RU2841373C1

RU2841373C1 - Method of producing modified polyelectrolyte complex for delivery of biologically active substances

Info

Publication number: RU2841373C1
Application number: RU2024134485A
Authority: RU
Inventors: Виктор Семенович Болдуев
Original assignee: Виктор Семенович Болдуев
Filing date: 2024-11-18
Publication date: 2025-06-06

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to chemistry and specifically to a method of producing a polyelectrolyte complex for delivering biologically active substances. Proposed method enables to obtain a modified low-molecular alginate with a molecular weight of 70 kDa by controlled dry thermal oxidation of sodium alginate with ozone at temperature of 80 °C for 5-10 minutes and then in an aqueous solution with pH from 2.0 to 5.0, the resulting modified low molecular weight alginate and poly-L-lysine hydrochloride are mixed at ratio of 2:1 or 1:1, respectively.

EFFECT: invention provides controlled reduction of molecular weight of alginate to 70 kDa and formation of a stable and biocompatible polyelectrolyte complex suitable for encapsulation and delivery of biologically active substances.

1 cl, 13 dwg, 2 tbl, 5 ex

Description

Область техникиField of technology

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения модифицированного полиэлектролитного комплекса (полиплекса), на основе анионного низкомолекулярного Альгината (LMWSA) и катионного L- Лизина Гидрохлорида (L-Lysine HCl).The invention relates to the field of polymer chemistry, biochemistry and medicine, namely to a method for producing a modified polyelectrolyte complex (polyplex) based on anionic low molecular weight alginate (LMWSA) and cationic L-Lysine hydrochloride (L-Lysine HCl).

Уровень техникиState of the art

Существуют различные методы получения полиэлектролитных комплексов, однако существующие технологии часто имеют ограничения по стабильности, биоактивности и возможности применения в различных областяхThere are various methods for obtaining polyelectrolyte complexes, but existing technologies often have limitations in stability, bioactivity and the possibility of application in various fields.

Альгинат натрия, линейный гетерополисахарид, содержащийся в клеточных стенках бурых водорослей и выделяемый некоторыми видами бактерий (Formo, Aarstad, Skjåk-Bræk, & Strand, 2014), широко используется в фармацевтической и пищевой промышленности благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, а также полезным эффектам для здоровья (Lee & Mooney, 2012; Liu et al., 2019; Pawar & Edgar, 2012). Однако его потенциальное применение в определенной степени ограничено из-за низкой растворимости в воде и высокой вязкости раствора, когда требуются высокие концентрации (Liu et al., 2019). Кроме того, было обнаружено, что функциональные свойства альгината натрия сильно коррелируют не только с его химической структурой, но и с его молекулярной массой и соотношением M/G (Liu et al., 2019; Schürks, Wingender, Flemming, & Mayer, 2002).Sodium alginate, a linear heteropolysaccharide found in the cell walls of brown algae and secreted by some bacterial species (Formo, Aarstad, Skjåk-Bræk, & Strand, 2014), is widely used in the pharmaceutical and food industries due to its unique physicochemical properties and health benefits (Lee & Mooney, 2012; Liu et al., 2019; Pawar & Edgar, 2012). However, its potential applications are somewhat limited due to its low water solubility and high solution viscosity when high concentrations are required (Liu et al., 2019). Furthermore, it was found that the functional properties of sodium alginate are strongly correlated not only with its chemical structure but also with its molecular weight and M/G ratio (Liu et al., 2019; Schürks, Wingender, Flemming, & Mayer, 2002).

Химические структуры G-блока, М-блока, чередующегося G и M-блока, присутствующего в молекулах альгината можно посмотреть на фигуре 11.The chemical structures of the G-block, M-block, and alternating G and M-block present in alginate molecules can be seen in Figure 11.

Молекулярная масса различных сортов альгинатов колеблется от 32 000 до 400 000 г/м, что зависит от ресурсов. Молекулярная масса альгината является важным параметром, который следует учитывать при выборе подходящего альгината для конкретного использования. Помимо проблем с растворимостью и вязкостью, низкомолекулярный альгинат натрия (LMWSA) и альгинатные олигомеры обладают более важными физико-химическими и биологическими свойствами, чем высокомолекулярный альгинат натрия (HMWSA). Например, LMWSA с низким соотношением M/G лучше подходит для защиты пробиотиков от жестких условий пищеварения, чем HMWSA с высоким соотношением M/G (Ramos et al., 2018). Сообщалось, что альгинатные олигомеры, полученные путем ферментативной деполимеризации, способствуют росту бифидобактерий и растений, в то время как исходные альгинаты до деполимеризации не оказывают такого действия (Akiyama et al., 1992; Tomoda, Umemura, & Adachi, 1994; Yonemoto et al., 1993).The molecular weight of different grades of alginates ranges from 32,000 to 400,000 g/m3, depending on the resources. The molecular weight of alginate is an important parameter to consider when selecting a suitable alginate for a specific application. In addition to solubility and viscosity issues, low molecular weight sodium alginate (LMWSA) and alginate oligomers have more important physicochemical and biological properties than high molecular weight sodium alginate (HMWSA). For example, LMWSA with a low M/G ratio is better suited to protect probiotics from harsh digestive conditions than HMWSA with a high M/G ratio (Ramos et al., 2018). It has been reported that alginate oligomers obtained by enzymatic depolymerization promote the growth of bifidobacteria and plants, whereas the original alginates before depolymerization do not have such an effect (Akiyama et al., 1992; Tomoda, Umemura, & Adachi, 1994; Yonemoto et al., 1993).

Гидрогели, сформированные из частично окисленного альгината с низкой молекулярной массой (255 кДа), могут быть использованы для значительного улучшения формирования хрящеподобной ткани in vivo по сравнению с гидрогелями, сформированными из HMWSA (390 кДа) (Bouhadir et al., 2001). Радикальная поглощающая активность LMWSA выше, чем у HMWSA (Falkeborg et al., 2014). Интересно, что олигомеры альгината, полученные путем деполимеризации альгинат-лиазой, эффективно усиливают индуцирующую активность фактора некроза опухоли-α по сравнению с исходным альгинатом (Kurachi et al., 2005). Было обнаружено, что ферментативно деполимеризованные олигомеры альгината эффективно индуцируют выработку цитотоксических цитокинов в лейкемических клетках периферической крови человека U937, хотя исходный альгинат такой активностью не обладал (Iwamoto, Xu, Tamura, Oda, & Muramatsu, 2003).Hydrogels formed from partially oxidized low molecular weight alginate (255 kDa) can be used to significantly improve the formation of cartilage-like tissue in vivo compared to hydrogels formed from HMWSA (390 kDa) (Bouhadir et al., 2001). The radical scavenging activity of LMWSA is higher than that of HMWSA (Falkeborg et al., 2014). Interestingly, alginate oligomers obtained by depolymerization with alginate lyase effectively enhance the tumor necrosis factor-α inducing activity compared to the parent alginate (Kurachi et al., 2005). Enzymatically depolymerized alginate oligomers were found to effectively induce cytotoxic cytokine production in human peripheral blood leukemia cells U937, although the parent alginate did not have this activity (Iwamoto, Xu, Tamura, Oda, & Muramatsu, 2003).

Альгинат олигосахаридов обладает иммуномодулирующим действием и может быть полезен в качестве функционального пищевого материала (Kuda et al., 2017). Альгинатные олигосахариды являются мощным растительным элиситором и могут смягчать повреждения растений, вызванные абиотическими стрессами, такими как засуха, высокая соль и тяжелые металлы (Liu et al., 2013). Олигосахариды альгината могут ингибировать послеуборочную гниль и продлевать качество плодов, подавляя деградацию клеточной стенки и вызывая действие антиоксидантов (Liu, Ken- nedy, Zhang, Heng, & Wu, 2020). Деградированный альгинат натрия также может способствовать росту корней растений (Hien et al., 2000; Natsume, Kamo, Hir- ayama, & Adachi, 1994; Zhang et al., 2013).Alginate oligosaccharides have immunomodulatory effects and may be useful as a functional food material (Kuda et al., 2017). Alginate oligosaccharides are a potent plant elicitor and can mitigate plant damage caused by abiotic stresses such as drought, high salt, and heavy metals (Liu et al., 2013). Alginate oligosaccharides can inhibit postharvest rot and prolong fruit quality by suppressing cell wall degradation and inducing antioxidant effects (Liu, Kennedy, Zhang, Heng, & Wu, 2020). Degraded sodium alginate can also promote plant root growth (Hien et al., 2000; Natsume, Kamo, Hirayama, & Adachi, 1994; Zhang et al., 2013).

