RU2731712C2 - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА - Google Patents
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2731712C2 RU2731712C2 RU2018143481A RU2018143481A RU2731712C2 RU 2731712 C2 RU2731712 C2 RU 2731712C2 RU 2018143481 A RU2018143481 A RU 2018143481A RU 2018143481 A RU2018143481 A RU 2018143481A RU 2731712 C2 RU2731712 C2 RU 2731712C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydroxyprogesterone
- acetoxyprogesterone
- transformation
- extraction
- medium
- Prior art date
Links
- IWRPVTXREVYBHT-ZQEATNLPSA-N [(8s,9s,10r,11r,13s,14s,17s)-17-acetyl-10,13-dimethyl-3-oxo-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-11-yl] acetate Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@H](OC(=O)C)C[C@]4(C)[C@@H](C(C)=O)CC[C@H]4[C@@H]3CCC2=C1 IWRPVTXREVYBHT-ZQEATNLPSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 title description 2
- BFZHCUBIASXHPK-QJSKAATBSA-N 11alpha-hydroxyprogesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)C[C@H]2O BFZHCUBIASXHPK-QJSKAATBSA-N 0.000 claims abstract description 66
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 28
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims abstract description 26
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002803 maceration Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 10
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 3
- DBPWSSGDRRHUNT-CEGNMAFCSA-N 17α-hydroxyprogesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2 DBPWSSGDRRHUNT-CEGNMAFCSA-N 0.000 abstract 1
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 abstract 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 43
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 31
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 31
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 21
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 15
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- KDHBHXVDYRGRDL-KDZLLLCRSA-N 6beta,11alpha-Dihydroxyprogesterone Chemical compound C1([C@H](O)C2)=CC(=O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)C)[C@@]2(C)C[C@H]1O KDHBHXVDYRGRDL-KDZLLLCRSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 8
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 8
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 6
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- WKAVAGKRWFGIEA-DADBAOPHSA-N 11-Ketoprogesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2=O WKAVAGKRWFGIEA-DADBAOPHSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 4
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-BJUDXGSMSA-N carbon-11 Chemical compound [11C] OKTJSMMVPCPJKN-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- -1 steroid esters Chemical class 0.000 description 3
- WKAVAGKRWFGIEA-UHFFFAOYSA-N 11-Ketoprogesterone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)C1(C)CC2=O WKAVAGKRWFGIEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZESRJSPZRDMNHY-YFWFAHHUSA-N 11-deoxycorticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 ZESRJSPZRDMNHY-YFWFAHHUSA-N 0.000 description 2
- BFZHCUBIASXHPK-UHFFFAOYSA-N 11beta-hydroxy-progesterone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)C1(C)CC2O BFZHCUBIASXHPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFZHCUBIASXHPK-ATWVFEABSA-N 11beta-hydroxyprogesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)C[C@@H]2O BFZHCUBIASXHPK-ATWVFEABSA-N 0.000 description 2
- QZLYKIGBANMMBK-UGCZWRCOSA-N 5α-Androstane Chemical compound C([C@@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CCC[C@@]2(C)CC1 QZLYKIGBANMMBK-UGCZWRCOSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101000745728 Mesocricetus auratus Lithocholate 6-beta-hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- APQHKWPGGHMYKJ-UHFFFAOYSA-N Tributyltin oxide Chemical compound CCCC[Sn](CCCC)(CCCC)O[Sn](CCCC)(CCCC)CCCC APQHKWPGGHMYKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- ZESRJSPZRDMNHY-UHFFFAOYSA-N de-oxy corticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 ZESRJSPZRDMNHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;propan-2-one Chemical compound ClCCl.CC(C)=O FDSGHYHRLSWSLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 150000003145 progesterone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003797 solvolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 2
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- IWRPVTXREVYBHT-UHFFFAOYSA-N (17-acetyl-10,13-dimethyl-3-oxo-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-11-yl) acetate Chemical compound O=C1CCC2(C)C3C(OC(=O)C)CC4(C)C(C(C)=O)CCC4C3CCC2=C1 IWRPVTXREVYBHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUHUCHOQIDJXAT-OLVMNOGESA-N 3-hydroxy-(3-α,5-α)-Pregnane-11,20-dione Chemical compound C([C@@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)C)[C@@]2(C)CC1=O DUHUCHOQIDJXAT-OLVMNOGESA-N 0.000 description 1
- PWCLWZOSAFOXFL-CXICGXRGSA-N 6beta-hydroxyprogesterone Chemical compound C1([C@H](O)C2)=CC(=O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)C)[C@@]2(C)CC1 PWCLWZOSAFOXFL-CXICGXRGSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000131314 Aspergillus candidus Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000228168 Penicillium sp. Species 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010039792 Seborrhoea Diseases 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 241000497320 Trichoderma glaucum Species 0.000 description 1
- 150000004075 acetic anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003668 acetyloxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)O[*] 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003305 alfaxalone Drugs 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 150000001886 cortisols Chemical class 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008686 ergosterol biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 239000003687 estradiol congener Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003152 gestagenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000003295 industrial effluent Substances 0.000 description 1
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 150000003128 pregnanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000757 progestagenic effect Effects 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-UHFFFAOYSA-N progesterone acetate Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)C1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003146 progesterones Chemical class 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 208000008742 seborrheic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000002884 skin cream Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 1
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения 11α-ацетоксипрогестерона. Способ включает трансформацию 11α-гидроксипрогестерона штаммом мицелиального гриба Aspergillus nidulans, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером F-1069. При этом для трансформации споровую суспензию гриба высевают в качалочные колбы с ростовой средой, выращивают до достижения количества биомассы ~1 г/100 мл по весу сухого мицелия при перемешивании. Затем в ростовую среду вносят раствор 11α-гидроксипрогестерона в диметилсульфоксиде или диметилформамиде до достижения их концентрации в среде от 2 до 6% (об.) и до концентрации субстрата в диапазоне 0,1-1,0 г/л, инкубируют на качалке при температуре 37±0,5°С в течение 4±0.5 суток в условиях ограниченной аэрации со скоростью 90-100 об/мин в течение 216 ч или в условиях интенсивной аэрации со скоростью 240-250 об/мин в течение не менее 168 ч. По окончании инкубации продукты извлекают экстракцией и очищают с получением целевого продукта 11α-ацетоксипрогестерона. Изобретение обеспечивает селективность образования целевого продукта не менее 80%. 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и касается нового способа применения известного штамма мицелиального гриба Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 для ацетилирования стероидных гидроксил-содержащих соединений, в частности, соединений ряда прегнана (производных прогестерона) и может быть использовано в промышленной биотехнологии, а также в фармацевтической промышленности для производства стероидных медицинских препаратов.
