RU2732923C1 - Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника - Google Patents
Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника Download PDFInfo
- Publication number
- RU2732923C1 RU2732923C1 RU2019136587A RU2019136587A RU2732923C1 RU 2732923 C1 RU2732923 C1 RU 2732923C1 RU 2019136587 A RU2019136587 A RU 2019136587A RU 2019136587 A RU2019136587 A RU 2019136587A RU 2732923 C1 RU2732923 C1 RU 2732923C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tris
- campylobacter
- hcl
- edta
- buffer
- Prior art date
Links
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 title description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 title 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 claims abstract description 5
- 241001135528 Campylobacter upsaliensis Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 14
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 claims description 12
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 7
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 6
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 abstract description 13
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000002052 colonoscopy Methods 0.000 abstract description 6
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical class [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 4
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 3
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241000589873 Campylobacter concisus Species 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 3
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 3
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 3
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 3
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 3
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010051226 Campylobacter infection Diseases 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 201000004927 campylobacteriosis Diseases 0.000 description 2
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 2
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- -1 pH 6.8 - 0.05 M Chemical compound 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001153886 Ami Species 0.000 description 1
- 241001135163 Arcobacter Species 0.000 description 1
- 241000589874 Campylobacter fetus Species 0.000 description 1
- 241000589872 Campylobacter hyointestinalis Species 0.000 description 1
- 208000018458 Colitis-Associated Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010061166 Gastroenteritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010079943 Pentagastrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 208000027503 bloody stool Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N cefoperazone Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2C(C(O)=O)=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21 GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N 0.000 description 1
- 229960004682 cefoperazone Drugs 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Chemical class 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- ANRIQLNBZQLTFV-DZUOILHNSA-N pentagastrin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)NC(=O)CCNC(=O)OC(C)(C)C)CCSC)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 ANRIQLNBZQLTFV-DZUOILHNSA-N 0.000 description 1
- 229960000444 pentagastrin Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Согласно изобретению проводят исследование фиксированных формалином и залитых в парафин срезов биоптатов пораженных участков кишки, полученных в процессе колоноскопии у пациентов с неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона, при помощи ПЦР с родоспецифичными праймерами, гомологичными родоспецифичному фрагменту 16S рРНК бактерии рода Campylobacter: C. jejuni, C. coli и C. upsaliensis. Набор для обнаружения бактерий рода Campylobacter содержит 6 компонентов. Использование группы изобретений упрощает и сокращает продолжительность исследования. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Description
Группа изобретений относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии и может использоваться для обнаружения патогенных для человека и животных (термофильных) бактерий рода Campylobacter в образцах ткани кишки, заключенных в парафин (ТПФ), у больных с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК).
Бактерии рода Campylobacter в настоящее время рассматриваются в качестве основной причины гастроэнтеритов бактериальной природы во всем мире [Anonymous Monitoring the Incidence and Causes of Diseases Potentially Transmitted by Food in Australia: Annual Report of the OzFoodNet Network, 2010. Communicable Diseases Intelligence. 2012; 36: E213-E241; Eurosurveillance Editorial Team. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-Borne Outbreaks in 2010. Euro Surveillance. 2012; 17: 21]. Наиболее этиологически значимыми среди них являются Campylobacter jejuni и Campylobacter coli [Skirrow M.B. Diseases Due to Campylobacter, Helicobacter and Related Bacteria. Journal of Comparative Pathology. 1994; 111: 113-149. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9975(05)80046-5]. He исключается эпидемиологическое значение и ряда других представителей Campylobacter spp., таких как Campylobacter concisus, Campylobacter upsaliensis, Campylobacter hyointestinalis и Campylobacter fetus, которые также могут вызывать заболевания у людей [Linton D., Owen R.J. and Stanley J. Rapid Identification by PCR of the Genus Campylobacter and of Five Campylobacter Species Enteropathogenic for Man and Animals. Research in Microbiology. 1996; 147: 707-718. http://dx.doi.org/10.1016/S0923-2508(97)85118-2; Kulkarni S.P., Lever S., Logan J.M., Lawson A.J., Stanley J., Shafi M.S. Detection of Campylobacter Species: A Comparison of Culture and Polymerase Chain Reaction Based Methods. Journal of Clinical Pathology. 2002; 55: 749-753; Sarnie A., Obi C.L., Barrett L.J., Powell S.M., Guerrant R.L. Prevalence of Campylobacter Species, Helicobacter pylori and Arcobacter Species in Stool Samples from the Venda Region, Limpopo, South Africa: Studies Using Molecular Diagnostic Methods. Journal of Infection. 2007; 54: 558-566].
