RU2841139C1

RU2841139C1 - Composition based on at least two glycosaminoglycans

Info

Publication number: RU2841139C1
Application number: RU2022125338A
Authority: RU
Inventors: Франсуа БУРДОН
Original assignee: Теоксан Са
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2025-06-03

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: group of inventions relates to an aqueous gel based on hyaluronic acid. Hyaluronic acid cosmetic and /or dermatological aqueous gel contains cross-linked hyaluronic acid and at least water-soluble hyaluronic acid having a weight-average molar mass in range of 0.02 MDa to 0.30 MDa, in amount of 30 wt.% to 70 wt.% based on the total weight of hyaluronic acid; water-soluble hyaluronic acid having a weight-average molar mass of more than 0.30 MDa, said water-soluble hyaluronic acids have a degree of modification of 5% or less, the degree of modification of all hyaluronic acids is 5% or less. Also disclosed are a cosmetic and/or dermatological composition and non-therapeutic cosmetic use of the aqueous gel for preventing and/or treating changes in the appearance of the skin surface.

EFFECT: group of inventions provides soft, easily injectable and tissue-diffusing gels which are effective for regenerating and/or improving the appearance of the skin surface.

16 cl, 5 dwg, 11 tbl, 8 ex

Description

Область техникиField of technology

Настоящее изобретение относится к водному гелю на основе гиалуроновой кислоты, содержащему по меньшей мере сшитую гиалуроновую кислоту и по меньшей мере один тип водорастворимой гиалуроновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к способу получения композиций с добавками на основе гликозаминогликанов, в частности на основе гиалуроновых кислот, которые являются мягкими, стабильными, стерильными и пригодными для инъекций. Полученные таким образом водный гель и композиции содержат по меньшей мере два типа гликозаминогликанов, включая по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, в частности, по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, полученный из несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой, в частности, полученный из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой.The present invention relates to an aqueous gel based on hyaluronic acid, containing at least cross-linked hyaluronic acid and at least one type of water-soluble hyaluronic acid. The present invention also relates to a method for producing compositions with additives based on glycosaminoglycans, in particular based on hyaluronic acids, which are soft, stable, sterile and suitable for injection. The aqueous gel and compositions obtained in this way contain at least two types of glycosaminoglycans, including at least one cross-linked glycosaminoglycan, in particular at least one cross-linked hyaluronic acid obtained from a non-cross-linked glycosaminoglycan with a high molar mass and at least one non-cross-linked glycosaminoglycan with a low molar mass, in particular obtained from at least one non-cross-linked hyaluronic acid with a high molar mass and at least one non-cross-linked hyaluronic acid with a low molar mass.

Предшествующий уровень техникиPrior art

Полисахариды, такие как гликозаминогликаны, широко используются в биомедицинской области. В частности, большинство продуктов, продаваемых для эстетического и/или косметического применения, основаны на гиалуроновой кислоте.Polysaccharides such as glycosaminoglycans are widely used in the biomedical field. In particular, most products sold for aesthetic and/or cosmetic use are based on hyaluronic acid.

Для улучшения качества кожи гели немодифицированной гиалуроновой кислоты являются привлекательными, поскольку они имеют преимущество, связанное с тем, что они являются идеально биосовместимыми. Однако после имплантации in vivo они очень быстро деградируют. Таким образом, эффекты таких гелей носят лишь кратковременный характер.For improving skin quality, unmodified hyaluronic acid gels are attractive because they have the advantage of being perfectly biocompatible. However, after implantation in vivo, they degrade very quickly. Thus, the effects of such gels are only short-term.

Для повышения ее долговечности in vivo и устойчивости к деградации гиалуроновую кислоту обычно модифицируют сшиванием. Гели сшитой гиалуроновой кислоты могут быть получены различными способами получения. Полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, могут быть сшиты с помощью различных сшивающих агентов, таких как эпоксидные агенты, альдегиды, такие как глутаральдегид, дивинилсульфон (DVS) или полиамины. В настоящее время наиболее распространенным агентом, используемым для сшивания гиалуроновой кислоты, является эпоксидный агент, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (БДДЭ).To improve its durability in vivo and resistance to degradation, hyaluronic acid is usually modified by cross-linking. Cross-linked hyaluronic acid gels can be prepared by various preparation methods. Polysaccharides such as hyaluronic acid can be cross-linked using various cross-linking agents such as epoxy agents, aldehydes such as glutaraldehyde, divinyl sulfone (DVS) or polyamines. Currently, the most common agent used to cross-link hyaluronic acid is the epoxy agent, 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE).

Такие процессы сшивания требуют осуществления двух основных стадий, а именно гидратации полисахарида и сшивания.Such cross-linking processes require two main steps, namely hydration of the polysaccharide and cross-linking.

Полученные таким образом коммерческие продукты на основе гиалуроновой кислоты, как правило, имеют, и в соответствии с их показаниями для применения, фракцию сшитой гиалуроновой кислоты и степень модификации в диапазоне от 1 до 10 %.The commercial hyaluronic acid products obtained in this way generally have, and according to their indications for use, a cross-linked hyaluronic acid fraction and a degree of modification in the range from 1 to 10%.

Тем не менее, увеличение сшивания гиалуроновой кислоты приводит к получению более химически модифицированного геля, который, следовательно, потенциально является менее биосовместимым. С другой стороны, механические характеристики этих композиций ограничены и приводят к получению очень эластичного и/или хрупкого конечного продукта.However, increasing the cross-linking of hyaluronic acid results in a more chemically modified gel, which is therefore potentially less biocompatible. On the other hand, the mechanical properties of these compositions are limited and result in a very elastic and/or brittle final product.

Однако, по соображениям безопасности и эффективности продукта, существует заинтересованность в том, чтобы иметь долговечные in vivo композиции, которые содержат биосовместимый полисахарид, настолько природный и настолько менее модифицированный, таким образом, менее сшитый, насколько это возможно.However, for reasons of product safety and efficacy, there is interest in having long-lasting in vivo compositions that contain a biocompatible polysaccharide that is as natural and as less modified, thus less cross-linked, as possible.

Помимо степени сшивания, концентрация применяемого гликозаминогликана является ключевым параметром при определении механических и резистентных свойств композиции. Таким образом, альтернативой для увеличения долговечности in vivo и устойчивости к деградации композиции на основе полисахарида является увеличение его общей концентрации в конечной композиции.In addition to the degree of crosslinking, the concentration of the glycosaminoglycan used is a key parameter in determining the mechanical and resistance properties of the composition. Thus, an alternative to increase the in vivo durability and resistance to degradation of a polysaccharide-based composition is to increase its total concentration in the final composition.

Однако, помимо увеличения ее устойчивости и долговечности, увеличение общей концентрации указанного гликозаминогликана приводит к утолщению композиции со значительным увеличением ее вязкости. Такое увеличение вязкости, таким образом, делает гель трудно инъецируемым и неспособным естественным образом интегрироваться в ткани. В частности, известно, что увеличение общей концентрации гиалуроновой кислоты является источником возникновения папул после инъекции.However, in addition to increasing its stability and durability, increasing the total concentration of said glycosaminoglycan results in a thickening of the composition with a significant increase in its viscosity. Such an increase in viscosity thus makes the gel difficult to inject and unable to integrate naturally into tissues. In particular, it is known that an increase in the total concentration of hyaluronic acid is the source of the occurrence of papules after injection.

Таким образом, по всем этим причинам большинство продуктов на основе сшитой гиалуроновой кислоты, продаваемых на сегодняшний день, имеют общую концентрацию гиалуроновой кислоты только около 25 или 26 мг/г. Однако, хотя такие гели потенциально пригодны для применений в области объемного заполнения кожи, они не подходят для кожных применений для регенерации и улучшения внешнего вида поверхности кожи, в которых механическое заполнение не является основным желаемым эффектом и которые требуют инъекции в поверхностные зоны кожи. Для последнего типа инъекции на самом деле желательно получить гель с более низкими модулями упругости (G') и вязкости (G''), то есть мягкий, легко инъецируемый и легко диффундирующий в ткани.Thus, for all these reasons, most cross-linked hyaluronic acid products sold today have a total hyaluronic acid concentration of only about 25 or 26 mg/g. However, although such gels are potentially suitable for volumetric skin filling applications, they are not suitable for dermal applications for regeneration and improvement of the skin surface appearance, in which mechanical filling is not the main desired effect and which require injection into superficial skin zones. For the latter type of injection, it is actually desirable to obtain a gel with a lower elastic moduli (G') and viscosity (G''), i.e. soft, easily injectable and easily diffusing into the tissue.

В тоже время, в этом контексте повышения устойчивости и долговечности продуктов на основе гликозаминогликанов, таких как гиалуроновая кислота, также было предложено добавлять различные соединения, обладающими защитными свойствами в отношении гиалуроновой кислоты. Так, против деградации гиалуроновой кислоты при нагревании заявка WO2014/032804 раскрывает добавление аскорбилфосфата магния, заявка WO2013/186493 - октасульфата сахарозы, и заявка WO2007/077399 - глицерина. Однако добавление этого типа стабилизирующих соединений увеличивает неопределенность с точки зрения биосовместимости продуктов.At the same time, in this context of increasing the stability and durability of products based on glycosaminoglycans, such as hyaluronic acid, it has also been proposed to add various compounds that have protective properties with respect to hyaluronic acid. Thus, against the degradation of hyaluronic acid when heated, the application WO2014/032804 discloses the addition of magnesium ascorbyl phosphate, the application WO2013/186493 - sucrose octasulfate, and the application WO2007/077399 - glycerol. However, the addition of this type of stabilizing compounds increases the uncertainty in terms of the biocompatibility of the products.

Следовательно, остается необходимость в стерильных гелях на основе гликозаминогликанов, и в частности на основе гиалуроновой кислоты, которые являются мягкими, легко инъецируемыми и легко диффундирующими в ткани, которые при этом являются достаточно долговечными и эффективными для регенерации и/или улучшения внешнего вида поверхности кожи.Therefore, there remains a need for sterile glycosaminoglycan-based gels, and in particular hyaluronic acid-based gels, that are soft, easily injectable and readily diffuse into tissue, yet are durable and effective enough to regenerate and/or improve the appearance of the skin surface.

В частности, остается необходимость увеличения устойчивости и долговечности композиций на основе гликозаминогликанов, таких как гиалуроновая кислота, для преодоления проблем предшествующего уровня техники. Настоящее изобретение предлагает удовлетворить эти потребности.In particular, there remains a need to increase the stability and durability of compositions based on glycosaminoglycans, such as hyaluronic acid, to overcome the problems of the prior art. The present invention proposes to meet these needs.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к водному гелю на основе гиалуроновой кислоты, содержащему сшитую гиалуроновую кислоту, характеризующемуся тем, что указанный гель содержит по меньшей мере:According to a first aspect, the present invention relates to an aqueous gel based on hyaluronic acid, containing cross-linked hyaluronic acid, characterized in that said gel contains at least:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.02 to 0.30 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 30 to 70 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа, называемую «sHA HMW»,- optionally, a water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass greater than 0.30 MDa, referred to as "sHA HMW",

и тем, что указанные водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или меньше, предпочтительно 3 % или меньше, более предпочтительно 1 % или меньше,and in that said water-soluble hyaluronic acids have a modification degree of 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.The corresponding percentage values for soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution at pH 7.2 containing 0.02%NaN₃, at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass-average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase of sodium nitrate with a pH of 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min.

В настоящем тексте описан способ получения водного геля, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан и по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан, причем указанный способ включает по меньшей мере стадии, состоящие в:The present text describes a method for producing an aqueous gel containing at least one cross-linked glycosaminoglycan and at least one non-cross-linked glycosaminoglycan, wherein said method comprises at least the steps of:

a) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, называемый «сшитый гликозаминогликан HMW», полученный из несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;a) providing an aqueous solution comprising at least one cross-linked glycosaminoglycan, referred to as a "cross-linked HMW glycosaminoglycan", derived from a non-cross-linked glycosaminoglycan with a molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, and a cross-linking agent;

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, называемый «несшитый гликозаминогликан LMW»; иb) providing an aqueous solution comprising at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa, more preferably 0.08 to 0.15 MDa, even more preferably 0.08 to 0.10 MDa, referred to as "non-crosslinked glycosaminoglycan LMW"; and

c) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий a) и b).c) forming a homogeneous mixture of all or part of the solutions specified in steps a) and b).

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к способу получения водного геля, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту и по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту, причем указанный способ включает по меньшей мере стадии, состоящие в:According to a second aspect, the present invention relates to a method for producing an aqueous gel comprising at least one cross-linked hyaluronic acid and at least one non-cross-linked hyaluronic acid, said method comprising at least the steps of:

a) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, называемую «сшитая HA HMW», полученную из несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;a) providing an aqueous solution comprising at least one cross-linked hyaluronic acid, referred to as "cross-linked HA HMW", obtained from non-cross-linked hyaluronic acid having a weight average molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, and a cross-linking agent;

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту, называемую «несшитая HA LMW», имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа; более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа; иb) providing an aqueous solution comprising at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA LMW", having a weight average molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa; more preferably 0.08 to 0.15 MDa; and

c) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий а) и b);c) forming a homogeneous mixture of all or part of the solutions specified in steps a) and b);

характеризующийся тем, что он включает применение гиалуроновой кислоты в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 2:1.characterized in that it includes the use of hyaluronic acid in a weight ratio of "non-crosslinked HA LMW" to "HA HMW" from 1:3 to 2:1.

Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что добавление к композициям, содержащим по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, полученный из по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой, по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой, в частности добавление к композициям, содержащим по меньшей мере сшитую гиалуроновую кислоту, полученную из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой, усиливает устойчивость конечной композиции.Surprisingly, the inventors have found that adding at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a low molar mass to compositions containing at least one crosslinked glycosaminoglycan obtained from at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a high molar mass, in particular adding at least one non-crosslinked hyaluronic acid with a low molar mass to compositions containing at least one crosslinked hyaluronic acid obtained from at least one non-crosslinked hyaluronic acid with a high molar mass, enhances the stability of the final composition.

Как показано в примерах ниже, результат представляет собой:As shown in the examples below, the result is:

улучшение устойчивости к деградации по сравнению с той же композицией без добавления несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой и, в частности, без добавления несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой; иan improvement in resistance to degradation compared to the same composition without the addition of non-crosslinked low molar mass glycosaminoglycan and, in particular, without the addition of non-crosslinked low molar mass hyaluronic acid; and

лучшую устойчивость к деградации по сравнению с композициями с такой же общей концентрацией гликозаминогликана, в частности, гиалуроновой кислоты, и такой же степенью сшивания фракции сшитого гликозаминогликана, в частности, сшитой гиалуроновой кислоты.better resistance to degradation compared to compositions with the same total concentration of glycosaminoglycan, in particular hyaluronic acid, and the same degree of cross-linking of the cross-linked glycosaminoglycan fraction, in particular cross-linked hyaluronic acid.

Благодаря такой улучшенной устойчивости к деградации композиции согласно изобретению более устойчивы к тепловой стерилизации. Таким образом, между двумя стерильными и инъекционными композициями, обладающими схожими реологическими свойствами до стерилизации, одной в соответствии с изобретением, и другой, полученной в соответствии с принципами предшествующего уровня техники, первая демонстрирует реологические свойства после стерилизации, превосходящие свойства последней.Due to such improved resistance to degradation, the compositions according to the invention are more resistant to heat sterilization. Thus, between two sterile and injectable compositions having similar rheological properties before sterilization, one according to the invention and the other obtained according to the principles of the prior art, the former exhibits rheological properties after sterilization that are superior to those of the latter.

Благодаря своей повышенной устойчивости к деградации композиции согласно изобретению преимущественно способны выдерживать переменные температуры, в частности, во время их транспортировки и хранения.Due to their increased resistance to degradation, the compositions according to the invention are advantageously able to withstand variable temperatures, in particular during their transportation and storage.

Кроме того, добавление по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой, в частности, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой, позволяет получить мягкие, легко инъецируемые и легко диффундирующие композиции с повышенной общей концентрацией гликозаминогликана, таким образом, с одним или более значительными биомеханическими и/или биологическими эффектами в отношении физиологии кожи.Furthermore, the addition of at least one non-crosslinked low molar mass glycosaminoglycan, in particular at least one non-crosslinked low molar mass hyaluronic acid, allows for the production of soft, easily injectable and easily diffusible compositions with an increased total glycosaminoglycan concentration, thus with one or more significant biomechanical and/or biological effects with respect to skin physiology.

Кроме того, применение композиции, полученной согласно изобретению, позволяет одновременно вводить гликозаминогликаны, в частности гиалуроновые кислоты, с различными молярными массами, способствующие диверсификации физиологических эффектов гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, в обрабатываемом участке.In addition, the use of the composition obtained according to the invention allows for the simultaneous administration of glycosaminoglycans, in particular hyaluronic acids, with different molar masses, which contributes to the diversification of the physiological effects of glycosaminoglycan, in particular hyaluronic acid, in the treated area.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к водному гелю гликозаминогликанов, в частности гиалуроновых кислот, получаемому в соответствии со способом согласно изобретению.According to a third aspect, the present invention relates to an aqueous gel of glycosaminoglycans, in particular hyaluronic acids, obtainable according to the method of the invention.

В соответствии с четвертым аспектом настоящее изобретение относится к косметической и/или дерматологической композиции, содержащей водный гель, как определено в настоящем изобретении.According to a fourth aspect, the present invention relates to a cosmetic and/or dermatological composition comprising an aqueous gel as defined in the present invention.

Настоящее изобретение также относится к композициям, полученным способом в соответствии с изобретением.The present invention also relates to compositions obtained by the method according to the invention.

Изобретение также относится к водному гелю согласно изобретению или композиции согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении изменения вязкоупругих или биомеханических свойств кожи.The invention also relates to an aqueous gel according to the invention or a composition according to the invention for use in preventing and/or treating changes in the viscoelastic or biomechanical properties of the skin.

Изобретение также относится к водному гелю согласно изобретению или дерматологической композиции согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении изменения внешнего вида поверхности кожи, например, вызванного внешними факторами, такими как стресс, загрязнение атмосферы, табак или длительное воздействие ультрафиолетового (УФ) света.The invention also relates to an aqueous gel according to the invention or a dermatological composition according to the invention for use in the prevention and/or treatment of changes in the appearance of the skin surface, for example caused by external factors such as stress, air pollution, tobacco or prolonged exposure to ultraviolet (UV) light.

Предпочтительно изобретение относится к водному гелю согласно изобретению или дерматологической композиции согласно изобретению для применения в контурной пластике и/или заполнении мягких тканей.Preferably, the invention relates to an aqueous gel according to the invention or a dermatological composition according to the invention for use in contour plastic surgery and/or filling of soft tissues.

Оно также относится к нетерапевтическому косметическому применению водного геля, как определено в настоящем изобретении, или косметической композиции, как определено в настоящем изобретении, для предотвращения и/или лечения изменения внешнего вида поверхности кожи, например, кожных признаков хронологического старения.It also relates to the non-therapeutic cosmetic use of an aqueous gel as defined in the present invention or a cosmetic composition as defined in the present invention for the prevention and/or treatment of changes in the appearance of the skin surface, such as cutaneous signs of chronological aging.

Оно также относится к нетерапевтическому косметическому применению водного геля, как определено в настоящем изобретении, или косметической композиции, как определено в настоящем изобретении, для контурной пластики и/или заполнения мягких тканей, в частности заполнения морщин.It also relates to the non-therapeutic cosmetic use of an aqueous gel as defined in the present invention or a cosmetic composition as defined in the present invention for contouring and/or filling of soft tissue, in particular filling of wrinkles.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

[Фиг. 1] Фиг. 1 представляет собой графическое представление потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации (ΔG'(%)), концентрации несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой и концентрации сшитой и несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой для образцов от 1-1 до 1-3.[Fig. 1] Fig. 1 is a graphical representation of the loss of elastic modulus (G') upon autoclave sterilization (ΔG'(%)), the concentration of low molar mass non-crosslinked hyaluronic acid, and the concentration of high molar mass crosslinked and non-crosslinked hyaluronic acid for Samples 1-1 to 1-3.

[Фиг. 2] Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации (Δ G'(%)) для образца 3-5 без добавления несшитой гиалуроновой кислоты и образцов от 3-6 до 3-9, содержащих добавленную несшитую гиалуроновую кислоту с молярной массой 0,04 МДа, 0,10 МДа, 0,20 МДа и 1,50 МДа, соответственно.[Fig. 2] Fig. 2 is a graph showing the loss of elastic modulus (G') upon autoclave sterilization (Δ G'(%)) for Sample 3-5 without adding non-cross-linked hyaluronic acid and Samples 3-6 to 3-9 containing added non-cross-linked hyaluronic acid with a molar mass of 0.04 MDa, 0.10 MDa, 0.20 MDa, and 1.50 MDa, respectively.

[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий проценты улучшения потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации для образца 3-5 без добавления несшитой гиалуроновой кислоты и образцов от 3-6 до 3-9, содержащих добавленную несшитую гиалуроновую кислоту с молярной массой 0,04 МДа, 0,10 МДа, 0,20 МДа и 1,50 МДа, соответственно.[Fig. 3] Fig. 3 is a graph showing the percentage improvement in the loss of elastic modulus (G') upon autoclave sterilization for Sample 3-5 without the addition of non-cross-linked hyaluronic acid and Samples 3-6 to 3-9 containing added non-cross-linked hyaluronic acid with a molar mass of 0.04 MDa, 0.10 MDa, 0.20 MDa and 1.50 MDa, respectively.

[Фиг. 4] Фиг. 4 представляет собой графическое представление потери модуля упругости (G') при автоклавной стерилизации (Δ G'(%)), концентрации несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой и концентрации сшитой и несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой для образца 4-1 (без добавок) и образцов от 4-2 до 4-4.[Fig. 4] Fig. 4 is a graphical representation of the loss of elastic modulus (G') upon autoclave sterilization (Δ G'(%)), the concentration of low molar mass non-crosslinked hyaluronic acid, and the concentration of high molar mass crosslinked and non-crosslinked hyaluronic acid for Sample 4-1 (without additives) and Samples 4-2 to 4-4.

[Фиг. 5] Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий различия в модуле упругости (G') до и после обработки гиалуронидазой (Δ G'(%)) для образца 6-1 без добавления несшитой гиалуроновой кислоты и образцов 6-2 и 6-3, содержащих добавленную несшитую гиалуроновую кислоту с молярной массой 0,10 МДа и 1,50 МДа, соответственно.[Fig. 5] Fig. 5 is a graph showing the difference in elastic modulus (G') before and after hyaluronidase treatment (Δ G'(%)) for sample 6-1 without adding non-cross-linked hyaluronic acid and samples 6-2 and 6-3 containing added non-cross-linked hyaluronic acid with a molar mass of 0.10 MDa and 1.50 MDa, respectively.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Определение терминов согласно изобретению:Definition of terms according to the invention:

- «Гликозаминогликаны» определяются как длинные цепи, состоящие из повторяющихся дисахаридных звеньев, в которых один из двух углеводных остатков представляет собой аминоуглевод (N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин), а второй представляет собой уроновую (глюкуроновую или идуроновую) кислоту или галактозу. Гликозаминогликаны включают гиалуроновую кислоту, гепарозан, хондроитина сульфат, дерматана сульфат и кератана сульфат. Особенно предпочтительным гликозаминогликаном является гиалуроновая кислота.- "Glycosaminoglycans" are defined as long chains of repeating disaccharide units in which one of the two carbohydrate residues is an amino carbohydrate (N-acetyl glucosamine or N-acetyl galactosamine) and the other is a uronic (glucuronic or iduronic) acid or galactose. Glycosaminoglycans include hyaluronic acid, heparosan, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, and keratan sulfate. A particularly preferred glycosaminoglycan is hyaluronic acid.

