RU2730615C1 - Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against gram-negative bacteria: pseudomonas aeruginosa, acinetobacter baumannii, klebsiella pneumoniae and salmonella typhi (embodiments) - Google Patents
Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against gram-negative bacteria: pseudomonas aeruginosa, acinetobacter baumannii, klebsiella pneumoniae and salmonella typhi (embodiments) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730615C1 RU2730615C1 RU2019114137A RU2019114137A RU2730615C1 RU 2730615 C1 RU2730615 C1 RU 2730615C1 RU 2019114137 A RU2019114137 A RU 2019114137A RU 2019114137 A RU2019114137 A RU 2019114137A RU 2730615 C1 RU2730615 C1 RU 2730615C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- bacteria
- pseudomonas aeruginosa
- endolysin
- negative bacteria
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 50
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 title claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 22
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 title claims abstract description 9
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims abstract description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 41
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 abstract description 38
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 36
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 12
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 abstract 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 230000009471 action Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 5
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 5
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- -1 coatings Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 244000000058 gram-negative pathogen Species 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010004743 Art-175 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 2
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 2
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229940041153 polymyxins Drugs 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- WTJDAUWOECZENF-OZWITMHCSA-N smap-29 Chemical compound NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 WTJDAUWOECZENF-OZWITMHCSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 229940037649 staphylococcus haemolyticus Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N (3aR,4R,9bS)-golgicide A Chemical compound C1([C@@H]2NC3=C(F)C=C(C=C3[C@H]3C=CC[C@H]32)F)=CC=CN=C1 NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 208000004020 Brain Abscess Diseases 0.000 description 1
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000244 anti-pseudomonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 208000025222 central nervous system infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000001806 lysozymelike Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008191 permeabilizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 208000012313 wound discharge Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates
Изобретение относится к биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в создании биологических препаратов для профилактики и лечения инфекций, а также дезинфекции.The invention relates to biochemistry, molecular biology, microbiology and biotechnology and can be used in the creation of biological preparations for the prevention and treatment of infections, as well as disinfection.
Уровень техникиState of the art
Устойчивость бактерий к существующим антимикробным средствам является одной из основных проблем современности в области здравоохранения. Горизонтальный перенос генов позволяет бактериям очень быстро распространять новые механизмы резистентности, что, наряду с неправильным использованием и злоупотреблением антибиотиками среди населения, а также в сельском хозяйстве и промышленности, приводит к появлению штаммов, которые невосприимчивы к антибиотикам вообще. Всемирная организация здравоохранения обращает особое внимание на патогенов группы ESKAPE, к которым относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и другие представители Enterobacteriaceae. Данные бактерии способны приобретать устойчивость сразу к нескольким антибактериальным средствам, и чаще других вызывают опасные для жизни пациентов инфекции, в том числе и внутрибольничные. Bacterial resistance to existing antimicrobial agents is one of the major health problems of our time. Horizontal gene transfer allows bacteria to very quickly spread new mechanisms of resistance, which, along with the misuse and abuse of antibiotics in the population, as well as in agriculture and industry, leads to the emergence of strains that are generally resistant to antibiotics. The World Health Organization pays special attention to pathogens of the ESKAPE group, which include Enterococcus faecium , Staphylococcus aureus , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae and other representatives of Enterobacteriaceae . These bacteria are able to acquire resistance to several antibacterial agents at once, and more often than others cause infections that are life-threatening to patients, including nosocomial ones.
Альтернативой антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам являются бактериофаги, использование которых началось еще до открытия пенициллина. Применение бактериофагов имеет множество преимуществ: автоматическое дозирование в зависимости от степени заражения, минимальное нарушение естественной микрофлоры, низкая вероятность развития устойчивости, совместимость с антибиотиками, быстрая скорость разработки препаратов на основе фагов и их низкая стоимость, уничтожение биопленок, возможность единоразового введения и применения низких доз, а также низкая степень нагрузки на окружающую среду.An alternative to antibiotics and synthetic antibacterial agents are bacteriophages, the use of which began even before the discovery of penicillin. The use of bacteriophages has many advantages: automatic dosing depending on the degree of infection, minimal disruption of natural microflora, low probability of resistance development, compatibility with antibiotics, rapid development of phage-based drugs and their low cost, destruction of biofilms, the possibility of one-time administration and the use of low doses as well as a low degree of pressure on the environment.
