RU2732150C1

RU2732150C1 - Method for producing autologous thrombocyte lysate as a base for cellular biomedical preparations of veterinary medicine

Info

Publication number: RU2732150C1
Application number: RU2020109651A
Authority: RU
Inventors: Лариса Сергеевна Литвинова; Валерия Владимировна Шуплецова; Ольга Геннадьевна Хазиахматова; Кристина Алексеевна Юрова; Наталья Михайловна Тодосенко
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий"
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2020-09-11

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention represents a method for producing an autologous thrombocyte lysate as a base for cell biomedical preparations of veterinary medicine, wherein the cell biomedical preparations are based on thrombocyte lysate and blood plasma derived from autologous blood for stromal cells cultivation when using a cell preparation in veterinary medicine. Thrombocyte lysate used in the declared invention is obtained from autologous blood, which is centrifuged, plasma rich in thrombocytes is taken.EFFECT: disclosed method is used to dilute a cell preparation, thereby improving its quality, stimulating activation of cell regenerative properties, maximally preserving viability of the cell component.1 cl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины.The invention relates to biotechnology and veterinary medicine and relates to the production of autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine.

Продукты фракционирования плазмы крови человека используются для лечения различных заболеваний. Эти производные включают богатую тромбоцитами плазму, сыворотку, гель тромбоцитов и лизат тромбоцитов (PL). Среди них PL содержит больше факторов роста, чем другие, и его производство является недорогим и простым. PL является одним из надлежащих источников факторов высвобождения тромбоцитов. Он используется в росте и пролиферации клеток и является хорошей альтернативой фетальной бычьей сыворотке. В последние годы клиническое использование PL стало более привлекательным. PL представляет собой раствор, насыщенный факторами роста, белками, цитокинами и хемокинами, и применяется для лечения различных заболеваний, таких как заживление ран, регенерация костей, алопеция, мукозит полости рта, корешковая боль, остеоартрит и заболевания глаз. Кроме того, его можно использовать в клеточной культуре для клеточной терапии и трансплантации тканей. Фактор роста тромбоцитов, фактор роста фибробластов, инсулиноподобный фактор роста, трансформирующий фактор роста β и фактор роста эндотелия сосудов являются ключевыми факторами роста PL, играющими основную роль в пролиферации клеток, заживлении ран и ангиогенезе.Fractionation products of human blood plasma are used to treat various diseases. These derivatives include platelet-rich plasma, serum, platelet gel, and platelet lysate (PL). Among them, PL contains more growth factors than others and is inexpensive and easy to manufacture. PL is one of the proper sources of platelet release factors. It is used in cell growth and proliferation and is a good alternative to fetal bovine serum. In recent years, the clinical use of PL has become more attractive. PL is a solution saturated with growth factors, proteins, cytokines and chemokines and is used to treat various diseases such as wound healing, bone regeneration, alopecia, oral mucositis, radicular pain, osteoarthritis and eye diseases. Moreover, it can be used in cell culture for cell therapy and tissue transplantation. Platelet growth factor, fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, transforming growth factor β and vascular endothelial growth factor are key growth factors PL, playing a major role in cell proliferation, wound healing and angiogenesis.

Лизат тромбоцитов первоначально был предложен Doucet et al. В качестве альтернативы сыворотке животных для экспансии MCK ex vivo. [Doucet С.et al., 2005]. Биологически активные молекулы и факторы роста, содержащиеся в PL, поддерживают рост МСК, полученных из костного мозга (ВМ) [Muller I. et al., 2006; Bieback K. et al., 2009; Fekete N. et al., 2012; Bartmann C. et al., 2007], пуповинной крови (UCB) [Avanzini M.A. et al., 2009, Reinisch A. et al., 2007] и жировой ткани (AT) [Naaijkens В.A. et al., 2012; Cholewa D. et al., 2011; Blande I.S. et al., 2009], показывая перспективные результаты по сравнению с FBS.Platelet lysate was originally proposed by Doucet et al. As an alternative to animal serum for ex vivo MCK expansion. [Doucet C. et al., 2005]. Biologically active molecules and growth factors contained in PL support the growth of MSCs obtained from bone marrow (BM) [Muller I. et al., 2006; Bieback K. et al., 2009; Fekete N. et al., 2012; Bartmann C. et al., 2007], cord blood (UCB) [Avanzini M.A. et al., 2009, Reinisch A. et al., 2007] and adipose tissue (AT) [Naaijkens V.A. et al., 2012; Cholewa D. et al., 2011; Blande I.S. et al., 2009], showing promising results compared to FBS.

