RU2737539C2 - Способ очистки белка - Google Patents
Способ очистки белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2737539C2 RU2737539C2 RU2018138445A RU2018138445A RU2737539C2 RU 2737539 C2 RU2737539 C2 RU 2737539C2 RU 2018138445 A RU2018138445 A RU 2018138445A RU 2018138445 A RU2018138445 A RU 2018138445A RU 2737539 C2 RU2737539 C2 RU 2737539C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- fragment
- protein
- chromatography
- filtration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 102
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 22
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 18
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 claims description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 41
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 15
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 15
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 14
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 229940052665 nadh Drugs 0.000 description 13
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 8
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 7
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 7
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 6
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- -1 etc. Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108010079911 Thioredoxin-disulfide reductase Proteins 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101000578492 Escherichia coli Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 2
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013090 Thioredoxin-Disulfide Reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLNDNABNWASMFD-UHFFFAOYSA-N 4-[(1,3-dimethylimidazol-1-ium-2-yl)diazenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=[N+](C)C=CN1C YLNDNABNWASMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 1
- 101100186130 Arabidopsis thaliana NAC052 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001519377 Atrichum undulatum Species 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 101100135859 Dictyostelium discoideum regA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 101150050927 Fcgrt gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096839 Fcmr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 238000012369 In process control Methods 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 1
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 1
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000195887 Physcomitrella patens Species 0.000 description 1
- 101100082606 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) PDEbeta gene Proteins 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100135860 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PDE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 102000019307 Sclerostin Human genes 0.000 description 1
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229940090568 combinations of vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000375 direct analysis in real time Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000003821 enantio-separation Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010965 in-process control Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150036274 kil gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012516 mab select resin Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
- B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
- B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/265—Adsorption chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction, e.g. ion-exchange, ion-pair, ion-suppression or ion-exclusion
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G or L chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J47/00—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor
- B01J47/014—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor in which the adsorbent properties of the ion-exchanger are involved, e.g. recovery of proteins or other high-molecular compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ получения антитела или его фрагмента, способ предотвращения восстановления дисульфидной связи во время очистки антитела или его фрагмента, способ очистки антитела или его фрагмента от жидкой смеси, а также способ уменьшения количества восстанавливающих агентов во время очистки антитела или его фрагмента. Вышеуказанные способы включают введение смеси, содержащей антитело или его фрагмент, обломки клеток-хозяев и примеси, на стадию фильтрации через активированный уголь, а далее хроматографию на белке А. Изобретения обеспечивают очистку белков в их нативной конформации с постоянной степенью чистоты в различных партиях. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 пр., 7 ил.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В области терапевтических препаратов использование белков, и в частности, антител и образованных из антител молекул, постоянно набирает силу и значимость, и соответственно, параллельно развивается необходимость в контролируемых производственных процессах. Коммерческое внедрение терапевтических белков требует их производства в больших количествах. C этой целью белок часто экспрессируется в клетке-хозяине и затем должен быть выделен и очищен до его приготовления в виде вводимой формы. Примеси, которые удаляются во время указанной очистки, обычно классифицируются как связанные с процессом примеси, включая обломки клеток-хозяев, белки клеток-хозяев, следы культуральных сред и т. д., и связанные с продуктом примеси, образующиеся в результате модификации, разрушения или агрегирования целевого продукта.
Наиболее распространенным классом молекул антител является иммуноглобулин G (IgG), гетеротетрамер, состоящий из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Молекула IgG может подразделяться на две функциональные субъединицы: (1) кристаллизующийся фрагмент (Fc), который образует «хвост» антитела и взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности для активации иммунного ответа, и (2) антигенсвязывающий фрагмент (Fab), который опосредует распознавание антигена. Fc-область содержит две пары константных доменов (CH2 и CH3) из двух парных тяжелых цепей, тогда как Fab-область состоит из вариабельного домена, за которым следует константный домен из тяжелой цепи (VH и CH1, соответственно), которые соединяются с вариабельным и константным доменом из легкой цепи (VL и CL, соответственно). Fc- и Fab-области разграничены шарнирной областью, которая содержит дисульфидную связь, удерживающую две тяжелые цепи вместе; дополнительные дисульфидные мостики в доменах CH1 и CL соединяют тяжелую и легкую цепи вместе.
Полноразмерные антитела класса IgG обычно очищают с помощью способов, которые включают стадию захвата аффинной хроматографии с использованием белка А, полученного из Staphylococcus aureus. Высокая специфичность связывания между белком А и Fc-областью антител позволяет этому методу хроматографии удалять более 98% примесей в одну стадию, начиная непосредственно из сложных растворов, таких как собранные клеточные культуральные среды. Большой коэффициент очистки, получаемый на этой стадии процесса, помогает упростить весь последующий процесс очистки. Как правило, только следовые примеси, такие как высокомолекулярные агрегаты, остаточные белки клеток-хозяев, остаточная ДНК или вымываемый белок A, остается удалить после этой стадии очистки, и это обычно может быть достигнуто за одну-две последующие стадии хроматографии.
Несмотря на тот факт, что очистка антител на основе белка А использовалась и развивалась в течение последних десятилетий, производство рекомбинантных антител в промышленном масштабе с уровнем чистоты, подходящим для введения препарата, остается сложной проблемой. В частности, белки, такие как антитела и их фрагменты, содержат межцепочечные дисульфидные связи, которые обычно нуждаются в защите и сохранении в процессе производства и очистки для получения антител в их нативной конформации, соответственно, сохраняющих свою биологическую активность.
Когда эти межцепочечные дисульфидные связи подвергаются воздействию окружающей среды и становятся восстановленными, различные полипептидные цепи будут разделяться, приводя к появлению примесей, состоящих из неполных молекул антител, которые должны быть удалены из конечного препарата антитела. По мере того, как среда становится окисляющей в дальнейшем во время процесса очистки, эти связанные с восстановлением примеси могут некорректно преобразовываться, что приводит к увеличению концентраций связанных с продуктом высоко- и низкомолекулярных соединений. Очистка образующихся дополнительных примесей приводит к снижению выхода способа и повышению уровней примесей в конечном лекарственном веществе. Кроме того, должна обеспечиваться воспроизводимость между производственными партиями, и поэтому регулирование наличия и относительного содержания таких примесей имеет важное значение для исключения брака конкретных производственных партий. Брак в партии может быть вызван или повышенными уровнями примесей в лекарственном веществе, или несоблюдением внутрипроизводственного контроля. Повышенный уровень примесей в лекарственном веществе также может снижать срок хранения лекарственного продукта.
В ходе получения антител появление примесей, связанных с продуктом, таких как свободные тяжелые и легкие цепи, полумономеры (одна тяжелая цепь и одна легкая цепь) или изоформы, частично лишенные дисульфидных связей, благодаря восстановлению межцепочечных дисульфидных связей, наблюдалось после стадии хроматографии на белке А. Следует избегать появления этих примесей во время процесса очистки и удалять примеси в ходе указанного процесса. Возможные связанные с продуктом примеси могут быть проанализированы с помощью невосстановительного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и показаны на фиг.1.
В этом отношении в US 8574869 описан способ предотвращения восстановления дисульфидной связи при сборе рекомбинантных белков из культур клеток-хозяев.
Соответственно, сохраняется потребность в воспроизводимых способах получения белка, которые позволяют осуществлять очистку белков в их нативной конформации с постоянной степенью чистоты в различных партиях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1: Невосстановительный гель-электрофорез с окраской кумасси, показывающий возможные связанные с продуктом примеси, выделенные из образца антитела после проведения очистки.