- «Гиалуроновая кислота» означает гиалуроновую кислоту или гиалуронан и их производные. Следовательно, термин «гиалуроновая кислота» также включает соли гиалуроновой кислоты, такие как гиалуронат натрия, и гиалуроновые кислоты, которые были химически модифицированы, например, путем окисления, восстановления, деацетилирования, сульфатирования или амидирования. Гиалуроновая кислота представляет собой линейный полисахарид с чередующимися звеньями D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, связанными чередующимися β-1,3-гликозидными и β-1,4-гликозидными связями.- "Hyaluronic acid" means hyaluronic acid or hyaluronan and their derivatives. Consequently, the term "hyaluronic acid" also includes salts of hyaluronic acid, such as sodium hyaluronate, and hyaluronic acids that have been chemically modified, for example by oxidation, reduction, deacetylation, sulfation or amidation. Hyaluronic acid is a linear polysaccharide with alternating units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine linked by alternating β-1,3-glycosidic and β-1,4-glycosidic bonds.

Он естественным образом присутствует в нескольких тканях человеческого организма и разрушается ферментами, гиалуронидазами, также присутствующими в организме, и/или через механизмы окисления.It is naturally present in several tissues of the human body and is broken down by enzymes, hyaluronidases, also present in the body, and/or through oxidation mechanisms.

- «Водорастворимая гиалуроновая кислота», или «растворимая гиалуроновая кислота», или «экстрагируемая гиалуроновая кислота», также называемая «sHA», означает гиалуроновую кислоту, которая может экстрагироваться из геля на основе гиалуроновой кислоты, когда последний набухает в избытке водной среды. Соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Практически, концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC (эксклюзионная хроматография) соответствующим образом регулируются специалистом в данной области техники как функция супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.- "Water-soluble hyaluronic acid" or "soluble hyaluronic acid" or "extractable hyaluronic acid", also called "sHA", means hyaluronic acid that can be extracted from a hyaluronic acid-based gel when the latter is swollen in excess aqueous medium. The corresponding percentage values for soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution of pH 7.2 containing 0.02%NaN₃, at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass-average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase of sodium nitrate with a pH of 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min. In practice, the concentration of the gel in the mobile phase for the dilution step, as well as the injected volume in SEC (size exclusion chromatography), are appropriately adjusted by the person skilled in the art as a function of the supernatant composition in order to maximize the signal-to-noise ratio and avoid column overloading.

В противоположность этому, «неводорастворимая гиалуроновая кислота», или «нерастворимая гиалуроновая кислота», или «неэкстрагируемая гиалуроновая кислота», также называемая «nsHA», означает гиалуроновую кислоту, которая не может экстрагироваться из геля на основе гиалуроновой кислоты, когда последний набухает в избытке водной среды.In contrast, “non-water-soluble hyaluronic acid” or “insoluble hyaluronic acid” or “non-extractable hyaluronic acid”, also called “nsHA”, refers to hyaluronic acid that cannot be extracted from a hyaluronic acid-based gel when the latter is swollen in excess aqueous medium.

- «Среднемассовая молярная масса», выраженная в г/моль или Дa, и сокращенно Mw гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, относится к среднемассовой молярной массе применяемых молекул гликозаминогликана. Среднемассовая молярная масса гликозаминогликана может быть определена различными способами, известными специалисту в данной области техники, такими как капиллярный электрофорез, эксклюзионная хроматография или измерение характеристической вязкости. В настоящем тексте выражения «молярная масса», «средняя молярная масса», «среднемассовая молярная масса» или «массовая молярная масса» могут использоваться взаимозаменяемо.- "Mass-average molar mass", expressed in g/mol or Da, and abbreviated as Mw of a glycosaminoglycan, in particular hyaluronic acid, refers to the mass-average molar mass of the glycosaminoglycan molecules used. The mass-average molar mass of a glycosaminoglycan can be determined by various methods known to those skilled in the art, such as capillary electrophoresis, size-exclusion chromatography or measurement of the intrinsic viscosity. In the present text, the expressions "molar mass", "average molar mass", "mass-average molar mass" or "mass molar mass" may be used interchangeably.

- «Характеристическая вязкость» ([η]), выраженная в мл/г илим³/кг, гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, относится к вкладу гликозаминогликана в вязкость раствора. Ее можно измерить путем пропускания через капиллярный вискозиметр. Она представляет собой гидродинамический удельный объем полимера. Чем ниже характеристическая вязкость гликозаминогликана, тем ниже его молярная масса. Для данного гликозаминогликана характеристическая вязкость связана с молярной массой эмпирическим соотношением, соотношением Марка-Хаувинка, которое может быть понято любым специалистом в данной области техники, и формула которого является следующей:- "Intrinsic viscosity" ([η]), expressed in ml/g orm³/kg, of a glycosaminoglycan, particularly hyaluronic acid, refers to the contribution of the glycosaminoglycan to the viscosity of the solution. It can be measured by passing it through a capillary viscometer. It represents the hydrodynamic specific volume of the polymer. The lower the intrinsic viscosity of a glycosaminoglycan, the lower its molar mass. For a given glycosaminoglycan, the intrinsic viscosity is related to the molar mass by an empirical relationship, the Mark-Houwink relationship, which can be understood by anyone skilled in the art and whose formula is:

[η] = K×Mwα,[η] = K×Mwα,

где:Where:

- К представляет собой постоянную функцию исследуемого полимера, применяемого растворителя и температуры, в частности, К связана с размерами цепей исследуемого полимера;- K is a constant function of the polymer under study, the solvent used and the temperature, in particular, K is related to the chain sizes of the polymer under study;

- α представляет собой постоянную функцию исследуемого полимера, применяемого растворителя и температуры, в частности, α связана с конформацией исследуемого полимера; и- α is a constant function of the polymer under study, the solvent used and the temperature, in particular, α is related to the conformation of the polymer under study; and

- Mw представляет собой среднемассовую молярную массу полимера, выраженную в дальтонах (Да).- Mw is the mass-average molar mass of the polymer, expressed in daltons (Da).

- «Гликозаминогликан с низкой молярной массой», также называемый «гликозаминогликан LMW» или «LMW гликозаминогликан», означает гликозаминогликан в качестве исходного материала со среднемассовой молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа.- "Low molar mass glycosaminoglycan", also referred to as "LMW glycosaminoglycan" or "LMW glycosaminoglycan", means a glycosaminoglycan as a starting material with a mass-average molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa, more preferably 0.08 to 0.15 MDa, even more preferably 0.08 to 0.10 MDa.

- «Гиалуроновая кислота с низкой молярной массой», также называемая «гиалуроновая кислота LMW», или «HA LMW», или «LMW гиалуроновая кислота», или «LMW HA», означает гиалуроновую кислоту в качестве исходного материала с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, что соответствует гиалуроновой кислоте с низкой характеристической вязкостью, то есть с характеристической вязкостью в диапазоне от 0,10 до 0,8 м³/кг, предпочтительно от 0,2 до 0,5 м³/кг, более предпочтительно от 0,2 до 0,4 м³/кг, измеренной в соответствии со способом, указанным в Европейской фармакопее (издание 01/2017:1472).- "Low molar mass hyaluronic acid", also referred to as "LMW hyaluronic acid" or "LMW HA" or "LMW hyaluronic acid" or "LMW HA", means hyaluronic acid as a starting material with a molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa, more preferably 0.08 to 0.15 MDa, which corresponds to a hyaluronic acid with a low intrinsic viscosity, i.e. with an intrinsic viscosity in the range of 0.10 to 0.8 ^m3 /kg, preferably 0.2 to 0.5 ^m3 /kg, more preferably 0.2 to 0.4 ^m3 /kg, measured according to the method specified in the European Pharmacopoeia (edition 01/2017:1472).

- «Водорастворимая гиалуроновая кислота с низкой молярной массой» или «растворимая гиалуроновая кислота с низкой молярной массой», также называемая «sHA LMW» или «LMW sHA», означает растворимую гиалуроновую кислоту с молярной массой в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,04 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,04 до 0,15 МДа, измеренную на конечном геле в соответствии со способом, описанным в п. 1 формулы, то есть путем разбавления водного геля раствором 150 нM нитрата натрия с pH 7,2, содержащим 0,02 %NaN₃, при 25°C в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 минут и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 MДa, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Практически, концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC соответствующим образом регулируются специалистом в данной области техники как функция супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.- "Water-soluble low molar mass hyaluronic acid" or "soluble low molar mass hyaluronic acid", also referred to as "LMW sHA" or "LMW sHA", means a soluble hyaluronic acid with a molar mass in the range of 0.02 to 0.30 MDa, preferably 0.04 to 0.20 MDa, more preferably 0.04 to 0.15 MDa, measured on the final gel according to the method described in claim 1, i.e. by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution with a pH of 7.2 containing 0.02%NaN₃, at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 minutes and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass-average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase of sodium nitrate at pH 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min. In practice, the concentration of the gel in the mobile phase for the dilution step, as well as the injected volume in the SEC, are appropriately adjusted by one skilled in the art as a function of the supernatant composition in order to maximize the signal-to-noise ratio and avoid column overloading.

- «Гликозаминогликан с высокой молярной массой», также называемый «гликозаминогликан HMW» или «HMW гликозаминогликан», означает гликозаминогликан в качестве исходного материала с молекулярной массой более 0,50 МДа, предпочтительно более 1,00 МДа и более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа.- “High molar mass glycosaminoglycan”, also referred to as “HMW glycosaminoglycan” or “HMW glycosaminoglycan”, means a glycosaminoglycan as a starting material with a molecular weight of more than 0.50 MDa, preferably more than 1.00 MDa, and more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa.

- «Гиалуроновая кислота с высокой молярной массой», также называемая «гиалуроновая кислота HMW», или «HA HMW», или «HMW гиалуроновая кислота», или «HMW HA», означает гиалуроновую кислоту в качестве исходного материала с молярной массой более 0,50 МДа, предпочтительно более 1,00 МДа и более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, что соответствует гиалуроновой кислоте с высокой характеристической вязкостью, т.е. характеристической вязкостью более 0,8м³/кг, предпочтительно более 1,2м³/кг, более предпочтительно в диапазоне от 1,2 до 3,5м³/кг, измеренной в соответствии с методом, указанным в Европейской фармакопее (издание 01/2017: 1472).- "High molar mass hyaluronic acid", also referred to as "HMW hyaluronic acid" or "HA HMW" or "HMW hyaluronic acid" or "HMW HA", means hyaluronic acid as a starting material with a molar mass of more than 0.50 MDa, preferably more than 1.00 MDa, and more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, which corresponds to hyaluronic acid with a high intrinsic viscosity, i.e. an intrinsic viscosity of more than 0.8m³/kg, preferably more than 1.2m³/kg, more preferably in the range from 1.2 to 3.5m³/kg, measured according to the method specified in the European Pharmacopoeia (edition 01/2017: 1472).

- «Растворимая гиалуроновая кислота с высокой молярной массой» или «водорастворимая гиалуроновая кислота с высокой молярной массой», также называемая «sHA HMW» или «HMW sHA», означает растворимую гиалуроновую кислоту с молярной массой более 0,30 МДа, предпочтительно более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, измеренной на конечном геле в соответствии со способом, описанным в п. 1 формулы, то есть путем разбавления водного геля раствором 150 нM нитрата натрия с pH 7,2, содержащим 0,02 %NaN₃, при 25°C в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 минут и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 MДa, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Практически, концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC соответствующим образом регулируются специалистом в данной области техники как функция супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.- "Soluble high molar mass hyaluronic acid" or "water-soluble high molar mass hyaluronic acid", also referred to as "HMW sHA" or "HMW sHA", means a soluble hyaluronic acid with a molar mass greater than 0.30 MDa, preferably greater than 0.30 MDa and less than or equal to 4.00 MDa, measured on the final gel according to the method described in claim 1, i.e. by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution with a pH of 7.2 containing 0.02%NaN₃, at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 minutes and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass-average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase of sodium nitrate at pH 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min. In practice, the concentration of the gel in the mobile phase for the dilution step, as well as the injected volume in the SEC, are appropriately adjusted by one skilled in the art as a function of the supernatant composition in order to maximize the signal-to-noise ratio and avoid column overloading.

- «Сшитый гликозаминогликан» относится к гликозаминогликану, модифицированному сшивающим агентом во время реакции сшивания. В противоположность этому, «несшитый гликозаминогликан» относится к гликозаминогликану, который не был модифицирован сшивающим агентом и, следовательно, не подвергался реакции сшивания.- "Cross-linked glycosaminoglycan" refers to glycosaminoglycan that has been modified by a cross-linking agent during a cross-linking reaction. In contrast, "uncross-linked glycosaminoglycan" refers to glycosaminoglycan that has not been modified by a cross-linking agent and therefore has not undergone a cross-linking reaction.

- «Сшитая гиалуроновая кислота» относится к гиалуроновой кислоте, модифицированной сшивающим агентом во время реакции сшивания. В противоположность этому, «несшитая гиалуроновая кислота» относится к гиалуроновой кислоте, которая не была модифицирована сшивающим агентом и, следовательно, не подвергалась реакции сшивания.- "Cross-linked hyaluronic acid" refers to hyaluronic acid that has been modified by a cross-linking agent during a cross-linking reaction. In contrast, "non-cross-linked hyaluronic acid" refers to hyaluronic acid that has not been modified by a cross-linking agent and therefore has not undergone a cross-linking reaction.

- «Несшитая» и «не являющаяся сшитой» являются синонимами и могут использоваться взаимозаменяемо в настоящем тексте.- "Unstitched" and "not being stitched" are synonyms and may be used interchangeably in this text.

- Выражение «гликозаминогликан HMW» или «HMW гликозаминогликан» относится к компоненту «сшитый гликозаминогликан HMW» и компоненту «несшитый гликозаминогликан HMW», если таковой присутствует, в водном геле.- The expression "HMW glycosaminoglycan" or "HMW glycosaminoglycan" refers to the "cross-linked HMW glycosaminoglycan" component and the "non-cross-linked HMW glycosaminoglycan" component, if present, in the aqueous gel.

- Выражение «гиалуроновая кислота HMW», также называемая «HA HMW» или «HMW HA», относится к компоненту «сшитая гиалуроновая кислота HMW» (также называемая «сшитой HA HMW» или «сшитой HMW HA») и, если применимо, к компоненту «несшитая гиалуроновая кислота HMW» (также называемая «несшитая HA HMW» или «несшитая HMW HA»), если он присутствует, в водном геле.- The expression "HMW hyaluronic acid", also referred to as "HA HMW" or "HMW HA", refers to the "cross-linked HMW hyaluronic acid" component (also referred to as "cross-linked HA HMW" or "cross-linked HMW HA") and, if applicable, to the "non-cross-linked HMW hyaluronic acid" component (also referred to as "non-cross-linked HA HMW" or "non-cross-linked HMW HA"), if present, in the aqueous gel.

- «Степень сшивания», применяемая при получении «сшитого гликозаминогликана», в частности «сшитой гиалуроновой кислоты», соответствует соотношению между массой (или весом) сшивающего агента и массой гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, применяемого для получения указанного сшитого гликозаминогликана, в частности указанной сшитой гиалуроновой кислоты. Она обычно выражается в процентах.- The "degree of crosslinking" used in obtaining the "crosslinked glycosaminoglycan", in particular the "crosslinked hyaluronic acid", corresponds to the ratio between the mass (or weight) of the crosslinking agent and the mass of the glycosaminoglycan, in particular the hyaluronic acid, used to obtain the said crosslinked glycosaminoglycan, in particular the said crosslinked hyaluronic acid. It is usually expressed as a percentage.

- Сшитый гликозаминогликан и композицию, содержащую такой сшитый гликозаминогликан, в частности сшитую гиалуроновую кислоту и композицию, содержащую такую сшитую гиалуроновую кислоту, можно квалифицировать по их «степени модификации» (MOD). Эта степень модификации соответствует молярному количеству модифицирующего агента, связанного с указанным гликозаминогликаном одним или несколькими его концами, выраженному на 100 моль дисахаридных повторяющихся звеньев гликозаминогликана в композиции, в частности 100 моль дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты в композиции. Референсным методом определения этой степени модификации является ядерно-магнитная резонансная спектроскопия (¹H ЯМР). Указанная степень модификации определяется молярным отношением сигналов сшивающего агента к сигналу дисахаридных звеньев гликозаминогликана (гликозаминогликан участвовал в сшивании или нет).- A cross-linked glycosaminoglycan and a composition comprising such a cross-linked glycosaminoglycan, in particular a cross-linked hyaluronic acid and a composition comprising such a cross-linked hyaluronic acid, can be qualified by their "degree of modification" (MOD). This degree of modification corresponds to the molar amount of the modifying agent bound to said glycosaminoglycan at one or more of its ends, expressed per 100 mol of disaccharide repeating units of the glycosaminoglycan in the composition, in particular 100 mol of disaccharide repeating units of hyaluronic acid in the composition. The reference method for determining this degree of modification is nuclear magnetic resonance spectroscopy ( ¹ H NMR). The specified degree of modification is determined by the molar ratio of the signals of the cross-linking agent to the signal of the disaccharide units of the glycosaminoglycan (whether the glycosaminoglycan was involved in the cross-linking or not).

- «Сшитый гликозаминогликан с высокой молярной массой (HMW)» или «сшитый высокомолекулярный (HMW) гликозаминогликан» относится к сшитому гликозаминогликану, полученному из несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой. Предпочтительно, сшитый HMW гликозаминогликан имеет степень сшивания 8 % или меньше, предпочтительно 5 % или меньше и более предпочтительно меньше 2 %.- "High molar mass (HMW) cross-linked glycosaminoglycan" or "high molecular weight (HMW) cross-linked glycosaminoglycan" refers to a cross-linked glycosaminoglycan derived from a non-cross-linked high molar mass glycosaminoglycan. Preferably, the cross-linked HMW glycosaminoglycan has a degree of cross-linking of 8% or less, preferably 5% or less, and more preferably less than 2%.

- «Сшитая гиалуроновая кислота с высокой молярной массой (HMW)» или «сшитая высокомолекулярная (HMW) гиалуроновая кислота» относится к сшитой гиалуроновой кислоте, полученной из несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой. Предпочтительно, сшитая HMW гиалуроновая кислота имеет степень сшивания 8 % или меньше, предпочтительно 5 % или меньше и более предпочтительно меньше 2 %.- "High molar mass (HMW) cross-linked hyaluronic acid" or "high molecular weight (HMW) cross-linked hyaluronic acid" refers to a cross-linked hyaluronic acid obtained from non-cross-linked high molar mass hyaluronic acid. Preferably, the HMW cross-linked hyaluronic acid has a cross-linking degree of 8% or less, preferably 5% or less, and more preferably less than 2%.

- «Биомеханические и биологические свойства гликозаминогликанов в отношении физиологии кожи» включают, в частности, гидратацию и активацию фибробластов. Например, благодаря своим биомеханическим и биологическим свойствам гиалуроновая кислота участвует в реструктуризации, регенерации и/или омоложении кожи.- "The biomechanical and biological properties of glycosaminoglycans in relation to skin physiology" include, in particular, hydration and activation of fibroblasts. For example, due to its biomechanical and biological properties, hyaluronic acid is involved in the restructuring, regeneration and/or rejuvenation of the skin.

- «Добавка» к композиции представляет собой добавление к этой композиции по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с низкой молярной массой. Предпочтительно, добавка соответствует добавлению к композиции по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты с низкой молярной массой.- The "additive" to the composition is the addition to this composition of at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a low molar mass. Preferably, the additive corresponds to the addition to the composition of at least one non-crosslinked hyaluronic acid with a low molar mass.

- «Общая концентрация гликозаминогликана» означает сумму концентрации сшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и, необязательно, несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и концентрации гликозаминогликана, применяемого для добавки. Эта концентрация выражается в миллиграммах гликозаминогликана на грамм геля.- "Total glycosaminoglycan concentration" means the sum of the concentration of cross-linked high molar mass glycosaminoglycan and, optionally, non-cross-linked high molar mass glycosaminoglycan and the concentration of glycosaminoglycan used for the additive. This concentration is expressed in milligrams of glycosaminoglycan per gram of gel.

- «Общая концентрация гиалуроновой кислоты» означает сумму концентрации сшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и, необязательно, несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и концентрации гиалуроновой кислоты, применяемой для добавки. Эта концентрация выражается в миллиграммах гликозаминогликана на грамм геля.- "Total hyaluronic acid concentration" means the sum of the concentration of cross-linked high molar mass hyaluronic acid and, optionally, non-cross-linked high molar mass hyaluronic acid and the concentration of hyaluronic acid used for the additive. This concentration is expressed in milligrams of glycosaminoglycan per gram of gel.

Раствор считается «гомогенным», когда его цвет, внешний вид и вязкость воспринимаются невооруженным глазом и на ощупь как однородные.A solution is considered "homogeneous" when its color, appearance, and viscosity are perceived to be uniform to the naked eye and to the touch.

- «Водная среда» означает любую жидкую среду, содержащую по меньшей мере воду в качестве растворителя и обладающую свойством растворять гликозаминогликан, в частности гиалуроновую кислоту.- "Aqueous medium" means any liquid medium containing at least water as a solvent and having the property of dissolving a glycosaminoglycan, in particular hyaluronic acid.

- «Сшивающий агент» означает любое соединение, способное осуществлять сшивание между различными цепями гликозаминогликана. В качестве сшивающих агентов, подходящих для осуществления изобретения, можно упомянуть, в частности, би- или полифункциональные эпоксидные или неэпоксидные сшивающие агенты. Среди эпоксидных агентов можно упомянуть диглицидиловый эфир бутандиола (БДДЭ), диэпоксиоктан, 1,2-бис(2,3-эпоксипропил)-2,3-этилен, 1,2-бис(2,3-эпоксипропил)-2,3-эмилен и их смеси. Среди неэпоксидных агентов могут быть упомянуты эндогенные полиамины, такие как спермин, спермидин и путресцин, альдегиды, карбодиимиды и дивинилсульфон.- "Crosslinking agent" means any compound capable of crosslinking between different chains of glycosaminoglycan. As crosslinking agents suitable for carrying out the invention, mention may be made in particular of bi- or polyfunctional epoxy or non-epoxy crosslinking agents. Among the epoxy agents, mention may be made of diglycidyl ether of butanediol (BDDE), diepoxyoctane, 1,2-bis(2,3-epoxypropyl)-2,3-ethylene, 1,2-bis(2,3-epoxypropyl)-2,3-emylene and mixtures thereof. Among the non-epoxy agents, mention may be made of endogenous polyamines such as spermine, spermidine and putrescine, aldehydes, carbodiimides and divinyl sulfone.

- «водный гель» означает как водный гель, получаемый способом согласно изобретению, так и водный гель согласно настоящему изобретению, когда не указано другое.- "aqueous gel" means both an aqueous gel obtainable by the method according to the invention and an aqueous gel according to the present invention, unless otherwise indicated.

