RU2843181C9

RU2843181C9 - Низкомолекулярный хондроитина сульфат, его композиция, способ получения и применение

Info

Publication number: RU2843181C9
Application number: RU2022112645A
Authority: RU
Inventors: Хаонин ЧЖАН; Сун ЧЭНЬ; Бо ЦЗИНЬ; Юнган СЮЙ; Чуаньгэнь ТАН
Original assignee: Нанкин Хансинь Фармасьютикал Текнолоджи Ко., Лтд.
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2025-08-21

Abstract

Изобретение относится к низкомолекулярному хондроитина сульфату и к способу его получения. Предложен низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой менее 1000 Дальтон, имеющий узкий диапазон молекулярно-массового распределения, содержание хондроитина сульфата дисахарида 43-60% и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида 30-45%, суммарное содержание хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида более 87%. Указанный низкомолекулярный хондроитина сульфат получают деполимеризацией хондроитин-сульфат-лиазой макромолекулярного хондроитина сульфата в качестве исходного вещества. Предложены также способ получения указанного низкомолекулярного хондроитина сульфата, его применение для уменьшения воспаления сустава, облегчения боли и/или облегчения или лечения остеопороза, а также содержащая его композиция и способ уменьшения воспаления сустава, облегчения боли и/или облегчения или лечения остеопороза с ее использованием. По сравнению с обычным рыночным макромолекулярным хондроитина сульфатом предложенный продукт обладает более заметным восстановительным действием в концентрации 50-100 мкг/мл на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, с сильной восстановительной способностью и степенью восстановления 14-23%. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 24 пр.

Description

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0001] Изобретение относится к биохимической области техники, в частности к низкомолекулярному хондроитина сульфату, его композиции, способу получения и применению.

Описание предшествующего уровня техники

[0002] Хондроитина сульфат (CS, а именно макромолекулярный хондроитина сульфат или хондроитина сульфат полисахарид) представляет собой класс линейного полисахаридсодержащего полианиона. D-глюкуроновая кислота (GlcA) и N-ацетил-D-галактозамин (GalNAc) связаны β-1,3 гликозидной связью с образованием дисахаридных единиц, которые связаны друг с другом β-1,4 гликозидной связью, и сульфатные группы введены в разные положения в последующем процессе биосинтеза. Хондроитина сульфат широко распространен в хрящевой и соединительной ткани различных животных.

[0003] Большое количество исследований показали, что CS обладает активностью снижения уровня липидов в крови, активностью против атеросклероза, активностью усиления иммунитета, активностью против вирусного гепатита и противоопухолевой активностью и клинически широко применяется в медицине и в области пищевых продуктов при ортопедических, офтальмологических, сердечно-сосудистых заболеваниях и заболеваниях полости рта. Например, в рекомендациях по лечению коленного остеоартрита, опубликованных Европейской лигой ревматизма (European League of Rheumatism), CS рассматривается как эффективное лекарственное средство для лечения коленного остеоартрита; в Японии CS получают в виде перорального препарата для снятия боли в суставах или в виде глазных капель для восполнения слезы или защиты роговицы; в Соединенных Штатах CS продается в качестве пищевой добавки; в Австралии CS в основном включают в состав композиционных препаратов и продают в качестве пищевых добавок; натриевая соль хондроитина сульфата (CS-Na), CS-Na таблетки и CS-Na капсулы также собраны в издании 2015 года Китайской Фармакопеи, и они классифицируются как лекарственные средства для снижения уровня липидов в крови и лечения заболеваний костей и суставов. Следовательно, CS, как вид макромолекулярного вещества с разнообразной биологической активностью и широким применением, имеет большую ценность для разработки и применения. Тем не менее традиционный высокомолекулярный CS имеет высокую кажущуюся вязкость, сложную структуру и с трудом проходит через клеточную мембрану. В клиническом применении в основном приходится сталкиваться с проблемами низкой биодоступности, плохим пероральным всасыванием и нестабильной эффективностью.

[0004] Относительная молекулярная масса (Mr) природного CS обычно составляет 50-100 кДа, и диапазон Mr CS, полученных разными способами и из разных источников, обычно составляет 10-40 кДа. Когда Mr ниже 10 кДа, тогда он называется низкомолекулярным хондроитина сульфатом (LMWCS) или хондроитина сульфатом олигосахаридом (CSO).

[0005] LMWCS обычно получают путем расщепления CS продуктов, в том числе методами кислотного гидролиза, щелочного гидролиза и методами ферментативной деполимеризации. В реакционных продуктах кислотного гидролиза много примесей, и их трудно удалять. Сульфоновые группы на хондроитина сульфате также во время реакции будут отщепляться в разной степени и вызывать загрязнение окружающей среды. В отличие от этого, реакционные условия ферментативной деполимеризации мягкие, и поэтому загрязнение снижено и легко контролируется, и ферментативная деполимеризация не будет вызывать деструкцию группы сульфоновой кислоты, что облегчает промышленное производство.

[0006] Согласно предшествующему уровню техники из патентной литературы в CN 102676613 В раскрыто, что гиалуронидаза из бычьих яичек имеет низкую специфичность и низкую эффективность, и смесь хондроитина сульфата дисахарида, тетрасахарида и гексасахарида получают и затем разделяют на три мономера с молекулярной массой 521 Да, 1024 Да и 1527 Да соответственно, которые отличаются по составу и молекулярной массе от низкомолекулярного хондроитина сульфата по настоящему изобретению. Молекулярная масса дисахарида в настоящем способе равна примерно 379 Да и примерно 459 Да, и молекулярная масса тетрасахарида равна примерно 838 Да и примерно 918 Да. Кроме того, никаких фармакодинамических исследований полученного продукта не было проведено в патентной литературе.

[0007] В патентной заявке CN 108070627 A раскрыто применение хондроитина сульфата АС фермента с высокой стоимостью для получения хондроитина сульфата D тетрасахарида с конкретной структурой и молекулярной массой, но его молекулярная масса равна 1078 Да, и она отличается от молекулярной массы настоящего низкомолекулярного хондроитина сульфата тетрасахарида примерно 838 Да и примерно 918 Да. Кроме того, никаких фармакодинамических исследований полученного продукта не было проведено в этой патентной заявке.

[0008] В патенте CN 103602711 В раскрыто применение ферментационной жидкости после ферментации из Bacteria sulfolifolia, эффективность которой низкая, 1000 л ферментационной жидкости может катализировать только 400 кг продуктов с получением в результате хондроитина сульфата дисахарида, имеющего молекулярную массу 450-480 Да, и содержание дисахарида составляет более 97%. В отличие от низкомолекулярного хондроитина сульфата по составу и молекулярной массе по настоящему изобретению молекулярная масса дисахарида в настоящем способе равна примерно 379 Да и примерно 459 Да, и доля содержания дисахарида равна 42-58%. Кроме того, в этом патенте раскрыто, что продукты получают из куриного хряща, свиного хряща и хряща крупного рогатого скота, и их применяют для лечения миокардита.

[0009] В периодической литературе "Preparation of Chondroitin Sulfate Oligosaccharides by Enzymatic Method and Its Antioxidant Activity" (Food Industry Science and Technology, 2017, 13, 48-52) раскрыто применение фермента хондроитина сульфата (молекулярная масса 76 кДа) после ферментации из продуцирующего фермент штамма Acinetobacter sp.C26. Каталитическая эффективность низкая, реакционная концентрация сообщается только как 2%, и доля олигосахаридов не анализируется. Хондроитина сульфата дисахариды и тетрасахариды получают пиролизом, m/z дисахаридов равно 342 Да и 458 Да, m/z тетрасахаридов равно 939 Да, что отличается от молекулярной массы дисахарида примерно 379 Да и примерно 459 Да и молекулярной массы тетрасахаридов примерно 838 Да и примерно 918 Да в настоящем изобретении. Кроме того, продукт, полученный в этой литературе, был протестирован только на антиоксидантную активность, и никаких других фармакодинамических исследований не было проведено.

[0010] Таким образом, исследования по фармакодинамике низкомолекулярного хондроитина сульфата в стране и за рубежом недостаточны, особенно для хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида как основных компонентов, которые имеют содержание, контролируемое в определенном диапазоне, и среднюю молекулярную массу, стабильно контролируемую до менее чем 1000 Дальтон, и узкое молекулярно-массовое распределение. Все еще необходимы дополнительные исследования и идентификация низкомолекулярного хондроитина сульфата для лечения повреждения суставов, чтобы дополнить исследования в данной области техники в стране и за рубежом.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Изобретение нацелено на преодоление вышеуказанных недостатков предшествующего уровня техники и предоставление нового низкомолекулярного хондроитина сульфата, его композиции, способа получения и применения.

[0012] Для реализации вышеуказанных задач одна из задач настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить следующее техническое решение: низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой менее 1000 Дальтон и узким молекулярно-массовым распределением, содержащий хондроитина сульфат дисахарид и хондроитина сульфат тетрасахарид в качестве основных компонентов, из которых содержание хондроитина дисахарида составляет 43-60%, и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида составляет 30-45%, сумма хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида составляет более 87%; общая формула структуры низкомолекулярного хондроитина сульфата показана в следующей формуле I:

Формула I: n=0-5, и n представляет собой целое число, R₁, R₂, R₃=-Н или -SO₃Na.

[0013] Далее, средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата равна 590-830 Да и предпочтительно 677-742 Да.

[0014] Далее, в низкомолекулярном хондроитина сульфате содержание хондроитина сульфата дисахарида составляет 48-55%, и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида составляет 35-40%.

[0015] Вторая задача изобретения заключается в том, чтобы предоставить следующее техническое решение: способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата, где макромолекулярный хондроитина сульфат в качестве исходного вещества деполимеризуют хондроитин-сульфат-лиазой с получением продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой, стабильно контролируемой до менее чем 1000 Дальтон, и узким молекулярно-массовым распределением, причем низкомолекулярный хондроитина сульфат содержит хондроитина сульфат дисахарид и хондроитина сульфат тетрасахарид в качестве основных компонентов, из которых содержание хондроитина сульфата дисахарида составляет 43-60%, и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида составляет 30-45%, сумма хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида составляет более 87%; общая формула структуры низкомолекулярного хондроитина сульфата показана в следующей формуле I:

[0016] Далее, хондроитин-сульфат-лиазу получают путем проведения следующих стадий: скрининг и идентификация образцов почвы, сточных вод или ила из прибрежных районов, берегов рек, фермерских рынков, скотобоен и столовых, и оптимально экспрессируют посредством Escherichia coli или Bacillus subtilis.

[0017] Далее, технический способ заключается в использовании коммерчески доступного макромолекулярного хондроитина сульфата в качестве исходного вещества для производства, и это исходное вещество получено из хрящевой ткани наземных и морских животных. Исходное вещество также относится к одной или более смесям куриного хряща, свиного хряща, хряща крупного рогатого скота или акульей кости, предпочтительно акульей кости.

[0018] Далее, рабочие условия реакции ферментативной деполимеризации следующие: добавляемое количество хондроитин-сульфат-лиазы относительно ферментационного бульона на литр составляет 100-300 ед./л, концентрация макромолекулярного хондроитина сульфата в качестве исходного вещества составляет 100-700 г/л, время ферментативной деполимеризации составляет 6-40 ч, температура ферментативной деполимеризации равна 25-35°С, скорость перемешивания равна 100-700 об/мин, и рН ферментативной деполимеризации равен 6,5-8,5. Далее, белок удаляют из гидролизата смешанными растворителями после реакции энзимолиза, в которой объемное соотношение гидролизата и смешанных растворителей составляет 2-5:1, и объемное соотношение дихлорметана и изопропилового спирта в смешанных растворителях составляет 3-5:1; смесь перемешивают при 100-500 об/мин в течение 10-40 мин, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 10-30 мин, и берут верхний слой реакционного раствора.

[0019] Далее, белок также может быть удален из гидролизата после реакции ферментативной деполимеризации ультрафильтрацией с получением реакционного раствора.

[0020] Далее, реакционную жидкость верхнего слоя фильтруют и стерилизуют через капсульный фильтр 0,22 мкм после удаления белка, и реакционный раствор добавляют в 8-12-кратный объем безводного этанола для осаждения и сушат в вакууме.

[0021] Далее, реакционный раствор фильтруют и стерилизуют через капсульный фильтр 0,22 мкм после удаления белка и затем сушат распылением.

[0022] Далее, по сравнению с макромолекулярным хондроитина сульфатом из акульей кости низкомолекулярный хондроитина сульфат, полученный в результате ферментативной деполимеризации одного или более чем одного из акульей кости и куриного хряща, оказывает более значительное восстановительное воздействие в концентрации 50-100 мкг/мл на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, и степень восстановления составляет 14%-23%.