Фигура 2: Невосстановительный биоанализ образцов элюата с белка А соединения А. Образцы представляют собой образцы элюата белка A из партии 1 и партии 2 производственного цикла 2 (C2B1 и C2B2, соответственно), без использования угольного фильтра, и партии 1 цикла 3 (C3B1), где угольный фильтр использовался. Полумономер, отмечающийся в образцах партии 2, не наблюдается в образце партии 3.
Фигура 3: Блок-схема процесса очистки, включающего фильтрацию через уголь. Стадию фильтрации через фильтр с активированным углем выполняли в одном потоке между глубинной фильтрацией и фильтрацией через стерилизующий фильтр. Затем следовала стадия захвата с использованием белка A и последующие стадии очистки: анионообменная хроматография (AEX), катионообменная хроматография (CEX), снижение вирусной нагрузки фильтрацией (VRF) и приготовление лекарственной формы.
Фигура 4: Невосстановительный биоанализ производственных образцов соединения В IgG. Показанные образцы представляют собой осветленную клеточную культуральную жидкость и элюат захвата (после хроматографии на белке А) для партии 1, в которой антитело восстанавливается, образуя полумономер и свободную тяжелую цепь. Также показан элюат захвата для партии 3, в которой фильтр с активированным углем использовался при первичном извлечении, и молекула антитела была все еще мономерной после стадии захвата на белке А.
Фигура 5: Невосстановительный SDS-PAGE анализ с окрашиванием Sypro производственных образцов соединения В. Дорожка 1: стандарт молекулярной массы, Дорожка 2: эталонный стандарт соединения 1, Дорожка 3: клеточная культуральная жидкость партии 1 цикла 1, Дорожка 4: партия 2 цикла 1 до угольного фильтра, Дорожка 5: партия 2 цикла 1 после угольного фильтра, Дорожка 6: элюат захвата для партии 1 цикла 1, Дорожка 7: элюат захвата без угольного фильтра для партии 2 цикла 1, Дорожка 8: элюат захвата после угольного фильтра для партии 2 цикла 1.
Фигура 6: Осветленная клеточная культуральная жидкость (CCCF) соединения А с глубинной и стерилизующей фильтрацией (контроль) и после введения угольного фильтра между глубинным и стерилизующим фильтрами, анализируемая на восстанавливающие агенты тиоредоксин (А), NAD/NADH (B) и NADP/NADPH (C).
Фигура 7: Осветленная клеточная культуральная жидкость (CCCF) соединения B из партии 1 (до введения угольного фильтра, контроль) и партии 2 (после введения угольного фильтра), анализируемая на восстанавливающие агенты NAD/NADH и NADP/NADPH.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение решает указанную выше потребность, предлагая новый способ получения антител, который позволяет выделять антитело с нативными дисульфидными связями, соответственно повышая выход процесса и гарантируя стабильность между партиями.
Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу получения антитела или его фрагмента, включающему:
- экспрессию указанного антитела или его фрагмента в клетке-хозяине;
- выделение смеси, содержащей антитело или его фрагмент, обломки клеток-хозяев и примеси; и
- очистку указанного антитела или его фрагмента от смеси, при этом указанная очистка включает:
- фильтрацию через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
Во втором аспекте изобретение относится к способу предотвращения восстановления дисульфидной связи во время очистки антитела или его фрагмента, экспрессированного в клетке-хозяине, ему
- фильтрацию через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
В третьем аспекте изобретение относится к способу очистки антитела или его фрагмента, включающему:
- фильтрацию через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
В четвертом аспекте изобретение относится к способу уменьшения количества восстанавливающих агентов во время очистки антитела или его фрагмента, включающему:
- фильтрацию через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
Восстанавливающий агент, также называемый в данной области восстановителем или редуцирующим агентом, представляет собой элемент или соединение, которое теряет (или отдает) электрон другим химическим соединениям в окислительно-восстановительной химической реакции. Поскольку восстанавливающий агент теряет электроны, считается, что он окисляется. Некоторые восстанавливающие агенты, такие как, например, кальций, могут присутствовать в клеточной культуральной среде, дополнительные восстанавливающие агенты могут быть секретированы в клеточную культуральную жидкость в результате метаболизма клеток-хозяев. Кроме того, во время получения рекомбинантного белка восстанавливающие агенты могут дополнительно высвобождаться в среде из-за усилий сдвига и последующего повреждения клеток и возможного лизиса и/или апоптоза, выделяющих клеточные компоненты в среду. Количество и мощность восстанавливающих агентов высвобожденного содержимого клеток зависит от клеточной линии и процесса; примеры таких восстанавливающих агентов включают, без ограничения, глутатион, цистеинилглицинат, цистеинилсульфонат, тиоредоксин, NADP, NADPH, NAD, NADH.
В частном варианте осуществления четвертого аспекта изобретения способ по изобретению снижает количество тиоредоксина, NADP, NADPH, NAD и/или NADH.
В еще одном частном варианте осуществления четвертого аспекта изобретения способ по изобретению снижает количество тиоредоксина, NADP, NADPH, NAD и/или NADH.
Как правило, хроматографию на белке А проводят в режиме связывания и элюирования, в котором связывание представляющего интерес белка с твердой фазой позволяет примесям, таким как белки клеток-хозяев, протекать через хроматографическую среду, в то время как представляющий интерес белок остается связанным с твердой фазой. Представляющий интерес связанный белок затем извлекают из твердой фазы элюирующим буфером, который разрушает механизм, с помощью которого представляющий интерес белок связывается с указанной твердой фазой.
В еще одном варианте осуществления способа по изобретению первый раствор добавляют к хроматографическому материалу белка А после нанесения смеси, содержащей антитело или его фрагмент, благодаря чему несвязанный материал удаляется в раствор.
В еще одном варианте осуществления способа по изобретению элюирующий буфер наносят на хроматографический материал белка А, благодаря чему связанное антитело или его фрагмент высвобождаются.
В частном варианте осуществления способа по изобретению связанное антитело высвобождается из хроматографического материала белка А путем нанесения элюирующего буфера с рН, подходящим для нарушения связывания антитела. Указанный рН зависит от конкретного соединения и обычно определяется эмпирически специалистом и корректируется для достижения желаемого конечного показателя, т.е. может быть желательно извлечение наибольшего возможного количества мономера из нанесенной смеси, или может быть желательно получить мономер с максимально возможной чистотой. В конкретном варианте осуществления способа по изобретению элюирующий буфер имеет pH от 3 до 4,5, предпочтительно от 3,2 до 4,3, от 3,5 до 4, предпочтительно от 3,6 до 3,9.
Буферы, пригодные для использования в качестве промывочных и элюирующих буферов в хроматографии на белке А, легко доступны в данной области, и могут быть выбраны, в качестве неограничивающих примеров, среди прочего, из фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), Трис, гистидиновых, ацетатных, цитратных буферов или буферов MES (2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты-имидазола), BES (N,N-(бис-2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты), MOPS (3- (N-морфолин)пропансульфоновой кислоты) или HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты).
Во втором варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с первым, вторым, третьим или четвертым аспектом, где указанная очистка включает по меньшей мере одну дополнительную стадию хроматографии. Указанные дополнительные стадии хроматографии выбирают из анионообменной или катионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии со смешанным режимом, такой как хроматография на гидроксиапатите, хиральная хроматография или диэлектрическая хроматография. Эти стадии хроматографии могут применяться по отдельности или, в качестве альтернативы, в сочетании с еще одной стадией хроматографии. Кроме того, эти стадии хроматографии могут работать в режиме связывания и элюирования или в проточном режиме. В проточном режиме примеси связываются или имеют пониженную подвижность в твердой фазе, тогда как целевой белок выделяют в элюате или проточной фракции. В еще одном конкретном варианте осуществления указанные дополнительные стадии хроматографии проводят после хроматографии на белке А.