Интересные физико-химические и биологические свойства, которыми обладают LMWSA и альгинатные олигомеры, могут быть обусловлены фундаментальными структурами и свойствами их собственных молекул. LMWSA имеет малый молекулярный объем и быструю молекулярную подвижность по сравнению с HMWSA. Это позволяет LMWSA легче проникать в биологические ткани, чем HMWSA. LMWSA легче поглощается, переваривается и утилизируется организмами, чем HMWSA. По сравнению с LMWSA, HMWSA имеет сложную пространственную структуру молекулярной цепи. Таким образом, многие активные участки HMWSA легко закрываются и трудно полностью раскрываются, по сравнению с LMWSAThe interesting physicochemical and biological properties that LMWSA and alginate oligomers possess may be due to the fundamental structures and properties of their own molecules. LMWSA has a small molecular volume and fast molecular mobility compared to HMWSA. This allows LMWSA to penetrate biological tissues more easily than HMWSA. LMWSA is more easily absorbed, digested and utilized by organisms than HMWSA. Compared to LMWSA, HMWSA has a complex spatial structure of the molecular chain. Thus, many active sites of HMWSA are easily closed and difficult to fully open, compared to LMWSA.

Для получения LMWSA и альгинатных олигомеров используется множество методов, включая ферментативный процесс (Belik, Silchenko, Kusaykin, Zvyagintseva, & Ermakova, 2018; Kim, Lee, & Lee, 2011; Murata, Inose, Hisano, Abe, & Imanaka, 1993), химический подход (Gomez, Rinaudo, & Villar, 2007; Ikeda, Takemura, & Ono, 2000; Kristiansen, Tomren, & Christensen, 2011; Li et al., 2010; Yang, Li, & Guan, 2004), и физический метод (Aida, Yamagata, Watanabe, & Smith, 2010; Burana-osot et al., 2009; Dodero, Vicini, & Castellano, 2020; Lee et al., 2003; Nagasawa, Mitomo, Yoshii, & Kume, 2000; Watthanaphanit & Saito, 2013), были использованы для деградации альгината натрия. Однако некоторые методы, используемые для деградации альгината натрия, могут в определенной степени приводить к изменению химической структуры деградированного альгината натрия (Li et al., 2010; Zhou et al., 2017). После деградации альгината натрия наблюдалось изменение его цвета (Lee et al., 2003; Nagasawa et al., 2000; Watthanaphanit & Saito, 2013). Также было обнаружено, что соотношение M/G изменяется при деградации альгината натрия под действием гамма-облучения (Lee et al., 2003).Many methods have been used to prepare LMWSA and alginate oligomers, including enzymatic process (Belik, Silchenko, Kusaykin, Zvyagintseva, & Ermakova, 2018; Kim, Lee, & Lee, 2011; Murata, Inose, Hisano, Abe, & Imanaka, 1993), chemical approach (Gomez, Rinaudo, & Villar, 2007; Ikeda, Takemura, & Ono, 2000; Kristiansen, Tomren, & Christensen, 2011; Li et al., 2010; Yang, Li, & Guan, 2004), and physical method (Aida, Yamagata, Watanabe, & Smith, 2010; Burana-osot et al., 2009; Dodero, Vicini, & Castellano, 2020; Lee et al., 2003; Nagasawa, Mitomo, Yoshii, & Kume, 2000; Watthanaphanit & Saito, 2013) have been used to degrade sodium alginate. However, some methods used to degrade sodium alginate may change the chemical structure of the degraded sodium alginate to a certain extent (Li et al., 2010; Zhou et al., 2017). Color change was observed after the degradation of sodium alginate (Lee et al., 2003; Nagasawa et al., 2000; Watthanaphanit & Saito, 2013). The M/G ratio was also found to change during the degradation of sodium alginate by gamma irradiation (Lee et al., 2003).

Хотя деградация альгината натрия различными методами, упомянутыми выше, уже изучалась, исследований по получению LMWSA с помощью озонирования относительно мало. Было обнаружено, что низкомолекулярный альгинат натрия (LMWSA) может быть получен в результате деградации альгината натрия, вызванной озонированием в водном растворе. Так например в US20190345184 by Zhongping Xiao et.al. “Method of degrading polysaccharide using ozone” by GREEN VALLEY (SHANGHAI) PHARMACEUTICALS CO., LTD. Озонирование полисахарида происходит в 20% водном растворе в течении 3-4 часов, предпочтительно в присутствии катализаторов (основания, УФ, пероксиды, ионы металлов), температура поддерживается в диапазоне 20-50С, с концентрацией озона до 10 г в час, степень деградации предпочтительно до 5 кДа, “Ozonolytic depolymerization of polysaccharides in aqueous solution” by Ying Wang et.al где описывается «одноэтапный» метод, при котором полисахариды, растворенные в воде или основных растворах, де-полимеризуются путем озонолиза. WO/1997/032903 by Kesselmans, Ronald et.al. “Method of oxidizing polysaccharides using ozone in the presence of halogenide-containing catalyst” by COÖPERATIEVE VERKOOP (NL) Согласно вышеупомянутому способу, полисахарид окисляется в водной суспензии, и после реакции водную фазу с катализатором можно отделить от продукта реакции простым и известным способом и вернуть в цикл. Концентрация полисахарида в реакционной смеси может варьироваться (в пересчёте на сухое вещество) и предпочтительно составляет от 10 до 40%., в качестве катализатора используются соединения йода.Although the degradation of sodium alginate by various methods mentioned above has been studied, there are relatively few studies on the preparation of LMWSA by ozonation. It has been found that low molecular weight sodium alginate (LMWSA) can be obtained by the degradation of sodium alginate induced by ozonation in aqueous solution. For example, in US20190345184 by Zhongping Xiao et.al. “Method of degrading polysaccharide using ozone” by GREEN VALLEY (SHANGHAI) PHARMACEUTICALS CO., LTD. Ozonation of the polysaccharide occurs in a 20% aqueous solution for 3-4 hours, preferably in the presence of catalysts (bases, UV, peroxides, metal ions), the temperature is maintained in the range of 20-50C, with an ozone concentration of up to 10 g per hour, the degree of degradation is preferably up to 5 kDa, “Ozonolytic depolymerization of polysaccharides in aqueous solution” by Ying Wang et.al, which describes a “one-step” method in which polysaccharides dissolved in water or basic solutions are depolymerized by ozonolysis. WO/1997/032903 by Kesselmans, Ronald et.al. “Method of oxidizing polysaccharides using ozone in the presence of halogenide-containing catalyst” by COÖPERATIEVE VERKOOP (NL) According to the above-mentioned method, the polysaccharide is oxidized in an aqueous suspension, and after the reaction, the aqueous phase with the catalyst can be separated from the reaction product in a simple and known manner and returned to the cycle. The concentration of the polysaccharide in the reaction mixture can vary (based on dry matter) and is preferably from 10 to 40%. Iodine compounds are used as a catalyst.

Процессы описанные в этих работах достаточно сложны и не экологичны для производственных процессов и носят в основном лабораторный характер. До сих пор было мало известно о вызванном озонированием изменении молекулярной массы и молекулярно-массового распределения альгината натрия. Имеется мало информации об изменении цвета и соотношения M/G LMWSA, полученного озонированием. До сих пор неизвестно, происходят ли изменения в химической структуре LMWSA, полученного в результате озонирования.The processes described in these papers are quite complex and not environmentally friendly for industrial processes and are mainly of laboratory nature. Until now, little has been known about the change in molecular weight and molecular weight distribution of sodium alginate caused by ozonation. Little information is available on the change in color and M/G ratio of LMWSA obtained by ozonation. It is still unknown whether changes occur in the chemical structure of LMWSA obtained by ozonation.

Наиболее близкий процесс к настоящему изобретению на стадии озонирования полимеров продемонстрирован в патенте РФ № 2404997 С2, автор Болдуев В.С, ООО «ГРАФТ-ПОЛИМЕР» (RU), где газохимическую модификацию осуществляют при температуре не выше 30°С и при концентрации озона 5-15 мас.% с продувкой реакционно-способными газами, что подразумевает целый спектр газов, уже имеющихся в воздухе либо специально введенных в реакторв. Порошок полимера, находящийся в «псевдоожиженном» состоянии, в реакторе, работающем в режиме «сухой» газовой схемы озонируют в течении 10-30 мин, и где озон разлагается до кислорода в каталитическом деструкторе перед выхлопом в атмосферу. В результате модификации The closest process to the present invention at the stage of polymer ozonation is demonstrated in the Russian Federation patent No. 2404997 C2, author V.S. Bolduev, OOO GRAFT-POLYMER (RU), where gas-chemical modification is carried out at a temperature of no higher than 30°C and at an ozone concentration of 5-15 wt.% with purging with reactive gases, which implies a whole range of gases already present in the air or specially introduced into the reactor. The polymer powder, which is in a "pseudoequilibrated" state, is ozonized in a reactor operating in the "dry" gas circuit mode for 10-30 minutes, and where ozone decomposes to oxygen in a catalytic destructor before being exhausted into the atmosphere. As a result of the modification

на поверхности полимера образуются гидроксильные, карбоксильные, карбонильные и перекисные функциональные группы. Однако, в данном процессе нет упоминания о натуральных биополимерах (полисахаридах) - и в частности об альгинате или его производных. Также можно предположить что такой процесс (при температуре не выше 30С и времени 10-30 мин) будет не достаточно эффективен для промышленного получения низкомолекулярного полисахарида.hydroxyl, carboxyl, carbonyl and peroxide functional groups are formed on the polymer surface. However, this process does not mention natural biopolymers (polysaccharides) - and in particular alginate or its derivatives. It can also be assumed that such a process (at a temperature of no higher than 30C and a time of 10-30 min) will not be effective enough for industrial production of low-molecular polysaccharide.

