RU2843006C1 - Новая система доставки лекарственного препарата для офтальмологического использования - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к офтальмологическим составам. Раскрыта система доставки лекарственного препарата, включающая децеллюляризованный каркас стромы роговицы, имеющий диспергированные в пределах поверхности и/или связанные с поверхностью микрочастицы, содержащие по меньшей мере одну фармацевтически активную молекулу, диспергированную в матрице, содержащей композицию, включающую от 85% масс./масс. до 95% масс./масс. сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA), полиэтиленгликоль и альбумин, где частицы характеризуются распределением частиц по размерам согласно измерению при использовании технологии лазерной дифракции в диапазоне между 1,9 и 7 мкм, и фармацевтически активная молекула представляет собой белок или пептид. Также раскрыты способ получения системы доставки лекарственного препарата и ее применение для лечения глазных заболеваний. Группа изобретений обеспечивает высвобождение активной молекулы с постоянной скоростью, при этом система доставки является высокобиосовместимой и неиммуногенной. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 6 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области офтальмологических составов с замедленным высвобождением для доставки активных веществ на поверхность глаза, в частности, для лечения патологий роговицы.

Уровень техники

Местная инстилляция лекарственных препаратов в виде глазных капель представляет собой предпочтительный и общепринятый путь лечения большинства заболеваний переднего сегмента глаза.

Однако, данный способ введения является исключительно неэффективным и характеризуется в высшей степени неудовлетворительной биодоступностью. После инстилляции поток слезной жидкости перемещает лекарственный препарат с поверхности глаза в носослезные протоки за несколько минут, и, таким образом, основная его часть утрачивается через носослезный дренаж. Только 5% от совокупного количества вводимого лекарственного препарата доступны на протяжении достаточного периода времени нахождения в контакте с поверхностью глаза для проявления лечебного действия.

Это требует частого введения большого количества лекарственного препарата при очень плохом соблюдении пациентами инструкций по его приему и делает эффективную дозу неточной.

В целях достижения эффективных концентрации лекарственного препарата и времени удержания на передней поверхности глаза использовали обтураторы слезных точек, что, таким образом, уменьшает дозу и частоту введения. Они представляют собой маленькие медицинские изделия, которые вставляются в слезный проток глаза для блокирования протока и, таким образом, предотвращают дренаж жидкости из глаза. Однако, они могут плохо переноситься пациентами и вызывать осложнения, такие как повышенное слезоотделение, ощущение инородного тела, инфицирование, пиогенная гранулема, эрозия слезных канальцев, дакриоцистит и повышенные симптомы аллергии.

Один альтернативный подход заключался в разработке систем доставки с замедленным высвобождением, которые продлевают для переднего сегмента глаза время удерживания на роговице лекарственных препаратов, таких как вязкие растворы, мукоадгезивные материалы или контактные линзы с лекарственным покрытием.

Например, в публикации US 20040241207 раскрывается контактная линза с внедренными наночастицами лекарственного препарата, которые диффундируют через контактную линзу в подлинзовую слезную пленку при наложении линзы на глаз.

Однако, контактным линзам или другим искусственным полимерам свойственно неудобство, заключающееся в возможном запуске ими иммунных реакций у пациентов.

В дополнение к вышеизложенному биодоступность лекарственного препарата дополнительно уменьшается физиологическими барьерами глаза, что значительно ограничивает концентрацию лекарственного препарата во внутренних слоях роговицы. В частности, эпителий роговицы является липофильным и демонстрирует плотные соединения между клетками, что приводит к его ограниченной проницаемости молекулами лекарственного препарата, в частности, гидрофильными молекулами лекарственного препарата.

Поэтому ощущается потребность в разработке биосовместимой неиммуногенной системы доставки, которая разрешает вышеупомянутые проблемы и делает возможным получение достаточных концентраций молекул лекарственного препарата на протяжении достаточного периода времени на переднем участке глаза.

Сущность изобретения

Изобретатели настоящего изобретения к своему удивлению обнаружили возможность функционализации стромы роговицы микрочастицами сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA), содержащими фармацевтически активные молекулы, и использования ее для доставки с контролируемым высвобождением данных молекул переднему участку глаза.

В соответствии с этим, первая цель изобретения представляет собой систему доставки лекарственного препарата, подходящую для офтальмологического использования и включающую децеллюляризованный каркас стромы роговицы, имеющий диспергированные в пределах поверхности и/или связанные с поверхностью микрочастицы, содержащие, по меньшей мере, одну фармацевтически активную молекулу, диспергированную в матрице, содержащей композицию, состоящую на, по меньшей мере, 70% из сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA).