В третьем варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии со вторым вариантом осуществления, при этом указанные дополнительные стадии хроматографии включают катионообменную хроматографию и/или анионообменную хроматографию.
В частном варианте осуществления изобретения указанная первая дополнительная стадия хроматографии представляет собой стадию анионообменной хроматографии для захвата примесей и образования проточной фракции, содержащей белок.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения за первой дополнительной стадией хроматографии следует стадия катионообменной хроматографии, на которой представляющий интерес белок связывается с хроматографической средой и затем элюируется в элюат, содержащий белок. В качестве альтернативы, указанную стадию катионообменной хроматографии осуществляют таким образом, чтобы захватить примеси и получить проточную фракцию, содержащую белок.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии со вторым или третьим вариантом осуществления, в котором указанные дополнительные стадии хроматографии включают первую стадию анионообменной хроматографии и вторую стадию катионообменной хроматографии.
В альтернативном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии со вторым или третьим вариантом осуществления, в котором указанные дополнительные стадии хроматографии включают первую стадию катионообменной хроматографии и вторую стадию анионообменной хроматографии.
В других вариантах осуществления одна или более стадий ультрафильтрации или диафильтрации (UF/DF) осуществляются между стадиями хроматографии. В промышленном производстве белков это обычно осуществляют с использованием стадии тангенциальной поточной фильтрации на основе мембраны, выполняемой с целью концентрирования продукта и замены буфера. Эти мембраны обычно характеризуются низким связыванием белка и имеют определенное номинальное отсечение по молекулярной массе для предотвращения потери продукта, например, они включают мембраны из простого полиэфирсульфона (PES) с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа (мембрана T-series Omega PES от Pall Life Sciences) или регенерированную целлюлозу с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа (Delta Regenerated Cellulose Membrane от Pall Life Sciences). В качестве альтернативы используют мембраны с отсечением по молекулярной массе 30 кДа, такие как Pellicon 3 от Millipore или Hydrosart от Sartorius.
Методика очистки может включать любую из этих стадий в различных комбинациях для соответствия физико-химическим свойствам целевого белка.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по изобретению стадия очистки белка от смеси включает первую дополнительную стадию хроматографии, которая представляет собой анионообменную хроматографию, на которой получают первую проточную фракцию, содержащую белок, вторую дополнительную стадию хроматографии, которая представляет собой катионообменную хроматографию, на которой элюируется элюат, содержащий белок; и вторую стадию ультрафильтрации или диафильтрации, проведенную на элюате.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по изобретению стадия очистки белка от смеси включает первую дополнительную стадию хроматографии, которая представляет собой катионообменную хроматографию, на которой элюируется первый элюат, содержащий белок, первую стадию ультрафильтрации или диафильтрации, проведенную на первом элюате, вторую дополнительную стадию хроматографии, которая представляет собой анионообменную хроматографию с получением проточной фракции, содержащей белок; и вторую стадию ультрафильтрации или диафильтрации, проведенную на проточной фракции.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по изобретению процесс очистки также включает стадию ультрафильтрации или диафильтрации после хроматографии на белке А и перед дополнительными стадиями хроматографии.
В четвертом варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором выделенное антитело или его фрагмент содержит нативные дисульфидные связи.
В пятом варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором выделенное антитело или его фрагмент содержит нативные межцепочечные дисульфидные связи.
В еще одном варианте осуществления, в соответствии с любым из аспектов изобретения, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором антитело или фрагмент, выделенные в результате хроматографии на белке A, содержат менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1% связанных с восстановлением антитела примесей.
В другом дополнительном варианте осуществления, в соответствии с любым из аспектов изобретения, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором антитело или его фрагмент, выделенные в результате хроматографии на белке A, содержит меньше связанных с восстановлением антитела примесей, чем антитело или фрагмент, выделенные в результате этого же процесса без использования стадии фильтрации через активированный уголь.
В еще одном альтернативном варианте осуществления, в соответствии с любым из аспектов изобретения, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором очищенное антитело или его фрагмент имеет пониженный уровень связанных с восстановлением антитела примесей.
В еще одном альтернативном варианте осуществления, в соответствии с любым из аспектов изобретения, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором очищенное антитело или его фрагмент имеет пониженный уровень связанных с восстановлением антитела примесей после стадии хроматографии на белке А.
В шестом варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, в котором указанная клетка-хозяин является клеткой-хозяином млекопитающего, и смесь, содержащая антитело, является супернатантом клеточной культуры.
В седьмом варианте осуществления изобретение относится к способу согласно пятому варианту осуществления, в котором указанный процесс очистки дополнительно включает глубинную фильтрацию супернатанта клеточной культуры перед фильтрацией через активированный уголь.
В дополнительном возможном варианте осуществления изобретения указанная последовательность фильтрации может включать дополнительные фильтры, доступные специалисту, такие как, например, стерилизующий фильтр.
Последовательные стадии фильтрации во время очистки белка могут быть осуществлены как отдельные стадии, при этом фильтруемую смесь пропускают через один фильтр, фильтрат извлекают и затем пропускают через второй фильтр, из которого извлекается второй фильтрат. В качестве альтернативы, указанные стадии фильтрации могут осуществляться однопоточно, когда один фильтр примыкает к следующему, благодаря чему фильтруемая среда последовательно пропускается через оба фильтра, и после этой стадии извлекается один фильтрат; указанная однопоточная установка обычно называется последовательностью фильтров.
В восьмом варианте осуществления изобретение относится к способу согласно седьмому варианту осуществления, в котором глубинная фильтрация и фильтрация через активированный уголь осуществляются однопоточно.
В качестве альтернативы, в другом конкретном варианте осуществления седьмого варианта осуществления способа по изобретению, глубинная фильтрация и фильтрация через активированный уголь представляют собой отдельные стадии.
Клетки-хозяева согласно вариантам осуществления изобретения представляют собой, например, к прокариотические клетки, дрожжевые клетки (например, без ограничения Candida boidinii, Hansenula polymorpha, Pichia methanolica, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis и другие Kluyveromyces spp., Yarrowia lipolytica), клетки миксомицет (например, без ограничения, Dictyostelium discoideum), мицелиальных грибов (например, без ограничения, Trichoderma reesei и другие Trichoderma spp., Aspergillus niger и другие Aspergillus spp.), мха (например, без ограничения, Physcomitrella patens, Atrichum undulatum), насекомых или млекопитающих. Клетки-хозяева млекопитающих представляют собой, например, без ограничения NSO, SP2.0, клетки 3Т3, клетки COS, клетки остеосаркомы человека, клетки MRC-5, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки VERO, клетки СНО, клетки rCHO-tPA, клетки rCHO-поверхностного антигена гепатита В, клетки CHO-S, клетки HEK 293, клетки rHEK 293, клетки C127, клетки rC127-поверхностного антигена гепатита В, клетки фибробластов человека, стромальные клетки, клетки гепатоцитов или клетки PER.C6.
Клетки-хозяева предпочтительно представляют собой эукариотические клетки-хозяева, предпочтительно клетки-хозяева млекопитающих, более предпочтительно клетки яичника китайского хомячка (CHO), например, штамма DG44.