Полиэлектролиты - это высокомолекулярные материалы, которые имеют несколько ионизируемых функциональных групп с разной молекулярной массой и химическим составом. Заряд на макромолекулах создается за счет частичной или полной диссоциации ПЭК в водных растворах. В растворе одновременно смешиваются противоположно заряженные полиэлектролиты с образованием ПЭК (фиг. 1). Электронейтральность полиэлектролитов в растворе поддерживается за счет нейтрализации заряда для повторяющейся единицы противоположным зарядом. Повторяющиеся единицы, например, положительно заряженные электролиты сопровождаются меньшими ионами отрицательного заряда.Polyelectrolytes are high-molecular materials that have several ionizable functional groups with different molecular weights and chemical compositions. The charge on the macromolecules is created by partial or complete dissociation of PEC in aqueous solutions. Oppositely charged polyelectrolytes are simultaneously mixed in the solution to form PEC (Fig. 1). The electroneutrality of polyelectrolytes in solution is maintained by neutralizing the charge for a repeating unit with an opposite charge. Repeating units, for example, positively charged electrolytes are accompanied by smaller ions of negative charge.

Частицы ПЭК образуются в результате нековалентных электростатических взаимодействий между различными поликатионами и полианионами. При смешивании противоположно заряженных полиэлектролитов в водной среде раствора в контролируемых условиях ионной силы, рН, концентрации полиэлектролитов, распределения ионных групп в зависимости от молекулярной массы полимеров и соотношения смешивания, плотная фаза отделяется от растворителя. Кроме того, порядок полиэлектролитической реакции также влияет на степень ионизации, что, в свою очередь, влияет на образование наночастиц. Комплексообразование полиэлектролитов происходит между противоположно заряженными частицами и называются соответственно (например, комплексы полиэлектролитных поверхностно-активных веществ, комплексы полиэлектролитных нуклеиновых кислот, ПЭК, полиэлектролитные лекарственные комплексы). Полиэлектролиты представляют собой интересный класс макромолекул, которые содержат диссоциированные ионные группы. Эти молекулы обладают макромолекулярными цепями и содержат высокие заряды, которые отвечают за их увлекательные бехавиоры. Различные классы полиэлектролитов в зависимости от их природы приведены в таблице 1. Как правило, при приготовлении ПЭК химические сшивающие агенты не используются (за исключением химически сшитых ПЭК), поэтому они нетоксичны, биосовместимы и хорошо переносятся. Они обладают многочисленными уникальными характеристиками, которые подходят в качестве идеальных фармацевтических вспомогательных веществ для контроля кинетики высвобождения лекарствPEC particles are formed by non-covalent electrostatic interactions between different polycations and polyanions. By mixing oppositely charged polyelectrolytes in an aqueous solution medium under controlled conditions of ionic strength, pH, polyelectrolyte concentration, ionic group distribution depending on the molecular weight of the polymers and the mixing ratio, the dense phase is separated from the solvent. In addition, the order of the polyelectrolytic reaction also affects the degree of ionization, which in turn affects the formation of nanoparticles. Complexation of polyelectrolytes occurs between oppositely charged particles and are named accordingly (e.g., polyelectrolyte surfactant complexes, polyelectrolyte nucleic acid complexes, PEC, polyelectrolyte drug complexes). Polyelectrolytes are an interesting class of macromolecules that contain dissociated ionic groups. These molecules possess macromolecular chains and contain high charges, which are responsible for their fascinating behaviors. The different classes of polyelectrolytes depending on their nature are listed in Table 1. Generally, chemical crosslinking agents are not used in the preparation of PECs (except for chemically crosslinked PECs), so they are non-toxic, biocompatible and well tolerated. They have numerous unique characteristics that make them ideal pharmaceutical excipients for controlling drug release kinetics.

Таблица 1. Некоторые полиэлектролиты и их ионная природаTable 1. Some polyelectrolytes and their ionic nature

Типы натуральных полиэлектролитовTypes of natural polyelectrolytes ПолианионыPolyanions ПоликатионыPolycations Нуклеиновые кислоты, поли(L-глутамикацида), полигалактуроновая кислота, каррагинан, натриималгинат, лоуметоксипектин, геллангум, стеркулиагум гумкондагогу, хондроитинсульфат и т. д.Nucleic acids, poly(L-glutamic acid), polygalacturonic acid, carrageenan, sodium malginate, lowmethoxypectin, gellanguic acid, sterculiagum gumcondagogu, chondroitin sulfate, etc. Хитозан, декстран, желатин, поли(L-лизин), лизоцим и т.д.Chitosan, dextran, gelatin, poly(L-lysine), lysozyme, etc.

Полилизин (PL) широко используется в кондитерских изделиях, хлебе, продуктах с низким содержанием сахара и калорий, а также в низкотемпературных мягких консервах, которые могут эффективно подавлять размножение термостойких спор, улучшать эффективность консервации и предотвращать появление запаха после стерилизации. Будучи катионным полимером, PL содержит большое количество аминных групп с хорошей биосовместимостью и биоразлагаемостью (Chen, Yu, & Li, 2017; Diamanti et al., 2016; Lu, Zou, Xu, & Li, 2018). PL может взаимодействовать с поливалентными анионами, образуя сшитые сложные системы, которые имеют перспективное применение при проектировании транспортных средств с контролируемым выбросом (Vernon, Gooden, Preisinger, & Gebe, 2018). L-лизин является разновидностью основной аминокислоты, содержащей одну карбоксильную и две аминогруппы. Известно, что карбоксил может соединяться с α или ε аминогруппой другого катионного гомополмера, а именно поли-L L-лизина, образуя -лизин. Этот вид катионного хомополимера может быть использован в качестве эмульгирующих или доставочных агентов, средств против ожирения, гидрогелей, биоразлагаемых материалов, пищевых консервантов и так далее (Jia et al., 2009; Li et al., 2019). Polylysine (PL) is widely used in confectionery, bread, low-sugar and low-calorie foods and low-temperature soft canned food, which can effectively inhibit the reproduction of heat-resistant spores, improve the preservation efficiency and prevent odor after sterilization. As a cationic polymer, PL contains a large number of amine groups with good biocompatibility and biodegradability (Chen, Yu, & Li, 2017; Diamanti et al., 2016; Lu, Zou, Xu, & Li, 2018). PL can interact with polyvalent anions to form cross-linked complex systems, which have promising applications in the design of emission-controlled vehicles (Vernon, Gooden, Preisinger, & Gebe, 2018). L-lysine is a kind of basic amino acid containing one carboxyl and two amino groups. It is known that carboxyl can combine with the α or ε amino group of another cationic homopolymer, namely poly-L L-lysine, to form -lysine. This kind of cationic homopolymer can be used as emulsifying or delivery agents, anti-obesity agents, hydrogels, biodegradable materials, food preservatives and so on (Jia et al., 2009; Li et al., 2019).

Lysine HСl, гидрохлорид L-лизина, L-лизин HСl, лизингидрохлорид Pharma Grade, лизиновый гидрохлорид показан на фигуре 13.Lysine HCl, L-lysine hydrochloride, L-lysine HCl, lysine hydrochloride Pharma Grade, lysine hydrochloride is shown in Figure 13.

Упомянутые сложные системы на самом деле представляют собой разновидность полиэлектролитного комплекса (ПЭК), который был впервые изготовлен методом самосборки Ямамото и его коллегами (Wasupalli & Verma, 2018). Полиэлектролитные комплексы обычно относятся к сложным системам, образующимся между противоположно заряженными материалами (например, полимер-полимер, полимер-лекарство и полимер-лекарство-полимер) в результате электростатического притяжения (Murakami & Takashima, 2003; Wasupalli & Verma, 2018). Благодаря своим превосходным свойствам, полиэлектролитные комплексы имеют потенциальное применение в защите окружающей.The mentioned complex systems are actually a kind of polyelectrolyte complex (PEC) , which was first fabricated by self-assembly by Yamamoto and co-workers (Wasupalli & Verma, 2018). Polyelectrolyte complexes generally refer to complex systems formed between oppositely charged materials (e.g., polymer–polymer, polymer–drug, and polymer–drug–polymer) as a result of electrostatic attraction (Murakami & Takashima, 2003; Wasupalli & Verma, 2018). Due to their excellent properties, polyelectrolyte complexes have potential applications in environmental protection.