Уровень техники
Мицелиальный гриб Aspergillus nidulans является одной из наиболее известных эукариотических генетических систем и широко используется в качестве модельной системы для расшифровки биологии клеточного цикла, патогенности, лекарственной устойчивости, болезней человека, первичного и вторичного метаболизма других микроорганизмов. Несмотря на это, штаммы гриба A. nidulans как стероид-трансформирующие микроорганизмы мало изучены. Имеются сообщения, что этот вид обладает 11α-монооксигеназной активностью и способен трансформировать прогестерон с образованием преимущественно 11α-гидрокси-производного. Так, M.J. Henry и H.D. Sisler [M.J. Henry, and H.D. Sisler. Effects of sterol biosynthesis-inhibiting (SBI) fungicides on cytochrome P-450 oxygenations in fungi. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1984, Vol. 22(3), 262-275], изучая влияние фунгицидов, ингибирующих биосинтез эргостерина в грибах, на цитохром-Р450-зависимое гидроксилирование прогестерона, сообщили, что гриб A. nidulans (Eidam) Winter (штамм 003) гидроксилирует прогестерон при начальной концентрации 100 мкг/мл с образованием смеси, содержащей 11α-гидроксипрогестерон (50%), 6β-гидроксипрогестерон (5%), 6β,11α-дигидроксипрогестерон (14%) и неконвертированный прогестерон (31%).
Также известно, что культура гриба A. nidulans (из коллекции Центра культур лаборатории микробиологической химии, National Research Centre, Каир, местная среда обитания), обладая стероид-11α-гидроксилирующей активностью, может трансформировать прогестерон не только в 11α-гидроксипрогестерон, но и в 21-гидроксипрогестерон (он же 11-дезоксикортикостерон) [А.Н. El-Refai, and K.М. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338; A.H. El-Refai, and K.M. Ghanem. Microbial response to steroids. Egyptian Journal of Microbiology, 1989, Vol. 23(1), 1-11]. Авторы вносили прогестерон в ростовую среду в растворе 96% этанола с финальной концентрацией растворителя 1%. Трансформацию прогестерона проводили с нагрузкой 1 г/л при температуре 30±2°С на качалке (200 об/мин, амплитуда 7 см) в течение 48 ч. При этом авторы наблюдали образование дигидроксилированного производного - 6β,11α-дигидроксипрогестерона. Был сделан вывод, что при значениях рН среды, близких к нейтральным, 6β-гидроксилирование является вторичным процессом и 6β,11α-дигидроксипрогестерон образуется из первично образованного 11α-гидроксипрогестерона [А.Н. El-Refai, and K.М. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338].
Известно, что микроорганизмы способны ацетилировать стероидные вторичные и первичные спирты. Так, известна способность некоторых видов дрожжей и дрожжеподобных организмов (Saccharomyces fragilis, S. lactis, Candida pseudotropicalis и Torulopsis sphaerica) ацетилировать вторичную 17β-гидроксильную группу тестостерона [A. 
, М. Tadra, and J. 
. Microbial transformations of steroids XXIV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. 1964, Vol. 9(6), 380-382]. При этом авторы отметили, что ацетилирование происходит только с 17β-гидроксипроизводным, тогда как соответствующий 17α-эпимер остается нетронутым. В этих условиях не происходит ацетилирования молекулы стероида с гидроксигруппой в положениях 11α, 11β, 20β и 21. Известен способ ферментативного ацетилирования стероидных 3-олов [US 3597320, 1971], в котором описана способность микромицетов родов Penicillium sp. АТСС 16501, Spicaria sp. АТСС 20152 и Spicaria sp. АТСС 20153 проводить ацетилирование вторичной гидроксильной группы при атоме С3, не затрагивая при этом вторичную 11β-гидроксильную группу. Также описана способность штамма Trichoderma glaucum ацетилировать первичную гидроксильную группу при атоме С21 в молекуле 9α-фтор-11β,21-дигидрокси-16α,17α-изопропилидендиокси-прегн-4-ен-3,20-диона и ряда других производных гидрокортизона и преднизолона [С.Е. Holmlund, L.I. Feldman, N.E. Rigler, B.E. Nielsen, and R.H. Evans Jr. Microbial esterification of steroids. J. Am. Chem. Soc., 1961, Vol. 83(11), 2586-2587]. Однако информация о способности мицелиальных грибов рода Aspergillus ацетилировать стероидные спирты в литературных источниках отсутствует.
Из уровня техники известно, что ацетилирование вторичных спиртов стероидной структуры, в частности, 11-гидроксилированных стероидов, возможно только химически с применением в качестве ацетилирующего агента ангидридов уксусной кислоты (ангидрида или хлорангидрида). Например, ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона осуществляют химически, используя в качестве ацетилирующего агента уксусный ангидрид [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936].
Таким образом, из уровня техники следует, что получение 11α-ацетоксипрогестерона трансформацией 11α-гидроксипрогестерона культурами мицелиальных грибов вообще, в частности, рода Aspergillus, конкретно Aspergillus nidulans, ранее не проводилось.
11α-Ацетоксипрогестерон (11α-гидроксипрегн-4-ен-3,20-диона ацетат, CAS №2268-98-6) является физиологически активным производным прогестерона (прегн-4-ен-3,20-диона, CAS №57-83-0) - нативного стероидного гормона, синтезируемого желтым телом яичника, корковым веществом (корой) надпочечников, семенными пузырьками и плацентой. Препараты на основе прогестерона и его производных применяются в качестве лекарственных средств в медицине и ветеринарии.