[0023] Далее, низкомолекулярный хондроитина сульфат с конкретным диапазоном содержания дисахарида и тетрасахарида может восстанавливать хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, в диапазоне концентраций 50-1600 мкг/мл, и степень восстановления составляет 20%-62,4%.

[0024] Далее, низкомолекулярный хондроитина сульфат с конкретным диапазоном содержания дисахарида и тетрасахарида может восстанавливать хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, в диапазоне концентраций 50-1600 мкг/мл, и степень восстановления составляет более 20%, предпочтительно более 40%, предпочтительно более 50% и еще более предпочтительно более 60%.

[0025] Далее, низкомолекулярный хондроитина сульфат находит применение в областях приготовления фармацевтических препаратов, косметических средств, продуктов здравоохранения и продуктов питания.

[0026] Согласно другому аспекту изобретения предложена композиция гидролизованного хондроитина сульфата для увеличения плотности кости и облегчения артрита. Суточная доза композиции гидролитического хондроитина сульфата и глюкозамина ниже, чем суточная доза известной в настоящее время коммерчески доступной композиции хондроитина сульфата и глюкозамина; например, суточная доза хондроитина сульфата и глюкозамина в Move free составляет 1700 мг/сутки; суточная доза хондроитина сульфата и глюкозамина в BJ Tomson составляет 1160 мг/сутки. За счет снижения дозировки можно улучшить соблюдение пациентами режима приема, но эффект увеличения плотности кости и облегчения артрита не снижается.

[0027] В нижеследующем контексте глюкозамин иногда упоминается просто как "аммиачный сахар".

[0028] В данном контексте термин "гидролитический хондроитина сульфат" имеет такое значение, как и термин "хондроитина сульфат олигосахарид (CSO)" и термин "низкомолекулярный хондроитина сульфат (nmCS)".

[0029] Термин "гидролитический хондроитина сульфат" в данном документе относится к смесям гидролитического хондроитина сульфата с различными молекулярными массами. Например, молекулярная масса может быть более чем примерно 300 Да и менее чем 10000 Да, такая как 379-10000 Да, такая как более чем примерно 350 Да, более чем примерно 400 Да, более чем примерно 500 Да, более чем примерно 600 Да, более чем примерно 700 Да, более чем примерно 800 Да, более чем примерно 900 Да, ниже, чем примерно 9000 Da, ниже, чем примерно 8000 Да, ниже, чем примерно 7000 Да, ниже, чем примерно 6000 Да, ниже, чем примерно 5000 Да, ниже, чем примерно 4000 Да, ниже, чем примерно 3000 Да, ниже, чем примерно 2000 Да, или менее чем примерно 1000 Да, предпочтительно менее чем примерно 1000 Да продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат, более предпочтительно примерно 590 Da-830 Да, такая как примерно 600 Da-750 Da и еще предпочтительней 677-742 Da.

[0030] В одном воплощении изобретения предложена композиция гидролизованного хондроитина сульфата, которая акцептует следующее техническое предложение: изобретение относится к композиции, содержащей гидролизованный хондроитина сульфат, которая характеризуется тем, что она содержит суточную дозировку 50 мг-800 мг гидролизованного хондроитина сульфата для человека. В некоторых воплощениях композиции, содержащие гидролизованный хондроитина сульфат, содержат примерно от 50 мг до 800 мг гидролизованного хондроитина сульфата. В другом воплощении композиция, содержащая гидролизованный хондроитина сульфат, состоит из примерно 60 мг, примерно 70 мг, примерно 80 мг, примерно 90 мг, примерно 100 мг, примерно 110 мг, примерно 120 мг, примерно 130 мг, примерно 140 мг, примерно 150 мг, примерно 160 мг, примерно 170 мг, примерно 180 мг, примерно 190 мг, примерно 200 мг, примерно 210 мг, примерно 220 мг, примерно 230 мг, примерно 240 мг, примерно 250 мг, примерно 260 мг, примерно 270 мг, примерно 280 мг, примерно 290 мг, примерно 300 мг, примерно 310 мг, примерно 320 мг, примерно 330 мг, примерно 340 мг, примерно 350 мг, примерно 360 мг, примерно 370 мг, примерно 380 мг, примерно 390 мг, примерно 400 мг, примерно 410 мг, примерно 420 мг, примерно 430 мг, примерно 440 мг, примерно 450 мг, примерно 460 мг, примерно 470 мг, примерно 480 мг, примерно 490 мг, примерно 500 мг, примерно 510 мг, примерно 520 мг, примерно 530 мг, примерно 540 мг, примерно 550 мг, примерно 560 мг, примерно 570 мг, примерно 580 мг, примерно 590 мг, примерно 600 мг, примерно 610 мг, примерно 620 мг, примерно 630 мг, примерно 640 мг, примерно 650 мг, примерно 660 мг, примерно 670 мг, примерно 680 мг, примерно 690 мг, примерно 700 мг, примерно 710 мг, примерно 720 мг, примерно 730 мг, примерно 740 мг, примерно 750 мг, примерно 760 мг, примерно 770 мг, примерно 780 мг, примерно 790 мг, примерно 800 мг гидролизованного хондроитина сульфата.

[0031] Композиция, содержащая гидролизованный хондроитина сульфат, характеризуется тем, что эта композиция может содержать глюкозамин.

[0032] Изобретение относится к композиции, содержащей гидролизованный хондроитина сульфат, которая характеризуется тем, что глюкозамин может представлять собой смесь одного из или обоих глюкозамина гидрохлорида и глюкозамина сульфата.

[0033] Композиция, содержащая гидролизованный хондроитина сульфат, характеризуется тем, что гидролизованный хондроитина сульфат представляет собой смесь гидролизованного хондроитина сульфата с различными молекулярными массами.

[0034] Композиция, содержащая гидролизованный хондроитина сульфат, характеризуется тем, что соотношение гидролизованного хондроитина сульфата и глюкозамина составляет примерно 1:3-1:10, такое как примерно 1:9, примерно 1:8, примерно 1:7, примерно 1:6, примерно 1:5, примерно 1:4, примерно 1:3, предпочтительно примерно 1:6-1:4, более предпочтительно примерно 1:5. Композиция может содержать суточную дозу для человека примерно 150 мг-8000 мг глюкозамина. В некоторых воплощениях композиция может содержать примерно 7200 мг, примерно 6400 мг, примерно 5600 мг, примерно 4800 мг, примерно 4000 мг, примерно 3200 мг, примерно 2400 мг, примерно 1600 мг, примерно 1200 мг, примерно 800 мг, примерно 600 мг, примерно 450 мг, примерно 400 мг, примерно 350 мг, примерно 300 мг, примерно 250 мг, примерно 200 мг, примерно 150 мг глюкозамина. Композиция более предпочтительно содержит примерно 100 мг гидролизованного хондроитина сульфата и примерно 500 мг глюкозамина. Композиция может также содержать примерно 200 мг гидролизованного хондроитина сульфата и примерно 1000 мг глюкозамина.

[0035] Изобретение относится к композиции гидролизованного хондроитина сульфата, где гидролизованный хондроитина сульфат представляет собой смесь, полученную путем ферментативной деполимеризации, очистки, концентрирования и распылительной сушки хондроитина сульфата, и его молекулярная масса составляет 379-10000 Да.

[0036] Композиция, содержащая гидролизованный хондроитина сульфат, также содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые выбраны из наполнителей, разрыхлителей, адгезивов, отдушек, смазывающих веществ и агентов пленочного покрытия.

[0037] Изобретение относится к композиции гидролизованного хондроитина сульфата и способу ее получения, которая характеризуется тем, что наполнители включают, но без ограничения ими, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал, декстрин, маннит, лактозу и т.д. Разрыхлители включают, но без ограничения ими, кросповидон, натриевую соль кроскармелозы, натриевую соль карбоксиметилкрахмала, гидроксипропилкрахмал, прежелатинизированный крахмал, малозамещенную гидроксипропилцеллюлозу (L-гидроксипропилцеллюлозу), бикарбонат натрия, лимонную кислоту, винную кислоту и т.д. Адгезивы включают, но без ограничения ими, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.д. Смазывающие вещества включают, но без ограничения ими, стеарат магния, диоксид кремния, тальк, гидрогенизированное растительное масло, полиэтиленгликоль, стеариновую кислоту и т.д. Композиция агента пленочного покрытия включает, но без ограничения ими, гидроксипропилметилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, цветной лак и т.д.

[0038] Изобретение относится к композиции гидролизованного хондроитина сульфата и способу ее получения, которая характеризуется тем, что препарат включает, но без ограничения ими, таблетку, гранулу, капсулу и пилюлю.

[0039] Композицию по изобретению можно применять для получения медицинской продукции или лекарственных средств в целях ослабления артрита и облегчения боли. В частности, композицию можно применять для получения медицинской продукции или лекарственных средств для ослабления остеоартрита, увеличения плотности кости, облегчения остеопороза или облегчения боли.

[0040] Композиция низкомолекулярного хондроитина сульфата или гидролизованного хондроитина сульфата может снижать уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β и TNF-α в сыворотке крови и/или уровень компонента C5b-9 в сыворотке крови.

[0041] Композиция низкомолекулярного хондроитина сульфата или композиция гидролизованного хондроитина сульфата может увеличивать уровень гидроксипролина в бедренной кости.

[0042] По сравнению с предшествующим уровнем техники гидролизованный хондроитина сульфат, полученный путем ферментативной деполимеризации хондроитина сульфата, можно применять для получения продуктов медицинского назначения для увеличения плотности кости, облегчения остеопороза и облечения артрита, и дозировка низкая, и раздражение желудочно-кишечного тракта меньше. Суточная доза для человека гидролизованного хондроитина сульфата и глюкозамина, компонентов, составляющих композицию по изобретению, ниже, чем суточная доза известных в настоящее время хондроитина сульфата и глюкозамина, доступных на рынке. За счет снижения дозировки можно улучшить соблюдение пациентами режима приема, но эффект увеличения плотности кости и облегчения артрита не снижается. Результаты оценки степени боли при артрите у мышей и суточной дозы для человека показали, что суточная доза гидролизованного хондроитина сульфата от 50 до 800 мг оказывает очевидное облегчающее и лечащее воздействие на боль при остеоартрите, и добавление глюкозамина в композицию может увеличивать облегчающее и лечащее воздействие на боль при остеоартрите и остеопорозе.

[0043] По сравнению с предшествующим уровнем техники изобретение имеет следующие преимущества:

1. Хондроитин-сульфат-лиазу получают путем скрининга и идентификации образцов почвы, сточных вод или ила из прибрежных районов, берегов рек, фермерского рынка, скотобоен и столовых и оптимально экспрессируют посредством Escherichia coli или Bacillus subtilis; хондроитин-сульфат-лиазу используют для ферментативной деполимеризации, и она имеет хорошую специфичность и более высокую ферментативную активность. Низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой менее 1000 Дальтон может быть стабильно получен, особенно низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой 590-830 Да, который имеет узкое молекулярно-массовое распределение.

2. Белок удаляют методом с использованием растворителя или методом ультрафильтрации, и содержание белка составляет не более чем 0,5%.

3. 100 л ферментационного бульона катализируют более 400 кг макромолекулярного хондроитина сульфата. Это обеспечивает преимущества короткого производственного цикла, высокой эффективности и подходит для расширения промышленного производства.

4. Долю олигосахаридов разных компонентов определяют путем проведения анализа методом ЖХ/МС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия). Качество продукта стабильное. Общее содержание олигосахаридов низкомолекулярного хондроитина сульфата с дисахаридами, тетрасахаридами, гексасахаридами и октасахаридами составляет более 97%, причем хондроитина сульфат дисахарид и хондроитина сульфат тетрасахарид являются основными компонентами; содержание хондроитина сульфата дисахарида составляет 43-60%, и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида составляет 30-45%, сумма хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида составляет более 87%.

5. По сравнению с макромолекулярным хондроитина сульфатом из акульей кости низкомолекулярный хондроитина сульфат, полученный в результате ферментативной деполимеризации одного или более из акульей кости и куриного хряща, оказывает более значительное восстановительное воздействие в концентрации 50-100 мкг/мл на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, и степень восстановления составляет 14%-23%, что может быть использовано для лечения повреждений суставов. Восстановительное воздействие низкомолекулярного хондроитина сульфата, полученного из акульей кости, лучше, чем полученного из куриного хряща, свиного хряща, хряща крупного рогатого скота и смешанной кости. В концентрации 50 мкг/мл низкомолекулярный хондроитина сульфат, полученный из акульей кости, куриного хряща, свиного хряща, хряща крупного рогатого скота и смешанной кости оказывает более значительное восстановительное воздействие на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, чем макромолекулярный хондроитина сульфат, полученный из акульей кости.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0044] Фиг. 1 представляет собой спектр распределения олигосахаридов низкомолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости в Примере 9.