Для эукариотических клеток-хозяев (например, дрожжей, клеток насекомых или млекопитающих) могут использоваться различные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, в зависимости от природы хозяина. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус обезьяны или тому подобное, где регуляторные сигналы связаны с определенным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Примерами являются промотор TK вируса герпеса, ранний промотор SV40, промотор гена gal4 дрожжей, и т.д. Могут быть выбраны регуляторные сигналы инициации транскрипции, которые обеспечивают репрессию и активацию, благодаря чему экспрессию генов можно модулировать. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут быть выбраны путем введения одного или более маркеров, которые обеспечивают отбор клеток-хозяев, которые содержат вектор экспрессии. Маркер может также обеспечивать фототрофию у ауксотропного хозяина, резистентность к биоцидам, например, без ограничения, к антибиотикам или тяжелым металлам, таким как медь, или тому подобное. Селектируемый маркерный ген может быть или непосредственно связан с экспрессируемой последовательностью гена ДНК или же введен в эту же клетку с помощью котрансфекции. Дополнительные элементы также могут быть необходимы для оптимального синтеза белков по изобретению.
Эукариотические клетки-хозяева трансфицируют одним или несколькими векторами экспрессии, кодирующими представляющий интерес белок, и затем культивируют в любой среде, которая будет поддерживать их рост и экспрессию представляющего интерес белка. Среда представляет собой химически определенную среду, не содержащую продуктов животного происхождения, таких как животная сыворотка и пептон. Существуют различные клеточные культуральные среды, доступные специалисту в данной области, содержащие различные комбинации витаминов, аминокислот, гормонов, факторов роста, ионов, буферов, нуклеозидов, глюкозы или эквивалентного источника энергии, присутствующие в соответствующих концентрациях, чтобы обеспечить рост клеток и получение белка. Дополнительные компоненты клеточных культуральных сред могут быть включены в клеточную культуральную среду в соответствующих концентрациях в разное время цикла культивирования клеток, что известно специалистам в данной области.
Культивирование клеток млекопитающих может происходить в любом подходящем контейнере, таком как встряхивая колба или биореактор, который может работать или может и не работать в режиме с подпиткой, в зависимости от требуемого масштаба производства. Эти биореакторы могут представлять собой реакторы с мешалкой или эрлифтные реакторы. Доступны различные крупномасштабные биореакторы емкостью более 400 л, от 1000 л до 50000 л или до 100000 л, предпочтительно от 5000 л до 20000 л или до 10000 л. В качестве альтернативы, биореакторы меньшего масштаба, такие как от 2 л до 80 л и 100 л, также можно использовать для получения антитела в соответствии со способом по изобретению.
Представляющий интерес белок, такой как антитело или антигенсвязывающий фрагмент, продуцируемый в эукариотической клетке-хозяине, такой как клетка СНО, в соответствии с процессом и способами настоящего изобретения обычно находится в супернатанте клеточной культуры. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный супернатант представляет собой смесь, очищенную в способе изобретения.
Поэтому в конкретном варианте осуществления изобретения процесс и способы по изобретению включают стадию центрифугирования клеточной культуральной жидкости и извлечения жидкой фазы после центрифугирования, для получения смеси, содержащей антитело или его фрагмент, для дальнейшей очистки в соответствии со способом по изобретению.
В качестве альтернативы или дополнительно, указанный супернатант может быть извлечен с использованием методик осветления, известных специалисту в данной области, таких как, например, глубинная фильтрация. Поэтому в конкретном варианте осуществления изобретения способ включает стадию глубинной фильтрации для получения смеси, содержащей антитело или его фрагмент, для дальнейшей очистки в соответствии со способом по изобретению.
В качестве альтернативы, клетки-хозяева представляют собой прокариотические клетки, предпочтительно грамотрицательных бактерий, предпочтительно клетки E. coli. Прокариотические клетки-хозяева для экспрессии белка хорошо известны в данной области (Terpe, 2006; Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.). Клетки-хозяева представляют собой рекомбинантные клетки, которые были образованы генетическими методами для получения представляющего интерес белка, такого как фрагмент антитела. Рекомбинантные клетки-хозяева E. coli могут быть получены из любого подходящего штамма E. coli, включая MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue и JM109. Одним из примеров является штамм E.coli W3110 (АТСС 27325), обычно используемый штамм-хозяин для ферментации рекомбинантных белков. Фрагменты антител также могут быть получены путем культивирования модифицированных штаммов E. coli, например, метаболических мутантов или дефицитных по протеазе штаммов E. coli.
Фрагмент антитела, который может быть очищен в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, обычно находится либо в периплазме клетки-хозяина E. coli, либо в супернатанте культуры клеток-хозяина, в зависимости от природы белка, масштаба производства и используемого штамма E. coli. Способы направления белков в эти области хорошо известны в области техники (Makrides, 1996; Microbiol Rev 60, 512-538). Примеры подходящих сигнальных последовательностей для направления белков в периплазму E. coli включают сигнальные последовательности E. coli PhoA, OmpA, OmpT, LamB и OmpF. Белки могут быть направлены в супернатант, опираясь на естественные секреторные пути, или путем индукции ограниченной проницаемости наружной мембраны, чтобы вызвать секрецию белка, примерами которой являются использование pelB-лидера, лидера белка А, коэкспрессия белка высвобождения бактериоцинов, митомицин-индуцированного белка высвобождения бактериоцинов, наряду с добавлением глицина к культуральной среде и коэкспрессией гена kil для пермеабилизации мембраны. Наиболее предпочтительно в способах изобретения рекомбинантный белок экспрессируется в периплазме хозяина E. coli.
Экспрессия рекомбинантного белка в клетках-хозяевах E.coli также может находиться под контролем индуцибельной системы, при этом экспрессия рекомбинантного антитела в E. coli находится под контролем индуцибельного промотора. Многие индуцибельные промоторы, подходящие для использования в E. coli, хорошо известны в данной области и зависят от промотора; экспрессия рекомбинантного белка может быть индуцирована различными факторами, такими как температура или концентрация конкретного вещества в питательной среде. Примеры индуцибельных промоторов включают промоторы lac, tac и trc E.coli, которые индуцируются лактозой или негидролизуемым аналогом лактозы, изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) и phoA, trp и araBAD промоторы, которые индуцируются фосфатом, триптофаном и L-арабинозой, соответственно. Экспрессия может быть индуцирована, например, добавлением индуктора или изменением температуры, если индукция зависит от температуры. Если индукция экспрессии рекомбинантного белка достигается добавлением индуктора в культуру, - индуктор может быть добавлен любым подходящим способом в зависимости от системы ферментации и индуктора, например, путем однократной или многократных дробных добавок или путем постепенного добавления индуктора через питательное вещество. Следует отметить, что может быть задержка между добавлением индуктора и фактической индукцией экспрессии белка, например, когда индуктор представляет собой лактозу, может быть задержка перед индукцией экспрессии белка, в то время как любой уже существующий источник углерода утилизируется перед лактозой.
Культуры клеток-хозяев E. coli (ферментации) можно культивировать в любой среде, которая будет поддерживать рост E. coli и экспрессию рекомбинантного белка. Среда может быть любой химически определенной средой, такой как, например, описанная Durany O, 2004, в Process Biochem 39, p.1677-1684.
Культивирование клеток-хозяев E. coli может происходить в любом подходящем контейнере, таком как встряхивая колба или ферментер, в зависимости от требуемого масштаба производства. Доступны различные крупномасштабные ферментеры емкостью более 1000 л, до 100000 л. Предпочтительно используют ферментеры от 1000 л до 50000 л, более предпочтительно от 1000 л до 10000 л или 12000 л. Также могут быть использованы ферментеры меньшего масштаба, с емкостью от 0,5 л до 1000 л.