11α-Ацетоксипрогестерон, как и 11α-гидроксипрогестерон, являясь производным прогестерона, обладающий гестагенной активностью, может быть использован как средство, снижающее риск преждевременных родов, а также в качестве активного ингредиента в комбинации с природными или синтетическими эстрогенами как в препаратах для пероральной контрацепции, так и в препаратах для гормональной заместительной терапии женщин в постклимактерический период.
Кроме того, ацетат 11α-гидроксипрогестерона может быть использован не только в качестве прогестагенного средства, как указано выше, но и в качестве антиандрогенного агента для снижения сальных выделений у пациентов, страдающих себореей, аллопецией, вульгарными угрями и другими заболеваниями кожи, связанными с гиперандрогенизацией. Так, известны косметические композиции для ухода за волосами и кожей головы, содержащие 11α-ацетоксипрогестерон в количестве 1,4-1,8% вес. [DE 2757024, 1979]. При этом отмечено, что у этого соединения при местном применении гормональные побочные эффекты отсутствуют. Косметические композиции могут быть составлены как лосьоны для волос или масла, кремы для кожи, масла или эмульсии для нанесения на кожу, шампуни, аэрозольные аэрозоли и т.п.
11α-Ацетоксипрогестерон может быть использован как исходный продукт в синтезе других лекарственных средств для медицинского применения. При необходимости он может быть гидролизован любым удобным способом, известным из уровня техники, с образованием 11α-гидроксипрогестерона. Так, например, известен химический метод получения 11α-гидроксипрогестерона сольволизом 11α-ацетоксипрогестерона действием бис(трибутилолово)оксида [M.G. Perez, and M.S. Maier. Mild deprotection of steroid esters by bis(tributyltin)oxide. Tetrahedron Letters, 1995, Vol. 36(19), 3311-3314] или традиционным способом химического сольволиза в условиях основного катализа: в среде метанола в присутствии КОН [Т. Kubota, and F. Hayashi. Studies on A-norsteroids - VI. Directing effects of С11 substituents on the addition of osmium tetroxide to steroidal Δ1,4-3-ketones. Tetrahedron, 1967. Vol. 23, 995-1006]. Образованный 11α-гидроксипрогестерон может быть использован, например, в синтезе 11-кетопрогестерона (кетогестина, CAS №516-15-4), который далее превращают в кортизон или 11β-гидроксипрогестерон - предшественник нативного гидрокортизона - методами, известными из уровня техники. Химический метод перехода от 11α-гидроксипрогестерона к 11-кетопрогестерону с выходом более 90% и далее в 11β-гидроксипрогестерон описан в патенте [US 2015376225, 2015, примеры 1 и 7 соответственно]. Кроме того, 11α-гидроксипрогестерон может быть использован в качестве исходного соединения в синтезе перспективных аналогов нейростероидного анестетика альфаксолона [P.Y. Savechenkov, D.C. Chiara, R. Desai, A.T. Stern, X. Zhou, A.M. Ziemba, A.L. Szabo, Y. Zhang, J.B. Cohen, S.A. Forman, K.W. Miller, K.S. Bruzik. Synthesis and pharmacological evaluation of neurosteroid photoaffinity ligands. European Journal of Medicinal Chemistry, 2017, Vol. 136, 334-347].
Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона является химический метод [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936], который заключается в получении 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона (20 мг) действием уксусного ангидрида (0,6 мл) в среде пиридина (0,6 мл). Смесь выдерживали в течение 16 ч при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную массу разбавляли 25 мл воды, выдерживали в течение 1 ч, охлаждали для начала кристаллизации. Кристаллы отделяли фильтрацией, промывали водой и сушили. Получали 16,1 мг 11α-ацетоксипрогестерона с т. пл. 176-177°С. Таким образом, молярный выход 11α-ацетоксипрогестерона, полученного авторами высаживанием его кристаллов из реакционной массы ~20-кратным количеством воды, составлял 71,4%.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением является разработка экологически более чистого микробиологического способа получения 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона с применением мицелиального гриба при обеспечении выхода целевого продукта не менее чем 80%.
Техническим результатом заявляемого изобретения является биокаталитическая этерификация стероидного спирта без применения химических ацетилирующих реагентов и органических оснований, применяемых традиционно в качестве катализаторов и растворителей, с практически полной конверсией исходного субстрата и селективностью образования целевого продукта не менее 85%. Экологическая значимость способа заключается в исключении указанных выше реагентов и органических растворителей, применение которых требует разработки дополнительных энергоемких методов регенерации растворителей, очистки промышленных стоков, очистки целевого продукта. Следует отметить, что модификация стероидных соединений с помощью микроорганизмов относится к области белой биотехнологии, так как позволяет не только уменьшить загрязнение окружающей среды, сберечь сырьевые и энергетические ресурсы, но и снизить стоимость конечного продукта. Это соответствует современным тенденциям в изучении биотехнологических процессов, включающим поиск новых биокатализаторов, способных выполнять реакции, наиболее важные для стероидной промышленности, с высокой степенью селективности (в том числе поиск биотехнологических методов, альтернативных химическим).
Также техническим результатом является расширение ассортимента методов ацетилирования вторичной гидроксильной группы при атоме С11 молекулы прогестерона, благодаря наличию способности штамма A. nidulans ВКПМ F-1069 по настоящему изобретению ацетилировать вторичную гидроксильную группу при атоме С11 молекулы прогестерона, как альтернативы химическому методу ацетилирования.
Поставленная техническая задача решается способом получения 11α-ацетоксипрогестерона ацетилированием 11α-гидроксипрогестерона путем микробиологической трансформации с использованием штамма дикого типа A. nidulans ВКПМ F-1069 в условиях интенсивной аэрации или в условиях ограниченной аэрации.
Использованный штамм A. nidulans депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером F-1069 (synonym FGSC A4; АТСС 3863, 12996, 26451; CBS 112.46; NRRL 194), ранее для биотрасформации стероидных соединений не применялся, его ацетилирующая способность обнаружена впервые. Этот штамм впервые применен для биотрасформации 11α-гидроксипрогестерона в 11α-ацетоксипрогестерон.
