RU2843363C1 - Способ получения биологически активной добавки к пище, обладающей противоопухолевой активностью - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области нутрициологии, а именно способам получения биологически активных добавок (БАД) к пище, обладающих противоопухолевым эффектом. Способ получения БАД к пище характеризуется тем, что используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus) и трутовик скошенный (Inonotus Obliquus). При этом проводят экстрагирование высушенных и измельченных растительных компонентов по отдельности при соотношении сырье-экстрагент 1:10 поочередной последовательностью трехкратно 70 % водным раствором этанола и двукратно 96 % водным раствором этанола при температуре 20-24°С в течение 24 часов на каждом этапе. Затем осуществляют упаривание этанольных экстрактов с последующим лиофильным высушиванием до получения сухого экстракта. Полученные сухие экстракты объединяют в равной пропорции. Изобретение позволяет расширить ассортимент БАД к пище, обладающих противоопухолевой активностью. 1 табл.

Description

Изобретение относится к области нутрициологии, а именно способам получения биологически активных добавок к пище, обладающих противоопухолевым эффектом.

Среди средств для профилактики онкологических заболеваний на основе природного сырья известны средства, например, на основе настойки травы татарника колючего (см. RU № 2356566, кл. А61К 36/28, А61Р 35/00, А61Р 37/02, опубл. 27.05.2009); композиции растений из астрагала перепончатого, корни шлемника байкальского, корневища и корни вздутоплодника сибирского (см. RU № 2603465, кл. А61К 36/539, А61К 36/23, А61К 36/481, B01D 11/02, А61Р 9/10, А61Р 39/06, опубл. 27.11.2016); композиции растений из листьев вздутоплодника, лопуха водяного, цветов ольхи, семян укропа, травы чистотела, крапивы и шалфея в равных частях (см. RU № 2011151961, кл. А61К 36/00, опубл. 27.06.2013); композиции растений из багульника, аира болотного, кровохлебки, календулы, конского щавеля, черной смородины, бессмертника песчаного, шиповника, цикория, спорыша, подорожника, рябины черноплодной, черники, хвоща полевого, шелковицы черной, чабреца, полыни, солодки, зверобоя, терна (см. RU № 2080867, кл. А61К 35/78, А23С 3/00, опубл. 10.06.1997).

Кроме того, известны средства для профилактики и лечения онкологических заболеваний (см. RU № 2118166, кл. А61К 35/78, опубл. 27.08.1998; RU № 2208446, кл. А61К 35/78, А61Р 35/00, А61Р 39/06, опубл. 20.07.2003; RU № 2118536, кл. А61К 35/78, опубл. 10.09.1998), в которых представлены экстракты из герани, подорожника, календулы, лапчатки кустарниковой (курильский чай) и дягиля (дудник). В качестве объектов испытаний заявленных средств использованы культуры клеток линии карциномы легкого A-549 и мыши линии BDF1 с перевивными опухолями: лимфоцитарной лейкемией Р-388, миеломоноцитарной лейкемией L-1210 и опухолью Эрлиха.

При этом в известных решениях отсутствуют результаты исследований микробиологической обсемененности препаратов, необходимые для оценки их эффективности. Кроме того, многокомпонентный состав средств приводит к удорожанию их себестоимости, обусловленного сбором биосырья, произрастающего в различных условиях, и затратами при изготовлении биопрепаратов, связанными с проведением многочисленных анализов.

В народной медицине известно использование вздутоплодника сибирского и трутовика скошенного (чаги) как средства против многих патологических состояний.