- «Мягкий гель» означает гель, вязкоупругое распределение которого остается умеренно эластичным, то есть достаточно вязким с фазовым углом (δ) от 15° до 50° и низким модулем упругости G', другими словами, G' 150 Па или менее, предпочтительно от 20 до 150 Па, измеренными для напряжения 5 Па при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2), имеющего геометрию конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм), с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или менее, предпочтительно менее 15 Н, измеренную при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внутренним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.- "Soft gel" means a gel whose viscoelastic distribution remains moderately elastic, i.e. sufficiently viscous with a phase angle (δ) from 15° to 50° and a low elastic modulus G', in other words, G' of 150 Pa or less, preferably from 20 to 150 Pa, measured for a stress of 5 Pa at room temperature using a rheometer (TA Instruments DHR2) having a cone/plate geometry (cone angle 1°/plate diameter 40 mm), using an oscillatory sweep voltage with a frequency of 1 Hz, and an extrusion force of 18 N or less, preferably less than 15 N, measured at a fixed speed of about 12.5 mm/min, in syringes with an internal diameter of 6.3 mm or more, with a needle with an external diameter of 0.3 mm (30 G) or less and a length of ½", at room temperature.

- «Легко инъецируемый» означает гель со средней силой экструзии менее 18 Н, предпочтительно менее 15 Н, при измерении динамометром при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внешним диаметром 6,3 мм или более, с иглой внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.- "Easy to inject" means a gel with an average extrusion force of less than 18 N, preferably less than 15 N, when measured with a dynamometer at a fixed speed of about 12.5 mm/min, in syringes with an outer diameter of 6.3 mm or more, with a needle of an outer diameter of 0.3 mm (30 G) or less and a length of ½", at room temperature.

- Композиция или гель, «легко диффундирующий в тканях», означает композицию для кожных применений в области регенерации и улучшения внешнего вида поверхности кожи, которая не способствует образованию папул после ее инъекции в поверхностные зоны кожи, т.е. в верхнюю и среднюю части дермы.- A composition or gel that "easily diffuses into tissues" means a composition for cutaneous applications in the area of regeneration and improvement of the appearance of the skin surface, which does not promote the formation of papules after its injection into the superficial zones of the skin, i.e., into the upper and middle parts of the dermis.

- «Долговечность in vivo» означает способность геля оставаться в обработанном месте в течение долгого времени после его введения. Гель, долговечный in vivo, представляет собой гель, способный оставаться в обработанном участке по меньшей мере 1 месяц, предпочтительно по меньшей мере 3 месяца, более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, т.е. способный поддерживать после нанесения общее эстетическое улучшение в течение по меньшей мере 1 месяца, предпочтительно по меньшей мере 3 месяцев, более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, другими словами, способный поддерживать после нанесения по меньшей мере улучшение 1 или 2 степени по субъективной шкале оценки общего эстетического улучшения, включающей 5 степеней: 1. Значительное улучшение; 2. Улучшение; 3. Без изменений; 4. Деградация; 5. Сильная деградация, и делать это по меньшей мере 1 месяц, предпочтительно по меньшей мере 3 месяца, более предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев.- "In vivo durability" means the ability of a gel to remain in the treated area for a long time after its administration. A gel that is durable in vivo is a gel that is capable of remaining in the treated area for at least 1 month, preferably at least 3 months, more preferably at least 6 months, i.e. capable of maintaining, after application, an overall aesthetic improvement for at least 1 month, preferably at least 3 months, more preferably at least 6 months, in other words, capable of maintaining, after application, at least an improvement of grade 1 or 2 on a subjective scale for assessing overall aesthetic improvement that includes 5 grades: 1. Significant improvement; 2. Improvement; 3. No change; 4. Degradation; 5. Strong degradation, and to do so for at least 1 month, preferably at least 3 months, more preferably at least 6 months.

- Термин «стабильность» характеризует способность композиции сохранять физико-химические свойства (цвет, рН, гомогенность, мутность, реологию и т.д.) в соответствии с ее характеристиками при хранении по меньшей мере один год. Стабильность композиции обычно контролируют путем наблюдения и/или измерения одного или нескольких ее физико-химических параметров, в частности, одного или более ее реологических параметров, таких как модуль упругости (G') или вязкость (η).- The term "stability" characterizes the ability of a composition to maintain its physicochemical properties (color, pH, homogeneity, turbidity, rheology, etc.) in accordance with its characteristics when stored for at least one year. The stability of a composition is usually monitored by observing and/or measuring one or more of its physicochemical parameters, in particular one or more of its rheological parameters, such as the elastic modulus (G') or viscosity (η).

- «Стерильный гель» означает гель, который безопасен для введения в поверхностные участки кожи или через них, т.е. верхнюю и среднюю части дермы. В частности, важно, чтобы гель, подлежащий введению методом инъекции, не содержал каких-либо загрязняющих веществ, которые могли бы инициировать нежелательную вторичную реакцию в организме-хозяине.- "Sterile gel" means a gel that is safe for injection into or through superficial areas of the skin, i.e. the upper and mid dermis. In particular, it is important that the gel to be injected does not contain any contaminants that could initiate an undesirable secondary reaction in the host.

Термины «вспомогательное вещество», «дополнительный компонент» и «эксципиент» используются взаимозаменяемо и относятся к любому компоненту, совместимому с нанесением в кожу и/или на кожу. Количество применяемого вспомогательного вещества зависит от природы указанного компонента, желаемого эффекта и применения композиции согласно изобретению. Это вспомогательное вещество может представлять собой один из следующих компонентов или одно из его производных: анестетик, антиоксидант, аминокислоту, витамин, минералы, нуклеиновую кислоту, нуклеотид, нуклеозид, кофермент, адренергическое производное, натрия дигидрофосфата моногидрат и/или дигидрат или хлорид натрия.The terms "excipient", "additional component" and "excipient" are used interchangeably and refer to any component compatible with application to and/or onto the skin. The amount of excipient used depends on the nature of said component, the desired effect and the use of the composition according to the invention. This excipient may be one of the following components or one of its derivatives: anesthetic, antioxidant, amino acid, vitamin, minerals, nucleic acid, nucleotide, nucleoside, coenzyme, adrenergic derivative, sodium dihydrogen phosphate monohydrate and/or dihydrate or sodium chloride.

- В качестве «анестетика» можно упомянуть амбукаин, амоксекаин, амилеин, априндин, аптокаин, артикаин, бензокаин, бетоксикаин, бупивакаин, бутакаин, бутамбен, бутаниликаин, хлорбутанол, хлорпрокаин, цинхокаин, клодакаин, кокаин, криофлуоран, циклометикаин, дексивакаин, диамокаин, диперодон, диклонин, этидокаин, эупроцин, фебуерин, фомокаин, гуафекаинол, гептакаин, гексилкаин, гидроксипрокаин, гидрокситетракаин, изобутамбен, лейцинокаин, левобупивакаин, левоксадрол, лидамидин, лидокаин, лотукаин, менглитат, мепивакаин, меприлкаин, миртекаин, октакаин, октодрин, оксетакаин, оксибупрокаин, паретоксикаин, паридокаин, фенакаин, пиперокаин, пиридокаин, полидоканол, прамокаин, прилокаин, прокаин, пропанокаин, пропипокаин, пропоксикаин, проксиметакаин, пиррокаин, кватакаин, хинисокаин, рисокаин, родокаин, ропивакаин, тетракаин, толикаин, тримекаин и их соли.- As an "anesthetic" we can mention ambucaine, amoxecaine, amyloid, aprindine, aptocaine, articaine, benzocaine, betoxycaine, bupivacaine, butacaine, butamben, butanilicaine, chlorbutanol, chloroprocaine, cinchocaine, clodacaine, cocaine, cryofluorane, cyclomethicaine, dexivacaine, diamocaine, diperodone, dyclonine, etidocaine, euprocin, febuerine, fomocaine, guafecainol, heptacaine, hexylcaine, hydroxyprocaine, hydroxytetracaine, isobutamben, leucinocaine, levobupivacaine, levoxadrol, lidamidine, lidocaine, lotucaine, menglitate, mepivacaine, meprilcaine, mirtecaine, octacaine, octodrine, oxetakaine, oxybuprocaine, parethoxycaine, paridocaine, phenacaine, piperocaine, pyridocaine, polidocanol, pramocaine, prilocaine, procaine, propanocaine, propipocaine, propoxycaine, proxymetacaine, pyrrocaine, quatacaine, quinisocaine, risocaine, rhodocaine, ropivacaine, tetracaine, tolicaine, trimecaine and their salts.

- В качестве «антиоксиданта» можно упомянуть глутатион, эллаговую кислоту, спермин, ресвератрол, ретинол, L-карнитин, полиолы, полифенолы, флавонолы, теафлавины, катехины, кофеин, убихинол, убихинон, альфа-липоевую кислоту.- As an "antioxidant" we can mention glutathione, ellagic acid, spermine, resveratrol, retinol, L-carnitine, polyols, polyphenols, flavonols, theaflavins, catechins, caffeine, ubiquinol, ubiquinone, alpha-lipoic acid.

- В качестве «аминокислот» можно упомянуть аргинин, изолейцин, лейцин, лизин, глицин, валин, треонин, пролин, метионин, гистидин, фенилаланин, триптофан, цистеин.- As "amino acids" we can mention arginine, isoleucine, leucine, lysine, glycine, valine, threonine, proline, methionine, histidine, phenylalanine, tryptophan, cysteine.

В качестве «витаминов» можно упомянуть витамины Е, А, С, В и, в частности, витамины В4, В5, В6, В8, В9, В7, В12 и, предпочтительно, пиридоксин.As "vitamins" we can mention vitamins E, A, C, B and, in particular, vitamins B4, B5, B6, B8, B9, B7, B12 and, preferably, pyridoxine.

- В качестве «минералов» можно упомянуть соли цинка, магния, кальция, калия, марганца, натрия, меди.- As “minerals” we can mention salts of zinc, magnesium, calcium, potassium, manganese, sodium, copper.

- В качестве «коферментов» можно упомянуть коферменты Q10, CoA, NAD, NADP.- As “coenzymes” we can mention coenzymes Q10, CoA, NAD, NADP.

- В качестве «адренергического производного» можно упомянуть адреналин и норадреналин.- As an "adrenergic derivative" we can mention adrenaline and noradrenaline.

Наконец, следует понимать, что все указанные числовые значения должны рассматриваться не строго, а приблизительно в соответствии с общей Конвенцией, то есть последняя цифра, указанная в числовых значениях, соответствует точности измерения. Например, для молярной массы 0,04 МДа погрешность составляет 0,035-0,044 МДа.Finally, it should be understood that all the indicated numerical values should not be considered strictly, but approximately in accordance with the general Convention, i.e. the last figure indicated in the numerical values corresponds to the measurement accuracy. For example, for a molar mass of 0.04 MDa, the error is 0.035-0.044 MDa.

Способ согласно изобретениюThe method according to the invention

Как указано выше, в настоящем тексте описан способ получения водного геля, требующего обеспечения, с одной стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере один сшитый гликозаминогликан, также называемый «сшитый гликозаминогликан HMW», поскольку он получен из несшитого гликозаминогликана с высокой молярной массой и сшивающего агента, и, с другой стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан с низкой молярной массой, называемый «несшитый гликозаминогликан LMW», и образования гомогенной смеси всех или части указанных растворов.As stated above, the present text describes a method for producing an aqueous gel, which requires providing, on the one hand, an aqueous solution containing at least one cross-linked glycosaminoglycan, also called "cross-linked HMW glycosaminoglycan" since it is obtained from a non-cross-linked glycosaminoglycan with a high molar mass and a cross-linking agent, and, on the other hand, an aqueous solution containing at least one non-cross-linked glycosaminoglycan with a low molar mass, called "non-cross-linked LMW glycosaminoglycan", and forming a homogeneous mixture of all or part of said solutions.

Гликозаминогликаны, применяемые в способе согласно изобретению, могут быть выбраны из гиалуроновой кислоты, гепарозана, хондроитина сульфата, дерматана сульфата, кератана сульфата и их смесей.The glycosaminoglycans used in the method according to the invention can be selected from hyaluronic acid, heparosan, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate and mixtures thereof.

Гликозаминогликаны, применяемые в способе согласно изобретению, могут иметь одинаковую или различную химическую природу.The glycosaminoglycans used in the method according to the invention may have the same or different chemical nature.

В конкретном варианте осуществления гликозаминогликаны, применяемые в способе согласно изобретению, имеют одинаковую химическую природу и предпочтительно представляют собой гиалуроновую кислоту.In a particular embodiment, the glycosaminoglycans used in the method according to the invention have the same chemical nature and are preferably hyaluronic acid.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения водного геля, требующего обеспечения, с одной стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере одну сшитую гиалуроновую кислоту, также называемую «сшитая HA HMW», поскольку она получена из несшитой гиалуроновой кислоты с высокой молярной массой и сшивающего агента, и, с другой стороны, водного раствора, содержащего по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту с низкой молярной массой, называемую «несшитая HA LMW», и образования гомогенной смеси всех или части указанных растворов,More particularly, the present invention relates to a method for producing an aqueous gel, which requires providing, on the one hand, an aqueous solution containing at least one cross-linked hyaluronic acid, also called "cross-linked HA HMW" since it is obtained from a non-cross-linked hyaluronic acid with a high molar mass and a cross-linking agent, and, on the other hand, an aqueous solution containing at least one non-cross-linked hyaluronic acid with a low molar mass, called "non-cross-linked HA LMW", and forming a homogeneous mixture of all or part of said solutions,

характеризующемуся тем, что он включает применение гиалуроновой кислоты в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 2:1.characterized in that it includes the use of hyaluronic acid in a weight ratio of "non-crosslinked HA LMW" to "HA HMW" from 1:3 to 2:1.

В конкретном варианте осуществления гиалуроновые кислоты, применяемые в способе изобретения, не являются химически модифицированными.In a particular embodiment, the hyaluronic acids used in the method of the invention are not chemically modified.

Как указывалось ранее, в способе согласно изобретению применяют эти гликозаминогликаны и предпочтительно эти гиалуроновые кислоты в форме водных растворов, в частности, как определено на стадиях а) и b) способа согласно изобретению.As indicated previously, the method according to the invention uses these glycosaminoglycans and preferably these hyaluronic acids in the form of aqueous solutions, in particular as defined in steps a) and b) of the method according to the invention.

Эти растворы гликозаминогликанов, в частности гиалуроновых кислот, являются предпочтительно гомогенными.These solutions of glycosaminoglycans, in particular hyaluronic acids, are preferably homogeneous.

Они могут быть получены в соответствии с традиционным способом, например, путем солюбилизации и/или разбавления гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, сшитой или несшитой, в водной среде, такой как фосфатно-солевой буфер. Эти получения предпочтительно проводят при комнатной температуре, предпочтительно при температуре от 15 до 25°С, при механическом или ручном перемешивании.They can be prepared according to a conventional method, for example by solubilizing and/or diluting a glycosaminoglycan, in particular hyaluronic acid, cross-linked or not, in an aqueous medium such as phosphate-buffered saline. These preparations are preferably carried out at room temperature, preferably at a temperature of 15 to 25°C, with mechanical or manual stirring.

Стадия а)Stage a)

Что касается водного раствора «сшитого гликозаминогликана HMW» и, в частности «сшитой HA HMW», рассматриваемого на стадии а), то их сначала получают путем сшивания по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана, имеющего среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно от 1,00 до 4,00 МДа, с по меньшей мере одним сшивающим агентом; и, в частности, их сначала получают путем сшивания по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно от 1,00 до 4,00 МДа, с по меньшей мере одним сшивающим агентом.With regard to the aqueous solution of "cross-linked HMW glycosaminoglycan" and in particular "cross-linked HMW HA" considered in step a), they are first obtained by cross-linking at least one non-cross-linked glycosaminoglycan having a weight-average molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably from 1.00 to 4.00 MDa, with at least one cross-linking agent; and in particular they are first obtained by cross-linking at least one non-cross-linked hyaluronic acid having a weight-average molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably from 1.00 to 4.00 MDa, with at least one cross-linking agent.

Осуществление такого сшивания явно входит в компетенцию специалиста в области техники.Carrying out such stitching is clearly within the competence of a specialist in the field of technology.

Предпочтительно сшивающий агент вводят со степенью сшивания 8 мас.% или менее, предпочтительно 5 % или менее, более предпочтительно менее 2 %.Preferably, the crosslinking agent is introduced at a crosslinking degree of 8% by mass or less, preferably 5% or less, more preferably less than 2%.

Предпочтительно сшивающий агент вводят в молярном соотношении в расчете на общее количество молей звеньев гликозаминогликана, в частности в расчете на общее количество молей звеньев гиалуроновой кислоты, составляющему от 0,001 до 0,25.Preferably, the crosslinking agent is introduced in a molar ratio based on the total number of moles of glycosaminoglycan units, in particular based on the total number of moles of hyaluronic acid units, of from 0.001 to 0.25.

Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления указанную «сшитую HA HMW» получают со степенью сшивания 8 мас.% или менее, предпочтительно 5 % и менее и более предпочтительно менее 2 %.Thus, according to a preferred embodiment, said “crosslinked HA HMW” is obtained with a degree of crosslinking of 8% by weight or less, preferably 5% or less, and more preferably less than 2%.

Это сшивание проводят при различных температурах и времени для получения ожидаемой степени модификации.This crosslinking is carried out at different temperatures and times to obtain the expected degree of modification.

Таким образом, сшивание, осуществляемое при комнатной температуре, то есть температуре в диапазоне от 15 до 25°С, может потребовать времени реакции более 5 ч или даже 10 ч или более.Thus, crosslinking carried out at room temperature, i.e. a temperature in the range of 15 to 25°C, may require a reaction time of more than 5 h or even 10 h or more.

С другой стороны, сшивание, стимулируемое с помощью стимулирующего элемента, такого как нагревание, УФ-облучение, микроволновое воздействие или катализатор, предпочтительно с помощью нагревания, может иметь значительно повышенную степень сшивания и продолжительность менее 5 часов.On the other hand, crosslinking stimulated by a stimulating element such as heating, UV irradiation, microwave action or a catalyst, preferably by heating, can have a significantly increased degree of crosslinking and a duration of less than 5 hours.

В конкретном варианте осуществления сшивание несшитого гликозаминогликана, в частности несшитой гиалуроновой кислоты, с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа проводят при температуре более 40°С, предпочтительно более 50°С, более предпочтительно в диапазоне от 45 до 60°С или еще более предпочтительно от 50 до 55°С.In a particular embodiment, the crosslinking of a non-crosslinked glycosaminoglycan, in particular non-crosslinked hyaluronic acid, with a molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, is carried out at a temperature of more than 40°C, preferably more than 50°C, more preferably in the range of 45 to 60°C, or even more preferably from 50 to 55°C.

Такое сшивание предпочтительно имеет продолжительность от 30 до 300 минут, предпочтительно от 100 до 240 минут.Such crosslinking preferably has a duration of 30 to 300 minutes, preferably 100 to 240 minutes.

В особенно предпочтительном варианте осуществления сшивание несшитой гиалуроновой кислоты с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа проводят при комнатной температуре, то есть температуре в диапазоне от 15 до 25°С.In a particularly preferred embodiment, the crosslinking of non-crosslinked hyaluronic acid with a molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, is carried out at room temperature, i.e. a temperature in the range of 15 to 25°C.

Такое сшивание предпочтительно имеет время реакции более 5 ч или даже более 10 ч, в частности от 10 до 100 ч.Such crosslinking preferably has a reaction time of more than 5 hours or even more than 10 hours, in particular from 10 to 100 hours.

Предпочтительно, сшивающий агент, применяемый в способе согласно изобретению, представляет собой эпоксидный сшивающий агент, предпочтительно диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (БДДЭ).Preferably, the crosslinking agent used in the method according to the invention is an epoxy crosslinking agent, preferably 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE).

В конкретном варианте осуществления, где применяемый сшивающий агент представляет собой би- или полифункциональный эпоксидный сшивающий агент, такой как БДДЭ, рН водной среды подщелачивают или подкисляют для активации реакции сшивания. Согласно конкретному варианту осуществления водную среду подщелачивают, как правило, раствором, содержащим гидроксид натрия, и предпочтительно pH водной среды составляет 11 или более, более предпочтительно pH водной среды составляет 12 или более.In a particular embodiment, where the crosslinking agent used is a bi- or polyfunctional epoxy crosslinking agent, such as BDDE, the pH of the aqueous medium is alkalized or acidified to activate the crosslinking reaction. According to a particular embodiment, the aqueous medium is alkalized, typically with a solution containing sodium hydroxide, and preferably the pH of the aqueous medium is 11 or more, more preferably the pH of the aqueous medium is 12 or more.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления концентрацию «сшитого HMW гликозаминогликана», более конкретно «сшитой HMW HA», водной среды со стадии a) регулируют для образования в конце стадии c) водного геля, в котором концентрация «сшитого HMW гликозаминогликана», более конкретно «сшитой HMW HA», составляет по меньшей мере 5 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.According to a preferred embodiment, the concentration of the "cross-linked HMW glycosaminoglycan", more particularly the "cross-linked HMW HA", of the aqueous medium from step a) is adjusted to form, at the end of step c), an aqueous gel in which the concentration of the "cross-linked HMW glycosaminoglycan", more particularly the "cross-linked HMW HA", is at least 5 mg/g based on the total weight of said aqueous gel.

Предпочтительно, в способе согласно изобретению применяют водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «сшитой HA HMW».Preferably, the method according to the invention uses an aqueous solution containing from 5 to 15 mg/g of “cross-linked HA HMW”.

Стадия b)Stage b)

Стадия b) способа по изобретению требует, со своей стороны, чтобы водный раствор содержал по меньшей мере один «несшитый гликозаминогликан LMW», в частности по меньшей мере одну «несшитую HA LMW».Step b) of the process according to the invention requires, for its part, that the aqueous solution contains at least one “non-crosslinked LMW glycosaminoglycan”, in particular at least one “non-crosslinked LMW HA”.

Предпочтительно, концентрацию «несшитого гликозаминогликана LMW», в частности «несшитой HA LMW», рассматриваемого в водном растворе на стадии b), регулируют для образования в конце стадии c) водного геля, в котором концентрация «несшитого гликозаминогликана LMW», в частности концентрация «несшитой HA LMW», составляет по меньшей мере 3 мг/г, предпочтительно 10 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.Preferably, the concentration of the "non-crosslinked glycosaminoglycan LMW", in particular the "non-crosslinked HA LMW", considered in the aqueous solution in step b) is adjusted to form, at the end of step c), an aqueous gel in which the concentration of the "non-crosslinked glycosaminoglycan LMW", in particular the concentration of the "non-crosslinked HA LMW", is at least 3 mg/g, preferably 10 mg/g, based on the total weight of said aqueous gel.

Предпочтительно, в способе согласно изобретению применяют водный раствор, содержащий от 50 до 60 мг/г «несшитой HA LMW».Preferably, the method according to the invention uses an aqueous solution containing from 50 to 60 mg/g of “non-crosslinked HA LMW”.

Как подробно описано ниже, способ согласно изобретению может также включать применение гликозаминогликана, в частности гиалуроновой кислоты, отличного от тех, которые определены для стадий a) и b).As described in detail below, the method according to the invention may also comprise the use of a glycosaminoglycan, in particular hyaluronic acid, other than those defined for steps a) and b).

Стадия с)Stage c)

Как описано выше, стадия c) заключается в образовании гомогенной смеси из по меньшей мере некоторых или всех растворов, полученных на стадиях a) и b).As described above, step c) consists of forming a homogeneous mixture from at least some or all of the solutions obtained in steps a) and b).

Образование гомогенной смеси, рассматриваемое на стадии c), предпочтительно включает по меньшей мере одну стадию гомогенизации.The formation of a homogeneous mixture, as considered in step c), preferably comprises at least one homogenization step.

Гомогенизацию предпочтительно проводят в щадящих условиях для предотвращения деградации применяемых цепей гликозаминогликана.Homogenization is preferably carried out under gentle conditions to prevent degradation of the glycosaminoglycan chains used.