Вторая цель изобретения представляет собой технологический процесс изготовления системы доставки лекарственного препарата, соответствующей первой цели изобретения.

Третья цель изобретения представляет собой фармацевтически активную молекулу для использования при лечении патологий передней области глаза, где упомянутая фармацевтически активная молекула вводится при использовании системы доставки лекарственного препарата, соответствующей первой цели изобретения.

Четвертая цель изобретения представляет собой способ лечения патологий передней области глаза, включающий введение фармацевтически активной молекулы при использовании системы доставки лекарственного препарата, соответствующей первой цели изобретения.

Описание фигур

На фиг. 1 представлены полученные при использовании просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) изображения, демонстрирующие лентикулу без обработки (панель А) и лентикулу после децеллюляризации под действием 0,1% SDS (панель В) в соответствии с описанием изобретения в примере 2.

Фиг. 2 демонстрирует изображения лентикул, полученные при использовании конфокальной микроскопии в соответствии с описанием изобретения в примере 4. Говоря подробно, панель А демонстрирует трехмерную реконструкцию, обнаруживающую поверхностную локализацию микрочастиц Fluo-MPs (светло-серые точки) в лентикуле; панель В демонстрирует двумерное изображение, обнаруживающее распределение микрочастиц Fluo-Mps (светло-серые точки) между коллагеновыми волокнами (темно-серая область).

Фиг. 3 демонстрирует кинетику высвобождения фактора rhNGF в лабораторных условиях из лентикулы согласно измерениям в примере 6. Диаграмма демонстрирует кумулятивное высвобождение фактора rhNGF из содержащих его микрочастиц PLGA-MPs, прежде включенных в лентикулу.

Подробное описание изобретения

Первая цель настоящего изобретения представляет собой систему доставки лекарственного препарата, включающую децеллюляризованный каркас стромы роговицы, имеющий диспергированные в пределах поверхности и/или связанные с поверхностью микрочастицы, содержащие, по меньшей мере, одну фармацевтически активную молекулу, диспергированную в матрице, содержащей композицию, состоящую на, по меньшей мере, 70% (масс./масс.) из сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA).

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения каркас стромы роговицы, соответствующий первой цели изобретения, представляет собой трансплантат, полученный из роговицы излечиваемого пациента или от донора.

Например, упомянутая строма роговицы может быть получена от донора, подвергающегося воздействию рефракционной глазной хирургии, предпочтительно рефракционной экстракции лентикулы (ReLex) или фемтосекундной экстракции лентикулы (FLEx). В альтернативном варианте, строма роговицы может происходить от донора трупной ткани.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения упомянутый каркас стромы роговицы является сконструированным каркасом стромы роговицы, полученным в лабораторных условиях.

Предпочтительно упомянутый каркас стромы роговицы представляет собой лентикулу стромы роговицы.

Предпочтительно упомянутая лентикула стромы роговицы имеет толщину в диапазоне между 80 и 300 мкм, предпочтительно между 100 и 150 мкм, и/или диаметр между 4 и 9 мм, предпочтительно между 5 и 8 мм, более предпочтительно между 6 и 7 мм.

Предпочтительно упомянутый каркас стромы роговицы является бесклеточным.

Отсутствие клеток в строме делает ее иммуногенно-совместимой и создает поры в каркасе, которые включают микрочастицы.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления упомянутые микрочастицы дипергируются в пределах децеллюляризованного каркаса стромы роговицы.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления упомянутые микрочастицы являются как диспергированными в пределах поверхности децеллюляризованного каркаса стромы роговицы, так и связанными с данной поверхностью.

Предпочтительно упомянутая матрица системы доставки лекарственного препарата, соответствующая первой цели изобретения, содержит, по меньшей мере, 75% (масс./масс.), предпочтительно 80% (масс./масс.), более предпочтительно 85% (масс./масс.), сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA).

Предпочтительно упомянутая матрица содержит от 85% (масс./масс.) до 95% (масс./масс.), более предпочтительно 89% (масс./масс.), сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA).

В соответствии с одним в особенности предпочтительным вариантом осуществления упомянутый сополимер PLGA характеризуется составом сополимера, состоящим из от 50% (масс./масс.) до 75% (масс./масс.), предпочтительно 75% (масс./масс.), молочной кислоты и от 50% (масс./масс.) до 25% (масс./масс.), предпочтительно 25% (масс./масс.), гликолевой кислоты.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления, также и в комбинации с предшествующими вариантами осуществления, упомянутый сополимер PLGA является аморфным.