Вздутоплодник сибирский (Phlojodicarpus sibiricus) у народов Сибири и Якутии применяли при ожирении, туберкулезе легких, заболеваниях щитовидной железы, желудка и сердца, ревматизма, атеросклероза, при лечении ран и опухолях желудка и пищевода (см. Баторова С.М., Яковлев Г.П., Асеева Т.А. Справочник лекарственных растений традиционной тибетской медицины / Баторова С.М., Яковлев Г.П., Асеева Т.А., Новосибирск: Наука, 2013; Кузнецова Л.В., Михалева Л.Г., Захарова В.И. Атлас лекарственных растений Якутии / Кузнецова Л.В., Михалева Л.Г., Захарова В.И., под ред. Б. И. Иванов, Якутск: Изд-во ЯНЦ СО РАН, 2003. 224 c.; Barnaulov, O.D.; Belenovskaya, L.M.; Medvedeva, L.I. Plant Resources of USSR: Flowering Plants, Chemical Components, Uses-Family Rutaceae-Elaegnaceae / Barnaulov, O.D.; Belenovskaya, L.M.; Medvedeva, L.I., Ленинград: Nauka, 1988. 357 c.). Активно использовался в фармацевтике при производстве препаратов димидина, фловерина и сафинора, которое приостановлено по причине сокращения численности популяций и, соответственно, отсутствия сырья (см. Васильева О.Д. Вздутоплодник сибирский Phlojodicarpus Sibiricus (Steph. ex Spreng.) K.- Pol. в Якутии: Биология, интродукция, охрана. Диссертация ... кандидата биологических наук. Якутск, 2005. 170 с.; Громакова А.И., Исайкина А.П., Кривут Б.А., Вандышев В.В. Изучение содержания виснадина и дигидросамидина в сырье вздутоплодника сибирского // Хим. -фарм. журн. 1982. Т. 16. № 4. С. 60-66; Пименов М.Г., Бабилев Ф.В., Никонов Г.К. Phlojodicarpus Turcz. и Libanotis L. Как источники получения кумаринов со спазмолитической активностью // Растительные ресурсы. 1968. Т.4. №4. С. 486-491). Известно, что полифенолы природного происхождения оказывают протективное действие в отношении развития опухолей органов ротовой полости, желудка, двенадцатиперстной кишки, печени, легких, кожи, яичников, шейки матки, молочной и предстательной желез (см. Amararathna M., Johnston M.R., Rupasinghe H.P.V. Plant polyphenols as chemopreventive agents for lung cancer // Int. J. Mol. Sci. 2016. № 8 (17). C. 1352; Amin A.R.M.R., Kucuk O., Khuri F.R., Shin D.M. Perspectives for cancer prevention with natural compounds // J. Clin. Oncol. 2009. № 16 (27). C. 2712–2725; Kozlowska A. Szostak-Wegierek D. Flavonoids – food sources and health benefits // Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 2014. № 2 (65). C. 79–85; Li Q., Ren F.Q., Yang C.L., Zhou L.M., Liu Y.Y., Xiao J., Zhu L., Wang Z.G. Anti-proliferation effects of isorhamnetin on lung cancer cells in vitro and in vivo // Asian Pac. J. Cancer Prev. 2015. № 7 (16). C. 3035–3042; Pandey K.B., Rizvi S.I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human htalth and disease // Oxid. Med. Cell. Long. 2009. № 5 (2). C. 270–278; Romano B., Pagano E., Montanaro V., Fortunato A.L., Milic N., Borrelli F. Novel insights into the pharmacology of flavonoids. // Phytother. Res. 2013. № 11 (27). C. 1588–1596; Sak K. Cytotoxicity of dietary flavonoids on different human cancer types // Pharmacogn. Rev. 2014. № 16 (8). C. 122–146; Zhou Y., Zheng J., Li Y., Xu D.P., Li S., Chen Y.M., Li H.B. Natural polyphenols for prevention and treatment of cancer // Nutrients. 2016. № 8 (8)).

