RU2842283C1

RU2842283C1 - Method for preparing samples of bronchoalveolar washings for analysis by mass spectrometry of microbial markers

Info

Publication number: RU2842283C1
Application number: RU2024118697A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Валерьевна Умпелева; Сергей Николаевич Скорняков; Диана Владимировна Вахрушева; Анна Сергеевна Цвиренко; Ольга Викторовна Быстрова
Filing date: 2024-07-04
Publication date: 2025-06-24

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to a method for preparing samples of bronchoalveolar washings, including the introduction through a video bronchoscope channel into a bronchial lumen of 0.9% NaCl solution heated to 37 °C in volume of 40 ml, sampling of bronchial contents by means of a vacuum aspirator through the aspiration canal of the bronchoscope into a sterile storage container. Samples of bronchial contents are delivered at room temperature to laboratory and within one hour material is selected for analysis, washout 3 ml is transferred into two Eppendorf test tubes, centrifuged, then the precipitate is transferred into a glass vial, acetone is added, dried in a dry heat cabinet or a thermostat.

EFFECT: invention simplifies sample preparation, storage and transportation of biomaterial intended for analysis by mass spectrometry of microbial markers, preparation of quality samples of bronchoalveolar washings for analysis by mass spectrometry of microbial markers with possibility of their storage and transportation without observing time constraints and temperature conditions.

1 cl, 3 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и может быть использовано для проведения исследований микробиоты у пациентов с разными клинико-рентгенологическими вариантами течения туберкулеза.The invention relates to medicine, namely to microbiology, and can be used to conduct studies of the microbiota in patients with different clinical and radiological variants of tuberculosis.

В настоящее время ключевой информацией при назначении химиотерапии туберкулеза является лекарственная чувствительность возбудителя - Mycobacterium tuberculosis, при этом не учитывается взаимодействие возбудителя туберкулеза с другими микроорганизмами, входящими в состав микробных сообществ макроорганизма (микробиоты). Несмотря на активное развитие исследований микробиоты человека, количество доступных исследований респираторной микробиоты в контексте туберкулеза легких остается ограниченным. Анализируя существующие данные исследований респираторной микробиоты, можно отметить ряд аспектов, затрудняющих интерпретацию данных и сравнение результатов исследований, проведенных различными авторами.Currently, the key information when prescribing chemotherapy for tuberculosis is the drug sensitivity of the pathogen - Mycobacterium tuberculosis , while the interaction of the tuberculosis pathogen with other microorganisms that are part of the microbial communities of the macroorganism (microbiota) is not taken into account. Despite the active development of human microbiota research, the number of available studies of the respiratory microbiota in the context of pulmonary tuberculosis remains limited. Analyzing the existing data on respiratory microbiota research, we can note a number of aspects that complicate the interpretation of data and comparison of the results of studies conducted by different authors.

Во-первых, использование для анализа разных видов диагностического материала. Установлено, что микробный состав различается на всем протяжении респираторного тракта, следовательно, состав микробиоты, полученный для верхних отделов, не может полностью соответствовать микробиоте легких.Firstly, the use of different types of diagnostic material for analysis. It has been established that the microbial composition varies throughout the respiratory tract, therefore, the composition of the microbiota obtained for the upper sections cannot fully correspond to the microbiota of the lungs.

Во-вторых, использование разных методов исследования. Основным методом для оценки микробного состава долгое время оставался посев диагностического материала на питательные среды. Вместе с тем, этот метод позволяет выявить лишь крайне ограниченный спектр микроорганизмов. Это связано с наличием большого количества некультивируемых форм, потребности которых не могут быть удовлетворены использованием имеющихся бактериологических сред и методов культивирования. Технологии секвенирования сегодня принято считать «золотым стандартом» изучения микробиоты. Однако отсутствие стандартизации на всех этапах исследования затрудняет сопоставление результатов и оценку их значимости, а высокая стоимость исследования делают его недоступным для внедрения в практическое здравоохранения.Secondly, the use of different research methods. The main method for assessing the microbial composition has long been the seeding of diagnostic material on nutrient media. However, this method allows identifying only an extremely limited range of microorganisms. This is due to the presence of a large number of uncultivated forms, the needs of which cannot be met using existing bacteriological media and cultivation methods. Sequencing technologies are now considered the "gold standard" for studying microbiota. However, the lack of standardization at all stages of the study makes it difficult to compare the results and assess their significance, and the high cost of the study makes it inaccessible for implementation in practical healthcare.