Тромбоциты содержат биоактивные молекулы и факторы роста, которые высвобождаются из α-гранул после разрушения тромбоцитов физическими или физиологическими методами. Среди них факторы коагуляции, молекулы адгезии, ингибиторы протеаз и протеогликаны, основной фактор роста, выделенный из фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF), HGF, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), растворимый CD40L, TGF-β1, молекула межклеточной адгезии-1, молекула адгезии сосудистых клеток-1, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, хемокин (СС) лиганд 5 и хемокин (СХС) лиганд 1 / 2/3 [Fekete N. et al., 2012]. Все эти молекулы влияют на пролиферацию и функции клеток [Schallmoser K. et al., 2006] и могут более эффективно способствовать пролиферации по сравнению с FBS [Castegnaro S. et al., 2011].Platelets contain bioactive molecules and growth factors that are released from α-granules after platelets are destroyed by physical or physiological methods. Among them, coagulation factors, adhesion molecules, protease inhibitors and proteoglycans, basic growth factor isolated from fibroblasts (bFGF), epidermal growth factor (EGF), HGF, vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1 ), soluble CD40L, TGF-β1, intercellular adhesion molecule-1, vascular cell adhesion molecule-1, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, chemokine (CC) ligand 5 and chemokine (CXC) ligand 1/2 / 3 [Fekete N. et al., 2012]. All these molecules affect cell proliferation and function [Schallmoser K. et al., 2006] and can more effectively promote proliferation compared to FBS [Castegnaro S. et al., 2011].

В последние годы PL используется в качестве дополнения в культуральной среде стромальных клеток [Chou M.L., et al., 2016].In recent years, PL has been used as a supplement in the culture medium of stromal cells [Chou M.L., et al., 2016].

Наиболее близким по технической сущности заявляемому (или выбранному в качестве прототипа) является способ «Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток» (RU 2648162 С2). Способ заключается в получении ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов (ЛТ) из тромбоцитарной массы (ТМ) доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток человека. Представленный способ включает нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов 1,75×10⁹ кл/мл посредством центрифугирования тромбоцитарной массы при 3130 g в течение 40 минут при 20°С и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до указанной концентрации тромбоцитов. Трехкратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С. Осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования при 3130 g в течение 40 минут при 20°С, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов с последующим его микроскопическим контролем при увеличении ×200 на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов.The closest in technical essence to the claimed (or selected as a prototype) is the method "Method for producing a growth supplement based on platelet lysate from platelet mass of donors to a medium for increasing the cell mass of stem, progenitor, differentiated and tumor cells" (RU 2648162 C2). The method consists in obtaining a growth supplement based on platelet lysate (LT) from platelet mass (TM) donors to a medium for increasing the cell mass of stem, progenitor, differentiated and tumor cells of a person. The presented method includes normalizing a platelet sample to a predetermined platelet concentration of 1.75 × 10 ⁹ cells / ml by centrifuging the platelet mass at 3130 g for 40 minutes at 20 ° C and resuspending the sediment in the supernatant of a given volume to the indicated platelet concentration. Three-fold thermal lysis of the standardized sample by freezing for a day to -80 ° C and thawing at + 37 ° C. Sedimentation of cell debris by centrifugation at 3130 g for 40 minutes at 20 ° C, collecting the supernatant to obtain an individual sample of platelet lysate, followed by its microscopic control at a magnification of × 200 for the presence of no more than 3 platelet fragments in the field of view.

