касающуюся ингибирующего действия против SARS-CoV-2 и цитотоксичности при предварительной обработке пиронаридинтетрафосфатом, который является одним из активных ингредиентов по настоящему изобретению, при измерении через 24 часа после заражения/инфицирования.

Фиг. 2 представляет собой кривую «концентрация-ответ», касающуюся ингибирующего действия против SARS-CoV-2 и цитотоксичности при совместном лечении пиронаридинтетрафосфатом при измерении через 24 часа после заражения вирусом.

На Фиг. 3 показаны результаты измерения ингибирующего действия против SARS-CoV-2 при совместном лечении артесунатом - одним из активных ингредиентов по настоящему изобретению - через 24 и 48 часов после заражения по сравнению с эффектами хлорохина, используемого в качестве контроля.

На Фиг. 4 представлены результаты сравнения ингибирующего действия комбинаций, имеющих различные соотношения пиронаридинтетрафосфата и артесуната, в клетках, инфицированных SARS-CoV-2, при оптимальном соотношении сравнивались ингибирующие эффекты против вирусов через 24 часа и 48 часов после заражения.

Фиг. 5 представляет собой кривые «концентрация-ответ», зависимость ингибирующего действия против SARS-CoV-2 и цитотоксичности, измеренных через 24 часа и 48 часов после заражения клеток линии Calu-3 легких человека при одновременном введении пиронаридинтетрафосфата или артесуната в момент заражения вирусной инфекцией, от концентрации, и сравнение таковых с данными при использовании гидроксихлорохина в качестве контроля.

Фиг. 6 представляет собой кривую зависимости ингибирующего действия против SARS-CoV-2 при одновременном введении после заражения (постинфекционная обработка) пиронаридинтетрафосфата или артесуната в клетки клеточной линии Calu-3 легких человека, при измерении через 48 часов после лечения лекарственным средством.

На Фиг. 7 показаны результаты экспериментов, в которых хомячки были инфицированы SARS-CoV-2, а затем подвергнуты пероральному введению низких или высоких доз пиронаридинтетрафосфата и артесуната в комбинации в соотношении 3:1 через 1 час после заражения один раз в день в течение 3 дней, или пероральному введению высокой дозы одного пиронаридинтетрафосфата через 25 часов после заражения, а также показаны титры вируса в легких на 4 день после заражения по сравнению с контрольной группой, инокулированной вирусом, но не проходящей обработку лекарственным средством.

ПРИМЕРЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее состав и эффекты настоящего изобретения будут описаны более подробно с помощью примеров. Следует понимать, что данные примеры являются только иллюстративными, и не ограничивающими объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение монотаблетки пиронаридинтетрафосфата

Гидроксипропилцеллюлозу растворяли в этаноле для приготовления связующего раствора. После влажной грануляции пиронаридинтетрафосфата с использованием приготовленного связующего раствора полученный продукт сушили и гранулировали. Смешивали низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, крахмалгликолят натрия, микрокристаллическую целлюлозу и диоксид кремния. После добавления любриканта стеарата магния таблетки готовили таблетированием.

[Таблица 1]

Содержание ингредиентов (мг/препарат)
Пиронаридинтетрафосфат Микрокристаллическая целлюлоза Диоксид кремния Гидроксипропилцеллюлоза Гидроксипропилцеллюлоза низкозамещенная Крахмалгликолят натрия Стеарат магния	360 48 6 12 18 24 12

Пример 2: Получение монотаблетки артесуната

Диоксид кремния и лаурилсульфат натрия просеивали через сито. Просеянный диоксид кремния и лаурилсульфат натрия смешивали с артесунатом, микрокристаллической целлюлозой, низкозамещенной гидроксипропилцеллюлозой и крахмалгликолятом натрия, смазывали добавлением стеарата магния и затем таблетировали для приготовления таблеток. Полученный продукт покрыли пленкообразующим агентом.