Сущность заявленного изобретения, касающегося получения 11α-ацетоксипрогестерона биотрансформацией 11α-гидроксипрогестерона, заключается в том, что с целью повышения выхода и экологичности процесса этерификацию проводят в водной среде с применением штамма мицелиального гриба дикого типа A. nidulans ВКПМ F-1069 в условиях интенсивной аэрации или в условиях ограниченной аэрации до практически полной конверсии 11α-гидроксипрогестерона.
Преимущества заявляемого способа получения 11α-ацетоксипрогестерона биотрансформацией 11α-гидроксипрогестерона перед известным из уровня техники химическим методом ацетилирования вторичной 11α-гидроксильной группы состоят в следующем:
- биотехнологическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона является экологически более безопасным и экономически более эффективным процессом;
- процесс проводится без использования агрессивных химических ацетилирующих реагентов, таких как уксусный ангидрид, без использования органических оснований, например, пиридина, в качестве растворителя и одновременно катализатора ацетилирования, а также других возможных органических растворителей и катализаторов химической этерификации, известных из уровня техники, например, минеральных и органических кислот;
- биокаталитическая этерификация 11α-гидроксипрогестерона, как альтернатива химическому методу ацетилирования, является экологически более чистым и безопасным методом: в способе-прототипе для проведения реакции этерификации используется 30-кратное количество пиридина и 30-кратное количество уксусного ангидрида по объему к весу исходного соединения, а для высаживания кристаллов продукта реакции применяется 20-кратное количество воды к суммарному объему пиридина и уксусного ангидрида и промывка осадка водой; это требует разработки дополнительных методов регенерации растворителя и очистки промышленных стоков;
- биокаталитическое ацетилирование протекает регионаправленно без образования возможного побочного продукта енолацетилирования Δ4-3-кетогруппы молекулы 11α-гидроксипрогестерона - 3,11α-диацетоксипрегна-3,5-диен-20-она, содержание которого при использовании химического метода ацетилирования может иметь место и достигать 20-30%, что существенно осложняет очистку целевого 11α-ацетоксипрогестерона и приводит к потерям его выхода;
- биокаталитическое ацетилирование протекает с практически полной конверсией исходного субстрата и селективностью образования целевого продукта не ниже 85% в условиях интенсивной аэрации и не ниже 89% в условиях ограниченной аэрации. При этом выход выделенного кристаллического 11α-ацетоксипрогестерона составляет не менее 80% и 85% соответственно.
Для достижения указанного выше технического результата по настоящему изобретению предлагается использовать известный штамм дикого типа Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 в качестве биокатализатора для биотехнологического процесса ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона. Таким образом, сущность заявленного изобретения заключается также в применении известного штамма Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 по новому назначению, а именно для ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.
Культурально-морфологические особенности штамма A. nidulans ВКПМ F1069.
На агаризованной среде образует круглые колонии диаметром 30-35 мм через 7 суток роста. Поверхность ровная, выпуклая, пушистая. Текстура средней плотности. Край колоний плотный, ровный. Цвет колоний в зоне спороношения зеленовато-белый. Обратная сторона палево-коричневая. Эксудат отсутствует. Характеризуется интенсивным спороношением. Цвет спор зеленый.
Основным свойством штамма по настоящему изобретению является наличие ацетилирующей активности и способности этерифицировать 11α-гидроксипрогестерон с образованием 11α-ацетоксипрогестерона с высоким выходом как в условиях интенсивной, так и в условиях ограниченной аэрации.
На фиг. 1 представлена схема получения 11α-ацетоксипрогестерона путем трансформации 11α-гидроксипрогестерона известным штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.
Трансформация 11α-гидроксипрогестерона протекает с образованием и 6β,11α-дигидроксипрогестерона в качестве побочного продукта. Процессы ацетилирования гидроксильной группы 11α-гидроксипрогестерона и его 6β-гидроксилирования являются конкурентными процессами трансформации, причем процесс биокаталитической этерификации имеет преимущества, так как не требует интенсивной аэрации. Этот вывод подтвержден экспериментально. При продолжительности трансформации 48 ч в условиях ограниченной аэрации в культуральной среде определено наличие только 11α-ацетоксипрогестерона и нетрансформированного исходного субстрата.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена схема трансформации 11α-гидроксипрогестерона штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.
На фиг. 2 представлены хроматограммы и результат масс-спектрометрического анализа 11α-ацетоксипрогестерона.
На фиг. 3-9 представлены 1Н ЯМР-, 13С ЯМР-, DEPT-ЯМР-, HSQC-ЯМР- и НМВС-ЯМР- спектры 11α-ацетоксипрогестерона.
Осуществление изобретения
Штамм дикого типа Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 (synonym FGSC A4; АТСС 3863, 12996, 26451; CBS 112.46; NRRL 194) был получен из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ).
11α-Гидроксипрогестерон (II) (CAS №80-75-1, С21Н30О3) и 11α-ацетоксипрогестерон (С23Н32О4, M.w. 372.5 являются коммерчески доступными и могут быть приобретены, например, у компании Steraloids Inc. (USA) или у других производителей.
Неорганические соли были приобретены у компании Fluka (Germany). Дрожжевой экстракт и агар - у Difco Becton Dickinson and company (Sparks, USA).
Другие реагенты и растворители являются коммерчески доступными, были приобретены у российских производителей.
Для приготовления сред для культивирования и трансформации, водных растворов кислот, солей и щелочей использовали дистиллированную воду. Для промывки экстрактов в органических растворителях использовали питьевую водопроводную воду, если не оговорено особо.
Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре, то есть в диапазоне от 20 до 25°С. Для процессов, требующих более низкие температуры, чем комнатная, охлаждение обеспечивали холодной водопроводной водой (в диапазоне от 10 до 20°С) или смесью колотого льда и холодной воды (в диапазоне от 5 до 10°С).
Биотрансформацию осуществляли на качалке New Brunswick™ Innova® 44/44R в термостатированном помещении при температуре 37°С в режиме перемешивания 240-250 об/мин. для обеспечения условия интенсивной аэрации или в режиме перемешивания 60-100 об/мин. для обеспечения условия ограниченной аэрации.
