RU2730848C2 - Способы пэгилирования по аминогруппе для получения сайт-специфичных конъюгатов белков - Google Patents
Способы пэгилирования по аминогруппе для получения сайт-специфичных конъюгатов белков Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730848C2 RU2730848C2 RU2017145825A RU2017145825A RU2730848C2 RU 2730848 C2 RU2730848 C2 RU 2730848C2 RU 2017145825 A RU2017145825 A RU 2017145825A RU 2017145825 A RU2017145825 A RU 2017145825A RU 2730848 C2 RU2730848 C2 RU 2730848C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- insulin
- polyethylene glycol
- conjugate
- acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 title description 24
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 title description 7
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 190
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 123
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 117
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 98
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N Glycolaldehyde Chemical compound OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 93
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 50
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 43
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 claims abstract description 36
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims abstract description 25
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 13
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- DRAJWRKLRBNJRQ-UHFFFAOYSA-N Hydroxycarbamic acid Chemical compound ONC(O)=O DRAJWRKLRBNJRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 108010049175 N-substituted Glycines Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 50
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- QHXLIQMGIGEHJP-UHFFFAOYSA-N boron;2-methylpyridine Chemical compound [B].CC1=CC=CC=N1 QHXLIQMGIGEHJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- -1 sodium triacetoxyborohydride Chemical compound 0.000 claims description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 claims description 8
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 claims description 8
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- WNGKJGQIQHPXGZ-UHFFFAOYSA-N 1,4-diamino-4-oxobutane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(N)CCC(N)=O WNGKJGQIQHPXGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- YJROYUJAFGZMJA-UHFFFAOYSA-N boron;morpholine Chemical compound [B].C1COCCN1 YJROYUJAFGZMJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 claims description 5
- PHFFANVCGVJLOM-UHFFFAOYSA-N n-diethylboranylethanamine Chemical compound CCNB(CC)CC PHFFANVCGVJLOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BORTXUKGEOWSPS-UHFFFAOYSA-N n-dimethylboranylmethanamine Chemical compound CNB(C)C BORTXUKGEOWSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JYXGIOKAKDAARW-UHFFFAOYSA-N N-(2-hydroxyethyl)iminodiacetic acid Chemical compound OCCN(CC(O)=O)CC(O)=O JYXGIOKAKDAARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- YPTUAQWMBNZZRN-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoboron Chemical compound [B]N(C)C YPTUAQWMBNZZRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical group [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 claims description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 claims description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 5
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 claims 1
- 125000000532 dioxanyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 19
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 14
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 12
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 11
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 11
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 11
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 11
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 11
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 11
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 11
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 11
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 9
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 6
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 6
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 6
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 3
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 3
- 108700002854 polyethylene glycol(B1)- insulin Proteins 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 3
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 2
- 108010032976 Enfuvirtide Proteins 0.000 description 2
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- VPEPQDBAIMZCGV-UHFFFAOYSA-N boron;5-ethyl-2-methylpyridine Chemical compound [B].CCC1=CC=C(C)N=C1 VPEPQDBAIMZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- PEASPLKKXBYDKL-FXEVSJAOSA-N enfuvirtide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(C)=O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PEASPLKKXBYDKL-FXEVSJAOSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- QQEVAEVDNGPTQA-UHFFFAOYSA-N n-boranyl-2-methylpropan-2-amine Chemical compound BNC(C)(C)C QQEVAEVDNGPTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- OEYNWAWWSZUGDU-UHFFFAOYSA-N 1-methoxypropane-1,2-diol Chemical compound COC(O)C(C)O OEYNWAWWSZUGDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033372 Pain and discomfort Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001638 boron Chemical class 0.000 description 1
- RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N boron;n-methylmethanamine Chemical compound [B].CNC RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 229960002062 enfuvirtide Drugs 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940099052 fuzeon Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940072272 sandostatin Drugs 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/26—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/29—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
- A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу получения конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Способ включает в себя приготовление водного раствора белка, содержащего белок, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, и хелатирующий агент, где указанный белок является инсулином, указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным или цитратным, и указанный хелатирующий агент выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновой кислоты, гидроксиаминокарбоновой кислоты, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF); добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 25:1 до 1,5:1; и взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 3,88 до 4,27, и в результате указанного взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с указанным белком образуется конъюгат ПЭГ и белка, пэгилированного в одном положении. Группа изобретений также относится к способу получения конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль и к способу получения микросфер замедленного высвобождения, содержащих конъюгат белка с полиэтиленгликолем. Группа изобретений обеспечивает получение пэгилированных белков с высоким выходом, а также большую эффективность лечения диабета и других заболеваний. 3 н. и 32 з.п. ф-лы, 16 ил., 19 пр.
Description
Отсылки к родственным заявкам
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 62/170,933, озаглавленной «Способы ПЭГилирования по аминогруппам для получения сайт-специфичных конъюгатов белков» (авторы Mary S. Rosendahl et al.), поданной 4 июня 2015 г., которая родственна предварительной заявке на патент США № 62/086,294, озаглавленной «Белки и белковые конъюгаты с повышенной гидрофобностью» (авторы Mary S. Rosendahl et al.), поданной 2 декабря 2014 г., содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством отсылки во всех отношениях, как если бы они были непосредственно включены в текст настоящего документа.
Уровень техники
Задача попадания лекарственного вещества, гормона, белка или иного медицински активного агента в организм пациента сталкивается с рядом трудностей. Медицински активный агент должен показаться в организме больного. Для этого есть два пути – проглатывание и инъекция. В том случае, когда медицински активный агент проглатывается, он, прежде чем попадет в кровеносное русло или в тот участок организма, который является мишенью лечебного воздействия, должен пройти через пищеварительную систему. Введенный путем инъекции, медицински активный агент может оказаться в кровотоке или в участке-мишени быстро или впрямую, однако инъекции могут причинять пациенту боль и дискомфорт. Коль скоро медицински активный агент оказался в организме, его концентрация изменяется во времени в зависимости от природы данного агента, наличия в нем различных функциональных групп, его инкапсулированности или других факторов. Если концентрация медицински активного агента становится ниже некоторого уровня, его может быть необходимо ввести снова. Многие медицински активные агенты приходится вводить часто, например несколько раз в сутки. Чем чаще нужно делать инъекции, тем больше дискомфорта это приносит пациенту, из-за чего он может хуже выполнять предписания врача и в итоге лечение не достигнет оптимального результата. При введении медицински активного агента путем инъекций каждый следующий укол причиняет новую боль, повышает риск инфекции и вероятность иммунологической реакции в организме пациента. Таким образом, имеется настоятельная нужда в медицински активных агентах, изменение концентрации которых со временем в организме больного отвечало бы терапевтической потребности. Способы и композиции, описанные в настоящем документе, предлагают решение этой и других проблем.
Раскрытие изобретения
Медицински активный агент можно присоединить к полиэтиленгликолю (PEG). В результате присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГилирования) увеличивается молекулярная масса медицински активного агента, что может привести к увеличению времени его полужизни в организме пациента. Также в результате присоединения полиэтиленгликоля, в том числе небольших молекул PEG, медицински активный агент может стать более гидрофобным и амфифильным. Наличие полиэтиленгликоля может облегчить растворение медицински активного агента в органическом растворителе с полимером, способным к биологической деградации. Медицински активный агент может быть инкапсулирован в микросферу из такого полимера. Инкапсулирование медицински активного агента продлевает время его полужизни. Из описанных в настоящем документе препаратов медицински активный агент высвобождается медленно и равномерно на протяжении некоторого периода времени. Такой профиль высвобождения и обеспечивает сохранение определенного уровень введенного белка практически без пика концентрации на протяжении предполагаемого периода лечения даже без помощи эксципиентов. Благодаря получающемуся в результате профилю концентрации медицински активного агента в организме пациента достигается оптимальный клинический результат его воздействия. Препараты, описанные в настоящем документе вводят пациентам достаточно редко – один раз в месяц.
В частности, введению медицински активного агента пациентам может способствовать его сайт-специфичная модификация гидрофильными белками. В одном из примеров используются ПЭГилированные производные инсулина, в которых сайтом замещения является преимущественно остаток фенилаланина PheB1 (N-конец B-цепи). Эти производные физически стабильнее нативного инсулина и меньше подвержены ферментативной деградации. Также эти производные обладают большей, чем нативный инсулин, растворимостью в водных/органических системах. Кроме того они менее иммуногенны и дольше циркулируют в кровотоке (более продолжительное время полужизни). С помощью способов, описанных в настоящем документе, сайт-специфично ПЭГилированные белки можно получать с высоким выходом. Эти и другие преимущества позволяют добиться большей эффективности лечения диабета и других заболеваний. При высоком выходе продукта процесс изготовления более эффективен, выгоднее по стоимости и его производство может быть масштабируемым.