[Таблица 2]

Содержание ингредиентов (мг/препарат)
Артесунат Микрокристаллическая целлюлоза Гидроксипропилцеллюлоза низкозамещенная Крахмалгликолят натрия Диоксид кремния Лаурилсульфат натрия Стеарат магния Средство пленочное покрытие (Opadry)	100 228 30 20 5 12 5 12

Пример 3: Получение комбинированной таблетки пиронаридинтетрафосфат/артесунат

Полиэтиленгликоль в качестве плавящегося диспергирующего носителя, бутилгидрокситолуол и артесунат в качестве активного ингредиента смешивали, расплавляли при нагревании, а затем быстро охлаждали и тонко измельчали. Затем к этому подмешивали микрокристаллическую целлюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, кросповидон и стеарат магния с получением Смеси 1. После растворения гидроксипропилцеллюлозы в этаноле пиронаридинтетрафосфат подвергали влажной грануляции, сушили и гранулировали с получением Смеси 2. Смесь 1, Смесь 2, лаурилсульфат натрия, диоксид кремния и кросповидон смешивали и затем к смеси добавляли стеарат магния для лубрикации смеси с последующим таблетированием для получения таблеток. Полученный продукт покрывали пленкообразующим агентом.

[Таблица 3]

Содержание ингредиентов (мг/препарат)
Артесунат Пиронаридин тетрафосфат Микрокристаллическая целлюлоза Кросповидон Низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза Лаурилсульфат натрия Полиэтиленгликоль Гидроксипропилцеллюлоза Бутилгидрокситолуол Диоксид кремния Стеарат магния Средство пленочное покрытие (Opadry)	60 180 93 120 38 23 90 6 0,12 4,5 16,5 20

Чтобы определить, обладают ли пиронаридин или его соль и артемизинин или его производное по настоящему изобретению противовирусной активностью против коронавируса, реагенты вводили по отдельности и в комбинации, как показано в следующих экспериментальных примерах, и оценивали степень ингибирования вирусной инфекции.

Экспериментальный Пример 1: оценка противовирусного действия тетрафосфата пиронаридина (предварительная обработка)

В экспериментальном Примере 1 перед заражением клеток SARS-CoV-2 (корейский изолят), клетки предварительно обрабатывали пиронаридинтетрафосфатом в течение 1 часа и затем оценивали ингибирующую эффективность такового против вирусной инфекции.

1) Подготовка вирусов и клеток-хозяев

Клетки Vero были приобретены в Американской коллекции типовых культур (ATCC) и инкубированы при 37°C с 5% CO₂ в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотика. SARS-CoV-2 был предоставлен Корейским центром по контролю и профилактике заболеваний (KCDC). После амплификации вируса титры вируса определяли анализом бляшек путем подсчета вирусных бляшек, образующихся в клетках, используемых для амплификации вируса при заражении вирусом.

2) Определение противовирусной эффективности с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания

Клетки Vero высевали по 1,2×10⁴ клеток на лунку в планшеты µClear и за 24 часа до эксперимента клетки предварительно обрабатывали в течение 1 часа серией из 10 разведений препарата в культуральных средах в диапазоне 0,05-50 мкМ, а затем клетки инокулировали SARS-CoV-2 при множественности заражения (MOI) 0,0125. Через 24 часа после заражения клетки фиксировали 4% формальдегидом и анализировали инфицированные клетки с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против N-белка SARS-CoV-2. Уровень инфицирования рассчитывали как отношение количества инфицированных клеток к общему количеству клеток по сравнению с положительным и отрицательным контролем с помощью программы анализа изображений. Противовирусный эффект препарата представлен в виде кривой концентрация-ответ, а с помощью программы анализа Graph Prism (Ver. 8) эффективную концентрацию 50% (EC_{50 -}концентрация, которая ингибирует цитотоксичность, вызванную вирусной инфекцией, на 50%) и 50% цитотоксическую концентрацию (CC_{50 -}концентрация соединения, вызывающая повреждение 50% клеток по сравнению с нормальными клетками) рассчитывали, как показано в Уравнении 1.