Присутствие радикалов в клетках организма связано с процессами жизнедеятельности и играет важную роль в прооксидантно-антиоксидантном равновесии. При этом окислительное повреждение является результатом эндогенных и экзогенных факторов образования активных форм кислорода. К числу внутренних источников окислителей относят митохондриальную электронно-транспортную цепь и реакцию синтеза синтазы оксида азота, а также немитохондриальные реакции (см. Gilca M., Stoian I., Atanasiu V., Virgolici B. The oxidative hypothesis of senescence // J. Postgrad. Med. 2007. № 3 (53). C. 207–213). Чрезмерное образование свободных радикалов вызывает угнетение естественной клеточной антиоксидантной защиты и приводит к ухудшению функциональности организма (см. Poljsak B., Milisav I. Aging, oxidative stress and antioxidants под ред. Morales-González J.A., Croatia: Intech Open Access Publisher, 2013.C. 331–356). В качестве одной из важнейших стратегий снижения окислительного стресса выделяют потребление экзогенных антиоксидантов, как правило, растительного происхождения (см. Packer L. Oxidative stress, antioxidants, aging and disease под ред. Cutler R.G., Packer L., Bertram J., Mori A., 1995.C. 1–14; Ames B.N, Shigenaga M.K, Hagen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. (90). C. 7915–7922). В частности, флавоноиды способны ингибировать три этапа развития раковых клеток: инициирование – влияние на оксидативный стресс и инактивацию канцерогенов; активирование (промоцию) – ингибирование клеточной пролиферации и распространение - активация апоптоза, ингибировании ангиогенеза и подавлении метастазирования опухоли (см. Chachar M.K., Sharma N., Dobhal M.P., Joshi Y.C. Flavonoids: A versatile source of anticancer drugs // Pharmacogn. Rev. 2011. № 9 (5). C. 1–12; Li F., Li S., Li H.B., Deng G.F., Ling W.H., Xu X.R. Antiproliferative activities of tea and herbal infusions // Food Funct. 2013. № 4 (4). C. 530–538 Li Q., Ren F.Q., Yang C.L., Zhou L.M., Liu Y.Y., Xiao J., Zhu L., Wang Z.G. Anti-proliferation effects of isorhamnetin on lung cancer cells in vitro and in vivo // Asian Pac. J. Cancer Prev. 2015. № 7 (16). C. 3035–3042; Majewski G., Lubecka-Pietruszewska K., Kaufman-Szymczak A., Fabianowska-Majewska K. Anticarcinogenic capabilities of plant polyphenols: Flavonoids and stilbene // Pol. J. Public Health. № 4 (122). C. 434–439; Mantena S.K. Grape seed proanthocyanidins induce apoptosis and inhibit metastasis of highly metastatic breast carcinoma cells // Carcinogenesis. 2005. № 8 (27). C. 1682–1691; Middleton E.Jr., Kandaswami C., Theoharidis T.C. The effects of plant flavonoids on mammalian biology: Implications for inflammations, heart disease and cancer // Pharmacol. Rev. 2000. № 4 (52). C. 673–751).

Известно, что в экстракте листьев вздутоплодника (P.sibiricus), произрастающего на территории Якутии, содержится: эфирное масло 2,11 мг/г сухой массы, кумарины 56,28 мг/г сухой массы, кофеоилхинные кислоты 18,62 мг/г сухой массы, водорастворимые полисахариды 3,74, пектин 2,67, триацилглицерол 755,1 мкг/мг протеина. Компонентный состав листьев P.sibiricus включает фенилпропаноиды: 1-O-кофеоил-глюкоза, 1-O-кофеоилхиновая кислота, 6-O-кофеоил-глюкоза и 5-O-кофеоилхиновая кислота; флавоноиды: диосметин-7-O-глюкозид и хризоериол-7-O-глюкозид; хелактоны и его производные: хеллактон 4’-О-метиловый эфир, хеллактон 4’-О-ацетиловый эфир, хеллактон 3’-о-ацетил-4’-о-изобутироиловый эфир (хьюганин D), хеллактон 3′-O-изовалероил-4′-O-ацетилловый эфир (дигидросамидин), хеллактон-3'-O-глюкозид (праэрозид II); кумарины: умбеллиферон-О-дезоксигексозил-О-гексозид, умбеллиферон-7-О-(6”-апиосил)-глюкозид (6”-апиосилскиммин), пецеданол-3'-O-глюкозид (см. Olennikov D.N., Fedorov I.A., Kashchenko N.I., Chirikova N.K. Cecile Vennos. Khellactone Derivatives and Other Phenolics of Phlojodicarpus sibiricus(Apiaceae): HPLC-DAD-ESI-QQQ-MS/MS and HPLC-UV Profile, and Antiobesity Potential of Dihydrosamidin // Molecules. № 12 (24). C. 2286). Кроме того, включает хеллактон, хеллактон 4′-O-метиловый эфир, хьюганин D, хеллактон 3'-О ацетил-4'-О-(2-метилбутироил) эфир, 6'-апиозил-скиммин, виснадин, суксдорфин и изоимператорин (см. Gantimur D., Syrchina A.I., Semenov A.A. Isoimperatorin from Phlojodicarpus sibiricus. // Chem. Nat. Comp. 1986. (22). C. 103–104; Gantimur D., Syrchina A.I., Semenov A.A. Khellactone derivatives from Phlojodicarpus sibiricus. // Chem. Nat. Comp. 1986. (22). C. 103–104; Nikonov G.K., Vandyshev V.V. Visnadin—A new component of the plant genus Phlojodicarpus. // Chem. Nat. Comp. 1969. (5). C. 101–102).