Наряду с этим имеются указания на то, что Campylobacter spp., имеют значение и в этиологии ВЗК, таких как неспецифический язвенный колит и/или болезнь Крона [Mahendran V., Riordan S.M., Grimm М.С., Tran T.A.T., Major J. et al. Prevalence of Campylobacter Species in Adult Crohn's Disease and the Preferential. Colonization Sites of Campylobacter Species in the Human Intestine. PLoS ONE. 2011; 6(9): e25417. doi: 10.1371/journal.pone.0025417]. В пользу вышеуказанного свидетельствует тот факт, что в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника доказана ведущая роль аутоиммунного компонента повреждения тканей кишки, который может инициироваться бактериями рода Campylobacter, а именно, их способностью к проникновению в слизистую с последующей ее сенсибилизацией [Mahendran V., Riordan S.M., Grimm М.С., Tran T.A.T., Major J. et al. Prevalence of Campylobacter Species in Adult Crohn's Disease and the Preferential. Colonization Sites of Campylobacter Species in the Human Intestine. PLoS ONE. 2011; 6(9): e25417. doi: 10.1371/journal.pone.0025417; Kaakoush N.O., Mitchell H.M. Campylobacter concisus - a new player in intestinal disease. Front. Cell. Infect. Microbiol., 03 February 2012 https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00004; Rubin D.C., Shaker A., Levin M.S. Chronic intestinal inflammation: inflammatory bowel disease and colitis-associated colon cancer. Front. Immunol., 08 May 2012 https://doi.org/10.3389/fimmu.2012.00107]. Соответственно, аутоиммунные эффекты Campylobacter spp.могут быть предупреждены и/или остановлены своевременным проведением этиотропной антибактериальной терапии вследствие раннего обнаружения и последующей эрадикации этих микроорганизмов. Однако для этого необходимо их надежное выявление непосредственно в тканях пораженных участков кишки, в которых Campylobacter spp.могут длительно сохраняться даже при отсутствии или не обнаружении их в фекалиях.
Известны способы детекции и идентификации Campylobacter spp. при использовании микроскопии или культурального метода [Методические рекомендации (MP) 01/15702-8-34. Микробиологическая диагностика кампилобактериоза. 2008; Санитарные правила (СП) 3.1.7.2816-10. Профилактика кампилобактериоза среди людей. 2010]. Однако методы микроскопии отличает крайне низкая чувствительность и специфичность. Методы культивирования, предполагающие выделение чистых культур Campylobacter spp.и их идентификацию, преимущественно ориентированы на исследование нативных фекалий, которые должны доставляться в лабораторию в специальных транспортных средах (Среда Кэри-Блер (Cary-Blair), среда Эймса (Amies)). Высевы производятся после предварительного обогащения исследуемого материала методом «мембранных» фильтров [Бойцов А.Г., Порин А.А. Устройство для выделения Campylobacter spp.из пробы. Авторское свидетельство СССР, №01576558 от 07.07.1990], на селективные среды, содержащие антибиотики в различных комбинациях Skirrow М. (ванкомицин + полимиксин В + триметоприм), Blaser М. (ванкомицин + полимиксин В + триметоприм + цефалотин + амфотерицин), Karmali М. (цефоперазон + ванкомицин + циклогексимид), Матвеева З. (рифампицин + полимиксин В + ристомицин + амфотерицин), Минаев В. (рифампицин + фузидин + цефалотин + амфотерицин) и др.). Для культивирования Campylobacter spp. предложены сложные кровяные питательные среды, включающие факторы роста, селективные добавки (антибиотики) и хромогенные субстраты, а потому дорогостоящие и имеющие ограниченные сроки хранения, например, среды Campy Food ID (Biomerieux, Франция) и Brilliance CampyCount (Oxoid, США). Вне зависимости от используемых питательных сред посевы инкубируются в специальной газовоздушной среде для микроаэрофильных бактерий (5-7% O2, 10% CO2, 83-85% N2 или 6% O2, 7% CO2, 7% Н2, 80% N2), в CO2-инкубаторах или анаэростатах. Предложены модификации культурального метода для количественного определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах [Методические указания (МУК 4.2.2321-08) Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах]. Указанные выше способы отличает исключительно высокая материало- и трудоемкость, продолжительность исследования варьирует от 3 до 7 дней. Более того ни один из этих способов не может использоваться для выявления бактерий рода Campylobacter в биоптатах, заключенных в парафин, поскольку этому обязательно предшествует фиксация ткани в формалине и гибель жизнеспособных бактерий. Это полностью исключает возможность последующего культивирования Campylobacter spp. и выделения их в чистой культуре [Kirk K.F., Nielsen H.L., Thorlacius-Ussing О., Nielsen Н. Optimized cultivation of Campylobacter concisus from gut mucosal biopsies in inflammatory bowel disease. Gut Pathog. 2016; 8: 27. DOI 10.1186/sl3099-016-0111-7].