В качестве альтернативы описанным выше подходам можно рассматривать метод исследования микробных маркеров (жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов), состав которых указывает на принадлежность микроорганизмов к 57 таксонам, с применением газовой хромато-масс-спектрометрии (МСММ). Данная методика позволяет проводить исследования любых образцов клинического материала без этапа культивирования, отличается низкой стоимостью и простотой выполнения. Исследований с использованием данного метода для изучения респираторной микробиоты больных туберкулезом ранее не проводилось.As an alternative to the approaches described above, one can consider a method for studying microbial markers (fatty acids, aldehydes, alcohols and sterols), the composition of which indicates the belonging of microorganisms to 57 taxa, using gas chromatography-mass spectrometry (GCMS). This technique allows for studying any samples of clinical material without a cultivation stage, is low-cost and easy to perform. No studies using this method have been conducted previously to study the respiratory microbiota of tuberculosis patients.

Для проведения исследования необходима оборудованная лаборатория и прибор - хромато-масс спектрометр. Учитывая отсутствие данного прибора в лабораториях противотуберкулезной службы проблемой заявляемого изобретения является разработка способа подготовки образцов бронхоальвеолярных смывов (БАС), как материала, полученного непосредственно из очага инфекции, которые можно было бы хранить продолжительное время и транспортировать в лабораторию, оснащенную необходимым оборудованием для проведения исследования образцов бронхоальвеолярных смывов методом масс-спектрометрии микробных маркеров.To conduct the study, an equipped laboratory and a device - a chromatograph mass spectrometer are required. Given the absence of this device in the laboratories of the anti-tuberculosis service, the problem of the claimed invention is the development of a method for preparing samples of bronchoalveolar lavage (BAS), as a material obtained directly from the source of infection, which could be stored for a long time and transported to a laboratory equipped with the necessary equipment for conducting a study of bronchoalveolar lavage samples using the method of mass spectrometry of microbial markers.

Известен способ подготовки образцов бронхоальвеолярных смывов, выбранный в качестве прототипа, при котором через канал видеобронхоскопа в просвет бронха вводят физиологический раствор NaCl, через аспирационный канал бронхоскопа производят забор бронхиального содержимого в стерильную накопительную емкость, которую сразу направляют в лабораторию для исследования (https://dna-technology.ru/sites/default/files/tehnika_sbora_i_transportirovaniya_biomaterialov_v_mikrobiologicheskie_laboratorii.pdf).A method for preparing bronchoalveolar lavage samples is known, selected as a prototype, in which a physiological NaCl solution is introduced into the lumen of the bronchus through the channel of the video bronchoscope, and bronchial contents are collected through the aspiration channel of the bronchoscope into a sterile collection container, which is immediately sent to the laboratory for examination (https://dna-technology.ru/sites/default/files/tehnika_sbora_i_transportirovaniya_biomaterialov_v_mikrobiologicheskie_laboratorii.pdf).

Транспортировка исходного образца, без предварительной обработки требует соблюдения температурного и временного режимов. Для большинства клинических образцов, для которых проводится исследование методом МСММ требуется транспортировка при 2-8°С в течение 24 часов, при более длительном времени транспортировки - заморозка -18-20°С. Такие ограничения влекут за собой повышение стоимости транспортировки и риски, связанные с потерей исходных характеристик образца, в случае несоблюдения режимов транспортировки.Transportation of the original sample without preliminary processing requires compliance with temperature and time conditions. Most clinical samples for which the MSMM method is used require transportation at 2-8°C for 24 hours, with a longer transportation time - freezing at -18-20°C. Such restrictions entail an increase in the cost of transportation and risks associated with the loss of the original characteristics of the sample in the event of non-compliance with the transportation conditions.

Технический результат заявляемого изобретения - упрощение пробоподготовки, хранения и транспортировки биоматериала, предполагаемого для исследования методом масс-спектрометрии микробных маркеров, подготовка качественных образцов бронхоальвеолярных смывов для исследования методом масс-спектрометрии микробных маркеров, с возможностью их хранения и транспортировки без соблюдения временных ограничений и температурных условий.The technical result of the claimed invention is the simplification of sample preparation, storage and transportation of biomaterial intended for research using the method of mass spectrometry of microbial markers, the preparation of high-quality samples of bronchoalveolar lavages for research using the method of mass spectrometry of microbial markers, with the possibility of storing and transporting them without observing time restrictions and temperature conditions.