Наличие в экстракте листьев P. sibiricus содержания кофеоилхинных кислот может обусловливать гипогликемическое, гипохолестеринемическое, гепатопротекторное, противоопухолевое действие на организм человека (см. Giamperi L., Bucchini A., Cara P., Fraternale D., Ricci D., Genovese S., Curini M., Epifano F. Composition and antioxidant activity of Nepeta foliosa essential oil from Sardinia (Italy) // Chemistry of Natural Compounds. 2009. (45). C. 554–556). Установлено, что экстракт травы P. sibiricus оказывает цитотоксический эффект на диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, вызывая снижение экспрессии антиапоптотических членов семейства Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1, индуцируя коллапс потенциала митохондриальной мембраны, что вызывает апоптоз (см. Kim Jisu, Kim Dong, Nam Jehyun, Jeon Byeol, Okhlopkova Zhanna, Zulfugarov Ismayil, Kim Sang-Woo Anti-lymphoma Activities of Phlojodicarpus sibiricus and Artemisia kruhsiana Besser Extracts // Journal of Life Science. 2020. № 4 (30). C. 379–385). Особое внимание исследователей также уделяется эфирам хеллактона с их высокой эффективностью в качестве антиадипогенных средств, установлено, что дигидропиранокумарины группы хеллактонов могут оказывать ингибирующее действие на адипогенез (см. Nugara, R.N.; Inafuku, M.; Takara, K.; Iwasaki, H.; Oku, H. Pteryxin: A coumarin in Peucedanum japonicum Thunb leaves exerts antiobesity activity through modulation of adipogenic gene network. // Nutrition. 2014. (30). C. 1177–1184). Таким образом, растительные компоненты, содержащиеся в экстрактах P. sibiricus, могут влиять на процессы подготовки и распространения клеток из первичного очага при лимфогематогенном метастазировании.

Кроме того, из уровня техники известно использование P. sibiricus в качестве сырья, обладающего иммуномодулирующей активностью (см. RU № 2496510, кл. A61K 36/738, A61K 36/23, A61K 36/28, A61K 36/484, A61K 36/533, A61K 36/55, A61K 36/57, А61K 36/704, B01D 11/02, А61Р 37/02, опубл. 27.10.2013), источника макро- и микроэлементов (см. RU № 2263511, кл. А61К 35/78, А61Р 39/00, опубл. 10.11.2005), источника пиранокумаринов широкого применения в фармацевтике (см. RU № 2666920, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.09.2018), источника дигидросамидина и виснадина, ставшими основой препарата «Фловерин» (см. SU № 876136, кл. А61К 35/78, опубл. 30.10.1981), компонента фиточая (см. RU № 2746625, кл. А23F 3/34, опубл. 19.04.2021). В способе получения биопрепарата на основе вздутоплодника сибирского по патенту RU № 2818479 (кл. А61К 36/23, B01D 11/02, А61Р 35/00, опубл. 02.05.2024) в качестве сырья используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского, собранную в период цветения, а именно, листья, стебли и цветки, при этом предварительно высушенное и измельченное сырье экстрагируют водными растворами этанола.