Недостатком данного метода является то, что тромбоцитарный лизат используется только при культивировании клеток. Кроме того, данный способ характеризуется множественными циклами очистки, необходимыми при культивировании клеточной линии. При использовании тромбоцитарного лизата в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов, клеточный дебрис при лизисе аутологичных тромбоцитов можно не центрифугировать. Все тромбоцитарные факторы и клеточный дебрис способствуют более эффективной активации стромальных клеток в клеточном препарате.The disadvantage of this method is that platelet lysate is used only for cell cultivation. In addition, this method is characterized by multiple purification cycles required for culturing the cell line. When platelet lysate is used as the basis for cellular biomedical preparations, cell debris during lysis of autologous platelets need not be centrifuged. All platelet factors and cell debris promote more efficient activation of stromal cells in the cell preparation.

В способах создания клеточных продуктов на основе стромальных клеток, таких как биотрансплантанты, в качестве среды/основы для продукта используют физиологический раствор. Так в способе «Биотрансплантат и способ лечения остеопороза» (патент РФ №RU 2265442 С1, 2004 г., A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); А61Р 19/10 (2000.01)). Способ лечения остеопороза заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора.Methods for making stromal cell products, such as biotransplants, use saline as a medium / product base. So in the method "Biograft and a method for treating osteoporosis" (RF patent No. RU 2265442 C1, 2004, A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); A61P 19/10 (2000.01)). The method of osteoporosis treatment consists in intravenous drip of MSCs from 50 to 500 million in 50-100 ml of saline.

Другой способ «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения» (патент РФ RU 2 659 204 С1) характеризуется тем, что он содержит от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в 1 мл физиологического раствора.Another method "Biotransplant for the treatment of joint dysplasia and a method for its production" (RF patent RU 2 659 204 C1) is characterized in that it contains from 5 million multipotent mesenchymal stromal cells in 1 ml of saline.

Недостатком данного способа является использования физиологического раствора для разведения клеточного препарата. Использование тромбоцитарного лизата в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины, позволяет улучшить качество продукта, в частности его терапевтических свойств, посредством ростовых и противовоспалительных факторов, присутствующих непосредственно в тромбоцитарном лизате.The disadvantage of this method is the use of saline for dilution of the cell preparation. The use of platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine makes it possible to improve the quality of the product, in particular its therapeutic properties, by means of growth and anti-inflammatory factors present directly in the platelet lysate.

Заявляемый способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов является методом изоляции аутологичной плазмы богатой тромбоцитами из крови, последующего температурного лизиса обогащенной тромбоцитами плазмы и использования в качестве основы для клеточного препарата.The inventive method for producing autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations is a method of isolating autologous platelet-rich plasma from blood, subsequent thermal lysis of platelet-rich plasma and use as a basis for a cell preparation.

Задачей заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа получения аутологичного тромбоцитарного лизата для применения в качестве основы для клеточного препарата ветеринарной медицины.The objective of the claimed invention is to develop a highly effective method for producing autologous platelet lysate for use as a basis for a cell preparation in veterinary medicine.

Поставленная задача решается тем, что в изобретении «Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины», при котором в основе для клеточных биомедицинских препаратов содержится тромбоцитарный лизат и плазма крови, полученные из аутологичной крови, предназначенные для разведения стромальных клеток при использовании клеточного препарата в ветеринарной медицине.The problem is solved by the fact that the invention "A method for producing autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine", in which the basis for cellular biomedical preparations contains platelet lysate and blood plasma obtained from autologous blood, intended for dilution of stromal cells when using a cell preparation in veterinary medicine.

Используемый в заявленном изобретении тромбоцитарный лизат, получают из аутологичной крови, которую центрифугируют, отбирают плазму богатую тромбоцитами.The platelet lysate used in the claimed invention is obtained from autologous blood, which is centrifuged, and platelet-rich plasma is collected.

В «Способе получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины» тромбоциты изолируют от форменных элементов крови, концентрируют тромбоциты посредством центрифугирования и последующего многократного температурного лизиса.In the "Method for producing autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine", platelets are isolated from blood cells, platelets are concentrated by centrifugation and subsequent multiple temperature lysis.

Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.

Аутологичная венозная кровь пациента в присутствие антикоагулянта гепарином или этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) центрифугируется 10 минут при 1800 об/мин. После чего в стерильных условиях ламинарного бокса из пробирки отбирается верхняя фракция обогащенной тромбоцитами плазмы крови. Для изоляции и концентрации тромбоцитов полученная фракция подвергается повторному центрифугированию 15 минут при 3600 об/мин. Осадок тромбоцитов разводится в 1 мл аутологичной плазмы крови и определяется концентрация тромбоцитов. Полученный концентрат тромбоцитов подвергается температурному лизису, посредством многократных 3-5 циклов быстрой заморозки до -80°С и разморозки до +37°С. При температуре -80°С образцы находятся 24-48 часов. При температуре +37°С образцы находятся 30-60 минут. Последний цикл температурного лизиса завершается заморозкой образца и хранением при -80°С. Для применения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины замороженную пробу аутологичного лизата тромбоцитов размораживают при температуре +37°С и используют для разведения клеточного материала и используют непосредственно перед применением клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины.Autologous venous blood of the patient in the presence of the anticoagulant heparin or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is centrifuged for 10 minutes at 1800 rpm. After that, under sterile conditions in a laminar box, the upper fraction of platelet-rich blood plasma is taken from the test tube. For isolation and concentration of platelets, the obtained fraction is subjected to repeated centrifugation for 15 minutes at 3600 rpm. The platelet sediment is diluted in 1 ml of autologous blood plasma and the platelet concentration is determined. The obtained platelet concentrate is subjected to temperature lysis, through repeated 3-5 cycles of rapid freezing to -80 ° C and defrosting to + 37 ° C. At a temperature of -80 ° C, the samples are kept for 24-48 hours. At a temperature of + 37 ° C, samples are kept for 30-60 minutes. The last cycle of thermal lysis is completed by freezing the sample and storing at -80 ° C. For the use of autologous platelet lysate as the basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine, a frozen sample of autologous platelet lysate is thawed at a temperature of + 37 ° C and used to dilute the cellular material and used immediately before the application of cellular biomedical preparations of veterinary medicine.

Условия поэтапного центрифугирования позволяют выделить чистую популяцию тромбоцитов без примесей других типов форменных элементов крови.The conditions of stepwise centrifugation make it possible to isolate a pure population of platelets without admixtures of other types of blood cells.

Условия центрифугирования позволяют сконцентрировать максимальное количество тромбоцитов в минимальном объеме.Centrifugation conditions allow concentrating the maximum number of platelets in a minimum volume.

Условия многократных циклов лизиса тромбоцитарной массы позволяют денатурировать более 95% тромбоцитов (Фиг. 1).The conditions of multiple cycles of platelet mass lysis make it possible to denature more than 95% of platelets (Fig. 1).

Ниже на таблице 1 показана эффективность предложенного способа лизирования тромбоцитов выражающееся в числе тромбоцитов в 1 мл плазмы.Table 1 below shows the effectiveness of the proposed method of lysis of platelets, expressed in the number of platelets in 1 ml of plasma.

Таким образом, в заявляемом способе получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины, проходит изоляция тромбоцитов от форменных элементов крови, их концентрация посредством центрифугирования и последующий многократный температурный лизис. Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов применяется для создания основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины, посредством добавления в тромбоцитарный лизат клеточного материала, представленного суспензией клеток для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины.Thus, in the claimed method for producing an autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine, platelets are isolated from blood cells, their concentration by centrifugation and subsequent multiple temperature lysis. The method of obtaining an autologous platelet lysate is used to create a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine by adding to the platelet lysate cellular material represented by a cell suspension for cellular biomedical preparations of veterinary medicine.