[0045] Фиг. 2 представляет собой спектр распределения олигосахаридов низкомолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости в Примере 10.

[0046] Фиг. 3 представляет собой спектр распределения олигосахаридов низкомолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости в Примере 11.

[0047] Фиг. 4 представляет собой спектр распределения олигосахаридов низкомолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости в Примере 12.

[0048] Фиг. 5 представляет собой результаты тестов на эффективность и активность низкомолекулярного хондроитина сульфата из разных источников в Примере 14.

[0049] Фиг. 6 демонстрирует воздействие композиции по изобретению на массу тела мышей.

[0050] Фиг. 7 демонстрирует диаграмму влияния композиции по изобретению на опорное усилие мышей.

[0051] Фиг. 8 демонстрирует спектр распределения олигосахаридов низкомолекулярного хондроитина сульфата с чистотой 97,72% в контрольной группе 1.

[0052] Фиг. 9 демонстрирует восстановительное воздействие образца из Примера 9 и контрольных группах 1-2 на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, при разных уровнях концентрации.

[0053] Фиг. 10A демонстрирует воздействия различных по дозе групп на уровень IL-6(A), IL-1β (В), TNF-α (C) и C5b-9 (D) в мышиной сыворотке.

[0054] Фиг. 10В демонстрирует определение уровня гидроксипролина (HYP) в бедренной кости мышей.

[0055] Фиг. 10С демонстрирует окрашивание сафранином О-стойким зеленым (×100) коленного сустава мышей.

[0056] Фиг. 10D демонстрирует патологическую оценку в баллах после окрашивания сафранином О-стойким зеленым коленного сустава мышей.

[0057] Фиг. 10Е демонстрирует иммуногистохимическое окрашивание C5b-9 (×100) коленного сустава у мышей.

[0058] Фиг. 10F демонстрирует количество C5b-9-положительных клеток в коленном суставе мышей.

[0059] Фиг. 11А демонстрирует изменения массы тела у крыс в исследовании дозы CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав.

[0060] Фиг. 11В демонстрирует уровень IL-6 в сыворотке крови у крыс в исследовании дозы CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав.

[0061] Фиг. 11C демонстрирует уровень IL-1β в сыворотке крови у крыс в исследовании дозы CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав.

[0062] Фиг. 11D демонстрирует уровень TNF-α в сыворотке крови у крыс в исследовании дозы CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав.

[0063] Фиг. 11Е демонстрирует патологическое окрашивание (×100) коленного сустава крыс в исследовании дозы CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав.

[0064] Фиг. 11F демонстрирует патологическую оценку в баллах в коленном суставе крыс в исследовании дозы CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав.

[0065] Фиг. 12А демонстрирует изменения массы тела у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0066] Фиг. 12В демонстрирует изменения массы тела у самцов крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0067] Фиг. 12С демонстрирует весовой коэффициент бедренной кости самцов крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0068] Фиг. 12D демонстрирует весовой коэффициент бедренной кости самок крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0069] Фиг. 12Е демонстрирует минеральную плотность кости самок крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0070] Фиг. 12F демонстрирует минеральную плотность кости самцов крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0071] Фиг. 12G демонстрирует уровень зольности бедренной кости у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0072] Фиг. 12Н демонстрирует уровень фосфора в кости у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0073] Фиг. 12I демонстрирует уровень щелочной фосфатазы (ALP) в сыворотке крови у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0074] Фиг. 12J демонстрирует уровень костного морфогенетического белка-4 (ВМР-4) в сыворотке крови у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0075] Фиг. 12K демонстрирует уровень кальцитонина (СТ) в сыворотке крови у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0076] Фиг. 12L демонстрирует уровень паратиреоидного гормона (РТН) в сыворотке крови крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0077] Фиг. 12М демонстрирует площадь бедренных трабекул у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0078] Фиг. 12N демонстрирует процент площади бедренных трабекул у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

[0079] Фиг. 12O демонстрирует количество бедренных трабекул у крыс в исследовании терапевтического воздействия CSO на вызванный удалением яичников остеопороз у самок крыс и вызванный удалением яичек остеопороз у самцов крыс.

ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ

[0080] Для того чтобы облегчить специалистам в данной области понимание настоящего изобретения, технические решения по изобретению будут описаны дополнительно ниже со ссылкой на примеры, но нижеследующее никоим образом не должно ограничивать объем изобретения, заявленного в прилагаемой формуле изобретения.

[0081] Вещества, реагенты и т.п., использованные в нижеследующих примерах, коммерчески доступны, если конкретно не указано иное. Хондроитин-сульфат-лиаза получена путем скрининга и идентификации образцов почвы, сточных вод или ила из прибрежных районов, берегов рек, фермерских рынков, скотобоен и столовых, и оптимально экспрессирована посредством Escherichia coli или Bacillus subtilis. Наивысшая активность для фермента составляет 11976,5 ед./л, и фермент содержит 998 аминокислот и имеет молекулярную массу 113 кДа. Аминокислотная последовательность хондроитин-сульфат-лиазы раскрыта в другой патентной заявке на изобретение этого же заявителя, дата подачи 3 апреля 2019 года, номер заявки 201910264385.5, дата публикации 21 июня 2019 года, и номер публикации CN 109913437 A. Все релевантные сведения из этой патентной заявки включены в данную патентную заявку.

[0082] Формула вычисления средней молекулярной массы низкомолекулярного хондроитина сульфата следующая:

где r_t=r_U1+r_U2+r_U3+r_U4+r_U5,

где r_u1: значение отклика пика компонента 1 (гексасахарид и октасахарид) в растворе образца; M_w1 означает молекулярную массу компонента 1 в растворе образца;

r_u2: значение отклика пика компонента 2 (тетрасахарид) в растворе образца; M_w2означает молекулярную массу компонента 2 в растворе образца;

r_u3: значение отклика пика компонента 3 (тетрасахарид) в растворе образца; M_w3означает молекулярную массу компонента 3 в растворе образца;

r_u4: значение отклика пика компонента 4 (дисахарид) в растворе образца; M_w4означает молекулярную массу компонента 4 в растворе образца;

r_u5: значение отклика пика компонента 5 (дисахарид) в растворе образца; M_w5означает молекулярную массу компонента 5 в растворе образца;

r_t: сумма значений отклика пика компонента 1, компонента 2, компонента 3, компонента 4 и компонента 5 в растворе образца.

[0083] Молекулярные массы дисахарида (n=0), тетрасахарида (n=1), гексасахарида (n=2) и октасахарида (n=3) в низкомолекулярном хондроитина сульфате, полученном в результате ферментативной деполимеризации макромолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости, были разными. Содержание декосахарида (n=4) и содержание додекосахарида (n=5) очень низкие, поэтому средняя молекулярная масса олигосахаридных композиций игнорируется при вычислении. Молекулярные массы дисахарида, тетрасахарида, гексасахарида и октасахарида, измеренные жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией в образцах, полученных в Примере 9, показаны ниже в Таблице 1.

[0084] Пример 1. Реакция ферментативной деполимеризации

[0085] В 5-литровый химический стакан добавляли 2 л очищенной воды, затем добавляли 800 г хондроитина сульфата из акульей кости при перемешивании со скоростью 400 об/мин. После растворения всего вещества раствор гидроксида натрия использовали для доведения рН до 7,0 и добавляли 200 ед./л хондроитин-сульфат-лиазы. Эту систему перемешивали при 30°С в течение 6 ч и определяли, является ли средняя молекулярная масса ниже 1000 Да. Если реакция не была завершена, то время реакции увеличивали еще на 4 ч и продолжали центральный контроль. Реакцию продолжали проводить до тех пор, пока средняя молекулярная масса не стала меньше 1000 Да.

[0086] Пример 2. Реакция ферментативной деполимеризации

[0087] В 5-литровый химический стакан добавляли 2 л очищенной воды, затем добавляли 400 г хондроитина сульфата из акульей кости при перемешивании со скоростью 700 об/мин. После того, как все вещество растворилось, раствор гидроксида натрия использовали для доведения рН до 6,5 и добавляли 300 ед./л хондроитин-сульфат-лиазы. Эту систему перемешивали при 35°С в течение 6 ч и определяли, является ли средняя молекулярная масса ниже 1000 Да. Если реакция не была завершена, то время реакции увеличивали еще на 4 ч и продолжали центральный контроль. Реакцию продолжали проводить до тех пор, пока средняя молекулярная масса не стала менее 1000 Да.

[0088] Пример 3. Реакция ферментативной деполимеризации

[0089] В 5-литровый химический стакан добавляли 2 л очищенной воды, затем добавляли 200 г хондроитина сульфата из акульей кости при перемешивании со скоростью 100 об/мин. После того, как все вещество растворилось, раствор гидроксида натрия использовали для доведения рН до 8,0 и добавляли 100 ед./л хондроитин-сульфат-лиазы. Эту систему перемешивали при 25°С в течение 6 ч и определяли, является ли средняя молекулярная масса ниже 1000 Да. Если реакция не была завершена, то время реакции увеличивали еще на 4 ч и продолжали центральный контроль. Реакцию продолжали проводить до тех пор, пока средняя молекулярная масса не стала менее 1000 Да.

[0090] Пример 4. Реакция ферментативной деполимеризации

[0091] В 5-литровый химический стакан добавляли 2 л очищенной воды, контролировали скорость перемешивания до 500 об/мин, затем добавляли 1400 г хондроитина сульфата из акульей кости. После того, как все вещество растворилось, раствор гидроксида натрия использовали для доведения рН до 8,5 и добавляли 280 ед./л хондроитин-сульфат-лиазы. Эту систему перемешивали при 28°С в течение 6 ч и определяли, является ли средняя молекулярная масса ниже 1000 Да. Если реакция не была завершена, то время реакции увеличивали еще на 4 ч и продолжали центральный контроль. Реакцию продолжали проводить до тех пор, пока средняя молекулярная масса не стала менее 1000 Да.

[0092] Пример 5. Удаление белка

[0093] Брали 2 л гидролизата после реакции в Примере 1 и переносили в центрифугу. Гидролизат после проведения реакции центрифугировали при 4200 об/мин в течение 15 мин, чтобы удалить таллом, отбирали надосадочную жидкость, добавляли 0,4 л органического растворителя (объемное соотношение дихлорметана и изопропилового спирта=5:1) для удаления белка. После перемешивания при 100 об/мин в течение 40 мин и центрифугирования при 4200 об/мин в течение 15 мин верхний слой реакционного раствора отбирали и выливали.

[0094] Пример 6. Удаление белка

[0095] Брали 2,1 л гидролизата после реакции в Примере 2 и переносили в центрифугу. Гидролизат после проведения реакции центрифугировали при 4200 об/мин в течение 15 мин, чтобы удалить таллом, отбирали надосадочную жидкость, добавляли 0,7 л органического растворителя (объемное соотношение дихлорметана и изопропилового спирта=4:1) для удаления белка. После перемешивания при 500 об/мин в течение 10 мин и центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин верхний слой реакционного раствора отбирали и выливали.

[0096] Пример 7. Удаление белка

[0097] Брали 2 л гидролизата после реакции в Примере 3 и переносили в центрифугу. Гидролизат после проведения реакции центрифугировали при 4200 об/мин в течение 15 мин, чтобы удалить таллом, отбирали надосадочную жидкость, добавляли 1 л органического растворителя (объемное соотношение дихлорметана и изопропилового спирта=3:1) для удаления белка. После перемешивания при 300 об/мин в течение 30 мин и центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин верхний слой реакционного раствора отбирали и выливали.

[0098] Пример 8. Удаление белка

[0099] Брали 2,3 л гидролизата после реакции в Примере 4 и подвергали ультрафильтрации через ультрафильтрационную систему с помощью мембранного мешка с отсечкой молекулярной массы 50000-80000 в условиях низкой температуры, чтобы белок был удален, с получением ультрафильтрационного реакционного раствора.