Эта стадия c) образования гомогенной смеси по меньшей мере одного сшитого гликозаминогликана и по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана, в частности по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты и по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, может осуществляться в соответствии с обычными способами гомогенизации, такими как трехмерное перемешивание, перемешивание с помощью лопастной мешалки, перемешивание с помощью шпателя и/или стадия экструзии через по меньшей мере одну сетку.This step c) of forming a homogeneous mixture of at least one cross-linked glycosaminoglycan and at least one non-cross-linked glycosaminoglycan, in particular at least one cross-linked hyaluronic acid and at least one non-cross-linked hyaluronic acid, can be carried out according to conventional homogenisation methods, such as three-dimensional mixing, mixing with a paddle mixer, mixing with a spatula and/or an extrusion step through at least one mesh.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стадия c) включает по меньшей мере одну стадию экструзии полученной смеси через по меньшей мере одну сетку. Регулирование характеристик такой сетки является частью общих знаний специалиста в области техники. Традиционно их выбирают в зависимости от свойств, ожидаемых для образуемой смеси, и с учетом соответствующих особенностей растворов гликозаминогликанов, в частности растворов гиалуроновых кислот, которые объединяют вместе.According to a preferred embodiment, step c) comprises at least one step of extruding the obtained mixture through at least one mesh. The adjustment of the characteristics of such a mesh is part of the general knowledge of a person skilled in the art. They are traditionally selected depending on the properties expected for the mixture to be formed and taking into account the relevant characteristics of the glycosaminoglycan solutions, in particular the hyaluronic acid solutions, which are combined together.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления эта стадия c), таким образом, включает по меньшей мере одну стадию гомогенизации с помощью лопастной мешалки, за которой следует по меньшей мере одна стадия экструзии смеси через по меньшей мере одну сетку.According to a particular embodiment, this step c) thus comprises at least one step of homogenisation using a paddle mixer, followed by at least one step of extruding the mixture through at least one mesh.

Гомогенизация считается удовлетворительной, когда полученный гель имеет макроскопически, невооруженным глазом и на ощупь однородный цвет, однородную вязкость и не содержит агломератов. Продолжительность гомогенизации оценивается специалистом в данной области техники в соответствии с его общими знаниями. Указанная гомогенизация может включать несколько циклов, необязательно разнесенных по времени фазой покоя, в частности, для оценки качества гомогенизации гликозаминогликанов, в частности гиалуроновых кислот, в указанном геле.Homogenization is considered satisfactory when the resulting gel has a uniform color macroscopically, to the naked eye and to the touch, uniform viscosity and does not contain agglomerates. The duration of homogenization is assessed by a person skilled in the art in accordance with his general knowledge. Said homogenization may include several cycles, not necessarily separated in time by a resting phase, in particular for assessing the quality of homogenization of glycosaminoglycans, in particular hyaluronic acids, in said gel.

Более конкретно, стадия c) согласно настоящему изобретению может включать гомогенизацию с общей продолжительностью менее 200 минут, предпочтительно менее 150 минут или даже продолжительностью в диапазоне от 5 до 100 минут.More specifically, step c) according to the present invention may comprise homogenization with a total duration of less than 200 minutes, preferably less than 150 minutes or even a duration in the range of 5 to 100 minutes.

Несшитый HMW гликозаминогликан, в частности несшитая HMW гиалуроновая кислотаNon-crosslinked HMW glycosaminoglycan, in particular non-crosslinked HMW hyaluronic acid

В конкретном варианте осуществления способ согласно изобретению также предусматривает применение по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемого «несшитый HMW гликозаминогликан», в частности применение по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 MДa, так называемой «несшитой HA HMW».In a particular embodiment, the method according to the invention also comprises the use of at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, referred to as "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan", in particular the use of at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a weight average molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, referred to as "non-crosslinked HMW HA".

Предпочтительно, указанный «несшитый HMW гликозаминогликан», в частности указанная «несшитая HA HMW», осуществляют в водном растворе. Этот водный раствор может отличаться или быть схожим с одним из водных растворов, рассматриваемых на стадиях а) и b).Preferably, said "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan", in particular said "non-crosslinked HMW HA", is carried out in an aqueous solution. This aqueous solution may be different from or similar to one of the aqueous solutions considered in steps a) and b).

Согласно альтернативному варианту осуществления весь или часть указанного «несшитого гликозаминогликана HMW», в частности указанной «несшитой HA HMW» применяют в водном растворе на стадии b).According to an alternative embodiment, all or part of said "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan", in particular said "non-crosslinked HMW HA", is used in an aqueous solution in step b).

Согласно другому альтернативному варианту осуществления, весь или часть указанного «несшитого HMW гликозаминогликана», в частности указанной «несшитой HA HMW», применяют в форме водного раствора, отличного от водных растворов со стадий a) и b). Согласно этому альтернативному варианту водный раствор, содержащий весь или часть указанного «несшитого HMW гликозаминогликана», в частности указанной «несшитой HA HMW», и водный раствор со стадии b) смешивают одновременно или последовательно с водным раствором со стадии a).According to another alternative embodiment, all or part of said "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan", in particular said "non-crosslinked HMW HA", is used in the form of an aqueous solution different from the aqueous solutions of steps a) and b). According to this alternative embodiment, an aqueous solution containing all or part of said "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan", in particular said "non-crosslinked HMW HA", and the aqueous solution of step b) are mixed simultaneously or sequentially with the aqueous solution of step a).

Предпочтительно, в способе согласно изобретению на стадии b) применяют водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «несшитой HA HMW».Preferably, in the method according to the invention, in step b) an aqueous solution containing from 5 to 15 mg/g of “non-crosslinked HMW HA” is used.

Вспомогательное веществоExcipient

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, как описано выше, дополнительно включающему осуществление по меньшей мере одного вспомогательного вещества, выбранного из группы, состоящей из анестетиков, антиоксидантов, аминокислот, витаминов, минералов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, нуклеозидов, коферментов, адренергических производных, натрия дигидрофосфата моногидрата и/или дигидрата и хлорида натрия.In a particular embodiment, the present invention relates to a method as described above, further comprising the implementation of at least one auxiliary substance selected from the group consisting of anesthetics, antioxidants, amino acids, vitamins, minerals, nucleic acids, nucleotides, nucleosides, coenzymes, adrenergic derivatives, sodium dihydrogen phosphate monohydrate and/or dihydrate and sodium chloride.

СтерилизацияSterilization

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, для поддержания стерильности указанного геля, применяемые исходные материалы являются стерильными, и получение указанного геля, включая его упаковку в устройство для введения, осуществляют в контролируемых атмосферных условиях.Thus, according to one aspect of the present invention, in order to maintain the sterility of said gel, the starting materials used are sterile, and the production of said gel, including its packaging in the device for administration, is carried out under controlled atmospheric conditions.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения стерильного и инъекционного водного геля, включающему по меньшей мере одну стадию, заключающуюся в применении водного геля, полученного способом согласно изобретению, или водного геля, как определено в настоящем изобретении, и стадию стерилизации, в частности в автоклаве.According to another aspect, the present invention relates to a method for producing a sterile and injectable aqueous gel, comprising at least one step consisting of using an aqueous gel obtained by the method according to the invention, or an aqueous gel as defined in the present invention, and a sterilization step, in particular in an autoclave.

Более конкретно, способ получения водного геля согласно изобретению включает по меньшей мере стадии, состоящие в:More specifically, the method for producing an aqueous gel according to the invention comprises at least the steps of:

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере один несшитый гликозаминогликан с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, называемый «несшитый гликозаминогликан LMW»;b) providing an aqueous solution comprising at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa, more preferably 0.08 to 0.15 MDa, even more preferably 0.08 to 0.10 MDa, referred to as "non-crosslinked glycosaminoglycan LMW";

с) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий а) и b), которую стерилизуют, в частности в автоклаве.c) forming a homogeneous mixture of all or part of the solutions specified in steps a) and b), which is sterilized, in particular in an autoclave.

b) обеспечении водного раствора, содержащего по меньшей мере одну несшитую гиалуроновую кислоту, называемую «несшитая HA LMW», имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа; более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа;b) providing an aqueous solution comprising at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA LMW", having a weight average molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa; more preferably 0.08 to 0.15 MDa;

c) образовании гомогенной смеси всех или части указанных растворов со стадий а) и b), которую стерилизуют, в частности в автоклаве,c) the formation of a homogeneous mixture of all or part of the solutions specified in steps a) and b), which is sterilized, in particular in an autoclave,

Указанную стерилизацию предпочтительно проводят на продукте, уже упакованном в устройство для введения, обычно на шприце.Said sterilization is preferably carried out on the product already packaged in the device for administration, usually a syringe.

Таким образом, предпочтительно, водный гель, получаемый способом согласно изобретению, упаковывают в шприц до его стерилизации.Thus, preferably, the aqueous gel obtained by the method according to the invention is packaged in a syringe prior to its sterilization.

Предпочтительно, указанный способ включает одну стадию стерилизации.Preferably, said method comprises one sterilization step.

Предпочтительно, указанную стадию стерилизации проводят тепловым способом, например, в автоклаве, в частности при температуре от 120 до 140°С.Preferably, said sterilization step is carried out by a thermal method, for example, in an autoclave, in particular at a temperature of 120 to 140°C.

В частности, стадию стерилизации проводят в автоклаве, во влажных тепловых условиях, при стабильной температуре 121°С или более, предпочтительно от 121 до 135°С с F0 более 15 (показатель стерилизации). Согласно настоящему изобретению показатель стерилизации F0 соответствует времени, в минутах, необходимому при 121°С для инактивации 90 % популяции микроорганизмов, присутствующих в стерилизуемом продукте.In particular, the sterilization step is carried out in an autoclave, under humid thermal conditions, at a stable temperature of 121°C or more, preferably from 121 to 135°C with an F0 greater than 15 (sterilization index). According to the present invention, the sterilization index F0 corresponds to the time, in minutes, required at 121°C to inactivate 90% of the population of microorganisms present in the product to be sterilized.

Водный гельWater gel

Как упоминалось выше, одним из аспектов настоящего изобретения является водный гель на основе гиалуроновой кислоты, содержащий сшитую гиалуроновую кислоту, характеризующийся тем, что указанный гель содержит по меньшей мере:As mentioned above, one aspect of the present invention is an aqueous gel based on hyaluronic acid, containing cross-linked hyaluronic acid, characterized in that said gel contains at least:

и характеризующийся тем, что все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % и менее, предпочтительно3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее, соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.and characterized in that all water-soluble hyaluronic acids have a modification degree of 5% or less, preferably3% or less, more preferably 1% or less, the corresponding percentage values for soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution with pH 7.2 containing 0.02% NaN₃, at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass-average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase of sodium nitrate with a pH of 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению представляет собой мягкий гель, то есть гель, имеющий фазовый угол (δ) от 15° до 50° и модуль упругости G' 150 Пa или меньше, предпочтительно от 20 до 150 Пa, измеренные при напряжении 5 Пa при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2) с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм) с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или меньше, предпочтительно меньше 15 Н, измеренную при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внутренним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.In a particular embodiment, the aqueous gel according to the invention is a soft gel, i.e. a gel having a phase angle (δ) from 15° to 50° and an elastic modulus G' of 150 Pa or less, preferably from 20 to 150 Pa, measured at a stress of 5 Pa at room temperature using a rheometer (TA Instruments DHR2) with a cone/plate geometry (cone angle 1°/plate diameter 40 mm) using an oscillatory sweep voltage with a frequency of 1 Hz, and an extrusion force of 18 N or less, preferably less than 15 N, measured at a fixed speed of about 12.5 mm/min, in syringes with an internal diameter of 6.3 mm or more, with a needle with an external diameter of 0.3 mm (30 G) or less and a length of ½", at room temperature.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению содержит от 35 до 65 мас.% «sHA LMW» в расчете на общую массу указанного водного геля.In a particular embodiment, the aqueous gel according to the invention comprises from 35 to 65% by weight of “sHA LMW” based on the total weight of said aqueous gel.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA LMW», имеет среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, предпочтительно от 0,04 до 0,15 МДа.In a particular embodiment, in the aqueous gel according to the invention, said water-soluble hyaluronic acid, referred to as “sHA LMW”, has a weight average molar mass in the range of 0.04 to 0.20 MDa, preferably 0.04 to 0.15 MDa.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA HMW», имеет среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа.In a particular embodiment, in the aqueous gel according to the invention, said water-soluble hyaluronic acid, referred to as "sHA HMW", has a weight average molar mass of greater than 0.30 MDa and less than or equal to 4.00 MDa.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению содержит от 10 до 30 мас.%, предпочтительно от 15 до 20 мас.% «sHA HMW» в расчете на общую массу указанного водного геля.In a particular embodiment, the aqueous gel according to the invention comprises from 10 to 30 wt.%, preferably from 15 to 20 wt.% “sHA HMW”, based on the total weight of said aqueous gel.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная сшитая гиалуроновая кислота присутствует в количестве по меньшей мере 5 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.In a particular embodiment, in the aqueous gel according to the invention, said cross-linked hyaluronic acid is present in an amount of at least 5 mg/g based on the total weight of said aqueous gel.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению указанная водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA LMW», присутствует в количестве по меньшей мере 3 мг/г, предпочтительно 10 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.In a particular embodiment, in the aqueous gel according to the invention, said water-soluble hyaluronic acid, referred to as “sHA LMW”, is present in an amount of at least 3 mg/g, preferably 10 mg/g, based on the total weight of said aqueous gel.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению общая концентрация гиалуроновой кислоты составляет от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на общую массу указанного водного геля.In a particular embodiment, in the aqueous gel according to the invention, the total concentration of hyaluronic acid is from 10 to 40 mg/g, preferably from 15 to 35 mg/g, more preferably from 20 to 30 mg/g, based on the total weight of said aqueous gel.

В конкретном варианте осуществления в водном геле согласно изобретению степень модификации всех гиалуроновых кислот составляет 5 % или меньше, предпочтительно 3 % или меньше, более предпочтительно 1 % или меньше.In a particular embodiment, in the aqueous gel according to the invention, the degree of modification of all hyaluronic acids is 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less.

Согласно конкретному варианту осуществления в водном геле, как определено в изобретении:According to a specific embodiment, in an aqueous gel as defined in the invention:

- сшитая гиалуроновая кислота присутствует в количестве в диапазоне от 6 до 12 мг/г в расчете на общую массу водного геля,- cross-linked hyaluronic acid is present in an amount in the range of 6 to 12 mg/g based on the total weight of the aqueous gel,

- водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA LMW», присутствует в количестве в диапазоне от 12 до 20 мг/г в расчете на общую массу водного геля,- water-soluble hyaluronic acid, called "sHA LMW", is present in an amount ranging from 12 to 20 mg/g based on the total weight of the aqueous gel,

- водорастворимая гиалуроновая кислота, называемая «sHA HMW», присутствует в количестве в диапазоне от 3 до 6 мг/г в расчете на общую массу водного геля,- water-soluble hyaluronic acid, called "sHA HMW", is present in an amount ranging from 3 to 6 mg/g based on the total weight of the aqueous gel,

причем указанный водный гель содержит общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г в расчете на общую массу водного геля.wherein said aqueous gel contains a total concentration of hyaluronic acid from 20 to 30 mg/g based on the total weight of the aqueous gel.

В конкретном варианте осуществления водный гель согласно изобретению подвергают стадии тепловой стерилизации, например, в автоклаве.In a particular embodiment, the aqueous gel according to the invention is subjected to a heat sterilization step, for example in an autoclave.

Известно, что гиалуроновая кислота очень чувствительна к сильному кислотному и щелочному рН, высоким температурам (например, во время тепловой стерилизации), окислению (например, активными формами кислорода) и ферментативной активности (Stern R, Kogan G, Jedrzejas MJ, et al. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnol Adv 2007;25:537-57).It is known that hyaluronic acid is very sensitive to strong acidic and alkaline pH, high temperatures (e.g. during heat sterilization), oxidation (e.g. by reactive oxygen species) and enzymatic activity (Stern R, Kogan G, Jedrzejas MJ, et al. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnol Adv 2007;25:537-57).

В результате, способ получения, в частности условия сшивания, применяемые для получения композиций, содержащих сшитую гиалуроновую кислоту, способствуют деградации цепей гиалуроновой кислоты с высвобождением растворимой LMW гиалуроновой кислоты. Такие фрагменты LMW гиалуроновой кислоты по меньшей мере частично модифицированы применяемым сшивающим агентом, таким как БДДЭ.As a result, the production method, in particular the crosslinking conditions used to produce compositions containing crosslinked hyaluronic acid, promote the degradation of hyaluronic acid chains with the release of soluble LMW hyaluronic acid. Such LMW hyaluronic acid fragments are at least partially modified by the crosslinking agent used, such as BDDE.

Напротив, растворимая гиалуроновая кислота из несшитой LMW гиалуроновой кислоты, добавленной в процессе получения, не модифицируется БДДЭ.In contrast, soluble hyaluronic acid from non-crosslinked LMW hyaluronic acid added during the production process is not modified by BDDE.

Модификация с помощью БДДЭ может быть визуализирована путем измерения степени модификации (MOD). В этом контексте, чем выше MOD растворимой гиалуроновой кислоты, тем выше доля фрагментов LMW гиалуроновой кислоты, образуемых в процессе получения исследуемого геля, и тем ниже доля растворимой гиалуроновой кислоты из LMW гиалуроновой кислоты, добавленной в процессе получения.Modification by BDDE can be visualized by measuring the degree of modification (MOD). In this context, the higher the MOD of soluble hyaluronic acid, the higher the proportion of LMW hyaluronic acid fragments formed during the preparation of the gel under study, and the lower the proportion of soluble hyaluronic acid from LMW hyaluronic acid added during the preparation.

Это проиллюстрировано в примере 7.This is illustrated in example 7.

Вышеупомянутое расщепление гиалуроновой кислоты объясняет то, что молярная масса гиалуроновой кислоты, добавленной в гель до стерилизации с использованием тепла, выше, чем молярная масса растворимой гиалуроновой кислоты, измеренная в стерилизованном геле.The above-mentioned degradation of hyaluronic acid explains why the molar mass of hyaluronic acid added to the gel before heat sterilization is higher than the molar mass of soluble hyaluronic acid measured in the sterilized gel.

Такая чувствительность также характерна и для других гликозаминогликанов.This sensitivity is also characteristic of other glycosaminoglycans.

Практически «sHA» соответствует:In practice, "sHA" corresponds to:

- несшитой HA LMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a); и- non-crosslinked HA LMW added during the gel preparation process after crosslinking step a); and

- когда присутствует, несшитой HA HMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a); и- when present, non-crosslinked HA HMW added during the gel preparation process after the crosslinking step a); and

- фрагментам HA, высвобожденным в процессе получения геля, причем указанные фрагменты HA по меньшей мере частично модифицированы сшивающим агентом, таким как БДДЭ.- HA fragments released during the gel production process, wherein said HA fragments are at least partially modified with a crosslinking agent such as BDDE.

Таким образом, количество «sHA LMW» по меньшей мере равно количеству:Thus, the number of "sHA LMW" is at least equal to the number of:

- когда присутствует, несшитой HA HMW, добавленной в процессе получения геля после стадии сшивания a).- when present, non-crosslinked HA HMW added during the gel preparation process after crosslinking step a).

- Напротив, «nsHA» соответствует сшитой HA.- On the contrary, "nsHA" corresponds to cross-linked HA.

Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:According to a particular embodiment, the aqueous gel according to the invention comprises at least:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.04 to 0.20 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 30 to 70 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

- необязательно, водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу более 0,30 МДа и меньше или равную 4,00 МДа, называемую «sHA HMW»,- optionally, a water-soluble hyaluronic acid having a weight average molar mass greater than 0.30 MDa and less than or equal to 4.00 MDa, referred to as "sHA HMW",

и все водорастворимые гиалуроновые кислоты имеют степень модификации 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее,and all water-soluble hyaluronic acids have a modification degree of 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less,

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Согласно конкретному варианту осуществления водный гель согласно изобретению содержит по меньшей мере:the corresponding percentage values for soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution at pH 7.2 containing 0.02% NaN ₃ at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase sodium nitrate with a pH of 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min. According to a particular embodiment, the aqueous gel according to the invention comprises at least:

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,15 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 30 до 70 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.04 to 0.15 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 30 to 70 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин.the corresponding percentage values for soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution at pH 7.2 containing 0.02% NaN ₃ at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase sodium nitrate with pH 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min.

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,02 до 0,30 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 35 до 65 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.02 to 0.30 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 35 to 65 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 35 до 65 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.04 to 0.20 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 35 to 65 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

- водорастворимую гиалуроновую кислоту, имеющую среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,15 МДа, называемую «sHA LMW», в количестве от 35 до 65 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты; и- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.04 to 0.15 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 35 to 65 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

соответствующие процентные значения для растворимых гиалуроновых кислот определяют путем разбавления водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02% NaN₃, при 25°С в течение 5 дней и его центрифугирования при 4400 об/мин в течение 10 мин и фильтрации через 0,45 мм указанного разбавленного геля с получением фильтрата, затем анализа указанного фильтрата с помощью прибора для эксклюзионной хроматографии, оснащенного детектором многоуглового рассеяния света (MALS) и рефрактометрическим (RI) детектором с инкрементом показателя преломления (dn/dc), установленным на уровне 0,165 мл/г, и насосной станции жидкостного хроматографа, оснащенной двойным набором эксклюзионных колонок, адаптированных для молекул, имеющих среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,001 Да до 20 МДа, с подвижной фазой нитрата натрия с pH 7,2 при скорости потока 0,3 мл/мин. Как указано выше, настоящее изобретение также относится к водному гелю, получаемому согласно способу по изобретению.the corresponding percentage values for soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution at pH 7.2 containing 0.02% NaN ₃ at 25°C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile phase sodium nitrate with a pH of 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min. As indicated above, the present invention also relates to an aqueous gel obtainable according to the method of the invention.

В конце стадии c) получают гомогенный водный гель, содержащий по меньшей мере один «несшитый LMW гликозаминогликан» и «HMW гликозаминогликан», включая по меньшей мере один «сшитый HMW гликозаминогликан».At the end of step c), a homogeneous aqueous gel is obtained containing at least one “non-crosslinked LMW glycosaminoglycan” and an “HMW glycosaminoglycan”, including at least one “crosslinked HMW glycosaminoglycan”.

Предпочтительно водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, содержит общую концентрацию гликозаминогликана в диапазоне от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.Preferably, the aqueous gel obtainable by the method according to the invention contains a total concentration of glycosaminoglycan in the range of 10 to 40 mg/g, preferably 15 to 35 mg/g, more preferably 20 to 30 mg/g, based on its total weight.

Водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, также может характеризоваться массовым соотношением «несшитого гликозаминогликана LMW» к «гликозаминогликану HMW» в диапазоне от 1:4 до 4:1, предпочтительно от 1:3 до 5:3, более предпочтительно от 1:2 до 2:1.The aqueous gel obtainable by the method according to the invention may also be characterized by a weight ratio of "non-crosslinked LMW glycosaminoglycan" to "HMW glycosaminoglycan" in the range of from 1:4 to 4:1, preferably from 1:3 to 5:3, more preferably from 1:2 to 2:1.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный водный гель имеет степень модификации указанных гликозаминогликанов менее 5 %, предпочтительно менее 3 %, более предпочтительно менее 1 %.According to a specific embodiment, said aqueous gel has a degree of modification of said glycosaminoglycans of less than 5%, preferably less than 3%, more preferably less than 1%.