Помимо зарегистрированных на территории РФ бактериофаговых препаратов компании «Микроген», существует множество изолированных бактериофагов, которые можно применять для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Например, вирулентный фаг Фи 03 (RU 2112800, опубликован 29.03.1996) обладает способностью действовать на клетки синегнойной палочки, имеющие пили. Однако его спектр действия довольно узкий. Фаг Фи 02 (RU 2113476, опубликован 29.03.1996) обладает широким спектром действия. Бактериофаг ph57 (RU 2455355, опубликован 29.04.2011) также обладает широким спектром и может применяться для лечения гнойно-септических инфекций. Вирулентный штамм бактериофага Acinetobacter baumannii AP22 (RU 2439151, опубликован 24.06.2010) обладает узким спектром действия и способен лизировать только представителей вида Acinetobacter baumannii. Бактериофаг Esc-СОР-1 способен специфически уничтожать штаммы Шига-токсин продуцирующей E. соli типа F18 и может быть использован в медицинской промышленности (RU 2662985, опубликован 28.12.2015). Высоковирулентный штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ph57 обладает широким спектром литической активности в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa и может быть использован в качестве основы для приготовления антисептического средства против синегнойной палочки (RU 2455355, опубликован 19.04.2011). Штамм бактериофага Salmonella typhimurium S-394 обладает поливалентной литической активностью по отношению к бактериям родов Escherichia coli, штаммам Salmonella ТА 1537 и Salmonella ТА 100 и штаммам Shigella sonnei 32 и Shigella flexneri Аd (RU 2412243, опубликован 16.06.2009). Также можно отметить антибактериальные композиции широкого сперта действия, содержащие несколько бактериофагов, например, те, которые описаны в патентах RU 2518303 (опубликован 29.06.2012) и RU 2628312 (опубликован 16.03.2015). In addition to the bacteriophage preparations of the Microgen company registered in the Russian Federation, there are many isolated bacteriophages that can be used to treat infections caused by gram-negative bacteria. For example, the virulent phage Phi 03 (RU 2112800, published 03/29/1996) has the ability to act on Pseudomonas aeruginosa cells that have pili. However, its spectrum of action is rather narrow. Phage Phi 02 (RU 2113476, published 03/29/1996) has a wide spectrum of action. Bacteriophage ph57 (RU 2455355, published on April 29, 2011) also has a wide spectrum and can be used to treat purulent-septic infections. The virulent bacteriophage strain Acinetobacter baumannii AP22 (RU 2439151, published on June 24, 2010) has a narrow spectrum of action and is capable of lyzing only representatives of the species Acinetobacter baumannii . Bacteriophage Esc-COP-1 is able to specifically destroy strains of Shiga-toxin producing E. coli type F18 and can be used in the medical industry (RU 2662985, published on December 28, 2015). The highly virulent Pseudomonas aeruginosa ph57 bacteriophage strain has a wide spectrum of lytic activity against Pseudomonas aeruginosa bacteria and can be used as a basis for the preparation of an antiseptic agent against Pseudomonas aeruginosa (RU 2455355, published on 19.04.2011). The bacteriophage strain Salmonella typhimurium S-394 has polyvalent lytic activity against bacteria of the genera Escherichia coli , the Salmonella TA 1537 and Salmonella TA 100 strains and the Shigella sonnei 32 and Shigella flexneri Ad strains (RU 2412243, published on June 16, 2009). It is also possible to note antibacterial compositions of wide action sperm containing several bacteriophages, for example, those described in patents RU 2518303 (published on June 29, 2012) and RU 2628312 (published on March 16, 2015).