[00100] Пример 9. Осаждение спиртом и сушка

[00101] 2-литровый верхний слой реакционного раствора, полученного в Примере 5, фильтровали и стерилизовали в чистую зону через капсульный фильтр 0,22 мкм. Затем полученный фильтрат добавляли по каплям в 20 л безводного этанола, перемешивали в течение 0,5 ч и отставляли на 2 ч. После полного осаждения твердого вещества надосадочную жидкость удаляли. Твердое вещество собирали центрифужным фильтрованием и затем сушили в вакуумном сушильном шкафу при 45°С в течение 24 ч до потери веса не более чем 10%. Затем 650 г продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат, получили с выходом 81,3% (то есть отношение 650 г низкомолекулярного хондроитина сульфата к 800 г исходного хондроитина сульфата из акульей кости). Содержание белка, определенное методом окрашивания Кумасси ярко-синим, составляло 0,3%. Молекулярно-массовое распределение определяли жидкостной хроматографией масс-спектрометрией, как показано на Фиг. 1, максимальное время удерживания компонента 1 равнялось 5,879 мин, и содержание компонента 1 равнялось 9,51%, который состоял, главным образом, из гексасахарида и октасахарида. Компонент 2 с максимальным временем удерживания 8,632 мин представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 33,83%. Компонент 3 с максимальным временем удерживания 8,966 мин также представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 5,07%. Компонент 4 с максимальным временем удерживания 9,846 мин представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 47,08%. Компонент 5 с максимальным временем удерживания 10,786 мин также представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 2,03%. Компонент 6 с максимальным временем удерживания 12,506 мин представлял собой пик соли. Таким образом, общее содержание низкомолекулярного хондроитина сульфата, включающего в себя дисахарид, тетрасахарид, гексасахарид и октасахарид, составляло 97,52%, содержащего дисахарид и тетрасахарид в качестве основных компонентов, где суммарное содержание дисахарида и тетрасахарида составляло 88,01%. Средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата, полученного в результате ферментативной деполимеризации акульей кости, была равна 704,3-741,2 Да, и конкретно вычисление было следующим:

[00102] Допустим, что компонент 1 весь представлял гексасахарид, тогда

Допустим, что компонент 1 весь представлял собой октасахарид, тогда

[00103] Молекулярную массу анализировали методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) в следующих конкретных условиях анализа:

Хроматографические условия:

Хроматографическая колонка 1: TSK Guard Column SWXL 7 мкм, 6 мм × 4 см

Хроматографическая колонка 2: TSK G3000 SWXL 5 мкм, 7,8 мм × 30 см

Скорость потока: 1 мл/мин

Количество образца: 10 мкл

Температура колонки: 30°С

Детекционная длина волны: 195 нм

Время сбора: 25 мин

Буфер: Разбавляли 0,38 г формиата аммония водой до 2000 мл, тщательно смешивали, фильтровали и получали.

Подвижная фаза: объемное соотношение буфера и метанола составляло 9:1.

Масс-спектральные условия:

Режим регистрации ионов: режим регистрации отрицательных ионов [М-Н]-

Импульсное напряжение: 70 В

Диапазон отношения массы к заряду: 300-1000 m/z

Скорость потока сухого газа: 12 л/мин

Давление распылителя: 35 фунт/кв. дюйм

Напряжение на конденсаторе: 3000 В.

[00104] Результаты определения молекулярной массы были следующие: соответствующие молекулярные массы дисахарида равнялись 378,1 и 458,1, и соответствующие молекулярные массы тетрасахарида равнялись 837,2 и 917,1.

[00105] Пример 10. Осаждение спиртом и сушка

[00106] 2-литровый верхний слой реакционного раствора, полученного в Примере 6, фильтровали и стерилизовали в чистую зону через капсульный фильтр 0,22 мкм. Затем полученный фильтрат добавляли по каплям в 16 л безводного этанола, перемешивали в течение 0,5 ч и отставляли на 2 ч. После осаждения всего твердого вещества надосадочную жидкость удаляли. Твердое вещество собирали центрифужным фильтрованием и затем сушили в вакуумном сушильном шкафу при 50°С в течение 24 ч до потери массы не более чем 10%. Затем 320 г продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат, было получено с выходом 80,0% (то есть отношение 320 г низкомолекулярного хондроитина сульфата к 400 г исходного хондроитина сульфата из акульей кости). Содержание белка, определенное методом окрашивания Кумасси ярко-синим, составляло 0,4%. Молекулярно-массовое распределение определяли жидкостной хроматографией масс-спектрометрией, как показано на Фиг. 2, максимальное время удерживания компонента 1 было равно 5,878 мин, и содержание компонента 1 составляло 9,50%, и он состоял в основном из гексасахарида и октасахарида. Компонент 2 с максимальным временем удерживания 8,625 мин представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 33,90%. Компонент 3 с максимальным временем удерживания 8,958 мин также представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 5,08%. Компонент 4 с максимальным временем удерживания 9,838 мин представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 46,86%. Компонент 5 с максимальным временем удерживания 10,785 мин также представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 2,13%. Компонент 6 с максимальным временем удерживания 12,505 мин представлял собой пик соли. Таким образом, общее содержание низкомолекулярного хондроитина сульфата, включающего в себя дисахарид, тетрасахарид, гексасахарид и октасахарид, составляло 97,47%, в основном дисахарид и тетрасахарид, и содержание дисахарида и тетрасахарида в сумме составляло 87,97%. Средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата, полученного в результате ферментативной деполимеризации акульей кости, была равна 704,7-741,6 Да, и конкретный способ вычисления был следующий:

[00107] Допустим, что компонент 1 весь представлял собой гексасахарид, тогда

[00108] Пример 11. Осаждение спиртом и сушка

[00109] 2-литровый верхний слой реакционного раствора, полученного в Примере 7, фильтровали и стерилизовали в чистую зону через капсульный фильтр 0,22 мкм. Затем полученный фильтрат добавляли по каплям в 24 л безводного этанола, перемешивали в течение 0,5 ч и отставляли на 2 ч. После осаждения всего твердого вещества надосадочную жидкость удаляли. Твердое вещество собирали центрифужным фильтрованием и затем сушили в вакуумном сушильном шкафу при 40°С в течение 24 ч до потери веса не более чем 10%. Затем 150 г продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат, было получено с выходом 75,0% (то есть отношение 150 г низкомолекулярного хондроитина сульфата к 200 г исходного хондроитина сульфата из акульей кости). Содержание белка, определенное методом окрашивания Кумасси ярко-синим, составляло 0,4%. Молекулярно-массовое распределение определяли жидкостной хроматографией масс-спектрометрией, как показано на Фиг. 3, максимальное время удерживания компонента 1 было равно 5,879 мин, и содержание компонента 1 составляло 8,62%, и он состоял в основном из гексасахарида и октасахарида. Компонент 2 с максимальным временем удерживания 8,632 мин представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 30,79%. Компонент 3 с максимальным временем удерживания 8,966 мин также представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 4,41%. Компонент 4 с максимальным временем удерживания 9,872 мин представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 52,49%. Компонент 5 с максимальным временем удерживания 10,786 мин также представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 2,02%. Компонент 6 с максимальным временем удерживания 12,512 мин представлял собой пик соли. Таким образом, общее содержание низкомолекулярного хондроитина сульфата, включающего в себя дисахарид, тетрасахарид, гексасахарид и октасахарид, составляло 98,32%, в основном дисахарид и тетрасахарид, и содержание дисахарида и тетрасахарида в сумме составляло 89,70%. Средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата, полученного в результате ферментативной деполимеризации акульей кости, была равна 679,2-712,5 Да, и конкретный способ вычисления был следующий:

[00110] Допустим, что компонент 1 весь представлял собой гексасахарид, тогда

[00111] Пример 12. Сушка распылением

[00112] 2-литровый верхний слой реакционного раствора, полученного в Примере 8, фильтровали и стерилизовали в чистую зону через капсульный фильтр 0,22 мкм и затем сушили распылением. Параметры сушки распылением были следующие: температура воздуха на входе была равна 120°С, температура воздуха на выходе была равна 60°С, и скорость потока была равна 100 об/мин. Затем 1200 г продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат, было получено с выходом 85,7% (то есть отношение 1200 г низкомолекулярного хондроитина сульфата к 1400 г исходного хондроитина сульфата из акульей кости). Содержание белка, определенное методом окрашивания Кумасси ярко-синим, составляло 0,5%. Молекулярно-массовое распределение определяли жидкостной хроматографией масс-спектрометрией, как показано на Фиг. 4, максимальное время удерживания компонента 1 было равно 5,876 мин, и содержание компонента 1 было равно 8,50%, и он состоял в основном из гексасахарида и октасахарида. Компонент 2 с максимальным временем удерживания 8,636 мин представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 30,59%. Компонент 3 с максимальным временем удерживания 8,963 мин также представлял собой тетрасахарид, содержание которого составляло 4,43%. Компонент 4 с максимальным временем удерживания 9,870 мин представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 52,69%. Компонент 5 с максимальным временем удерживания 10,783 мин также представлял собой дисахарид, содержание которого составляло 2,14%. Компонент 6 с максимальным временем удерживания 12,510 мин представлял собой пик соли. Таким образом, общее содержание низкомолекулярного хондроитина сульфата, включающего в себя дисахарид, тетрасахарид, гексасахарид и октасахарид, составляло 98,35%, в основном дисахарид и тетрасахарид, и содержание дисахарида и тетрасахарида в сумме составляло 89,85%. Средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата, полученного в результате ферментативной деполимеризации акульей кости, была равна 677,4-710,2 Да, и конкретный способ вычисления был следующий:

[00113] Допустим, что компонент 1 весь представлял собой гексасахарид, тогда

[00114] Пример 13

[00115] В соответствии с реакцией ферментативной деполимеризации из Примера 1, способом удаления белка Примера 5 и способом осаждения спиртом и сушки Примера 9 еще четыре типа низкомолекулярного хондроитина сульфата из разных источников были получены с использованием хряща крупного рогатого скота, свиного хряща, куриного хряща и смешанного костного хондроитина сульфата из куриного хряща и акульей кости соответственно с содержанием 90% от компании Shandong Baolijiao Company.

[00116] Пример 14. Тест на эффективность и активность

[00117] (1) Приготовление образцов:

(1.1) Образец Примера 9 был получен в результате реакции ферментативной деполимеризации способом, описанным в Примере 1.

(1.2) Образец контрольной группы 1: смесь 0,63 г дисахарида с чистотой 97,72% и 0,41 г олигомерного пептида из глубоководных рыб (Ningxia Vanilla Biotechnology Co., Ltd., спецификация 98%). 61,56% дисахарида и 40,18% олигопептидов из глубоководных рыб были вычислены.

Способ приготовления образцов 97,72%-ного дисахарида был следующий:

Приготовление подвижной фазы:

А: 20 мМ Tris, доводили рН до 7,5 добавлением HCl;

В: 20 мМ Tris, 1М NaCl, доводили рН до 7,5 добавлением HCl.

Обработка образцов:

Образец Примера 9 растворяли в подвижной фазе А путем взвешивания 20 г порошка образца и растворения в 1 л подвижной фазы А.

Стадии: Перед очисткой колонку, упакованную Q-Sepharose-FF, промывали подвижной фазой В и затем уравновешивали подвижной фазой А. Образец загружали в колонку, упакованную Q-Sepharose-FF, и пики пенетрации собирали. Тетрасахарид, абсорбированный в колонке, промывали подвижной фазой В, и элюированные пики собирали и повторно пропускали через колонку для хроматографической очистки до тех пор, пока не обнаружили единственный пик дисахарида.

Деионизация: обнаруженный единственный пик дисахарида объединяли и собирали и затем деионизировали с использованием глюкозной гель-колонки. Перед загрузкой образец промывали очищенной водой до тех пор, пока проводимость не стала ниже 0,1 мс/см, и объем загружаемого образца составлял 20%-30% от объема колонки. Затем пики с проводимостью ниже 1 мс/см собирали путем промывки колонки очищенной водой.

Лиофилизация: После сбора деионизированного пика и предварительного замораживания при -20°С его помещали в сублимационную сушилку для сублимационной сушки. После лиофилизации до порошка дисахарид с чистотой 97,72% собирали. Чистоту дисахарида определяли следующим образом: ВЭЖХ использовали для определения молекулярно-массового распределения, как показано на Фиг. 8. Компонент 1 с пиковым временем удерживания 9,265 мин представлял собой тетрасахарид с содержанием 2,28%. Компонент 2 с пиковым временем удерживания 10,070 мин представлял собой дисахарид с содержанием 65,79%. Компонент 3 с пиковым временем удерживания 10,937 мин представлял собой дисахарид с содержанием 31,93%. Пик соли на Фиг. 8 не интегрировали.

(1.3) Образец контрольной группы 2: Использовали макромолекулярный хондроитина сульфат из акульей кости с содержанием 90% от компании Shandong Baoliga Company, со средней молекулярной массой примерно 70000 Да, который почти не содержал дисахарид и тетрасахарид.

[00118] (2) Приготовление культу ральной среды, раствора и клеток:

(2.1) Минимальная среда: среда DMEM/F-12.