Примеры по изобретению включают способ получения конъюгата белка с полиэтиленгликолем. В этом способе используется водный раствор белка. Водный раствор белка может содержать белок, буферный раствор с нужным рН и хелатирующий агент. Хелатирующий агент, используемый по изобретению, выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновых кислот, гидроксиаминокарбоновых кислот, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF). Способ по изобретению может также включать добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида. Способ по изобретению может также включать взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белка с полиэтиленгликолем.
В некоторых примерах по изобретению борсодержащий восстанавливающий агент может быть представлен цианборгидридом натрия. Цианборгидрид натрия и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 5:1 до около 1,5:1. Буферный раствор берут таким, чтобы он в процессе реакции обеспечивал рН водного белкового раствора от около 4,0 до 4,4. В примерах по изобретению рН водного белкового раствора может варьировать от 3,8 до 4,0; от 4,0 до 4,2 или от 4,2 до 4,4.
В некоторых примерах по изобретению борсодержащий восстанавливающий агент включает диметиламиноборан (Met2NHBH3), триметиламиноборан (Met3NBH3), 2-пиколинборан (2-метилпиридинборан C6H7NBH3), триацетоксиборгидрид натрия (NaBH(OAc)3), триэтиламиноборан (Et3NBH3), морфолинборан (C4H9ONBH), трет-бутиламиноборан (C4H11NBH3) или 5-этил-2-метил-пиридинборан (C8H11NBH3). При использовании этих борсодержащих восстанавливающих агентов в процессе реакции не выделяется газообразный цианид, что является преимуществом в производстве. Борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 25:1 до около 1,5:1. Буферный раствор берут таким, чтобы он в процессе реакции обеспечивал рН водного белкового раствора от 4,0 до 6,0. В некоторых примерах по изобретению рН водного белкового раствора может варьировать от 4,0 до 4,4; от 4,4 до 4,8 или от 4,8 до 5,2, от 5,2 до 5,6; от 5,6 до 6,0.
Примеры по изобретению могут включать способ получения конъюгата инсулина с полиэтиленгликолем. В этом способе используется водный раствор инсулина. Водный раствор инсулина может содержать инсулин, буферный раствор с нужным рН, органический растворитель и хелатирующий агент. Хелатирующий агент, используемый по изобретению, может включать этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Способ по изобретению может также включать добавление в водный раствор инсулина борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида. Борсодержащий восстанавливающий агент в способе по изобретению может быть любым из борсодержащих восстанавливающих агентов, описанных в настоящем документе. Борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 5:1 до около 1:1 или в любом из молярных соотношений, описанных в настоящем документе. Способ по изобретению также включает взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и инсулина с образованием конъюгата инсулина с полиэтиленгликолем. Буферный раствор берут таким, чтобы он в процессе реакции обеспечивал рН водного раствора инсулина в любом из диапазонов, описанных в настоящем документе. В результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида и инсулина образуется конъюгат PEG-PheB1-инсулин, составляющий более 75% всех образующихся конъюгатов инсулина с полиэтиленгликолем.
Примеры по изобретению включают способ получения микросфер, содержащих конъюгат белка с полиэтиленгликолем, которые обеспечивают его замедленное высвобождение. Этот способ включает использование водного белкового раствора, содержащего белок, буферный раствор с нужным рН и хелатирующий агент. Хелатирующий агент, используемый по изобретению, выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновых кислот, гидроксиаминокарбоновых кислот, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF). Способ по изобретению может также включать добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида. Борсодержащий восстанавливающий агент в способе по изобретению может быть любым из борсодержащих восстанавливающих агентов, описанных в настоящем документе. Борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в любом из молярных соотношений, описанных в настоящем документе. Этот способ также включает взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 4,0 до 6,0. Кроме того, указанный способ может включать смешивание конъюгата белок-полиэтиленгликоль в органическом растворителе с полимером, способным к биологической деградации. Также этот способ может включать эмульгирование смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль с биоразлагаемым полимером в водном растворе. Этот способ может включать отверждение эмульгированной смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера с образованием микросфер, обеспечивающих замедленное высвобождение.
Краткое описание чертежей
Описание изложенной в настоящем документе технологии иллюстрируется прилагаемыми фигурами.
Фигура 1 изображает функциональную схему способа получения конъюгатов белок-полиэтиленгликоль по примерам изобретения.
Фигура 2 изображает функциональную схему способа получения конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль по примерам изобретения.
Фигура 3 изображает функциональную схему способа получения микросфер, содержащих конъюгаты белок-полиэтиленгликоль и обеспечивающих их замедленное высвобождение, по примерам изобретения.
Фигура 4 – точечный график, представляющий выход моноПЭГилированного инсулина как функцию концентрации цианборгидрида натрия по примерам изобретения.
Фигуры 5A и 5B - точечные графики, представляющие выход моноПЭГилированного инсулина как функцию отношения концентрации хелатирующего агента и исходной концентрации инсулина, по примерам изобретения.
Фигура 6 - точечный график, представляющий выход моноПЭГилированного инсулина как функцию относительного содержания (в процентах) ионов цинка, по примерам изобретения.
Фигура 7 точечный график, представляющий выход моноПЭГилированного инсулина как функцию исходной концентрации инсулина, по примерам изобретения.
Фигура 8 точечный график, представляющий выход моноПЭГилированного инсулина как функцию рН, по примерам изобретения.
Фигуры 9A и 9B точечные графики, представляющие выход моноПЭГилированного инсулина как функцию буферной силы, по примерам изобретения.
Фигура 10 точечный график, представляющий выход моноПЭГилированного инсулина как функцию времени, прошедшего с момента начала реакции ПЭГилирования, при различных соотношениях концентрации хелатирующего агента и исходной концентрации инсулина, по примерам изобретения.
Фигура 11 - точечный график, представляющий выход моноПЭГилированного инсулина как функцию концентрации хлорида натрия, по примерам изобретения.
Фигура 12 – диаграмма, демонстрирующая эффективность ПЭГилирования при использовании различных растворителей, по примерам изобретения.
Фигура 13 диаграмма, демонстрирующая эффективность ПЭГилирования при различных рН и концентрациях восстанавливающего агента, по примерам изобретения.
Фигура 14 - точечный график, представляющий относительное количество (в процентах) моноПЭГилированного инсулина как функцию времени, по примерам изобретения.
Фигура 15 – точечные графики, представляющие относительное количество (в процентах) моноПЭГилированного инсулина как функцию времени при использовании двух разных буферных растворов по примерам изобретения.
Фигура 16 – точечный график, демонстрирующий влияние рН цитратного буферного раствора на эффективность ПЭГилирования, по примерам изобретения.
Осуществление изобретения
Нативные белки, предполагаемые на роль медицински активного агента, не обязательно обладают желаемым концентрационным профилем и другими свойствами, ценными для такого агента. В результате ПЭГилирования, то есть присоединения к белковой молекуле полиэтиленгликоля (PEG), может способствовать введению пептидов и белков в организм пациента, что ведет к улучшению фармакологических свойств и повышению эффективности терапевтического воздействия. Полиэтиленгликоль - это неразветвленный полимер, субъединицами которого являются молекулы этиленгликоля; он растворим как в воде, так и во многих органических растворителях. Полиэтиленгликоль как материал гибкий, не токсичный и способен к биологической деградации. Благодаря свойствам полиэтиленгликоля увеличиваются растворимость и/или время полужизни белка или пептида в организме пациента.
Обычно применяемые методы получения сайт-специфичных конъюгатов белков с полиэтиленгликолем не отличаются высоким выходом, который оставляет лишь около 50%. Кроме того, эти методы предполагают больше этапов для защиты белковой молекулы от присоединения полиэтиленгликоля по менее предпочтительным сайтам или аминокислотным остаткам. В обычных методах ПЭГилирования белок должен претерпевать реакции в неблагоприятной для белковых молекул среде (высокие или низкие значения рН) в течение относительно продолжительного времени. Из-за низкого выхода и негативной для белков среды возрастает стоимость процесса и снижается клиническая эффективность воздействия.