Однако есть и минусы применения лекарственных препаратов на основе бактериофагов. Бактериофаги сложно и долго выделять из бактериальных культур, они могут переносить гены бактериальных токсинов, к ним зачастую может возникать устойчивость бактерий, они обладают сильной иммуногенностью. Также их выделение может быть затруднительным, а нормировать их фармакокинетические характеристики сложно, а порой и невозможно. Для раневых инфекций было показано, что присутствие бактериофагов вызывало непродуктивный иммунный ответ, способствующий развитию хронической раневой инфекции и определяющий более тяжелое течение.However, there are also disadvantages of using drugs based on bacteriophages. It is difficult and takes a long time to isolate bacteriophages from bacterial cultures, they can transfer genes of bacterial toxins, bacteria can often become resistant to them, they have strong immunogenicity. Also, their isolation can be difficult, and it is difficult, and sometimes impossible, to normalize their pharmacokinetic characteristics. For wound infections, it was shown that the presence of bacteriophages caused an unproductive immune response, contributing to the development of chronic wound infection and determining a more severe course.
Считается, что более перспективным классом антибактериальных агентов могут стать эндолизины бактериофагов - литические ферменты, способные расщеплять пептидогликан клеточной стенки бактерий, что влечет за собой гибель бактерии вследствие гипотонического лизиса.It is believed that a more promising class of antibacterial agents can be bacteriophage endolysins - lytic enzymes capable of cleaving peptidoglycan of the bacterial cell wall, which entails the death of bacteria due to hypotonic lysis.
Эндолизины обладают рядом преимуществ по сравнению с бактериофагами и антибактериальными молекулами. Чаще всего они действуют специфично на определенный вид бактерий, при этом литический эффект достигается очень быстро за счет прямого действия на пептидогликан. Однако для многих эндолизинов, чье действие показано против грамотрицательных бактерий, обнаруживается довольно широкий спектр активности на различные роды представителей грамотрицательных патогенов. Среди других преимуществ эндолизинов можно отметить низкую вероятность развития резистентности, действие на антибиотикоустойчивые штаммы, а также на бактерии, находящиеся в любых метаболических стадиях, включая дормантные.Endolysins have several advantages over bacteriophages and antibacterial molecules. Most often, they act specifically on a certain type of bacteria, while the lytic effect is achieved very quickly due to the direct action on peptidoglycan. However, for many endolysins, whose action has been shown against gram-negative bacteria, a rather wide spectrum of activity is found against various genera of representatives of gram-negative pathogens. Other advantages of endolysins include a low probability of developing resistance, an effect on antibiotic-resistant strains, as well as on bacteria in any metabolic stage, including dormant ones.
Эндолизины все чаще отмечают как потенциальные и эффективные препараты в борьбе с различными возбудителями. Независимыми группами ученых проводятся исследования по созданию и применению их для борьбы с грамотрицательными бактериями особо важной группы ESKAPE. При этом очень часто (но не всегда) использованию эндолизинов в чистом виде мешает наличие наружной мембраны, экранирующей пептидогликан от действия фермента. В качестве веществ, увеличивающих проницаемость наружной мембраны, могут использоваться полимиксины, полигуанидины и их производные, аминогликозиды, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и ее соли, лимонная кислота и др.Endolysins are increasingly being noted as potential and effective drugs in the fight against various pathogens. Independent groups of scientists are conducting research on the creation and application of them to combat gram-negative bacteria of the especially important ESKAPE group. At the same time, very often (but not always) the use of pure endolysins is hindered by the presence of an outer membrane that shields peptidoglycan from the action of the enzyme. Polymyxins, polyguanidines and their derivatives, aminoglycosides, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) and its salts, citric acid, etc. can be used as substances that increase the permeability of the outer membrane.
