RU2843581C2 - Микроорганизм, продуцирующий пуриновые нуклеотиды, и способ получения пуриновых нуклеотидов c его использованием - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой микроорганизм Corynebacterium stationis, имеющий способность продуцировать пуриновые нуклеотиды, у которого усилена активность системы импортера фосфата, кодируемой геном pit, и где усиление активности системы импортера фосфата представляет собой усиление активности полипептида, кодируемого геном pitA. Такой микроорганизм предназначен для получения пуринового нуклеотида. Изобретение позволяет получать пуриновые нуклеотиды с высокой степенью эффективности. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к микроорганизму Corynebacterium stationis, обладающему способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды, у которого усилена активность системы транспорта фосфата, и к способу получения пуриновых нуклеотидов с использованием этого микроорганизма.

Предшествующий уровень техники

Пуриновые нуклеотиды, то есть 5'-инозинмонофосфат (далее именуемый IMP), 5'-ксантозинмонофосфат (далее именуемый ХМР) и 5'-гуанозинмонофосфат (далее именуемый GMP), которые представляют собой промежуточные соединения в метаболической системе биосинтеза нуклеиновых кислот, играют важную физиологическую роль в организме и широко используются в пищевых продуктах, фармацевтических средствах и т.д. В частности, известно, что IMP сам по себе придает вкус говядины, и известно, что GMP, который происходит из ХМВ, придает грибной вкус. Известно, что оба вещества усиливают интенсивность вкуса однозамещенного глутамата натрия (MSG) и, таким образом, привлекают большое внимание в качестве приправы с обогащенным вкусом на основе нуклеиновых кислот.

Фосфат, который представляет собой компонент пуриновых нуклеотидов, обеспечивает энергию, необходимую для роста микроорганизмов, и необходим для биосинтеза фосфолипидов клеточных мембран, нуклеиновых кислот и белков. Он также играет важную роль в процессе передачи сигналов между клетками.

В основном фосфат поглощается клетками в форме неорганического ортофосфата (далее именуемого Pi). Поступление Pi в микроорганизмы зависит от функции импортеров, присутствующих в клеточной мембране. Ранее известные импортеры Pi включают Pst-систему, которая представляет собой высокоаффинную систему импортера Pi, экспрессия которой регулируется путем распознавания внеклеточной концентрации Pi; Pit-система, которая экспрессируется независимо от концентрации Pi и вводит Pi в смешанной форме с ионами металлов; и антипортерную систему транспорта, которая вводит глицерин-3-фосфат и глюкозо-6-фосфат в форме фосфорорганического соединения, и т.д.

Сообщалось о нескольких типах способов, используемых в производстве аминокислот посредством регулирования системы Pit среди систем импортеров Pi, но не сообщалось о влиянии системы Pit на продуцирование нуклеиновых кислот. Кроме того, в отношении увеличения продуцирования аминокислот было подтверждено, что ослабление или усиление экспрессии Pit-системы приводит к разным результатам для каждого микроорганизма и аминокислоты. В случае продуцирования аминокислот можно подтвердить, что регулирование системы поступления Pi в определенном направлении не имеет одинакового влияния на увеличение или уменьшение количества продукции (US 9506094 В2, US 9873898 В2).

Описание изобретения

Техническая задача

Проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в предложении микроорганизма Corynebacterium stationis, обладающего способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды, у которого усилена активность системы импортера фосфата (Pit-системы), и способа получения пуриновых нуклеотидов с использованием этого микроорганизма.

Техническое решение

Цель настоящего изобретения заключается в предложении микроорганизма Corynebacterium stationis, обладающего способностью продуцировать нуклеотиды, у которого усилена активность системы импортера фосфата (Pit-системы).

Другая цель настоящего изобретения заключается в предложении способа получения пуриновых нуклеотидов, включающего: культивирование микроорганизма Corynebacterium stationis, обладающего способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды, в среде.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении композиции для получения пуриновых нуклеотидов, включающей микроорганизм Corynebacterium stationis, обладающий способностью продуцировать нуклеотиды; среду, на которой культивируют микроорганизм; или их комбинацию.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении применения микроорганизма Corynebacterium stationis, обладающего способностью продуцировать нуклеотиды, для получения пуриновых нуклеотидов.

Полезные эффекты

Поступление фосфата, ключевого компонента в производстве пуриновых нуклеотидов, в микроорганизмы можно облегчить путем усиления активности импортера фосфата согласно настоящему изобретению. В результате микроорганизм, обладающий способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды, может эффективно продуцировать пуриновые нуклеотиды и может вносить значительный вклад в снижение затрат при получении пуриновых нуклеотидов в промышленном масштабе.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Ниже настоящее изобретение будет описано подробно. При этом, каждое описание и воплощение, раскрытые здесь, могут быть применены к другим описаниям и воплощениям, соответственно. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых здесь, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, в настоящем описании указан ряд статей и патентных документов. Содержание указанных статей и патентных документов включено в данное описание изобретения посредством ссылки во всей их полноте, и уровень технической области, к которой относится настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения будут описаны более ясно.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм Corynebacterium stationis, обладающий способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды, в котором усилена активность системы импортера фосфата (Pit-системы), кодируемой геном pit.

При использовании здесь термин ”система импортера фосфатов” относится к полипептиду, имеющему функцию введения фосфата в клетку, или к системе, содержащей его. Система импортера фосфатов может включать в себя импортер фосфата. Для целей настоящего изобретения система импортера фосфатов может представлять собой Pit-систему.

При использовании здесь термин “импортер фосфатов” относится к полипептиду, который играет роль во внутриклеточном поглощении фосфата. Фосфат в основном поглощается клетками в форме неорганического ортофосфата (далее именуемого Pi) и, как известно, зависит от функции импортеров, присутствующих в клеточной мембране. Конкретно, ранее известные импортеры Pi включают Pst-систему, Pit-систему и антипортерную транспортную систему, которая вводит глицерин-3-фосфат и глюкозо-6-фосфат в форме фосфорорганического соединения, и т.д., но без ограничения ими.

При использовании здесь термин “Pit-система” относится к импортеру транспортафосфатов (транспортер фосфатов с низкой аффинностью; импортер теллурита; далее именуемый Pit), который проявляет низкую аффинность к Pi. Экспрессия Pit-системы не зависит от концентрации внеклеточного Pi, и известно, что Pi вводится в клетки в виде комплекса катионов металлов {JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2001, p.5008-5014 Vol. 183, No. 17).

Pit-система может включать по меньшей мере один полипептид, кодируемый по меньшей мере одним геном, выбранным из pit, pit1, pit2, pit3, pitA, pitB и pitC, или полипептид Pit, Pit1, Pit2, Pit3, PitA, PitB и PitC, и для целей настоящего изобретения Pit-система может представлять собой полипептид, кодируемый геном pitA (транспортер неорганического фосфата), или полипептид PitA, но без ограничения ими.

Pit-система может включать полипептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, но эта система или полипептид этим не ограничиваются, так как аминокислотная последовательность фермента, проявляющего активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов.

Полипептид PitA или полипептид, кодируемый геном pitA, может состоять из полипептида, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, но без ограничения этим.

Полипептид PitA или полипептид, кодируемый геном pitA, может иметь, включать, состоять из, или по существу состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но без ограничения этим. Более конкретно, SEQ ID NO: 1 может представлять собой полипептидную последовательность, обладающую активностью импортера фосфата, кодируемую геном pitA.

В одном воплощении полипептид, кодируемый геном pitA, может включать полипептид, имеющий гомологию или идентичность 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более с аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, но без ограничения этим.

Аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 можно получить из различных баз данных, например из NCBI GenBank, известной базы данных и т.д., но без ограничения этим. В одном примере аминокислотная последовательность может быть получена из Escherichia coli, но без ограничения этим, и может включать любую последовательность, имеющую такую же активность, что и вышеуказанная аминокислотная последовательность, без ограничения. Кроме того, хотя полипептид, имеющий активность импортера фосфата, Pit-система или PitA по настоящему изобретению определены какполипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, не исключены добавление в него бессмысленной последовательности до или после аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, природная мутации или молчащая мутация, и специалисту в данной области техники очевидно, что, пока полипептид обладает активностью, идентичной или соответствующей активности полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, он может относиться к полипептиду, имеющему активность импортера фосфата, Pit-системе или PitA по настоящему изобретению.

В конкретном воплощении полипептид, имеющий активность импортера фосфата, Pit-системы или PitA по настоящему изобретению, может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или аминокислотной последовательности, имеющей гомологию или идентичность 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более.

Полипептид, имеющий активность полипептида PitA, или полипептид, кодируемый геном pitA, может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или аминокислотной последовательности, имеющей гомологию или идентичность 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более.

Кроме того, очевидно, что любой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением в части последовательности, также может быть включен в объем полипептида по настоящему изобретению, при условии, что аминокислотная последовательность имеет такую гомологию или идентичность и проявляет эффективность, соответствующую эффективности этого полипептида.

Несмотря на то, что в настоящем изобретении он описывается как “полипептид, включающий аминокислотную последовательность с определенным SEQ ID NO, “полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности с определенным SEQ ID NO” или “полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с определенным SEQ ID NO”, очевидно, что любой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой, консервативной заменой или добавлением в части последовательности, также можно использовать в настоящем изобретении, пока этот полипептид может иметь активность, идентичную или соответствующую активности полипептида, состоящего из аминокислотнойпоследовательности с соответствующим SEQ ID NO. Например, он может включать добавления последовательности, которые не изменяют функцию белка по настоящему изобретению, на N-конце и/или С-конце аминокислотной последовательности, встречающиеся в природе мутации, молчащие мутации в ней или консервативные замены.

При использовании здесь термин “консервативная замена” относится к замене одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена, как правило, может происходить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатка. Обычно консервативные замены могут иметь незначительное влияние или не иметь никакого влияния на активность полипептида.

Pit-система может кодироваться одним или несколькими генами, выбранными из pit, pit1, pit2, pit3, pitA, pitB и pitch, но без ограничения этим. Конкретно, Pit-система может кодироваться полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, но без ограничения этим вследствие вырождения кодонов. Pit-система может кодироваться полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию или идентичность 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, но без ограничения этим.

Полипептид PitA или полипептид, кодируемый геном pitA, может кодироваться полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, но без ограничения этим. Полипептид PitA или полипептид, кодируемый геном pitA, может кодироваться полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию или идентичность 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, но без ограничения этим.

В настоящем изобретении аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 может кодироваться полинуклеотидом, включающим, например, последовательность нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO: 2.

При использовании здесь “полинуклеотид”, который представляет собой полимер нуклеотидов, состоящий из нуклеотидных мономеров, соединенных в длинную цепь посредством ковалентной связи, представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую по меньшей мере конкретную длину. В настоящем изобретении полинуклеотид может кодировать полипептид, имеющий активность импортера фосфата или Pit-системы, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, но без ограничения этим.

Полинуклеотид может включать любой полинуклеотид без ограничения, при условии, что он представляет собой полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий активность импортера фосфата, Pit-системы или PitA согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность импортера фосфата или Pit-системы, может представлять собой любой один или более генов, выбранных из pit, pit1, pit2, pit3, pitA, pitB и pitC, и ген может быть получен из Escherichia coli, но без ограничения этим.

Конкретно, полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий активность импортера фосфата, Pit-системы или PitA, может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Полинуклеотид может подвергаться различным модификациям в кодирующей области без изменения аминокислотной последовательности полипептида из-за вырождения кодонов или с учетом кодонов, предпочтительных в организме, в котором должен экспрессироваться полипептид. Полинуклеотид может включать, например, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 и может состоять из нуклеотидной последовательности, имеющей гомологию или идентичность 80%, конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более, 96% или более, 97% или более, или 98% или более, или даже более конкретно 99% или более от этого, но без ограничения этим.

Кроме того, может быть включен зонд, который может быть получен из известной последовательности гена, например любой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной всей или части нуклеотидной последовательности, в строгих условиях для кодирования аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, без ограничения. “Строгие условия” относятся к условиям, которые допускают специфическую гибридизацию между полинуклеотидами. Такие условия подробно раскрыты в литературе (например, в J. Sambrook et al., выше). Например, строгие условия могут включать условия, в которых полинуклеотиды, имеющие высокую гомологию или идентичность, полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность 40% или более, конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, и особенно конкретно 99% или более, гибридизуются друг с другом, в то время как полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность ниже указанной выше гомологии или идентичности, не гибридизуются друг с другом; или могут включать обычные условия промывки для Саузерн-гибридизации, тоесть промывку один раз, конкретно два или три раза, с концентрацией соли и температурой, соответствующими 60°С, 1×SSC (цитратно-солевой раствор), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), конкретно 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS и, более конкретно, 68°СС, 0,1×SSC, 0,1% SSD.

Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя, в зависимости от строгости гибридизации, возможны несоответствия между основаниями. Термин “комплементарный” используется для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. В отношении, например, ДНК, аденин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, настоящее изобретение также может включать изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный всей последовательности, а также нуклеиновую последовательность, по существу аналогичную ей.

Конкретно, полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность, могут быть обнаружены с использованием условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении T_m, равном 55°С, в описанных выше условиях. Кроме того, значение T_m может представлять собой 60°С, 63°С или 65°С, но без ограничения этим, и может соответствующим образом регулироваться специалистом в данной области техники в зависимости от их цели.

Соответствующая строгость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины и степени комплементарности полинуклеотидов, и эти переменные хорошо известны в данной области техники (смотри Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

При использовании здесь термин “гомология” или “идентичность” относится к степени родства между двумя взятыми аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями и она может быть выражена в процентах. Термины гомология и идентичность часто можно использовать взаимозаменяемо друг с другом.

Гомология последовательности или идентичность консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть определена посредством стандартных алгоритмов выравнивания и может использоваться вместе со штрафом за пробелы по умолчанию, установленным используемой программой. По существу, обычно ожидается, что гомологичные или идентичные последовательности гибридизуются по всей длине или, по меньшей мере, примерно с 50%, 50%, 60%, 70%, 80%, или 90% от всей длины последовательностей в умеренных или очень строгих условиях. Также можнорассматривать полинуклеотиды, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующихся полинуклеотидах.

Имеют ли какие-либо две полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологию, сходство или идентичность, может быть, например, определено посредством известного компьютерного алгоритма, такого как программа “FASTA” (Pearson et al, (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444) с использованием параметров по умолчанию. Альтернативно, это может быть определено посредством алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который выполняют с использованием программы Needleman из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (пакет программ GCG (Devereux, J., et at, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), В LAS TP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J. MOLECBIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO et al.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с помощью BLAST или ClustalW Национального центра биотехнологической информации.

Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов могут быть определены путем сравнения информации о последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, такой как Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, которая описана в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В общем, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность в виде значения, полученного путем деления количества аналогично выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и весовую матрицу сравнения (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)) в Gribskov et al. (1986) Nucl Acids Res. 14:6745, которая описана в Schwartz and DayhofF, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979); (2) штраф в размере 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф в размере 0,10 за каждый символ в каждом пробеле (или штраф за открытие пробела в размере 10 и штраф за удлинение пробела в размере 0,5); и (3) отсутствие штрафа за конечные пробелы.