Полиэлектролитные комплексы широко представлены в научной литературе и патентах. Так например в патенте РФ № 2445118 С2 Мустафин и др. «Способ получения носителя биологически активных соединений на основе интерполиэлектролитного комплекса.Polyelectrolyte complexes are widely represented in scientific literature and patents. For example, in the Russian Federation patent No. 2445118 C2 Mustafin et al. "Method for obtaining a carrier of biologically active compounds based on an interpolyelectrolyte complex.

Носитель получают путем смешения растворов сополимера катионного характера диметиламиноэтилметакрилата, бутилметакрилата и метилметакрилата в соотношении 2:1:1, доведенного до значения рН 2,0-7,0, и геля редкосшитой полиакриловой кислоты со значением рН 2,0-7,0, в качестве растворителей используют воду.The carrier is obtained by mixing solutions of a cationic copolymer of dimethylaminoethyl methacrylate, butyl methacrylate and methyl methacrylate in a ratio of 2:1:1, brought to a pH of 2.0-7.0, and a gel of rarely cross-linked polyacrylic acid with a pH of 2.0-7.0, using water as a solvent.

Патент РФ 2283848С1 Понеделькина и др. «Способ получения конъюгатов альгиновой кислоты» раскрывает способ получения конъюгатов альгиновой кислоты путем взаимодействия ее с аминосодержащими соединениями (RNH 2) в присутствии конденсирующего реагента.Russian Federation Patent 2283848C1 by Ponedelkina et al. “Method for Obtaining Alginic Acid Conjugates” discloses a method for obtaining alginic acid conjugates by reacting it with amino-containing compounds (RNH 2) in the presence of a condensing reagent.

Патент US 10,342,228 B2, van der Krieken et.al, “Polyelectrolyte Complexes for biocide enhancements “CERADIS B. V, Wageningen (NL). Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим биоцид и полиэлектролитный комплекс полианиона, такой электролитный комплекс полианиона, как лигносульфонат, и поликатион, такой как хитозан для доставки биоцидов.Patent US 10,342,228 B2, van der Krieken et.al, “Polyelectrolyte Complexes for biocide enhancements “CERADIS B. V, Wageningen (NL). The present invention relates to compositions containing a biocide and a polyelectrolyte complex of a polyanion, such an electrolyte complex of a polyanion as a lignosulfonate, and a polycation such as chitosan for the delivery of biocides.

Патент US 8435787B2 Tim Maguire et.al. Rutgers State University of New Jersey (USA) “Alginate polyelectrolyte encapsulation of embryonic stem cells” Изобретение направлено на использование альгинатной микрокапсуляции поли-L-лизина в контролируемой дифференцировке эмбриональных стволовых клеток. Patent US 8435787B2 Tim Maguire et.al. Rutgers State University of New Jersey (USA) “Alginate polyelectrolyte encapsulation of embryonic stem cells” The invention is aimed at using alginate microencapsulation of poly-L-lysine in the controlled differentiation of embryonic stem cells.

Можно привести примеры наиболее близких исследований к тематике настоящего изобретения, такие как: “Antibacterial dialdehyde sodium alginate/ ε -polylysine microspheres for fruit preservation” Liming Ge et.al. В данном исследовании были разработаны антибактериальные диальдегидные альгинатные микросферы натрия/ε-полилизиновые микросферы (DSA-PL MPs) для эффективного продления срока хранения фруктов. DSA были получены путём пероксидного окисления альгината натрия. Затем PL был присоединен к основе DSA с помощью реакции Шиффа для синтеза конъюгатов DSA-PL, после чего последовали эмульгирование и сшивание ионами Ca²⁺ для получения DSA-PL МПА. Результаты показывают, что DSA-PL МПА представляют собой гладкие сферические частицы с относительно узким распределением по размерам и хорошей дисперсностью.The closest examples of the studies to the subject of the present invention are: “ Antibacterial dialdehyde sodium alginate/ ε -polylysine microspheres for fruit preservation” by Liming Ge et.al. In this study, antibacterial dialdehyde sodium alginate microspheres/ε-polylysine microspheres (DSA-PL MPs) were developed for effectively extending the shelf life of fruits. DSA was obtained by peroxidation of sodium alginate. Then, PL was attached to the DSA backbone by the Schiff reaction to synthesize DSA-PL conjugates, followed by emulsification and cross-linking with Ca ²⁺ ions to obtain DSA-PL MPA. The results show that the DSA-PL MPA are smooth spherical particles with a relatively narrow size distribution and good dispersibility.

“Lysine-Sodium Alginate Conjugates as controlled drug delivery vehicle for 5-fluoracil nanoparticle system” Ruchi Gaikwad et al. Department of Pharmaceutical Technology, India Настоящее исследование было посвящено получению наночастиц методом контролируемой гелеобразования для модельного противоракового препарата 5-фторурацила. Препараты были приготовлены с использованием биосовместимого конъюгата (окисленного периодатом альгинат натрия, конъюгированный с лизином). Этот комплекс был безопасен и готовился по мягкой и простой процедуре реакции. Конъюгат хорошо диспергируется в воде, а наночастицы альгината натрия, закрепленные L-лизином, демонстрируют контролируемое высвобождение модельного препарата. Различные количества метапериодата натрия, растворенного в 100 мл дистиллированной воды, и перемешивали магнитом в темноте при 25°C в течение 6 ч. Затем раствор диализовали в дистиллированной воде (2,5 л) с различными изменениями воды до полного освобождения от периодата (48 ч). “Lysine-Sodium Alginate Conjugates as controlled drug delivery vehicle for 5-fluoracil nanoparticle system” Ruchi Gaikwad et al. Department of Pharmaceutical Technology, India The present study was devoted to preparation of nanoparticles by controlled gelation method for a model anticancer drug 5-fluorouracil. The drugs were prepared using a biocompatible conjugate (periodate-oxidized sodium alginate conjugated with lysine). This complex was safe and was prepared by a mild and simple reaction procedure. The conjugate was well dispersible in water and sodium alginate nanoparticles anchored with L-lysine demonstrated controlled release of the model drug. Different amounts of sodium metaperiodate were dissolved in 100 ml of distilled water and stirred with a magnet in the dark at 25°C for 6 h. The solution was then dialyzed in distilled water (2.5 l) with different changes of water until completely free of periodate (48 h).

Очевидно, что все упомянутые выше методы, имеют серьезные недостатки, отмеченные выше и относящиеся прежде всего к способом модификации (окисления) полисахаридов.It is obvious that all the above mentioned methods have serious shortcomings, noted above and related primarily to the method of modification (oxidation) of polysaccharides.

Суть изобретенияThe essence of the invention

Целью настоящего изобретения является разработка нового способа получения модифицированного полиэлектролитного комплекса, обладающего с улучшенными характеристиками стабильности и биосовместимости для широкого применения в биохимии и медицине - для доставки БАВ, а также в пищевой отрасли - для сохранности продуктов при хранении. При создании данного изобретения ставилась задача разработать экономически эффективный и экологически чистый промышленный способ по модификации поверхности полисахаридов ( в частности альгината натрия) реакционно-способными газами с последующим синтезом в водном растворе полиэлектролитного комплекса (ПЭК) Заявленное изобретение позволяет не только преодолеть все вышеупомянутые недостатки, присущие известным способам, но и впервые продемонстрировать уже коммерциализированный промышленный процесс. Технический результат достигается за счет инновационной промышленной технологической схемы и параметров процесса газохимической модификации и синтеза ПЭК. При этом удалось повысить безопасность и экологичность процесса, значительно расширить спектр применяемых используемых для доставки биологически активных веществ (БАВ).The objective of the present invention is to develop a new method for obtaining a modified polyelectrolyte complex with improved stability and biocompatibility characteristics for wide application in biochemistry and medicine - for delivery of biologically active substances, as well as in the food industry - for preservation of products during storage. When creating this invention, the task was to develop a cost-effective and environmentally friendly industrial method for modifying the surface of polysaccharides (in particular, sodium alginate) with reactive gases followed by synthesis in an aqueous solution of a polyelectrolyte complex (PEC). The claimed invention allows not only to overcome all the above-mentioned disadvantages inherent in the known methods, but also to demonstrate for the first time an already commercialized industrial process. The technical result is achieved due to an innovative industrial process flow chart and process parameters for gas-chemical modification and synthesis of PEC. At the same time, it was possible to increase the safety and environmental friendliness of the process, significantly expand the range of biologically active substances (BAS) used for delivery.