Заявляемый способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины позволяет получить лизат тромбоцитов который используется для разведения клеточного препарата, тем самым улучшая его качество, стимулируя активацию регенаративных свойств клеток, максимально сохраняя жизнеспособность клеточной составляющей, причем, полученный лизат тромбоцитов предназначен для добавления в клеточный препарат непосредственно перед его использованием.The inventive method for producing autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine makes it possible to obtain platelet lysate which is used to dilute the cell preparation, thereby improving its quality, stimulating the activation of the regenerative properties of cells, maximally preserving the viability of the cellular component, and the obtained platelet lysate is intended to be added to the cell preparation immediately before its use.

ЛитератураLiterature

1. Avanzini MA, Bernardo ME, Cometa AM, Perotti C, Zaffaroni N, Novara F, et al. Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrow-derived progenitors. Haematologica. 2009; 94(12):1649-60. doi: 10.3324/haematol.2009.006171.1. Avanzini MA, Bernardo ME, Cometa AM, Perotti C, Zaffaroni N, Novara F, et al. Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrow-derived progenitors. Haematologica. 2009; 94 (12): 1649-60. doi: 10.3324 / haematol.2009.006171.

2. Bartmann C, Rohde E, Schallmoser K, Purstner P, Lanzer G, Linkesch W, et al. Two steps to functional mesenchymal stromal cells for clinical application. Transfusion. 2007; 47(8):1426-35. doi: 10.1111/j.l537-2995.2007.01219.x.2. Bartmann C, Rohde E, Schallmoser K, Purstner P, Lanzer G, Linkesch W, et al. Two steps to functional mesenchymal stromal cells for clinical application. Transfusion. 2007; 47 (8): 1426-35. doi: 10.1111 / j.l537-2995.2007.01219.x.

3. Bieback K, Hecker A, Kocaomer A, Lannert H, Schallmoser K, Strunk D, et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 2009; 27(9):2331-41. doi: 10.1002/stem.139.3. Bieback K, Hecker A, Kocaomer A, Lannert H, Schallmoser K, Strunk D, et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 2009; 27 (9): 2331-41. doi: 10.1002 / stem.139.

4. Blande IS, Bassaneze V, Lavini-Ramos C, Fae KC, Kalil J, Miyakawa AA, et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 2009; 49(12):2680-5. doi: 10.1111/j.1537-2995.2009.02346.x.4. Blande IS, Bassaneze V, Lavini-Ramos C, Fae KC, Kalil J, Miyakawa AA, et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 2009; 49 (12): 2680-5. doi: 10.1111 / j.1537-2995.2009.02346.x.

5. Castegnaro S, Chieregato K, Maddalena M, Albiero E, Visco C, Madeo D, et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Curr Stem Cell Res Ther. 2011;6(2): 105-14. doi: 10.2174/157488811795495440.5. Castegnaro S, Chieregato K, Maddalena M, Albiero E, Visco C, Madeo D, et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Curr Stem Cell Res Ther. 2011; 6 (2): 105-14. doi: 10.2174 / 157488811795495440.

6. Cholewa D, Stiehl T, Schellenberg A, Bokermann G, Joussen S, Koch C, et al. Expansion of adipose mesenchymal stromal cells is affected by human platelet lysate and plating density. Cell Transplant. 2011; 20(9):1409-22. doi: 10.3727/096368910X557218.6. Cholewa D, Stiehl T, Schellenberg A, Bokermann G, Joussen S, Koch C, et al. Expansion of adipose mesenchymal stromal cells is affected by human platelet lysate and plating density. Cell Transplant. 2011; 20 (9): 1409-22. doi: 10.3727 / 096368910X557218.

7. Chou M.L., Burnouf T. Current methods to manufacture human platelet lysates (HPLs) for cell therapy and tissue engineering; possible trends in product safety and standardisation. Vox Sanguinis, 2016; 12, 168-175. doi: 10,1111/voxs.123167. Chou M.L., Burnouf T. Current methods to manufacture human platelet lysates (HPLs) for cell therapy and tissue engineering; possible trends in product safety and standardization. Vox Sanguinis, 2016; 12, 168-175. doi: 10.1111 / voxs.12316

8. Doucet C, Ernou I, Zhang Y, Llense JR, Begot L, Holy X, et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005; 205(2):228-36. doi: 10.1002/jcp.20391.8. Doucet C, Ernou I, Zhang Y, Llense JR, Begot L, Holy X, et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005; 205 (2): 228-36. doi: 10.1002 / jcp.20391.