Кроме того, имеют ли какие-либо две полинуклеотидные или полипептидныепоследовательности гомологию, сходство или идентичность, можно определять посредством сравнения последовательностей с помощью экспериментов по Саузерн-гибридизации в определенных строгих условиях, и соответствующие условия гибридизации, которые должны быть определены, могут быть установлены посредством способа в объеме настоящего изобретения, который известен специалисту в данной области техники (например J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; F. M. Ausubel et at, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

В одном воплощении усиление активности системы импортера фосфата может представлять собой усиление активности полипептида, кодируемого геном pitA, но без ограничения этим.

В одном воплощении ген pitA по настоящему изобретению может представлять собой чужеродный ген pitA. В другом воплощении микроорганизмом по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, в который был введен чужеродный ген pitA или чужеродный полипептид pit, но без ограничения этим. Кроме того, он включает те микроорганизмы, в которых были усилены введенные чужеродные гены или полипептиды. Конкретно, чужеродный ген pitA может быть получен из Escherichia sp.или Escherichia coli, но без ограничения этим.

При использовании здесь термин “усиление полипептидной активности” означает, что активность полипептида повышена по сравнению с его эндогенной активностью. Усиление может быть использовано взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия, увеличение и т.д. В частности, термины активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать оба случая, в которых проявляется активность, не имевшаяся первоначально, или активность усилена по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации. “Эндогенная активность” относится к активности конкретного полипептида, которой первоначально обладал родительский штамм до трансформации, или немодифицированный микроорганизм, когда признак изменен путем генетической вариации вследствие естественного или искусственного фактора. Эндогенную активность также можно взаимозаменяемо использовать с “активностью до модификации”. “Усиление”, “повышающая регуляция’, “сверхэкспрессия” или “увеличение” активности полипептида по сравнению с эндогенной активностью означает, что активность полипептида усилена по сравнению с активностью конкретного полипептида, которойпервоначально обладал родительский штамм до трансформации, или немодифицированный микроорганизм.

Усиление может быть достигнуто путем введения чужеродного полипептида или усиления активности и/или концентрации (уровня экспрессии) эндогенного полипептида. Усилена активность полипептида или нет, может быть подтверждено по активности или уровню экспрессии соответствующего полипептида или по увеличению количества продукта, полученного из соответствующего полипептида.

Усиление активности полипептида может быть вызвано различными способами, хорошо известными в данной области техники, и не ограничено, пока оно может усиливать активность целевого полипептида по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. Конкретно, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известную специалистам в данной области техники, которая представляет собой распространенный способ молекулярной биологии, но способ этим не ограничивается (например Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16; Sambrook et al., Molecular Cloning 2012, etc.).

Конкретно, усиление полипептидной активности по настоящему изобретению может быть достигнуто посредством:

1) увеличения числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) замены области, регулирующей экспрессию гена, кодирующего полипептид на хромосоме, последовательностью, имеющей сильную активность;

3) модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид;

4) модификации аминокислотной последовательности полипептида таким образом, что активность полипептида усиливается;

5) модификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, таким образом, что активность полипептида усиливается (например модификации полинуклеотидной последовательности гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности этого полипептида);

6) введения чужеродного полипептида, проявляющего полипептидную активность, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего такой полипептид;

7) кодон-оптимизации полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) анализа третичной структуры полипептида и, посредством этого, выбора имодификации экспонированного сайта, или химической модификации того же самого; или

9) комбинации из двух или более, выбранных из приведенных выше пунктов 1-8, но без ограничения конкретно этим.

Более конкретно:

1) Способ увеличения числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть осуществлен путем введения в клетку-хозяина вектора, который функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, и способен реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина. Альтернативно, способ может быть осуществлен путем введения одной копии или двух копий полинуклеотидов, кодирующих полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому можно выполнять посредством введения вектора, который способен встраивать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но без ограничения этим. Вектор является таким, как описано выше.

2) Способ замены области, регулирующей экспрессию (или последовательности, регулирующей экспрессию) гена, кодирующего полипептид на хромосоме, последовательностью, имеющей сильную активность, может быть осуществлен, например, посредством индуцирования модификации последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены, или их комбинации для дальнейшего усиления активности области, регулирующей экспрессию, или путем замены последовательности последовательностью, обладающей более сильной активностью. Область, регулирующая экспрессию, может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую окончание транскрипции и трансляции и т.д, но конкретно не ограничивается этим. В одном примере способ может включать замену исходного промотора сильным промотором, но без ограничения этим.

Примеры известных сильных промоторов могут включать промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR лямбда-фага, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt, промотор уссА и т.д., но сильный промотор этим не ограничивается.

3) Способ модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон, или 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид, может быть осуществлен, например, путем замены нуклеотидной последовательностинуклеотидной последовательностью, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую степень экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но этим не ограничивается.

Способы 4) и 5) модификации аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности могут быть осуществлены путем индуцирования модификации последовательности посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены аминокислотной последовательности полипептида или полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или их комбинации для усиления активности полипептида или посредством замены последовательности аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью, модифицированной для придания более сильной активности, или аминокислотную последовательность, или полинуклеотидной последовательности, модифицированной для усиления активности, но не ограничиваются этим. Замену можно выполнять конкретно посредством вставки полинуклеотида в хромосому путем гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Вектор, используемый в настоящем изобретении, может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.

6) Способ введения чужеродного полинуклеотида, проявляющего активность полипептида, может быть осуществлен путем введения в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, который проявляет активность такую же/аналогичную активность, что и полипептид. Чужеродный полинуклеотид можно использовать без ограничения, независимо от его происхождения или последовательности, при условии, что он проявляет такую же/ аналогичную активность, что и полипептид. Введение может быть выполнено обычным специалистами в данной области техники посредством выбора соответствующим образом способа трансформации, известного в данной области техники, и экспрессия введенного полинуклеотида в клетке-хозяине позволяет продуцировать полипептид, повышая тем самым его активность.

7) Способ кодон-оптимизации полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть осуществлен путем кодон-оптимизации эндогенного полинуклеотида для увеличения транскрипции или трансляции в клетке-хозяине или путем оптимизации его кодонов таким образом, что могут быть достигнуты оптимизированные транскрипция и трансляция чужеродного полинуклеотида в клетке-хозяине.

Кроме того, 8) способ анализа третичной структуры полипептида и, тем самым, выбора и модификации экспонированного участка или его химической модификации может быть осуществлен, например, путем сравнения информации о последовательности подлежащего анализу полипептида с базой данных, в которой хранится информация о последовательности известных белков, для определения матричных белков-кандидатов в соответствии со степенью сходства последовательностей и, таким образом, подтверждения структуры на основе этой информации, тем самым выбирая и трансформируя или модифицируя экспонированный сайт, подлежащий модификации или химической модификации.

Такое усиление активности полипептида может означать, что активность или концентрация (уровень экспрессии) соответствующего полипептида повышена относительно активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в штамме дикого типа или в микроорганизме до модификации, или что количество продукта, получаемого от полипептида, увеличено, но без ограничения этим.

Модификация части или всего полинуклеотида в микроорганизме по настоящему изобретению может быть осуществлена посредством (а) гомологичной рекомбинации с использованием вектора для хромосомной вставки в микроорганизм или редактирования генома с использованием сконструированной нуклеазы (например CRISPR-Cas9), и/или (б) может быть индуцирована светом, таким как ультрафиолетовые лучи и радиация и т.д., и/или химической обработкой, но без ограничения этим. Способ модификации части или всего гена может включать в себя способ, использующий технологию рекомбинантной ДНК. Например, часть или весь ген может быть делетирован посредством инъекции нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную гену-мишени, в микроорганизм для индуцирования гомологичной рекомбинации. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор могут включать доминантный селективный маркер, без ограничения этим.

В настоящем изобретении полипептид, предназначенный для усиления активности, может представлять собой импортер фосфата, и, конкретно, он может представлять собой Pit-систему или полипептид, кодируемый геном pitA, или полипептид PitA. Для целей настоящего изобретения усиление активности может быть достигнуто путем введения чужеродной Pit-системы, чужеродного полипептида, кодируемого геном pitA, или чужеродного полипептида PitA, но без ограничения этим.