Чага (Inonotus Obliquus, трутовик скошенный, черный березовый гриб, зольный конк, клинкерный полипор, cinder conk, березовый полип, инонотус скóшенный, chaga и т.д.) - старинное народное средство, издавна используемое населением России, северо-западной части Европы, Сибири, Кореи, Канады для лечения желудочно-кишечных заболеваний, воспалительных процессов и раковых опухолей. Установлено, что чага и препараты на ее основе благоприятно влияют на больной организм и могут быть перспективными для применения в лечебно-профилактической онкологии. За счет суммарного комплекса биологически активных веществ (гуминоподобные полифенольные соединения, флавоноиды, лектины, микро- и макроэлементы) препараты чаги оказывают многофункциональное фармакологическое действие, в т.ч. противовоспалительное и общетонизирующее. Они активируют обмен веществ в мозговой ткани и повышают биоэлектрическую активность коры головного мозга, регулируют метаболические процессы и повышают защитные реакции организма, купируют болевой синдром, диспептические явления и нормализуют функции кишечника, улучшают общее состояние и качество жизни даже больных раком IV стадии (см. Шашкина М.Я., Шашкин П.H. Чага в онкологии // Российский биотерапевтический журнал. 2005. № 4). Также установлено, что водный экстракт чаги достоверно ингибировал активность раковых органоидов рака мочевого пузыря (см. Abugomaa A, Elbadawy M, Ishihara Y, Yamamoto H, Kaneda M, Yamawaki H, Shinohara Y, Usui T, Sasaki K. Anti-cancer activity of Chaga mushroom (Inonotus obliquus) against dog bladder cancer organoids. // Front Pharmacol. 2023. (19)), при этом выделенные фракции тритерпеноидных кислот обладают высокой антипролиферативной активностью по отношению к линиям раковых клеток HT-29, AGS, MCF-7 и PC3 (см. Kim J, Yang SC, Hwang AY, Cho H, Hwang KT. Composition of Triterpenoids in Inonotus obliquus and Their Anti-Proliferative Activity on Cancer Cell Lines // Molecules. № 18 (25). C. 4066).

Противоопухолевая активность достигается либо путем подавления множественных онкогенных сигналов, включая, помимо прочего, активацию NF-κB и FAK, а также экспрессию RhoA/MMP-9 через сигнальный путь ERK1/2 и PI3K/Akt. Противоопухолевая активность также может быть достигнута путем ингибирования активности тирозиназы через сигнальный путь, зависимый от PAK1, или изменения проницаемости лизосомальной мембраны посредством блокирования полимеризации тубулина и/или нарушения энергетического метаболизма через путь LKB1/AMPK. Кроме того, метаболиты I. obliquus также обладают потенциалом против молекулярных механизмов лекарственной устойчивости либо посредством селективного ингибирования белков P-gp/ABCB1 или MRP1/ABCC1, либо посредством индукции остановки контрольной точки G2/M в опухолевых клетках химиорезистентных фенотипов, опосредованной сигнальным путем Nox/ROS/NF-kB/STAT3 (см. Zhao Y, Zheng W. Deciphering the antitumoral potential of the bioactive metabolites from medicinal mushroom Inonotus obliquus // J Ethnopharmacol. 2021. (265)). Ингибирование роста раковых клеток in vitro и in vivo опосредовано макрофагами, благодаря высокой продукции IL-12p70, запускаемой полисахаридами I. obliquus (см. Wold CW, Christopoulos PF, Arias MA, Dzovor DE, Oynebraten I, Corthay A, Inngjerdingen KT Fungal polysaccharides from Inonotus obliquus are agonists for Toll-like receptors and induce macrophage anti-cancer activity. // Commun Biol. 2024. № 1 (7). C. 222).