Ферментация клеток-хозяев, таких как СНО или E. coli, может быть осуществлена в любой подходящей системе, например, работающей в непрерывном, периодическом режиме или режиме с подпиткой, в зависимости от белка и требуемого выхода. Может использоваться периодический режим с дробными добавками питательных веществ или индукторов, где это необходимо. В качестве альтернативы, можно использовать культуру с подпиткой и культуры, выращенные в периодическом режиме преиндукции при максимальной удельной скорости роста, которые могут поддерживаться с помощью питательных веществ, изначально присутствующих в ферментере, и один или более режимов подачи питательных веществ, используемых для регулирования скорости роста до завершения ферментации.
В одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает, перед загрузкой на хроматографическую матрицу белка А, стадию центрифугирования сбора клеточной культуры, за которой следует суспендирование клеток-хозяев с помощью добавления экстрагирующего буфера.
Для процессов ферментации E. coli, в которых представляющий интерес белок, такой как фрагмент антитела, находится в периплазматическом пространстве клетки-хозяина, необходимо высвободить белок из клетки-хозяина. Высвобождение может быть достигнуто любым подходящим способом, таким как лизис клеток путем механической обработки или обработки давлением, способом замораживания-оттаивания, осмотического шока, использованием экстрагирующих агентов или тепловой обработкой. Такие способы экстракции для высвобождения белка хорошо известны в данной области.
Используемый здесь термин «активированный уголь» относится к форме углерода, который был обработан с образованием миллионов крошечных пор между атомами углерода, что приводит к значительному увеличению площади поверхности. Площадь поверхности активированного угля делает материал подходящим для адсорбции, процесса, с помощью которого примеси удаляются из текучих сред, паров или газа. Активированный уголь также известен как активный древесный уголь. Коммерчески доступные фильтры с активированным углем включают, без ограничения, Millipore Millistak+ CR series, Pall Activated Carbon Filters Incorporating Seitz® AKS Filter Media, и 3M Zeta Plus™ Activated Carbon Filters.
Термин «анионообменная хроматография», используемый в рамках изобретения, относится к хроматографии, в которой твердая фаза является положительно заряженной, например, имеет один или более положительно заряженных лигандов, таких как присоединенные к ней четвертичные аминогруппы. Коммерчески доступные анионообменные матрицы включают DEAE-целлюлозу, QAE SEPHADEXTM, FAST Q SEPHAROSETM Capto Q, Capto Adhere и Capto Q Impres (GE Healthcare), Unosphere и Nuvia Q (BioRad), GigaCap Q (Tosoh), Mustang Q XT (Pall), Fractogel Q и Eshmuno Q (Merck Millipore), Poros XQ (Thermo Fisher) и анионообменные мембранные адсорберы, такие как SartoBind Q (Sartorius) и монолитные адсорберы, такие как монолиты QA (Bia Separations).
Термин «антитело» или «антитела», используемый в рамках изобретения, относится к моноклональным или поликлональным тетрамерным полноразмерным антителам, содержащим две тяжелые и две легкие цепи. Термин «иммуноглобулин» или «иммуноглобулины» используется как синоним «антитела» или «антител», соответственно. Используемый здесь термин «антитело» или «антитела» включает, без ограничения, рекомбинантные антитела, которые вырабатывают с помощью рекомбинантных технологий, как известно в данной области. «Антитело» или «антитела» могут быть любого происхождения, в том числе от таких видов млекопитающих, как человек, отличные от человека приматы (например, человекообразные, такие как шимпанзе, бабуин, макак-резус или макак-крабоед), грызуны (например, от мыши, крысы, кролика, хомяка или морской свинки), козы, крупный рогатый скот или лошади. Антитело здесь направлено против представляющего интерес «антигена». Предпочтительно антиген представляет собой биологически важный полипептид, и введение антитела млекопитающему, страдающему заболеванием или нарушением, может вызвать терапевтический эффект у этого млекопитающего. Однако рассматриваются также антитела, направленные против неполипептидных антигенов. Если антиген представляет собой полипептид, он может представлять собой трансмембранную молекулу (например, рецептор) или лиганд, такой как фактор роста или цитокин. Предпочтительные молекулярные мишени для антител, охватываемых настоящим изобретением, включают полипептиды CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD38, CD40 и CD40-L; FcRN; OX40; члены семейства рецепторов HER, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и av/b3-интегрин, включая их α или β субъединицы (например, антитела анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD11b); хемокины и цитокины или их рецепторы, такие как IL-1 α и β, IL-2, рецептор IL-6, IL-12, IL-13, IL-17A и/или IL-17F, IL-18, IL-21, IL-23, TNFα и TNFβ; факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl; CTLA-4; полипептид С; PD1, PD-L1, PCSK9; склеростин и т.д.
Термин «фрагмент антитела» или «фрагменты антител», используемый в рамках изобретения, относится к части антитела, обычно к его антигенсвязывающей или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают любое антитело, которое не содержит или не имеет Fc-части. Примеры фрагментов антител включают также такие фрагменты, как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, и scFv; а также диатела, включая такие форматы, как BiTE® (биспецифичные активаторы T-клеток) и DART™ (технология переориентирующегося антитела с двойной аффинностью), триатела, тетратела, минитела, доменные антитела (dAbs), такие как sdAbs, VHH и VNAR фрагменты, одноцепочечные антитела, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические или мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител или антител, включая, без ограничения,, Fab-Fv, Fab-scFv, Fab(Fv)2 или Fab-(scFv)2 конструкции. Определенные выше фрагменты антител известны в данной области техники. Для ясности следует понимать, что Fab-Fv относится к конструкции, содержащей одну Fv-область и одну Fab-область, соединенные в любом порядке, т.е. Fab-Fv, или Fv-Fab, при этом за последними аминокислотами в одной области следуют первые аминокислоты в следующей области или наоборот. Аналогичным образом, следует понимать, что Fab-scFv относится к конструкции, содержащей одну scFv-область и одну Fab-область, соединенные в любом порядке, и в случае Fab с каждой полипептидной цепью, т.е. Fab-scFv или scFv-Fab, при этом за последней аминокислотой в одной области следует первая аминокислота в следующей области или наоборот. Аналогичным образом, следует понимать, что Fab-(Fv)2 относится к конструкции, содержащей две Fv-области и одну Fab-область, соединенные в любом порядке, т.е. Fab-Fv-Fv, Fv-Fab-Fv или Fv-Fv-Fab, при этом за последними аминокислотами в одной области следуют первые аминокислоты в следующей области или наоборот. Аналогичным образом, следует понимать, что Fab-(scFv)2 относится к конструкции, содержащей две scFv-области и одну Fab-область, соединенные в любом порядке, и в случае Fab с каждой полипептидной цепью, что приводит к 20 возможным перестановкам. Обычно эти конструкции включают пептидный линкер между первой областью (например, Fab) и второй областью (например, Fv). Такие линкеры хорошо известны в данной области техники и могут быть одной или несколькими аминокислотами, обычно оптимизированными по длине и составу специалистом. В качестве альтернативы, указанные области могут быть связаны непосредственно, т.е. без пептидного линкера. Примеры подходящих линкерных областей для связывания вариабельного домена с Fab или Fab' описаны в WO 2013/068571, включенном в настоящее описание посредством ссылки, и включают, без ограничения, гибкие линкерные последовательности и жесткие линкерные последовательности. Гибкие линкерные последовательности включают последовательности, описанные в Huston et al., 1988, 10 PNAS 85:5879-5883; Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11):2860-2869; Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731; Luo et al., J. Biochem., 1995, 118(4):825-831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chern. 271(26): 15682-15686; и Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54. Фрагменты антител могут быть агликозилированными или гликозилированными.