Упаривание растворителей в вакууме осуществляли с использованием ротационного вакуумного испарителя Rotavapor (
Labortechnik AG) при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см2 (35±5 кПа) и температуре воды в бане в диапазоне от 35-50°С в зависимости от природы упариваемого растворителя.
Высушивание кристаллов продукта до постоянного веса осуществляли при температуре 35-45°С при атмосферном давлении или с использованием вакуум-сушильного шкафа при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см2 (35±5 кПа).
Для определения рН промывных вод использовали универсальную индикаторную бумагу с диапазоном значений от 0 до 12 (Лахема, Чехия).
Очистку продукта осуществляли фильтрацией через слой силикагеля на воронке Шотта №1, используя силикагель марки Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) (Merck, Germany).
Контроль за ходом элюирования осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластины Silica gel 60 F254 (Merck, Germany) и хроматографические системы растворителей: дихлорметан-ацетон 9:1 (v/v) и дихлорметан-ацетон 4:1 (v/v). Пластинки просматривали в УФ-свете при длине волны 254 нм, затем опрыскивали 1% раствором ванилина в 10% водном растворе HClO4, проявляли при температуре 100-120°С.
Структуру и чистоту продукта подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ Silica gel 60 F254 (Merck, Germany)), масс-спектрометрия, элементный анализ, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
Температуру плавления продукта определяли на приборе для определения точки плавления М-565 ( Labortechnik AG).
1Н- и 13C- ЯМР спектры были определены на спектрометре Bruker Avance-400 (Bruker BioSpin GmbH) с рабочей частотой 400 МГц и 100.6 МГц соответственно, используя дейтерированный хлороформ (99,8% D, Sigma-Aldrich), или дейтерированный диметилсульфоксид (99,9% D, Sigma-Aldrich) в качестве растворителя относительно тетраметилсилана (TMS NMR grade ≥99,9%, Sigma-Aldrich) в качестве внутреннего стандарта, в миллионных долях (м.д.).
Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) регистрировали на приборе Bruker Daltonics micrOTOF-Q II, используя электрораспылительную ионизацию (ESI). Измерения были получены в режиме положительных ионов со следующими параметрами: граничное напряжение капилляра 4500 В; диапазон масс от m/z 50 до 3000; внешняя калибровка (Electricpray Calibrant Solution, Fluka); давление распылителя 0,4 бар; скорость потока 3 мкл/мин; азот применяли в виде сухого газа (6 л/мин); температура интерфейса была установлена при 180°С. Образец вводили в камеру масс-спектрометра из системы HPLC Agilent 1260, снабженной колонкой Agilent Poroshell 120 ЕС-С18 (3.0×50 mm; 2,7 μm) и защитой, используя автосамплер. Образец вводили в растворе 50% ацетонитрила (квалификация LC-MS) в воде (ультрачистая вода MilliQ, Merck Millipore KGaA, Germany), и колонку элюировали смесью ацетонитрила (А) и воды (В) в градиенте концентраций со скоростью потока 400 мкл/мин в следующих параметрах градиента: 0-15% А в течение 6 мин, 15%-85% А в течение 1,5 мин, 85%-0% А в течение 0,1 мин, 0% А в течение 2,4 мин. Время удерживания было следующим: 11α-гидроксипрогестерон - 5,2 мин; 11α-ацетоксипрогестерон - 6,0 мин; 6β,11α дигидроксипрогестерон - 4,2 мин.
Образование 11α-ацетоксипрогестерона в результате трансформации 11α-гидроксипрогестерона культурой A. nidulans ВКПМ F-1069 подтверждено данными спектров 1Н ЯМР, 13С ЯМР, 2DЯMP, хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. На фиг. №№3-9 приведены спектры ЯМР и на фиг. №2 - хроматограмма и масс-спектр полученного 11α-ацетоксипрогестерона.
Для подтверждения образования 11α-ацетоксипрогестерона в процессе трансформации 11α-гидроксипрогестерона 11α-ацетоксипрогестерон был получен химическим синтезом из 11α-гидроксипрогестерона с применением известного из уровня техники метода ацетилирования. Кроме этого, полученный 11α-ацетоксипрогестерон был гидролизован известным из уровня техники методом с образованием исходного 11α-гидроксипрогестерона.
Выходы 11α-ацетоксипрогестерона, полученные биотрансформацией 11α-гидроксипрогестерона штаммом по настоящему изобретению и приведенные в примерах заявляемого изобретения, подтверждают эффективность предлагаемого способа и его пригодность для использования в промышленных процессах. Однако примеры даны лишь для иллюстрации биокаталитической способности заявляемого штамма конвертировать 11α-гидроксипрогестерон в 11α-ацетоксипрогестерон. Следует отметить, что указанная ацетилирующая способность штамма выявлена нами впервые. Выходы могут быть улучшены за счет оптимизации условий проведения биотрансформации с целью минимизации образования 6β,11α-дигидроксипрогестерона и сдвига направления модификации 11α-гидроксипрогестерона в сторону ацетилирования. Известно, что состав продуктов зависит от состава среды, рН среды, возраста культуры, от индукции исходным субстратом или продуктом [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338]. Поэтому для снижения активности энзима 6β-гидроксилазы и уменьшения количества образованного побочного 6β,11α-дигидроксипрогестерона необходимо оптимизировать параметры проведения процесса трансформации, например, значение рН среды, возраст культуры, способ внесения субстрата, состав среды для трансформации, температурный режим и другие, известные из уровня техники. Для примера в таблице 1 приведено влияние режима аэрации на конверсию 11α-гидроксипрогестерона заявляемым штаммом и на селективность образования 11α-ацетоксипрогестерона и 6β,11α-дигидроксипрогестерона, при прочих одинаковых условиях.
Для трансформации мы использовали среду СМ следующего состава, г/л: глюкоза - 40; MgSO4×7H2O - 1; КН2РО4 - 0,74; пептон - 1; дрожжевой экстракт - 1; L-аспарагин - 0,7. Среда СМ была ранее использована А. 
et al [А. , М. Tadra, J. 