(2.2) Ростовая среда: К 180 мл минимальной среды добавляли 20 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и хранили при 2°С-8°С.

(2.3) Полная среда: DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко)+фетальная бычья сыворотка Cell Р5 (5-я генерация).

(2.4) 1 мМ раствор Н₂О₂ для стимуляции: 30%-ную (9790 мМ) перекись водорода фильтровали через стерильный фильтр 0,2 мкм и затем для использования разводили до 1 мМ минимальной средой.

(2.5) Исходные растворы образцов 1 и 2: Взвешивание определенной навески образцов [CSO олигосахарид из бычьей кости (из Примера 13), CSO олигосахарид из свиной кости (из Примера 13), CSO олигосахарид из акульей кости (из Примера 9), CSO олигосахарид из куриной кости (из Примера 13), CSO олигосахарид из куриной кости и акульей кости (из Примера 13) и CSO полисахарид из акульей кости (Shandong Baolijia)]. DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко) использовали в качестве разбавителя для приготовления 10 мг/мл исходного раствора образца 1 и затем для использования фильтровали через мембрану стерильного фильтра 0,2 мкм.

Взвешивание определенной навески образцов (образец Примера 9, образец в контрольных группах 1-2), DPBS использовали для разбавителя для приготовления 10 мг/мл исходного раствора образца 1 и затем фильтровали через мембрану стерильного фильтра 0,2 мкм для использования.

(2.6) Образцы детектировали в градиентных растворах 1 и 2:

Раствор образца 1, приготовленный выше, дополнительно разводили в минимальной среде для приготовления двух последовательных разведений в концентрации 50 и 100 мкг/мл соответственно.

Раствор образца 2, приготовленный выше, дополнительно разводили в минимальной среде для приготовления семи последовательных разведений в концентрациях в диапазоне от 50 до 3200 мкг/мл, а именно: 50, 100, 200, 400, 800, 1600 и 3200 мкг/мл соответственно.

(2.7) Приготовление клеточной культуры:

Клетки ATDC5 оживляли ростовой средой и инкубировали в инкубаторе с влажностью при температуре 37±2°С и при концентрации диоксида углерода 5±1%. Ростовую среду использовали для субкультивирования, когда примерно 70%-90%-ная конфлюентность культур наблюдалась через микроскоп с подходящим увеличением (таким как 10-40×).

Клеточную среду удаляли для пассажа клеток. Клетки промывали однократно DPBS. Затем клетки фильтровали с примерно 0,5 мл раствора, содержащего 0,25% трипсина в течение примерно 1 минуты, и клетки становились круглыми и отслаивались от поверхности. Под микроскопом морфология клеток становилась круглой, некоторые клетки отрывались от стенки сосуда, и их сразу добавляли в полную среду для окончательного расщепления. Используют пипетку для отсоса среды, сдувают клетки со стенки сосуда, равномерно диспергируют клетки в среде и переносят клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом на 15 мл и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость отбрасывали, клетки ресуспендировали в 2 мл полной среды, затем клетки переносили в 2 новых прямоугольных флакона Т25 соответственно. В каждый прямоугольный флакон добавляли 5 мл полной среды соответственно, осторожно смешивали и помещали в инкубатор, содержащий диоксид углерода (37°С, 5% СО₂), для культивирования.

Клетки субкультивировали в течение 2-5 суток, используя пассажи клеток 4-20 и конфлюентность 70%-90%. Согласно методике приготовления культуры клеток готовили соответствующий объем клеточного раствора, содержащего 2×10⁶/мл живых клеток, в ростовой среде. Брали 96-луночный прозрачный планшет для клеточной культуры и добавляли 100 мкл клеточного раствора в каждую лунку, чтобы каждая лунка содержала примерно 6000 клеток. Для предотвращения седиментации клеток и обеспечения однородности в каждой лунке клеточный раствор часто смешивали перед добавлением. Планшеты инкубировали в инкубаторе, содержащем диоксид углерода (37°С, 5% СО₂) в течение ночи (24 ч).

После культивирования на следующий день (24 ч) первоначальную среду отбрасывали, и 50 мкл 1 мМ Н₂О₂ добавляли в каждую лунку (см. Стадию 4.2 в отношении способа приготовления 1 мМ раствора Н₂О₂ для стимуляции). Затем растворы для градиентного детектирования хондроитина сульфата из разных источников и в разных концентрациях добавляли в каждую лунку (см. Стадию 4.3 в отношении способа приготовления растворов для градиентного детектирования) и затем помещали в инкубатор, содержащий диоксид углерода (37°С, 5% СО₂) для дополнительного культивирования в течение 12 часов.

После культивирования 10 мкл раствора CCK-8 добавляли в каждую лунку еще на 2 ч на следующий день (12 ч). Сразу после реакции значение поглощения при 450 нм детектировали с помощью многофункционального иммуноферментного планшетного анализатора. Каждый образец будут тестировать в двух параллельных экспериментах, и среднее значение поглощения света будет взято в конце.

[00119] (3) Сравнение клеточной активности низкомолекулярного хондроитина сульфата из разных животных источников и макромолекулярного хондроитина сульфата:

CCK анализ использовали для исследования восстановительного воздействия на поврежденные хондроциты для низкомолекулярного хондроитина сульфата из разных животных источников и макромолекулярного хондроитина сульфата. Результаты теста на эффективность, показанные на Фиг. 5, показали, что по сравнению с макромолекулярным хондроитина сульфатом (хондроитина сульфат полисахарид) из акульей кости низкомолекулярный хондроитина сульфат, полученный ферментативным гидролизом одной или более из акульей кости и куриной кости, оказывал более значительное восстановительное воздействие в концентрациях 50-100 мкг/мл на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, и восстановительная способность составляет от 14% до 23%, что может быть использовано для лечения повреждения сустава.

[00120] (4) Сравнение клеточной активности низкомолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости, содержащего разные компоненты, и макромолекулярного хондроитина сульфата из акульей кости:

В контрольной группе 1 0,63 г дисахарида с чистотой 91,12% смешивали с 0,41 г олигопептида рыбьего коллагена. Содержание дисахарида составляло 61,56%, и содержание олигопептидов из глубоководной рыбы составляло 40,18% при вычислении (Ningxia Vanilla Biotechnology Co., Ltd., спецификация 98%).

Результаты представлены в Таблице А и на Фиг. 9. Восстанавливающее воздействие продукта по изобретению на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, было более значительным, чем в контрольных группах 1-2, в диапазоне концентраций 50-3200 мкг/мл. Среди них продукт по изобретению имел улучшение степени восстановления хондроцитов в диапазоне концентраций 50-1600 мкг/мл, и улучшение тем больше, чем больше концентрация. Тем не менее, когда концентрация достигла 3200 мкг/мл, появился эффект торможения, так как концентрация была слишком высокой, и степень восстановления колебалась от 20% до 62,4%, демонстрируя тенденцию очевидного снижения.

[00121] Пример 15. Капсулы гидролизованного хондроитина сульфата

[00122] Рецептура:

[00123] Способ изготовления:

(1) Гидролизованный хондроитина сульфат из Примера 9 и микрокристаллическую целлюлозу по отдельности пропускали через сито 80 меш для подготовки к использованию;

(2) после тщательного смешивания гидролизованного хондроитина сульфата и микрокристаллической целлюлозы последовательно добавляли предписанное количество кросповидона, коллоидного диоксида кремния и стеарата магния и смешивали в течение 15 мин;

(3) этой смесью наполняли оболочку капсулы, используя машину для наполнения капсул, и формировали капсулы.

[00124] Пример 16. Таблетки гидролизованного хондроитина сульфата

[00125] Рецептура:

[00126] Способ изготовления:

(2) После тщательного смешивания гидролизованного хондроитина сульфата и микрокристаллической целлюлозы последовательно добавляли предписанное количество натриевой соли кроскармелозы, коллоидного диоксида кремния и стеарата магния, и эту смесь смешивали в течение 15 мин;

(3) Смесь прессовали роторным таблеточным прессом и контролировали, чтобы твердость таблетки составляла 6-10 кг;

(4) Покрытие, содержащее 10% твердого вещества, готовили с использованием очищенной воды;

(5) Покрытие наносили на таблетки с использованием высокоэффективной машины для нанесения покрытий. Температура воздуха на входе была установлена на 55°С, давление распыления составляло 0,2 МПа, и температуру листового основания контролировали при 40-45°С. После завершения нанесения покрытия таблетки были изготовлены.

[00127] Пример 17. Таблетки гидролизованного хондроитина сульфата

[00128] Рецептура:

[00129] Способ изготовления:

(1) Гидролизованный хондроитина сульфат из Примера 9 и лактозу по отдельности пропускали через сито 80 меш для подготовки к использованию;

(2) После тщательного смешивания гидролизованного хондроитина сульфата и лактозы последовательно добавляли предписанное количество гидроксипропилцеллюлозы, L-гидроксипропилцеллюлозы, коллоидного диоксида кремния и стеарата магния, и эту смесь смешивали в течение 15 мин;

(5) Таблетки покрывали оболочкой с использованием высокоэффективной машины для нанесения покрытий. Температура воздуха на входе была установлена 55°С, давление распыления составляло 0,2 МПа, и температуру листового основания контролировали при 40-45°С. После завершения нанесения покрытия таблетки были изготовлены.

[00130] Пример 18. Таблетки гидролизованного хондроитина сульфата

[00131] Рецептура:

[00132] Способ изготовления:

(1) Гидролизованный хондроитина сульфат из Примера 9, крахмал и декстрин по отдельности пропускали через сито 80 меш для подготовки к использованию;

(2) После тщательного смешивания гидролизованного хондроитина сульфата, крахмала и декстрина последовательно добавляли предписанное количество гидроксипропилцеллюлозы, натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, коллоидного диоксида кремния и стеарата магния, и эту смесь смешивали в течение 15 мин;

[00133] Пример 19. Капсулы гидролизованного хондроитина сульфата

[00134] Способ изготовления:

(1) Низкомолекулярный хондроитина сульфат из Примера 9 и микрокристаллическую целлюлозу по отдельности пропускали через сито 80 меш для подготовки к использованию;

(2) После тщательного смешивания низкомолекулярного хондроитина сульфата и микрокристаллической целлюлозы последовательно добавляли предписанное количество натриевой соли кроскармелозы, коллоидного диоксида кремния и стеарата магния, и смешивали в течение 15 мин;

(3) Этой смесью наполняли оболочку капсулы, используя машину для наполнения капсул, и формировали капсулы;

[00135] Пример 20. Таблетки гидролизованного хондроитина сульфата и глюкозамина сульфата

[00136] Рецептура:

[00137] Способ изготовления:

(1) Гидролизованный хондроитина сульфат из Примера 9, глюкозамина сульфат, микрокристаллическую целлюлозу и лактозу по отдельности пропускали через сито 80 меш для подготовки к использованию;

(2) После тщательного смешивания гидролизованного хондроитина сульфата, глюкозамина сульфата, микрокристаллической целлюлозы и лактозы последовательно добавляли предписанное количество натриевой соли кроскармелозы, коллоидного диоксида кремния и стеарата магния, и эту смесь смешивали в течение 15 мин;

[00138] Пример 21. Тестирование композиции, полученной согласно изобретению, в мышиной модели нестабильности медиального мениска (DMM)

[00139] 1. Материалы

1.1 Тестируемый образец: Композицию получали согласно Примерам 15-20 настоящего изобретения, и рекомендованная суточная дозировка композиции из Примера 15, Примера 16, Примера 17, Примера 18, Примера 19 и Примера 20 составляла 2 таблетки (гранул) в сутки, и по 1 таблетке (гранул) утром и вечером.

1.2 Приготовление тестируемого вещества: Тестируемый образец для введения примешивали в корм. Для Примеров 15, 16, 17, 18, 19, и 20 образцы по 150 мг/сутки вводили мышам ежесуточно.

1.3 Путь введения субъектам: образцы каждого Примера вводили животным в каждой группе внутрижелудочным путем введения.

[00140] 2. Создание модели

[00141] Мышей анестезировали хлоральгидратом, и волосы на коленном суставе правой задней конечности сбривали. После дезинфекции йодом и спиртом делали продольный разрез длиной примерно 1 см со стороны внутреннего скелета мышей, чтобы обнажить коленный сустав. Микрохирургические ножницы использовали, чтобы открыть суставную полость и связку медиального мениска на плато большеберцовой кости перерезали. Рассасывающуюся нить 6-0 использовали для зашивания суставной капсулы. Нить 6-0 использовали для зашивания кожи сустава, и небольшое количество пенициллина наносили на зашитую кожу для предотвращения инфицирования. Контрольная группа (9 мышей) была субъектом такой же процедуры за исключение того, что большеберцовую связку медиального мениска не перерезали. На второй день после хирургического вмешательства DMM мышей случайным образом разделяли на 7 групп по 13 крыс в каждой группе (1. Модельная контрольная группа; 2. Пример 15; 3. Пример 16; 4. Пример 17; 5. Пример 18; 6. Пример 19; 7. Пример 20).