Термин «связанные с восстановлением антитела примеси», используемый в рамках изобретения, относится к примесям, таким как свободные тяжелые и легкие цепи, полумономеры (одна тяжелая цепь и одна легкая цепь) или изоформы, частично лишенные дисульфидных связей, благодаря восстановлению межцепочечных дисульфидных связей.
Термин «катионообменная хроматография», используемый в рамках изобретения, относится к хроматографии, в которой твердая фаза, которая отрицательно заряжена, например, имеет один или более отрицательно заряженных лигандов, таких как, например, карбоксилатная или сульфонатная группа. Коммерчески доступные катионообменные матрицы включают карбоксиметилцеллюлозу, сульфопропил (SP), иммобилизованный на агарозе и сульфонил, иммобилизованный на агарозе, такие как Capto S и Capto S Impres (GE Healthcare), Unosphere S и Nuvia S (BioRad), GigaCap S (Tosoh), Fractogel S и Eshmuno S (Merck Millipore), Poros S и Poros XS (Thermo Fisher), или катионообменные мембранные адсорберы, такие как SartoBind Q (Sartorius) и монолитные адсорберы, такие как монолиты SO3 (Bia Separations).
Термин «белок А», используемый в рамках изобретения, охватывает белок А, выделенный из своего нативного источника, белок А, полученный синтетическим путем (например, пептидным синтезом или рекомбинантными способами), и его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, которые имеют CH2/CH3-область, такую как Fc-область. Белок А может быть коммерчески приобретен у Repligen, GE Healthcare и Fermatech. Белок A обычно иммобилизуют на твердофазном материале носителя, таком как мембрана или смола. Термин «белок А» также относится к смоле или колонке афинной хроматографии, содержащей твердую хроматографическую матрицу-носитель, к которой ковалентно присоединен белок А. Коммерчески доступные матрицы белка А включают MabSelect, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX от GE Healthcare; Amsphere Protein A (JSR Life Sciences), KanCapA (Kaneka), AbSolute® High Cap (NovaSep), UNOsphere SUPrA (BioRad), Toyopearl (Toso BioScience), Prosep Ultra plus, Eshmuno A, ProSep®-vA, ProSep®-vA Ultra от Millipore, Poros Mab-Capture A (Life Technologies) и Praesto AC (Purolite).
Термин «глубинный фильтр», используемый в рамках изобретения, относится к множеству фильтров, которые используют пористую фильтрующую среду для удерживания частиц во всей среде, а не только на поверхности среды. Они обычно используются для текучих сред, которые имеют высокую концентрацию частиц, поскольку они могут удерживать большую массу частиц до своего насыщения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Предотвращение восстановления антител в процессе с биореактором масштаба 2000 л
В настоящем примере производство соединения A в масштабе 2000 л продемонстрировало значительное восстановление антител в цикле 2 после стадии захватывающей хроматографии на белке A. В последующем производственном цикле (цикл 3) была реализована стадия фильтрации через активированный уголь (Millistak+CR40, Millipore) в процессе первичного извлечения, как показано на фиг.3. В этом цикле не было обнаружено никакого восстановления антител.
Соединение А представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4P, экспрессированное в клеточной линии CHO DG44 в процессе с биореактором с периодической подпиткой, и очищаемое с помощью способа трехстадийной хроматографии. Определено, что теоретическая интактная масса полной гликозилированной молекулы составляла 147460 Да. На фиг.3 подробно описан процесс очистки соединения А с подаваемым материалом из 2000 л биореактора, выращиваемом в течение 14 суток. Материал центрифугировали с помощью тарельчатой центрифуги, используя оптимизированные настройки для извлечения и очистки продукта. В цикле 2 центрифугат (или супернатант) далее отфильтровывали с помощью фильтров Pall PDE2 и PDD1 (или эквивалентных), за чем следовала стерилизующая фильтрация. Затем следовала стадия захвата с использованием белка A (MabSelect SuRe LX, GE Healthcare), и последующие стадии очистки: анионный обмен (AEX с использованием Capto Q, GE Healthcare), катионный обмен (CEX с использованием Capto SP ImpRes), снижение вирусной нагрузки фильтрацией (VRF) и приготовление лекарственной формы. В цикле 3 стадию фильтрации через фильтр с активированным углем выполняли в потоке между глубинной фильтрацией и фильтрацией через стерилизующий фильтр (с диаметром пор 0,2 мкм).
Стадия очистки захватывающей хроматографией снижает уровни примесей клеток-хозяев и компонентов клеточной культуральной среды, которые не связываются со смолой. Продукт связывается с колонкой при нейтральном рН. Связанный продукт элюируют из колонки с использованием 30 мМ ацетата натрия, рН 3,7.
Восстановление антител определяли в образцах элюата захвата, проанализированных с помощью невосстанавливающего биоанализатора, см. фиг.2. Аналитический метод использовали для определения чистоты образцов и присутствия примесей, образующихся при восстановлении антител в невосстанавливающих условиях, с помощью анализа чип-электрофореза. Анализ включает две основные стадии: ковалентное связывание белка с флуоресцентным красителем (мечение) и выделение и обнаружение меченных белков с помощью чип-электрофореза.
Чип-анализ состоит из взаимосвязанного набора заполненных гель-полимером микроканалов, которые просеивают белки по размеру, когда они проходят через них под действием электрофореза. Использованным оборудованием был биоанализатор 2100 с программным обеспечением 2100 Expert (поставляется Agilent, каталожный номер G2940CA) и набор для высокочувствительного анализа белков (поставляемый Agilent technologies, каталожный номер 5067-1575).
Образцами были образцы элюата белка A из партии 1 и партии 2 производственного цикла 2 (C2B1 и C2B2, соответственно), в котором угольный фильтр не использовался во время первичного извлечения, и партии 1 цикла 3 (C3B1), в котором угольный фильтр использовался. Продукты восстановления антител (полумономер и свободные цепи), наблюдаемые в образцах цикла 2, не отмечались в образце цикла 3.
На фиг.6 показаны образцы осветленной клеточной культуральной жидкости (CCCF) для соединения А, с глубинной и стерилизующей фильтрацией (цикл 2 процесса, контроль), и после введения угольного фильтра между глубинным и стерилизующим фильтрами (цикл 3 процесса), анализируемые на восстанавливающие агенты тиоредоксин, NAD/NADH и NADP/NADPH. Более низкие уровни этих восстанавливающих агентов обнаруживаются после введения угольного фильтра. Тиоредоксинредуктаза, однако, не удаляется с помощью фильтрации через уголь.
Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) является ферментным кофактором, участвующим во многих окислительно-восстановительных реакциях. NAD функционирует как носитель электронов, циклически переходящий между окисленными (NAD) и восстановленными (NADH) формами. Набор MAK037 от Sigma Aldrich для количественного определения NAD/NADH служит для определения NAD и NADH и их соотношения без предварительной очистки от образца. Этот анализ специфичен для NAD и NADH и не обнаруживает NADP или NADPH. NAD общий (NAD и NADH) или NADH количественно определяют в колориметрическом анализе (450 нм).
Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP) является ферментным кофактором, участвующим во многих окислительно-восстановительных реакциях, где он циклически переходит между восстановленной (NADPH) и окисленной (NADP) формами.
Набор MAK038 от Sigma Aldrich для количественного определения NADP/NADPH служит для определения NADP и NADPH и их соотношения без предварительной очистки от образца. Этот анализ специфичен для NADP и NADPH и не обнаруживает NAD или NADH. NADP общий (NADP и NADPH) или NADPH количественно определяют в колориметрическом анализе (450 нм).
Тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу определяют с помощью Simon Simple Western анализа. Образцы обрабатывают SDS/DTT и денатурируют нагреванием. Затем образцы загружают в капилляры, разделяют по размеру и иммобилизуют на капиллярной стенке с помощью запатентованного способа УФ-захвата. Целевые белки иммунозондируют антителом (антитиоредоксиновый путь/антиглутаредоксин) с последующим HRP-усиленным хемилюминесцентным детектированием (кроличий анти-козий HRP конъюгат).
Пониженный уровень примесей в цикле 3 по сравнению с циклом 2 привел к более высокому выходу продукта на последующей стадии катионообменной хроматографии, предназначенной для удаления низкомолекулярных соединений и высокомолекулярных соединений. Срок хранения материала из цикла 3 также был больше, чем для материала из цикла 2.
Пример 2: Предотвращение восстановления антител в процессе с биореактором масштаба 400 л
В настоящем примере производство соединения В в масштабе 400 л продемонстрировало значительное восстановление антител в партии 1 цикла 1 после стадии захватывающей хроматографии на белке A. В последующих производственных партиях была реализована стадия фильтрации через активированный уголь (Millistak+CR40, Millipore) в процессе первичного извлечения, как показано на фиг.3. В этих партиях не было обнаружено никакого восстановления антител.
Соединение В представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4P. Оно экспрессируется в клеточной линии CHO DG44 в процессе с биореактором с периодической подпиткой и очищается с помощью процесса трехстадийной хроматографии. Определено, что теоретическая интактная масса полной гликозилированной молекулы IgG составляла 146372 Да (с точностью до целых Дальтон).
Процесс очистки был очень похож на процесс для соединения А в примере 1. Разница заключалась в том, что элюирующий буфер из колонки для хроматографии на белке А был 100 мМ ацетатом натрия, рН 3,7. Результаты невосстанавливающего биоанализа производственных образцов IgG соединения B, представленные на фиг.4, показывают образцы осветленной клеточной культуральной жидкости и элюата захвата (после хроматографии на белке A) для партии 1, в которой мономер восстанавливается, образуя полумономер и тяжелую цепь. Также показан образец элюата захвата для партии 3, в которой фильтр с активированным углем был использован при первичном извлечении, и молекула была все еще мономерной после стадии захвата на белке А.
На фиг.7 показана осветленная клеточная культуральная жидкость (CCCF) для соединения B из партии 1 (перед введением угольного фильтра, контроль) и партии 2 (после применения угольного фильтра), проанализированная на восстанавливающие агенты NAD/NADH и NADP/NADPH. Более низкие уровни этих восстанавливающих агентов обнаруживаются после введения угольного фильтра.
Пример 3
Образцы были отобраны из производственного цикла соединения B после фильтрации (с фильтрацией через угольный фильтр и без нее), но затем очищались в условиях низкого содержания кислорода, с использованием менее масштабной модели производственного процесса. Данная модель включала продувку образцов газообразным азотом в течение по меньшей мере 30 мин, которые затем хранили в этих условиях в течение ночи.
Результаты этого процесса, которые были проанализированы с использованием невосстановительного SDS-PAGE анализа с окрашиванием Sypro, можно увидеть на фиг.5. Аналитический метод использовали для определения чистоты образцов и присутствия примесей, образующихся при восстановлении антител в невосстанавливающих условиях. Используемыми гелями были NuPAGE 4-20% трис-глицин, 10×15 лунок 1,5 мм от Thermo Fisher (кат. № EС6028). Показан стандарт молекулярной массы Mark 12 (Thermo Fisher, каталожный номер LC5677). Гель пропускали при постоянном напряжении 125 В. Окрашивание проводили с использованием рубиново-красного флуоресцентного красителя SYPRO (Bio-Rad, кат. № 170-3125).
Образцы до стадии захвата, дорожки 3, 4 и 5, были затем заморожены (≤ -60°С) и размораживались непосредственно перед анализом. Образцы на дорожках 6, 7 и 8 очищали на белке А в емкости, продуваемой газообразным азотом, и образцы элюата затем замораживали и размораживали непосредственно перед анализом.
Образцы культуральной жидкости и элюата захвата партии 1 цикла 1 содержали низкие уровни мономера и высокие уровни примесей, образующихся при восстановлении антител. Образец партии 2 цикла 1, отобранный перед угольным фильтром, и элюат захвата из этого образца содержали высокие уровни примесей, связанных с восстановлением антител. Образец, отобранный после угольного фильтра, и элюат захвата из этого образца содержали высокие уровни мономера и низкие/нулевые уровни примесей, связанных с восстановлением антител. Таким образом, фильтрация через угольный фильтр препятствует образованию восстановленных продуктов антител, наблюдаемых после хроматографии на белке А.
Claims (26)
1. Способ получения антитела или его фрагмента, включающий:
- экспрессию указанного антитела или его фрагмента в клетке-хозяине;
- выделение смеси, содержащей антитело или его фрагмент, обломки клеток-хозяев и примеси; и
- очистку указанного антитела или его фрагмента от смеси, при этом указанная очистка включает:
- фильтрацию через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
2. Способ по п. 1, в котором указанная очистка включает по меньшей мере одну дополнительную стадию хроматографии.
3. Способ по п. 2, в котором указанные дополнительные стадии хроматографии включают катионообменную хроматографию и/или анионообменную хроматографию.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором выделенное антитело или его фрагмент содержит нативные дисульфидные связи.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором выделенное антитело или его фрагмент содержит нативные межцепочечные дисульфидные связи.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором указанная клетка-хозяин является клеткой-хозяином млекопитающего, и смесь, содержащая антитело, является супернатантом клеточной культуры.
7. Способ по п. 6, в котором указанный процесс очистки дополнительно включает глубинную фильтрацию супернатанта клеточной культуры перед фильтрацией через активированный уголь.
8. Способ по п. 7, в котором глубинную фильтрацию и фильтрацию через активированный уголь осуществляют однопоточно.
9. Способ предотвращения восстановления дисульфидной связи во время очистки антитела или его фрагмента, экспрессированного в клетке-хозяине, включающий введение смеси, содержащей антитело или его фрагмент, обломки клеток-хозяев и примеси, на:
- стадию фильтрации через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
10. Способ очистки антитела или его фрагмента от жидкой смеси, содержащей загрязнители, включающий:
- фильтрацию указанной жидкой смеси через фильтр с активированным углем, за которой следует
- хроматография на белке А.
11. Способ по п. 10, в котором указанное выделенное антитело или его фрагмент содержит нативные дисульфидные связи.
12. Способ по п. 11, в котором выделенный белок содержит нативные межцепочечные дисульфидные связи.
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором антитело или фрагмент, выделенные в результате хроматографии на белке A, содержат менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1% связанных с восстановлением антитела примесей.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором антитело или фрагмент, выделенные в результате хроматографии на белке A, содержит меньше связанных с восстановлением антитела примесей, чем антитело или фрагмент, выделенные в результате этого же процесса без использования стадии фильтрации через активированный уголь.