Для достижения заявленного технического результата в Способе подготовки образцов бронхоальвеолярных смывов для исследования методом масс-спектрометрии микробных маркеров, при котором через канал видеобронхоскопа в просвет бронха вводят физиологический раствор NaCl, через аспирационный канал бронхоскопа производят забор бронхиального содержимого в стерильную накопительную емкость, согласно изобретения используют нагретый до 37°С раствор 0,9% NaCl объемом 40 мл, затем через аспирационный канал бронхоскопа производят забор бронхиального содержимого с помощью вакуум-аспиратора, скорость аспирации 70л/мин, в стерильную накопительную емкость, далее образцы доставляют при комнатной температуре в лабораторию и в течение одного часа производят отбор материала для исследования, при этом 3 мл бронхоальвеолярного смыва переносят в две пробирки типа «эпплендорф», по 1,5 мл в каждую, производят центрифугирование 13000 g в течение 15 минут при комнатной температуре, далее осадок переносят в стеклянную виалу, добавляют 200 мкл ацетона, высушивают в сухожаровом шкафу или термостате при 80°С.In order to achieve the stated technical result in the Method of preparing bronchoalveolar lavage samples for testing microbial markers by mass spectrometry, in which a physiological NaCl solution is introduced into the bronchial lumen through a video bronchoscope channel, bronchial contents are collected into a sterile storage container through the bronchoscope aspiration channel, according to the invention, a 0.9% NaCl solution with a volume of 40 ml heated to 37°C is used, then bronchial contents are collected through the bronchoscope aspiration channel using a vacuum aspirator, the aspiration rate is 70 l/min, into a sterile storage container, then the samples are delivered to the laboratory at room temperature and within one hour the material is collected for testing, while 3 ml of bronchoalveolar lavage is transferred into two Epplendorf type test tubes, 1.5 ml in each, centrifugation is performed at 13,000 g for 15 minutes at room temperature, then the sediment is transferred into a glass vial, 200 µl of acetone is added, and dried in a dry-heat oven or thermostat at 80°C.

Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.

На фиг.1 - изображены варианты условий пробоподготовки, проработанные в ходе предварительного лабораторного исследования.Fig. 1 shows variants of sample preparation conditions developed during preliminary laboratory research.

На фиг.2 - клинический пример, результат исследования состава микробных маркеров в бронхоальвеолярном смыве методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии.Fig. 2 shows a clinical example, the result of a study of the composition of microbial markers in bronchoalveolar lavage using gas chromatography-mass spectrometry.

На фиг.3 - то же, продолжениеFig.3 - the same, continued

Предварительно было проведено исследование. В исследование было включено 49 пациентов с установленным диагнозом туберкулез легких, получающие противотуберкулезную химиотерапию. Поскольку технология пробоподготовки бронхоальвеолярных смывов для проведения исследования МСММ не была ранее стандартизирована, то для поиска оптимального варианта авторы провели серию экспериментов, используя различные объемы и режимы центрифугирования. Производили забор бронхиального содержимого. Исследовали осадок, надосадочную жидкость и весь образец целиком. Выполнили пробоподготовку различных вариантов. Исследуемые варианты представлены в таблице на фиг.1. Виалы с высушенными образцами были отправлены для исследования методом МСММ в лабораторию, г.Москва. Исследование методом масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) проводили по стандартной процедуре с использованием модифицированного газового хроматографа масс-спектрометра - Микробиологического анализатора «МАЭСТРО».A preliminary study was conducted. The study included 49 patients with an established diagnosis of pulmonary tuberculosis receiving anti-tuberculosis chemotherapy. Since the technology of sample preparation of bronchoalveolar lavages for the study of MSMM was not previously standardized, then to find the optimal option, the authors conducted a series of experiments using different volumes and centrifugation modes. Bronchial contents were collected. The sediment, supernatant and the entire sample were examined. Sample preparation of various options was performed. The studied options are presented in the table in Fig. 1. Vials with dried samples were sent for research by the MSMM method to the laboratory in Moscow. The study by the method of mass spectrometry of microbial markers (MSMM) was carried out according to the standard procedure using a modified gas chromatograph mass spectrometer - the Microbiological analyzer "MAESTRO".

Маркеры микроорганизмов были выявлены во всех отобранных образцах: без центрифугирования, в осадках и надосадочной жидкости после центрифугирования, но интенсивность сигнала при исследовании МСММ была различна. Причем, результаты одного варианта пробоподготовки могли отличаться у разных образцов. По соотношению «качество результата / удобство технологии» был выбран следующий вариант: центрифугирование 3 мл БАС при 13000 g, 15 мин, при комнатной температуре в двух пробирках типа «эппендорф» (по 1,5 мл в каждой), перенос осадка в стеклянную виалу, добавление 200 мкл ацетона, высушивание в сухожаровом шкафу +80°С.Microorganism markers were detected in all samples: without centrifugation, in sediments and supernatant after centrifugation, but the signal intensity during the MSMM study was different. Moreover, the results of one sample preparation option could differ for different samples. Based on the "quality of the result / convenience of the technology" ratio, the following option was selected: centrifugation of 3 ml of BAS at 13,000 g, 15 min, at room temperature in two Eppendorf tubes (1.5 ml in each), transfer of sediment to a glass vial, addition of 200 μl of acetone, drying in a dry-heat oven at +80°C.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.The claimed method is carried out as follows.