К разряду экспресс-тестов для обнаружения Campylobacter spp., не предполагающих культивирования искомых микроорганизмов, можно отнести агглютинационные (Microscreen (Lucron), INDX-Campy (Biotrading), Dryspot Campylobacter Test (Oxoid), BBL-Campyslide (BD)) и иммунохроматографические тесты [MP 24 ФЦ/976-2004. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства компании «Merck» (Германия)]. Однако они могут использоваться только для исследования сыворотки или нативных фекалий, но не образцов ткани, заключенных в парафин.
Известен способ определения инфицированности желудка Campylobacter pyloridis путем измерения концентрации мочевины в базальной и стимулированной гистамином или пентагастрином фракциях желудочного сока до и после проведения антибактериальной терапии [Авторское свидетельство SU 1659850 А1, МПК G01N 33/48, БИ N 24, 1991], но он имеет низкую специфичность, чувствительность и также неприменим для ТПФ.
Известен набор реагентов для выявления ДНК Campylobacter spp. в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Campylobacter spp.-FL» методом ПЦР [https://www.interlabservice:ru/upload/iblock/dc9/Campvlobacter%20spp.-FL%20060219.pdf]. Однако способ рассчитан на исследование проб ДНК, выделенных из жидких селективных питательных сред для культивирования бактерий рода Campylobacter с целью первичного обогащения исследуемого материала и выделения указанных микроорганизмов из продуктов питания. Это исключает возможность исследования данным способом с применением предлагаемого набора реагентов фиксированных в формалине и заключенных в парафин образцов ткани.
Наиболее близким аналогом способа обнаружения бактерий рода Campylobacter является способ определения в биологическом образце ДНК вызывающих острые кишечные инфекции патогенных микроорганизмов, в том числе Campylobacter jejuni, включающий выделение ДНК из биологического образца, содержащего патоген, получение прямых и обратных праймеров, специфичных к ДНК одного или более маркеров ОКИ, и микрочипа, проведение ПЦР в присутствии образца ДНК и праймеров, специфичных к указанному одному или более маркерам, нанесение ПЦР-продуктов на рабочую зону биочипа, инкубацию в условиях гибридизации, детекцию образованных гибридизационных комплексов на биочипе, который содержит дифференцирующие олигонуклеотиды определенной последовательности [патент RU 2509804, 2014 г.]. Недостатками прототипа являются продолжительность, высокая стоимость и трудоемкость способа.
Наиболее близким аналогом набора для идентификации бактерий рода Campylobacter является набор для обнаружения ДНК вызывающих острые кишечные инфекции патогенных микроорганизмов, в том числе Campylobacter jejuni, включающий матрицу, содержащую аминогруппы с плотностью 1-2 групп/нм2; реакционную смесь, содержащую 1 мкМ олигонуклеотида и 60 мМ гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида в 0,1 М 1-метилимидазоле, рН 7,0; промывочные растворы - 0,5 мМ NaCl, содержащий 0,1% додецилсульфат натрия и дистиллированную воду; олигонуклеотиды, модифицированные фосфатной группой (р) по 5'-положению ID SEQ No: 59, 68, 90 и 91; для лизиса - физиологический раствор, лизирующий буфер на деионизованной воде (Трис-HCl, рН 6,8 - 0,05 М, гуанидинтиоцианата - 3,13 М, GTC, этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) - 0,025 М, саркозил - 1, буфер 1 (Трис-HCl, рН 6,8 - 0,0585 М, гуанидингидрохлорид - 2,34 М, и ЭДТА - 0,0243 М), буфер 2 (1 М Трис-HCl, рН 8,0 с конечной концентрацией 0,05 М); буфера для элюции (Chelex 100 - 5%, Трис-HCl, рН 8,0 - 0,05 М); ПЦР-смесь - композиции олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, и 1 мкл Taq ДНК-полимеразы, 2х реакционный буфер готовят на деионизованной воде (1 М Трис-HCl, рН 8,8-0,16 М; (NH4)2SO4 - 0,032 М; MgCI2 - 0,004 М; смесь дНТФ - 0,004 М; твин 20 -до конечной концентрации 0,04%); ПК-положительный контрольный образец - смесь рекомбинантных плазмид, полученных на основе pUC18 и содержащих последовательность маркерных генов каждого возбудителя в концентрации 5 пг/мкл (или 1,5×106 молекул ДНК в 1 мкл); отрицательный контрольный образец - рекомбинантная плазмида, полученная на основе pUC18 и содержащая последовательность маркера GE13 в концентрации 50 пг/мкл (или 15×106 молекул ДНК в 1 мкл). После окончания программы амплификации - раствор экзонуклеазы в буферном растворе в концентрации 2 ед. активности/мкл; стоп-раствор - ЭДТА на деионизованной воде в концентрации 0,020 М. Для гибридизации продуктов ПЦР на биочипах смесь (2,5 мкл 20×SSC, 2 мкл 1% додецилсульфат натрия); растворы для чипов: 2×SSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 минут; 1×SSC, 0,1% додецилсульфат натрия - 1 раз 5 минут; 0,5×SSC - 2 раза по 5 минут [патент RU 2509804, 2014 г.]. Набор обеспечивает выявление 10-103 копий ДНК, наряду с рядом патогенов лишь одного вида кампилобактерий - Campylobacter jejuni.