Для целей настоящего изобретения усиление активности системы импортера фосфата может включать введение чужеродного гена pitA или полипептида, кодируемогочужеродным pitA, но без ограничения этим.

При использовании здесь термин ”введение полипептида” может означать проявление активности специфического полипептида, которой микроорганизм первоначально не обладал, или проявление улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации полипептида. Например, может быть введен конкретный полипептид, полинуклеотид, кодирующий конкретный полипептид, может быть введен в хромосому внутри микроорганизма, или вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий конкретный полипептид, может быть введен в микроорганизм для проявления его активности.

При использовании здесь термин “чужеродный ген” относится к ненативному (неприродному) гену, включенному в микроорганизм. Например, он может представлять собой (а) ген, который не может быть обнаружен естественным образом в микроорганизме (экзогенный), (б) ген, который может быть обнаружен естественным образом в микроорганизме (эндогенный), но транскрипция или трансляция этого гена в микроорганизме приводит к неестественному количеству (большему или меньшему количеству по сравнению с количеством, присутствующим в природе), (в) полипептидную последовательность, которая эндогенно присутствует в микроорганизме, но последовательность гена, кодирующего ее, отличается, и/или (г) комбинацию в микроорганизме двух или более из приведенного выше, но без ограничения этим.

Для целей настоящего изобретения, так как pit-система не существует в микроорганизме Corynebacterium stationis, чужеродный ген может представлять собой чужеродный ген pitA, может представлять собой ген pitA из Escherichia sp.или может представлять собой ген pitA, полученный из Escherichia coli, но без ограничения этим.

Вектор по настоящему изобретению может включать конструкцию ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, функционально связанный с подходящим участком, регулирующим экспрессию (последовательностью, регулирующей экспрессию) таким образом, чтобы иметь возможность экспрессировать целевой полипептид в подходящей клетке-хозяине. Область, регулирующая экспрессию, может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность для регуляции окончания транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящую клетку-хозяина вектор может реплицироваться илифункционировать независимо от генома хозяина или может интегрироваться в его геном.

Вектор, используемый в настоящем описании, конкретно не ограничен, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры обычно используемого вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, АРП, t10, t11, Charon4A и Charon21A и т.д.; и в качестве плазмидного вектора, можно использовать вектора на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL и pET, и т.д. Конкретно, можно использовать вектор pDZ, pDC, pdc2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.д.

В одном примере полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, может быть встроен в хромосому с помощью вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку полинуклеотида в хромосому можно выполнять посредством любого способа, известного в данной области, например посредством гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Вектор может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения встраивания в хромосому. Селективный маркер предназначен для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения того, была ли введена целевая молекула нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые обеспечивают селектируемые фенотипы, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофия, устойчивость к клеточным токсичным агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. Только клетки, экспрессирующие селективный маркер, способны выживать или проявлять разные фенотипы в среде, обработанной селективным агентом, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.

При использовании здесь термин “трансформация” относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый этим полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. До тех пор, пока трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, не имеет значения, интегрирован ли трансформированный полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина и локализован в ней, или он локализован внехромосомно, и могут быть включены оба случая. Кроме того, полинуклеотид может включать ДНК и/или РНК, кодирующие целевой полипептид. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид можетбыть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все элементы, необходимые для ее автономной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, терминатор транскрипции, сайт связывания рибосомы или терминатор трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме самовоспроизводящегося вектора экспрессии. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина таким, какой он есть, и функционально связан с последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине, но без ограничивается этим.

Кроме того, при использовании здесь термин ”функционально связанный” означает, что полинуклеотидная последовательность функционально связана с промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой вариант по настоящему изобретению.

При использовании здесь термин “штамм (или микроорганизм)” включает все микроорганизмы дикого типа, или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие вставки чужеродного гена, или усиления или инактивации активности эндогенного гена и т.д., и может представлять собой микроорганизм, включающий генетическую модификацию для получения нужного полипептида, белка или продукта.

При использовании здесь термин “микроорганизм Corynebacterium stationis, обладающий способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды” относится к микроорганизму, который обладает способностью продуцировать и накапливать внутри организма пуриновые нуклеотиды в качестве целевого продукта или секретировать или накапливать пуриновые нуклеотиды в среде, когда микроорганизм культивируют в среде. В одном воплощении термин “обладающий способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды” может быть использован взаимозаменяемо с “продуцирующий пуриновые нуклеотиды”. Способность продуцировать пуриновые нуклеотиды может быть свойством штамма микроорганизма Corynebacterium stationis дикого типа, и может быть придана или усилена посредством генетической модификации.

Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды по настоящему изобретению, может представлять собой рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность продуцировать пуриновые нуклеотиды посредствомусиления активности системы импортера фосфата (Pit-системы), кодируемой геном pit. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность продуцирования пуриновых нуклеотидов, может обладать повышенной продуктивностью пуриновых нуклеотидов по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или с микроорганизмом с немодифицированной системой импортера фосфата (т.е. микроорганизмом, экспрессирующим систему импортера фосфата дикого типа, микроорганизмом без усиленной системы импортера фосфата или микроорганизмом, который не экспрессирует систему импортера фосфатов), но не ограничивается этим. В одном примере микроорганизм с немодифицированной системой импортера фосфата, целевой штамм, подлежащий сравнению в отношении того, повышена ли способность продуцировать пуриновые нуклеотиды, может представлять собой CJX1664 (КССМ12285Р, KR 10-1950141 B1, US 2020-0392478 A1), CJX1665 (КССМ12286Р, KR 10-1950141 B1, US 2020-0392478 A1), CJI2332 (KCCM12277P, KR 10-1950141 B1, US 2020-0392478 A1) или CJI2335 (KCCM12278P, KR 10-1956510 B1, EP 3705572 A1), но без ограничения ими.

В одном примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность продуцирования, может иметь способность продуцировать пуриновые нуклеотиды, повышенную примерно на 1% или более, конкретно примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или более, примерно на 6% или более, примерно на 7% или более, примерно на 8% или больше, примерно 9% или более, примерно 10% или более, примерно 11% или более, примерно 11,5% или более, примерно 12% или более, или примерно 13% или более (верхний предел конкретно не ограничен, например примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 40% или менее, или примерно 30% или менее), по сравнению со способностью родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма, но без ограничения этим, при условии, что он имеет повышенное + значение по сравнению со способностью продуцирования родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность продуцирования, может иметь способность продуцирования пуриновых нуклеотидов, повышенную примерно в 1,01 раза или более, примерно в 1,02 раза или более, примерно в 1,03 раза или более, примерно в 1,05 раза или более, примерно в 1,06 раза или более, примерно в 1,07 раза или более, примерно в 1,08 раза или более больше, примерно в 1,09 раза или более, примерно в 1,10 раза или более, примерно в 1,11 раза или более, примерно в 1,12 раза или более, илипримерно в 1,13 раза или более (верхний предел конкретно не ограничен, например примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, или примерно в 2 раза или менее) по сравнению с исходным штаммом до модификации или немодифицированным микроорганизмом, но без ограничения этим. При использовании здесь термин “примерно” относится к диапазону, который включает в себя все из ±0,5, ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 и т.д., и включает в себя все значения, которые эквивалентны или аналогичны значениям, указанным далее, но диапазон этим не ограничивается.

Микроорганизм, обладающий способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды по настоящему изобретению, может представлять собой микроорганизм, обладающий способностью продуцировать целевой полипептид или целевой продукт, вовлеченный в продуцировании целевого полипептида путем включения одного или более из pit-системы, полипептида PitA; полинуклеотида, кодирующего их; и вектора, содержащего указанный полинуклеотид, но без ограничения этим. Микроорганизм может представлять собой микроорганизм, который естественным образом обладает способностью продуцировать целевой полипептид или целевой продукт, или микроорганизм, у которого способность продуцировать целевой полипептид или целевой продукт была придана родительскому штамму, не обладающему способностью продуцировать целевой полипептид или целевой продукт, но без ограничения этим.