<Уравнение 1>

Модель сигмоидной кривой,

Y= Нижнее значение + (Верхнее - Нижнее)/(1 + (IC ₅₀ /X) ^{наклон кривой} )

Результат показан на Фиг. 1: в случае клеток Vero, инфицированных SARS-CoV-2, наблюдалась 70% степень ингибирования вируса при концентрации 50 мкМ пиронаридина, но цитотоксичность также увеличивалась на 17% при применении предварительной обработки препаратом. Клетки Vero были выделены из эпителиальных клеток почек африканской зеленой макаки (Chlorocebus sp.) и известны как клетки с дефицитом IFN-1. В предыдущем исследовании при измерении противовирусной эффективности пиронаридина in vitro против вируса Эбола в клетках Vero противовирусная активность не наблюдалась при концентрации ниже CC₅₀ (CC₅₀=1,3 мкМ), но при инокуляции в клетки Hela человеческого происхождения была обнаружено, что CC₅₀ выше, а противовирусная активность проявляется при нетоксичной концентрации (EC₅₀=0,42-1,12 мкМ, CC₅₀=3,1 мкМ). Кроме того, пиронаридин значительно снижал смертность и уровень вирусной инфекции в моделях мышей, зараженных вирусом Эбола (Lane et al., 2015). Хорошо известно, что эффективность антивирусных агентов может различаться в системах анализа in vitro или in vivo в зависимости от различий в свойствах тестируемых клеток-хозяев и внутриклеточных иммунных сигнальных путей таковых (Lane et al., 2015), и, следовательно, были дополнительно проведены анализы клеток-хозяев человеческого происхождения, и противовирусная эффективность пиронаридина была дополнительно подтверждена в различных клеточных линиях и исследованиях на животных.

Экспериментальный Пример 2: ингибирующее действие пиронаридинтетрафосфата на вирус SARS-CoV-2 (введение в момент инфицирования)

В экспериментальном Примере 2 ингибирующее действие пиронаридина на вирусную инфекцию оценивали при совместной обработке клеток в момент инфицирования SARS-CoV-2 (корейский изолят). Известно, что хлорохин проявляет противовирусную эффективность за счет повышения эндосомального pH, что приводит к ингибированию связывания вируса с клетками и гликозилированию рецепторов клетки-хозяина к SARS-CoV (Vincent et al., 2005). Поскольку ожидалось, что пиронаридин, который имеет структуру, аналогичную хлорохину, будет действовать по аналогичному механизму, пиронаридин вводили одновременно (с вирусом) в момент заражения вирусной инфекцией и измеряли его противовирусную эффективность. Путем оптимизации некоторых экспериментальных условий, использованных в экспериментальном Примере 1, эксперимент был проведен в тестовых условиях с относительно низкой цитотоксичностью.

1) Подготовка вирусов и клеток-хозяев

Клетки Vero инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотика. SARS-CoV-2 был предоставлен Корейским центром по контролю и профилактике заболеваний (KCDC). После амплификации вируса титры вируса определяли с помощью qRT-PCR, измеряя количество копий РНК.

2) Измерение противовирусной эффективности посредством анализа количества копий РНК

После растворения пиронаридинтетрафосфата в DMSO его разбавляли до концентрации 0,033-100 мкМ в культуральной среде. За 24 часа до эксперимента SARS-CoV-2 инокулировали в клетки Vero, высеянные в 96-луночный планшет с плотностью 2×10⁴ клеток/лунку (MOI=0,01), и культуральную среду, содержащую различные разведения препарата, добавляли в каждую лунку. Через 24 часа после инфицирования собирали супернатант клеток, выделяли РНК и проводили qRT-PCR против гена RdRp. Противовирусную эффективность препарата анализировали, сравнивая число копий вирусной РНК в препарате с таковой в контроле. Была построена кривая «концентрация-ответ», отражающая зависимость степени ингибирования вирусной инфекции (% ингибирования) от титра вируса, рассчитанного из числа копий РНК, а также была рассчитана 50% эффективная концентрация (EC₅₀, концентрация, подавляющая титр вируса на 50%) с использованием программы анализа Graph Prism (Ver. 8), как в экспериментальном Примере 1.

3) Измерение цитотоксичности (% цитотоксичности)

Цитотоксичность измеряли с использованием анализа на основе солей тетразолия (WST-1). WST-1 конвертируется в хромогенное вещество, называемое формазаном, с помощью митохондриальных дегидрогеназ, присутствующих только в живых клетках. После добавления 10 мкл премикса WST-1 в каждую лунку, клетки инкубировали еще в течение 1 часа и рассчитывали количество образовавшегося формазана, измеряя оптическую плотность с помощью ELISA. Рассчитывали 50% цитотоксическую концентрацию (CC₅₀, концентрация соединения, вызывающая повреждение 50% клеток по сравнению с нормальными клетками).