Более конкретно, в конце стадии c) получают гомогенный водный гель, содержащий по меньшей мере одну «несшитую HA LMW» и «HA HMW», включая по меньшей мере одну «сшитую HA HMW».More specifically, at the end of step c) a homogeneous aqueous gel is obtained comprising at least one “non-crosslinked HA LMW” and “HA HMW”, including at least one “crosslinked HA HMW”.

Предпочтительно водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, содержит общую концентрацию гиалуроновой кислоты в диапазоне от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.Preferably, the aqueous gel obtainable by the method according to the invention contains a total concentration of hyaluronic acid in the range of 10 to 40 mg/g, preferably 15 to 35 mg/g, more preferably 20 to 30 mg/g, based on its total weight.

В соответствии с вариантом осуществления водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, также характеризуется массовым соотношением «несшитой HA LMW» к «HA HMW» в диапазоне от 1:3 до 5:3, предпочтительно от 1:2 до 5:3.According to an embodiment, the aqueous gel obtainable by the method according to the invention is also characterized by a weight ratio of "non-crosslinked HA LMW" to "HA HMW" in the range from 1:3 to 5:3, preferably from 1:2 to 5:3.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный водный гель имеет степень модификации указанных гиалуроновых кислот 5 % или менее, предпочтительно 3 % или менее, более предпочтительно 1 % или менее.According to a particular embodiment, said aqueous gel has a modification degree of said hyaluronic acids of 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления указанный водный гель, полученный способом согласно настоящему изобретению, представляет собой мягкий гель, то есть гель, имеющий фазовый угол (δ) от 15° до 50° и модуль упругости G' 150 Пa или меньше, предпочтительно от 20 до 150 Пa, измеренные при напряжении 5 Пa при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2) с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм) с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или меньше, предпочтительно меньше 15 Н, измеренную при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внутренним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″, при комнатной температуре.According to another particular embodiment, said aqueous gel obtained by the method according to the present invention is a soft gel, i.e. a gel having a phase angle (δ) from 15° to 50° and an elastic modulus G' of 150 Pa or less, preferably from 20 to 150 Pa, measured at a stress of 5 Pa at room temperature using a rheometer (TA Instruments DHR2) with a cone/plate geometry (cone angle 1°/plate diameter 40 mm) using an oscillatory sweep voltage with a frequency of 1 Hz, and an extrusion force of 18 N or less, preferably less than 15 N, measured at a fixed speed of about 12.5 mm/min, in syringes with an internal diameter of 6.3 mm or more, with a needle with an external diameter of 0.3 mm (30 G) or less and a length of ½", at room temperature.

Согласно одному варианту осуществления указанный водный гель получают в конце способа, в котором обеспечивают:According to one embodiment, said aqueous gel is obtained at the end of a process in which:

- на стадии а) водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «сшитого гликозаминогликана HMW»;- at stage a) an aqueous solution containing from 5 to 15 mg/g of “cross-linked HMW glycosaminoglycan”;

- на стадии b) водный раствор, содержащий от 50 до 60 мг/г «несшитого гликозаминогликана LMW» и от 5 до 20 мг/г «несшитого гликозаминогликана HMW», и- in step b) an aqueous solution containing from 50 to 60 mg/g of "non-crosslinked LMW glycosaminoglycan" and from 5 to 20 mg/g of "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan", and

указанный полученный гель имеет общую концентрацию гликозаминогликана от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.The resulting gel has a total glycosaminoglycan concentration of 20 to 30 mg/g based on its total mass.

- на стадии а) водный раствор, содержащий от 5 до 15 мг/г «сшитой HA HMW»;- in step a) an aqueous solution containing from 5 to 15 mg/g of “cross-linked HA HMW”;

- на стадии b) водный раствор, содержащий от 50 до 60 мг/г «несшитой HA LMW» и от 5 до 20 мг/г «несшитой HA HMW», и- in step b) an aqueous solution containing from 50 to 60 mg/g of "non-crosslinked HA LMW" and from 5 to 20 mg/g of "non-crosslinked HA HMW", and

указанный полученный гель имеет общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу.The resulting gel has a total concentration of hyaluronic acid of 20 to 30 mg/g based on its total mass.

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую концентрацию гликозаминогликана от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу, является результатом обеспечения, в частности:A representative of the aqueous gels obtainable by the method according to the invention and having a total glycosaminoglycan concentration of 10 to 40 mg/g, preferably 15 to 35 mg/g, more preferably 20 to 30 mg/g, based on its total weight, is the result of providing, in particular:

- по меньшей мере одного сшитого гликозаминогликана, полученного из по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемого «сшитый гликозаминогликан HMW»;- at least one cross-linked glycosaminoglycan obtained from at least one non-cross-linked glycosaminoglycan with a molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, called "cross-linked HMW glycosaminoglycan";

- по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, еще более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, называемого «несшитый гликозаминогликан LMW»; и- at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a molar mass of from 0.04 to 0.30 MDa, preferably from 0.08 to 0.20 MDa, more preferably from 0.08 to 0.15 MDa, even more preferably from 0.08 to 0.10 MDa, called "non-crosslinked glycosaminoglycan LMW"; and

необязательно, по меньшей мере одного несшитого гликозаминогликана с молярной массой 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемого «несшитый гликозаминогликан HMW».optionally, at least one non-crosslinked glycosaminoglycan with a molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, referred to as "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan".

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г в расчете на его общую массу, является результатом обеспечения, в частности:A representative of aqueous gels obtained by the method in accordance with the invention and having a total concentration of hyaluronic acid from 20 to 30 mg/g based on its total mass is the result of providing, in particular:

на стадии а) водного раствора, содержащего от 5 до 15 мг/г «сшитой HA HMW»;in step a) an aqueous solution containing from 5 to 15 mg/g of “cross-linked HA HMW”;

на стадии b) водного раствора, содержащего от 50 до 60 мг/г «несшитой HA LMW» и от 5 до 20 мг/г «несшитой HA HMW».in step b) an aqueous solution containing from 50 to 60 mg/g of "non-crosslinked HA LMW" and from 5 to 20 mg/g of "non-crosslinked HA HMW".

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением, является результатом обеспечения, в частности:A representative of the aqueous gels obtained by the method according to the invention is the result of providing, in particular:

- по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты, называемой «сшитая HA HMW», полученной из несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу более 1,00 МДа, и сшивающего агента;- at least one cross-linked hyaluronic acid, called "cross-linked HA HMW", obtained from non-cross-linked hyaluronic acid having a mass-average molar mass of more than 1.00 MDa and a cross-linking agent;

- по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, называемой «несшитая HA LMW», имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,08 до 0,20 МДа; и- at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA LMW", having a mass average molar mass in the range of 0.08 to 0.20 MDa; and

- необязательно, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, называемой «несшитая HA HMW», имеющей среднемассовую молярную массу более 1,00 МДа,- optionally, at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA HMW", having a mass average molar mass greater than 1.00 MDa,

причем гиалуроновую кислоту применяют в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 2:1.moreover, hyaluronic acid is used in a mass ratio of “non-crosslinked HA LMW” to “HA HMW” from 1:3 to 2:1.

- по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты, называемой «сшитая HA HMW», полученной из несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, и сшивающего агента;- at least one cross-linked hyaluronic acid, called "cross-linked HA HMW", obtained from non-cross-linked hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 1.00 to 4.00 MDa, and a cross-linking agent;

- по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, называемой «несшитая HA LMW», имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,08 до 0,15 МДа; и- at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA LMW", having a mass average molar mass in the range of 0.08 to 0.15 MDa; and

- необязательно, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, называемой «несшитая HA HMW», имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа,- optionally, at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA HMW", having a mass average molar mass in the range of 1.00 to 4.00 MDa,

- по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты, называемой «сшитая HA HMW», полученной из несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, и сшивающего агента;- at least one cross-linked hyaluronic acid, called "cross-linked HA HMW", obtained from non-cross-linked hyaluronic acid having a mass-average molar mass of 0.50 MDa or more, and a cross-linking agent;

- по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, называемой «несшитая HA LMW», имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа; и- at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA LMW", having a mass average molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa; and

- необязательно, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, называемой «несшитая HA HMW», имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более,- optionally, at least one non-crosslinked hyaluronic acid, referred to as "non-crosslinked HA HMW", having a mass average molar mass of 0.50 MDa or more,

причем гиалуроновую кислоту применяют в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:3 до 5:3.wherein hyaluronic acid is used in a mass ratio of “non-crosslinked HA LMW” to “HA HMW” from 1:3 to 5:3.

причем гиалуроновую кислоту применяют в массовом соотношении «несшитой HA LMW» к «HA HMW» от 1:2 до 5:3.Moreover, hyaluronic acid is used in a mass ratio of “non-crosslinked HA LMW” to “HA HMW” from 1:2 to 5:3.

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на их общую массу, является результатом обеспечения, в частности:A representative of the aqueous gels obtainable by the method according to the invention and having a total concentration of hyaluronic acid from 10 to 40 mg/g, preferably from 15 to 35 mg/g, more preferably from 20 to 30 mg/g, based on their total weight, is the result of providing, in particular:

- по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты, полученной из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1,00 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемой «сшитая HA HMW», и сшивающего агента;- at least one cross-linked hyaluronic acid obtained from at least one non-cross-linked hyaluronic acid having a weight average molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1.00 MDa, more preferably in the range from 1.00 to 4.00 MDa, called "cross-linked HA HMW", and a cross-linking agent;

- по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,04 до 0,30 МДа, предпочтительно от 0,08 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,15 МДа, называемой «несшитая HA LMW»; и- at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a weight average molar mass in the range of 0.04 to 0.30 MDa, preferably 0.08 to 0.20 MDa, more preferably 0.08 to 0.15 MDa, referred to as "non-crosslinked HA LMW"; and

- необязательно, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу 0,50 МДа или более, предпочтительно более 1 МДа, более предпочтительно в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемой «несшитая HA HMW»,- optionally, at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a weight average molar mass of 0.50 MDa or more, preferably more than 1 MDa, more preferably in the range of 1.00 to 4.00 MDa, referred to as "non-crosslinked HA HMW",

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 10 до 40 мг/г в расчете на их общую массу, является результатом обеспечения, в частности:A representative of aqueous gels obtained by the method in accordance with the invention and having a total concentration of hyaluronic acid from 10 to 40 mg/g based on their total mass is the result of providing, in particular:

- по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты, полученной из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу более 1,00 МДа, называемой «сшитая HA HMW», и сшивающего агента;- at least one cross-linked hyaluronic acid obtained from at least one non-cross-linked hyaluronic acid having a mass-average molar mass of more than 1.00 MDa, called "cross-linked HA HMW", and a cross-linking agent;

- по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,08 до 0,20 МДа, называемой «несшитая HA LMW»; и- at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a mass average molar mass in the range of 0.08 to 0.20 MDa, referred to as "non-crosslinked HA LMW"; and

- необязательно, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу более 1,00 МДа, называемой «несшитая HA HMW»,- optionally, at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a mass average molar mass greater than 1.00 MDa, referred to as "non-crosslinked HA HMW",

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую гиалуроновую кислоту от 20 до 30 мг/г в расчете на их общую массу, является результатом обеспечения, в частности:A representative of aqueous gels obtained by the method in accordance with the invention and having a total hyaluronic acid of 20 to 30 mg/g based on their total weight is the result of providing, in particular:

- по меньшей мере одной сшитой гиалуроновой кислоты, полученной из по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемой «сшитая HA HMW», и сшивающего агента;- at least one cross-linked hyaluronic acid obtained from at least one non-cross-linked hyaluronic acid having a weight-average molar mass in the range of 1.00 to 4.00 MDa, called "cross-linked HA HMW", and a cross-linking agent;

- по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 0,08 до 0,15 МДа, называемой «несшитая HA LMW»; и- at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a mass average molar mass in the range of 0.08 to 0.15 MDa, referred to as "non-crosslinked HA LMW"; and

- необязательно, по меньшей мере одной несшитой гиалуроновой кислоты, имеющей среднемассовую молярную массу в диапазоне от 1,00 до 4,00 МДа, называемой «несшитая HA HMW»,- optionally, at least one non-crosslinked hyaluronic acid having a weight average molar mass in the range of 1.00 to 4.00 MDa, referred to as "non-crosslinked HA HMW",

Представитель водных гелей, получаемых способом в соответствии с изобретением и имеющих общую гиалуроновую кислоту от 10 до 40 мг/г, предпочтительно от 15 до 35 мг/г, более предпочтительно от 20 до 30 мг/г в расчете на их общую массу, является результатом обеспечения, в частности:A representative of the aqueous gels obtainable by the method according to the invention and having a total hyaluronic acid of 10 to 40 mg/g, preferably 15 to 35 mg/g, more preferably 20 to 30 mg/g, based on their total weight, is the result of providing, in particular:

Конечно, водный гель, получаемый способом в соответствии с изобретением, может также содержать одно или более вспомогательное вещество, традиционно рассматриваемое в этом типе композиций, и, в частности, одно или более вспомогательное вещество, как определено выше.Of course, the aqueous gel obtainable by the process according to the invention may also contain one or more auxiliary substances conventionally considered in this type of compositions, and in particular one or more auxiliary substances as defined above.

Конечно, выбор и количество вспомогательного вещества(вспомогательных веществ) регулируются таким образом, чтобы не повышать риск несовместимости с другими соединениями, применяемыми в геле согласно изобретению, в частности, с указанными гиалуроновыми кислотами, и быть совместимыми с применением, как описано ниже. Эти корректировки находятся в пределах общей компетенции специалиста в данной области техники.Of course, the choice and amount of the excipient(s) are adjusted so as not to increase the risk of incompatibility with other compounds used in the gel according to the invention, in particular with the said hyaluronic acids, and to be compatible with the use as described below. These adjustments are within the general competence of a person skilled in the art.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей по меньшей мере один водный гель, как определено согласно изобретению, и, если необходимо, по меньшей мере одно вспомогательное вещество, выбранное из группы, состоящей из анестетиков, антиоксидантов, аминокислот, витаминов, минералов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, нуклеозидов, коферментов, адренергических производных, натрия дигидрофосфата моногидрата и/или дигидрата и хлорида натрия.In a particular embodiment, the present invention also relates to a composition comprising at least one aqueous gel as defined according to the invention and, if necessary, at least one auxiliary substance selected from the group consisting of anesthetics, antioxidants, amino acids, vitamins, minerals, nucleic acids, nucleotides, nucleosides, coenzymes, adrenergic derivatives, sodium dihydrogen phosphate monohydrate and/or dihydrate and sodium chloride.

В предпочтительном варианте осуществления указанное вспомогательное вещество представляет собой анестетик, как определено выше, и, в частности, лидокаин, мепивакаин или их соль, такую как гидрохлорид.In a preferred embodiment, said excipient is an anesthetic as defined above, and in particular lidocaine, mepivacaine or a salt thereof, such as the hydrochloride.

Гели, полученные в соответствии со способом согласно изобретению, и водные гели согласно изобретению особенно пригодны в качестве композиций для применения в предотвращении и/или лечении изменения внешнего вида поверхности кожи.The gels obtained according to the method of the invention and the aqueous gels of the invention are particularly suitable as compositions for use in the prevention and/or treatment of changes in the appearance of the surface of the skin.

Композиции согласно настоящему изобретению могут представлять собой косметические и/или дерматологические композиции.The compositions according to the present invention may be cosmetic and/or dermatological compositions.

Эти композиции можно вводить местно, но также путем инъекции, в частности, в поверхностные зоны кожи, т.е. в верхнюю и среднюю части дермы.These compositions can be administered locally, but also by injection, in particular into the superficial areas of the skin, i.e. into the upper and middle parts of the dermis.

При применении инъекции конечно необходимо, чтобы композиция и/или водный гель были стерильными и инъекционными.When using an injection, it is of course necessary that the composition and/or aqueous gel be sterile and injectable.

Когда композиция согласно изобретению представляет собой композицию для местного применения, она может находиться в любой галеновой форме, подходящей для ее применения, например, в форме крема, мази, лосьона, сыворотки, геля или дисперсии.When the composition according to the invention is a composition for topical application, it may be in any galenic form suitable for its use, for example in the form of a cream, ointment, lotion, serum, gel or dispersion.

Любые подходящие эксципиенты, хорошо известные специалистам в данной области техники, в соответствующем количестве, в зависимости от желаемого показания, могут содержаться в композиции согласно изобретению.Any suitable excipients well known to those skilled in the art, in an appropriate amount depending on the desired indication, may be contained in the composition according to the invention.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к инъекционному водному гелю, стерилизованному в соответствии со способом стерилизации, описанным выше.According to another aspect, the present invention relates to an injectable aqueous gel sterilized according to the sterilization method described above.

Представителем такого водного геля, получаемого способом в соответствии с изобретением, являются, в частности, такие, которые содержат:Representative of such an aqueous gel obtained by the method in accordance with the invention are, in particular, those that contain:

- от 0,6 до 0,8 мас.% по меньшей мере одного «сшитого гликозаминогликана HMW» в расчете на общую массу указанного водного геля;- from 0.6 to 0.8 wt.% of at least one "cross-linked HMW glycosaminoglycan" based on the total weight of said aqueous gel;

- от 1,4 до 1,8 мас.% по меньшей мере одного «несшитого гликозаминогликана LMW» в расчете на общую массу указанного водного геля; и- from 1.4 to 1.8 wt.% of at least one "non-crosslinked glycosaminoglycan LMW" based on the total weight of said aqueous gel; and

- от 0,2 до 0,4 мас.% по меньшей мере одного «несшитого гликозаминогликана HMW» в расчете на общую массу указанного водного геля;- from 0.2 to 0.4 wt.% of at least one "non-crosslinked HMW glycosaminoglycan" based on the total weight of said aqueous gel;

и имеющие общую концентрацию гликозаминогликана от 20 до 30 мг/г, фазовый угол (δ) от 15° до 50° и G' от 20 до 150 Па, измеренные для напряжения 5 Па при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2) с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм) с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 15 Н или меньше, измеренную с помощью динамометра при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внешним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″ при комнатной температуре.and having a total glycosaminoglycan concentration of 20 to 30 mg/g, a phase angle (δ) of 15° to 50° and a G' of 20 to 150 Pa, measured for a stress of 5 Pa at room temperature using a rheometer (TA Instruments DHR2) with a cone/plate geometry (1° cone angle/40 mm plate diameter) using an oscillatory sweep stress of 1 Hz, and an extrusion force of 15 N or less, measured with a dynamometer at a fixed speed of about 12.5 mm/min, in syringes with an outer diameter of 6.3 mm or more, with a needle with an outer diameter of 0.3 mm (30 G) or less and a length of ½″ at room temperature.

Представителем такого водного геля, получаемого способом в соответствии с изобретением, являются, в частности, такие, которые содержатRepresentative of such an aqueous gel obtained by the method in accordance with the invention are, in particular, those that contain

- от 0,6 до 1,0 мас.% по меньшей мере одной «сшитой HA HMW» в расчете на общую массу указанного водного геля;- from 0.6 to 1.0 wt.% of at least one "crosslinked HA HMW" based on the total weight of said aqueous gel;

- от 1,4 до 1,8 мас.% по меньшей мере одной «несшитой HA LMW» в расчете на общую массу указанного водного геля; и- from 1.4 to 1.8 wt.% of at least one "non-crosslinked HA LMW" based on the total weight of said aqueous gel; and

- от 0,2 до 0,6 мас.% по меньшей мере одной «несшитой HA HMW» в расчете на общую массу указанного водного геля;- from 0.2 to 0.6 wt.% of at least one "non-crosslinked HA HMW" based on the total weight of said aqueous gel;

и имеющие общую концентрацию гиалуроновой кислоты от 20 до 30 мг/г, фазовый угол (δ) от 15° до 50° и G' от 20 до 150 Па, измеренные для напряжения 5 Па при комнатной температуре с использованием реометра (TA Instruments DHR2) с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм) с применением колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц, и силу экструзии 18 Н или меньше, измеренную с помощью динамометра при фиксированной скорости около 12,5 мм/мин, в шприцах с внешним диаметром 6,3 мм или более, с иглой с внешним диаметром 0,3 мм (30 G) или меньше и длиной ½″ при комнатной температуре.and having a total hyaluronic acid concentration of 20 to 30 mg/g, a phase angle (δ) of 15° to 50° and a G' of 20 to 150 Pa, measured for a stress of 5 Pa at room temperature using a rheometer (TA Instruments DHR2) with a cone/plate geometry (cone angle 1°/plate diameter 40 mm) using an oscillatory sweep voltage with a frequency of 1 Hz, and an extrusion force of 18 N or less, measured with a dynamometer at a fixed speed of about 12.5 mm/min, in syringes with an outer diameter of 6.3 mm or more, with a needle with an outer diameter of 0.3 mm (30 G) or less and a length of ½″ at room temperature.

НаборKit

В частности, настоящее изобретение относится к предварительно заполненному шприцу, содержащему водный гель, полученный способом согласно изобретению, или водный гель, как определено в настоящем изобретении, или косметическую и/или дерматологическую композицию согласно изобретению.In particular, the present invention relates to a pre-filled syringe containing an aqueous gel obtained by the method according to the invention, or an aqueous gel as defined in the present invention, or a cosmetic and/or dermatological composition according to the invention.

В соответствии с одним дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к набору, содержащему предварительно заполненный шприц, содержащий водный гель, полученный способом согласно изобретению, или водный гель, как определено в настоящем изобретении, или косметическую и/или дерматологическую композицию согласно изобретению, и инструкции по применению.According to one further aspect, the present invention relates to a kit comprising a pre-filled syringe containing an aqueous gel obtained by the method according to the invention, or an aqueous gel as defined in the present invention, or a cosmetic and/or dermatological composition according to the invention, and instructions for use.

ПримененияApplications

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к водному гелю согласно изобретению или дерматологической композиции согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении изменения внешнего вида поверхности кожи. Предпочтительно, изобретение относится к водному гелю, как определено в изобретении, или к дерматологической композиции, как определено в изобретении, для применения в контурной пластике и/или заполнении мягких тканей.According to another aspect, the present invention relates to an aqueous gel according to the invention or a dermatological composition according to the invention for use in preventing and/or treating changes in the appearance of the skin surface. Preferably, the invention relates to an aqueous gel as defined in the invention or a dermatological composition as defined in the invention for use in contouring and/or filling of soft tissues.

Также описан водный гель, как определено в настоящем изобретении, или дерматологическая композиция согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении измененных вязкоупругих или биомеханических свойств кожи.Also described is an aqueous gel as defined in the present invention or a dermatological composition according to the invention for use in the prevention and/or treatment of altered viscoelastic or biomechanical properties of the skin.

Также описан водный гель, как определено в настоящем изобретении, или дерматологическая композиция согласно изобретению для применения в предотвращении и/или лечении кожных признаков, вызванных внешними факторами, такими как стресс, загрязнение воздуха, табак или длительное воздействие ультрафиолетового (УФ) света.Also described is an aqueous gel as defined in the present invention or a dermatological composition according to the invention for use in the prevention and/or treatment of skin signs caused by external factors such as stress, air pollution, tobacco or prolonged exposure to ultraviolet (UV) light.

Настоящее изобретение также относится к нетерапевтическому косметическому применению водного геля, как определено в изобретении, или косметической композиции согласно изобретению для предотвращения и/или лечения изменения внешнего вида поверхности кожи, такого как предотвращение и/или лечение кожных признаков хронологического старения.The present invention also relates to a non-therapeutic cosmetic use of an aqueous gel as defined in the invention or a cosmetic composition according to the invention for the prevention and/or treatment of changes in the appearance of the skin surface, such as the prevention and/or treatment of cutaneous signs of chronological aging.