Задачей настоящей группы изобретений является разработка высокочувствительного и специфичного способа и набора для ускоренной лабораторной детекции патогенных представителей бактерий рода Campylobacter в образцах ткани кишечника, заключенных в парафин, у больных с воспалительными заболеваниями кишечника.
Технический результат, достигаемый при использовании группы изобретений, - упрощение и сокращение продолжительности исследования.
Сущность предлагаемой группы изобретений заключается в следующем.
При колоноскопии проводят забор биоптата пораженного участка кишки, фиксируют биоптат в формалине и заключают в парафин общепринятым способом [Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - 5-е изд., испр. и доп. Ленинград: Медицина. Ленингр. отд-ние, 1969.- 423 с.]. Для выделения ДНК Campylobacter spp. из образцов ткани кишки, заключенных в парафин, изготавливают срезы толщиной 1-2 мм (по 4-6 срезов на 1 образец), помещают их в пробирки типа эппендорф, которые инкубируют в портативном термостате при 93°С для плавления парафина. Не вынимая пробирки из термостата, в каждую пробу с анализируемым образцом быстро вносят компонент 1-10 мкл магнитных частиц («Sileks» MagNA, Россия) и суспендируют на вортексе. Помещают пробирки в портативный термостат (93°С) и, не вынимая, вносят в каждую по 100 мкл компонента 2 - связывающий буфер для лизиса, содержащий 4М гуанидинтиоцианата, 100 мМ Трис-HCl буфера (рН 7.4), 2 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (рН 8.0), 2% Triton Х-100. Затем пробирки ресуспендируют на вортексе и снова помещают в портативный термостат (93°С). Далее каждую из пробирок поочередно помещают в магнитный штатив. С помощью дозатора из пробирок отбирают и отбрасывают светлую фазу (остатки парафина и детрит ткани), не задевая при этом осадка из магнитных частиц. Затем в каждый образец вносят по 200 мкл компонента 3 - отмывочный раствор, содержащий 70% Этанол, 20 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 2 мМ ЭДТА (рН 8.0), перемешивают на вортексе в течение 10-15 секунд. Помещают пробирки в магнитный штатив, после чего отбирают и отбрасывают прозрачную фазу, не задевая осадка из магнитных частиц. Пробирки с открытой крышкой подсушивают при 65°С 5-10 мин. В каждую пробирку вносят по 50 мкл компонента 4 - буфера для элюции, содержащего 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 1 мМ ЭДТА (рН 8.0), перемешивают 5-10 сек и осаждают магнитные частицы в магнитном штативе. Отбирают надосадочную жидкость, содержащую очищенную ДНК, в чистые промаркированные пробирки. Проводят ПЦР.
Для этого смешивают выделенную ДНК (1 мкл/образец) и детекционную смесь (25 мкл/образец), включающую 2,5 мкл Taq-буфера, 2,5 мкл DNTP, 16,5 мкл деионизованной воды, 0,5 мкл Taq-полимеразы, по 1 мкл праймеров CampF (5'-AGAACACGCGGACCTATATA-3') и CampR (5'-CGATGCATCCAGGTAATGTAT-3') - родоспецифичных праймеров, гомологичных родоспецифичному фрагменту 16S рРНК бактерий рода Campylobacter (Campylobacter jejuni, Campylobacter coli и Campylobacter upsaliensis). На поверхность каждой реакционной смеси наслаивают 50 мкл минерального масла. Режим амплификации: денатурация (95°С, 1 мин), затем - 30 циклов амплификации (денатурация ДНК (95°С, 30 сек), отжиг (60°С, 30 сек), элонгация (72°С, 30 сек).