В результате, как показано на Фиг. 2, пиронаридин проявлял противовирусный эффект в зависимости от концентрации при обработке в момент инокуляции вирусом, а цитотоксичность наблюдалась при некоторых высоких концентрациях, но противовирусная активность в отношении вируса SARS-CoV-2 приводящая к более чем 90% ингибирования, наблюдалась при нецитотоксических концентрациях (EC₅₀=8,27 мкМ, CC₅₀=11,54 мкМ; индекс селективности, SI>1,40).

Экспериментальный Пример 3: ингибирующее действие артесуната на SARS-CoV-2 (совместное введение)

В экспериментальном Примере 3 противовирусную эффективность артесуната измеряли в тех же экспериментальных условиях, что и в экспериментальном Примере 2.

1) Подготовка вируса и клетки-хозяина

Клетки Vero и вирусы получали таким же образом, как показано в экспериментальном Примере 2.

2) Измерение противовирусной эффективности анализом количества копий РНК

Артесунат растворяли в DMSO и затем разбавляли до концентраций 3,13, 12,5 и 50 мкМ в культуральной среде. За 24 часа до эксперимента SARS-CoV-2 инокулировали в клетки Vero, высеянные в 96-луночный планшет с плотностью 2×10⁴ клеток/лунку (MOI=0,01), и культуральную среду, содержащую различные разведения препарата, добавляли в каждую лунку. Через 24 часа и 48 часов после заражения собирали супернатант клеток и проводили qRT-PCR против гена RdRp для расчета титра вируса и степени ингибирования вирусной инфекции (% ингибирования), как показано в экспериментальном Примере 2, хлорохин использовался в качестве контроля.

3) Измерение цитотоксичности (% цитотоксичности)

Цитотоксичность измеряли так же, как показано в экспериментальном Примере 2.

В результате, как показано на Фиг. 3, артесунат проявлял противовирусную активность в зависимости от концентрации и продемонстрировал степень ингибирования вируса на уровне 83% при концентрации 50 мкМ. При 12,5 мкМ степень ингибирования составляла 40% и 51% через 24 часа после заражения (24 hpi, 24 hours post-infection)) и через 48 часов после заражения (48 hpi, 48 hours post-infection) соответственно. Кроме того, при 3,13 мкМ степень ингибирования составила 39% через 48 часов после заражения. Во всех испытанных условиях не наблюдалось значительной цитотоксичности. Артесунат имел более низкую EC₅₀ и более медленное начало ингибирования SARS-CoV-2 по сравнению с пиронаридином или хлорохином, используемым в качестве контроля, но обладал более длительным противовирусным эффектом, демонстрируя закономерность, при которой степень ингибирования вируса медленно увеличивалась с течением времени.

Экспериментальный Пример 4: ингибирующее действие комбинации пиронаридинтетрафосфата/артесуната на SARS-CoV-2

В отличие от хлорохина, который не показал противовирусного эффекта на моделях морских свинок, инфицированных вирусом Эбола, пиронаридин значительно улучшил титр вируса и выживаемость на моделях мышей, зараженных вирусом Эбола. Таким образом, предполагалось, что хлорохин может иметь механизм действия, отличающийся от тех, для которых были предложены иммуномодулирующие механизмы, например, такие как путь IFN-1 типа 1 (Lane et al., 2019). Артесунат также продемонстрировал противовирусную эффективность против вируса Эбола в анализах in vitro, но слабее, чем пиронаридин (Gignox et al., 2016). Таким образом, в экспериментальном Примере 4 оценивали изменения противовирусной эффективности в зависимости от комбинированного введения двух лекарственных средств при различных соотношениях.

1) Подготовка вируса и клеток-хозяев

Клетки Vero и вирус получали таким же образом, как показано в экспериментальном Примере 2.