[00142] 3. Результаты эксперимента

[00143] На второй день после операции мышам вводили внутрижелудочно, и холостой группе и модельной группе вводили такой же объем нормального физиологического раствора внутрижелудочно. Животным вводили один раз в сутки в течение 12 недель. Животных взвешивали один раз в неделю, и дозу корректировали в соответствии с массой тела.

[00144] Заключение: Как показано на Фиг. 6, с Дня 0 эксперимента масса тела мышей в каждой группе показала тенденцию к небольшому увеличению, и не было значительной разницы между группами в каждой точке времени (Р>0,05).

[00145] После внутрижелудочного введения мышам в течение 12 недель работающий в канальном режиме прибор YLS-11A для измерения опорного усилия стопы у мышей использовали для обнаружения разницы в опорном усилии двух задних лап мыши при стоянии, чтобы оценить степень остеоартритной боли у мышей. Мышей загоняли в единственный канал для эксперимента по подъему по склону с углом 60 градусов. Когда мышь начинала стоять на склоне, регистрировали разницу в опоре между левой и правой задними лапами. Чем больше разница опорного усилия, тем белее тяжелая степень остеоартрита.

[00146] Степень остеоартритной боли у мышей оценивали путем определения разницы в опорном усилии у мышей. Как показано на Фиг. 7, разница в опорном усилии в модельной группе была наибольшей, что свидетельствует о том, что степень остеоартритной боли в модельной группе была самой тяжелой. Имела место значительная разница по сравнению с ложно-оперированной группой, что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена. По сравнению с модельной группой, соединения Примеров 15, 16, 19 и 20 могли значительно снижать разницу в опорном усилии (Р<0,01), соединения Примеров 17 и 18 также снижали разницу в опорном усилии (Р<0,05). Суточная доза для мышей может быть вычислена по формуле: доза для человека=доза для мыши * масса тела/эквивалентное соотношение доз. Суточную дозу для человека вычисляют следующим образом:

Замечания: 1. Эквивалентное соотношение доз для мышей и для человека составляло 9,1; 2, доза гидролизованного хондроитина сульфата для мыши=доза композиции для мыши

* прописанная доза гидролизованного хондроитина сульфата/общая масса таблетки.

[00147] Результаты показали, что суточная доза гидролизованного хондроитина сульфата от 50 до 800 мг оказывала значительное облегчающее и лечащее воздействие на боль при остеоартрите, и добавление глюкозамина в композицию могло повышать облегчающее и лечащее воздействие на боль при остеоартрите.

[00148] Пример 22. Для оценки терапевтического воздействия хондроитина сульфата олигосахарида (CSO) и комбинации CSO с глюкозамином (аминосахаром) на остеоартрит, вызванный нестабильностью медиального мениска (DMM), у мышей путем патологического и иммуногистохимического обнаружения воспалительных цитокинов, костной кислоты гидроксипролин и окрашивания сафранином О-стойким зеленым в сыворотке

[00149] Самцов мышей C57BL/6 в возрасте 8-9 недель, 100 мышей, не ограничивали в питье и корме. Мышей анестезировали хлоральгидратом, и волосы коленного сустава правой задней конечности сбривали. Мышей анестезировали хлоральгидратом, и волосы коленного сустава правой задней рапы сбривали. После дезинфекции йодом и спиртом делали продольный разрез длиной примерно 1 см со стороны внутреннего скелета мышей, чтобы обнажить коленный сустав. Микрохирургические ножницы использовали, чтобы открыть суставную полость и связку медиального мениска на плато большеберцовой кости перерезали.

Рассасывающую нить 6-0 использовали для зашивания суставной капсулы. Нить 6-0 использовали для сшивания кожи сустава, и небольшое количество пенициллина наносили на зашитую кожу для предотвращения инфицирования. Ложно-оперированная группа (9 мышей) была субъектом такой же процедуры, но большеберцовую связку медиального мениска не перерезали.

[00150] На второй день после хирургического вмешательства DMM мышей случайным образом разделяли на 7 групп по 13 крыс в каждой группе:

1) модельная контрольная группа;

2) группа хондроитина сульфата олигосахарида в наивысшей дозе (60 мг/кг);

3) группа хондроитина сульфата олигосахарида в высокой дозе (30 мг/кг);

4) группа хондроитина сульфата олигосахарида в средней дозе (15 мг/кг);

5) группа хондроитина сульфата олигосахарида в низкой дозе (7,5 мг/кг);

6) группа хондроитина сульфата олигосахарида (15 мг/кг)+глюкозамина гидрохлорид (7,5 мг/кг).

[00151] На второй день после операции мышам внутрижелудочно вводили объем 0,2 мл/20 г. Ложно-оперированной группе и модельной группе вводили такой же объем нормального физиологического раствора. Высокомолекулярный хондроитина сульфат (CS) (80 мг/кг)+глюкозамин (400 мг/кг) суспендировали в 0,5% CMC-NA (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы). Животным вводили один раз в день в течение 12 недель. Животных взвешивали один раз в неделю, и дозу корректировали в соответствии с массой тела.

[00152] Образцы крови собирали из глазных яблок мышей, и сыворотку крови отделяли. TNF-α, IL-1β, IL-6 и C5b-9 определяли методом ELISA (иммуноферментный анализ). Мышей умерщвляли, брали правую заднюю бедренную кость, и кислоту гидроксипролин в кости определяли согласно методу набора. Брали коленный сустав правой задней конечности и исследовали на патологию (окрашивание сафранином О-стойким зеленым) и экспрессию C5b-9 (иммуногистохимия). Оценочные показатели суммированы следующим образом:

[00153] Влияние на уровень воспалительных цитокинов в сыворотке крови

[00154] Тяжесть остеоартрита у мышей оценивали путем измерения уровней воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β, TNF-α и комплемента C5b-9 в сыворотке крови. Как показано на Фиг. 10А, уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β, TNF-α и комплемента C5b-9 в модельной группе были наивысшими, что свидетельствует о том, что модельная группа имела самый тяжелый остеоартрит. Имело место значительное отличие по сравнению с ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00155] Как показано на Фиг. 10А, по сравнению с модельной группой уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β, TNF-α и комплемента C5b-9 в группе наивысшей, высокой, средней и низкой дозы хондроитина сульфата олигосахарида снижались в различной степени, что свидетельствует о том, что различные дозы хондроитина сульфата олигосахарида оказывали ослабляющее и лечащее воздействие на остеоартрит.

[00156] По сравнению с группой средней дозы уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β, TNF-α и комплемента C5b-9 в сыворотке крови в группе CSO+глюкозамин снижались в различной степени, что свидетельствует о том, что комбинация хондроитина сульфата олигосахарида и глюкозамина может улучшать ослабление и лечение остеоартрита.

[00157] По сравнению с группой макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β, TNF-α и комплемента C5b-9 в сыворотке крови в группе CSO+глюкозамин и в группе олигосахарида по изобретению значительно снижались, что свидетельствует о том, что лечебное воздействие хондроитина сульфата олигосахарида на остеоартрит было лучше, чем в группе макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин.

[00158] Действие на уровень гидроксипролина в бедренной кости

[00159] Тяжесть остеоартрита у мышей оценивали путем определения гидроксипролина в бедренной кости у мышей. Как показано на Фиг. 10В, уровень гидроксипролина в бедренной кости в модельной группе был самым низким, что свидетельствует о том, что остеоартрит в модельной группе был самым тяжелым. Имело место значительное отличие по сравнению с ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00160] По сравнению с модельной группой в группах наивысшей, высокой, средней и низкой дозы хондроитина сульфата олигосахарида и в группе хондроитина сульфата олигосахарида+глюкозамин значительно увеличивался уровень гидроксипролина в бедренной кости у мышей (Р<0,01).

[00161] По сравнению с группой средней дозы уровень гидроксипролина в группе CSO+глюкозамин был значительно повышен, что указывает на то, что комбинация глюкозамина и CSO может промотировать эффективность лечения остеоартрита.

[00162] По сравнению с группой макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин данные группы CSO+глюкозамин показали, что воздействие CSO превосходило воздействие CS.

[00163] Патологическое исследование коленного сустава

[00164] Тяжесть остеоартрита у мышей оценивали путем окрашивания коленного сустава сафранином О-стойким зеленым. Результаты показаны на Фиг. 10С и Фиг. 10D. Патологическая оценка в баллах после окрашивания сафранином О-стойким зеленым в коленном суставе мышей в модельной группе была наивысшей, что свидетельствует о том, что модельная группа имела самый тяжелый остеоартрит. Имело место значительное отличие по сравнению с ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00165] По сравнению с модельной группой в группах хондроитина сульфата олигосахарида в наивысшей и высокой дозе и в группе хондроитина сульфата олигосахарида в средней дозе+глюкозамин могла значительно снижаться патологическая оценка в баллах после окрашивания сафранином О-стойким зеленым (Р<0,05), что свидетельствует о том, что хондроитина сульфат олигосахарид оказывает облегчающее воздействие на остеоартрит.

[00166] Уровень C5b-9 на хрящевой поверхности коленного сустава

[00167] Тяжесть остеоартрита у мышей оценивали путем иммуногистохимического окрашивания в коленном суставе C5b-9. Результаты показаны на Фиг. 10Е и Фиг. 10F. Количество C5b-9-положительных клеток в коленном суставе мышей в модельной группе было наивысшим, что свидетельствует о том, что остеоартрит в модельной группе был самым тяжелым. Имело место значительное отличие по сравнению с ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00168] По сравнению с модельной группой в группе хондроитина сульфата олигосахарида в наивысшей и высокой дозе, в группе олигосахарида в средней дозе+глюкозамин значительно снижалось количество C5b-9-положительных клеток в коленной суставе мышей (Р<0,01), что свидетельствует о том, что хондроитина сульфат олигосахарид может ослаблять повреждение хряща при остеоартрите.

[00169] Пример 23. Влияние различных доз CSO в крысиной модели остеоартрита, вызванного инъекцией папаина в коленный сустав

[00170] Восемьдесят самцов крыс Wistar 180-220 г. 4% папаин и 0,03 моль/л L-цистеина смешивали в соотношении 2:1 и оставляли стоять в течение 30 мин. В День 0, 3 и 6 эксперимента 0,3 мл смешанного раствора инъецировали в полость коленного сустава крыс, чтобы вызвать модель остеоартрита. Нормальной контрольной группе инъецировали равный объем нормального физиологического раствора.

[00171] После последней инъекции папаиновой смеси модельных животных случайным образом разделяли на 7 групп по 10 крыс в каждой группе:

1) модельная контрольная группа;

2) группа хондроитина сульфата олигосахарида в наивысшей (30 мг/кг);

3) группа хондроитина сульфата олигосахарида в высокой дозе (15 мг/кг);

4) группа хондроитина сульфата олигосахарида в средней дозе (7,5 мг/кг);

5) группа хондроитина сульфата олигосахарида в низкой дозе (3,8 мг/кг);

6) группа хондроитина сульфата олигосахарида (7,5 мг/кг)+глюкозамина гидрохлорид (37,5 мг/кг);

7) группа макромолекулярного хондроитина сульфата (40 мг/кг)+глюкозамин (200 мг/кг).

[00172] На второй день после моделирования осуществляли внутрижелудочное введение крысам объема 0,2 мл/100 г. Нормальной контрольной группе и модельной группе вводили такой же объем нормального физиологического раствора. Макромолекулярный хондроитина сульфат (40 мг/кг)+глюкозамин (200 мг/кг) был суспендирован в 0,5% CMC-Na. Лекарственное средство вводили один раз в сутки в течение 12 недель. Животных взвешивали каждые 3 дня, и дозу корректировали в соответствии с массой тела.

[00173] Ширину обоих коленных суставов измеряли перед моделированием, перед введением и через 1, 3, 6, 9 и 12 недель после введения. Степень отека сустава вычисляли по следующей формуле: Степень отека сустава (мм)=ширина колена после воспаления (после введения) - ширина колена до воспаления.