9. Fekete N, Gadelorge M, Furst D, Maurer C, Dausend J, Fleury-Cappellesso S, et al. Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells: production process, content and identification of active components. Cytotherapy. 2012; 14(5):540-54. doi: 10.3109/14653249.2012.655420.9. Fekete N, Gadelorge M, Furst D, Maurer C, Dausend J, Fleury-Cappellesso S, et al. Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells: production process, content and identification of active components. Cytotherapy. 2012; 14 (5): 540-54. doi: 10.3109 / 14653249.2012.655420.

10. Fekete N, Rojewski MT, Furst D, Kreja L, Ignatius A, Dausend J, et al. GMP-compliant isolation and large-scale expansion of bone marrow-derived MSC. PLoS One. 2012; 7(8):e43255. doi: 10.1371/journal.pone.0043255.10. Fekete N, Rojewski MT, Furst D, Kreja L, Ignatius A, Dausend J, et al. GMP-compliant isolation and large-scale expansion of bone marrow-derived MSC. PLoS One. 2012; 7 (8): e43255. doi: 10.1371 / journal.pone.0043255.

11. Muller I, Kordowich S, Holzwarth C, Spano C, Isensee G, Staiber A, et al. Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM. Cytotherapy. 2006; 8(5):437-44. doi: 10.1080/14653240600920782.11. Muller I, Kordowich S, Holzwarth C, Spano C, Isensee G, Staiber A, et al. Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM. Cytotherapy. 2006; 8 (5): 437-44. doi: 10.1080 / 14653240600920782.

12. Naaijkens BA, Niessen HW, Prins HJ, Krijnen PA, Kokhuis TJ, de Jong N, et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 2012; 348(1):119-30. doi: 10.1007/s00441-012-1360-5.12. Naaijkens BA, Niessen HW, Prins HJ, Krijnen PA, Kokhuis TJ, de Jong N, et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 2012; 348 (1): 119-30. doi: 10.1007 / s00441-012-1360-5.

13. Reinisch A, Bartmann C, Rohde E, Schallmoser K, Bjelic-Radisic V, Lanzer G, et al. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2007; 2(4):371-82. doi: 10.2217/17460751.2.4.371.13. Reinisch A, Bartmann C, Rohde E, Schallmoser K, Bjelic-Radisic V, Lanzer G, et al. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2007; 2 (4): 371-82. doi: 10.2217 / 17460751.2.4.371.

14. Schallmoser K, Strunk D. Preparation of pooled human platelet lysate (pHPL) as an efficient supplement for animal serum-free human stem cell cultures. J Vis Exp. 2009; 32. doi:10.3791/152314. Schallmoser K, Strunk D. Preparation of pooled human platelet lysate (pHPL) as an efficient supplement for animal serum-free human stem cell cultures. J Vis Exp. 2009; 32. doi: 10.3791 / 1523

Claims

A method of obtaining an autologous platelet lysate as a basis for cellular biomedical preparations of veterinary medicine, in which the autologous venous blood of a patient in the presence of an anticoagulant with heparin or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is centrifuged for 10 min at 1800 rpm, after which, under sterile conditions, the laminar flow is sampled from the test tube the upper fraction of platelet-rich blood plasma; for isolation and concentration of platelets, the resulting fraction is subjected to repeated centrifugation for 15 minutes at 3600 rpm; the platelet sediment is diluted in 1 ml of autologous blood plasma and the platelet concentration is determined; the obtained platelet concentrate is subjected to temperature lysis, through 3-5 cycles of quick freezing to -80 ° C and defrosting to + 37 ° C, at a temperature of -80 ° C the samples are kept for 24-48 hours, at a temperature of + 37 ° C, the samples are kept for 30- 60 min, the last cycle of thermal lysis is completed by freezing the sample and storing at -80 ° C.