2) Измерение противовирусной эффективности анализом количества копий РНК

Пиронаридинтетрафосфат и артесунат растворяли в DMSO, разбавляли до различных концентраций в культуральной среде в различных соотношениях, создавая комбинации, такие как 1:1, 3:1, 10:1 и т. д. За 24 часа до начала эксперимента клетки Vero, высеянные в 96-луночный планшет при плотности 2×10⁴ клеток/лунку (MOI=0,01) инокулировали SARS-CoV-2, а затем в каждую лунку добавляли культуральную среду, содержащую различные разведения препарата. Через 24 часа после заражения собирали клеточный супернатант и проводили qRT-PCR против гена RdRp для подсчета титра вируса и степени ингибирования вирусной инфекции (% ингибирования), как показано в экспериментальном Примере 2. При введении комбинации, содержащей 10 мкМ пиронаридинтетрафосфата и 3,3 мкМ артесуната, титры вируса измеряли через 24 и 48 часов после заражения, и сравнивали с хлорохином и лопинавиром, используемыми в качестве контроля.

3) Измерение цитотоксичности (% цитотоксичности)

Цитотоксичность измеряли так же, как показано в экспериментальном Примере 2.

В результате, как показано на Фиг. 4, противовирусный эффект артесуната, введенного в комбинации с пиронаридином, был выше, чем у артесуната, введенного отдельно, и противовирусный эффект увеличивался по мере того, как соотношение пиронаридина в комбинации повышалось. В частности, когда 10 мкМ пиронаридинтетрафосфата и 3,3 мкМ артесуната использовались совместно (соотношение 3:1), была достигнута степень ингибирования вирусной инфекции на 90-100%, что является более высоким противовирусным эффектом по сравнению с хлорохином или лопинавиром, используемыми в качестве контроля. В данном случае степень ингибирования инфекции сохранялась до 48 часов. Никакой значительной цитотоксичности не наблюдалось при всех соотношениях в комбинациях, показанных на Фиг. 4, а если 10 мкМ пиронаридинтетрафосфата и 3,3 мкМ артесуната вводились в комбинации, наблюдалась более низкая цитотоксичность по сравнению с обработкой только одним 10 мкМ пиронаридинтетрафосфатом (уменьшение на 49,5%).

Экспериментальный Пример 5: ингибирующее действие пиронаридинтетрафосфата или артесуната на SARS-CoV-2 в линиях клеток легких человека (совместное введение)

Сообщалось, что в отношении антивирусного ответа у человека и других млекопитающих могут наблюдаться видовые различия, например, в структуре рецепторов. Таким образом, чтобы подтвердить эффективность в линиях клеток легких человека, в экспериментальном Примере 5, SARS-CoV-2 (корейский изолят) инокулировали в клетки Calu-3 (линия клеток легких человека), и обрабатывали пиронаридинфосфатом или артесунатом и оценивали эффективность в ингибировании вирусной инфекции. Ингибирующее действие пиронаридинтетрафосфата или артесуната на вирусную инфекцию оценивали на линиях клеток легких человека, таких как Calu-3, при совместном введении в клетки в момент заражения вирусом SARS-CoV-2 (корейский изолят).

1) Подготовка вирусов и клеток-хозяев

Клетки Calu-3 инкубировали при 37°C с 5% CO₂ в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS) и антибиотика. SARS-CoV-2 был предоставлен Корейским центром по контролю и профилактике заболеваний (KCDC).

2) Измерение противовирусной эффективности с использованием количества копий РНК

После растворения в DMSO пиронаридинтетрафосфат разбавляли до концентрации 0,033-100 мкМ в культуральной среде. За 24 часа до эксперимента SARS-CoV-2 инокулировали в клетки Vero, высеянные в 96-луночный планшет с плотностью 2×10⁴ клеток/лунку (MOI=0,01), и культуральную среду, содержащую различные разведения препарата, добавляли в каждую лунку. Через 24 часа и 48 часов после инфицирования была проведена qRT-PCR против гена RdRp, как показано в экспериментальном Примере 2. Была построена кривая концентрация-ответ, показывающая степень ингибирования вирусной инфекции (% ингибирования) от титра вируса, рассчитанного по количеству копий РНК и 50% эффективную концентрацию (EC₅₀, концентрация, которая подавляет титр вируса на 50%) рассчитывали с использованием программы анализа Graph Prism (Ver. 8), как показано в экспериментальном Примере 1.

3) Измерение цитотоксичности (% цитотоксичности)

Цитотоксичность измеряли так же, как в экспериментальном Примере 2.