Но при получении сайт-специфичных конъюгатов белок-полиэтиленгликоль возможно достигнуть более высокого выхода, чем обычными методами. При использовании альдегидов полиэтиленгликоля выход выше, чем при использовании эфиров полиэтиленгликоля. Более низкие рН способствуют специфичности в отношении N-концевого остатка фенилаланина цепи В инсулина. Что касается цианборгидрида натрия, то предпочтительны более низкие его концентрации, так как при более высоких концентрациях этого восстанавливающего агента может происходить восстановление альдегидной группы полиэтиленгликоля. Концентрации или соотношения различных компонентов выбирают так, чтобы максимально повысить выход реакции образования сайт-специфичного конъюгата белок-полиэтиленгликоль. Значения этих концентраций и соотношений могут быть в диапазонах, которые нельзя предсказать, исходя из данных о выходе реакции в условиях вне такого диапазона.
Примеры по изобретению включают способ получения конъюгатов белок-полиэтиленгликоль, изображенный на фиг. 1. Способ 100 включает приготовление водного раствора белка 102. Этот водный белковый раствор содержит белок, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, и хелатирующий агент. Белок, входящий в состав этого раствора, выбирают из группы, состоящей из инсулина, паратиреоидного гормона (PTH), фрагмента паратиреоидного гормона, гормона роста (например, человеческого гормона роста (hGH)), глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), энфувиртида (Fuzeon®), и октреотида (Sandostatin®). Инсулин здесь включает человеческий инсулин. Буферный раствор включает неорганическую соль фосфорной кислоты.
Хелатирующий агент по изобретению выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновых кислот, гидроксиаминокарбоновых кислот, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF). Аминополикарбоновую кислоту выбирают из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусной кислоты (ADA), бис(аминоэтил)гликолевого эфира N,N,N’,N’-тетрауксусной кислоты (EGTA), транс-диаминоциклогексантетрауксусной кислоты (DCTA), глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты. Аминополикарбоновые кислоты могут и не включать любое из этих соединений или любую группу этих соединений. Гидроксиаминокарбоновую кислоту выбирают из группы, состоящей из N-гидроксиэтилиминодиуксусной кислоты (HIMDA), N,N-бис-гидроксиэтилглицина и N-трис (гидроксиметил)метилглицина (трицина). N-замещенный глицин включает глицилглицин.
В способ 100 входит добавление борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида в водный белковый раствор. Восстанавливающий агент включает цианборгидрид натрия (NaCNBH3), диметиламинборан (Met2NHBH3), триметиламиноборан (Met3NBH3), 2-пиколинборан (2-метилпиридинборан C6H7NBH3), триацетоксиборгидрид натрия (NaBH(OAc)3), триэтиламиноборан (Et3NBH3), морфолинборан (C4H9ONBH), трет-бутиламиноборан (C4H11NBH3) или 5-этил-2-метил-пиридинборан (C8H11NBH3). В примерах по изобретению борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 25:1 до около 1,5:1; от около 22:1 до около 5,5:1; от около 22:1 до около 1,6:1 или от около 10:1 до около 5,5:1.
Восстанавливающим агентом может служить цианборгидрид натрия. В некоторых примерах по изобретению метод 100 также включает добавление цианборгидрида натрия и метоксиполиэтиленгликоля альдегида в водный раствор белка. В примерах по изобретению цианборгидрид натрия и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от около 5:1 до около 1,5:1; от около 4:1 до около 1,5:1; от около 5:1 до около 2:1 или от около 5:1 до около 3:1.
Также метод 100 может не включать взаимодействие эфира полиэтиленгликоля с белком. Полиэтиленгликоля альдегиды избирательно реагируют с первичными аминами, тогда как полиэтиленгликоля эфиры способны взаимодействовать с другими функциональными группами и с аминокислотами. В случае полиэтиленгликоля эфиров для желаемой реакции могут требоваться более высокие значения рН, чем в случае полиэтиленгликоля альдегидов.
Способ 100 также включает взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль. В этой реакции между альдегидной и аминогруппами может образовываться промежуточный продукт – имин. Эти реакции могут катализироваться кислотами и зависят от рН. В молекуле инсулина имеются три аминогруппы, доступные для присоединения полиэтиленгликоля. У каждой из этих групп свое значение pKa. Для аминогруппы в боковой цепи остатка лизина pKa = 10,5, для аминогруппы N-концевого остатка глицина pKa = 9,78, для N-концевого остатка фенилаланина pKa = 9,31. На избирательность аминогруппы в реакции с альдегидом может влиять pH. Буферный раствор обеспечивает поддержание pH водного белкового раствора во время реакции в диапазоне от 4,0 дo 6,0. Когда восстанавливающим агентом служит цианборгидрид, в процессе реакции pH может составлять от 4,0 дo 4,4.
В результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка образуется сайт-специфичный моноПЭГилированный белок в относительном количестве более 75%, более 85% или более 90% от всех конъюгатов белка с полиэтиленгликолем, полученных в примерах по изобретению. Например, белок может быть представлен инсулином, а сайт-специфичный моноПЭГилированный белок может включать конъюгат, в котором полиэтиленгликоль присоединен к инсулину по концевому остатку фенилаланина цепи В. Реакция с метоксиполиэтиленгликоля может происходить без перемешивания. Реакция с метоксиполиэтиленгликолем не требует этапов защиты одного или обоих остатков GlyA1 и LysB29. И можно не добавлять хлорид натрия или другие соли, увеличивающие проводимость смеси до тех пор, пока реакция не завершится или в основном не завершится.
Как показано на фиг. 2, примеры по изобретению включают способ 200 получения конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль. Метод 200 включает приготовление водного раствора инсулина 202. Этот водный раствор инсулина содержит инсулин, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, органический растворитель и хелатирующий агент. Используемый в способе 202 хелатирующий агент включает этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) или любой из хелатирующих агентов, описанных в настоящем документе. Органический растворитель, используемый при этом, выбирают из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, диметилсульфоксида (DMSO), диоксана, ацетонитрила, диметилформамида (DMF) и N-метилпирролидона(NMP).
Способ 200 также включает добавление борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида 204 к водному раствору инсулина. Борсодержащий восстанавливающий агент включает любой из описанных в настоящем документе восстанавливающих агентов. Борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в любом из молярных соотношений, описанных в настоящем документе.
Способ 200 также включает взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и инсулина с образованием конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль 206. В ходе этой реакции буферный раствор обеспечивает поддержание рН водного раствора инсулина в любом из описанных в настоящем документе диапазонов. В этих и других примерах по изобретению рН водного раствора инсулина в процессе указанной реакции может быть около 4,0 или иметь любое значение из диапазона рН, описанного в настоящем документе. В момент начала реакции метоксиполиэтиленгликоля альдегид и инсулин находятся в молярном соотношении от около 10:1 до около 1:1, или от около 8:1 до около 3:1, или от около 6:1 до около 4:1, или от около 5:1 до около 1:1 согласно примерам по изобретению.
В результате взаимодействия метоксиполиэтиленглколя альдегида с инсулином образуется конъюгат PEG-PheB1-инсулин в количестве более 75% или от 75% до 85% всех конъюгатов полиэтиленгликоля с инсулином, образующихся согласно примерам по изобретению.
Как изображено на фиг. 3, примеры по изобретению включают способ 300 получения микросфер, содержащих конъюгат инсулин-полиэтиленгликоль и обеспечивающих его замедленное высвобождение. Способ 300 включает приготовление водного белкового раствора 302, содержащего белок, буферный раствор с нужным рН и хелатирующий агент. Белок здесь может быть любым из белков, описанных ранее. Буферный раствор может быть любым из буферных растворов, описанных в настоящем документе. Хелатирующий агент может быть любым из хелатирующих агентов, описанных в настоящем документе.
[0001] Способ 300 также включает добавление борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида 304 к водному раствору инсулина. При этом борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в любом из молярных соотношений, описанных в настоящем документе.
Способ 300 включает также взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида с белком, в результате чего образуется конъюгат белок-полиэтиленгликоль 306, причем в процессе этой реакции буферный раствор обеспечивает поддержание рН в любом из диапазонов pH, описанных в настоящем документе. Конъюгат белок-полиэтиленгликоль может быть сайт-специфично моноПЭГилированным белком – сайт-специфичным конъюгатом белок-полиэтиленгликоль, включая конъюгат PheB1-инсулин. Выход конъюгата PEG-PheB1-инсулин может составлять 75% - 85% или более 75% от всех конъюгатов инсулин-полиэтиленгликоль, образующихся согласно примерам по изобретению.
Также способ 300 включает смешивание конъюгата белко-полиэтиленгликоль в органическом растворителе с биоразлагаемым полимером 308. Используемый при этом органический растворитель может включать метиленхлорид (дихлорметан). Биоразлагаемый полимер выбирают из группы, состоящей из полилактида, полигликолида, поли(d,1-лактид-ко-гликолида); поликапролактона, полиортоэфира, сополимера простого и сложного эфиров и сополимера полилактида и полиэтиленгликоля. Здесь биоразлагаемый полимер может не включать какой-либо из описанных полимеров или групп полимеров.