При использовании здесь термин “немодифицированный микроорганизм” не исключает штамм, содержащий мутацию, которая может возникать в микроорганизме естественным образом, и может относиться к штамму дикого типа или к самому штамму природного типа, или к штамму до изменения свойства вследствие генетической модификации, вызванной естественными или искусственными факторами. Например, немодифицированный микроорганизм может относиться к штамму, в котором описанная здесь система импортера фосфата не введена или не усилена, или к штамму до ее усиления или введения. “Немодифицированный микроорганизм” можно использовать взаимозаменяемо со “штаммом до модификации”, “микроорганизмом до модификации”, “немутантным штаммом”, “немодифицированным штаммом”, “немутантным микроорганизмом” или “референсным микроорганизмом”.

При использовании здесь “пуриновый нуклеотид” может представлять собой любой один или более нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из 5'-инозинмонофосфата (IMP), 5'-ксантозинмонофосфата (ХМР) и 5'-гуанозинмонофосфата (GMP). IMP представляет собой дезаминированное адениновоесоединение и относится к нуклеотиду, состоящему из одной молекулы гипоксантина, рибозы и фосфата. IMP может быть биосинтезирован из 5'-фосфорибозил-1-пирофосфата (PRPP), и, конкретно, он может быть образован посредством замещения пирофосфатной группы, связанной с первым углеродом PRPP с атомом азота, и посредством образования имидазольного кольца и пиримидинового кольца за девять стадий, но без ограничения этим. ХМР относится к нуклеотиду, получаемому в результате дегидрирования IMP, и может быть синтезирован из IMP при помощи инозин-5'-монофосфатдегидрогеназы, но без ограничения этим. GMP относится к нуклеотиду, имеющему структуру, в которой фосфатная группа образует сложноэфирную связь в рибозе молекулы гуанозина. GMP может быть синтезирован путем добавления молекул аммиака к ХМР с помощью биосинтазы 5'-гуаниловой кислоты (GMP-синтазы), но без ограничения этим.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения пуриновых нуклеотидов, включающий культивирование микроорганизма Corynebacterium stationis, обладающего способностью продуцировать пуриновые нуклеотиды, в котором усилена активность системы импортера фосфата (Pit-системы), в среде.

Система импортера фосфатов, Pit-система, усиление, пуриновый нуклеотид и микроорганизм Corynebacterium stationis и т.д. являются такими, как описано в других аспектах выше.

При использовании здесь термин ”культивирование” означает, что микроорганизм выращивают в надлежащим образом контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению можно осуществлять в подходящей культуральной среде и условиях культивирования, известных в данной области техники. Такой процесс культивирования может легко адаптировать для использования специалистами в данной области техники в соответствии с выбранным штаммом. Конкретно, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и/или периодическое культивирование с подпиткой, но без ограничения этим.

При использовании здесь термин ”среда” относится к смеси веществ, которая содержит питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма, в качестве основного ингредиента, и она поставляет питательные вещества и факторы роста, вместе с водой, которая необходима для выживания и роста. Конкретно, среда и другие условия культивирования, используемые для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, могут представлять собой любую среду, используемую дляобычного культивирования микроорганизмов, без особого ограничения. Однако микроорганизм по настоящему изобретению можно культивировать в аэробных условиях в обычной среде, содержащей подходящий источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамин, при регулировании температуры, рН и т.д.

В настоящем изобретении источник углерода может включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и т.д.; сахарные спирты, такие как маннит, сорбит и т.д.; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота, лимонная кислота и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, лизин и т.д. Кроме того, источник углерода может включать натуральные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, меласса, черная патока, рисовые отруби, маниока, патока из сахарного тростника, кукурузный экстракт и т.д. Конкретно, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованная предварительно обработанная меласса (т.е. меласса, превращенная в восстанавливающий сахар), и, кроме того, можно использовать различные другие источники углерода в подходящем количестве без ограничения. Эти источники углерода можно использовать по отдельности или в комбинации двух или более видов, но без ограничения этим.

Источник азота может включать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и т.д.; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин, глутамин и т.д.; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукт ее разложения, обезжиренный соевый жмых или продукт его разложения и т.д. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации из двух или более видов, но без ограничения этим.

Источник фосфора может включать монокалийфосфат, дикалийфосфат или соответствующие натрийсодержащие соли и т.д. Примеры неорганических соединений могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и т.д. Кроме того, могут быть включены аминокислоты, витамины и/или соответствующие предшественники и т.д. Эти составляющие ингредиенты или предшественники можно добавлять в среду периодическим или непрерывным способом, но указанные источники фосфора не ограничиваются этим.

Кроме того, рН среды можно регулировать соответствующим образом путем добавления соединения, такого как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота и т.д., во время культивирования микроорганизма. Кроме того, образование пузырьков может быть предотвращено во время культивирования с помощью пеногасителя, такого как полигликолевый эфир жирных кислот. Кроме того, газообразный кислород или газ, содержащий кислород, можно вводить в среду для поддержания аэробных условий среды; или газообразный азот, газообразный водород или диоксид углерода можно вводить для поддержания анаэробных или микроаэробных условий, без введения газа, но газ не ограничивается этим.

Температура среды может находиться в диапазоне от 27°С до 37°С, конкретно от 30°С до 33°С, но без ограничения этим. Культивирование можно продолжать до тех пор, пока продуцирование полезного продукта не достигнет желаемого уровня. Конкретно, культивирование можно продолжать от 20 до 120 часов, но без ограничения этим.

Конкретно, питательную среду для микроорганизма рода Corynebacterium можно найти в литературе (“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)).

Пуриновые нуклеотиды, полученные посредством культивирования по настоящему изобретению, могут высвобождаться в среду или оставаться в клетках.

Способ получения пуриновых нуклеотидов по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию получения микроорганизма Corynebacterium stationis по настоящему изобретению, стадию приготовления среды для культивирования микроорганизма или их комбинацию (независимо от порядка, в любом порядке), например, перед стадией культивирования.

Способ получения пуриновых нуклеотидов по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию выделения пуриновых нуклеотидов из питательной среды (среды, на которой выращивали культуру) или микроорганизма (микроорганизма, из которого выращивали культуру). Стадия извлечения может быть дополнительно включена после стадии культивирования.

На стадии выделения нужные пуриновые нуклеотиды могут быть собраны с использованием способа культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, в соответствии со способом периодического культивирования, непрерывного культивирования или методом периодического культивирования с подпиткой. Например, можно использовать такие способы, как центрифугирование, фильтрация, обработка осадителем для кристаллизации белка (способ высаливания), экстракция, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрация, диализ, различные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.д., ВЭЖХ или их комбинацию, и нужные пуриновые нуклеотиды могут быть выделены из среды или микроорганизмов с использованием подходящих способов, известных в данной области техники.

Кроме того, способ получения пуриновых нуклеотидов по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию очистки, которую можно выполнять, используя подходящий способ, известный в данной области техники. В одном примере, когда способ получения пуриновых нуклеотидов по настоящему изобретению включает как стадию выделения, так и стадию очистки, стадию выделения и стадию очистки можно выполнять непрерывно или с перерывами независимо от порядка или одновременно, или можно объединять в одну стадию, но способ этим не ограничивается.