Среди примеров эндолизинов, чье бактерицидное действие проявляется или значительно увеличивается в присутствии пермеабилизующих агентов, в частности ЭДТА, можно отметить антисинегнойные эндолизины EL188 (WO2015071437 A1, опубликован 21.05.2015) и OBPgpLYS (US 8846865 B2, опубликован 30.09.2014). Among the examples of endolysins, whose bactericidal action is manifested or significantly increased in the presence of permeabilizing agents, in particular EDTA, are the antipseudomonal endolysins EL188 (WO2015071437 A1, published 05.21.2015) and OBPgpLYS (US 8846865 B2, published 09.30.2014).
Другим подходом, позволяющим не задействовать дополнительные реагенты, увеличивающие проницаемость наружных мембран, является создание химерных молекул. Эти соединения представляют собой ковалентно сшитые эндолизин и пептид, который позволяет перенести молекулу через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. В частности, антимикробный пептид SMAP-29 использовался для создания Art-175, представляющего собой модифицированную молекулу KZ144. В отличие от KZ144 Art-175 может проходить через наружную мембрану синегнойной палочки и уничтожать бактерии, в том числе и с множественной резистентностью (US 20160281074 A1, опубликован 29.09.2016).Another approach that allows not to use additional reagents that increase the permeability of outer membranes is the creation of chimeric molecules. These compounds are covalently crosslinked endolysin and a peptide that allows the molecule to be transported across the outer membrane of gram-negative bacteria. In particular, the antimicrobial peptide SMAP-29 was used to create Art-175, which is a modified KZ144 molecule. Unlike KZ144 Art-175 can pass through the outer membrane of the Pseudomonas aeruginosa and destroy bacteria, including those with multiple resistance (US 20160281074 A1, published 09.29.2016).
Известно, что OBPgpLYS также модифицировали с помощью SMAP-29. При этом он начинает проявлять значительно больший антимикробный эффект как на штаммы синегнойной палочки, так и на другие грамотрицательные бактерии (US 8846865 B2, опубликован 30.09.2014). Модифицированный и немодифицированный OBPgpLYS также способны элиминировать бактерии внутри биопленок (WO 2011134998 A1, опубликован 03.11.2011).It is known that OBPgpLYS has also been modified with SMAP-29. At the same time, it begins to exhibit a significantly greater antimicrobial effect on both Pseudomonas aeruginosa strains and other gram-negative bacteria (US 8846865 B2, published 09/30/2014). Modified and unmodified OBPgpLYS are also capable of eliminating bacteria within biofilms (WO 2011134998 A1, published 03.11.2011).
Однако встречается множество примеров рекомбинантных эндолизинов, которые способны действовать на представителей грамотрицательных бактерий и без пермеабилизаторов или видоизменения структуры. However, there are many examples of recombinant endolysins that are capable of acting on representatives of gram-negative bacteria without permeabilizers or structural modifications.
Эндолизин PlyE146 за счет положительно заряженной области на С-конце белка также обладает способностью проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий и лизировать клетки E. coli, P. aeruginosa и A. baumannii в концентрации 400 мкг/мл (Larpin et al., 2018). Эндолизин бактериофага Acinetobacter baumannii LysAB2 за счет амфифильных структур в молекуле обладает бактерицидным действием как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, эффект достигается при концентрации 500 мкг/мл. В его спектр входят штаммы A. baumannii, E. coli и S. aureus (Lai et al, 2011). Также без добавления пермеабилизаторов проявляет свой антимикробный эффект эндолизин Р28 в концентрации 500 мкг/мл, его спектр действия охватывает Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella mobilis, Shigella flexneri, Xanthomonas campestris и Staphylococcus aureus (Dong et al, 2015). Другие примеры включают в себя LysPA26, способный уничтожать клетки Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii и Escherichia coli в концентрации 500 мкг/мл (Guo et al., 2017), PlyAB1 с узким спектром действия против A. baumannii (Huang et al., 2014) и другие.Endolysin PlyE146, due to the positively charged region at the C-terminus of the protein, also has the ability to penetrate the outer membrane of gram-negative bacteria and lyse the cells of E. coli , P. aeruginosa, and A. baumannii at a concentration of 400 μg / ml (Larpin et al., 2018). Endolysin of bacteriophage Acinetobacter baumannii LysAB2, due to amphiphilic structures in the molecule, has a bactericidal effect against both gram-negative and gram-positive bacteria, the effect is achieved at a concentration of 500 μg / ml. Its spectrum includes strains of A. baumannii , E. coli, and S. aureus (Lai et al, 2011). Also, without the addition of permeabilizers, endolysin P28 at a concentration of 500 μg / ml exhibits its antimicrobial effect; its spectrum of action covers Bacillus subtilis , Bacillus cereus , Klebsiella mobilis , Shigella flexneri , Xanthomonas campestris and Staphylococcus aureus (Dong et al, 2015). Other examples include LysPA26, capable of killing Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumonia , Acinetobacter baumannii and Escherichia coli cells at 500 μg / ml (Guo et al., 2017), PlyAB1 with a narrow spectrum of action against A. baumannii (Huang et al. , 2014) and others.