Также способ 300 включает эмульгирование смеси конъюгата белко-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера 310 в водном растворе. Способ 300 включает отверждение эмульгированной смеси 312 конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера с образованием микросфер, обеспечивающих замедленное высвобождение.
Примеры
Пример 1
Были проведены эксперименты в некотором диапазоне концентраций цианборгидрида натрия ([NaBH3CN]) для того, чтобы определить рабочие условия и границы использования цианборгидрида натрия для достижения стабильного выхода моноПЭГилированного инсулина (конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль). В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,04), [EDTA]/[rhI]0 (0,17 – 0,18), температура (28°C), буферная сила (30 мМ), pH (4,0); здесь [rhI]0 – исходная концентрация человеческого рекомбинантного инсулина, [mPEGpropald]0 - исходная концентрация метоксипропиленгликоля альдегида; [EDTA] – концентрация этилендиаминтетрауксусной кислоты. Во всех экспериментах исходные реагенты были одинаковые. На фиг. 4 выход моноПЭГилированного инсулина (конъюгата полиэтиленгликоль-инсулин) представлен как функция концентрации цианборгидрида натрия. При взятом для этого значении [rhI]0, оптимальной с точки зрения выхода моноПЭГилированного инсулина является концентрация [NaBH3CN] от 1,0 мМ до 1,5 мМ. Но при концентрациях цианборгидрида натрия выше 2 мМ выход конъюгата полиэтиленгликоль-инсулин снижается. Разница между выходом указанного конъюгата при [NaBH3CN] = 1,0 мМ и при [NaBH3CN] = 1,5 мМ составляет приблизительно 2 молярных %. Если верхний предел концентрации цианборгидрида натрия должен позволять такие вариации выхода желаемого конъюгата, то верхнее значение диапазона [NaBH3CN] можно брать 4,0 мМ. Наибольшему наблюдавшемуся выходу моноПЭГилированного инсулина соответствовала концентрация NaBH3CN 1,5 мМ.
Пример 2
EDTA, будучи хелатирующим агентом, связывает ионы Zn2+, присутствующие в исходном реагенте – рекомбинантном человеческом инсулине и тем самым его солюбилизирует. Чтобы соответствовать Фармакопее США (USP), исходный реагент rhI должен содержать не более 1,00% (масса/масса) Zn2+. Концентрацию Zn2+ имитировали, заменяя в буферном растворе для реакции небольшую часть ацетата натрия соответствующим количеством ацетата цинка.
Был изучен узкий диапазон соотношения концентраций этилендиаминтетрауксусной кислоты и рекомбинантного человеческого инсулина ([EDTA]/[rhI]0). В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86-0,88 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,04), [NaBH3CN] (1,2 мМ), температура (28°C), буферная сила (30 мМ), pH (4,0). В каждом опыте определяли выход моноПЭГилированного инсулина путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPHPLC); на фиг. 5А полученные данные представлены как функция [EDTA]/[rhI]0. Эти результаты показывают, что максимальный выход желаемого конъюгата инсулина с полиэтиленгликолем достигается при [EDTA]/[rhI]0 = 0,25. При значениях [EDTA]/[rhI]0 больше 0,175 выход моноПЭГилированного инсулина колеблется вокруг значения 83,5%. При снижении уровня [EDTA]/[rhI]0 до 0,05 выход моноПЭГилированного инсулина уменьшается лишь немного (~ 3 молярных %).
Пример 3
Эксперимент, описанный в примере 2, повторили в более широком диапазоне значений соотношения [EDTA]/[rhI]0. В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,07), [NaBH3CN] (2,0 мМ), температура (28°C), буферная сила (40 мМ), pH (4,0). На фиг. 5В представлен выход моноПЭГилированного инсулина как функция [EDTA]/[rhI]0. В диапазоне, отраженном на фиг. 5В, наблюдалось снижение выхода желаемого конъюгата с увеличением [EDTA]/[rhI]0.
В примерах 2 и 3 опыты проводились с рекомбинантным человеческим инсулином, содержащим 0,36% (масса/масса) ионов Zn2+. Судя по фиг. 5A в диапазоне значений [EDTA]/[rhI]0 от 0,175 дo 0,50, выход конъюгата полэтиленгликоль-инсулин приблизительно одинаковый. Если рассматривать содержание ионов Zn2+, то этому диапазону соответствует диапазон значений [EDTA]/[Zn2+] от 0,55 до 1,56. При [EDTA]/[rhI]0 = 0,48 соответственно [EDTA]/[Zn2+] = 0,55. Исходя из данных, представленных на фиг. 5B, верхняя граница диапазона [EDTA]/[Zn2+] составляет 2,0. Однако с учетом времени реакции (см. пример 8) верхняя граница диапазона [EDTA]/[Zn2+] составляет 1,0.
Пример 4
Изучали влияние содержания ионов Zn2+ в рекомбинантном человеческом инсулине на выход моноПЭГилированного инсулина. Чтобы имитировать 0,0% (масса/масса) Zn2+ и 0,40% (масса/масса) Zn2+ в реакционную смесь с выделенным рекомбинантным человеческим инсулином добавляли ацетат цинка. Ацетат цинка добавляли к рекомбинантному человеческому инсулину производства компании Diosynth (лот # SIHR010-121306A) с содержанием ионов Zn2+ = 0.36% (масса/масса), чтобы получить 0,36% (масса/масса), 1,00% (масса/масса) и 1,22% (масса/масса) Zn2+. В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05-1,07), [NaBH3CN] (2,0 мМ), температура (28°C), pH (4,0). На фиг. 6 выход моноПЭГилированного инсулина представлен как функция содержания ионов Zn2+ в указанных препаратах инсулина. Данные, изображенные на фиг. 6, согласуются с тем, что показывают фиг. 5A и 5B. Значение [EDTA]/[rhI]0 брали близким к минимальному значению, нужному для стабильного выхода при содержании ионов Zn2+ в рекомбинантном человеческом инсулине, равном 1,0% (масса/масса), поэтому концентрация EDTA должна была быть соответственной этому минимуму при содержании ионов Zn2+ в области от 1,0% (масса/масса) до 1,2% (масса/масса). Как видно на фиг. 6, когда содержание ионов Zn2+ оказывается в области от 1,0% (масса/масса) до 1,2% (масса/масса), наблюдается относительно резкий спад выхода моноПЭГилированного инсулина. При снижении содержания ионов Zn2+ от 1,0% (масса/масса) до 0,0% (масса/масса) имеет место постепенное уменьшение выхода этого конъюгата. Это постепенное уменьшение выхода конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль сходно с эффектом, демонстрируемым фиг. 5B – снижение выхода при увеличении количества EDTA, приходящегося на rhI/Zn2+. В этом примере наблюдалось, что изменения содержание ионов Zn2+ в диапазоне от 0,0% (масса/масса) до 1,0% (масса/масса) приводят к изменениям в выходе моноПЭГилированного инсулина, составляющим приблизительно 2,5 мол.% от rhI.
Пример 5
Были проведены эксперименты для диапазона исходной концентрации рекомбинантного человеческого инсулина ([rhI]0). Выход моноПЭГилированного инсулина определяли путем хроматографии RP-HPLC; на фиг. 7 выход реакции ПЭГилирования представлен как функция [rhI]0. С уменьшением исходной концентрации инсулина увеличивался выход его конъюгата с полиэтиленгликолем. Уменьшение [rhI]0 с 0,86 мМ дo 0,50 м сопровождается возрастанием выхода моноПЭГилированного инсулина всего лишь на 0,8 мол.%. Но при некоторой очень низкой исходной концентрации инсулина [rhI]0 реакция просто прекращается. По недавно собранным данным, это критическое значение [rhI]0 находится в диапазоне от 0,00 мМ до 0,50 мМ,
Значению [rhI]0 = 0,86 мМ отвечает 50 г рекомбинантного человеческого инсулина на 10 л реакционной смеси. Если загрузка постоянная, то всякому снижению исходной концентрации инсулина соответствует увеличение объема реакционной смеси. При большем ее объеме для достижения той же концентрации цианборгидрида натрия NaBH3CN его нужно больше по массе, а также требуется больше времени для очистки конъюгата инсулина с полиэтиленгликолем путем ионообменной хроматографии. Поскольку наблюдаемое влияние исходной концентрации инсулина [rhI]0 на выход его конъюгата с пеолиэтиленгликолем невелико в интервале концентраций 0,50 - 0,86 мМ, и соображений удобства и безопасности, описанных выше, рекомендуемая исходная концентрация [rhI]0 составляет 0,86 мМ, с нижним и верхним пределами 0,50 мМ и 1,0 мМ соответственно.