Конкретно, способ получения 5'-гуанозинмонофосфата (GMP) может дополнительно включать стадию превращения 5'-ксантозинмонофосфата (ХМР) в GMP на стадии культивирования. В способе получения GMP по настоящему изобретению стадию превращения можно дополнительно включать после стадии культивирования или стадии извлечения. Стадию превращения можно выполнять, используя подходящий способ, известный в данной области техники. Например, превращение можно выполнять с использованием коринеформных микроорганизмов, Escherichia coli или аминазы ХМР (KR 10-0655902 В1), но без ограничения этим.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается композиция для получения пуриновых нуклеотидов, включающая микроорганизм Corynebacterium stationis по настоящему изобретению; среду, на которой культивируют микроорганизм; или их комбинацию.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать любой подходящий эксципиент, обычно используемый в композициях для получения пуриновых нуклеотидов, и такие эксципиенты включают, например, консерванты, смачивающие агенты, диспергирующие агенты, суспендирующие агенты, буферы, стабилизаторы или изотонические агенты и т.д., но без ограничения этим.

В композиции по настоящему изобретению микроорганизм, среда и пуриновый нуклеотид и т.д. являются такими, как описано в других аспектах выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение микроорганизма Corynebacterium stationis по настоящему изобретению для получения пуриновых нуклеотидов.

При использовании для получения пуриновых нуклеотидов микроорганизм и пуриновый нуклеотид и т.д. являются такими, как описано в других аспектах выше.

Вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано посредством Примеров. Однако эти примеры представляют собой только предпочтительные Примеры, представленные в иллюстративных целях, и специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, очевидно, что не предполагается ограничивать этими Примерами объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение штамма с введенным чужеродным pitA и оценка продуктивности IMP

1-1: Получение рекомбинантного вектора для введения чужеродного гена pitA и получение штамма, продуцирующего IMP

У штаммов Corynebacterium stationis дикого типа отсутствует pit-система. Соответственно, получали вектор для введения чужеродной системы Pit в Corynebacterium stationis. Кроме того, промотор CJ1 (корейский патент №10-0620092, SEQ ID №: 3), известный сильный промотор среди промоторов микроорганизмов рода Corynebacterium, конъюгировали с чужеродным геном pitA. Получали вектор для замены геном fepB, одним из связывающих белков периплазмы микроорганизмов рода Corynebacterium.

Конкретно, для получения инсерционного вектора, способного делетировать ген fepB Corynebacterium stationis, хромосомный ген штамма АТСС6872, который представляет собой Corynebacterium stationis дикого типа, выделяли, используя G-spin total DNA extraction mini kit (G-спин мини-набор для извлечения тотальной ДНК (Cat. No. 17045, Intron) согласно протоколу, предлагаемому в наборе, и выполняли ПЦР, используя его в качестве матрицы. В качестве полимеразы использовали высокоточную ДНК-полимеразу (Intron) из Maxime PCR PreMix (i-pfu). ПЦР выполнял следующим образом: денатурация при 95°С в течение 5 минут с последующими 24 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 54°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд. В результате получали два разных продукта ПЦР (fepBdel-A, fepBdel-В). fepB-A имел размер 1038 п. н. и был амплифицирован с использованием SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 в качестве праймеров. fepB-B имел размер 1111 п. н. и был амплифицированс использованием SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 в качестве праймеров. Вторичную ПЦР выполняли, используя эти два вида продуктов амплификации в качестве матриц, методом сшивающей ПЦР. ПЦР выполняли в тех же условиях, как описано выше, и в результате получали продукт ПЦР из 2131 п. н., в котором ген fерВ делетирован и который включает сайты ферментов рестрикции SpeI и NotI в середине. Затем продукты амплификации расщепляли, используя сайты рестрикции (fepBdel-A: HindIII, fepBdel-B: HindIII), расположенные на обоих концах, и затем клонировали в вектор pDZ посредством лигазной активности Т4, и в результате получали вектор pDZ-fepBdel для делеции гена fepB. Последовательности используемых выше праймеров представляют собой следующие.

Вектор, в котором область нуклеиновой кислоты гена fepB, делетированного из вектора pDZ-fepBdel, заменена чужеродным pitA, получали следующим образом. Конкретно, выделяли хромосомы штамма дикого типа Corynebacterium stationis АТСС6782 и Е coli MG1655 и выполняли ПЦР с использованием хромосом в качестве матрицы и высокоточной ДНК-полимер азы (Intron) из Maxime PCR premix (i-pfu) в качестве полимеразы. ПЦР выполняли следующим образом: денатурация при 95°С в течение 5 минут с последующими 24 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 54°С в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 2 минут и 30 секунд. В результате ПЦР получали два продукта ПЦР (pCJ1-pitA-A, pCJ1-pitA-B) гена pitA, конъюгированного с промотором CJ1. pCJ1-pitA-A, который представляет собой продукт ПЦР промоторной области, имел размер 341 п. н. и был амплифицирован с использованием SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 в качестве праймеров. pCJ1-pitA-B, который представляет собой продуктПЦР гена pitA, имел размер 1537 п. н. и был амплифицирован, используя SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 в качестве праймеров. Вторичную ПЦР выполняли, используя два вида продуктов амплификации в качестве матриц, методом сшивающей ПЦР. ПЦР выполняли в тех же условиях, как описано выше, и в результате получали ген pitA, конъюгированный с промотором pCJ1, содержащий нуклеотидные последовательности, гомологичные вектору pDZ-fepBdel, на обоих концах. Этот ген клонировали в вектор pDZ-fepBdel, обработанный ферментами рестрикции SpeI и NotI, используя гомологичную рекомбиназу, с получением вектора pDZ-ΔfepB::pCJ1/pitA(Eco). Последовательности используемых выше праймеров являются следующими.

Затем полученный выше вектор pDZ-ΔfepB::pCJ1/pitA(Eco) трансформировали в каждый штамм CJI2332, который представляет собой продуцирующий IMP штамм (продуцирующий IMP штамм КССМ12277Р, полученный из АТСС6872 Corynebacterium stationis, патент Кореи №10-1950141, US 2020-0392478 Al) и СЛ2335 (IMP-продуцирующий штамм КССМ12278Р, полученный из Corynebacterium stationis АТСС6872, патент Кореи №10-1956510, ЕР 3705572 А1) посредством электропорации с получением штаммов, содержащих промотор CJ1-ген pitA в середине эндогенного гена. fepB на хромосоме, посредством второго процесса кроссинговера. Только что встроенный промотор CJ1-ген pitA подтверждали с использованием SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 в качестве праймеров, которые могут амплифицировать область, где сходятся оба конца встроенного гена и гена fepB. Таким же способом, как указано выше, получали два штамма, CJI2332_pCJ1/pitA и CJI2335_pCJ1/pitA, которые представляют собой штаммы, которыеконститутивно сверхэкспрессируют pitA, введенный экзогенно посредством промотора CJ1.

1-2. Оценка продуктивности IMP штамма с включенным чужеродным pitA

Для изучения улучшения продуктивности IMP штамма у CJI2332_pCJ1/pitA и штамма CJI2335_pCJ1/pitA, полученных в Примере 1-1, выполняли следующий эксперимент.

Каждый из CJI2332_pCJ1/pitA, CJI2332, CJI2335_pCJ1/pitA и CJI2335 высевали в 5 мл среды для посева в автоклавируемую тестируемую пробирку, имеющую диаметр 18 мм, и культивировали при встряхивании при температуре 30°С в течение 24 часов и использовали в качестве бульона для посевной культуры. 29 мл ферментационной среды разливали в встряхиваемую 250 мл колбу Эрленмейера и затем автоклавировали при температуре 121°С в течение 15 минут. После этого в нее высевали 2 мл бульона с посевной культурой и культивировали в течение 3 суток. Условия культивирования контролировали при 170 оборотах в минуту, 30°С и рН 7,5. Составы среды для посева и среды для ферментации были следующими.