Кроме того, из уровня техники известны решения, относящиеся к использованию чаги березовой (см. RU № 2438685, кл. А61К 36/06, В01D 11/02, опубл. 10.01.2012; RU № 2548767, кл. А61К 36/06, В01D 11/02, опубл. 20.04.2015; RU № 2406515, кл. А61К 36/06, А61Р 35/00, опубл. 20.12.2010; RU №2597160, кл. А61К 36/07, В01D 11/02, опубл. 10.09.2016). Преимущественно технологии направлены на извлечение биологически активных молекул чаги для последующего применения в фармацевтической промышленности. Многократно упоминаются онкопротекторная, иммуномодулирующая, антиоксидантная активности.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в получении биологически активной добавки к пище на основе вздутоплодника сибирского и трутовика скошенного, обладающей противоопухолевой активностью.

Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в получении экологически чистого и безопасного биопрепарата на основе надземной части вздутоплодника сибирского и трутовика скошенного.

Для решения поставленной задачи способ получения биологически активной добавки к пище на основе вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus) и трутовика скошенного (Inonotus Obliquus), характеризуется тем, что используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), проводят экстрагирование высушенных и измельченных растительных компонентов по отдельности при соотношении сырье-экстрагент 1:10 поочередной последовательностью трехкратно 70 % водным раствором этанола и двукратно 96 % водным раствором этанола при температуре 20-24°С в течение 24 часов на каждом этапе, затем осуществляют упаривание этанольных экстрактов с последующим лиофильным высушиванием до получения сухого экстракта, полученные сухие экстракты объединяют в равной пропорции.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, расширение ассортимента биопрепаратов, обладающих противоопухолевой активностью, и способов их получения. При этом получают лиофилизированный экстракт, способный подавлять рост раковых клеток HepG2, MCF-7, HeLa, HEp-2, который может найти применение для подавления опухолевого роста как отдельно, так и совместно с иными препаратами при комплексном лечении. Кроме того, простота выполнения технологических операций для получения лиофилизированного экстракта способствует его применению в профилактике и адъювантной терапии для подавления опухолевого роста.

Таким образом, биологически активная добавка к пище представляет собой композицию из экстрактов двух природных компонентов: надземной части вздутоплодника сибирского и трутовика скошенного (чаги березовой). Учитывая противоопухолевый эффект по отношению к раковым клеткам, обнадеживающими результатами исследований in vivo и многочисленным эмпирическим упоминаниям в народной медицине об эффективности различных средств на основе вздутоплодника сибирского и чаги березовой, предполагается, что сочетание этих растительных компонентов будет способствовать профилактике онкологических заболеваний и адъювантной терапии рака.

Для обеспечения выхода наибольшего спектра биохимического состава биологически активных веществ из внутриклеточной среды в экстрагент используют технологию водно-спиртовой экстракции. Биологически активные соединения, полученные экстракцией водно-этанольными смесями, являются экологически чистыми и токсически безопасными (см. Васильцова И.В., Бокова Т.И. Возможность использования экстрактов растительного сырья в качестве биологически активных добавок // Инновации и продовольственная безопасность. 2015. (3). C. 5–10; Нечипоренко И.А. Экстрагирование биологически активных веществ из тонко измельченного растительного сырья: диссертация кандидата технических наук, 1984; Пономарев В.Д. Экстрагирование растительного сырья. / Пономарев В.Д., Москва: Медицина, 1976. 202 c.).

Заявленное техническое решение включает многоэтапную раздельную водно-этанольную экстракцию вздутоплодника сибирского и чаги березовой с последующим выпариванием, лиофилизацией и смешиванием масс сухого остатка в равных пропорциях.

Таким образом, сущность заявленного решения состоит в том, что для приготовления биопрепарата используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского, выращиваемого, например, плантационно на открытом грунте, и березовой чаги, произрастающей в естественных условиях.

Для экспериментов высушивание надземной биомассы вздутоплодника сибирского и очищенной мелконарезанной биомассы чаги проводили в комнатных условиях без доступа света и в разных помещениях.