Пример 6
Были проведены эксперименты в диапазоне pH. В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,04), [NaBH3CN] (2,0 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,175), температура (28°C), буферная сила (30 мМ). На фиг. 8 выход реакции ПЭГилирования представлен как функция pH. В диапазоне рН от 3,88 до 4,27 выход моноПЭГилированного инсулина варьировал от минимального значения до максимального менее чем на 1,5 мол.%. За пределами этого диапазона значения выхода варьировали гораздо значительнее. Искомое значение pH составляет 4,0; в области этого рН выход конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль был максимальным.
Пример 7
Были проведены эксперименты по варьированию силы ацетатного буферного раствора. В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,07), [NaBH3CN] (2,0 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), pH (4,0). На фиг. 9A выход моноПЭГилированного инсулина представлен как функция силы ацетатного буферного раствора. Общая тенденция – чем ниже буферная сила, тем выше выход желаемого конъюгата, однако при изменении буферной силы с 10 мМ до 50 мМ выход указанного конъюгата изменяется лишь чуть больше чем на 1 мол.%. В реакционной смеси измеряли pH в начале и в конце реакции; на фиг. 9В изменение рН представлено как функция силы ацетатного буферного раствора. При буферной силе не менее 40 мМ, изменение рН за время протекания реакции, по-видимому, достигает плато. Чтобы изменение рН не выходило за пределы пределах 0,1 единицы pH, нижний предел буферной силы должен быть 20 мМ. Для стабильного ограничения рН реакционной смеси в разных партиях реагентов, искомое значение буферной силы составляет 30 мМ.
Пример 8
Выход моноПЭГилированного инсулина значительно увеличиваются в период между приблизительно 3 и 20 часами протекания реакции. Был проведен эксперимент, в котором в различные моменты времени в ходе реакции ПЭГилирования, в том числе через 16,6; 18,0; 19,2 и 20,3 часа после начала реакции, отбирали образцы из реакционной смеси. Соотношение [EDTA]/[rhI]0 варьировал: брали значения 0,15; 0,50; 1,0 и 2,0. В этом эксперименте соблюдалось постоянство следующих параметров: [rhI]0 = 0,86 мМ, [mPEGpropald]0/[rhI]0 = 1,07; [NaBH3CN] = 2,0 мМ; температура 28°C; буферная сила 30 мМ; pH 4,0. На фиг. 10 выход моноПЭГилированного инсулина представлен как функция времени от начала реакции; приведены данные для образцов, взятых в каждый из указанных четырех моментов времени. Цифрами на рисунке указаны различные значения [EDTA]/[rhI]0. Выход конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль при [EDTA]/[rhI]0 = 0,50 несколько варьирует между моментами времени 16,6 ч и 20,3 ч. Вряд ли выход продукта снижается с увеличением времени реакции, поэтому его вариации отражают, скорее всего, вариабельность измерения и анализа, а не реальные изменения выхода конъюгата. В случае [EDTA]/[rhI]0 = 0,50 данные, представленные на фиг. 10, показывают, что после 16,6 ч от начала реакции и до 20,3 ч (максимальное время) большая продолжительность реакции не улучшает выход моноПЭГилированного инсулина по сравнению с моментом времени 16,6 ч. То же (то есть практически отсутствие изменений в промежутке времени от 16,6 ч после начала реакции до 20,3 ч) имеет место, по-видимому, при [EDTA]/[rhI]0 = 0,15 и 1,0, но не при [EDTA]/[rhI]0 = 2,0. При [EDTA]/[rhI]0 = 2,0 выход моноПЭГилированного инсулина возрастал приблизительно на 1мол.% за промежуток времени от 16,6 ч до 20,3 ч. Для того, чтобы выход конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль через 16,6 ч после начала реакции достиг плато, верхний предел величины [EDTA]/[rhI]0 должен быть, по наблюдениям, 1,0.
Пример 9
Проверяли влияние изменения концентрации NaCl в реакционной смеси на выход моноПЭГилированного инсулина. В серии опытов соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [NaBH3CN] (1,5 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), буферная сила (30 мМ), pH (4,0). На фиг. 10 выход моноПЭГилированного инсулина представлен как функция [NaCl]. Степень превращения рекомбинантного человеческого инсулина отражает тенденцию, наблюдаемую в данных по выходу конъюгата (не показано). При концентрации хлорида натрия [NaCl] = 100 мМ или более в реакционной смеси перед добавлением цианборгидрида натрия присутствовал заметный осадок. (не показано). По этому примеру выход конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль снижался в присутствии NaCl даже при концентрации 50 мМ; поэтому добавлять хлорид натрия для регуляции проводимости раствора следует после протекания реакции.
Пример 10
ПЭГилирование инсулина проводили с использованием 2-метилпиридинборана; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [2-метилпиридинборан] (1,5 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), сила ацетатного буферного раствора (30 мМ), pH (4,0). Эффективность присоединения полиэтиленгликоля по данным RP-HPLC составила 55% моноПЭГилирования B-цепи инсулина, причем моноПЭГилирования по N-концу А-цепи инсулина не выявлялось.
Пример 11
Оценивали влияние добавления растворителя на эффективность ПЭГилирования; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [2-метилпиридинборан] (20 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), сила ацетатного буферного раствора (30 мМ), pH (4,0). Результаты, представленные на фиг. 12, показывают, что наиболее благоприятный эффект в отношении выхода ПЭГилированного инсулина имели ацетонитрил (ACN) и этилацетат (EtAC), предположительно благодаря повышению растворимости инсулина. На фиг. 12 представлены также данные по изопропанолу (IPA) и метиловому спирту (MeOH).
Пример 12
Определяли влияние pH и концентрации 2-метилпиридинборана на эффективность присоединения полиэтиленгликоля к инсулину; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), [ацетонитрил] (20%), сила ацетатного буферного раствора (30 мМ). Для определения концентрации конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль в реакционной смеси применяли метод RP-HPLC. Результаты, представленные на фиг. 13, показывают, что при использовании в качестве восстановителя 2-метилпиридинборана в концентрации 5 мМ оптимальны значения pH в области 5.
Пример 13
Определяли степень ПЭГилирования инсулина; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [2-метилпиридинборан] (5 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), [ацетонитрил] (20%), сила ацетатного буферного раствора (30 мМ), pH 5. Для определения концентрации конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль в реакционной смеси применяли метод RP-HPLC. На фиг. 14 представлены данные по относительному количеству (в процентах) моноПЭГилированного инсулина во времени. Реакции давали протекать в течение 16 часов; по истечении этого времени степень моноПЭГилирования составляла около 75% и считалась окончательной.
Пример 14
Определяли влияние состава забуферивающего агента на степень ПЭГилирования; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [2-метилпиридинборан] (5 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), [ацетонитрил] (20%), буферная сила (30 мМ), рН 5. Полученные результаты представлены на фиг. 15. Для определения концентрации конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль в реакционной смеси применяли метод RP-HPLC. При использовании ацетатного буферного раствора степень ПЭГилирования была выше, чем в случае цитратного буферного раствора.
Пример 15
Определяли влияние рН цитратного буферного раствора на степень ПЭГилирования; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEGpropald]0/[rhI]0 (1,05), [2-метилпиридинборан] (5 мМ), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), [ацетонитрил] (20%), сила цитратного буферного раствора (30 мМ). Для определения концентрации конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль в реакционной смеси через 3 часа после начала реакции применяли метод RP-HPLC. Полученные результаты представлены на фиг. 16.
Пример 16
Определяли влияние замены метоксиполиэтиленгликоля пропионового альдегида с молекулярной массой 5 кДа на метоксиполиэтиленгликоля N-гидроксисукцинимидный (NHS) эфир с молекулярной массой 5 кДа; при этом соблюдалось постоянство следующих параметров (значения указаны в скобках): [rhI]0 (0,86 мМ), [mPEG-NHSэфир]0/[rhI]0 (1,05), [EDTA]/[rhI]0 (0,5), температура (28°C), натрий-фосфатный буферный раствор 100 мМ; рН 6,5. Чрез 30 минут и через 1 час после начала реакции проводили анализ методом RP-HPLC, результаты которого показали, что реакция заканчивалась на том, что приблизительно 72% исходного инсулина оставалось не ПЭГилированным, 23% инсулина было ПЭГилировано по N-концу цепи B и 5% приходилось на другие формы ПЭГилированного инсулина. Этот пример показывает, что для ПЭГилирования инсулина по N-концу цепи В NHS-эфир метоксиполиэтиленгликоля менее эффективен, чем его пропионовый альдегид.