В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления, также и в комбинации с предшествующими вариантами осуществления, упомянутый сополимер PLGA имеет молекулярную массу в диапазоне между 4000-15000 г/моль.

Сополимер PLGA, в особенности хорошо подходящий для использования в системе доставки лекарственного препарата изобретения, представляет собой, например, продукт, выпущенный на рынок под торговым наименованием Resomer® RG752H и представляющий собой сополи(D, L-лактид-гликолид).

Предпочтительно упомянутая матрица, кроме того, содержит в дополнение к PLGA один или несколько дополнительных компонентов, выбираемых из полиэтиленгликоля, предпочтительно полиэтиленгликоля низкомолекулярной марки, более предпочтительно PEG400, альбумина, предпочтительно человеческого сывороточного альбумина (HSА), и/или трегалозы. Предпочтительно упомянутая матрица содержит композицию, состоящую из PLGA, PEG400, HAS и трегалозы, где PLGA присутствует в количестве, составляющем, по меньшей мере, 70% (масс./масс.) от совокупной композиции.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения упомянутые микрочастицы состоят из упомянутой матрицы совместно с диспергированной в ней, по меньшей мере, одной фармацевтически активной молекулой.

Предпочтительно в целях получения как эффективных включения в каркас стромы роговицы или связывания с ним, так и подходящей для использования скорости высвобождения фармацевтически активной молекулы микрочастицы характеризуются распределением частиц по размерам согласно измерению при использовании технологии лазерной дифракции в диапазоне между 1 и 15 мкм, предпочтительно между 1,5 и 10 мкм, более предпочтительно между 1,9 и 7 мкм. Предпочтительно упомянутый размер частиц измеряют при использовании анализатора размеров частиц Mastersizer2000 с установкой для диспергирования влажного образца Hydro 2000μP (Malvern Panalytical).

Система доставки лекарственного препарата, соответствующая изобретению, способна высвобождать фармацевтически активную молекулу с контролируемой скоростью, предпочтительно на протяжении периода, составляющего, по меньшей мере, один месяц.

Предпочтительно упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой белок или пептид.

Упомянутый белок может быть природного происхождения или синтетически произведенным, предпочтительно он представляет собой рекомбинантный белок.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой фактор роста или пептид или белок, имитирующие фактор роста. Более предпочтительно упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой нейротропин или пептид или белок, имитирующие нейротропин.

В соответствии с настоящим изобретением термин «нейротропин» относится к белкам, включающим рекомбинантные белки, которые исполняют функцию стимуляторов роста для нейронов. Они включают фактор роста нервов (NGF), нейротропный фактор мозга (BDNF), нейротропин-3 (NT-3) и нейротропин-4 (NT-4); термин «пептид или белок, имитирующие нейротропин» относится к любым пептиду или белку природного или синтетического происхождения, способным исполнять функцию агониста для одного или нескольких рецепторов нейротропина. Например, белок, имитирующий нейротропин, может быть белком, который имеет мутации или усечения по отношению природному нейротропину дикого типа, но способен активировать один или несколько рецепторов нейротропина. Пептидомиметики могут представлять собой либо линейные, либо циклические пептиды.

В особенности предпочтительные фармацевтически активные молекулы, соответствующие изобретению, представляют собой фактор роста нервов или пептиды или белки, имитирующие фактор роста нервов. Упомянутый фактор роста нервов предпочтительно является фактором роста нервов человека, более предпочтительно рекомбинантным фактором роста нервов человека.

Количество фармацевтически активной молекулы, диспергированной в матрице микрочастиц, будет варьироваться в зависимости от желательной дозы, вводимой на переднюю часть глаза. Предпочтительно, когда упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой фактор роста нервов, она содержится в упомянутой матрице микрочастиц в количестве в диапазоне между 30 и 100 нг, предпочтительно между 50 и 90 нг, более предпочтительно между 60 и 80 нг, при расчете на каждый мг. В соответствии с настоящим изобретением выражение «децеллюляризованный каркас стромы роговицы, имеющий связанные с поверхностью микрочастицы» обозначает то, что микрочастицы удерживаются и сохраняются на поверхности децеллюляризованного каркаса стромы роговицы под действием силы притяжения, которая может быть различного вида.