Технический результат достигается тем, что в способе получения полиэлектролитного комплекса на основе Альгината натрия и Лизина, используется предварительная модификация полисахарида (альгината) методом «сухого» термического озонирования озоновоздушной смесью газов. Низкомолекулярный альгинат натрия (LMWSA) с молекулярной массой до 70 кДа,, получают контролируемым газо-термическим окислением с помощью озона при температуре до 80°, продолжительностью до 10 минут, а полиэлектролитный комплекс (ПЭК) синтезируют в водном растворе электростатическим взаимодействием вышеупомянутых компонентов в соотношении 2:1 или 1:2 и значений pH 2,0-5,0, по водородным связям и реакции Шиффа.The technical result is achieved by the fact that in the method for obtaining a polyelectrolyte complex based on sodium alginate and lysine, preliminary modification of the polysaccharide (alginate) is used by the method of "dry" thermal ozonation with an ozone-air mixture of gases. Low-molecular sodium alginate (LMWSA) with a molecular weight of up to 70 kDa is obtained by controlled gas-thermal oxidation using ozone at a temperature of up to 80°, for up to 10 minutes, and the polyelectrolyte complex (PEC) is synthesized in an aqueous solution by electrostatic interaction of the above-mentioned components in a ratio of 2:1 or 1:2 and pH values of 2.0-5.0, by hydrogen bonds and the Schiff reaction.

Описание изобретенияDescription of the invention

Способ получения модифицированного полиэлектролитного комплекса включает следующие этапы:The method for obtaining a modified polyelectrolyte complex includes the following steps:

1. Получение модифицированного низкомолекулярного альгината1. Obtaining modified low molecular weight alginate

Получают анионный низкомолекулярный альгинат (LMWSA) с молекулярной массой от 200 до 70 кДа.Anionic low molecular weight alginate (LMWSA) with a molecular weight of 200 to 70 kDa is obtained.

Альгинат получают контролируемым термическим окислением с помощью озона в сухом виде при температуре до 80°C в течение 5-10 минут. Этот процесс позволяет достичь необходимых физико-химических свойств альгината.Alginate is obtained by controlled thermal oxidation using ozone in dry form at a temperature of up to 80°C for 5-10 minutes. This process allows achieving the necessary physical and chemical properties of alginate.

2. Формирование полиэлектролитного комплекса2. Formation of a polyelectrolyte complex

К полученному низкомолекулярному альгиновому натрию добавляется катионный L-лизин гидрохлорид (L-Lysine HCl) в соотношении 2:1 или 1:2.Cationic L-lysine hydrochloride (L-Lysine HCl) is added to the obtained low molecular weight sodium alginate in a ratio of 2:1 or 1:2.

Процесс проводится в водном растворе при значениях pH от 2,0 до 5,0.The process is carried out in an aqueous solution at pH values from 2.0 to 5.0.

Полиэлектролитный комплекс образуется за счет электростатического взаимодействия между анионными и катионными компонентами по водородным связям и реакции Шиффа.The polyelectrolyte complex is formed due to electrostatic interaction between anionic and cationic components via hydrogen bonds and the Schiff reaction.

Химический механизм газовой модификации.Chemical mechanism of gas modification.

Одним из наиболее перспективных и современных методов модификации поверхности полимеров является модификация реактивными газами, которая позволяет изменить свойства поверхностей этих материалов в широких пределах и значительно расширить области их использования. Под термином «реактивные газы» подразумевают совокупность химически активных и естественной смеси газов воздуха, так или иначе принимающих участие в химических реакциях в процессе модификации. В качестве химически активных, как правило, используют известные газы-окислители: хлор, фтор, озон. К естественной смеси относится целый спектр газов, как уже присутствующих в атмосферном воздухе (азот, водород, кислород, окислы углерода), так и специально введенных в реактивную газовую среду (азот, аммиак, газообразные прекурсоры). Например, газообразные прекурсоры на основе аминов получаются при введении в реактор при соответствующей температуре мономеров: триметиламин, пропиламин, пиперидин, этаноламин, этилендиамин т.п.).One of the most promising and modern methods of modifying the surface of polymers is modification with reactive gases, which allows changing the properties of the surfaces of these materials in a wide range and significantly expanding the areas of their use. The term "reactive gases" refers to a set of chemically active and natural mixtures of air gases, which in one way or another participate in chemical reactions during the modification process. As chemically active, known oxidizing gases are usually used: chlorine, fluorine, ozone. The natural mixture includes a whole range of gases, both those already present in the atmospheric air (nitrogen, hydrogen, oxygen, carbon oxides) and those specially introduced into the reactive gas environment (nitrogen, ammonia, gaseous precursors). For example, gaseous precursors based on amines are obtained by introducing monomers into the reactor at the appropriate temperature: trimethylamine, propylamine, piperidine, ethanolamine, ethylenediamine, etc.).

Химический механизм газовой модификации показан на фигуре 12. The chemical mechanism of gas modification is shown in Figure 12.

В процессе газохимической наномодификации на поверхности полимера возникают функциональные полярные химически активные группы: гидроксильные, карбоксильные, карбонильные, перекисные, аминные и т. д. (набор и химическая природа групп определяется спектром газов занятых в реакции) Химически активные функциональные группы образованные на поверхности полимера (размерами 20-50нм) позволяют провести практически любую реакцию присоединения (со-полимеризации) а перекисные и нитро-радикалы осуществляют химическую сшивку (cross-linking) с образованием ковалентных и водородных связей. (Фиг. 4) In the process of gas-chemical nanomodification, functional polar chemically active groups arise on the polymer surface: hydroxyl, carboxyl, carbonyl, peroxide, amine, etc. (the set and chemical nature of the groups is determined by the spectrum of gases involved in the reaction). Chemically active functional groups formed on the polymer surface (20-50 nm in size) allow for virtually any addition reaction (co-polymerization), while peroxide and nitro radicals perform chemical cross-linking with the formation of covalent and hydrogen bonds. (Fig. 4)

Особенностью нанотехнологии газохимической модификации и графтинга (химической прививки полимерных цепей к поверхности материала) является широкое использование процессов самоорганизации, самосборки и поверхностно-инициируемого синтеза, которые могут в сложно организованной системе привести к формированию необходимых упорядоченных структур (наноструктур), проявляющих требуемые практически важные (функциональные) свойства. A special feature of the nanotechnology of gas-chemical modification and grafting (chemical grafting of polymer chains to the surface of a material) is the wide use of self-organization, self-assembly and surface-initiated synthesis processes, which can lead to the formation of the necessary ordered structures (nanostructures) in a complexly organized system, exhibiting the required practically important (functional) properties.

Основные принципы являющихся «краеугольными камнями» технологии термической газо-модификации являются:The basic principles that are the “cornerstones” of thermal gas modification technology are:

1) Поверхностная модификация полимера реакционно-способными газами для создания химически активных функциональных групп (так называемых «графтовых сайтов»);1) Surface modification of the polymer with reactive gases to create chemically active functional groups (so-called “graft sites”);

2) Иммобилизация инициатора полимеризации на поверхности предварительно модифицированного полимера по методу «grafting to» или SAM (self-assembled monolayer) 3) Поверхностно -инициированная полимеризация (SIP -surface initiated polymerization) по методу «grafting from» c использованием методов контролируемой радикальной полимеризации ATRP, RAFT, NMP.2) Immobilization of the polymerization initiator on the surface of a pre-modified polymer using the “grafting to” or SAM (self-assembled monolayer) method; 3) Surface-initiated polymerization (SIP - surface initiated polymerization) using the “grafting from” method using the controlled radical polymerization methods ATRP, RAFT, NMP.

Термический ОзонолизThermal Ozonolysis

Температурный озонолиз приводит к образованию метастабильных (возбужденных)Temperature ozonolysis leads to the formation of metastable (excited)

атомов кислорода, в процессе декомпозиции ( разложения) которых происходит выделение энергии в количестве 102 500 калорий, в виде хемолюминисценции ( в голубом спектре) соответствующей длины волны 2780Аoxygen atoms, in the process of decomposition (decomposition) of which there is a release of energy in the amount of 102,500 calories, in the form of chemiluminescence (in the blue spectrum) of the corresponding wavelength of 2780 A

В случае введения в реакционную среду специальных газов, например: аммиака или его смесей с водородом или газовых аминных прекурсоров на поверхности возникают азотсодержащие группы (амино-, амидо-, имидо-, имино- и т.п.).In the case of introducing special gases into the reaction medium, for example: ammonia or its mixtures with hydrogen or gaseous amine precursors , nitrogen-containing groups (amino, amido, imido, imino, etc.) appear on the surface.