Пример 17
Были проведены эксперименты по ПЭГилированию с глюкагоноподобным пептидом 1 (GLP-1) в следующих условиях протекания реакции: [GLP-1]0 (1-2,5 мг/мл), [mPEGpropald]0/[GLP-1]0 (1,2), [NaCNBH3] (5 мМ), температура (25°C), сила ацетатного буферного раствора (10 мМ), pH (4,5). Через 16 после начала реакции ПЭГилирования реакционную смесь анализировали методом RP-HPLC. МоноПЭГилированный GLP-1 составлял 90-95%, не прореагировавший GLP-1 5-10% и диПЭГилированный GLP-1 1-2%. МоноПЭГилированный GLP-1 очищали путем катионообменной хроматографии, заменяли буферный раствор на 0,02%-ный раствор бикарбоната аммония и лиофилизировали. Получали микрочастицы, содержащие конъюгат PEG–GLP-1, применяя метод одинарной эмульсии типа «масло в воде» с экстракцией и выпариванием растворителя. Масляная фаза состояла из 8,5% (масса/объем) полимера PLGA (полилактид-ко-гликолида) и 5 мг/мл PEG–GLP-1, растворенных в дихлорметане (MeCl2). Масляную фазу эмульгировали путем вихревого перемешивания с 2,5-кратным избытком по объему 1%-ного (масса/объем) поливинилового спирта (PVA), и первичную эмульсию добавляли к 15-кратному избытку 0,3%-ного поливинилового спирта при перемешивании со скоростью 300 об/мин. Затем, примерно через 10 минут, прибавляли 30-кратный избыток 2%-ного изопропанола (IPA) и суспензию перемешивали, чтобы ускорить отверждение микросфер при испарении растворителя. Через 3 часа отвержденные микросферы отфильтровывали, промывали большим объемом дважды дистиллированной воды и лиофилизировали.
Пример 18
Были проведены эксперименты по ПЭГилированию с паратиреоидным гормоном (PTH 1-34) в следующих условиях протекания реакции: [PTH]0 (2,5 мг/мл), [mPEGpropald]0/[PTH]0 (1,2), [NaCNBH3] (20 мМ), температура (25°C), сила ацетатного буферного раствора (30 мМ), pH (4,5). Через 16 после начала реакции ПЭГилирования реакционную смесь анализировали методом RP-HPLC. МоноПЭГилированный паратиреоидный гормон составлял 68%, не прореагировавший РТН 24% и другие ПЭГилированные формы 8%. МоноПЭГилированный паратиреоидный гормон очищали путем катионообменной хроматографии, заменяли буферный раствор на 0,02%-ный раствор бикарбоната аммония и лиофилизировали. Получали микрочастицы, содержащие конъюгат PEG–РТН, применяя метод одинарной эмульсии типа «масло в воде» с экстракцией и выпариванием растворителя. Масляная фаза состояла из 8,5% (масса/объем) полимера PLGA и 1 мг/мл PEG–РТН, растворенных в дихлорметане (MeCl2). Масляную фазу эмульгировали путем вихревого перемешивания с 2,5-кратным избытком по объему 1%-ного (масса/объем) поливинилового спирта (PVA), и первичную эмульсию добавляли к 15-кратному избытку 0,3%-ного поливинилового спирта при перемешивании со скоростью 300 об/мин. Затем, примерно через 10 минут, прибавляли 30-кратный избыток 2%-ного изопропанола (IPA) и суспензию перемешивали, чтобы ускорить отверждение микросфер при испарении растворителя. Через 3 часа отвержденные микросферы отфильтровывали, промывали большим объемом дважды дистиллированной воды и лиофилизировали.
Пример 19
Были проведены эксперименты по ПЭГилированию с человеческим гормоном роста (hGH) в следующих условиях протекания реакции: [hGH]0 (2,5 мг/мл), [mPEGpropald]0/[ hGH]0 (3), [NaCNBH3] (20 мМ), температура (25°C), сила ацетатного буферного раствора (30 мМ), pH (5,5). Через 16 после начала реакции ПЭГилирования реакционную смесь анализировали методом RP-HPLC. МоноПЭГилированный человеческий гормон роста составлял 65%, не прореагировавший hGH 30% и другие ПЭГилированные формы 5%. МоноПЭГилированный человеческий гормон роста очищали путем анионообменной хроматографии, заменяли буферный раствор на 0,02%-ный раствор бикарбоната аммония и лиофилизировали. Получали микрочастицы, содержащие конъюгат PEG–hGH, применяя метод одинарной эмульсии типа «масло в воде» с экстракцией и выпариванием растворителя. Масляная фаза состояла из 8,5% (масса/объем) полимера PLGA и 1 мг/мл PEG–hGH, растворенных в дихлорметане (MeCl2). Масляную фазу эмульгировали путем вихревого перемешивания с 2,5-кратным избытком по объему 1%-ного (масса/объем) поливинилового спирта (PVA), и первичную эмульсию добавляли к 15-кратному избытку 0,3%-ного поливинилового спирта при перемешивании со скоростью 300 об/мин. Затем, примерно через 10 минут, прибавляли 30-кратный избыток 2%-ного изопропанола (IPA) и суспензию перемешивали, чтобы ускорить отверждение микросфер при испарении растворителя. Через 3 часа отвержденные микросферы отфильтровывали, промывали большим объемом дважды дистиллированной воды и лиофилизировали.
В настоящем описании с целью пояснения приведены многочисленные детали, чтобы обеспечить понимание различных примеров предлагаемой технологии. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что определенные примеры можно осуществить на практике без некоторых из этих деталей или с дополнительными деталями.
По ознакомлении с рядом описанных в настоящем документе примеров специалисту в данной области техники будет очевидно, что можно использовать различные модификации, альтернативные конструкции и эквиваленты без отступления от сущности изобретения. Кроме того, в настоящем документе не описан ряд хорошо известных способов и элементов во избежание излишнего загромождения изложения изобретения. Также детали какого-либо конкретного примера не всегда наличествуют в вариантах этого примера или могут быть добавлены в другие примеры.
Там, где в настоящем документе приводятся диапазоны величин, следует учесть, что каждое значение до десятой доли единицы нижней границы диапазона, промежуточное между его нижней и верхней границами, также конкретно включается в настоящее описание, если только из контекста не очевидно иное. Также включаются каждый более узкий диапазон между любыми указанными или промежуточными значениями данного диапазона и любое другое указанное или промежуточное значение в данном диапазоне. Верхние и нижние границы этих более узких диапазонов могут независимо включаться в данный диапазон или исключаться из него, а каждый диапазон, в котором одна из границ или обе, или ни одна из границ (не) включаются в указанные более узкие диапазоны, тоже охватываются изобретением при наличии какой-либо конкретно исключенной границы в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает одну или обе границы, диапазоны, исключающие одну из или обе этих границы, тоже охватываются изобретением.
В настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения единственное число включает значение множественного числа, если из контекста не следует иного. Так, например, если написано «способ», то подразумевается множество таких способов; если написано «белок», то подразумеваются один или более белков и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники; и т.п. В настоящем документе изобретение описано в деталях с целью ясности и понятности изложения. Однако очевидно, что при практическом его осуществлении возможны определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.
Claims (60)
1. Способ получения конъюгата белок-полиэтиленгликоль, включающий
- приготовление водного раствора белка, содержащего белок, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, и хелатирующий агент, где:
указанный белок является инсулином,
указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным или цитратным, и
указанный хелатирующий агент выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновой кислоты, гидроксиаминокарбоновой кислоты, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF);
- добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 25:1 до 1,5:1; и
- взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем:
буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 3,88 до 4,27, и
в результате указанного взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с указанным белком образуется конъюгат ПЭГ и белка, пэгилированного в одном положении.
2. Способ по п. 1, в котором борсодержащий восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из цианборгидрида натрия, диметиламиноборана, триметиламиноборана, 2-метилпиридинборана, триацетоксиборгидрида натрия, триэтиламиноборана, морфолинборана, трет-бутиламиноборана и 5-этил-2-метил-пиридинборана.
3. Способ по п. 1, в котором борсодержащий восстанавливающий агент является 2-метилпиридинбораном.
4. Способ по п. 1, в котором конъюгат ПЭГ и белка, пэгилированного в одном положении, представляет собой конъюгат PEG-PheB1-инсулин.
5. Способ по п. 1, в котором указанный хелатирующий агент является аминополикарбоновой кислотой, выбираной из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусной кислоты (ADA), бис(аминоэтил)гликолевого эфира N,N,N’,N’-тетрауксусной кислоты (EGTA), транс-диаминоциклогексантетрауксусной кислоты (DCTA), глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.