Таким образом, в настоящее время проводится множество исследований эндолизинов, чей эффект направлен против широких панелей штаммов грамотрицательных бактерий с лекарственной устойчивостью, в том числе и множественной. Это подтверждает актуальность данного направления исследований.Thus, there are currently many studies on endolysins, whose effect is directed against broad panels of strains of gram-negative bacteria with drug resistance, including multiple. This confirms the relevance of this line of research.
Техническая проблемаTechnical problem
Техническая проблема состоит в необходимости расширения арсенала средств литического действия на грамотрицательные бактерии, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью.The technical problem is the need to expand the arsenal of lytic agents against gram-negative bacteria, including those with multidrug resistance.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Данное изобретение представляет собой рекомбинантный белок эндолизин LysECD7 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 а также последовательности, которые по меньшей мере на 90% ей идентичны, и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 4, а также последовательности, которые по меньшей мере на 80% ей идентичны), представляющий собой модифицированный 8-гистидиновой меткой рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2, а также последовательности, которые по меньшей мере на 90% им идентичны). Он обладает широким спектром действия, проявляя антибактериальную активность в отношении Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и других видов бактерий.This invention is a recombinant protein endolysin LysECD7 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and sequences that are at least 90% identical to it, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, as well as sequences that are at least 80% identical to it), which is a modified 8-histidine tag recombinant endolysin of bacteriophage ECD7 (amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, as well as sequences that are at least 90% identical to them). It has a broad spectrum of action, exhibiting antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , Salmonella typhi and other types of bacteria.
Рекомбинантный ндолизин LysECD7 способен без добавления дополнительных увеличивающих проницаемость мембран компонентов проникать через наружную мембрану и эффективно и быстро уничтожать клетки грамотрицательных бактерий различных штаммов, видов и родов. Он позволит проводить антимикробную терапию различных видов инфекций, вызванных штаммами бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, а также избавляться от бактерий, образовавших биопленки, внутрь которых доступ существующих антибактериальных средств затруднен. Recombinant ndolysin LysECD7 is capable of penetrating the outer membrane without adding additional membrane permeability increasing components and effectively and quickly destroying cells of gram-negative bacteria of various strains, species and genera. It will allow antimicrobial therapy for various types of infections caused by strains of multidrug-resistant bacteria, as well as getting rid of bacteria that have formed biofilms, into which the access of existing antibacterial agents is difficult.