Преимущества изобретенияAdvantages of the invention

Полученные полиэлектролитные комплексы обладают уникальными свойствами, которые могут быть использованы для эффективной доставки биологически активных веществ.The obtained polyelectrolyte complexes have unique properties that can be used for the effective delivery of biologically active substances.

Изобретение также находит применение в пищевой промышленности для увеличения сроков хранения продуктов и улучшения их сохранности.The invention also finds application in the food industry to increase the shelf life of products and improve their preservation.

Сравнительный анализ с прототипом показывает, что заявленный способ отличается параметрами модификации («сухая схема», повышенная температура озонолиза, короткое время, экологичность процесса) и химической природой химически активных групп на поверхности модифицированного полисахарида (в частности альгината), то есть заявленное решение соответствует критерию «новизна». A comparative analysis with the prototype shows that the claimed method differs in modification parameters (“dry scheme”, increased ozonolysis temperature, short time, environmentally friendly process) and the chemical nature of chemically active groups on the surface of the modified polysaccharide (in particular alginate), that is, the claimed solution meets the “novelty” criterion.

Оно также соответствует критерию «изобретательский уровень», так как использование термического озонолиза для модификации полисахарида (в частности альгината) и формированию на его основе полиэлектролитного комплекса с аминокислотами (в частности с лизином) является неизвестным способом, который уже является промышленным процессом и впервые продемонстрирован в данном изобретении. It also meets the criterion of “ inventive step”, since the use of thermal ozonolysis for the modification of a polysaccharide (in particular alginate) and the formation of a polyelectrolyte complex with amino acids (in particular lysine) on its basis is an unknown method, which is already an industrial process and is demonstrated for the first time in this invention.

Изобретение может быть дополнено различными вариантами реализации, которые не выходят за рамки заявленного способа.The invention can be supplemented by various implementation options that do not go beyond the scope of the declared method.

Описание фигурDescription of figures

Фиг. 1. Принципиальная схема модифицированного полиэлектролитного комплекса (ПЭК).Fig. 1. Schematic diagram of the modified polyelectrolyte complex (PEC).

Фиг. 2. Принципиальная технологическая схема газовой модификации.Fig. 2. Basic technological diagram of gas modification.

Фиг. 3. Алгоритм газохимической модификации.Fig. 3. Algorithm of gas-chemical modification.

Фиг. 4. ИК-спектры: модифицированного альгина (красный цвет) и исходного альгината (синий цвет).Fig. 4. IR spectra: modified algin (red) and original alginate (blue).

Фиг. 5. Изменение усредненного весового молекулярного распределения, kDa.Fig. 5. Change in average molecular weight distribution, kDa.

Фиг. 6. Микрофотографии иллюстрируют процесс образования наноразмерных химически активных групп ( время озонирования альгината при 80 С) На снимках a) b) c) d) можно видеть изменение топографии поверхности в процессе газохимической модификации. (область сканирования : 2.5 μm x 2.5 μm), время модификации соответственно : одна минута (a); три минуты (b); пять минут (c); и десять минут (d). Нанометрическиеразмеры функциональных групп определяются примерно от 20 нмдо 70 нм.Fig. 6. Micrographs illustrate the process of formation of nanosized chemically active groups (time of ozonation of alginate at 80 C). In the pictures a) b) c) d) one can see the change in the surface topography during the gas-chemical modification. (scanning area: 2.5 μm x 2.5 μm), the modification time is respectively: one minute (a); three minutes (b); five minutes (c); and ten minutes (d). The nanometric sizes of the functional groups are determined from approximately 20 nm to 70 nm.

Фиг. 7. Топографические снимки (область сканирования: 1 μm x 1 μm), в динамическом методе, после 15 минут модификации перед (a) и после (b) отмывки образца. Размеры «капель» на снимках(a) и (и) 24 и 14 nm, соответственно.Fig. 7. Topographic images (scan area: 1 μm x 1 μm), in the dynamic method, after 15 minutes of modification before (a) and after (b) washing the sample. The sizes of the "droplets" in images (a) and (i) are 24 and 14 nm, respectively.

Фиг. 8. Морфологические изменения, вызванные деструкцией полимерных фибрилл и образование низкомолекулярных олигомерных соединений (функциональных групп) отчетливо видны с помощью AFM.Fig. 8. Morphological changes caused by the destruction of polymer fibrils and the formation of low-molecular oligomeric compounds (functional groups) are clearly visible using AFM.

Фиг. 9. Образование ПЭК, показано образование ПЭК после смешивания левого (соотношение PLL: Alg1:1) и правого (соотношение PLL:ALg2:1) с различной концентрацией NaBr(0,025 М, 0,05 М, 0,25 М и 0,05 М слева направо).Fig. 9. Formation of PEC, showing the formation of PEC after mixing left (PLL:Alg ratio 1:1) and right (PLL:ALg ratio 2:1) with different concentrations of NaBr (0.025 M, 0.05 M, 0.25 M and 0.05 M from left to right).

Фиг. 10. Сравнительное фото ПЭК. Fig. 10. Comparative photo of PEC.

A)1:1 PLL: Algнемодифицированный с 0.025 M NaBR; A)1:1 PLL: Alg unmodified with 0.025 M NaBR;

B) 1:1 PLL:Algмодифицированный комплекс с 0.25 M NaBr.B) 1:1 PLL:Alg modified complex with 0.25 M NaBr.

ПримерыExamples

Пример №1. Example No. 1. Получение модифицированного низкомолекулярного альгината натрияObtaining modified low molecular weight sodium alginate

В данном эксперименте использовался очищенный альгинат натрия (Mw 972,3 кДа, Mw/Mn 2,72 и M/ G 0,79). Газ озон был получен из газообразного кислорода (или воздушной смеси) с помощью генератора озона. Purified sodium alginate (Mw 972.3 kDa, Mw/Mn 2.72 and M/G 0.79) was used in this experiment. Ozone gas was generated from oxygen gas (or air mixture) using an ozone generator.

Комплекс оборудования и Принципиальная схема (Фиг 2) Equipment complex and Schematic diagram (Fig. 2)

а) Газоподготовка (Gas Preparation Cabinet) - в него входит : генератор озона, компрессор с холодильником, чиллер, осушитель воздуха, ресивер. Также предусмотрено оборудование для подачи и других газов (например N2, CO2 и др.) Производители : фирмы «Озония» ( Швейцария), «Атлас-Копко» ( Швеция). a) Gas Preparation Cabinet - includes: ozone generator, compressor with refrigerator, chiller, air dryer, receiver. Equipment for supplying other gases (for example, N2, CO2, etc.) is also provided. Manufacturers: Ozonia (Switzerland), Atlas-Copco (Sweden).

б) Реактор газохимической модификации и Реактор полимеризации (графтинга). b) Gas-chemical modification reactor and polymerization (grafting) reactor.

Реакторы представляют собой горизонтальные двухосные смесители ( усовершенствованный тип «Forberg»), с донной выгрузкой типа «bomb-discharge», с двойной рубашкой нагрева-охлаждения, внутреннее покрытие -PTFE. Позволяют сформировать качественный «псевдоожиженный» слой, не допуская агломерацию и обеспечивая равномерный нагрев и обработку материалов газами и реагентами (газообразными прекурсорами). Для реактора предусмотрена система жидкостной и порошковой дозации реагентов. Для реактора газохимической модификации предусмотрена газовая схема, с системой рекуперации выхлопа. The reactors are horizontal biaxial mixers (improved Forberg type), with bottom discharge of the bomb-discharge type, with a double heating-cooling jacket, internal coating - PTFE. They allow to form a high-quality "pseudoequilibrated" layer, preventing agglomeration and providing uniform heating and processing of materials with gases and reagents (gaseous precursors). The reactor is provided with a system of liquid and powder dosing of reagents. For the gas-chemical modification of the reactor, a gas scheme is provided with an exhaust recovery system.

По окончанию цикла модификации и графтинга ( в среднем 5-10 минут) модифицированный или привитой порошок проходит стадию конциционирования и охлаждения в специальном смесителе и загружается в бункер перед упаковкой материала. Все параметры процессов модификации и графтинга строго контролируются (PLC monitor). At the end of the modification and grafting cycle (5-10 minutes on average), the modified or grafted powder undergoes conditioning and cooling in a special mixer and is loaded into a bin before the material is packaged. All parameters of the modification and grafting processes are strictly controlled (PLC monitor).

Параметры процесса модификации зависят отThe parameters of the modification process depend on

площади поверхности порошка полимера, surface area of the polymer powder,

времени озонирования и ozonation time and

температуры, определены эмпирическим путем и отражены в Алгоритме газовой модификации (Фиг. 3).temperatures, determined empirically and reflected in the Gas Modification Algorithm (Fig. 3).