Высушенные компоненты измельчали механическим путем до порошкообразного состояния, после чего, осуществляли экстрагирование порошков последовательно водно-этанольными 70 % (трёхкратно) и 96 % (двухкратно) растворами в соотношении сырье-экстрагент 1:10 в течение 24 часов на каждый этап при температуре 20-24°С. Экстракты объединяли, упаривали на роторном испарителе до получения водной фракции, которую высушивали на лиофильной установке. Полученный сухой экстракт хранили в вакуумной упаковке в комнатных условиях без доступа света. Лиофилизат проверяли на обсемененность по ТР/ТС 021/2011.

Для экспериментов полученная смесь была исследована лабораторно для выявления противоопухолевой активности.

Микробиологические исследования. Была выполнена проверка смеси на отсутствие микробиологических агентов согласно требованиям к сырью для биологически активных добавок к пище по стандарту ТРТС 021/2011. Результаты исследования подтверждают отсутствие в смеси подобных агентов (см. таблицу).

Определение цитотоксической активности. Тесты проводили с целью оценки ингибирующего влияния образцов по отношению к раковым линиям клеток in vitro. Использовали линии HepG2 (гепатоцеллюларная карцинома), MCF-7 (аденокарциномы протоков молочной железы), HEp-2 (эпидермоидная карцинома гортани), HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки). Для контроля использовали здоровые соматические клетки – дермальные фибробласты человека, культивируемые в тех же условиях. А также для сравнения с известными препаратами с противоопухолевой активностью использовали препарат Доксорубицин, предназначенный для лечения лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Доксорубицин подавляет синтез ДНК и РНК: интеркалирует в двойную спираль ДНК между парами азотистых оснований (при этом нарушается матрица и изменяется пространственная структура) и вызывает расщепление ДНК вследствие образования свободных радикалов. Помимо этого, противоопухолевое действие возможно обусловлено изменением клеточных функций в результате связывания с липидами клеточных мембран и взаимодействием с топоизомеразой II (см. US №3590028, кл. С07С 47/18, С07С 95/04, опубл. 29.06.1971).

Культивирование клеток производили при 37°С с содержанием в атмосфере 5 % СО₂ в среде DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки до 10 % объема, раствора пирувата натрия концентрации 100мМ до 1 % объема, раствора антибиотика-антимикотика, содержащего пенициллина 10000 ЕД/мл, стрептомицина 10 мг/мл до 1 % объема. По достижению монослоя для получения клеточной суспензии культуру открепляли с применением фермента трипсин (0,25 % раствора) с последующей его инактивацией питательной средой.

Для осуществления теста использовали 96-ти луночный планшет. В каждую лунку вносили от 2500 до 2800 клеток в 200 мкл культуральной среды. Далее планшеты с клетками инкубировали 24 часа в СО₂ инкубаторе для адгезии клеток при температуре 37°С. Через 24 часа добавляли серийное разведение образца в питательной среде в исследуемые лунки. Разведение производили в диапазоне 1:10–1:10000 (0,01 г/мл (1:10); 0,001 г/мл (1:100); 0,0001 г/мл (1:1000) и 0,00001 г/мл (1:10000), исходя из исходной концентрации 0,1 г/мл (1:1)). Доксорубицин добавляли в концентрации 0,5 мг/мл. После внесения исследуемого вещества клетки инкубировали в СО₂ инкубаторе в стандартных условиях в течение 72 часов. По истечении указанного времени удаляли культуральную среду с исследуемыми веществами с помощью вакуумного аспиратора.

Измерение противоопухолевой активности было основано на методе МТТ. МТТ–тест является индикатором функции митохондрий в жизнеспособных клетках, основанной на восстановлении тетразолия. Выбор методики обусловлен тем, что МТТ имеет положительный заряд и легко проникает в живые эукариотические клетки. (3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-ифенилтетразолиум бромид) – МТТ-реагент под действием митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных клеток превращается в нерастворимый в воде формазан, имеющий фиолетовую окраску.