[00174] После 12 недель внутрижелудочного введения собирали образец крови из брюшной аорты крыс, и сыворотку крови отделяли. TNF-α, IL-1β и IL-6 определяли методом ELISA. Бедренную кость у крыс собирали, и кислоту гидроксипролин в кости определяли согласно методу набора. Брали коленный сустав и исследовали на патологию (окрашивание НЕ (гематоксилином и эозином)). Оценочные показатели суммированы следующим образом:

[00175] Как показано на Фиг. 11А, с Дня 0 эксперимента масса тела крыс в каждой группе показала тенденцию увеличения и отсутствие значительной разницы между группами в каждой точке времени. Результаты показали, что хондроитина сульфат олигосахарид не оказывает значительного воздействия на массу тела крыс через 12 недель.

[00176] Тяжесть остеоартрита у крыс оценивали путем измерения уровней воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β и TNF-α в сыворотке крови крыс. Результаты показаны на Фиг. 11В, Фиг. 11С и Фиг. 11D. Уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β и TNF-α в сыворотке крови в модельной группе были наивысшими, что свидетельствует о том, что модельная группа имела самый тяжелый остеоартрит. Имело место значительное отличие по сравнению с ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00177] По сравнению с группой средней доза уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β и TNF-α в сыворотке крови крыс в группе олигосахарида в средней дозе+глюкозамин снижались в различной степени, что свидетельствует о том, что комбинация хондроитина сульфата олигосахарида и глюкозамина может повышать эффект облегчения и лечения остеоартрита.

[00178] По сравнению с группой макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин уровни воспалительных цитокинов IL-6, IL-1β и TNF-α в сыворотке крови крыс в группе CSO+глюкозамин значительно увеличивались, что свидетельствует о том, что воздействие хондроитина сульфата олигосахарида на остеоартрит было лучше, чем воздействие в группе макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин.

[00179] Тяжесть остеоартрита у крыс оценивали путем патологического исследования коленного сустава. Результаты показаны на Фиг. 11Е и Фиг. 11F. Патологическая оценка коленного сустава в баллах у крыс в модельной группе была наивысшей, что свидетельствует о том, что остеоартрит в модельной группе был самым тяжелым. Имело место значительное отличие по сравнению с ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00180] По сравнению с модельной группой группа хондроитина сульфата олигосахарида в наивысшей дозе и высокой дозе, группа олигосахарида средней дозы+глюкозамин могли значительно снижать патологическую оценку в баллах (Р<0.01), что свидетельствует о том, что хондроитина сульфат олигосахарид оказывает воздействие, облегчающее остеоартрит.

[00181] Пример 24. Терапевтическое воздействие CSO на остеопороз у самок крыс с удаленными яичниками и самцов крыс с удаленными яичками

[00182] Самки крыс:

[00183] Использовали девяносто самок крыс SD весом 200-220 г. Крыс адаптировали к окружающим условиям в течение 3 суток. Перед операции крысы голодали, но свободно получали воду в течение 24 часов. Крысам инъецировали инраперитонеально 3% хлоральгидрат и анестезировали. Десять мышей использовали в качестве ложно-оперированной группы с продольными разрезами на коже и мышце с обеих сторон поясничного и спинного отдела позвоночника без удаления яичников. Для остальных животных делали продольные разрезы с обеих сторон поясничного и спинного отдела позвоночника для разрезания кожи и мышцы, и оба яичника удаляли, и раны зашивали. Всем животным делали внутримышечные инъекции пенициллина в течение 3 последующих дней после операции. (Самцов крыс оперировали таким же способом с удалением яичек).

[00184] На второй день после хирургической операции крыс с удаленными яичниками случайным образом разделяли на 8 групп с 8 крысами в каждой группе:

1) ложно-оперированная группа;

2) модельная группа;

3) группа ацетата кальция (158 мг/кг);

4) группа хондроитина сульфата олигосахарида в наивысшей дозе (30 мг/кг)+ацетат кальция (158 мг/кг);

5) группа хондроитина сульфата олигосахарида в высокой дозе (15 мг/кг)+ацетат кальция (158 мг/кг);

6) группа хондроитина сульфата олигосахарида в средней дозе (7,5 мг/кг)+ацетат кальция (158 мг/кг);

7) группа хондроитина сульфата олигосахарида в низкой дозе (3,8 мг/кг)+ацетат кальция (158 мг/кг);

8) группа хондроитина сульфата олигосахарида (7,5 мг/кг)+глюкозамина гидрохлорид (37,5 мг/кг)+ацетат кальция (158 мг/кг);

9) группа макромолекулярного хондроитина сульфата (40 мг/кг)+глюкозамин (200 мг/кг)+ацетат кальция (158 мг/кг).

[00185] На второй день после хирургической операции крысам вводили внутрижелудочно объем 0,2 мл/100 г. Ложно-оперированной группе и модельной группе вводили такой же объем нормального физиологического раствора. После 12 недель непрерывного введения животных взвешивали один раз в неделю, и дозу корректировали в соответствии с массой тела.

[00186] Через 24 ч после последнего введения собирали образцы крови из глазниц крыс. Определяли щелочную фосфатазу (ALP) в сыворотке крови, костный морфогенетический белок (BGP), паратиреоидный гормон (РТН) и кальцитонин (СТ).

[00187] Крыс умерщвляли, и бедренную кость с обеих сторон отделяли. Брали правую бедренную кость и измеряли следующие показатели: костный весовой коэффициент (г/100 г массы тела), плотность кости, уровень зольности, костный кальций или костный фосфор, костный гидроксипролин, патология НЕ. Оценочные показатели суммированы следующим образом:

[00188] Самцы крыс:

[00189] Использовали в сумме 90 самцов крыс SD весом 200-220 г. Крыс адаптировали к окружающим условиям в течение 3 суток. Перед хирургической операцией крысы голодали, но имели свободный доступ к воде в течение 24 часов. Использовали в сумме 90 самцов крыс SD весом 200-220 г. Крыс адаптировали к окружающим условиям в течение 3 суток. Перед хирургической операцией крысы голодали, но имели свободный доступ к воде в течение 24 часов. Крысам инъецировали интраперитонеально 3% хлоральгидрат, анестезировали, и кожу мошонки дезинфицировали в горизонтальном положении йодом и спиртом. Два продольных разреза делали с каждой стороны средостения на расстоянии 1 см. После разрезания собственной оболочки яичка 10-ти из них отделяли их двусторонние яички от придатка яичка (без иссечения), а затем помещали обратно в мошонку, и разрезы зашивали, и их использовали в качестве ложно-оперированной группы. У остальных 80 самцов с вырезанными яичками двусторонние яички находили и вырезали таким же способом. Всем животным делали инъекции пенициллина в течение 3 суток после операции.

[00190] На второй день после хирургической операции крыс с удаленными яичниками случайным образом разделяли на 8 групп по 8 крыс в каждой группе:

Остальные стадии были таким же, как для самок крыс.

[00191] Результаты экспериментов

[00192] Изменения массы тела

[00193] Как показано на Фиг. 12А и Фиг. 12В, с Дня 0 эксперимента масса тела крыс в каждой группе показывала тенденцию к увеличению, и не было значительной разницы между группами в каждой точке времени. Результаты показывают, что хондроитина сульфат олигосахарид не оказывает значительного воздействия на массу тела самок и самцов крыс после 12 недель введения.

[00194] Костный весовой коэффициент

[00195] Как показано на Фиг. 12С и Фиг. 12D, по сравнению с ложно-оперированной группой костный весовой коэффициент крыс в модельной группе значительно снижался (Р<0,01), что свидетельствует об успешном моделировании. По сравнению с модельной группой в группе олигосахарида высокой дозы значительно увеличивался костный весовой коэффициент самок и самцов крыс (Р<0,05).

[00196] Минеральная плотность кости

[00197] Тяжесть остеопороза оценивали путем определения минеральной плотности кости крыс. Как показано на Фиг. 12Е и Фиг. 12F, минеральная плотность кости крыс в модельной группе была значительно снижена, что свидетельствует о том, что минеральная плотность кости крыс в модельной группе была наиболее серьезной, и имела место значительная разница между модельной группой и ложно-оперированной группой (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00198] По сравнению с модельной группой BMD (минеральная плотность кости) тела и эпифиза бедренной кости самок остеопорозных крыс была значительно повышена в каждой группе лечения (Р<0,05, Р<0,01), что свидетельствует о том, что хондроитина сульфат олигосахарид оказывает положительное воздействие на остеопороз.

[00199] По сравнению с модельной группой группа наивысшей, высокой, средней, низкой дозы, группа CSO+глюкозамин и группа макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин значительно увеличивали бедренную эпифизарную BMD у самцов крыс (Р<0,05, Р<0,01); группа CSO+глюкозамин и группа макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин значительно увеличивали минеральную плотность кости тела бедренной кости самцов крыс (Р<0,05).

[00200] Уровень зольности

[00201] Тяжесть остеопороза у крыс оценивали путем измерения уровня зольности бедренной кости у крыс. Как показано на Фиг. 12G, уровень зольности кости в модельной группе был значительно снижен, что свидетельствует о том, что модельная группа имела самый тяжелый остеопороз, который значительно отличался от такового в ложной группе (Р<0,01, Р<0,05), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00202] По сравнению с модельной группой группа CSO+глюкозамин значительно увеличивала уровень зольности бедренной кости у самок крыс (Р<0,05), остальные группы имели тенденцию к увеличению, и статистическая разница отсутствовала (Р>0,05). Группы CSO высокой дозы, средней дозы и низкой дозы, группа CSO+глюкозамин и группа Са значительно увеличивали уровень зольности бедренной кости у самцов крыс (Р<0,01, Р<0,05). Результаты показали, что хондроитина сульфат олигосахарид оказывает положительное воздействие на остеопороз.

[00203] Костный фосфор

[00204] Тяжесть остеопороза оценивали путем измерения уровня фосфора в кости у крыс. Как показано на Фиг. 12Н, уровень фосфора в кости у крыс в модельной группе был значительно снижен, что свидетельствует о том, что уровень фосфора в кости в модельной группе был наиболее серьезным и значительно отличался от уровня фосфора в ложно-оперированной группе (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00205] По сравнению с модельной группой уровень фосфора в кости самок крыс в группах CSO наивысшей и средней дозы, в группе макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин и в группе CSO+глюкозамин значительно увеличился (Р<0,05, Р<0,01). В группе CSO в низкой дозе, в группе CSO+глюкозамин group и в группе СА значительно увеличился уровень фосфора в кости у самцов крыс (Р<0,05, Р<0,01). Результаты показали, что хондроитина сульфат олигосахарид оказывает положительное воздействие на остеопороз.

[00206] Щелочная фосфатаза в сыворотке крови

[00207] Уровень щелочной фосфатазы (ALP) в сыворотке крови крыс измеряли для оценки тяжести остеопороза. Как показано на Фиг. 121, уровень щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс в модельной группе был значительно снижен, что свидетельствует о том, что модельная группа имела наиболее тяжелый остеопороз, и этот уровень значительно отличался от уровня в ложно-оперированной группе (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00208] По сравнению с модельной группой в группах лечения уровень щелочной фосфатазы в сыворотке крови самок остеопорозных крыс значительно увеличивался (Р<0,05, Р<0,01). За исключением группы CSO низкой дозы, в остальных группах лечения уровень щелочной фосфатазы в сыворотке крови самцов остеопорозных крыс значительно увеличивался (Р<0,01).

[00209] Уровень костного морфогенетического белка-4 в сыворотке крови

[00210] Уровень костного морфогенетического белка-4 (ВМР-4) в сыворотке крови крыс измеряли для оценки тяжести остеопороза. Как показано на Фиг. 12J, уровень костного морфогенетического белка-4 (ВМР-4) в сыворотке крови крыс в модельной группе был значительно снижен, что свидетельствует о том, что модельная группа имела наиболее тяжелый остеопороз, и это значительно отличалось от ложной группы (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00211] По сравнению с модельной группой уровень ВМР-4 в сыворотке крови самок остеопорозных крыс во всех группах значительно увеличивался (Р<0,05, Р<0,01). За исключением группы CSO в низкой дозе, в остальных группах лечения уровень ВМР-4 в сыворотке крови значительно увеличивался (Р<0,05, Р<0,01).

[00212] Кальцитонин в сыворотке крови

[00213] Уровень кальцитонина (СТ) в сыворотке крови крыс измеряли для оценки тяжести остеопороза. Как показано на Фиг. 12K, уровень кальцитонина (СТ) в сыворотке крови крыс в модельной группе был значительно снижен, что свидетельствует о том, что модельная группа имела наиболее тяжелый остеопороз, и это значительно отличается от ложно-оперированной группы (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00214] По сравнению с модельной группой, уровень СТ в сыворотке крови самок остеопорозных крыс в каждой группе введения значительно увеличивался (Р<0,05, Р<0,01). За исключением группы CSO в низкой дозе, СТ в сыворотке крови самцов остеопорозных крыс в остальных группах введения значительно увеличивался (Р<0,05, Р<0,01).