Вторая цель настоящего изобретения представляет собой способ получения системы доставки лекарственного препарата в соответствии с представленным выше описанием изобретения, включающий следующие далее стадии:

а. получение каркаса стромы роговицы в соответствии с представленным выше описанием изобретения, предпочтительно лентикулы стромы роговицы, из роговицы донора в соответствии с представленным выше описанием изобретения;

b. удаление клеточного материала из упомянутого каркаса в случае присутствия такового при получении, таким образом, децеллюляризованного каркаса стромы роговицы;

с. инкубирование упомянутого децеллюляризованного каркаса стромы роговицы в суспензии микрочастиц, содержащих, по меньшей мере, одну фармацевтически активную молекулу, диспергированную в матрице, содержащей композицию, состоящую на, по меньшей мере, 70% (масс./масс.) из сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA) в соответствии с представленным выше описанием изобретения.

Предпочтительно на стадии а. упомянутый каркас стромы роговицы представляет собой лентикулу стромы роговицы с толщиной в диапазоне между 80 и 300 мкм, предпочтительно между 100 и 150 мкм, и/или диаметром между 4 и 9 мм, предпочтительно между 5 и 8 мм, более предпочтительно между 6 и 7 мм.

Предпочтительно на стадии b. вышеупомянутого способа, соответствующего изобретению, упомянутый клеточный материал удаляют таким образом, чтобы получить количество остаточных клеток в упомянутом каркасе стромы роговицы, составляющее менее, чем 0,5% (масс.), более предпочтительно получить бесклеточную лентикулу.

Предпочтительно упомянутый клеточный материал удаляют в результате инкубирования лентикулы в растворе поверхностно-активного вещества. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления упомянутое поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия (SDS), предпочтительно при концентрации, находящейся в диапазоне между 0,05 и 0,2%, более предпочтительно составляющей 0,1%.

В целях получения эффективного удаления клеточного компонента из лентикулы инкубирование с раствором поверхностно-активного вещества необходимо проводить на протяжении, по меньшей мере, 20 часов, предпочтительно на протяжении, по меньшей мере, 24 часов.

Когда каркас стромы роговицы представляет собой лентикулу стромы роговицы, децеллюляризованные лентикулы, полученные на стадии b., могут быть инкубированы совместно с микрочастицами непосредственно после экстракции у донора.

Более предпочтительно децеллюляризованные лентикулы, полученные на стадии b., обезвоживают и хранят при комнатной температуре вплоть до использования. В соответствии с данным вариантом осуществления вышеупомянутый способ, кроме того, включает после стадии b. и до стадии с. стадию b', когда децеллюляризованные лентикулы обезвоживают, предпочтительно в результате обработки при температуре, находящейся в диапазоне между 50° и 70°С, предпочтительно между 55° и 65°С, более предпочтительно составляющей 60°С, на протяжении от 1 до 3 часов, предпочтительно 2 часов.

Обезвоживание децеллюляризованных лентикул является в особенности выгодным, поскольку оно значительно увеличивает возможность включения микрочаститц в строму.

Инкубирование каркаса стромы роговицы с суспензией микрочастиц на стадии с. предпочтительно проводят при комнатной температуре.

Предпочтительно упомянутое инкубирование проводят на протяжении периода времени, находящегося в диапазоне между 1 и 5 часами, предпочтительно составляющего 3 часа.

Микрочастицы стадии с. способа, соответствующего настоящему изобретению, получают при использовании следующих далее стадий:

а. получение эмульсии вода/масло, содержащей фармацевтически активное вещество и сополимер молочной-гликолевой кислот.

b. получение водного раствора, содержащего поливиниловый спирт с примешанным тем же самым органическим растворителем, что и использованный в масляной фазе стадии а.

с. смешивание эмульсии и раствора, полученных на стадиях а. и b., и гомогенизация при получении, таким образом, эмульсии вода/масло/вода.

d. выпаривание органического растворителя при получении, таким образом, осаждения микрочастиц.

е. извлечение и промывание осажденных микрочастиц.

f. лиофильная сушка микрочастиц.

Предпочтительно на стадии а. сополимер молочной-гликолевой кислот присутствует с концентрацией в диапазоне между 10 и 30% (масс./об.), предпочтительно между 15 и 25% (масс./об.), более предпочтительно между 18 и 22% (масс./об.).

Предпочтительно упомянутая масляная фаза на стадии а. представляет собой этилацетат.

Предпочтительно на стадии b. концентрация поливинилового спирта в водном растворе находится в диапазоне между 0,5 и 2% (масс./об.), предпочтительно составляет 1% (масс./об.).