15. Способ уменьшения количества восстанавливающих агентов во время очистки антитела или его фрагмента, включающий введение смеси, содержащей антитело или его фрагмент, обломки клеток-хозяев и примеси, на:
- фильтрацию через активированный уголь, за которой следует
- хроматография на белке А.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1605562.6 | 2016-04-01 | ||
| GB201605562 | 2016-04-01 | ||
| PCT/EP2017/057685 WO2017167960A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-03-31 | Method for protein purification |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018138445A RU2018138445A (ru) | 2020-05-12 |
| RU2018138445A3 RU2018138445A3 (ru) | 2020-07-07 |
| RU2737539C2 true RU2737539C2 (ru) | 2020-12-01 |
Family
ID=58461345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018138445A RU2737539C2 (ru) | 2016-04-01 | 2017-03-31 | Способ очистки белка |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11014962B2 (ru) |
| EP (1) | EP3436173A1 (ru) |
| JP (2) | JP7012023B2 (ru) |
| KR (1) | KR102413808B1 (ru) |
| CN (1) | CN108883345B (ru) |
| AU (1) | AU2017242900B2 (ru) |
| BR (1) | BR112018068803A2 (ru) |
| CA (1) | CA3016847C (ru) |
| CL (1) | CL2018002689A1 (ru) |
| CO (1) | CO2018010286A2 (ru) |
| EA (1) | EA201892231A1 (ru) |
| IL (1) | IL261560B (ru) |
| MX (1) | MX2018011435A (ru) |
| MY (1) | MY197993A (ru) |
| RU (1) | RU2737539C2 (ru) |
| SG (1) | SG11201807676UA (ru) |
| WO (1) | WO2017167960A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3824906A1 (en) | 2016-12-21 | 2021-05-26 | Amgen Inc. | Anti-tnf alpha antibody formulations |
| US20220314142A1 (en) * | 2019-07-01 | 2022-10-06 | Pfizer Inc. | Improvements to wash solutions for protein a chromatography in an antibody purification process |
| AU2021208515A1 (en) * | 2020-01-15 | 2022-08-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods to decrease impurities from recombinant protein manufacturing processes |
| WO2023136820A1 (en) * | 2022-01-13 | 2023-07-20 | Bayer Healthcare Llc | Improved antibody manufacture |
| EP4622990A1 (en) | 2022-11-21 | 2025-10-01 | CHRETO ApS | Method for purification of a target product using affinity purification technology |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013028330A2 (en) * | 2011-08-19 | 2013-02-28 | Emd Millipore Corporation | Methods of reducing level of one of more impurities in a sample during protein purification |
| WO2013148389A1 (en) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Emd Millipore Corporation | Use of charged fluorocarbon compositions in methods for purification of biomolecules |
| US20140046038A1 (en) * | 2012-08-07 | 2014-02-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method of purifying protein |
| RU2520838C2 (ru) * | 2008-10-20 | 2014-06-27 | Эббви Инк | Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а |
| WO2015005960A1 (en) * | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Emd Millipore Corporation | Removal of fragments from a sample containing a target protein using activated carbon |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5659795A (en) * | 1979-10-22 | 1981-05-23 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Purification of nicotinic acid amide adenine dinucleotide |
| EP2682168A1 (en) * | 2012-07-02 | 2014-01-08 | Millipore Corporation | Purification of biological molecules |
| WO2014146175A1 (en) * | 2013-03-21 | 2014-09-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Purification of triple helical proteins |
| KR101894762B1 (ko) | 2013-07-12 | 2018-09-05 | 이엠디 밀리포어 코포레이션 | 표적 단백질을 함유하는 샘플로부터 활성탄을 사용하여 바이러스 제거를 결정하는 방법 |
| CN104546715B (zh) | 2014-12-22 | 2018-01-16 | 蓝佳堂生物医药（福建）有限公司 | 一种用于上呼吸道感染的复合抗体口腔喷剂及其制备方法 |
-
2017
- 2017-03-31 BR BR112018068803-7A patent/BR112018068803A2/pt active Search and Examination
- 2017-03-31 KR KR1020187031874A patent/KR102413808B1/ko active Active
- 2017-03-31 CA CA3016847A patent/CA3016847C/en active Active
- 2017-03-31 US US16/089,443 patent/US11014962B2/en active Active
- 2017-03-31 AU AU2017242900A patent/AU2017242900B2/en active Active
- 2017-03-31 SG SG11201807676UA patent/SG11201807676UA/en unknown
- 2017-03-31 WO PCT/EP2017/057685 patent/WO2017167960A1/en not_active Ceased
- 2017-03-31 MX MX2018011435A patent/MX2018011435A/es unknown
- 2017-03-31 RU RU2018138445A patent/RU2737539C2/ru active
- 2017-03-31 MY MYPI2018703312A patent/MY197993A/en unknown
- 2017-03-31 EP EP17714759.2A patent/EP3436173A1/en active Pending
- 2017-03-31 EA EA201892231A patent/EA201892231A1/ru unknown
- 2017-03-31 CN CN201780020300.8A patent/CN108883345B/zh active Active
- 2017-03-31 JP JP2018551087A patent/JP7012023B2/ja active Active
-
2018
- 2018-09-03 IL IL261560A patent/IL261560B/en active IP Right Grant
- 2018-09-21 CL CL2018002689A patent/CL2018002689A1/es unknown
- 2018-09-26 CO CONC2018/0010286A patent/CO2018010286A2/es unknown
-
2021
- 2021-11-24 JP JP2021189889A patent/JP2022036993A/ja not_active Abandoned
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520838C2 (ru) * | 2008-10-20 | 2014-06-27 | Эббви Инк | Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а |
| WO2013028330A2 (en) * | 2011-08-19 | 2013-02-28 | Emd Millipore Corporation | Methods of reducing level of one of more impurities in a sample during protein purification |
| WO2013148389A1 (en) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Emd Millipore Corporation | Use of charged fluorocarbon compositions in methods for purification of biomolecules |
| US20140046038A1 (en) * | 2012-08-07 | 2014-02-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method of purifying protein |
| WO2015005960A1 (en) * | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Emd Millipore Corporation | Removal of fragments from a sample containing a target protein using activated carbon |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20190153028A1 (en) | 2019-05-23 |
| JP2019512255A (ja) | 2019-05-16 |
| EP3436173A1 (en) | 2019-02-06 |
| US11014962B2 (en) | 2021-05-25 |
| AU2017242900B2 (en) | 2022-07-28 |
| HK1257713A1 (zh) | 2019-10-25 |
| CA3016847C (en) | 2023-12-19 |
| CO2018010286A2 (es) | 2018-10-31 |
| IL261560A (en) | 2018-10-31 |
| WO2017167960A1 (en) | 2017-10-05 |
| KR102413808B1 (ko) | 2022-06-29 |
| CN108883345B (zh) | 2022-09-13 |
| AU2017242900A1 (en) | 2018-10-04 |
| EA201892231A1 (ru) | 2019-03-29 |
| KR20180131599A (ko) | 2018-12-10 |
| CN108883345A (zh) | 2018-11-23 |
| CL2018002689A1 (es) | 2018-11-23 |
| MX2018011435A (es) | 2019-01-10 |
| JP2022036993A (ja) | 2022-03-08 |
| SG11201807676UA (en) | 2018-10-30 |
| IL261560B (en) | 2021-06-30 |
| BR112018068803A2 (pt) | 2019-01-22 |
| CA3016847A1 (en) | 2017-10-05 |
| JP7012023B2 (ja) | 2022-01-27 |
| RU2018138445A3 (ru) | 2020-07-07 |
| RU2018138445A (ru) | 2020-05-12 |
| MY197993A (en) | 2023-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2737539C2 (ru) | Способ очистки белка | |
| US12371671B2 (en) | Methods for continuously inactivating a virus during manufacture of a protein | |
| US9309280B2 (en) | Protein purification | |
| US20240392030A1 (en) | Methods of Controlling the Formation of Disulfide Bonds in Protein Solutions | |
| EP3416974B1 (en) | Protein purification | |
| BR112019027760A2 (pt) | cromatografia | |
| HK1257713B (en) | Method for protein purification | |
| HK1241901A1 (en) | Controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions by adding reducing agents |