Среда для посева IMP

1% глюкозы, 1% пептона, 1% мясного экстракта, 1% дрожжевого экстракта, 0,25% хлорида натрия, 100 мг/л аденина, 100 мг/л гуанина, рН 7,2 (из расчета на 1 л среды)

Среда для ферментации в колбе IMP

0,1% глутамата натрия, 1% хлорида аммония, 1,2% сульфата магния, 0,01% хлорида кальция, 20 мг/л сульфата железа, 20 мг/л сульфата марганца, 20 мг/л сульфата цинка, 5 мг/л сульфата меди, 23 мг/л L-цистеина, 24 мг/л аланина, 8 мг/л никотиновой кислоты, 45 мкг/л биотина, 5 мг/л тиамина-HCl, 30 мг/л аденина, 1,9% фосфорной кислоты (85%), 4,2% глюкозы, 2,4% сахара-сырца (из расчета на 1 л среды).

Результаты измерения продуцирования IMP посредством способа с использованием ВЭЖХ после завершения культивирования приведены в Таблице 4 ниже.

Таблица 4

Как показано в Таблице 4, было подтверждено, что при одинаковых условиях выход накопления IMP, продуцированного штаммом CJI2332_pCJ1/pitA и штаммом CJI2335_pCJ1/pitA, увеличился примерно на 13% и примерно на 12,5% соответственно по сравнению с родительскими штаммами CJI2332 и CJI2335. CJI2332_pCJ1/pitA был назван CJI2630 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором 13 апреля 2021 года, с регистрационным номером КССМ12974Р.

CJI2335_pCJ1/pitA был назван CJI2631 и депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором 13 апреля 2021 года, с регистрационным номером КССМ12975Р.

Пример 2: Получение штамма с введенным чужеродным pitA и оценка продуктивности ХМР

2-1: Получение штамма с введенным чужеродным pitA

pDZ-ΔfepB::pCJ1/pitAA(Eco) трансформировали в каждый из штаммов CJX1664, который представляет собой штамм, продуцирующий ХМР (штамм КССМ12285Р, продуцирующий ХМР, полученный из Corynebacterium stationis, патент Кореи №10-1950141, US 2020-0392478 Al), и CJX1665, который представляет собой вариантный штамм purA (G85S) CJX1664 (КССМ12286Р, патент Кореи №10-1950141, US 2020-0392478 A1) посредством электропорации с получением штамма CJX1664_pCJ1/pitA и штамма CJX1665_pCJ1/pitA, содержащих ген pCJ1-pitA в середине эндогенного гена fepB на хромосоме, посредством второго процесса кроссинговера. Только что встроенный ген pCJ1-pitA подтверждали с использованием SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 в качестве праймеров, которые могут амплифицировать область, где сходятся оба конца введенного гена и гена fepB.

Оценка продуктивности ХМР чужеродного гена с введенным pitA

Для измерения продуктивности ХМР у штамма CJX1664_pCJ1/pitA и штамма CJX1665_pCJ1/pitA, полученного в Примере 2-1, выполняли тест в колбе. Каждый из CJX1664, CJX1664_pCJ1/pitA, CJX1665 и CJX1665_pCJ1/pitA высевали в пробирку 14 мл, содержащую 2,5 мл следующей среды для посева, и культивировали при встряхивании при 30°С и 170 об/мин в течение 24 часов. 0,7 мл бульона посевной культуры высевали в 250 мл колбу с угловой перегородкой, содержащую 32 мл (24 мл основной среды +8 мл отдельной стерильной среды) следующей среды для продуцирования и культивировали при встряхивании при 30°С и 170 об/мин в течение 75 часов. Составы среды для посева, основной среды и отдельной стерильной среды следующие.

Среда для посева в колбе ХМР

30 г/л глюкозы, 15 г/л пептона, 15 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л хлорида натрия, 3 г/л мочевины, 150 мг/л аденина, 150 мг/л гуанина, рН 7,0 (из расчета на 1 л среды)

Среда для продуцирования ХМР в колбе (основная среда)

50 г/л глюкозы, 10 г/л сульфата магния, 100 мг/л хлорида кальция, 20 мг/л сульфата железа, 10 мг/л сульфата марганца, 10 мг/л сульфата цинка, 0,8 мг/л сульфата меди, 20 мг/л гистидина, 15 мг/л цистеина, 15 мг/л бета-аланина, 100 мкг/л биотина, 5 мг/л тиамина, 50 мг/л аденина, 25 мг/л гуанина, 15 мг/л ниацина, рН 7,0 (из расчета на 1 л среды)

Среда для продуцирования ХМР в колбе (отдельная стерильная среда)

18 г/л однозамещенного фосфата калия, 42 г/л двухосновного фосфата калия, 7 г/л мочевины, 5 г/л сульфата аммония (из расчета на 1 л среды)

Результаты измерения продуцирования ХМР посредством способа с использованием ВЭЖХ после завершения культивирования показаны в Таблице 5 ниже.

Как показано в Таблице 5 выше, концентрация ХМР, продуцированного СJХ1664_ pCJ1/pitA и CJX1665_pCJ1/pitA, которые представляют собой штаммы, которые конститутивно экспрессируют pita E coli, увеличилась на 6,7% и 6,4%, соответственно, по сравнению с родительскими штаммами CJX1664 и CJX1665.

Исходя из вышеизложенного, специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, может понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технических концепций или существенных характеристик настоящего изобретения. В связи с этим приведенные в качестве примеров воплощения, раскрытые здесь, предназначены только для иллюстративных целей и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, предполагается, что настоящее изобретение охватывает не только приведенные в качестве примеров воплощений, но также различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в пределах сути и объема настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

--->

<110> CJ CheilJedangCorporation

<120> МИКРООРГАНИЗМ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ПУРИНОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ, И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ C ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