Система доставки лекарственного препарата, полученная при использовании технологического процесса, соответствующего второй цели изобретения, имеет все признаки, соответствующие первой цели изобретения.

Как это будет продемонстрировано в примере 6, устройство доставки лекарственного препарата, соответствующее изобретению, способно высвобождать с контролируемой скоростью фармацевтически активную молекулу из микрочастиц, включенных в каркас стромы роговицы, на протяжении периода времени, составляющего, по меньшей мере, один месяц.

Система доставки, соответствующая изобретению, может быть с выгодой использована для доставки фармацевтически активных молекул до переднего сегмента глаза.

Введение пациенту может быть осуществлено различным образом в зависимости от конкретной излечиваемой патологии.

Например, в случае, когда необходимо, чтобы фармацевтически активная молекула проявляла бы свою активность на внутренних слоях роговицы, система доставки может быть имплантирована в созданный хирургическим путем интрастромальный карман в глазу пациента, например, сформированный при использовании фемтосекундного лазера. В альтернативном варианте, система доставки может быть нанесена на поверхность роговицы.

Активная молекула в системе доставки будет высвобождаться с постоянной скоростью, выдерживая, таким образом, эффективную концентрацию по месту действия на протяжении всего лечения.

Система доставки, соответствующая изобретению, является высокобиосовместимой и неиммуногенной и поэтому хорошо переносится пациентами.

В соответствии с этим, третья цель изобретения представляет собой фармацевтически активную молекулу в соответствии с представленным выше описанием изобретения для использования при лечении глазных патологий, предпочтительно патологий передней области глаза, где упомянутая фармацевтически активная молекула вводится в системе доставки лекарственного препарата, соответствующей первой цели изобретения.

Четвертая цель изобретения представляет собой способ лечения глазных патологий, предпочтительно патологий передней области глаза, включающий введение фармацевтически активной молекулы в системе доставки лекарственного препарата, соответствующей первой цели изобретения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ

Пример 1

Получение микрочастиц, содержащих rhNGF (рекомбинантный фактор роста нервов человека)

Микрочастицы, образованные из матрицы сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA), содержащей rhNGF, получали в соответствии с методикой, описанной ниже.

Получали раствор при 0,85 мг/мл rhNGF в рецептурном буфере (50 ммоль/л моногидрата одноосновного фосфата натрия, 100 ммоль/л хлорида натрия, рН 7,2).

Получали водный раствор W1, содержащий 150 мкл полученного выше раствора rhNGF, 6,01 мг человеческого сывороточного альбумина (HSА) и 150 мкл полиэтиленгликоля 400 (PEG400) (соотношение об./масс./об. 1:40:1).

После этого 150 мкл раствора W1 добавляли к 7,5 мл раствора О, содержащего 20% (масс./об.) PLGA (Resomer® RG752H) в этилацетате, и гомогенизировали при 17400 об./мин на протяжении 3 минут в гомогенизаторе Ultraturrax t25 basic (IKA), использующем зонд 8G.

Полученную эмульсию W1/O быстро добавляли к 30 мл водного раствора W2, содержащего 1% (масс./об.) поливинилового спирта (PVA) (Mowiol® 40-88) с примешанными 900 мкл этилацетата, и гомогенизировали еще раз при 1200 об./мин на протяжении 30 минут. Получающуюся в результате двойную эмульсию (W1/O/W2), воду для промывания пробирки и извлечения материала перемешивали на протяжении 3 часов при 500 об./мин при комнатной температуре, используя верхнеприводное перемешивающее устройство RW20D (IKA) с 2-лопастной пропеллерной мешалкой с покрытием из PTFE, для обеспечения выпаривания органического растворителя и осаждения микрочастиц. Суспензию собирали в двух полипропиленовых пробирках на 50 мл (Eppendorf Lobind protein) и центрифугировали при 7400 об./мин на протяжении 15 минут при 4°С. Микрочастицы выделяли и промывали 6 раз, используя 50 мл воды качества Milli-Q, в результате центрифугирования при 7400 об./мин на протяжении 15 минут при 4°С. После этого микрочастицы ресуспендировали в водном растворе трегалозы при 2% (масс./об.). Полученную суспензию перемещали в силиконизированные ампулы Class 1, относящиеся к типу стекла ISO, и замораживали при - 80°С для лиофилизации впоследствии. Микрочастицы, произведенные при использовании данной методики, демонстрируют эффективность включения, составляющую более, чем 73% (55,5 нг rhNGF/мг микрочастиц в сопоставлении с теоретическим значением 76 нг rhNGF/мг микрочастиц), при распределении частиц по размерам в диапазоне между 1,9 и 6,9 мкм согласно измерению при использовании способа диспергирования влажного образца Hydro 2000μP, использующего анализатор Mastersizer2000 (Malvern). Конечная композиция микрочастиц состоит на 89% (масс./масс.) из PLGA.