После чего осуществляют детекцию продуктов амплификации горизонтальным электрофорезом в агарозном геле путем сравнения электрофоретической подвижности полученных ампликонов с подвижностью маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix ("Fermentas", Литва). При наличии продукта амплификации, соответствующего размеру 256 пар нуклеотидов (п.н.), делают вывод о наличии в исследованных образцах ткани основных патогенных представителей Campylobacter spp. (Campylobacter jejuni, Campylobacter coli и Campylobacter upsaliensis).
Набор для ПЦР-детекции Campylobacter spp. в образцах ткани, заключенных в парафин, содержит компонент 1: 10 мкл суспензии магнитных частиц («Sileks» MagNA, Россия)); компонент 2: связывающий буфер для лизиса, содержащий 4М Гуанидинтиоцианата, 100 мМ Трис-HCl буфера (рН 7.4), 2 мМ ЭДТА (рН 8.0), 2% Triton Х-100; компонент 3: отмывочный раствор, содержащий 70% Этанол, 20 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 2 мМ ЭДТА (рН 8.0), компонент 4: буфер для элюции, содержащий 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 1 мМ ЭДТА (рН 8.0); компонент 5: детекционная смесь, содержащая 2,5 мкл Taq-буфера, 2,5 мкл смеси нуклеотидов (DNTP), 16,5 мкл деионизованной воды, 0,5 мкл Taq-полимеразы, по 1 мкл праймеров CampF (5'-AGAACACGCGGACCTATATA-3') и CampR (5'-CGATGCATCCAGGTAATGTAT-3') и компонент 6: маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix ("Fermentas", Литва).
Использование предлагаемой группы изобретений позволяет обнаруживать в ТПФ даже следы присутствия основных патогенных представителей рода Campylobacter.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 представлена электрофореграмма результатов амплификации ДНК, выделенной из образца пациента М. с градиентом температур от 53°С до 60°С, на которой видно, что при температуре 60°С образовался продукт амплификации, соответствующий размеру 256 п.н.; на фиг. 2 - электрофореграмма результатов амплификации участка гена 16s РНК Campylobacter spp. 256 п.н.
Способ осуществляется следующим образом.
Для ПЦР-детекции Campylobacter spp. в образцах ткани, заключенных в парафин, реализуются следующие этапы: 1) подготовка срезов образцов ткани, заключенных в парафин, и депарафинизация 2) выделение ДНК; 3) приготовление реакционной смеси; 4) амплификация; 5) детекция результатов путем горизонтального электрофореза в агарозном геле.
1. Из блоков ТФП, изготовленных из биоптатов пораженных участков кишки, полученных в процессе колоноскопии у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, одноразовыми скальпелями готовят срезы толщиной 1-2 мм (по 4-6 срезов на 1 образец), помещают их в предварительно промаркированные пробирки типа эппендорф, которые инкубируют в портативном термостате при 93°С до полного расплавления парафина.
2. Не вынимая пробирок из термостата, в каждую пробу с анализируемым образцом быстро вносят 10 мкл компонента 1 из набора, суспендируют на вортексе. Помещают пробирки в портативный термостат (93°С) и, не вынимая, вносят в каждую по 100 мкл компонента 2 из набора. Затем пробирки ресуспендируют на вортексе и повторно инкубируют в портативном термостате (93°С). Далее каждую из пробирок поочередно помещают в магнитный штатив. С помощью дозатора из пробирок отбирают и отбрасывают светлую фазу (остатки парафина и тканевой детрит), не задевая при этом осадка. Затем в каждый образец вносят по 200 мкл компонента 3, перемешивают на вортексе в течение 10-15 секунд. Помещают пробирки в магнитный штатив, после чего отбирают и отбрасывают прозрачную фазу, не задевая осадка. Пробирки с открытой крышкой подсушивают при 65°С 5-10 мин. В каждую пробирку вносят по 50 мкл компонента 4, перемешивают 5-10 сек и помещают в магнитный штатив. Отбирают надосадочную жидкость, содержащую очищенную ДНК, в чистые пробирки.
3. Приготовление реакционной смеси: отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб, маркируют. В каждую пробирку вносят 25 мкл компонента 5 из набора, затем - 3 мкл ДНК пробы, полученной после экстракции из клинического и/или контрольного образца; добавляют 1 каплю минерального масла.
4. Приготовленные пробы помещают в амплификатор МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия) или иной термоциклер. Режим амплификации: денатурация (95°С, 1 мин), затем - 30 циклов амплификации (денатурация ДНК (95°С, 30 сек), отжиг (60°С, 30 сек), элонгация (72°С, 30 сек)).