[00215] Паратиреоидный гормон в сыворотке крови

[00216] Уровень паратиреоидного гормона (РТН) в сыворотке крови крыс измеряли для оценки тяжести остеопороза. Как показано на Фиг. 12L, уровень РТН в сыворотке крови крыс в модельной группе был значительно снижен, что свидетельствует о том, что модельная группа имела наиболее тяжелый остеопороз, и этот уровень отличается от уровня в ложно-оперированной группе (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00217] По сравнению с модельной группой, за исключением группы CSO в низкой дозе и группы СА, в остальных группах введения уровень РТН в сыворотке крови самок остеопорозных крыс значительно снижался (Р<0,05, Р<0,01). За исключением группы макромолекулярного хондроитина сульфата+глюкозамин, в остальных группах введения уровень РТН в сыворотке крови самцов остеопорозных крыс значительно снижался (Р<0,05, Р<0,01).

[00218] Площадь бедренных трабекул, процент площади трабекул и количество трабекул

[00219] Для оценки тяжести остеопороза измеряли площадь бедренных трабекул, процент площади трабекул и количество трабекул у крыс. Результаты такие, как показано на Фиг. 12М, Фиг. 12N и Фиг. 12O. Площадь бедренных трабекул, процент площади трабекул и количество трабекул у крыс в модельной группе были значительно снижены, что свидетельствует о том, что крысы в модельной группе имели наиболее тяжелый остеопороз. Это значительно отличается от ложно-оперированной группы (Р<0,01), что свидетельствует о том, что модель была успешно осуществлена.

[00220] По сравнению с модельной группой в группах наивысшей, высокой и средней дозы и в группе олигосахарида в средней дозе+глюкозамин площадь бедренных трабекул, процент площади трабекул и количество трабекул значительно увеличивались у самцов остеопорозных крыс (Р<0,05, Р<0,01). По сравнению с модельной группой в группах лечения площадь бедренных трабекул, процент площади трабекул и количество трабекул значительно увеличивались у самок остеопорозных крыс (Р<0,05, Р<0,01).

[00221] По сравнению с модельной группой количество бедренных трабекул у самцов остеопорозных крыс значительно увеличивалось во всех группах введения за исключением группы Са (Р<0,05, Р<0,01). По сравнению с модельной группой, за исключением группы CSO в низкой дозе и группы Са, количество бедренных трабекул у самок остеопорозных крыс значительно увеличивалось во всех группах лечения (Р<0,05, Р<0,01).

[00222] Эти результаты показали, что хондроитина сульфат олигосахарид оказывал положительное воздействие на облегчение остеопороза.

[00223] Согласно имеющимся экспериментальным данным можно сделать следующие выводы: различные дозы хондроитина сульфата олигосахарида оказывают воздействие, облегчающее и лечащее боль при остеоартрите и остеопорозе. Хондроитина сульфат олигосахарид в комбинации с глюкозамином может повышать воздействие, облегчающее и лечащее боль при остеоартрите и остеопорозе. Воздействие хондроитина сульфата олигосахарида на облегчение остеоартрита и остеопороза лучше, чем воздействие макромолекулярного хондроитина сульфата.

[00224] Каждый из источников информации, процитированных выше в описании заявки, включен в него посредством ссылки. В случае противоречия между вышеизложенным описанием и источниками информации описание, представленное в данной заявке, будет иметь преимущественную силу.

Claims

1. Низкомолекулярный хондроитина сульфат, где средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата составляет менее 1000 Дальтон, и молекулярно-массовое распределение низкомолекулярного хондроитина сульфата является узким, содержащий хондроитина сульфат дисахарид и хондроитина сульфат тетрасахарид в качестве основных компонентов, из которых содержание хондроитина сульфата дисахарида составляет 43-60% и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида составляет 30-45%, сумма хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида составляет более 87%; где содержание хондроитина сульфата дисахарида и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида определено методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией; и где общая формула структуры низкомолекулярного хондроитина сульфата показана в следующей формуле I:

Формула I

где n=0-5, и n представляет собой целое число, R₁, R₂, R₃=-Н или -SO₃Na,

где низкомолекулярный хондроитина сульфат получен следующим способом: макромолекулярный хондроитина сульфат в качестве исходного вещества деполимеризуют хондроитин-сульфат-лиазой с получением продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой, стабильно контролируемой до менее чем 1000 Дальтон;

хондроитин-сульфат-лиаза получена путем проведения скрининга и идентификации образцов почвы, сточных вод или ила из прибрежных районов, берегов рек, фермерских рынков, скотобоен и столовых, и экспрессии посредством Escherichia coli или Bacillus subtilis;

где макромолекулярный хондроитина сульфат в качестве исходного вещества получен из хрящевой ткани наземных и морских животных, выбранной из одного или более чем одного из куриного хряща, свиного хряща, хряща крупного рогатого скота или акульей кости; и

где рабочие условия реакции ферментативной деполимеризации следующие: добавляемое количество хондроитин-сульфат-лиазы на литр ферментационного бульона составляет 100-300 ед./л, концентрация макромолекулярного хондроитина сульфата в качестве исходного вещества равна 100-700 г/л, время ферментативной деполимеризации равно 6-40 ч, температура ферментативной деполимеризации равна 25-35°С, скорость перемешивания равна 100-700 об/мин, и рН ферментативной деполимеризации равен 6,5-8,5.

2. Низкомолекулярный хондроитина сульфат по п. 1, где средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата составляет 590-830 Да и предпочтительно 677-742 Да.

3. Низкомолекулярный хондроитина сульфат по п. 1, где, по сравнению с макромолекулярным хондроитина сульфатом из акульей кости, низкомолекулярный хондроитина сульфат, полученный в результате ферментативной деполимеризации из одного или более чем одного из акульей кости и куриного хряща, оказывает более значительное восстановительное действие в концентрации 50-100 мкг/мл на хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, и степень восстановления составляет 14-23%; или низкомолекулярный хондроитина сульфат с конкретным диапазоном содержания дисахарида и тетрасахарида, указанным в п.1, в диапазоне концентраций 50-1600 мкг/мл может восстанавливать хондроциты, поврежденные 1 мМ перекисью водорода, и степень восстановления равна 20-62,4%.

4. Способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата по любому из пп. 1, 2, где макромолекулярный хондроитина сульфат в качестве исходного вещества деполимеризуют хондроитин-сульфат-лиазой с получением продукта, представляющего собой низкомолекулярный хондроитина сульфат со средней молекулярной массой, стабильно контролируемой до менее чем 1000 Дальтон,

хондроитин-сульфат-лиазу получают путем проведения скрининга и идентификации образцов почвы, сточных вод или ила из прибрежных районов, берегов рек, фермерских рынков, скотобоен и столовых, и экспрессируют посредством Escherichia coli или Bacillus subtilis;

где рабочие условия реакции ферментативной деполимеризации следующие: добавляемое количество хондроитин-сульфат-лиазы на литр ферментационного бульона составляет 100-300 ед./л, концентрация макромолекулярного хондроитина сульфата в качестве исходного вещества равна 100-700 г/л, время ферментативной деполимеризации равно 6-40 ч, температура ферментативной деполимеризации равна 25-35°С, скорость перемешивания равна 100-700 об/мин, и рН ферментативной деполимеризации равен 6,5-8,5; и

причем низкомолекулярный хондроитина сульфат содержит хондроитина сульфата дисахарид и хондроитина сульфата тетрасахарид в качестве основных компонентов, из которых содержание хондроитина сульфата дисахарида составляет 43-60%, и содержание хондроитина сульфата тетрасахарида составляет 30-45%, сумма хондроитина сульфата дисахарида и хондроитина сульфата тетрасахарида составляет более 87%; и где общая формула структуры низкомолекулярного хондроитина сульфата показана в следующей формуле I:

Формула I

где n=0-5, и n представляет собой целое число, R₁, R₂, R₃=-Н или -SO₃Na.

5. Способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата по п. 4, где макромолекулярный хондроитина сульфат в качестве исходного вещества получен из акульей кости.

6. Способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата по п. 4, где белок удаляют из гидролизата смешанными растворителями после реакции энзимолиза в реакционной смеси, в которой объемное соотношение гидролизата и смешанных растворителей составляет 2-5:1, и объемное соотношение дихлорметана и изопропилового спирта в смешанных растворителях составляет 3-5:1; и где реакционную смесь перемешивают при 100-500 об/мин в течение 10-40 мин, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 10-30 мин, и берут верхний слой реакционного раствора.

7. Способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата по п. 4, где белок удаляют из гидролизата после реакции энзимолиза посредством ультрафильтрации с получением реакционного раствора.

8. Способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата по п. 6, где верхний реакционный раствор фильтруют и стерилизуют через капсульный фильтр 0,22 мкм после удаления белка, и затем реакционный раствор добавляют в 8-12-кратный объем безводного этанола для осаждения и сушат в вакууме.

9. Способ получения низкомолекулярного хондроитина сульфата по п. 7, где реакционный раствор фильтруют и стерилизуют через капсульный фильтр 0,22 мкм после удаления белка и затем сушат распылением.

10. Применение низкомолекулярного хондроитина сульфата по любому из пп. 1, 2, в областях приготовления фармацевтических препаратов для уменьшения воспаления сустава, облегчения боли и/или облегчения или лечения остеопороза у субъекта.

11. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат по п. 1 или 2, которая содержит суточную дозировку 50-800 мг низкомолекулярного хондроитина сульфата для человека, предназначенная для использования в фармацевтических препаратах, продуктах здравоохранения и продуктах питания.

12. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 11, которая может содержать глюкозамин.

13. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 12, где глюкозамин может представлять собой глюкозамина гидрохлорид, глюкозамина сульфат или их смесь.

14. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 11, где низкомолекулярный хондроитина сульфат представляет собой смесь низкомолекулярного хондроитина сульфата с различными молекулярными массами.

15. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 14, где средняя молекулярная масса низкомолекулярного хондроитина сульфата составляет 379-1000 Да.

16. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 11, которая содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты, выбранные из наполнителей, разрыхлителей, адгезивов, отдушек, смазывающих веществ и агентов пленочного покрытия.

17. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 16, где наполнители включают, но без ограничения ими, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал, декстрин, маннит, лактозу; где разрыхлители включают, но без ограничения ими, кросповидон, натриевую соль кроскармелозы, натриевую соль карбоксиметилкрахмала, гидроксипропилкрахмал, прежелатинизированный крахмал, малозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, бикарбонат натрия, лимонную кислоту, винную кислоту; где адгезивы включают, но без ограничения ими, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон; где смазывающие вещества включают, но без ограничения ими, стеарат магния, коллоидный диоксид кремния, тальк, гидрогенизированное растительное масло, полиэтиленгликоль, стеариновую кислоту; и где агенты пленочного покрытия включают, но без ограничения ими, гидроксипропилметилцеллюлозу, полиэтиленгликоль и цветной лак.

18. Композиция, содержащая низкомолекулярный хондроитина сульфат, по п. 11, которая находится в лекарственных формах, включающих, но без ограничения ими, таблетки, гранулы, капсулы и пилюли.

19. Способ уменьшения воспаления сустава, облегчения боли и/или облегчения или лечения остеопороза у субъекта, включающий введение субъекту композиции, содержащей низкомолекулярный хондроитина сульфат, по любому из пп. 11-18.

20. Способ по п. 19, который предназначен для уменьшения воспаления сустава путем уменьшения уровня воспалительных цитокинов или комплемента в сыворотке крови или снижения патологической оценки в баллах при окрашивании сафранин О-быстрым зеленым, где воспалительные цитокины представляют собой один из следующих: IL-6, IL-1β или TNF-α; где комплемент представляет собой C5b-9.

21. Способ по п. 19, который предназначен для уменьшения воспаления сустава путем улучшения уровня гидроксипролиновой кислоты в бедренной кости.

22. Способ по п. 19, который предназначен для облегчения или лечения остеопороза путем повышения уровня одного из следующих: костного весового коэффициента, плотности кости, уровня зольности, уровня фосфора в кости, щелочной фосфатазы в сыворотке крови, костного морфогенетического белка, кальцитонина, площади бедренных трабекул, процента площади трабекул или количества трабекул, или путем снижения уровня паратиреоидного гормона.

23. Способ по п. 19, где указанная композиция содержит суточную дозу 50-800 мг низкомолекулярного хондроитина сульфата для человека.

24. Способ по п. 19, где указанную композицию вводят в лекарственных формах таблеток, гранул, капсул или пилюль.

25. Способ по п. 19, где указанную композицию вводят один раз в сутки или два раза в сутки.