В результате, как показано на Фиг. 5, и пиронаридин, и артесунат проявляли противовирусные эффекты в линиях клеток легких человека в зависимости от концентрации при совместном введении в момент инфекции. Кроме того, как через 24 часа после заражения (24 hpi), так и через 48 часов после заражения (48 hpi) они проявляли противовирусную активность против SARS-CoV-2, показывая ингибирование более чем на 90% в нецитотоксических концентрациях (для пиронаридина 48 ч после инфицирования IC₅₀=8,58 мкМ, CC₅₀ > 100 мкМ, индекс селективности, SI > 11,66, для артесуната через 48 ч после инфицирования IC₅₀=0,45 мкМ, CC₅₀ > 100 мкМ, индекс селективности, SI > 220,8). В частности, в случае артесуната эффект значительно усиливался в клеточных линиях легких человека по сравнению с таковым в клеточных линиях почек макаки (клетках Vero). В отличие от вышеперечисленных, гидроксихлорохин не проявлял противовирусного действия при концентрации менее 50 мкМ в клеточных линиях легких человека, но гидроксихлорохин проявлял противовирусную эффективность в клеточных линиях обезьян.

Экспериментальный Пример 6: ингибирующие эффекты постинфекционной обработки пиронаридинтетрафосфатом или артесунатом против SARS-CoV-2 в линиях клеток легких человека

В экспериментальном Примере 6 пиронаридинтетрафосфат или артесунат вводили отдельно в клетки Calu-3 через 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 и 36 часов после инокуляции вирусом SARS-CoV-2 (корейский изолят), и оценили, насколько долго сохраняется ингибирующий эффект каждого препарата в отношении вирусных инфекций.

1) Подготовка вирусов и клетки-хозяева

Клетки и вирусы Calu-3 получали таким же образом, как показано в экспериментальном Примере 5.

2) Определение противовирусной эффективности анализом вирусных бляшек

После растворения пиронаридинтетрафосфата и артесуната в DMSO, каждого по отдельности, таковые разбавляли до 12,5 мкМ культуральной средой. Через 1 час после инокуляции SARS-CoV-2 (MOI=0,1) в клетки, удаляли супернатант и промывали клетки Calu-3 с последующим добавлением культуральной среды DMEM, содержащей 2% бычьей сыворотки. Культуральные среды, содержащие лекарственные средства, добавляли через 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 и 36 часов каждую по отдельности. Через 48 часов после обработки каждым лекарственным средством собирали клеточные супернатанты и проводили анализ бляшек, в котором бляшки, образованные инфекционной вирусной инфекцией, подсчитывали в клетках Vero, используемых для амплификации вируса. Слой среды DMEM-F12, содержащий 2% агарозы, наносили на слой инфицированных клеток Vero и после инкубации в течение 72 часов подсчитывали количество бляшек с помощью контрастного окрашивания кристаллическим фиолетовым. Противовирусную эффективность препарата анализировали посредством анализа степени ингибирования вирусной инфекции (% ингибирования) в зависимости от титра вируса, рассчитанного по числу образовавшихся бляшек, и сравнивали с контролем.

В результате, как видно на Фиг. 6, максимальная противовирусная эффективность была показана при обработке 12,5 мкМ пиронаридина (>99% ингибирование при добавлении через 6 часов после инфицирования, >94% ингибирование при добавлении через 12 часов после инфицирования, >90% ингибирование при добавлении через 24 часов после инфицирования). С другой стороны, обработка 12,5 мкМ артесуната показала 92-96% ингибирование при добавлении через 6 часов после заражения, >90% ингибирование при добавлении через 12 часов после заражения и 48% ингибирование при добавлении через 24 часа после заражения.

Экспериментальный Пример 7: ингибирующее действие комбинации пиронаридинтетрафосфата/артесуната на SARS-CoV-2 на животных моделях COVID-19

В экспериментальном Примере 7 пиронаридинтетрафосфат и артесунат (комбинацию в соотношении 3:1) перорально вводили хомячкам, инфицированным SARS-CoV-2 (корейский изолят), для оценки противовирусной эффективности in vivo у животных.

1) Подготовка вирусов и хомячков к инфицированию SARS-CoV-2

Вирус SARS-CoV-2 был предоставлен Корейским центром по контролю и профилактике заболеваний (KCDC). В качестве экспериментальных животных-моделей использовались сирийские хомячки, показавшие высокую восприимчивость к SARS-CoV-2 и широкодоступные от поставщиков, SARS-CoV-2 (1×10⁶ PFU/100 мкл) инокулировали в каждую из носовых пазух хомячка в количестве 50 мкл.