5. Детекцию результатов реакции осуществляют в горизонтальном электрофорезе в агарозном геле. Заранее готовят 1,7% агарозный гель. Полученные амплификаты в объеме 10 мкл смешивают с лидирующим красителем, вносят в лунки агарозного геля и подключают к источнику электрического тока. Электрофорез проводят в режиме 110 V в течение 40 мин. Результат реакции выявляют с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографируют. Для контроля размеров ампликонов используют маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). После окончания электрофореза гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют на фотодокументационной системе Gel Camera System (UVP, Inc. США). Детекцию результатов осуществляют путем сравнения размеров исследуемого ДНК-образца с маркером молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Если размер ожидаемого продукта составляет 256 п.н., то данные образцы регистрируются как содержащие ДНК Campylobacter spp. Напротив, в образцах, не содержащих ДНК Campylobacter spp. после проведения ПЦР продукт амплификации не определяется.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами.
Пример №1.
Пациент М., 54 года. Диагноз: неспецифический язвенный колит в стадии обострения. Жалобы на стул с кровью, сильные боли в брюшной области, лихорадка, повышенная температура. Исследуемый материал: парфиновые блоки биоптатов толстого кишечника размером 1,5×1,0×0,5 см, №7.
Из ТПФ биоптата толстого кишечника размером 1,5×1,0×0,5 см, полученного из пораженных участков кишки в процессе колоноскопии, одноразовыми скальпелями приготовили 5 срезов толщиной 1-2 мм, поместили их в пробирки типа эппендорф, промаркировали и инкубировали при 93°С до полного расплавления парафина.
Не вынимая пробирок из термостата, в каждую пробу с анализируемым образцом быстро внесли 10 мкл компонента 1 из набора и суспендировали на вортексе. Не прекращая инкубации при 93°С внесли 100 мкл компонента 2 из набора. Ресуспендировали на вортексе и инкубировали при 93°С. Пробирку поместили в штатив с магнитом. С помощью дозатора из пробирок отобрали и отбросили светлую фазу (остатки парафина и детрит ткани), не задевая при этом осадка из компонента 1. Затем в каждый образец внесли 200 мкл компонента 3, ресуспендировали на вортексе в течение 10-15 секунд. Поместили пробирку в штатив с магнитом, после чего отобрали и отбросили прозрачную фазу, не задевая осадка. Пробирку с открытой крышкой подсушили при 65°С 10 мин. Внесли в пробирку 50 мкл компонента 4, перемешали 10 сек и поместили в магнитный штатив. Отобрали надосадочную жидкость, содержащую очищенную ДНК, в чистую пробирку. Далее внесли в пробирку сначала 25 мкл компонента 5 из набора, затем 3 мкл ДНК пробы и добавили 1 каплю минерального масла.
Приготовленные пробы разделили на 8 частей, каждую из которых амплифицировали в амплификаторе МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия), изменяя температуру отжига в градиенте от 53°С до 60°С для подбора оптимальной. Режим амплификации: денатурация (95°С, 1 мин), затем - 30 циклов амплификации (денатурация ДНК (95°С, 30 сек), отжиг (60°С, 30 сек), элонгация (72°С, 30 сек).
Детекцию результатов реакции осуществили в горизонтальном электрофорезе в 1,7% агарозном геле. Полученные амлификаты в количестве 10 мкл вносят в лунки агарозного геля и подключают к источнику электрического тока. Электрофорез проводят в режиме 110 V в течение 40 мин. Результат реакции выявляют с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографируют. Для контроля качества электрофореза используют маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). После окончания электрофореза гель окрашивают бромистым этидием и фотографируют на фотодокументационной системе Gel Camera System (UVP, Inc. США). Детекцию результатов осуществляют путем сравнения размеров исследуемого ДНК-образца со маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва).
Заключение. Температурный оптимум отжига для получения ожидаемого продукта составил 256 п.н. при 60°С (фиг. 1). Определяют наличие в исследованном образце ткани патогенных представителей рода Campylobacter. C. jejuni и\или C. coli и/или Cupsaliensis.
Пример №2.
Исследовали заключенные в парафиновые блоки биоптаты пораженных участков толстой кишки, полученные в процессе колоноскопии 9 пациентов с диагнозом «Неспецифический язвенный колит» (образцы №1-9) и 8 пациентов с клиническим диагнозом «Болезнь Крона» (образцы №10-17).
Из них одноразовыми скальпелями приготовили срезы толщиной 1-2 мм (по 4-6 срезов на 1 образец) и поместили их в пробирки типа эппендорф, промаркировали и инкубировали при 93°С до полного расплавления парафина.