Пример 2

Получение обезвоженных децеллюляризованных лентикул

Лентикулы роговицы человека, имеющие толщину в диапазоне между 100 и 150 мкм, получали при использовании хирургической операции SMALL (экстракция лентикулы через малый разрез) в соответствии с методикой, описанной в публикации Sekundo W, Kunert KS, Blum M. Br J Ophthalmol. 2011; 95:335-339, и криоконсервировали вплоть до дальнейшей переработки.

Позднее получали лентикулы для использования при функционализации в соответствии со следующей далее методикой.

Лентикулы оттаивали и клеточный компонент лентикул исключали в результате инкубирования в 0,1%-ном растворе SDS на протяжении 24 часов при комнатной температуре со следующими далее 3 промываниями в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе) (24 часа в каждом случае).

Как это продемонстрировано на фиг. 1, которая показывает анализ при использовании просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) лентикулы до (панель А) и после (панель В) обработки раствором SDS, получали полное удаление клеточного компонента.

После этого децеллюляризованные лентикулы роговицы обезвоживали в результате обработки при 60°С на протяжении 2 часов и хранили при комнатной температуре вплоть до использования.

Пример 3

Функционализация лентикул

Микрочастицы, содержащие rhNGF и полученные в примере 1, использовали для функционализации обезвоженных децеллюляризованных лентикул, полученных в примере 2.

Говоря подробно, 20 мг микрочастиц, полученных в примере 1, суспендировали в 0,175 мл 0,9%-ного раствора NaCl и к полученной суспензии добавляли одну лентикулу и инкубировали на протяжении 3 часов при комнатной температуре, используя орбитальный шейкер при 200 об./мин.

После этого лентикулу удаляли из суспензии и промывали 10 раз в 0,4 мл 0,9%-ного раствора NaCl (основательно).

Пример 4

Анализ функционализованных лентикул

Функционализованную лентикулу, полученную в соответствии с описанием изобретения в примере 3, лизировали в результате инкубирования с 0,2 мл раствора при 5 мг/мл коллагеназы IA в буфере PBS, содержащем 100 мг/л Са²⁺/Mg²⁺, при 37°С на протяжении 30 минут, данную стадию проводили для конкретного лизиса лентикулы при сохранении уже высвобожденного фактора rhNGF (супернатнант) и целых микрочастиц rhNGF-MPs (гранулы). Лизированные образцы центрифугировали на протяжении 10 минут при 8000 об./мин и 4°С.

Фаза супернатанта, полученная в результате центрифугирования, содержит фактор rhNGF, уже высвобожденный микрочастицами, тогда как фаза гранул содержит целостные микрочастицы MPs.

Фазу супернатанта собирали и сразу же отправляли ее на хранение при -20°С вплоть до анализа.

Остаточные гранулы, соответствующие целостным микрочастицам, высвобожденным лентикулой при лизисе, обрабатывали с помощью 0,05 мл этилацетата для лизиса оболочки из PLGA у микрочастиц MPs и добавляли 0,100 мл буфера PBS, содержащего 100 мг/л Са²⁺/Mg²⁺, для безопасной экстракции rhNGF. Образцы центрифугировали на протяжении 5 минут при 8000 об./мин и собирали водную фазу (фазу гранул).

Каждую среду, выбираемую из супернатанта и фазы гранул, разбавляли при 1:3 в буфере PBS, содержащем 100 мг/л Са²⁺/Mg²⁺, и анализировали, используя анализ ELISA, для детектирования концентрации rhNGF.

Фаза супернатанта содержит фактор rhNGF, уже высвобожденный микрочастицами MPs, в то время как фаза гранул содержит целостные микрочастицы MPs.

Результаты, полученные от анализа трех лентикул, продемонстрированы в приведенной ниже таблице 1.