Пример №2.Example No. 2. Сравнительный анализ ИК-спектров образцов исходного и модифицированного Альгината натрияComparative analysis of IR spectra of samples of original and modified sodium alginate

На (Фиг. 6) показано наличие характеристической полосы карбоксильных групп (1726 см-1), количественное определение которых было определено методом химического титрования. В образце газохимически модифицированного альгината натрия имеется характеристическая полоса внеплоскостных деформационных колебаний С-Н (888см-1) при RR1С=СН2 - группе, однако интенсивность этой полосы в несколько раз меньше интенсивности такой полосы в образце исходного альгината натрия, поскольку при озонировании большинство винилиденовых групп расходуется в результате их взаимодействия с озоном. На Фиг. 6 приведены ИК-спектры модифицированных ПЭ с полной расшифровкой характерных полос (см-1 ): 719-721 - маятниковые колебания СН2-групп; 1302 - крутильные колебания СН2-групп ; 1375-7 - веерные колебания СН2-групп; 1466-8 - деформационные ножничные колебания СН2-групп 1645 - валентные колебания С=С групп 1726 - валентные колебания СOOH карбоксильных групп; 1898 - обертон маятниковых колебаний СН2-групп (731+1170) 2021 - обертон маятниковых и крутильных колебаний СН2-групп (720+1302) ; 2667 - обертон веерных и крутильных колебаний СН2-групп (1375+1302) ; 2846-50- симметричные валентные колебания С-Н СН2-групп ; 2904-18- асимметричные валентные колебания С-Н СН2 групп ; 3662 - валентные колебания О-Н гидроксильных групп. (Фиг 4)Figure 6 shows the presence of a characteristic band of carboxyl groups (1726 cm-1), the quantitative determination of which was determined by the chemical titration method. In the sample of gas-chemically modified sodium alginate there is a characteristic band of out-of-plane deformation vibrations of C-H (888 cm-1) at the RR1C=CH2 group, however, the intensity of this band is several times less than the intensity of such a band in the sample of the original sodium alginate, since during ozonation most of the vinylidene groups are consumed as a result of their interaction with ozone. Figure 6 shows the IR spectra of the modified PE with a complete decoding of the characteristic bands (cm-1): 719-721 - pendulum vibrations of CH2 groups; 1302 - torsional vibrations of CH2 groups; 1375-7 - fan vibrations of CH2 groups; 1466-8 - deformation scissor vibrations of CH2 groups 1645 - stretching vibrations of C=C groups 1726 - stretching vibrations of COOH carboxyl groups; 1898 - overtone of pendulum vibrations of CH2 groups (731+1170) 2021 - overtone of pendulum and torsional vibrations of CH2 groups (720+1302); 2667 - overtone of fan and torsional vibrations of CH2 groups (1375+1302); 2846-50 - symmetrical stretching vibrations of C-H CH2 groups; 2904-18 - asymmetric stretching vibrations of C-H CH2 groups; 3662 - stretching vibrations of O-H hydroxyl groups. (Fig. 4)

Пример №3.Example No. 3. Влияние озонирования на молекулярно-массовое распределениеThe effect of ozonation on molecular weight distribution

Молекулярно-массовое распределение (Mw/ Mn) образцов LMWSA, полученных озонированием, заметно изменилось по сравнению с исходным альгинатом натрия. Mw/Mn альгината натрия сначала увеличилось с 2,72 до 3,26 в начальный 10-минутный период озонирования, затем медленно уменьшилось с увеличением времени озонирования (10-50 мин), затем снова медленно выровнялось (50-70 мин) и, наконец, сошлось до 1,43. Изменение Mw/Mn образцов LMWSA может быть результатом гетерогенной реакции между озоном и цепочками молекул альгината натрия. (Фиг. 5).The molecular weight distribution (Mw/Mn) of the LMWSA samples obtained by ozonation changed remarkably compared with the original sodium alginate. The Mw/Mn of sodium alginate first increased from 2.72 to 3.26 during the initial 10 min ozonation period, then slowly decreased with the increase of ozonation time (10-50 min), then slowly leveled off again (50-70 min), and finally converged to 1.43. The change in Mw/Mn of the LMWSA samples may be due to the heterogeneous reaction between ozone and the sodium alginate molecule chains. (Fig. 5).

Пример №4.Example No. 4. Анализ морфологии поверхности модифицированного полисахарида ( альгината натрия) Analysis of surface morphology of modified polysaccharide (sodium alginate)

Используя метод атомно-силовой микроскопии (AFM) можно проанализировать изменения на нано уровне в морфологии поверхности и адгезии, являющихся следствиями процесса газохимической поверхностной модификации полимеров. (для наглядности и простоты измерений в качестве примера рассматривается газохимическая модификация порошка альгината, нанесенного на стеклянную подложку.Using the atomic force microscopy (AFM) method, it is possible to analyze changes at the nano level in surface morphology and adhesion, which are consequences of the process of gas-chemical surface modification of polymers. (For clarity and ease of measurements, gas-chemical modification of alginate powder applied to a glass substrate is considered as an example.

Для порошкообразных образцов рекомендуется использовать полуконтактный режим (tapping mode), который минимизирует деформацию образца и позволяет получить высокое разрешение. Для анализа поверхности использовался атомный силовой микроскоп (Explorer, TopoMetrix) Альгинат натрия обрабатывалась озоновоздушной смесью в реакторе-модификаторе при температуре 80°С, рабочем давлении газа-2,5 бара, производительности озонатора CFS-7 «Озония» 250 г О3/час, концентрации озона 9 мас.% в течение 15 минут. Для анализа морфологии поверхности использовалась контактная техника AFM, с областью сканирования: 2,5 μm × 2,5 μm : ( Фиг.6).For powder samples, it is recommended to use the tapping mode, which minimizes sample deformation and allows obtaining high resolution. An atomic force microscope (Explorer, TopoMetrix) was used for surface analysis. Sodium alginate was treated with an ozone-air mixture in a reactor-modifier at a temperature of 80°C, an operating gas pressure of 2.5 bar, a CFS-7 "Ozonia" ozonizer productivity of 250 g O3 /hour, an ozone concentration of 9 wt.% for 15 minutes. For surface morphology analysis, the AFM contact technique was used, with a scanning area of 2.5 μm × 2.5 μm: (Fig. 6).

В первую минуту процесса практически не видно морфологических изменений поверхности. Когда время модификации доходит до 3 минут, отчетливо видны «утолщения» и «узелки» на фибрилах альгината (b). Очевидно, что изменения в морфологии произошли из-за образования низкомолекулярных олигомерных соединений гидроксильных, карбоксильных, альдегидных, кетонных, перикисных и др. химически активных функциональных групп. Наличие этих групп установлены FTIR (Фиг.4). Причем, окисление поверхности приводит не только к образованию низкомолекулярных олигомеров но и разрыву поверхностных полимерных цепочек, причем никомолекулярные олигомерные соединения сосредотачиваются (агрегируются) на поверхности полимерных фибрилл и имеют большую поверхностную энергию, чем переферийные области полимера. Появление этих соединений в виде «капель» очень похоже внешне на росу на текстильной поверхности. Когда время модификации превышает 5 минут «узелковая» структура «теряется» и изменяется на «вытянутые капли» на фибриллах (с). Резонно предположить, что при увеличении времени модифицирования увеличивается количество низкомолекулярных олигомерных соединений. Снимки (b) и (c), показывают, что эти «капли « в основном имеют округлую морфологию, тогда как снимки (с) показывают уже «пролонгированные капли и ламеллы». При достижении времени модификации 15 минут, снимок (d), формирование и насыщенность «пролонгированных капель» усиливается и в дальнейшем ясно видна агрегация этих низкомолекулярных олигомеров, из-за различия в поверхностной энергии, в какой - то мере повторяющих структуру фибрилл исходного полимера. При дальнейшей модификации поверхности полимера очевидно, что наиболее тонкие фибриллы будут более чувствительны к воздействию реакционной среды, мы будем наблюдать их разрывы, подобно «напряженной и затем релаксирующей ленте», образование и рост на разорванных фибриллах низкомолекулярных олигомерных соединений. During the first minute of the process, practically no morphological changes in the surface are visible. When the modification time reaches 3 minutes, “thickenings” and “nodules” on the alginate fibrils (b) are clearly visible. Obviously, the changes in morphology occurred due to the formation of low-molecular oligomeric compounds of hydroxyl, carboxyl, aldehyde, ketone, peroxide and other chemically active functional groups. The presence of these groups was established by FTIR (Fig. 4). Moreover, surface oxidation leads not only to the formation of low-molecular oligomers but also to the rupture of surface polymer chains, and low-molecular oligomeric compounds are concentrated (aggregated) on the surface of polymer fibrils and have a higher surface energy than the peripheral areas of the polymer. The appearance of these compounds in the form of “droplets” is very similar in appearance to dew on a textile surface. When the modification time exceeds 5 minutes, the "knotted" structure is "lost" and changes to "elongated drops" on the fibrils (c). It is reasonable to assume that with increasing modification time, the amount of low-molecular oligomeric compounds increases. Images (b) and (c) show that these "drops" mainly have a rounded morphology, while images (c) already show "prolonged drops and lamellae". When the modification time reaches 15 minutes, image (d), the formation and saturation of "prolonged drops" is enhanced and further aggregation of these low-molecular oligomers is clearly visible, due to the difference in surface energy, to some extent repeating the structure of the fibrils of the original polymer. With further modification of the polymer surface, it is obvious that the thinnest fibrils will be more sensitive to the effects of the reaction environment; we will observe their ruptures, like a “tense and then relaxing ribbon”, the formation and growth of low-molecular oligomeric compounds on the ruptured fibrils.