. Microbial transformations of steroids XXIV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. 1964, Vol. 9(6), 380-382] для ацетилирования тестостерона дрожжами и описана в статье А.Н. El-Refai и K.M. Ghanem [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338] (среда II, pH 6,5), как наиболее благоприятная для конверсии прогестерона в 11α-гидрокси-производное культурой A. nidulans. Исходный субстрат вносили в среду для трансформации в виде раствора в биполярном апротонном растворителе, в качестве которого могут быть использованы диметилсульфоксид или диметилформамид. При этом концентрация растворителя в ферментационной среде может составлять 2-6% по объему. Трансформацию проводили при температуре 37°С, так как ранее нами было установлено, что повышение температуры трансформации прогестерона мицелиальным грибом Aspergillus niger с 28°С до 37°С на среде СМ при прочих равных условиях проведения процесса приводит к существенному подавлению 6β-гидроксилазной активности штамма [О.С. Савинова, П.Н. Сольев, Д.В. Васина, Т.В. Тяжелова, Т.В. Федорова, Т.С. Савинова. Биотрансформация прогестерона аскомицетом Aspergillus niger N402. Биохимия (Москва). 2018. Том 83(1), с. 71-77].
Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Общий метод биотрансформации 11α-гидроксипрогестерона
Биотрансформация
Для получения посевного материала (споровой суспензии) штаммы выращивали при температуре 37°С в течение 7-10 суток на агаризованной среде МПА (мальт-экстракт - 3 г/л, пептон - 1 г/л, агар - 20 г/л). Споровую суспензию высевали в качалочные колбы вместимостью 750 мл, содержащие по 100 мл ростовой среды (из расчета ~1×107 спор на 100 мл среды), и выращивали на качалке (240-250 об/мин) при температуре 37°С в течение 4±0,5 суток до достижения количества биомассы ~1 г/100 мл (по весу сухого мицелия). Затем в ростовую среду вносили 11α-гидроксипрогестерон в виде раствора в диметилсульфоксиде до финальной концентрации 0.5 г/л, при этом концентрация растворителя составляла 2% (об.). Трансформацию проводили при температуре 37°С в условиях интенсивной или ограниченной аэрации в течение 48 ч или 216 ч, параллельно культивируя штамм без 11α-гидроксипрогестерона в качестве контроля. Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях.
Экстракция продуктов трансформации
Для извлечения продуктов трансформации 11α-гидроксипрогестерона использовали или метод экстракции с предварительным применением дезинтегратора-гомогенизатора для разрушения клеток микроорганизма, или метод двухэтапной экстракции - экстракции из предварительно отделенной культуральной жидкости и экстракции из мицелия мацерацией - с последующим объединением экстрактов.
Вариант 1.
По окончании инкубации ферментационную суспензию помещали в дезинтегратор-гомогенизатор типа Поттера-Эльвегейма порциями по 30-40 мл. Гомогенизацию проводили при комнатной температуре в течение 4-5 минут до полного разрушения клеток микроорганизма. Объединенный гомогенат экстрагировали дихлорметаном трижды порциями равного объема. Объединенные экстракты гомогената промывали водой, сушили Na2SO4, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Содержание продуктов в остатке после упаривания оценивали с помощью количественной ТСХ. Для разрушения клеток микроорганизма может быть использован любой дезинтегратор-гомогенизатор, известный из уровня техники, пригодный для разрушения клеток мицелиальных грибов (ультразвуковой, механический и др.).
Вариант 2.
По окончании инкубации мицелий отфильтровывали, промывали дихлорметаном на фильтре. Продукты реакции из культуральной жидкости экстрагировали трижды порциями дихлорметана равного объема. Стероиды, адсорбированные на мицелии, извлекали ре-мацерацией (трижды), используя метанол и выдерживая без перемешивания в течение 4 ч. Метанол упаривали, остаток, содержащий воду, экстрагировали дихлорметаном трижды. Объединенные экстракты культуральной жидкости и мицелия промывали водой, сушили Na2SO4, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Содержание продуктов в остатке после упаривания оценивали с помощью количественной ТСХ.
Извлечение 11α-ацетоксипрогестерона
Остаток после упаривания растворяли в 2-5 мл дихлорметана и фильтровали через слой силикагеля, помещенный на фильтровальную воронку Шотта №1, используя 10-кратное количество силикагеля к весу исходного субстрата (соотношение диаметра фильтра воронки к высоте слоя силикагеля 1:1.5-2). В качестве элюэнта использовали дихлорметан, для контроля элюции использовали ТСХ. По окончании элюирования 11α-ацетоксипрогестерона силикагель промывали метанолом для вымывания 6β,11α-дигидроксипрогестерона. Элюаты упаривали досуха. Кристаллизующийся остаток растирали с диэтиловым эфиром, суспензию охлаждали до температуры 5-10°С, выдерживали в течение 2 ч, осадок отфильтровывали, сушили до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу. Хроматографическую чистоту 11α-ацетоксипрогестерона подтверждали с помощью ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.
Пример 2. Биокаталитическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона в условиях интенсивной аэрации на качалке (240-250 об/мин)
Вариант 1. Трансформация в течение 48 ч
Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 1 примера 1. Из 50 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, после извлечения получили 51 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 30 мг 11α-гидроксипрогестерона (60% от загруженного), 17 мг (30,16 mol%) 11α-ацетоксипрогестерона и 2,5 мг (4,77 mol %) 6β,11α-дигидроксипрогестерона. По данным ТСХ анализа другие продукты трансформации отсутствуют.
Вариант 2. Трансформация в течение 216 ч
Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 2 примера 1. Из 500 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, получили 575 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 480 мг (85,17 mol %) 11α-ацетоксипрогестерона и 75 мг (14,31 mol %) 6β,11α-дигидроксипрогестерона. По данным ТСХ анализа 11α-гидроксипрогестерон практически отсутствует. Выход кристаллического 11α-ацетоксипрогестерона составил 451 мг (80,02%, считая на загруженный 11α-гидроксипрогестерон).
Пример 3. Биокаталитическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона в условиях ограниченной аэрации на качалке (90-100 об/мин)
Вариант 1. Трансформация в течение 48 ч
Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 1 примера 1. Из 50 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, после извлечения получили 50 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 40 мг 11α-гидроксипрогестерона (80% от загруженного) и 10 мг (17,74 mol %) 11α-ацетоксипрогестерона. По данным ТСХ анализа 6β,11α-дигидроксипрогестерон и другие продукты трансформации отсутствуют.