2) Измерение противовирусной эффективности in vivo анализом бляшек

Через 1 час после назальной инокуляции SARS-CoV-2 перорально вводили пиронаридинтетрафосфат (180 мг/кг или 360 мг/кг) и артесунат (60 мг/кг или 120 мг/кг) в комбинации в соотношении 3:1 один раз в день в течение 3 дней, и оценивали противовирусную эффективность комбинации двух препаратов против SARS-CoV-2 in vivo. Для сравнительной экспериментальной группы пиронаридин в дозе 360 мг/кг вводили перорально один раз через 25 часов после инокуляции для оценки продолжительности постинфекционной эффективности одного пиронаридина. Как пиронаридинтетрафосфат, так и артесунат готовили непосредственно перед использованием, полностью растворяли в 5% бикарбонате натрия и вводили перорально. В качестве контрольных групп использовали обычную контрольную группу (Mock), в которую вирус не инокулировали, и контрольную группу, которую одновременно обрабатывали только растворителем. На 4-й день после заражения вырезали как левую, так и правую доли легких, выделяли вирус и анализировали титры вируса в тканях легких с помощью анализа бляшек, как описано в экспериментальном Примере 6. Титр вируса в легких, определенный с помощью анализа бляшек, нормализовали к общей массе (г) легочных тканей, а затем преобразовывали в логарифмическое значение для расчета конечного титра (Log₁₀ бляшкообразующих единиц/г, Log₁₀PFU/г, PFU- plaque forming unit (БОЕ-бляшкообразующие единицы).

В результате, как показано на Фиг. 7, на 4-е сутки после инокуляции снижение титра инфекционного вируса в тканях легких было статистически значимым: для обоих пиронаридинтетрафосфата (P)-артесуната (A) 180/60 мг/кг и 360/120 мг/кг групп совместного введения [медиана Log10PFU: 8,30 для зараженной вирусом контрольной группы vs. 7,22 для группы совместного введения PA 180/60 мг/кг (p<0,001); vs. 7,61 для группы совместного введения PA 360/120 мг/кг (p=0,046)]. С другой стороны, при пероральном введении только одного пиронаридинтетрафосфата наблюдалось значительное снижение титра инфекционного вируса в легочной ткани при введении высокой дозы 360 мг/кг, а значительный ингибирующий эффект наблюдался даже при однократном введении через 25 часов после инфицирования [медиана Log10PFU 8,30 для зараженной вирусом контрольной группы, обработанной одним только носителем (растворителем) vs. 7,22 для группы, получавшей однократно высокую дозу 25 HPI, (p<0,001)].

Claims (10)

1. Применение терапевтически эффективного количества пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), где фармацевтически приемлемая соль пиронаридина выбрана из группы, состоящей из фосфата, сульфата, гидрохлорида, ацетата, метансульфоната, бензолсульфоната, толуолсульфоната, малеата и фумарата.

2. Применение терапевтически эффективного количества артемизинина или его производного в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), где производное артемизинина выбрано из группы, состоящей из дигидроартемизинина, артесуната, артеметера и артиэфира.

3. Применение терапевтически эффективного количества пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли и артемизинина или его производного в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения ближневосточного респираторного синдрома (MERS) или коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19),

где фармацевтически приемлемая соль пиронаридина выбрана из группы, состоящей из фосфата, сульфата, гидрохлорида, ацетата, метансульфоната, бензолсульфоната, толуолсульфоната, малеата и фумарата; и

где производное артемизинина выбрано из группы, состоящей из дигидроартемизинина, артесуната, артеметера и артиэфира.

4. Применение по п.1 или 3, где фармацевтически приемлемая соль пиронаридина представляет собой тетрафосфат пиронаридина.

5. Применение по п.3, где массовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному составляет от 10:1 до 1:10.

6. Применение по п.5, где массовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному составляет от 1:1 до 6:1.

7. Применение по п.6, где массовое соотношение пиронаридина или его фармацевтически приемлемой соли к артемизинину или его производному составляет 3:1.

8. Применение по п.2 или 3, где производное артемизинина представляет собой артесунат.