Для одного 96-ти луночного культурального планшета использовали раствор из 9 мл культуральной среды с прибавлением 1 мл МТТ-реагента (5 мг/мл в растворе Хэнкса), для чего, вносили по 100 мкл в каждую лунку планшета и инкубировали в СО₂ инкубаторе 3,5 часа. По истечении времени инкубации осторожно с помощью аспиратора удаляли питательную среду с исследуемыми веществами и в каждую лунку вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), далее инкубировали 10 мин. После чего, в лунках планшета наблюдали фиолетовое окрашивание. Детекцию фиолетового окрашивания проводили на планшетном ридере при 650 нм длине волны. При лизисе клеток кристаллы, сформированные в живых клетках, легко переходят в раствор ДМСО (диметилсульфоксид). По оптической плотности раствора формазана определяли активность митохондриальных дегидрогеназ, и соответственно, жизнеспособность клеток. Полученные данные оптической плотности в исследуемых лунках вносили в базу данных, которые далее были обработаны пакетом программ IBM SPSS Statistic 23.

При сравнительном анализе выявлено статистически значимые различия, свидетельствующие о наиболее эффективной цитотоксичности по отношению к раковым клеткам концентрации 0,01 г/мл (1:10) и 0,02 г/мл (1:5) по сравнению с другими меньшими концентрациями и контрольной группой (р=0,000). Каждая концентрация была представлена в 16 лунках планшета.

Результаты статистического анализа указывают на то, что выраженный цитотоксический эффект имеет концентрация образца 0,02 г/мл (1:5), которая оказалась близким к показателям лекарственного препарата Доксорубицин. А также выявлено отсутствие цитотоксического влияния образцов на культуры дермальных фиробластов.

Таким образом, проведенное экспериментальное исследование указывает на наличие ингибирующей активности лиофилизата водно-этанольного экстракта вздутоплодника сибирского и чаги березовой по отношению к культивированным раковым клеткам HepG2, MCF-7, HeLa, HEp-2.

Предлагаемый способ получения биопрепарата по сравнению с известными аналогами имеет следующие преимущества:

- состоит из двух растительных компонентов – вздутоплодника сибирского и березовой чаги, противоопухолевая активность каждого из которых доказана экспериментально, что обеспечивает высокую эффективность при лечении и профилактики онкологических заболеваний;

- растительные компоненты получены из возобновляемого экологически чистого и экономически выгодного сырья, при этом используют надземную часть биомассы вздутоплодника сибирского, выращенного, например, плантационным методом, и мясистую основу березовой чаги, произрастающей в условиях резкоконтинентального северного климата;

- является асептическим сухим экстрактом длительного хранения, готовый к употреблению и легко смешиваемый при капсулировании/таблетировании.

Таблица

Результаты микробиологических исследований растительной смеси

№№ п/п	Исследуемые показатели	Допустимые уровни	Результаты
1	Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), КОЕ/г, не более	5*105	Не обнаружено
2	Бактерии группы кишечных палочек (колиформы), не допускается в массе продукта, г	0,01	Не обнаружено
3	E. Coli, не допускается в массе продукта, г	0,1	Не обнаружено
4	S. aureus, не допускается в массе продукта, г	1,0	Не обнаружено
5	Плесень, КОЕ/г, не более	103	Не обнаружено
6	Дрожжи, КОЕ/г, не более	100	Не обнаружено

Claims (1)

1. Способ получения биологически активной добавки к пище на основе вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus) и трутовика скошенного (Inonotus Obliquus), характеризующийся тем, что используют надземную биомассу вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), проводят экстрагирование высушенных и измельченных растительных компонентов по отдельности при соотношении сырье-экстрагент 1:10 поочередной последовательностью трехкратно 70 % водным раствором этанола и двукратно 96 % водным раствором этанола при температуре 20-24°С в течение 24 часов на каждом этапе, затем осуществляют упаривание этанольных экстрактов с последующим лиофильным высушиванием до получения сухого экстракта, полученные сухие экстракты объединяют в равной пропорции.