Вариант 2. Трансформация в течение 216 ч
Для экстракции продуктов трансформации использовали вариант 2 примера 1. Из 500 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, получили 580 мг сухого остатка после упаривания, содержащего по данным анализа 506 мг (89,78 mol %) 11α-ацетоксипрогестерона и 49 мг (9,35 mol %) 6β,11α-дигидроксипрогестерона. По данным ТСХ анализа 11α-гидроксипрогестерон отсутствует. Выход кристаллического 11α-ацетоксипрогестерона составил 480 мг (85,17%, считая на загруженный 11α-гидроксипрогестерон).
ЯМР-спектры полученных образцов 11α-ацетоксипрогестерона идентичны спектрам стандартного образца и спектрам образца, полученного химическим методом ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.
Пример 4. Получение 11α-ацетоксипрогестерона химическим методом
К раствору 34 мг 11α-гидроксипрогестерона в 0,2 мл уксусного ангидрида добавили 1 каплю 60% хлорной кислоты. Реакционную массу выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. По окончании реакции реакционную массу добавляли по каплям в 5 мл воды, содержащей 1 мл 25% раствора аммиака (рН ~7.5). Перемешивали 30 мин., затем реакционную массу экстрагировали дихлорметаном трижды, экстракт промыли водой до нейтральной реакции, упарили досуха. Получили 39 мг остатка, из которого препаративной хроматографией извлекли 27 мг 11α-ацетоксипрогестерона с выходом 70,45%. Т. пл. 173-174°С (лит. Т. пл. 176-177°С [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936].
Характеристика продуктов биотрансформации
11α-Гидроксипрогестерон, полученный гидролизом ацетокси-группы 11α-ацетоксипрогестерона, полученного по примеру 2 в условиях общего метода биотрансформации 11α-гидроксипрогестерона штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.
Т. пл. 164-166°С (лит. Т. пл. 164-165°С [K. Yildirim, and A. Kuru. Biotransformation of some steroids by Aspergillus candidus. Journal of Chemical Research, 2015. Vol. 39(9), 546-549]). M.w. 330.46.
Масс-спектр высокого разрешения C21H30O3 (m/z): рассчитано для [М+Н]+ 331.2268, найдено 331.2264; рассчитано для [M+Na]+ 353.2087, найдено 353.2088. Спектр 1Н-ЯМР идентичен спектру исходного субстрата.
11α-Ацетоксипрогестерон, полученный в условиях биотрансформации 11α-гидроксипрогестерона штаммом A. nidulans ВКПМ F-1069.
Т. пл. 172-174°С (лит. Т. пл. 176-177°С [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74(23), 5933-5936]. M.w. 372.5;
Масс-спектр высокого разрешения C23H32O4 (m/z): рассчитано для [М+Н]+ 373.2373, найдено 373.2361; рассчитано для [M+Na]+ 395.2193, найдено 395.2183.
1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): 5.67 (с, 1H СН-4), 5.14 (дт, 1Н, 3J11, 9=10.6 Гц, 3J11, 10 5.0 Гц, СН-11), 2,62 (дд (псевдо-т), 1H, 3J17, 16α 8.9 Гц, 3J17, 16β 9.1 Гц, СН-17), 2.47-2.35 (м, 2Н, СН-2β & CH-6β), 2.29-2.12 (м, 3Н, СН-6α & СН-12β & СН-2α), 2.10-1.96 (м, 1Н, СН-16β), 2.05 (с, 3Н, СН3-21), 2.01 (с, 3Н, СН3-23), 1.91-1.78 (м, 3Н, СН2-1 & СН-7α), 1.72-1.60 (м, 3Н, СН-16α & СН-15α & СН-8), 1.50 (т, 1Н, 3J12α, 12β 11.6 Гц, СН-12α), 1.44 (т, 1Н, 3J9, 8 10.6 Гц, СН-9), 1.39-1.29 (ддд, 1Н, 3J14, 8 10.7 Гц, 3J14, 15β 6.4 Гц, 3J14, 15α 5.6 Гц, СН-14) 1.29 (уш.с, 4Н, CH3-19 & СН-15β), 1.17-1.00 (2×ддд, 2Н, 3J7α, 7β 12.6 Гц, 3J7, 6α ~ 3J7, 6β 12.2 Гц, 3J7α, 8 3.1 Гц, СН2-7), 0.64 (с, 3Н, СН3-18).
13С-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): 208.61 (с, СО-20), 199.40 (с, СО-3), 170.14 (с, С-5), 170.10 (с, СО-22) 124.48 (с, СН-4), 70.58 (с, СНОН-11), 62.30 (с, СН-17), 55.34 (с, СН-9), 54.39 (с, СН-14), 45.02 (с, CH2-12), 43.54 (с, С-13), 39.75 (с, С-10), 36.79 (с, СН2-1), 34.72 (с, СН-8) 34.19 (с, СН2-2), 33.03 (с, СН2-6), 31.67 (с, СН2-7), 31.37 (с, СН3-21), 24.16 (с, СН2-15), 22.96 (с, СН2-16), 22.02 (с, СН3-23), 18.20 (с, СН3-19), 14.24 (с, СН3-18).
Спектры идентичны спектрам стандартного образца, а также спектрам образца, полученного химическим методом ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.