6. Способ по п. 1, в котором указанный хелатирующий агент является аминополикарбоновой кислотой и указанная аминополикарбоновая кислота является этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA).
7. Способ по п. 1, в котором гидроксиаминокарбоновую кислоту выбирают из группы, состоящей из N-гидроксиэтилиминодиуксусной кислоты (HIMDA), N,N-бис-гидроксиэтилглицина и N-трис(гидроксиметил)метилглицина.
8. Способ по п. 1, в котором N-замещенный глицин представляет собой глицилглицин.
9. Способ по п. 1, в котором указанное молярное соотношение варьируется в диапазоне от 22:1 до 5,5:1.
10. Способ по п. 1, который исключает взаимодействие эфира полиэтиленгликоля с указанным белком.
11. Способ по п. 1, в котором рН водного раствора белка варьирует от 4,0 до 4,2.
12. Способ по п. 1, в котором указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным.
13. Способ по п. 1, в котором указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является цитратным.
14. Способ по п. 1, в котором указанное молярное соотношение варьируется в диапазоне от 5:1 до 1,5:1.
15. Способ получения конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль, включающий
- приготовление водного раствора инсулина, содержащего инсулин, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, органический растворитель и хелатирующий агент, представляющий собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA);
- добавление в водный раствор инсулина борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 25:1 до 1,5:1; и
- взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и инсулина с образованием конъюгата инсулин-полиэтиленгликоль, причем:
буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного раствора инсулина от 3,88 до 4,27,
указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным или цитратным, и
в результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с инсулином образуется конъюгат ПЭГ и инсулина, пэгилированного в одном положении.
16. Способ по п. 15, в котором борсодержащий восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из цианборгидрида натрия, диметиламиноборана, триметиламиноборана, 2-метилпиридинборана, триацетоксиборгидрида натрия, триэтиламиноборана, морфолинборана, трет-бутиламиноборана и 5-этил-2-метил-пиридинборана.
17. Способ по п. 15, в котором борсодержащий восстанавливающий агент является 2-метилпиридинбораном.
18. Способ по п. 15, в котором в момент начала реакции метоксиполиэтиленгликоля альдегид и инсулин присутствуют в молярном соотношении от 10:1 до 1:1.
19. Способ по п. 15, в котором борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 22:1 до 5,5:1.
20. Способ по п. 15, в котором органический растворитель выбирают из группы, состоящей из этилового спирта, метилового спирта, диметилсульфоксида (DMSO), диоксана, ацетонитрила, диметилформамида (DMF) и N-метилпирролидона (NMP).
21. Способ по п. 15, в котором органический растворитель является диоксаном.
22. Способ по п. 15, в котором инсулин является человеческим.
23. Способ по п. 15, в котором в результате взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с инсулином образуется конъюгат PEG-PheB1-инсулин, составляющий 75-85% всех образовавшихся конъюгатов инсулин-полиэтиленгликоль.
24. Способ по п. 15, в котором рН водного раствора белка варьирует от 4,0 до 4,2.
25. Способ по п. 15, в котором указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным.
26. Способ по п. 15, в котором указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является цитратным.
27. Способ получения микросфер замедленного высвобождения, содержащих конъюгат белка с полиэтиленгликолем, включающий:
- приготовление водного белкового раствора, содержащего белок, буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, и хелатирующий агент, где
указанный белок является инсулином,
указанный буферный раствор, обеспечивающий нужный рН, является ацетатным или цитратным, и
этот хелатирующий агент выбирают из группы, состоящей из аминополикарбоновой кислоты, гидроксиаминокарбоновой кислоты, N-замещенного глицина, 2-(2-aминo-2-oксоэтил)aминoэтансульфоновой кислоты (BES) и дефероксамина (DEF);
- добавление в водный белковый раствор борсодержащего восстанавливающего агента и метоксиполиэтиленгликоля альдегида, причем борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 25:1 до 1,5:1;
- взаимодействие метоксиполиэтиленгликоля альдегида и белка с образованием конъюгата белок-полиэтиленгликоль, причем буферный раствор в процессе реакции обеспечивает рН водного белкового раствора от 3,88 до 4,27;
- смешивание конъюгата белок-полиэтиленгликоль в органическом растворителе с полимером, способным к биологической деградации, с образованием смеси; и
- эмульгирование смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера в водном растворе с образованием эмульгированной смеси; и
- отверждение эмульгированной смеси конъюгата белок-полиэтиленгликоль и биоразлагаемого полимера с образованием микросфер замедленного высвобождения, где:
в результате указанного взаимодействия метоксиполиэтиленгликоля альдегида с указанным белком образуется конъюгат ПЭГ и белка, пэгилированного в одном положении, и
указанные микросферы замедленного высвобождения обеспечивают контролируемое высвобождение этого конъюгата белок-полиэтиленгликоль.
28. Способ по п. 27, в котором борсодержащий восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из цианборгидрида натрия, диметиламиноборана, триметиламиноборана, 2-метилпиридинборана, триацетоксиборгидрида натрия, триэтиламиноборана, морфолинборана, трет-бутиламиноборана и 5-этил-2-метил-пиридинборана.
29. Способ по п. 27, в котором борсодержащий восстанавливающий агент является 2-метилпиридинбораном.
30. Способ по п. 27, в котором белок представляет собой инсулин, а конъюгат белок-полиэтиленгликоль представляет собой конъюгат ПЭГ и белка, сайт-специфично пэгилированного в одном положении, и указанный конъюгат ПЭГ и белка, сайт-специфично пэгилированного в одном положении, представляет собой конъюгат PEG-PheB1-инсулин.
31. Способ по п. 27, в котором хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
32. Способ по п. 27, в котором борсодержащий восстанавливающий агент и метоксиполиэтиленгликоля альдегид берут в молярном соотношении от 25:1 до 5:1.
33. Способ по п. 27, в котором органический растворитель является дихлорметаном.
34. Способ по п. 27, в котором биоразлагаемый полимер выбирают из группы, состоящей из полилактида, полигликолида, поли(d,1-лактид-ко-гликолида), поликапролактона, полиортоэфира, сополимера простого и сложного эфиров и сополимера полилактида и полиэтиленгликоля.