Не вынимая пробирок из термостата, в каждую пробу с анализируемым образцом быстро внесли по 10 мкл компонента 1 из набора и суспендировали на вортексе. Поместили пробирки в портативный термостат (93°С) и, не вынимая, внесли в каждую по 100 мкл компонент 2 из набора. Затем пробирки ресуспендировали на вортексе и снова проинкубировали в портативном термостате (93°С). Далее каждую из пробирок поочередно поместили в штатив с магнитом. С помощью дозатора из пробирок отобрали и отбросили светлую фазу (остатки парафина и детрит ткани), не задевая при этом осадка. Затем в каждый образец внесли по 200 мкл компонента 3, перемешали на вортексе в течение 10-15 секунд. Поместили пробирки в штатив с магнитом, после чего отобрали и отбросили прозрачную фазу, не задевая осадка. Пробирки с открытой крышкой подсушили при 65°С 5-10 мин. В каждую пробирку внесли по 50 мкл компонента 4, перемешали 5-10 сек и поместили в магнитный штатив. Отобрали надосадочную жидкость, содержащую очищенную ДНК, в чистые пробирки.
Приготовление реакционной смеси: отобрали необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых проб, промаркировали. В каждую пробирку внесли сначала по 25 мкл компонента 5 из набора, затем по 3 мкл ДНК исследуемых проб, полученных после экстракции из заключенных в парафин биоптатов; добавили по 1 капле минерального масла.
Приготовленные пробы поместили в амплификатор МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия) или иной термоциклер. Режим амплификации: денатурация (95°С, 1 мин), затем - 30 циклов амплификации (денатурация ДНК (95°С, 30 сек), отжиг (60°С, 30 сек), элонгация (72°С, 30 сек).
Детекцию результатов реакции осуществили в горизонтальном электрофорезе в 1,7% агарозном геле. Полученные амлификаты в количестве по 10 мкл внесли в лунки агарозного геля и подключили к источнику электрического тока. Электрофорез проводили в режиме 110 V в течение 40 мин. Для контроля размеров ампликонов использовали маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Результат реакции были учтены с помощью УФ-трансиллюминатора и сфотографированы. Детекцию результатов осуществляли путем сравнения размеров исследуемого ДНК-образца со маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Если размер ожидаемого продукта составляет 256 п.н., то данные образцы регистрировали, как содержащие ДНК Campylobacter spp. Напротив, в образцах, не содержащих ДНК Campylobacter spp. после проведения ПЦР продукт амплификации не определялся.
В результате проведенных исследований в полученных путем колоноскопии и заключенных в парафин биоптатах 9 пациентов с диагнозом «Неспецифический язвенный колит» (образцы №1-9) в образцах №1, 3-9 обнаружена ДНК Campylobacter spp. Образец №2 - отрицательный. В заключенных в парафин биоптатах 8 пациентов с клиническим диагнозом «Болезнь Крона» (образцы №10-17) в образцах 11-17 обнаружена ДНК Campylobacter spp. Образец №10 - отрицательный (фиг. 2).
Claims (2)
1. Способ обнаружения бактерий рода Campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, включающий выделение ДНК из биологического образца, предположительно содержащего патоген, проведение ПЦР в присутствии специфичных праймеров, амплификацию, отличающийся тем, что в качестве биологического образца используют заключенные в парафин образцы ткани кишки больных с воспалительными заболеваниями кишечника, из них готовят 4-6 срезов толщиной 1-2, проводят депарафинизацию срезов, затем лизис, для чего добавляют магнитные частицы и связывающий буфер для лизиса, содержащий 4М гуанидинтиоцианата, 100 мМ Трис-HCl буфера, 2 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), 2% Triton Х-100, после чего проводят спиртовое осаждение и элюцию выделенной ДНК, для этого добавляют отмывочный раствор, содержащий 70% этанол, 20 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, после высушивания добавляют по 50 мкл буфера для элюции, содержащего 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, ПЦР проводят с использованием праймеров CampF 
и CampR 
для детекции продукта амплификации проводят электрофорез в агарозном геле, и при наличии продукта амплификации размером 256 пар нуклеотидов определяют наличие в исследованном образце ткани патогенных представителей рода Campylobacter: C. jejuni и/или C. coli и/или C. upsaliensis.