Производят забор материала из бронхов методикой минилаважа. Через канал видеобронхоскопа Pentax-1970К в просвет бронха вводят подогретый до 37°С раствор 0,9% NaCl объемом 40 мл. Затем через аспирационный канал бронхоскопа производят забор бронхиального содержимого с помощью вакуум-аспиратора Storzultimare 30, скорость аспирации 70л/мин, в стерильную накопительную емкость для трахеобронхиальной санации. Далее образцы доставляют при комнатной температуре в лабораторию и в течение одного часа производят отбор материала для исследования, при этом 3 мл смыва переносят в две пробирки типа «эпплендорф», по 1,5 мл в каждую. Производят центрифугирование 13000g. в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее осадок переносят в стеклянную виалу, добавляют 200 мкл ацетона, высушивают в сухожаровом шкафу или термостате при 80°С.The material is collected from the bronchi using the minilavage method. A 0.9% NaCl solution with a volume of 40 ml, heated to 37°C, is introduced into the bronchial lumen through the channel of the Pentax-1970K video bronchoscope. Then, bronchial contents are collected through the aspiration channel of the bronchoscope using a Storzultimare 30 vacuum aspirator, aspiration rate of 70 l/min, into a sterile storage container for tracheobronchial sanitation. Then the samples are delivered to the laboratory at room temperature and within one hour the material for the study is collected, while 3 ml of the wash is transferred into two Epplendorf tubes, 1.5 ml in each. Centrifugation is performed at 13000 g for 15 minutes at room temperature. Next, the sediment is transferred into a glass vial, 200 µl of acetone is added, and it is dried in a dry-heat oven or thermostat at 80°C.

Заявляемый способ подготовки образцов бронхоальвеолярных смывов для исследования методом масс-спектрометрии микробных маркеров отличается простотой исполнения, возможностью накапливать образцы до отправки при комнатной температуре и транспортировки без соблюдения временных ограничений и температурных условий. Количество и качество материала достаточно для исследования методом Масс-спектрометрии микробных маркеров.The claimed method of preparing bronchoalveolar lavage samples for mass spectrometry of microbial markers is characterized by simplicity of execution, the ability to accumulate samples before sending at room temperature and transportation without observing time restrictions and temperature conditions. The quantity and quality of the material is sufficient for mass spectrometry of microbial markers.

Клинический пример.Clinical example.

Пациент Ю.Patient Y.

Диагноз: Фиброзно-кавернозный туберкулез верхних долей обоих легких в фазе инфильтрации и двустороннего обсеменения (формирование множественных каверн). МБТ (+). МЛУ (H,R,S,E).Diagnosis: Fibro-cavernous tuberculosis of the upper lobes of both lungs in the phase of infiltration and bilateral seeding (formation of multiple cavities). MBT (+). MDR (H, R, S, E).

Бронхоальвеолярный смыв получен из верхнедолевого бронха справа, проведена пробоподготовка образца по заявляемому способу.Bronchoalveolar lavage was obtained from the upper lobe bronchus on the right; sample preparation was performed according to the claimed method.

До отправки в лабораторию проба хранилась в НИИФ Екатеринбург при комнатной температуре 14 дней. Затем была направлена для исследования методом МСММ в лабораторию, г. Москва. Результаты исследования представлены на фиг.2, 3.Before sending to the laboratory, the sample was stored at the Research Institute of Physiology and Microbiology in Yekaterinburg at room temperature for 14 days. Then it was sent for examination by the MSMM method to the laboratory in Moscow. The results of the examination are presented in Figs. 2, 3.

Claims

A method for preparing bronchoalveolar lavage samples for mass spectrometry of microbial markers, comprising introducing 40 ml of a 0.9% NaCl solution heated to 37°C through a video bronchoscope channel into the bronchial lumen, then collecting bronchial contents through the bronchoscope aspiration channel into a sterile storage container using a vacuum aspirator, the aspiration rate is 70 l/min, characterized in that the bronchial contents samples are delivered to the laboratory at room temperature and within one hour the material for the study is collected, while 3 ml of the lavage is transferred into two Epplendorf tubes, 1.5 ml in each, centrifuged at 13,000 g for 15 minutes at room temperature, then the sediment is transferred to a glass vial, 200 μl of acetone is added, dried in a dry-heat oven or thermostat at 80°С.