<130> OPA22030

<150> KR 10-2021-0065740

<151> 2021-05-21

<160> 13

<170>KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 499

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>PitA

<400> 1

Met Leu His LeuPhe Ala GlyLeu Asp Leu His ThrGlyLeuLeuLeu

1 5 10 15

LeuLeu Ala Leu Ala Phe Val LeuPhe Tyr Glu Ala Ile AsnGlyPhe

20 25 30

His Asp Thr Ala Asn Ala Val Ala Thr Val Ile Tyr ThrArg Ala Met

35 40 45

ArgSerGlnLeu Ala Val Val Met Ala Ala Val PheAsnPheLeuGly

50 55 60

Val LeuLeuGlyGlyLeuSer Val Ala Tyr Ala Ile Val His Met Leu

65 70 75 80

Pro Thr Asp LeuLeuLeuAsn Met GlySerSer His GlyLeu Ala Met

85 90 95

Val PheSer Met LeuLeu Ala Ala Ile IleTrpAsnLeuGlyThrTrp

100 105 110

Tyr PheGlyLeu Pro Ala SerSerSer His ThrLeu Ile Gly Ala Ile

115 120 125

Ile Gly Ile GlyLeuThrAsn Ala Leu Met ThrGlyThrSer Val Val

130 135 140

Asp Ala LeuAsn Ile Pro Lys Val LeuSer Ile PheGlySerLeu Ile

145 150 155 160

Val Ser Pro Ile Val GlyLeu Val Phe Ala GlyGlyLeu Ile PheLeu

165 170 175

LeuArgArg Tyr TrpSerGlyThr Lys LysArg Ala Arg Ile His Leu

180 185 190

Thr Pro Ala GluArgGlu Lys Lys Asp Gly Lys LysLys Pro ProPhe

195 200 205

TrpThrArg Ile Ala Leu Ile LeuSer Ala Ile Gly Val Ala PheSer

210 215 220

His Gly Ala Asn Asp GlyGln Lys Gly Ile GlyLeu Val Met Leu Val

225 230 235 240

Leu Ile Gly Val Ala Pro Ala GlyPhe Val ValAsn Met Asn Ala Thr

245 250 255

Gly Tyr Glu Ile ThrArgThrArg Asp Ala Ile AsnAsn Val Glu Ala

260 265 270

Tyr PheGluGln His Pro Ala LeuLeu Lys Gln Ala ThrGly Ala Asp

275 280 285

GlnLeu Val Pro Ala Pro Glu Ala Gly Ala ThrGln Pro Ala GluPhe

290 295 300

His Cys His Pro SerAsnThr Ile Asn Ala LeuAsnArgLeu Lys Gly

305 310 315 320

Met LeuThrThr Asp Val GluSer Tyr Asp Lys LeuSerLeu Asp Gln

325 330 335

ArgSerGln Met ArgArg Ile Met LeuCys Val Ser Asp Thr Ile Asp

340 345 350

Lys Val Val Lys Met Pro Gly Val Ser Ala Asp AspGlnArgLeuLeu

355 360 365

Lys LysLeu Lys Ser Asp Met LeuSerThr Ile Glu Tyr Ala Pro Val

370 375 380

Trp Ile Ile Met Ala Val Ala Leu Ala LeuGly Ile GlyThr Met Ile

385 390 395 400

GlyTrpArgArg Val Ala ThrThr Ile GlyGlu Lys Ile Gly Lys Lys

405 410 415

Gly Met Thr Tyr Ala GlnGly Met Ser Ala Gln Met Thr Ala Ala Val

420 425 430

Ser Ile GlyLeu Ala Ser Tyr ThrGly Met Pro Val SerThrThr His

435 440 445

Val LeuSerSerSer Val Ala GlyThr Met Val Val Asp GlyGlyGly

450 455 460

LeuGlnArg Lys Thr Val ThrSer Ile Leu Met Ala Trp Val PheThr

465 470 475 480

Leu Pro Ala Ala Val LeuLeuSerGlyGlyLeu Tyr TrpLeuSerLeu

485 490 495

GlnPheLeu

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>pitA

<400> 2

atgctacatttgtttgctggcctggatttgcataccgggctgttattattgcttgcactg 60

gcttttgtgctgttctacgaagccatcaatggtttccatgacacagccaacgccgtggca 120

accgttatctatacccgcgcgatgcgttctcagctcgccgtggttatggcggcggtattc 180

aactttttgggtgttttgctgggtggtctgagtgttgcctatgccattgtgcatatgctg 240

ccgacggatctgctgcttaatatgggatcgtctcatggccttgccatggtgttctctatg 300

ttgctggcggcgattatctggaacctgggtacctggtactttggtttacctgcatccagc 360

tctcatacgctgattggcgcgatcatcgggattggtttaaccaatgcgttgatgaccggg 420

acgtcagtggtggatgcactcaatatcccgaaagtattaagtattttcggttctctgatc 480

gtttcccctattgtcggcctggtgtttgctggcggtctgattttcttgctgcgtcgctac 540

tggagcggcaccaagaaacgcgcccgtatccacctgaccccagcggagcgtgaaaagaaa 600

gacggcaagaaaaagccgccgttctggacgcgtattgcgctgatcctttccgctatcggc 660

gtggcgttttcgcacggcgcgaacgatggtcagaaaggcattggtctggttatgttggta 720

ttgattggcgtcgcgccagcaggcttcgtggtgaacatgaatgccactggctacgaaatc 780

acccgtacccgtgatgccatcaacaacgtcgaagcttactttgagcagcatcctgcgctg 840

ctcaaacaggctaccggtgctgatcagttagtaccggctccggaagctggcgcaacgcaa 900

cctgcggagttccactgccatccgtcgaataccattaacgcgctcaaccgcctgaaaggt 960

atgttgaccaccgatgtggaaagctacgacaagctgtcgcttgatcaacgtagccagatg 1020

cgccgcattatgctgtgcgtttctgacactatcgacaaagtggtgaagatgcctggcgtg 1080

agtgctgacgatcagcgcctgttgaagaaactgaagtccgacatgcttagcaccatcgag 1140

tatgcaccggtgtggatcatcatggcggtcgcgctggcgttaggtatcggtacgatgatt 1200

ggctggcgccgtgtggcaacgactatcggtgagaaaatcggtaagaaaggcatgacctac 1260

gctcaggggatgtctgcccagatgacggcggcagtgtctatcggcctggcgagttatacc 1320

gggatgccggtttccactactcacgtactctcctcttctgtcgcggggacgatggtggta 1380

gatggtggcggcttacagcgtaaaaccgtgaccagcattctgatggcctgggtgtttacc 1440

cttccggctgcggtactgctttccggcgggctgtactggctctccttgcagttcctgtaa 1500

1500

<210> 3

<211> 301

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>промотор CJ1

<400> 3

caccgcgggcttattccattacatggaatgaccaggaatggcagggaatgcgacgaaatt 60

gactgttgtcgggagcttctgatccgatgctgccaaccaggagagaaaataatgacatgt 120

gcaggcacgctggtgagctggagatttatgatctcaagtaccttttttcttgcactcgag 180

ggggctgagtgccagaatggttgctgacaccaggttgaggttggtacacactcaccaatc 240

ctgccgtcgcgggcgcctgcgtggaacataaaccttgagtgaaacccaatctaggagatt 300

a 301

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>fepBdel-A-F

<400> 4

cccaagcttccggtgttcagaatcgctccg

30

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>fepBdel-A-R

<400> 5

gcggccgcaaaggactagtcctccggcattcagtcaggtc 40

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>fepBdel-B-F

<400> 6

ctagtcctttgcggccgcccattccgcccttcaaccttccgcctagattacttctc 56

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>fepBdel-B-R

<400> 7

cccaagcttgtgcaagctgtggatcgtctt cc

32

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCJ1-pitA-A-F

<400> 8

ttcgacctgactgaatgccggaggaaccgcgggcttattccattacatg 49

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCJ1-pitA-A-R

<400> 9

caaacaaatgtagcatttaatctcctagattgggtttcactcaagg 46

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCJ1-pitA-B-F

<400> 10

acccaatctaggagattaaatgctacatttgtttgctggcctg 43

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCJ1-pitA-B-R

<400> 11

cggaaggttgaaggcggattacaggaactgcaaggagagc cag 43

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>fepBdel-check-F

<400> 12

gacctgactgaatgccggag g

21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>fepBdel-check-R

<400> 13

ggaaggttgaaggcggagtg g

21

<---

Claims (10)

1. Микроорганизм Corynebacterium stationis, имеющий способность продуцировать пуриновые нуклеотиды, у которого усилена активность системы импортера фосфата, кодируемой геном pit, и где усиление активности системы импортера фосфата представляет собой усиление активности полипептида, кодируемого геном pitA.

2. Микроорганизм по п. 1, где ген pitA представляет собой чужеродный ген pitA.

3. Микроорганизм по п. 2, где чужеродный ген pitA получен из E.coli.

4. Микроорганизм по п. 1, где полипептид, кодированный геном pitA, содержит полипептид, имеющий идентичность 99% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

5. Микроорганизм по п. 1, где пуриновый нуклеотид представляет собой любой один или более выбранных из группы, состоящей из 5'-инозинмонофосфата, 5'-ксантозинмонофосфата и 5'-гуанозинмонофосфата.

6. Способ получения пуринового нуклеотида, включающий культивирование микроорганизма по любому из пп. 1-5 в среде.

7. Способ по п.6, который дополнительно включает выделение пуриновых нуклеотидов из культивируемого микроорганизма или среды.

8. Способ по п. 6, где пуриновый нуклеотид представляет собой любой один или более выбранных из группы, состоящей из 5'-инозинмонофосфата, 5'-ксантозинмонофосфата и 5'-гуанозинмонофосфата.

9. Композиция для получения пуринового нуклеотида, включающая по меньшей мере один материал, выбранный из микроорганизма по любому из пп. 1-5 и среды, на которой культивируют микроорганизм по любому из пп. 1-5, и эксципиенты.

10. Применение микроорганизма по любому из пп. 1-5 для продуцирования пуринового нуклеотида.