Claims (6)
1. Способ получения 11α-ацетоксипрогестерона, включающий трансформацию 11α-гидроксипрогестерона штаммом мицелиального гриба Aspergillus nidulans, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером F-1069, при этом для трансформации споровую суспензию гриба высевают в качалочные колбы с ростовой средой, выращивают до достижения количества биомассы ~1 г/100 мл по весу сухого мицелия при перемешивании, затем в ростовую среду вносят раствор 11α-гидроксипрогестерона в диметилсульфоксиде или диметилформамиде до достижения их концентрации в среде от 2 до 6% (об.) и до концентрации субстрата в диапазоне 0,1-1,0 г/л, инкубируют на качалке при температуре 37±0,5°С в течение 4±0.5 суток в условиях ограниченной аэрации со скоростью 90-100 об/мин в течение 216 ч или в условиях интенсивной аэрации со скоростью 240-250 об/мин в течение не менее 168 ч, по окончании инкубации продукты извлекают экстракцией и очищают с получением целевого продукта 11α-ацетоксипрогестерона.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качалочные колбы с ростовой средой высевают споровую суспензию гриба из расчета ~1×107 спор на 100 мл среды.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что перемешивание осуществляют со скоростью 240-250 об/мин.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что экстракцию продуктов трансформации из ферментационной суспензии проводят после предварительного разрушения клеток микроорганизма с помощью дезинтегратора-гомогенизатора.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что экстракцию продуктов трансформации из ферментационной суспензии проводят методом двухэтапной экстракции - экстракции из предварительно отделенной культуральной жидкости и экстракции из мицелия мацерацией - с последующим объединением экстрактов.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что очистку 11α-ацетоксипрогестерона от побочного продукта трансформации - 6β,11α-дигидроксипрогестерона - осуществляют фильтрацией через слой силикагеля в растворе дихлорметана.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143481A RU2731712C2 (ru) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018143481A RU2731712C2 (ru) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018143481A RU2018143481A (ru) | 2020-06-08 |
| RU2018143481A3 RU2018143481A3 (ru) | 2020-06-08 |
| RU2731712C2 true RU2731712C2 (ru) | 2020-09-08 |
Family
ID=71067102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018143481A RU2731712C2 (ru) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2731712C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2213143C2 (ru) * | 1995-12-12 | 2003-09-27 | Акцо Нобель Н.В. | МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ 11-α-ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ СТЕРОИДОВ |
-
2018
- 2018-12-07 RU RU2018143481A patent/RU2731712C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2213143C2 (ru) * | 1995-12-12 | 2003-09-27 | Акцо Нобель Н.В. | МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ 11-α-ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ СТЕРОИДОВ |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PETERSON D.H. ET AL. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. Am. Chem. Soc.1952, 74 (23), pp. 5933-5936. * |
| PETERSON D.H. ET AL. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. Am. Chem. Soc.1952, 74 (23), pp. 5933-5936. RIOS L.OL ET AL. Steroid 11-Alpha-Hydroxylation by the Fungi Aspergillus nidulans and Aspergillus ochraceus. Methods Mol Biol. 2017;1645:271-287. SAVINOVA O. S. ET AL. Biotransformation of Progesterone by the Ascomycete Aspergillus niger N402. Biochemistry (Moscow), 2018, Vol. 83, No. 1, pp. 26-31. * |
| RIOS L.OL ET AL. Steroid 11-Alpha-Hydroxylation by the Fungi Aspergillus nidulans and Aspergillus ochraceus. Methods Mol Biol. 2017;1645:271-287. * |
| SAVINOVA O. S. ETAL. Biotransformation of Progesterone by the Ascomycete Aspergillus niger N402. Biochemistry(Moscow), 2018, Vol. 83, No. 1, pp. 26-31. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2018143481A (ru) | 2020-06-08 |
| RU2018143481A3 (ru) | 2020-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bartmańska et al. | Steroids’ transformations in Penicillium notatum culture | |
| US4416985A (en) | Process for preparing 3β,7β-dihydroxy-Δ5 -steroids | |
| FUKUDA et al. | A method to screen anticholesterol substances produced by microbes and a new cholesterol oxidase produced by Streptomyces violascens | |
| Wu et al. | Efficient hydroxylation of functionalized steroids by Colletotrichum lini ST-1 | |
| US4230625A (en) | Process for chenodeoxycholic acid and intermediates therefore | |
| Faramarzi et al. | Metabolism of androst-4-en-3, 17-dione by the filamentous fungus Neurospora crassa | |
| GB2123833A (en) | Steroid 1,2-dehydrogenation using dried microbial cells | |
| Lacroix et al. | Microbial models of drug metabolism: microbial transformations of trimegestone®(RU27987), a 3-Keto-Δ4, 9 (10)-19-norsteroid drug | |
| RU2731712C2 (ru) | МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА | |
| Faramarzi et al. | Microbial transformation of hydrocortisone by Acremonium strictum PTCC 5282 | |
| US4301246A (en) | Process for chenodeoxycholic acid production | |
| Savinova et al. | Biotransformation of progesterone by the ascomycete Aspergillus niger N402 | |
| Ambrus et al. | Microbial transformation of β-sitosterol and stigmasterol into 26-oxygenated derivatives | |
| US4336332A (en) | Process for the manufacture of hydroxylated steroids | |
| RU2692932C2 (ru) | БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 11α-АЦЕТОКСИПРОГЕСТЕРОНА | |
| US4196203A (en) | Novel corticoids | |
| Abul-Hajj | Stereochemistry of C-1, 2 Dehydrogenation of 5β-Pregnane-3, 11, 20-trione by Septomyxa affinis | |
| Hörhold et al. | Bioconversion of steroids by Cochliobolus lunatus. I. Transformation of Reichstein's compound S with cell‐free preparations of Cochliobolus lunatus | |
| US2863806A (en) | 17alpha hydroxylation of steroids by trichoderma viride | |
| RU2677332C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS NIDULANS И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ 11α-ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ПРОГЕСТЕРОНА И ДЛЯ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ 11α-ГИДРОКСИПРОГЕСТЕРОНА | |
| Maatooq et al. | Microbial transformation of cucurbitacin E 2-O-β-D-glucopyranoside | |
| Hill et al. | Microbial conversion of sterols: 1. Selection of mutants for production of 20-carboxy-pregna-1, 4-dien-3-one (BNC) | |
| EP0922770B1 (en) | A microbiological process for the transformation of 17beta-carboxy substituted 3-oxo-4-azasteroids and the use of such products as inhibitors of the enzyme 5alpha-reductase | |
| Breiter et al. | Microbial hydroxylation of androsta-1, 4-diene-3, 17-dione | |
| Madyastha et al. | Transformation of 16-dehydroprogesterone and 17α-hydroxyprogesterone by Mucor piriformis |