Это отчетливо видно на Фиг 7 (a) после 15 минут модификации. И даже после отмывки этих «капель» водой - снимок (b) отчетливо видна уже измененная морфология поверхности полимера. (Фиг 8).This is clearly visible in Fig. 7 (a) after 15 minutes of modification. And even after washing these "droplets" with water - in picture (b) the already changed morphology of the polymer surface is clearly visible. (Fig. 8).

Пример №5.Example No. 5. Исследование соотношений компонентов в полиэлектролитном комплексе (ПЭК) PLL: Alg ( Л-Лизин : Альгинат) Study of the ratios of components in the polyelectrolyte complex (PEC) PLL: Alg (L-Lysine: Alginate)

Модифицированный альгинат натрия (Alg) с молекулярным весом 70 kDa (3%, w/v), Полилизин (PLL, Mw < 5000) поставлялся компанией Macklin Biochemical Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Смешивались в соотношениях 1:1 и 2:1, при комнатной температуре, с добавлением соли NaBr или NaCl. Данные приведены в Табл 2. и (Фиг 9-10).Modified sodium alginate (Alg) with a molecular weight of 70 kDa (3%, w/v), Polylysine (PLL, Mw < 5000) were purchased from Macklin Biochemical Co., Ltd. (Shanghai, China). They were mixed in the ratios of 1:1 and 2:1, at room temperature, with the addition of NaBr or NaCl salt. The data are shown in Table 2 and (Fig. 9-10).

Табл.2 Образцы ПЭК PLL:Alg с разными концентрациями соли после смешивания и после центрифугованияTable 2 Samples of PLL:Alg PEC with different salt concentrations after mixing and after centrifugation

Соотношение PLL:AlgPLL:Alg ratio Концентрация NaBrConcentration of NaBr Наблюдение после смешиванияObservation after mixing Наблюдение после ультрацентрифугированияObservation after ultracentrifugation 1:11:1 0,25 M0.25 M Быстрая преципитацияRapid precipitation Твёрдые агрегатыSolid aggregates 0,5 M0.5 M Быстрая преципитацияRapid precipitation Твёрдые агрегатыSolid aggregates 1,0 M1.0 M Мутная суспензияTurbid suspension Непрозрачный, эластичный, но непригодный для механических испытанийOpaque, elastic, but not suitable for mechanical testing 1,5 M1.5 M Прозрачный растворClear solution Н/ДN/A 2:12:1 0,25 M0.25 M Быстрая преципитацияRapid precipitation Твёрдые агрегатыSolid aggregates 0,5 M0.5 M Быстрая преципитацияRapid precipitation Твёрдые агрегатыSolid aggregates 1,0 M1.0 M Мутная суспензияTurbid suspension Непрозрачный, эластичный, но непригодный для механических испытанийOpaque, elastic, but not suitable for mechanical testing 1,5 M1.5 M Прозрачный растворClear solution Н/ДN/A

Примечания:Notes:

PLL - это соотношение полилизина (PLL) и альгината (Alg),PLL is the ratio of polylysine (PLL) to alginate (Alg),

M - молярная концентрация (моль/литр),M - molar concentration (mol/liter),

Н/Д - не применимо (не указаны данные).N/A - not applicable (no data provided).

Настоящее изобретение представляет собой новый подход к получению модифицированных полиэлектролитных комплексов, что открывает новые возможности для их применения в медицине и пищевой промышленности.The present invention represents a new approach to obtaining modified polyelectrolyte complexes, which opens up new possibilities for their application in medicine and the food industry.

ЛитератураLiterature

1. Биомиметический принцип конструирования экдистероидсодержащих липосом / Л.А. Ковлер, В.В. Володин, Н.К. Политова и др. // Докл. РАН, 1998. Т. 363, № 5. С. 641-644.1. Biomimetic principle of constructing ecdysteroid-containing liposomes / L.A. Kovler, V.V. Volodin, N.K. Politova et al. // Reports of the Russian Academy of Sciences, 1998. Vol. 363, No. 5. P. 641-644.

2. Гольбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соросовский образовательный журн., 2001. Т. 7, № 7. С. 51-56.2. Golbraich L.S. Chitin and chitosan: structure, properties, application // Soros educational journal, 2001. Vol. 7, No. 7. P. 51-56.

3. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов (обзор) // Высокомолекулярные соединения, 1994. Т. 36. № 2. С. 183-197.3. Kabanov V.A. Physicochemical foundations and prospects for the application of soluble interpolyelectrolyte complexes (review) // High-molecular compounds, 1994. Vol. 36. No. 2. P. 183-197.

4. Кабанов В.А., Зезин А.Б. Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы - новый класс синтетических полиэлектролитов // Итоги науки и техники. Сер. "Органическая химия". М., 1984. Т. 5. С. 131-189.4. Kabanov V.A., Zezin A.B. Water-soluble non-stoichiometric polyelectrolyte complexes - a new class of synthetic polyelectrolytes // Results of Science and Technology. Series "Organic Chemistry". Moscow, 1984. Vol. 5. Pp. 131-189.

5. Новоселов Н.П., Сашина Е.С. Современные представления о строении целлюлозы, хитина и хитозана. Механизм их растворения и биологическая активность // Биологически активные вещества в растворах. М.: Наука., 2001. С. 363-397.5. Novoselov N.P., Sashina E.S. Modern concepts of the structure of cellulose, chitin and chitosan. The mechanism of their dissolution and biological activity // Biologically active substances in solutions. Moscow: Nauka, 2001. Pp. 363-397.

6. Новый подход к созданию материалов с контролируемым выделением лекарственного вещества / Н.Р. Кильдеева, В.Г. Бабак, Г.А Вихорева. и др. // Вестн. МГУ. Сер. 2. Химия, 2000. Т. 41, № 6. С. 423-425.6. A new approach to the creation of materials with controlled release of a medicinal substance / N.R. Kildeeva, V.G. Babak, G.A. Vikhoreva. et al. // Vestn. Moscow State University. Series 2. Chemistry, 2000. Vol. 41, No. 6. P. 423-425.

7. Трехкомпонентные интерполимерные комплексы с низкомолекулярным посредником - некоторые особенности надмолекулярной структуры / О.В. Праздничная, И.Д. Юргенс, С.В. Кораблева и др. // Высокомолекулярные соединения, 1994. Сер. А. Т. 36, № 8. С. 1316-1321.7. Three-component interpolymer complexes with a low-molecular mediator - some features of the supramolecular structure / O.V. Prazdnichnaya, I.D. Yurgens, S.V. Korableva et al. // High-molecular compounds, 1994. Ser. A. V. 36, No. 8. P. 1316-1321.

8. Химическая модификация 20Е и исследование мембранотропных свойств его производных / Н.К. Политова, Л.А. Ковлер, В.В. Володин и др. // Химия растительного сырья, 2001. Т. 5, № 2. С. 69-81.8. Chemical modification of 20E and study of membrane-tropic properties of its derivatives / N.K. Politova, L.A. Kovler, V.V. Volodin et al. // Chemistry of plant raw materials, 2001. Vol. 5, No. 2. P. 69-81.

9. Slama K., Lafont R. Insect hormones - ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. P. 355-377.9. Slama K., Lafont R. Insect hormones - ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. P. 355-377.

Claims

A method for producing a polyelectrolyte complex for delivering biologically active substances, characterized in that a modified low-molecular alginate with a molecular weight of 70 kDa is obtained by controlled dry thermal oxidation of sodium alginate with ozone at a temperature of 80°C for 5-10 min and then the obtained modified low-molecular alginate and poly-L-lysine hydrochloride are mixed in an aqueous solution with a pH of 2.0 to 5.0 in a ratio of 2:1 or 1:1, respectively.