Таблица 1

Образец		Концентрация rhNGF в каждой фазе (пг/мл)	Совокупная концентрация rhNGF (пг/мл)	Свободный и высвобожденный фактор rhNGF/rhNGF в MP
Лентикула 1	Супернатант (свободный и высвобожденный фактор rhNGF)	6387	7617	84%
	Гранулы (целостные микрочастицы MPs)	1230		16%
Лентикула 2	Супернатант (свободный и высвобожденный фактор rhNGF)	3455	4384	79%
	Гранулы (целостные микрочастицы MPs)	929		21%
Лентикула 3	Супернатант (свободный и высвобожденный фактор rhNGF)	3904	4639	84%
	Гранулы (целостные микрочастицы MPs)	735		16%

Полученные результаты демонстрируют высокую воспроизводимость в различных лентикулах соотношения между высвобожденным фактором rhNGF и фактором rhNGF, содержащимся в микрочастицах.

Пример 5

Распределение микрочастиц rhNGF-MPs в лентикулах

Флуоресцентные микрочастицы из PLGA (Fluo-MPs) (поставляемые компанией S. I. C., #LGFG5000) использовали для тестирования взаимодействия микрочастиц с лентикулой.

5 мг Fluo-MPs суспендировали в 0,175 мл 0,9%-ного раствора и к полученной суспензии добавляли одну лентикулу и инкубировали на протяжении 3 часов при комнатной температуре, используя орбитальный шейкер при 200 об./мин.

После этого лентикулу удаляли из суспензии и промывали 10 раз в 0,4 мл 0,9%-ного раствора NaCl (основательно).

В целях оценки связывания микрочастиц Fluo-MPs с лентикулой или включения их в нее и их местоположения коллаген в лентикуле окрашивали при использовании иммунофлуоресценции, используя изложенный ниже протокол.

Лентикулу фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида на протяжении 10 мин, промывали 3 раза в PBS 1X на протяжении 5 мин, а после этого инкубировали на протяжении 1 часа с первичным антителом Anti-Collagen I (Abcam, Cat# ab34710) в 1%-ном растворе BSA (бычьего сывороточного альбумина), полученном в PBS 1X. После этого ее промывали снова 3 раза в PBS 1X на протяжении 5 минут и инкубировали на протяжении 1 часа с вторичным антителом Anti-rabbit Cy3 (Jackson ImmunoResearch, Laboratories, Cat# 111-165-144)) в 1%-ном растворе BSA, полученном в PBS 1X, и промывали 3 раза в PBS 1X на протяжении 5 минут.

В заключение, иммуноокрашенную лентикулу, размещали на покровном стекле и анализировали при использовании конфокального микроскопа LMS-800 Zeiss.

Как это демонстрируют полученные данные, показанные на фиг. 2, микрочастицы в основном связывались на поверхности лентикулы.

Пример 6

Кинетика высвобождения rhNGF из микрочастиц MPs, включенных в лентикулу, в лабораторных условиях

Кинетику высвобождения rhNGF из функционализованных лентикул в лабораторных условиях оценивали при использовании следующей далее методики.

Функционализованную лентикулу, полученную в соответствии с описанием изобретения в примере 3, инкубировали в пробирке, содержащей 0,150 мл PBS, при 37°С, используя орбитальный шейкер при 80 об./мин (для сохранения rhNGF использовали пробирки LoBind).

Задавали временные точки при t=0, 2, 4 или 24 часа и t=2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19, 21, 23 или 25 дней.

В каждой временной точке лентикулу удаляли из исходной пробирки и перемещали в новую пробирку, содержащую 0,150 мл PBS, и инкубировали еще раз при 37°С, используя орбитальный шейкер при 80 об./мин.

Каждый образец сразу же отправляли на хранение при -20°С.

По истечении 1 месяца образцы анализировали без разбавления, используя анализ ELISA, для оценки титра rhNGF.

Как это продемонстрировано на фиг. 3, высвобождение rhNGF из микрочастиц MPs, включенных в лентикулу, поддерживалось на протяжении приблизительно одного месяца. В частности, нейротропин быстро высвобождался в первые 24 часа, и высвобождение выдерживалось постоянным вплоть до конца эксперимента.

Claims (28)

1. Система доставки лекарственного препарата, включающая децеллюляризованный каркас стромы роговицы, имеющий диспергированные в пределах поверхности и/или связанные с поверхностью микрочастицы, содержащие по меньшей мере одну фармацевтически активную молекулу, диспергированную в матрице, содержащей композицию, включающую от 85% масс./масс. до 95% масс./масс. сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA), полиэтиленгликоль и альбумин,

где частицы характеризуются распределением частиц по размерам согласно измерению при использовании технологии лазерной дифракции в диапазоне между 1,9 и 7 мкм, и фармацевтически активная молекула представляет собой белок или пептид.