35. Способ по п. 27, в котором биоразлагаемый полимер является поли(d,1-лактид-ко-гликолидом).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562170933P | 2015-06-04 | 2015-06-04 | |
| US62/170,933 | 2015-06-04 | ||
| PCT/US2016/033190 WO2016196017A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-05-19 | Amine pegylation methods for the preparation of site-specific protein conjugates |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017145825A RU2017145825A (ru) | 2019-07-10 |
| RU2017145825A3 RU2017145825A3 (ru) | 2019-11-18 |
| RU2730848C2 true RU2730848C2 (ru) | 2020-08-26 |
Family
ID=57442063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145825A RU2730848C2 (ru) | 2015-06-04 | 2016-05-19 | Способы пэгилирования по аминогруппе для получения сайт-специфичных конъюгатов белков |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10220075B2 (ru) |
| EP (1) | EP3302450A4 (ru) |
| JP (1) | JP2018516874A (ru) |
| KR (1) | KR20180015131A (ru) |
| CN (1) | CN107708679A (ru) |
| AU (1) | AU2016270302B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017023145A2 (ru) |
| CA (1) | CA2981501A1 (ru) |
| MX (1) | MX2017014586A (ru) |
| RU (1) | RU2730848C2 (ru) |
| WO (1) | WO2016196017A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201708573B (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115029204A (zh) * | 2022-07-15 | 2022-09-09 | 曾会明 | 一种具有sod活性的酒及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6323311B1 (en) * | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
| US20070083006A1 (en) * | 2003-04-11 | 2007-04-12 | Pr Pharmaceuticals, Inc. | Method for preparation of site-specific protein conjugates |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5359030A (en) | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US6191105B1 (en) | 1993-05-10 | 2001-02-20 | Protein Delivery, Inc. | Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin |
| US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
| ES2222689T3 (es) | 1998-03-12 | 2005-02-01 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Derivados del polietilenglicol con grupos reactivos proximales. |
| US7053150B2 (en) | 2000-12-18 | 2006-05-30 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Segmented polymers and their conjugates |
| TW593427B (en) | 2000-12-18 | 2004-06-21 | Nektar Therapeutics Al Corp | Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives |
| WO2003084985A1 (fr) | 2002-04-11 | 2003-10-16 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Peptide chimiquement modifie a l'aide de polyethyleneglycol |
| CA2497794A1 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Modified glp-1 receptor agonists and their pharmacological methods of use |
| ATE361761T1 (de) | 2002-09-27 | 2007-06-15 | Hoffmann La Roche | Poly(ethylen glykol)-konjugate von insulinähnlichem wachstumfaktor bindenden protein-4 |
| MXPA05007348A (es) | 2003-01-06 | 2005-10-05 | Nektar Therapeutics Al Corp | Derivados de polimeros solubles en agua tiol-selectivos. |
| JP2006520818A (ja) | 2003-03-19 | 2006-09-14 | イーライ リリー アンド カンパニー | ポリエチレングリコール結合ｇｌｐ−１化合物 |
| KR101135244B1 (ko) | 2007-11-29 | 2012-04-24 | 한미사이언스 주식회사 | 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물 |
| JP4726128B2 (ja) | 2003-12-24 | 2011-07-20 | 塩野義製薬株式会社 | タンパク質のポリマー複合体の製造方法 |
| US20050170457A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-08-04 | Chadler Pool | Novel recombinant proteins with N-terminal free thiol |
| KR20060029770A (ko) | 2004-10-04 | 2006-04-07 | 주식회사 펙스피어 | Ｇｌｐ－１의 선택적 ｐｅｇ 접합체 및 그 제조방법 |
| BRPI0609676A2 (pt) | 2005-05-13 | 2011-10-18 | Lilly Co Eli | composto de glp-1 peguilado,e, uso do mesmo |
| ES2553160T3 (es) | 2005-06-17 | 2015-12-04 | Novo Nordisk Health Care Ag | Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa |
| GB0513852D0 (en) | 2005-07-06 | 2005-08-10 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
| US8338368B2 (en) | 2005-11-07 | 2012-12-25 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability |
| EP2021397A4 (en) | 2006-05-26 | 2012-01-04 | Ipsen Pharma | PROCESS FOR POTENTIAL PEGYLATION |
| EP2049149B1 (en) | 2006-07-31 | 2015-04-15 | Novo Nordisk A/S | Pegylated extended insulins |
| EP2102355B1 (en) | 2006-12-14 | 2016-03-02 | Bolder Biotechnology, Inc. | Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same |
| JP2008156283A (ja) * | 2006-12-25 | 2008-07-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 水溶性ポリマー修飾ポリペプチドの製造方法 |
| WO2010033220A2 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Nektar Therapeutics | Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use |
| EP2480578A4 (en) | 2009-09-25 | 2013-04-17 | Vybion Inc | MODIFICATION OF POLYPEPTIDE |
| GB0917072D0 (en) | 2009-09-29 | 2009-11-11 | Univ Ulster | Peptide analogues of glucagon for diabetes therapy |
| WO2011163473A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability in physiological ph buffers |
| WO2012054882A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Kci Licensing, Inc. | Debridement hand tool |
| WO2012054861A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Nektar Therapeutics | Glp-1 polymer conjugates having a releasable linkage |
| KR101746686B1 (ko) | 2010-10-26 | 2017-06-15 | 한미사이언스 주식회사 | 면역글로불린 단편을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드―２（ｇｌｐ―２）약물 결합체 |
| CA2835450C (en) * | 2011-05-12 | 2020-05-12 | Bionomics Limited | Methods for preparing naphthyridines |
| CN102786590A (zh) | 2011-05-19 | 2012-11-21 | 江苏豪森药业股份有限公司 | 分枝型peg修饰的glp-1类似物及其可药用盐 |
| WO2012166622A1 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Baxter International Inc. | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
| RU2014101697A (ru) | 2011-06-22 | 2015-07-27 | Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн | Коагонисты рецепторов глюкагона/glp-1 |
| AR090281A1 (es) * | 2012-03-08 | 2014-10-29 | Hanmi Science Co Ltd | Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo |
| AR094821A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-09-02 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada |
| ES2927607T3 (es) | 2013-09-13 | 2022-11-08 | Scripps Research Inst | Agentes terapéuticos modificados y composiciones de los mismos |
| US10039809B2 (en) | 2013-12-18 | 2018-08-07 | The California Institute For Biomedical Research | Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof |
-
2016
- 2016-05-19 CN CN201680030022.XA patent/CN107708679A/zh active Pending
- 2016-05-19 MX MX2017014586A patent/MX2017014586A/es unknown
- 2016-05-19 CA CA2981501A patent/CA2981501A1/en not_active Abandoned
- 2016-05-19 US US15/158,898 patent/US10220075B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2016-05-19 EP EP16803982.4A patent/EP3302450A4/en not_active Withdrawn
- 2016-05-19 JP JP2017555782A patent/JP2018516874A/ja not_active Ceased
- 2016-05-19 KR KR1020177033595A patent/KR20180015131A/ko not_active Withdrawn
- 2016-05-19 BR BR112017023145A patent/BR112017023145A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-05-19 WO PCT/US2016/033190 patent/WO2016196017A1/en not_active Ceased
- 2016-05-19 RU RU2017145825A patent/RU2730848C2/ru active
- 2016-05-19 AU AU2016270302A patent/AU2016270302B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-12-15 ZA ZA2017/08573A patent/ZA201708573B/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6323311B1 (en) * | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
| US20070083006A1 (en) * | 2003-04-11 | 2007-04-12 | Pr Pharmaceuticals, Inc. | Method for preparation of site-specific protein conjugates |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NA D. H., Lee K. C. Capillary electrophoretic characterization of PEGylated human parathyroid hormone with matrix-assisted laser * |
| RUHAAK L. R. et al. 2‐Picoline‐borane: A non‐toxic reducing agent for oligosaccharide labeling by reductive amination //Proteomics. - 2010. - Т. 10. - No. 12. - С. 2330-2336. * |
| RUHAAK L. R. et al. 2‐Picoline‐borane: A non‐toxic reducing agent for oligosaccharide labeling by reductive amination //Proteomics. - 2010. - Т. 10. - No. 12. - С. 2330-2336. NA D. H., Lee K. C. Capillary electrophoretic characterization of PEGylated human parathyroid hormone with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry //Analytical biochemistry. - 2004. - Т. 331. - No. 2. - С. 322-328. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180015131A (ko) | 2018-02-12 |
| CA2981501A1 (en) | 2016-12-08 |
| MX2017014586A (es) | 2018-03-09 |
| RU2017145825A (ru) | 2019-07-10 |
| WO2016196017A1 (en) | 2016-12-08 |
| BR112017023145A2 (pt) | 2018-07-10 |
| EP3302450A4 (en) | 2019-01-16 |
| EP3302450A1 (en) | 2018-04-11 |
| ZA201708573B (en) | 2019-08-28 |
| US10220075B2 (en) | 2019-03-05 |
| JP2018516874A (ja) | 2018-06-28 |
| RU2017145825A3 (ru) | 2019-11-18 |
| US20160354478A1 (en) | 2016-12-08 |
| AU2016270302B2 (en) | 2020-09-17 |
| AU2016270302A1 (en) | 2017-10-19 |
| CN107708679A (zh) | 2018-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2843506C (en) | Carrier-linked prodrugs having reversible carboxylic ester linkages | |
| JP5231412B2 (ja) | ペプチドを持続的放出により送達するための薬理組成物 | |
| JP4482267B2 (ja) | 接合安定化されたポリペプチド組成物 | |
| US9265723B2 (en) | Long acting insulin composition | |
| AU2003303646B2 (en) | Human growth hormone crystals and methods for preparing them | |
| CN109789188B (zh) | 具有低峰-谷比的pth化合物 | |
| RU2712644C2 (ru) | Белки и белковые конъюгаты с повышенной гидрофобностью | |
| US8071544B2 (en) | Crystallized recombinant human growth factor formulations | |
| JP2001525371A (ja) | Ｇｌｐ−１製剤 | |
| EA028657B1 (ru) | Пегилированные соединения инсулина лизпро | |
| JP2010248241A (ja) | 部位特異的タンパク質結合体を調製する方法 | |
| SG173117A1 (en) | Crystalline insulin-conjugates | |
| CN103492420A (zh) | 透明质酸-蛋白质结合物及其制备方法 | |
| US20060110458A1 (en) | Sustained release drug carrier | |
| JP2021504448A (ja) | 超高速応答を伴うグルコース誘発性インスリン送達のための電荷切り替え可能な高分子デポ | |
| RU2730848C2 (ru) | Способы пэгилирования по аминогруппе для получения сайт-специфичных конъюгатов белков | |
| JP2014502984A (ja) | Ｇｌｐ−１組成物 | |
| JP2010514679A (ja) | 制御放出組成物及び方法 | |
| HK40026763A (en) | Carrier-linked prodrugs having reversible carboxylic ester linkages | |
| CN113527505A (zh) | 一种多肽和包含该多肽的药物组合物以及它们的应用 | |
| JPH0366291B2 (ru) |