Настоящее изобретение также относится к нетерапевтическому косметическому применению водного геля, как определено в изобретении, или косметической композиции согласно изобретению для контурной пластики и/или заполнения мягких тканей, в частности, заполнения морщин.The present invention also relates to the non-therapeutic cosmetic use of an aqueous gel as defined in the invention or a cosmetic composition according to the invention for contouring and/or filling of soft tissues, in particular filling of wrinkles.

Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения и/или лечения изменения внешнего вида поверхности кожи, включающему по меньшей мере одну стадию местного нанесения субъекту, такому как пациент, нуждающийся в этом, или стадию введения путем инъекции в организм субъекта, такого как пациент, нуждающийся в этом, эффективного количества водного геля, как определено в изобретении, или дерматологической композиции согласно изобретению.The present invention also relates to a method for preventing and/or treating a change in the appearance of a skin surface, comprising at least one step of topical application to a subject, such as a patient, in need thereof, or a step of administering by injection into the body of a subject, such as a patient, in need thereof, an effective amount of an aqueous gel as defined in the invention, or a dermatological composition according to the invention.

Настоящее изобретение также относится к способу контурной пластики и/или заполнения мягких тканей, в частности заполнения морщин, включающему по меньшей мере одну стадию местного нанесения субъекту, такому как пациент, нуждающийся в этом, или стадию введения путем инъекции в организм субъекта, такого как пациент, нуждающийся в этом, эффективного количества водного геля, как определено в изобретении, или косметической и/или дерматологической композиции согласно изобретению.The present invention also relates to a method for contouring and/or filling soft tissues, in particular filling wrinkles, comprising at least one step of locally applying to a subject, such as a patient, in need thereof, or a step of injecting into the body of a subject, such as a patient, in need thereof, an effective amount of an aqueous gel as defined in the invention, or a cosmetic and/or dermatological composition according to the invention.

ПримерExample

МатериалыMaterials

Для различных приведенных ниже примеров были подготовлены отдельные наборы образцов. Между этими сериями существуют неизбежные вариации, в частности, из-за использования разных партий гиалуроновой кислоты или разных циклов стерилизации. Следовательно, важно отметить, что межпримерные сравнения между этими сериями данных нецелесообразны.Separate sets of samples were prepared for the various examples below. There are inevitable variations between these series, particularly due to the use of different lots of hyaluronic acid or different sterilization cycles. It is therefore important to note that inter-sample comparisons between these data series are not appropriate.

МетодыMethods

Следующие протоколы применяли для изучения вязкоупругих свойств композиций, проанализированных в примерах.The following protocols were used to study the viscoelastic properties of the compositions analyzed in the examples.

Реологическая характеристика образцовRheological characteristics of samples

Вязкоупругие свойства композиции измеряли с помощью реометра (TA Instruments DHR2) при комнатной температуре с геометрией конус/пластина (угол конуса 1°/диаметр пластины 40 мм). Выполняли измерение колебательного напряжения развертки с частотой 1 Гц. Модуль упругости (G', в Па), фазовый угол (δ, в°) и комплексную вязкость (η*) измеряли при напряжении 5 Па.The viscoelastic properties of the composition were measured using a rheometer (TA Instruments DHR2) at room temperature with a cone/plate geometry (cone angle 1°/plate diameter 40 mm). The oscillatory voltage sweep was measured at a frequency of 1 Hz. The elastic modulus (G', in Pa), phase angle (δ, in °) and complex viscosity (η*) were measured at a stress of 5 Pa.

Характеристика сил экструзии образцовCharacteristics of extrusion forces of samples

Силы экструзии образца определяли с помощью динамометра при фиксированной скорости 12,5 мм/мин, траектории падения 25 мм, в 1 мл COC шприцах (шприцы из циклоолефинового сополимера) внутреннего диаметра 6,4 мм, с иглой 30 G ½″, при комнатной температуре.The extrusion forces of the sample were determined using a dynamometer at a fixed speed of 12.5 mm/min, a fall trajectory of 25 mm, in 1 ml COC syringes (cycloolefin copolymer syringes) of 6.4 mm internal diameter, with a 30 G ½″ needle, at room temperature.

Характеристика устойчивости к деградации образца в течение времени и при нагреванииCharacteristic of resistance to sample degradation over time and under heating

Стерилизацию инъекционных гелей гиалуроновой кислоты обычно осуществляли в автоклаве (процесс влажной тепловой стерилизации).Sterilization of hyaluronic acid injectable gels was usually carried out in an autoclave (wet heat sterilization process).

Стабильность при хранении этих композиций может быть оценена ускоренным способом посредством испытаний на принудительную деградацию при высокой температуре (ASTM F1980-16).The storage stability of these compositions can be assessed in an accelerated manner by means of high temperature forced degradation testing (ASTM F1980-16).

Деградация гелей характеризуется значительной потерей модуля упругости (G').The degradation of gels is characterized by a significant loss of elastic modulus (G').

В этом контексте процент потери G' при стерилизации (Δ G' (%)) является релевантным показателем устойчивости геля к деградации, как в течение времени, так и при тепловой стерилизации.In this context, the percentage loss of G' during sterilization (Δ G' (%)) is a relevant indicator of the resistance of the gel to degradation, both over time and during heat sterilization.

Для этого изменение G' при стерилизации рассчитывали следующим образом:For this purpose, the change in G' during sterilization was calculated as follows:

Δ G' (%) = [(G' после стерилизации - G' до стерилизации)/G' до стерилизации]×100Δ G' (%) = [(G' after sterilization - G' before sterilization)/G' before sterilization]×100

Кроме того, процентное улучшение G' определяли следующим образом:In addition, the percentage improvement G' was determined as follows:

Улучшение G' (%) = [(Δ G' референсный образец - Δ G' исследуемый образец)/Δ G' референсный образец]×100Improvement G' (%) = [(Δ G' reference sample - Δ G' test sample)/Δ G' reference sample]×100

Характеристика устойчивости образцов к ферментативной деградацииCharacterization of resistance of samples to enzymatic degradation

Для изучения устойчивости образцов к ферментативной деградации 2 г исследуемого геля приводили в контакт и гомогенизировали с раствором гиалуронидазы (HAase) в фосфатно-солевом буфере (0,5 Ед/мл геля), затем помещали в печь при 37°С на 24 ч.To study the resistance of the samples to enzymatic degradation, 2 g of the test gel was brought into contact and homogenized with a solution of hyaluronidase (HAase) in phosphate-buffered saline (0.5 U/ml gel), then placed in an oven at 37°C for 24 h.

Каждый образец охарактеризовали реологическим измерением до и после ферментативной обработки, и изменение G' до/после деградации рассчитывали следующим образом: Δ G' = [(конечный G' - начальный G')/начальный G']×100. Это изменение G' является прямым показателем степени деградации геля в присутствии HAase.Each sample was characterized by rheological measurement before and after enzymatic treatment, and the change in G' before/after degradation was calculated as follows: Δ G' = [(final G' - initial G')/initial G']×100. This change in G' is a direct indicator of the degree of gel degradation in the presence of HAase.

Характеристика размера и распределения водорастворимой и неводорастворимой гиалуроновой кислоты, присутствующей в образцахCharacterization of the size and distribution of water-soluble and insoluble hyaluronic acid present in the samples

Значение Mw и количество sHA, высвобождаемой из гелей HA, определяли с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), оснащенной детектором многоуглового лазерного рассеяния света (Dawn Neon MALS, Wyatt Technology Corp) и рефрактометрическим детектором (Optilab, Wyatt Technology Corp). В приборе использовали систему Agilent Infinity LC, оснащенную двойным набором эксклюзионных колонок OHpak LB-806M, удерживаемых в последовательном потоке (Shodex), охватывающем широкий диапазон среднемассовой молярной массы (от 0,001 до 20 MДa). В качестве элюента применяли подвижную фазу 150 мМ нитрата натрия с pH 7,2 (содержащего 0,02%NaN₃) при скорости потока 0,3 мл/мин. Инкремент показателя преломления (dn/dc) устанавливали на уровне 0,165 мл/г в этих условиях. Хроматограммы получали и анализировали с использованием программного обеспечения ASTRA (Wyatt Technology Corp).The Mw and amount of sHA released from the HA gels were determined by size exclusion chromatography (SEC) equipped with a multi-angle laser light scattering detector (Dawn Neon MALS, Wyatt Technology Corp) and a refractive index detector (Optilab, Wyatt Technology Corp). The instrument used was an Agilent Infinity LC system equipped with a dual set of OHpak LB-806M size exclusion columns held in series flow (Shodex) covering a wide range of mass-average molar masses (0.001 to 20 MDa). The mobile phase used was 150 mM sodium nitrate, pH 7.2 (containing 0.02%NaN₃) at a flow rate of 0.3 ml/min. The refractive index increment (dn/dc) was set at 0.165 ml/g under these conditions. Chromatograms were obtained and analyzed using ASTRA software (Wyatt Technology Corp).

Получение образца заключалось в разбавлении водного геля раствором 150 нМ нитрата натрия с рН 7,2, содержащим 0,02%NaN₃, при 25°С в течение 5 дней, затем его центрифугировании при 4400 об/мин в течение 10 минут и его фильтрации через 0,45 мм с получением фильтрата, затем анализе указанного фильтрата с использованием SEC, оснащенного как указано выше.The sample preparation consisted of diluting the aqueous gel with a 150 nM sodium nitrate solution with a pH of 7.2 containing 0.02%NaN₃, at 25°C for 5 days, then centrifuging it at 4400 rpm for 10 minutes and filtering it through 0.45 mm to obtain a filtrate, then analyzing said filtrate using SEC equipped as above.

Концентрация геля в подвижной фазе для стадии разбавления, а также введенный объем в SEC регулировали соответствующим образом как функцию супернатанта композиции, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум и избежать перегрузки колонки.The concentration of the gel in the mobile phase for the dilution step, as well as the injected volume in SEC, were adjusted accordingly as a function of the supernatant composition to maximize the signal-to-noise ratio and avoid column overloading.

Проценты sHA, которые определяли, соответствуют массе водорастворимой HA в расчете на общую массу HA в образце.The percentages of sHA determined correspond to the mass of water-soluble HA based on the total mass of HA in the sample.

Степень модификации водорастворимой гиалуроновой кислоты, присутствующей в образцах, с использованием ¹H ЯМРDegree of modification of water-soluble hyaluronic acid present in samples using ¹ H NMR

Инкубировали 3 г каждого образца с 10 мл воды для инъекций в течение 5 дней при комнатной температуре. Затем образцы слегка центрифугировали (4400 об/мин, 10 мин) для отделения геля от супернатанта (содержащего водорастворимую HA) и фильтровали через 0,45 мм для удаления нерастворимых гелевых агрегатов. Супернатанты лиофилизировали и растворяли с помощью 1 мл D2O. Анализ ¹H ЯМР выполняли на спектрометре Bruker Avance 500 МГц. Степень модификации определяли молярным отношением сигналов сшивающего агента к сигналу дисахаридных звеньев HA (HA является сшитой или несшитой).3 g of each sample were incubated with 10 ml of water for injection for 5 days at room temperature. The samples were then gently centrifuged (4400 rpm, 10 min) to separate the gel from the supernatant (containing water-soluble HA) and filtered through 0.45 mm to remove insoluble gel aggregates. The supernatants were lyophilized and dissolved with 1 ml of D2O. ¹ H NMR analysis was performed on a Bruker Avance 500 MHz spectrometer. The degree of modification was determined by the molar ratio of the signals of the cross-linking agent to the signal of the disaccharide units of HA (HA is cross-linked or uncross-linked).

Пример 1Example 1

Влияние добавления к композиции на основе сшитой HMW гиалуроновой кислоты несшитой LMW гиалуроновой кислотыEffect of adding non-crosslinked LMW hyaluronic acid to a composition based on crosslinked HMW hyaluronic acid

Исследуемые образцы представлены ниже.The samples studied are presented below.

Сравнительный образец 1-1 представляет собой гель сшитой гиалуроновой кислоты, стерилизованный в шприце в автоклаве и полученный из HMW гиалуроновой кислоты (4,00 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) и БДДЭ (Sigma Aldrich, ≥ 95 %), с общей концентрацией гиалуроновой кислоты 20 мг/г и степенью модификации 2 %.Comparative sample 1-1 is a cross-linked hyaluronic acid gel, sterilized in a syringe in an autoclave and obtained from HMW hyaluronic acid (4.00 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) and BDDE (Sigma Aldrich, ≥ 95%), with a total hyaluronic acid concentration of 20 mg/g and a modification degree of 2%.

Образец 1-2, согласно изобретению, представляет собой гель сшитой гиалуроновой кислоты, стерилизованный в шприце в автоклаве, с общей концентрацией гиалуроновой кислоты 20 мг/г и полученный из смеси 1:1 образца 1-1 до стерилизации с 20 мг/г раствором несшитого гиалуроната натрия LMW (0,10 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты).Sample 1-2, according to the invention, is a cross-linked hyaluronic acid gel, sterilized in a syringe in an autoclave, with a total concentration of hyaluronic acid of 20 mg/g and obtained from a 1:1 mixture of sample 1-1 before sterilization with a 20 mg/g solution of non-cross-linked sodium hyaluronate LMW (0.10 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade purity).

Сравнительный образец 1-3 представляет собой гель сшитой гиалуроновой кислоты, стерилизованный в шприце в автоклаве, с общей концентрацией гиалуроновой кислоты 10 мг/г и полученный из смеси 1:1 образца 1-1 до стерилизации с раствором фосфатно-солевого буфера без несшитой гиалуроновой кислоты.Comparative sample 1-3 is a syringe-sterilized autoclaved cross-linked hyaluronic acid gel with a total hyaluronic acid concentration of 10 mg/g and prepared from a 1:1 mixture of sample 1-1 before sterilization with a phosphate-buffered saline solution without non-cross-linked hyaluronic acid.

Характеристики образцов, их G' и потери G' при стерилизации обобщены в таблице 1 ниже и на фигуре 1.The characteristics of the samples, their G' and G' losses during sterilization are summarized in Table 1 below and in Figure 1.

Таблица 1Table 1 ОбразцыSamples Концентрация сшитой HMW HA (мг/г)Cross-linked HMW HA concentration (mg/g) Концентрация несшитой LMW HA (0,10 MДa) (мг/г)Concentration of non-crosslinked LMW HA (0.10 MDa) (mg/g) Общая концентрация HA (мг/г)Total HA concentration (mg/g) Δ G' (%)Δ G' (%) 1-1 (референс)1-1 (reference) 2020 00 2020 минус 10,8minus 10.8 1-2 (изобретение)1-2 (invention) 1010 1010 2020 минус 2,4minus 2.4 1-3 (сравнительный)1-3 (comparative) 1010 00 1010 минус 21,6minus 21.6

Результаты демонстрируют лучшую устойчивость к деградации для композиций, содержащих LMW гиалуроновую кислоту (образец 1-2 согласно изобретению), по сравнению с композицией с такой же общей концентрацией гиалуроновой кислоты, но не содержащей LMW гиалуроновую кислоту (образец 1-1 (референс)).The results demonstrate better resistance to degradation for compositions containing LMW hyaluronic acid (sample 1-2 according to the invention) compared to a composition with the same total concentration of hyaluronic acid but not containing LMW hyaluronic acid (sample 1-1 (reference)).

Кроме того, представляется, что чем выше концентрация сшитой HMW гиалуроновой кислоты, тем выше стабильность композиции. Таким образом, образец 1-3 (сравнительный, 10 мг/г HMW гиалуроновой кислоты) демонстрирует большую потерю G' (Δ G' = минус 21,6 %), чем образец 1-1 (сравнительный), содержащий 20 мг/г HMW гиалуроновой кислоты (Δ G' = минус 10,8 %). Тем не менее, это увеличение стабильности намного ниже, чем у образца 1-2 (изобретение), содержащего несшитую LMW гиалуроновую кислоту (Δ G' = минус 2,4 %).In addition, it appears that the higher the concentration of cross-linked HMW hyaluronic acid, the higher the stability of the composition. Thus, sample 1-3 (comparative, 10 mg/g HMW hyaluronic acid) shows a greater loss of G' (Δ G' = minus 21.6%) than sample 1-1 (comparative) containing 20 mg/g HMW hyaluronic acid (Δ G' = minus 10.8%). However, this increase in stability is much lower than that of sample 1-2 (invention) containing non-cross-linked LMW hyaluronic acid (Δ G' = minus 2.4%).

Следовательно, это не просто увеличение общей концентрации гиалуроновой кислоты, которое связано с повышением устойчивости композиций к деградации, а скорее добавление соответствующей композиции HMW гиалуроновой кислоты.Therefore, it is not simply the increase in the total concentration of hyaluronic acid that is associated with the increased resistance of the compositions to degradation, but rather the addition of an appropriate HMW hyaluronic acid composition.

Пример 2Example 2

Влияние добавления к композиции на основе сшитой HMW гиалуроновой кислоты, необязательно содержащей несшитую HMW гиалуроновую кислоту, LMW гиалуроновой кислотыEffect of adding LMW hyaluronic acid to a composition based on cross-linked HMW hyaluronic acid, optionally containing non-cross-linked HMW hyaluronic acid

Образец 2-1 получали следующим образом.Sample 2-1 was prepared as follows.

Получение геля БДДЭ-сшитой гиалуроновой кислоты в основной среде из несшитой HMW гиалуроновой кислоты (HTL, 4,00 MДa, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты). Полученную сшитую фракцию нейтрализовали и оставляли набухать в фосфатно-солевом буфере с получением конечного геля с 15 мг/г NaHA. Затем его диализировали. На этой стадии гель имеет модуль упругости G' от 80 до 120 Па и фазовый угол δ от 7° до 10°.Preparation of BDDE-crosslinked hyaluronic acid gel in a base medium of non-crosslinked HMW hyaluronic acid (HTL, 4.00 MDa, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade). The resulting crosslinked fraction was neutralized and left to swell in phosphate-buffered saline to obtain a final gel with 15 mg/g NaHA. It was then dialyzed. At this stage, the gel has an elastic modulus G' of 80 to 120 Pa and a phase angle δ of 7° to 10°.

Раствор 15 мг/г несшитого HMW гиалуроната натрия (4,00 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) добавляли к сшитой фракции до достижения доли 30 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты в композиции. Гель гомогенизировали, экструдировали через сетку и заполняли в 1 мл COC шприцы. Наконец, гель подвергали автоклавированию.A solution of 15 mg/g non-crosslinked HMW sodium hyaluronate (4.00 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) was added to the crosslinked fraction to reach a proportion of 30 wt.% based on the total weight of hyaluronic acid in the composition. The gel was homogenized, extruded through a mesh and filled into 1 ml COC syringes. Finally, the gel was autoclaved.

Образец 2-2 получали аналогично образцу 2-1, но применяемую композицию геля несшитой гиалуроновой кислоты модифицировали таким образом, чтобы конечный гель дополнительно включал 10 мг/г несшитой LMW гиалуроновой кислоты (0,10 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты).Sample 2-2 was prepared similarly to sample 2-1, but the non-crosslinked hyaluronic acid gel composition used was modified such that the final gel additionally included 10 mg/g non-crosslinked LMW hyaluronic acid (0.10 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade).

Образец 2-3 получали как и образец 2-1, но без несшитой 4,00 МДа гиалуроновой кислоты.Sample 2-3 was prepared as sample 2-1, but without non-cross-linked 4.00 MDa hyaluronic acid.

Образец 2-4 получали как и образец 2-1, но с заменой применяемой несшитой 4,00 МДа гиалуроновой кислоты на 0,10 МДа гиалуроновую кислоту.Sample 2-4 was prepared in the same way as sample 2-1, but with the non-cross-linked 4.00 MDa hyaluronic acid replaced by 0.10 MDa hyaluronic acid.

Для каждого из этих образцов рассчитывали изменение (в процентах) G'. Полученные результаты обобщены в таблицах ниже.For each of these samples, the change (in percent) in G' was calculated. The results obtained are summarized in the tables below.

В таблице 2 показана стабилизация смеси сшитой и несшитой гиалуроновой кислоты.Table 2 shows the stabilization of a mixture of cross-linked and non-cross-linked hyaluronic acid.

Таблица 2Table 2 ОбразцыSamples HMW HAHMW HA Добавленная несшитая LMW HA (0,10 МДа)Added non-crosslinked LMW HA (0.10 MDa) Δ G' (%)Δ G' (%) 2-1 (сравнительный)2-1 (comparative) сшитая + несшитаяstitched + unstitched НетNo минус 25minus 25 2-2 (изобретение)2-2 (invention) сшитая + несшитаяstitched + unstitched ДаYes минус 15minus 15

В таблице 3 показана стабилизация только сшитой гиалуроновой кислоты.Table 3 shows the stabilization of cross-linked hyaluronic acid only.

Таблица 3Table 3 ОбразцыSamples HMW HAHMW HA Добавленная несшитая LMW HA (0,10 МДа)Added non-crosslinked LMW HA (0.10 MDa) Δ G' (%)Δ G' (%) 2-3 (сравнительный)2-3 (comparative) только сшитаяjust sewn НетNo минус 15minus 15 2-4 (изобретение)2-4 (invention) только сшитаяjust sewn ДаYes минус 10minus 10

Результаты показывают, что защитный эффект несшитой LMW гиалуроновой кислоты во время автоклавной стерилизации наблюдается как для композиций, содержащих только сшитую HMW гиалуроновую кислоту (образец 2-4 по сравнению с образцом 2-3), так и для композиций, содержащих смесь сшитой и несшитой HMW гиалуроновой кислоты (образец 2-2 по сравнению с образцом 2-1).The results show that the protective effect of non-cross-linked LMW hyaluronic acid during autoclave sterilization is observed for both compositions containing only cross-linked HMW hyaluronic acid (sample 2-4 versus sample 2-3) and for compositions containing a mixture of cross-linked and non-cross-linked HMW hyaluronic acid (sample 2-2 versus sample 2-1).

Таким образом, добавление несшитой LMW гиалуроновой кислоты к композициям, содержащим только сшитую HMW гиалуроновую кислоту (образец 2-4) или в смеси с несшитой HMW гиалуроновой кислотой (образец 2-2), преимущественно повышает их устойчивость к деградации.Thus, the addition of non-crosslinked LMW hyaluronic acid to compositions containing only crosslinked HMW hyaluronic acid (sample 2-4) or in a mixture with non-crosslinked HMW hyaluronic acid (sample 2-2) predominantly increases their resistance to degradation.

Пример 3Example 3

Исследование реологии и стабильности гелей гиалуроновой кислоты, содержащих несшитую гиалуроновую кислоту с различными молярными массамиStudy of rheology and stability of hyaluronic acid gels containing non-crosslinked hyaluronic acid with different molar masses

Реология растворов гиалуроновой кислоты различной молярной массыRheology of hyaluronic acid solutions of different molar masses

Растворы 10 мг/г (1%) несшитой гиалуроновой кислоты с различными молярными массами (0,04 МДа, 0,10 МДа, 0,20 МДа и 1,50 МДа, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) готовят в фосфатно-солевом буфере. Модуль упругости (G') и комплексная вязкость (η*) каждой из этих фракций определены и подробно описаны в таблице 4 ниже.Solutions of 10 mg/g (1%) non-crosslinked hyaluronic acid of different molar masses (0.04 MDa, 0.10 MDa, 0.20 MDa and 1.50 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) were prepared in phosphate-buffered saline. The elastic modulus (G') and complex viscosity (η*) of each of these fractions were determined and detailed in Table 4 below.