2. Система доставки лекарственного препарата по п. 1, где матрица содержит 89% масс./масс. сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA).

3. Система доставки лекарственного препарата по п. 1 или 2, где полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль низкомолекулярной марки, более предпочтительно PEG400, и альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSА).

4. Система доставки лекарственного препарата по пп. 1-3, где упомянутый каркас стромы роговицы представляет собой трансплантат, полученный из роговицы донора.

5. Система доставки лекарственного препарата по пп. 1-4, где упомянутый каркас стромы роговицы представляет собой лентикулу стромы роговицы.

6. Система доставки лекарственного препарата по п. 5, где упомянутую лентикулу стромы роговицы получают из роговицы донора при использовании рефракционной глазной хирургии, предпочтительно рефракционной экстракции лентикулы (ReLex) или фемтосекундной экстракции лентикулы (FLEx).

7. Система доставки лекарственного препарата по п. 5 или 6, где упомянутая лентикула роговицы имеет толщину в диапазоне между 80 и 300 мкм, предпочтительно между 100 и 150 мкм, и/или диаметр между 4 и 9 мм, предпочтительно между 5 и 8 мм, более предпочтительно между 6 и 7 мм.

8. Система доставки лекарственного препарата по п. 1, где упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой фактор роста или пептид или белок, имитирующие фактор роста.

9. Система доставки лекарственного препарата по п. 1 или 8, где упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой нейротропин или пептид или белок, имитирующие нейротропин.

10. Система доставки лекарственного препарата по пп. 1-9, где упомянутая фармацевтически активная молекула представляет собой фактор роста нервов или пептид или белок, имитирующие фактор роста нервов.

11. Система доставки лекарственного препарата по п. 10, где количество упомянутого фактора роста нервов в упомянутых микрочастицах находится в диапазоне между 30 и 100 нг, предпочтительно между 50 и 90 нг, более предпочтительно между 60 и 80 нг, при расчете на каждый мг микрочастиц.

12. Способ получения системы доставки лекарственного препарата по пп. 1-11, включающий следующие далее стадии:

а. получение каркаса стромы роговицы из роговицы донора;

b. удаление клеточного материала из упомянутого каркаса в случае присутствия такового при получении, таким образом, децеллюляризованного каркаса стромы роговицы;

с. инкубирование упомянутого децеллюляризованного каркаса стромы роговицы в суспензии микрочастиц, содержащих по меньшей мере одну фармацевтически активную молекулу, диспергированную в матрице, содержащей композицию, включающую от 85% масс./масс. до 95% масс./масс. сополимера молочной-гликолевой кислот (PLGA), полиэтиленгликоль и альбумин, где частицы характеризуются распределением частиц по размерам согласно измерению при использовании технологии лазерной дифракции в диапазоне между 1,9 и 7 мкм, и фармацевтически активная молекула представляет собой белок или пептид.

13. Способ получения по п. 12, где на стадии а получают каркас стромы роговицы, представляющий собой лентикулу стромы роговицы.

14. Способ по п. 12 или 13, где на стадии b упомянутый клеточный материал удаляют в результате инкубирования каркаса стромы роговицы в растворе поверхностно-активного вещества.

15. Способ по п. 14, где упомянутое поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия, предпочтительно при концентрации, находящейся в диапазоне между 0,05 и 0,2%, предпочтительно составляющей 0,1%.

16. Способ по пп. 12-15, где упомянутые микрочастицы стадии с получают при использовании следующих стадий:

а. получение эмульсии вода/масло, содержащей фармацевтически активное вещество и матрицу, включающую сополимер молочной-гликолевой кислот, полиэтиленгликоль и альбумин;

b. получение водного раствора, содержащего поливиниловый спирт с примешанным тем же самым органическим растворителем, что и использованный в масляной фазе стадии а;

с. смешивание эмульсии и раствора, полученных на стадиях а и b, и гомогенизация при получении, таким образом, эмульсии вода/масло/вода;

d. выпаривание органического растворителя при получении, таким образом, осаждения микрочастиц;

е. извлечение и промывание осажденных микрочастиц;

f. лиофильная сушка микрочастиц.

17. Применение системы доставки лекарственного препарата по пп. 1-11 для лечения глазных патологий.

18. Применение по п. 17, которое предпочтительно для лечения патологий передней области глаза.