2. Набор для обнаружения бактерий рода Campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника, включающий связывающий буфер для лизиса, содержащий гуанидинтиоцианат, Трис-HCl буфер и ЭДТА, буфер для элюции, содержащий Трис-HCl, а также реакционную смесь, содержащую Taq-полимеразу, воду, смесь нуклеотидов и праймеры, отличающийся тем, что дополнительно содержит 10 мкл суспензии магнитных частиц, отмывочный раствор, содержащий 70% этанол, 20 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 2 мМ ЭДТА (рН 8.0), маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix, при этом связывающий буфер для лизиса содержит 4М гуанидинтиоцианата, 100 мМ Трис-HCl буфера (рН 7.4), 2 мМ ЭДТА (рН 8.0), 2% Triton Х-100, буфер для элюции содержит 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 1 мМ ЭДТА (рН 8.0), а реакционная смесь содержит 2,5 мкл Taq-буфера, 2,5 мкл смеси нуклеотидов, 16,5 мкл деионизованной воды, 0,5 мкл Taq-полимеразы, по 1 мкл праймеров CampF 
и CampR 
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019136587A RU2732923C1 (ru) | 2019-11-13 | 2019-11-13 | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019136587A RU2732923C1 (ru) | 2019-11-13 | 2019-11-13 | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2732923C1 true RU2732923C1 (ru) | 2020-09-24 |
Family
ID=72922371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019136587A RU2732923C1 (ru) | 2019-11-13 | 2019-11-13 | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2732923C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1576558A1 (ru) * | 1988-06-08 | 1990-07-07 | Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт | Устройство дл выделени кампилобактерий из пробы |
| RU2509804C2 (ru) * | 2010-03-31 | 2014-03-20 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Набор дифференцирующих и специфических олигонуклеотидов для идентификации днк возбудителей острых кишечных инфекций, способ идентификации оки, микрочип и диагностическая система для осуществления способа |
-
2019
- 2019-11-13 RU RU2019136587A patent/RU2732923C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1576558A1 (ru) * | 1988-06-08 | 1990-07-07 | Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт | Устройство дл выделени кампилобактерий из пробы |
| RU2509804C2 (ru) * | 2010-03-31 | 2014-03-20 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Набор дифференцирующих и специфических олигонуклеотидов для идентификации днк возбудителей острых кишечных инфекций, способ идентификации оки, микрочип и диагностическая система для осуществления способа |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TRACEY A. et al. Speciating Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates from poultry and humans using six PCR-based assays, Fems microbiology letters 216, 2002, p.201-209. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Rapid detection of Salmonella with recombinase aided amplification | |
| Fan et al. | Multiplex real-time SYBR Green I PCR assay for detection of tetracycline efflux genes of Gram-negative bacteria | |
| Thapa et al. | Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by a dry methyl green loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method | |
| Haldar et al. | Improved laboratory diagnosis of tuberculosis–the Indian experience | |
| Fearnley et al. | The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue | |
| Xin et al. | Rapid detection and differentiating of the predominant Salmonella serovars in chicken farm by TaqMan multiplex real-time PCR assay | |
| RU2360972C1 (ru) | Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления | |
| Benga et al. | Development of a multiplex PCR assay based on the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification of rodent Pasteurellaceae | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| Brooks et al. | Diagnosis of Helicobacter pylori infection by polymerase chain reaction: is it worth it? | |
| Bölske et al. | Diagnosis of paratuberculosis by PCR. | |
| KR100388548B1 (ko) | 알이피 13 이 12 반복서열의 피시알 증폭을 이용한결핵균의 검출방법 | |
| Athari et al. | Prevalence of oral trichomoniasis in patients with periodontitis and gingivitis using PCR and direct smear | |
| Yu et al. | A novel CRISPR/Cas12a biosensor for sensitive detection of Helicobacter pylori from clinical patients | |
| CN105368825B (zh) | 幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法 | |
| KR20090100950A (ko) | 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법 | |
| CN108796105A (zh) | 羊贾第虫与隐孢子虫双重pcr检测试剂盒及其方法 | |
| CN102409102A (zh) | 一种鉴别牛分枝杆菌的pcr引物及方法 | |
| RU2732923C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника | |
| Saytekin et al. | Direct diagnosis of Brucella species through multiplex PCR formed by a new method | |
| Benga et al. | Specific detection and identification of [Actinobacillus] muris by PCR using primers targeting the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer regions | |
| RU2715333C1 (ru) | Набор реагентов для выявления и идентификации днк возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ом-скрин-бруцеллез-рв" | |
| Debroy et al. | Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) in alcohol-fixed tissues of sheep by ISMav2 gene PCR and its comparison with histopathology, bacterial culture and IS900 PCR | |
| RU2608651C1 (ru) | Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов | |
| JPWO2018212288A1 (ja) | パーキンソン病の判定マーカーおよび判定方法 |