Таблица 4Table 4 ОбразцыSamples Несшитая гиалуроновая кислота (MДa)Non-crosslinked hyaluronic acid (MDa) η* (мПа×с) до стерилизацииη* (mPa×s) before sterilization G' (Па) перед стерилизациейG' (Pa) before sterilization 3-13-1 0,040.04 N.D.**N.D.** N.D.**N.D.** 3-23-2 0,100.10 N.D.**N.D.** N.D.**N.D.** 3-33-3 0,200.20 21,221.2 менее 1less than 1 3-43-4 1,501.50 21102110 6,06.0 **N.D. Не поддается определению при напряжении 5 Па (образец 3-1: η* = 2,55 мПа×с и G' = от 0,65 до 0,6 Па; образец 3-2: η* = 5,2 мПа×с и G' = от 0,0057 до 1 Па).**N.D. Not determinable at 5 Pa (sample 3-1: η* = 2.55 mPa×s and G' = 0.65 to 0.6 Pa; sample 3-2: η* = 5.2 mPa×s and G' = 0.0057 to 1 Pa).

Приведенные выше результаты показывают, что гель на основе только несшитой гиалуроновой кислоты с молярной массой 0,20 МДа или менее и концентрированный при 1 %, не обладает значительными эластичными свойствами и имеет очень низкую вязкость.The above results show that the gel based only on non-crosslinked hyaluronic acid with a molar mass of 0.20 MDa or less and concentrated at 1% does not have significant elastic properties and has a very low viscosity.

Механический вкладMechanical contribution

Смесь сшитой и несшитой HMW гиалуроновой кислоты, образец 3-5 (референс), получали следующим образом. Получение геля БДДЭ-сшитой гиалуроновой кислоты в основной среде из несшитой HMW гиалуроновой кислоты (4,00 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты). Полученную сшитую фракцию нейтрализовали и оставляли набухать в фосфатно-солевом буфере с получением конечного геля с 15 мг/г NaHA. Затем его диализировали. На этой стадии гель имеет модуль упругости G' от около 80 до 120 Па и фазовый угол δ от 7° до 10°. Раствор 15 мг/г несшитого HMW гиалуроната натрия (4,00 MДa, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) добавляли к сшитой фракции до достижения доли 30 мас.% в расчете на общую массу гиалуроновой кислоты в композиции. Гель гомогенизировали, экструдировали через сетку и заполняли в 1 мл COC шприцы. Наконец, гель подвергали автоклавированию.A mixture of cross-linked and non-cross-linked HMW hyaluronic acid, sample 3-5 (reference), was prepared as follows. Preparation of a gel of BDDE-cross-linked hyaluronic acid in a base medium of non-cross-linked HMW hyaluronic acid (4.00 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade). The resulting cross-linked fraction was neutralized and left to swell in phosphate-buffered saline to obtain a final gel with 15 mg/g NaHA. It was then dialyzed. At this stage, the gel has an elastic modulus G' of about 80 to 120 Pa and a phase angle δ of 7° to 10°. A solution of 15 mg/g non-crosslinked HMW sodium hyaluronate (4.00 MDa, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) was added to the crosslinked fraction to achieve a proportion of 30 wt.% based on the total weight of hyaluronic acid in the composition. The gel was homogenized, extruded through a mesh and filled into 1 ml COC syringes. Finally, the gel was autoclaved.

Образцы от 3-6 до 3-9 получали аналогично образцу 3-5, но с гелем несшитой гиалуроновой кислоты, дополнительно содержащим дополнительную фиксированную концентрацию 10 мг/г несшитой гиалуроновой кислоты в расчете на общую массу композиции (1 %).Samples 3-6 to 3-9 were prepared similarly to sample 3-5, but with a non-crosslinked hyaluronic acid gel additionally containing an additional fixed concentration of 10 mg/g non-crosslinked hyaluronic acid based on the total weight of the composition (1%).

Для этого добавления применяют несшитые гиалуроновые кислоты с различными молярными массами, а именно для образцов от 3-6 до 3-9, в порядке: 0,04 MДa, 0,10 MДa, 0,20 MДa и 1,50 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты.For this addition, non-crosslinked hyaluronic acids with different molar masses are used, namely for samples from 3-6 to 3-9, in the order: 0.04 MDa, 0.10 MDa, 0.20 MDa and 1.50 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade purity.

Реологические характеристики этих образцов определяют до и после стерилизации на 6 шприцах для каждого образца. Результаты после стерилизации обобщены в таблице 5 ниже и на фигуре 2.The rheological characteristics of these samples were determined before and after sterilization on 6 syringes for each sample. The results after sterilization are summarized in Table 5 below and in Figure 2.

Таблица 5Table 5 ОбразцыSamples Добавленная несшитая гиалуроновая кислота (MДa)Added non-crosslinked hyaluronic acid (MDa) δ (°)/стандартное отклонение (°)δ (°)/standard deviation (°) G' (Па) до стерилизации/стандартное отклонение (Па)G' (Pa) before sterilization/standard deviation (Pa) G' (Па) после стерилизации/стандартное отклонение (Па)G' (Pa) after sterilization/standard deviation (Pa) F (Н)/стандартное отклонение (Н)F (N)/standard deviation (N) 3-5 (референс)3-5 (reference) -- 16,4/0,516.4/0.5 137/3137/3 110/3110/3 10,4/0,610.4/0.6 3-6 (изобретение)3-6 (invention) 0,040.04 16,8/0,416.8/0.4 138/2138/2 111/3111/3 12,0/0,312.0/0.3 3-7 (изобретение)3-7 (invention) 0,100.10 17,2/0,417.2/0.4 144/5144/5 124/5*124/5* 14,8/0,514.8/0.5 3-8 (изобретение)3-8 (invention) 0,200.20 19,9/0,719.9/0.7 161/3161/3 135/9*135/9* 15,6/0,415.6/0.4 3-9 (сравнительный)3-9 (comparative) 1,501.50 27,6/427.6/4 305/3305/3 240/21*240/21* 16,0/0,716.0/0.7 *Среднее значение значительно отличается от среднего значения референсного образца, p < 0,001, t-критерий для двух образцов.*Mean value is significantly different from the mean value of the reference sample, p < 0.001, two-sample t-test.

Благодаря ограниченному механическому вкладу несшитой LMW гиалуроновой кислоты образцы от 3-6 до 3-8 остаются мягкими гелями, то есть гелями с δ от 15° до 45°, G' 150 Па или менее и силой экструзии 18 Н или менее.Due to the limited mechanical contribution of non-crosslinked LMW hyaluronic acid, samples 3-6 to 3-8 remain soft gels, i.e. gels with δ from 15° to 45°, G' of 150 Pa or less, and an extrusion force of 18 N or less.

Следует отметить, что присутствие дополнительной LMW гиалуроновой кислоты и, следовательно, повышенная концентрация гиалуроновой кислоты в гелях согласно изобретению не влияет на их гибкость.It should be noted that the presence of additional LMW hyaluronic acid and, therefore, the increased concentration of hyaluronic acid in the gels according to the invention does not affect their flexibility.

С другой стороны, сравнительный образец 3-9, содержащий дополнительную HMW гиалуроновую кислоту, демонстрирует очень значительно повышенные реологические характеристики и больше не может рассматриваться как мягкий гель (G' более 150 Па).On the other hand, comparative sample 3-9, containing additional HMW hyaluronic acid, shows very significantly increased rheological properties and can no longer be considered as a soft gel (G' greater than 150 Pa).

Устойчивость к деградацииResistance to degradation

Устойчивость к тепловой деградации каждого образца изучали путем расчета процента потери G' после прохождения одного и того же цикла автоклавирования l.The thermal degradation resistance of each sample was studied by calculating the percentage loss of G' after undergoing the same autoclaving cycle l.

Полученные результаты обобщены в Таблице 6 ниже, на Фигуре 2 и Фигуре 3.The results obtained are summarized in Table 6 below, Figure 2 and Figure 3.

Таблица 6Table 6 ОбразцыSamples Добавленная несшитая гиалуроновая кислота (MДa)Added non-crosslinked hyaluronic acid (MDa) Δ G' (%)Δ G' (%) улучшение G' (%)improvement G' (%) 3-5 (референс)3-5 (reference) -- минус 20minus 20 00 3-6 (изобретение)3-6 (invention) 0,040.04 минус 19minus 19 22 3-7 (изобретение)3-7 (invention) 0,100.10 минус 13minus 13 3232 3-8 (изобретение)3-8 (invention) 0,200.20 минус 16minus 16 2020 3-9 (сравнительный)3-9 (comparative) 1,501.50 минус 21minus 21 минус 8minus 8

Как показано на фигуре 2, при реализованных условиях стерилизации (идентичных для всех испытанных образцов) референсный образец 3-5 страдает потерей около 20 %.As shown in Figure 2, under the implemented sterilization conditions (identical for all tested samples), reference sample 3-5 suffers from a loss of about 20%.

Добавление несшитой HMW гиалуроновой кислоты (1,50 MДa, образец 3-9) не улучшает потерю G' при стерилизации, которая остается выше, чем у референсного образца 3-5 (20 %).The addition of non-cross-linked HMW hyaluronic acid (1.50 MDa, sample 3-9) does not improve the G' loss during sterilization, which remains higher than that of the reference sample 3-5 (20%).

Напротив, добавка согласно изобретению, то есть добавление гиалуроновой кислоты с молярной массой в диапазоне от 0,04 до 0,20 МДа, более предпочтительно от 0,08 до 0,10 МДа, является источником снижения потери G' при стерилизации (сравнение образцов от 3-6 до 3-8 с образцом 3-5), то есть источником повышения устойчивости к деградации композиции.On the contrary, the additive according to the invention, i.e. the addition of hyaluronic acid with a molar mass in the range from 0.04 to 0.20 MDa, more preferably from 0.08 to 0.10 MDa, is a source of reducing the loss of G' during sterilization (comparison of samples 3-6 to 3-8 with sample 3-5), i.e. a source of increasing the resistance to degradation of the composition.

Таким образом, композиция с добавкой LMW гиалуроновой кислоты согласно изобретению обладает лучшей устойчивостью к деградации по сравнению с композициями с идентичной общей концентрацией гиалуроновой кислоты, такой же степенью сшивания фракции сшитой HMW гиалуроновой кислоты, но без добавок.Thus, the composition with the addition of LMW hyaluronic acid according to the invention has better resistance to degradation compared to compositions with an identical total concentration of hyaluronic acid, the same degree of cross-linking of the cross-linked HMW hyaluronic acid fraction, but without additives.

Это улучшение минимально, но уже заметно при самой низкой молярной массе (0,04 МДа) применяемой гиалуроновой кислоты (образец 3-6). Это улучшение является значительным при 0,10 МДа и 0,20 МДа гиалуроновой кислоты (образцы 3-7 и 3-8).This improvement is minimal but already noticeable at the lowest molar mass (0.04 MDa) of hyaluronic acid used (sample 3-6). This improvement is significant at 0.10 MDa and 0.20 MDa hyaluronic acid (samples 3-7 and 3-8).

Таким образом, сравнение средних значений из 6 измерений на 6 шприцах для каждого продукта после стерилизации показывает, что образцы 3-7 и 3-8 имеют значительно более высокое значение G', чем образец 3-5 (фигуры 2 и 3).Thus, comparison of the mean values from 6 measurements on 6 syringes for each product after sterilization shows that samples 3-7 and 3-8 have a significantly higher G' value than sample 3-5 (Figures 2 and 3).

Это увеличение G' связано как с взаимодействием между LMW HA и HMW гиалуроновой кислотой, применяемой в композиции, и особенно с эффектом улучшения устойчивости к деградации, связанной с присутствием LMW HA в композиции (что видно по улучшению значений потери G' при стерилизации).This increase in G' is due to both the interaction between the LMW HA and the HMW hyaluronic acid used in the composition and especially to the effect of improving the resistance to degradation associated with the presence of LMW HA in the composition (as seen by the improvement in the G' loss values upon sterilization).

Таким образом, в то время как добавление несшитой HMW гиалуроновой кислоты (например, 1,50 МДа) увеличивает механические свойства композиции без существенного улучшения ее устойчивости к деградации, добавление несшитой LMW HA увеличивает устойчивость к деградации геля при сохранении механических свойств мягкого геля.Thus, while the addition of non-crosslinked HMW hyaluronic acid (e.g. 1.50 MDa) increases the mechanical properties of the composition without significantly improving its resistance to degradation, the addition of non-crosslinked LMW HA increases the resistance to degradation of the gel while maintaining the mechanical properties of the soft gel.

Пример 4Example 4

Влияние вариаций в добавкахEffect of variations in additives

В этом примере сравнительный образец 4-1 идентичен образцу 3-5 (сравнительному), полученному в примере 3. Различные образцы получали для изучения влияния различных концентраций несшитой LMW HA.In this example, comparative sample 4-1 is identical to sample 3-5 (comparative) obtained in Example 3. Different samples were prepared to study the effect of different concentrations of non-crosslinked LMW HA.

Образец 4-1 сравнивали с образцами от 4-2 до 4-4, полученными аналогичным образом, но для которых композиция применяемого геля несшитой гиалуроновой кислоты дополнительно содержит возрастающие концентрации несшитой LMW HA (0,10 MДa HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты).Sample 4-1 was compared with samples 4-2 to 4-4, prepared in a similar manner but for which the composition of the non-crosslinked hyaluronic acid gel used additionally contained increasing concentrations of non-crosslinked LMW HA (0.10 MDa HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade).

Доля несшитой LMW HA (0,10 МДа, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) соответствует соотношению между массой несшитой LMW гиалуроновой кислоты и массой сшитой HMW гиалуроновой кислоты в композиции (%).The proportion of non-crosslinked LMW HA (0.10 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) corresponds to the ratio between the mass of non-crosslinked LMW hyaluronic acid and the mass of crosslinked HMW hyaluronic acid in the composition (%).

Реологические характеристики образцов и их потеря G' при стерилизации Δ G' (%) обобщены в таблице 7 ниже и на фигуре 4.The rheological characteristics of the samples and their G' loss during sterilization Δ G' (%) are summarized in Table 7 below and in Figure 4.

Таблица 7Table 7 ОбразцыSamples Доля несшитой LMW HA (%)Proportion of non-crosslinked LMW HA (%) Концентрация несшитой LMW HA (мг/г)Concentration of non-crosslinked LMW HA (mg/g) Концентрация сшитой и несшитой HMW HA (мг/г)Concentration of cross-linked and non-cross-linked HMW HA (mg/g) δ (°) после стерилизацииδ (°) after sterilization G' (Па) после стерилизацииG' (Pa) after sterilization Δ G' (%)Δ G' (%) F (Н)F (H) 4-1 (сравнительный)4-1 (comparative) 00 00 1515 16,4/0,516.4/0.5 110/3110/3 минус 20minus 20 10,4/0,610.4/0.6 4-2
(изобретение)4-2
(invention) 4848 55 1515 16,7/0,416.7/0.4 119/2119/2 минус 15minus 15 12,4/0,512.4/0.5 4-3
(изобретение)4-3
(invention) 9595 1010 1515 17,2/0,417.2/0.4 124/5124/5 минус 13minus 13 14,8/0,514.8/0.5 4-4
(изобретение)4-4
(invention) 143143 1515 1515 18,1/0,118.1/0.1 120/6120/6 минус 16minus 16 17,4/0,417.4/0.4

Стабилизирующий эффект добавки виден во всех образцах от 4-2 до 4-4 согласно изобретению.The stabilizing effect of the additive is visible in all samples from 4-2 to 4-4 according to the invention.

Таким образом, можно получить преимущественный эффект добавки к гелям, содержащим по меньшей мере одну сшитую HMW гиалуроновую кислоту, больших или меньших количеств несшитой LMW HA.Thus, it is possible to obtain an advantageous effect by adding larger or smaller amounts of non-crosslinked LMW HA to gels containing at least one crosslinked HMW hyaluronic acid.

Кроме того, приведенные выше результаты демонстрируют достижение композиций с высокой концентрацией гиалуроновой кислоты (до 30 мг/г общей гиалуроновой кислоты), которые остаются мягкими и легко инъецируемыми при реализации либо низких долей несшитой LMW HA (около 50 %), либо более высоких долей несшитой LMW HA (около 150 %).Furthermore, the above results demonstrate the achievement of compositions with high hyaluronic acid concentration (up to 30 mg/g total hyaluronic acid) that remain soft and easily injectable when implementing either low proportions of non-crosslinked LMW HA (around 50%) or higher proportions of non-crosslinked LMW HA (around 150%).

Пример 5Example 5

Влияние вариации концентрации HMW гиалуроновой кислотыEffect of variation in HMW hyaluronic acid concentration

В этом примере сравнительный образец 5-1 получали таким же образом, как и образец 3-5 (сравнительный), полученный в примере 3. Образцы 5-2 и 5-3 в соответствии с изобретением и содержащие более низкую концентрацию HMW гиалуроновой кислоты, чем в предыдущих примерах, получали с целью изучения влияния фиксированной концентрации несшитой LMW гиалуроновой кислоты на композиции с различными концентрациями сшитой и несшитой HMW гиалуроновой кислоты.In this example, comparative sample 5-1 was prepared in the same manner as sample 3-5 (comparative) obtained in example 3. Samples 5-2 and 5-3 according to the invention and containing a lower concentration of HMW hyaluronic acid than in the previous examples were prepared in order to study the effect of a fixed concentration of non-crosslinked LMW hyaluronic acid on compositions with different concentrations of crosslinked and non-crosslinked HMW hyaluronic acid.

Образец 5-2 получали аналогично образцу 5-1, но с целевой концентрацией 12 мг/г для фракции сшитой гиалуроновой кислоты и 12 мг/г для раствора несшитой HMW гиалуроновой кислоты, к которому добавляли достаточное количество 0,10 MДa несшитой гиалуроновой кислоты (HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) с получением концентрации 16 мг/г 0,10 MДa несшитой гиалуроновой кислоты в конечной композиции.Sample 5-2 was prepared similarly to sample 5-1, but with a target concentration of 12 mg/g for the cross-linked hyaluronic acid fraction and 12 mg/g for the non-cross-linked HMW hyaluronic acid solution, to which a sufficient amount of 0.10 MDa non-cross-linked hyaluronic acid (HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) was added to obtain a concentration of 16 mg/g 0.10 MDa non-cross-linked hyaluronic acid in the final composition.

Образец 5-3 также получали аналогично референсному образцу, но с целевой концентрацией 9 мг/г для фракции сшитой HMW гиалуроновой кислоты и 9 мг/г для раствора несшитой HMW гиалуроновой кислоты, к которому добавляли достаточное количество 0,10 MДa несшитой LMW гиалуроновой кислоты (HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты) с получением концентрации 16 мг/г 0,10 MДa несшитой гиалуроновой кислоты в конечной композиции.Sample 5-3 was also prepared similarly to the reference sample, but with a target concentration of 9 mg/g for the cross-linked HMW hyaluronic acid fraction and 9 mg/g for the non-cross-linked HMW hyaluronic acid solution, to which a sufficient amount of 0.10 MDa non-cross-linked LMW hyaluronic acid (HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade) was added to obtain a concentration of 16 mg/g 0.10 MDa non-cross-linked hyaluronic acid in the final composition.

Реологические характеристики образцов от 5-1 до 5-3, их доля несшитой LMW гиалуроновой кислоты (%) и потеря G' при стерилизации (Δ G' (%)) обобщены в таблице 8 ниже.The rheological characteristics of samples 5-1 to 5-3, their proportion of non-crosslinked LMW hyaluronic acid (%) and G' loss on sterilization (Δ G' (%)) are summarized in Table 8 below.

Таблица 8Table 8 ОбразцыSamples Доля несшитой LMW HA (%)Proportion of non-crosslinked LMW HA (%) Концентрация сшитой и несшитой HMW HA (мг/г)Concentration of cross-linked and non-cross-linked HMW HA (mg/g) Концентрация несшитой LMW HA (мг/г)Concentration of non-crosslinked LMW HA (mg/g) G' (Па) после стерилизацииG' (Pa) after sterilization δ (°) после стерилизацииδ (°) after sterilization Δ G' (%)Δ G' (%) F (Н) после стерилизацииF (H) after sterilization 5-1
(сравнительный)5-1
(comparative) 00 1515 00 98 ± 498 ± 4 17,7 ± 0,517.7 ± 0.5 минус 25minus 25 11,9 ± 0,311.9 ± 0.3 5-2
(изобретение)5-2
(invention) 190190 1212 1616 74 ± 174 ± 1 19,1 ± 0,619.1 ± 0.6 минус 19minus 19 18,2 ± 0,318.2 ± 0.3 5-3
(изобретение)5-3
(invention) 253253 99 1616 47 ± 847 ± 8 21,3 ± 0,821.3 ± 0.8 минус 4minus 4 14,1 ± 0,914.1 ± 0.9

Благодаря добавлению несшитой LMW гиалуроновой кислоты можно уменьшить долю сшитой и несшитой HMW гиалуроновой кислоты с 15 мг/г до 12 мг/г и наблюдать лишь незначительное снижение G' (образец 5-1 (сравнительный) по сравнению с образцом 5-2 (изобретение)).By adding non-crosslinked LMW hyaluronic acid, it is possible to reduce the proportion of crosslinked and non-crosslinked HMW hyaluronic acid from 15 mg/g to 12 mg/g and only a slight decrease in G' is observed (sample 5-1 (comparative) compared to sample 5-2 (invention)).

Кроме того, благодаря добавлению несшитой LMW гиалуроновой кислоты можно перейти от геля с 15 мг/г гиалуроновой кислоты к гелю с 28 мг/г гиалуроновой кислоты при сохранении механических свойств мягкого геля (образец 5-1 (сравнительный) по сравнению с образцом 5-2 (изобретение)).In addition, by adding non-crosslinked LMW hyaluronic acid, it is possible to switch from a gel with 15 mg/g hyaluronic acid to a gel with 28 mg/g hyaluronic acid while maintaining the mechanical properties of the soft gel (sample 5-1 (comparative) versus sample 5-2 (invention)).

Образец 5-3, полученный с очень небольшим количеством сшитой и несшитой HMW гиалуроновой кислоты, демонстрирует минимальную потерю G' при стерилизации (только минус 4 %).Sample 5-3, obtained with very small amounts of cross-linked and non-cross-linked HMW hyaluronic acid, shows minimal loss of G' upon sterilization (only minus 4%).

Присутствие несшитой LMW гиалуроновой кислоты преимущественно уменьшает количество сшитой гиалуроновой кислоты, необходимое для получения мягкого геля. Это также позволяет увеличить общую концентрацию гиалуроновой кислоты. Другими словами, добавка, таким образом, позволяет получать мягкие гели с потенциально повышенной биосовместимостью (снижение доли применяемой сшитой гиалуроновой кислоты), но также эффективные с биомеханической и/или биологической точки зрения.The presence of non-crosslinked LMW hyaluronic acid advantageously reduces the amount of crosslinked hyaluronic acid required to obtain a soft gel. It also allows for an increase in the overall concentration of hyaluronic acid. In other words, the additive thus allows for the production of soft gels with potentially increased biocompatibility (reduced proportion of crosslinked hyaluronic acid used), but also effective from a biomechanical and/or biological point of view.

Пример 6Example 6

Устойчивость к ферментативной деградацииResistance to enzymatic degradation

Образец 6-1 получали по тому же протоколу, что и образец 3-5 (сравнительный), полученный в Примере 3.Sample 6-1 was prepared using the same protocol as sample 3-5 (comparative) obtained in Example 3.

Образец 6-2 получали аналогичным образом, но композицию применяемого геля несшитой гиалуроновой кислоты модифицировали таким образом, чтобы конечный гель дополнительно содержал 10 мг/г несшитой LMW гиалуроновой кислоты (0,10 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты).Sample 6-2 was prepared in a similar manner, but the composition of the non-crosslinked hyaluronic acid gel used was modified such that the final gel additionally contained 10 mg/g non-crosslinked LMW hyaluronic acid (0.10 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade).

Образец 6-3 также получали аналогично образцу 6-1, но композицию применяемого геля несшитой гиалуроновой кислоты модифицировали таким образом, чтобы конечный гель дополнительно содержал 10 мг/г несшитой HMW гиалуроновой кислоты (1,50 MДa, HTL, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты).Sample 6-3 was also prepared similarly to sample 6-1, but the composition of the non-crosslinked hyaluronic acid gel used was modified such that the final gel additionally contained 10 mg/g non-crosslinked HMW hyaluronic acid (1.50 MDa, HTL, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade).

Все эти образцы подвергали испытанию на ферментативную деградацию с гиалуронидазой (HAase).All these samples were tested for enzymatic degradation with hyaluronidase (HAase).

Реологические характеристики образцов и их потеря G' при ферментативной деградации обобщены в таблице 9 ниже и на фигуре 5.The rheological characteristics of the samples and their G' loss during enzymatic degradation are summarized in Table 9 below and Figure 5.

Таблица 9Table 9 ОбразцыSamples Концентрация сшитой и несшитой HMW HA (мг/г)Concentration of cross-linked and non-cross-linked HMW HA (mg/g) Концентрация добавленной несшитой HA (мг/г)Concentration of added non-crosslinked HA (mg/g) Добавленная несшитая HA (МДа)Added uncrosslinked HA (MDa) G' (Па) до деградации/стандартное отклонениеG' (Pa) before degradation/standard deviation G' (Па) после деградации/стандартное отклонениеG' (Pa) after degradation/standard deviation Δ G' (%)Δ G' (%) 6-1
(сравнительный)6-1
(comparative) 1515 00 НДND 110/3110/3 89/189/1 минус 19minus 19 6-2
(изобретение)6-2
(invention) 1515 1010 0,100.10 124/5124/5 110/3110/3 минус 12minus 12 6-3
(сравнительный)6-3
(comparative) 2525 1010 1,501.50 240/21240/21 188/4188/4 минус 22minus 22

Следует отметить, что образцы 6-2 и 6-3 (содержащие гиалуроновые кислоты с молярными массами 0,10 МДа и 1,50 МДа, соответственно) имеют очень разные исходные свойства. Свойства образца 6-3 не желательны для применения для регенерации кожи и/или улучшения состояния кожи (см. δ, G' и F).It should be noted that samples 6-2 and 6-3 (containing hyaluronic acids with molar masses of 0.10 MDa and 1.50 MDa, respectively) have very different initial properties. The properties of sample 6-3 are not desirable for use in skin regeneration and/or skin condition improvement (see δ, G' and F).

Потеря G' при ферментативной деградации ниже в присутствии несшитой LMW гиалуроновой кислоты, чем без (образец 6-2 по сравнению с образцом 6-1) и даже чем в присутствии несшитой HMW гиалуроновой кислоты (образец 6-2 по сравнению с образцом 6-3). Таким образом, повышенная устойчивость композиции, представленной как соответствующая изобретению (образец 6-2), связана не с простым добавлением несшитой гиалуроновой кислоты, а конкретно с добавлением несшитой LMW гиалуроновой кислоты.The loss of G' upon enzymatic degradation is lower in the presence of non-crosslinked LMW hyaluronic acid than without (sample 6-2 compared to sample 6-1) and even than in the presence of non-crosslinked HMW hyaluronic acid (sample 6-2 compared to sample 6-3). Thus, the increased stability of the composition presented as corresponding to the invention (sample 6-2) is not due to the simple addition of non-crosslinked hyaluronic acid, but specifically to the addition of non-crosslinked LMW hyaluronic acid.

Таким образом, композиции, дополненные в соответствии с изобретением, обладают лучшей устойчивостью к ферментативной деградации по сравнению с композициями, имеющими одинаковую общую концентрацию гиалуроновой кислоты, одинаковую степень сшивания фракции сшитой гиалуроновой кислоты, но содержащими только HMW гиалуроновую кислоту.Thus, the compositions supplemented in accordance with the invention have better resistance to enzymatic degradation compared to compositions having the same total concentration of hyaluronic acid, the same degree of cross-linking of the cross-linked hyaluronic acid fraction, but containing only HMW hyaluronic acid.

Такая повышенная устойчивость к деградации под действием гиалуронидазы предполагает повышенную долговечность in vivo композиций согласно изобретению.Such increased resistance to degradation by hyaluronidase suggests increased in vivo durability of the compositions of the invention.

Наконец, приведенные выше результаты подчеркивают защитный эффект несшитой LMW гиалуроновой кислоты, таким образом, благоприятный эффект дополнения композицией на основе по меньшей мере одного сшитого гликозаминогликана.Finally, the above results highlight the protective effect of non-cross-linked LMW hyaluronic acid, thus the beneficial effect of supplementation with a composition based on at least one cross-linked glycosaminoglycan.

Пример 7Example 7

Характеристика водорастворимой и неводорастворимой гиалуроновой кислоты, присутствующей в образцахCharacteristics of water-soluble and non-water-soluble hyaluronic acid present in the samples

Водорастворимая и неводорастворимая гиалуроновая кислота (sHA и nsHA) нескольких стерилизованных образцов была охарактеризована, как описано выше. Исходный материал HA, Евр. Фарм. фармацевтическая/медицинская степень чистоты, получали из HTL.Water-soluble and non-water-soluble hyaluronic acid (sHA and nsHA) of several sterilized samples were characterized as described above. The starting material HA, Eur. Pharm. pharmaceutical/medical grade, was obtained from HTL.

Следующие композиции считаются референсными:The following compositions are considered reference:

- Образец 7-1: сшитая HA HMW: гель сшитой HA, полученный только с HA 4,00 MДa в фосфатном буфере; эту сшитую HA получают в качестве части сшитой HA образца 2-1, но набухают с получением геля с концентрацией 10,5 мг/г NaHA в расчете на общую массу геля;- Sample 7-1: HMW cross-linked HA: cross-linked HA gel prepared with only 4.00 MDa HA in phosphate buffer; this cross-linked HA was prepared as a portion of the cross-linked HA of sample 2-1, but swelled to yield a gel with a concentration of 10.5 mg/g NaHA based on the total gel weight;

- Образец 7-2: несшитая HA HMW: несшитая HA, полученная только с 4,00 MДa в фосфатном буфере с концентрацией 4,5 мг/г NaHA в расчете на общую массу геля;- Sample 7-2: Non-crosslinked HA HMW: Non-crosslinked HA prepared with only 4.00 MDa in phosphate buffer with a concentration of 4.5 mg/g NaHA based on the total gel weight;

- Образец 7-3: несшитая HA LMW: несшитая HA, полученная только с HA 0,10 MДa в фосфатном буфере с концентрацией 10 мг/г NaHA в расчете на общую массу геля.- Sample 7-3: Non-crosslinked HA LMW: Non-crosslinked HA prepared with only 0.10 MDa HA in phosphate buffer with a concentration of 10 mg/g NaHA based on the total gel weight.

Следующие три образца имеют переменную долю HMW HA и LMW HA, добавленных во время процесса.The next three samples have variable proportions of HMW HA and LMW HA added during the process.

- Образец 7-4: гель, как ранее представленный образец 2-4, содержащий до стерилизации сшитую HA HMW, полученную только с HA 4,00 MДa, и несшитую HA LMW, полученную с HA 0,10 MДa;- Sample 7-4: gel as previously presented sample 2-4, containing, before sterilization, cross-linked HA HMW obtained with HA 4.00 MDa only and non-cross-linked HA LMW obtained with HA 0.10 MDa;

- Образец 7-5: гель, содержащий до стерилизации сшитую HA, полученную только с HA HMW 4,00 MДa, и несшитую HA LMW, полученную с HA 0,10 MДa, и несшитую HA HMW, полученную с HA 4,00 MДa; указанный гель соответствует образцу 2-1, дополнительно содержащему дополнительную фиксированную концентрацию 10 мг/г несшитой HA LMW 0,10 MДa в расчете на общую массу геля (1 %);- Sample 7-5: a gel containing, before sterilization, cross-linked HA obtained only with HA HMW 4.00 MDa, and non-cross-linked HA LMW obtained with HA 0.10 MDa, and non-cross-linked HA HMW obtained with HA 4.00 MDa; this gel corresponds to sample 2-1 additionally containing an additional fixed concentration of 10 mg/g non-cross-linked HA LMW 0.10 MDa based on the total weight of the gel (1%);

- Образец 7-6: гель, как представленный ранее образец 2-1, содержащий сшитую HA HMW, полученную с HA 4,00 MДa, и несшитую HA HMW 4,00 MДa.- Sample 7-6: a gel similar to sample 2-1 presented earlier, containing cross-linked HMW HA prepared with HA 4.00 MDa and non-cross-linked HMW HA 4.00 MDa.

Все образцы от 7-1 до 7-6 стерилизуют автоклавированием (влажным нагреванием) с F0 более 15 мин.All samples from 7-1 to 7-6 are sterilized by autoclaving (moist heat) with F0 more than 15 min.

Кроме того, продукт, коммерциализированный Allergan, Juvederm Volift, тестировали в качестве образца 7-7. Этот продукт получали с использованием технологии сшивания Vycross, которая известна тем, что относится к сшитой гиалуроновой кислоте, полученной с гиалуроновыми кислотами с различной среднемассовой молярной массой, включая большую долю LMW HA. Указанный продукт содержит лидокаин HCl, концентрацию общей HA 17,5 мг/г и его стерилизуют влажным нагреванием.In addition, the product commercialized by Allergan, Juvederm Volift, was tested as a 7-7 sample. This product was produced using Vycross cross-linking technology, which is known for being a cross-linked hyaluronic acid produced with hyaluronic acids of different average molar masses, including a large proportion of LMW HA. This product contains lidocaine HCl, a total HA concentration of 17.5 mg/g, and is sterilized by moist heat.

Образец 7-1 (100 % HA, участвующей в реакции сшивания) показывает sHA с MOD 17 %, тогда как образцы 7-2 и 7-3 (только стерилизованная несшитая HA) логично не имеют никакого MOD. Сшитый образец 7-1 высвобождает фрагменты sHA (преимущественно LMW), которые сильно модифицированы сшивающим агентом. Образец 7-2, который получали из исходного материала несшитой HA 4,00 MДa, представляет наибольшую долю sHA с более 0,30 MДa, тогда как образец 7-3, полученный с применением исходного материала несшитой HA 0,10 MДa, представляет всю долю sHA с менее 0,30 MДa.Sample 7-1 (100% HA involved in the cross-linking reaction) shows sHA with a MOD of 17%, while samples 7-2 and 7-3 (sterilized, non-cross-linked HA only) logically have no MOD. The cross-linked sample 7-1 releases sHA fragments (primarily LMW) that are heavily modified by the cross-linking agent. Sample 7-2, which was prepared from a 4.00 MDa non-cross-linked HA starting material, represents the largest proportion of sHA with greater than 0.30 MDa, while sample 7-3, prepared using a 0.10 MDa non-cross-linked HA starting material, represents all sHA with less than 0.30 MDa.

Дополненные композиции согласно изобретению имеют sHA с более низким MOD, чем композиции, полученные без добавок (образцы 7-4 по сравнению с 7-1, 7-5 по сравнению с 7-6), за счет того, что несшитая LMW (0,10 MДa) HA увеличивает молярное количество дисахаридных звеньев HA в sHA, тем самым уменьшая значения MOD. Примечательно, что гели по изобретению (образцы 7-3 и 7-4) имеют более высокую долю LMW sHA с менее 0,3 MДa по сравнению с образцами 7-5, 7-6 и 7-7. В частности, коммерческий образец 7-7, полученный с большой долей несшитой LMW HA для сшивания, не содержит такого большого количества LMW sHA.The supplemented compositions according to the invention have sHA with a lower MOD than the compositions obtained without additives (samples 7-4 compared to 7-1, 7-5 compared to 7-6), due to the fact that the non-crosslinked LMW (0.10 MDa) HA increases the molar amount of HA disaccharide units in the sHA, thereby decreasing the MOD values. Notably, the gels of the invention (samples 7-3 and 7-4) have a higher proportion of LMW sHA with less than 0.3 MDa compared to samples 7-5, 7-6 and 7-7. In particular, commercial sample 7-7, obtained with a high proportion of non-crosslinked LMW HA for crosslinking, does not contain such a large amount of LMW sHA.

Теоретически можно ожидать, что композиция, содержащая сшитую HA HMW, дополненная несшитой HA LMW, имеет процентную долю общей sHA, равную сумме:Theoretically, a composition containing cross-linked HMW HA supplemented with non-cross-linked LMW HA would be expected to have a percentage of total sHA equal to the sum of:

- процентной доли несшитой HA LMW в расчете на общую массу HA в композиции и- the percentage of non-crosslinked HA LMW based on the total weight of HA in the composition and

- процентной доли общей sHA в расчете на общую массу HA, измеренной только для сшитой части.- percentage of total sHA based on the total HA mass, measured for the cross-linked portion only.

Образец 7-1 (100 % HA, участвующей в реакции сшивания) показывает 20,6 % общей sHA в расчете на общую массу HA в композиции, таким образом, теоретически можно ожидать, что образец 7-3 (то же самое основание из сшитой HA, что и у образца 7-1, дополнительно содержащее несшитую HA LMW) имеет около 30 + 20,6 = 50,6 % sHA в расчете на общую массу HA в композиции.Sample 7-1 (100% HA participating in the cross-linking reaction) shows 20.6% total sHA based on the total weight of HA in the composition, so sample 7-3 (the same cross-linked HA base as sample 7-1, additionally containing non-cross-linked LMW HA) would theoretically be expected to have about 30 + 20.6 = 50.6% sHA based on the total weight of HA in the composition.

Тем не менее, измеренный процент общей sHA для образца 7-3 на около 10 пунктов ниже (40,5 %). Это говорит о том, что добавка согласно изобретению защищает цепи HA во время процесса получения, снижая высвобождение LMW sHA, другими словами, что она повышает устойчивость к деградации композиции.However, the measured percentage of total sHA for sample 7-3 is about 10 points lower (40.5%). This suggests that the additive according to the invention protects the HA chains during the production process, reducing the release of LMW sHA, in other words, that it increases the degradation resistance of the composition.

В заключениеIn conclusion

Методы SEC и ¹H ЯМР могут быть успешно использованы для характеристики геля sHA и помогают отличить стандартные гели от гелей согласно настоящему изобретению.SEC and ¹ H NMR methods can be successfully used to characterize sHA gel and help to distinguish standard gels from gels according to the present invention.

Пример 8Example 8

Влияние массового отношения «несшитой HA LMW» к «HA HMW»Effect of the mass ratio of "uncrosslinked HA LMW" to "HA HMW"

Изученные образцы представлены ниже.The studied samples are presented below.

Образец 8-1, согласно изобретению, представляет собой гель из сшитой гиалуроновой кислоты, стерилизованный в шприцах автоклавированием (F0 более 15 минут), с общей концентрацией гиалуроновой кислоты 20 мг/г и полученный в результате смешивания до стерилизации в пропорции 1:1 следующего:Sample 8-1, according to the invention, is a gel of cross-linked hyaluronic acid, sterilized in syringes by autoclaving (F0 more than 15 minutes), with a total concentration of hyaluronic acid of 20 mg/g and obtained by mixing before sterilization in a 1:1 ratio of the following:

- геля сшитой гиалуроновой кислоты, полученный с несшитой HA HMW (4,00 MДa, HTL, фармацевтическая/медицинская Евр. Фарм. степень чистоты) и БДДЭ (Sigma Aldrich, ≥ 95 %) с общей концентрацией гиалуроновой кислоты 20 мг/г в фосфатном буфере и степенью сшивания 2 %; и- cross-linked hyaluronic acid gel obtained with non-cross-linked HA HMW (4.00 MDa, HTL, pharmaceutical/medical Eur. Pharm. grade) and BDDE (Sigma Aldrich, ≥ 95%) with a total hyaluronic acid concentration of 20 mg/g in phosphate buffer and a cross-linking degree of 2%; and

- раствора несшитой гиалуроновой кислоты 20 мг/г несшитой HA LMW (0,10 MДa, Altergon, фармацевтическая/медицинская Евр. Фарм. степень чистоты).- solution of non-cross-linked hyaluronic acid 20 mg/g non-cross-linked HA LMW (0.10 MDa, Altergon, pharmaceutical/medical Eur. Pharm. purity).

Образец 8-2 представляет собой сравнительный гель, полученный как образец 8-1, но с раствором несшитой гиалуроновой кислоты 2 мг/г несшитой HA LMW (010 MДa, Altergon, фармацевтическая/медицинская Евр. Фарм. степень чистоты) в фосфатном буфере вместо раствора несшитой гиалуроновой кислоты 20 мг/г несшитой HA LMW (0,10 МДа, Altergon, фармацевтическая/медицинская Евр. Фарм. степень чистоты).Sample 8-2 is a comparative gel prepared as sample 8-1 but with a solution of 2 mg/g non-crosslinked HA LMW (0.10 MDa, Altergon, pharmaceutical/medical Eur. Pharm. grade) in phosphate buffer instead of a solution of 20 mg/g non-crosslinked HA LMW (0.10 MDa, Altergon, pharmaceutical/medical Eur. Pharm. grade).

Образец 8-3 представляет собой референсный гель, имеющий концентрацию сшитой HMW HA 10 мг/г в расчете на общую массу геля. Его получали как образец 8-1, но с применением только фосфатного буфера вместо раствора несшитой гиалуроновой кислоты 20 мг/г несшитой HA LMW (0,10 MДa, Altergon, фармацевтическая/медицинская Евр. Фарм. степень чистоты).Sample 8-3 is a reference gel having a concentration of 10 mg/g cross-linked HMW HA based on the total gel weight. It was prepared as sample 8-1 but using only phosphate buffer instead of the 20 mg/g non-cross-linked HA LMW non-cross-linked hyaluronic acid solution (0.10 MDa, Altergon, pharmaceutical/medical Eur. Pharm. grade).

Таблица 11Table 11 ОбразцыSamples Концентрация сшитой HMW HA (мг/г)Cross-linked HMW HA concentration (mg/g) Концентрация несшитой LMW HA (мг/г)Concentration of non-crosslinked LMW HA (mg/g) Массовое соотношение несшитая LMW HA:сшитая HMW HAMass ratio non-crosslinked LMW HA:crosslinked HMW HA Δ G' (%)Δ G' (%) улучшение G' (%)improvement G' (%) 8-1
(изобретение)8-1
(invention) 1010 1010 1:11:1 минус 17minus 17 2323 8-2
(сравнительный)8-2
(comparative) 1010 11 1:101:10 минус 20minus 20 99 8-3
(референс)8-3
(reference) 1010 00 00 минус 22minus 22 00

Образец 8-1 имеет хороший процент улучшения G’, но образец 8-2 имеет более низкое значение. Соответственно, можно сделать вывод, что для получения значительного процента улучшения G’ необходима достаточная доля LMW HA.Sample 8-1 has a good G’ improvement percentage, but sample 8-2 has a lower value. Accordingly, it can be concluded that a sufficient proportion of LMW HA is needed to obtain a significant G’ improvement percentage.

Claims

1. A cosmetic and/or dermatological aqueous gel based on hyaluronic acid, containing cross-linked hyaluronic acid, characterized in that said gel additionally contains at least:

- water-soluble hyaluronic acid having a mass-average molar mass in the range of 0.02 to 0.30 MDa, referred to as "sHA LMW", in an amount of 30 to 70 wt.% based on the total mass of hyaluronic acid; and

- water-soluble hyaluronic acid with a mass-average molar mass of more than 0.30 MDa, called "sHA HMW",

and the fact that the said water-soluble hyaluronic acids have a modification degree of 5% or less,

where the degree of modification of all hyaluronic acids is 5% or less;

the corresponding percentage values for water-soluble hyaluronic acids are determined by diluting the aqueous gel with a solution of 150 nM sodium nitrate at pH 7.2 containing 0.02% NaN ₃ at 25 °C for 5 days and centrifuging it at 4400 rpm for 10 min and filtering it through 0.45 mm of the said diluted gel to obtain a filtrate, then analyzing the said filtrate using a size exclusion chromatography instrument equipped with a multi-angle light scattering (MALS) detector and a refractometric (RI) detector with a refractive index increment (dn/dc) set at 0.165 ml/g and a liquid chromatograph pump station equipped with a dual set of size exclusion columns adapted for molecules having a mass average molar mass in the range from 0.001 Da to 20 MDa, with a mobile sodium nitrate phase with pH 7.2 at a flow rate of 0.3 ml/min.

2. An aqueous gel according to claim 1, wherein said water-soluble hyaluronic acids have a modification degree of 3% or less, preferably 1% or less.

3. An aqueous gel according to claim 1 or 2, containing from 35 to 65% by weight of “sHA LMW” based on the total weight of said hyaluronic acid.

4. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 3, wherein said water-soluble hyaluronic acid, referred to as "sHA LMW", has a mass average molar mass in the range of 0.04 to 0.20 MDa, preferably 0.04 to 0.15 MDa.

5. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 4, wherein said water-soluble hyaluronic acid, referred to as "sHA HMW", has a mass average molar mass of greater than 0.30 MDa and less than or equal to 4.00 MDa.

6. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 5, containing from 10 to 30 wt.%, preferably from 15 to 20 wt.% of “sHA HMW” based on the total weight of said hyaluronic acid.

7. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 6, wherein said cross-linked hyaluronic acid is present in an amount of at least 5 mg/g based on the total weight of said aqueous gel.

8. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 7, wherein said water-soluble hyaluronic acid, referred to as "sHA LMW", is present in an amount of at least 3 mg/g, preferably 10 mg/g, based on the total weight of said aqueous gel.

9. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 8, wherein the total concentration of hyaluronic acid is from 10 to 40 mg/g, preferably from 15 to 35 mg/g, more preferably from 20 to 30 mg/g, based on the total weight of said aqueous gel.

10. An aqueous gel according to any one of claims 1 to 9, wherein the degree of modification of the total hyaluronic acid is 3% or less, more preferably 1% or less.

11. An aqueous gel according to any one of paragraphs 1-10, wherein:

- cross-linked hyaluronic acid is present in an amount in the range of 6 to 12 mg/g based on the total weight of the said aqueous gel,

- water-soluble hyaluronic acid, called "sHA LMW", is present in an amount in the range of 12 to 20 mg/g based on the total weight of said aqueous gel,

- water-soluble hyaluronic acid, called "sHA HMW", is present in an amount in the range of 3 to 6 mg/g based on the total weight of the said aqueous gel,

wherein said aqueous gel contains a total concentration of hyaluronic acid from 20 to 30 mg/g based on the total weight of said aqueous gel.

12. An aqueous gel according to any one of paragraphs 1-11, characterized in that said gel is a sterile gel.

13. A cosmetic and/or dermatological composition containing an aqueous gel according to any one of claims 1-12.

14. An aqueous gel according to any one of claims 1-12 or a dermatological composition according to claim 13 for preventing and/or treating changes in the appearance of the skin surface.

15. An aqueous gel according to any one of claims 1-12 or a dermatological composition according to claim 13 for contour plastic surgery and/or filling of soft tissues.

16. Non-therapeutic cosmetic use of an aqueous gel according to any one of claims 1-12 or a cosmetic composition according to claim 13 for preventing and/or treating changes in the appearance of the surface of the skin.