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и Klebsiella pneumoniae являются одними из самых опасных возбудителей внутрибольничных инфекций, терапия которых зачастую затруднена в связи с высокой устойчивостью данных видов бактерий к существующим лекарственным средствам, а также их способностью образовывать биопленки. Инфекции, вызываемые этими патогенами, клинически очень разнообразны, а их течение очень тяжелое, особенно в случае нозокомиального происхождения, когда иммунитет пациента сильно снижен. По различным оценкам, внутрибольничные инфекции поражают 5-10% пациентов, находящихся в стационаре. Ежегодно в России число зафиксированных случаев внутрибольничных инфекций составляет порядка 2,5 млн. Pseudomonas aeruginosa , Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae are some of the most dangerous causative agents of nosocomial infections, the treatment of which is often difficult due to the high resistance of these types of bacteria to existing drugs, as well as their ability to form biofilms. Infections caused by these pathogens are clinically very diverse, and their course is very severe, especially in the case of nosocomial origin, when the patient's immunity is greatly reduced. According to various estimates, nosocomial infections affect 5-10% of hospitalized patients. Annually in Russia, the number of cases of nosocomial infections recorded is about 2.5 million.
Escherichia coli является представителем нормальной микрофлоры организма, но среди них есть и патогенные разновидности, которые морфологически не отличаются от непатогенных и вызывают эшерихиозы, чаще всего сопровождающиеся интоксикацией, лихорадкой и поражением желудочно-кишечного тракта. Заражение чаще всего происходит через загрязненную воду или пищу. E. coli также зачастую может развивать множественную устойчивость. Escherichia coli is a representative of the normal microflora of the body, but among them there are pathogenic varieties that do not differ morphologically from non-pathogenic ones and cause Escherichiosis, most often accompanied by intoxication, fever and damage to the gastrointestinal tract. Infection most often occurs through contaminated water or food. E. coli can also often develop multiple resistance.
Различные представители рода Salmonella патогенны для человека и вызывают сальмонеллез, причем в последние годы заболеваемость сальмонеллезом сильно возросла, даже в развитых странах, так как данные бактерии активно развивают устойчивость к используемым антибиотикам. Также они могут вызывать внутрибольничные заболевания с тяжелым течением. Various representatives of the genus Salmonella are pathogens for humans and cause salmonellosis, and in recent years the incidence of salmonellosis has increased dramatically, even in developed countries, as these bacteria are actively developing resistance to the antibiotics used. They can also cause severe nosocomial illnesses.
Сложность терапии и высокая летальность говорят о высокой актуальности внедрения в практику новых эффективных методов лечения инфекций, вызванных грамотрицательными патогенами.The complexity of therapy and high mortality indicate the high relevance of the introduction into practice of new effective methods of treating infections caused by gram-negative pathogens.
Эндолизин LysECD7 в чистом виде, а также в комбинациях с различными средствами, увеличивающими проницаемость мембран, антимикробными пептидами и антимикробными средствами (в том числе антибиотиками) можно использовать в различных областях медицины, ветеринарии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности. Endolysin LysECD7 in its pure form, as well as in combination with various agents that increase membrane permeability, antimicrobial peptides and antimicrobial agents (including antibiotics) can be used in various fields of medicine, veterinary medicine, agriculture and the food industry.
Данные изобретения могут использоваться в виде подходящих лекарственных форм (раствор, аэрозоль, мазь и др.) для лечения и профилактики различных видов инфекций, вызванных чувствительными к действию эндолизина грамотрицательными бактериями. К таким инфекциям относятся эндокардит, респираторные инфекции (пневмонии), инфекции центральной нервной системы (менингит и абсцессы головного мозга), ушные и глазные инфекции (например, отит и кератит), бактериемия, инфекции кожных структур и мягких тканей (в том числе раневые и ожоговые), инфекции костей и суставов, инфекции мочевыводящих путей, инфекции желудочно-кишечного тракта и другие. Также возможно использование препаратов на основе LysECD7 для лечения пневмоний, сопутствующих муковисцидозу. При введении препарата, содержащего эффективную дозу активного вещества, местно, ингаляционно, внутримышечно, подкожно или внутривенно можно ожидать благоприятный исход течения инфекционного заболевания и быструю элиминацию патогенов.These inventions can be used in the form of suitable dosage forms (solution, aerosol, ointment, etc.) for the treatment and prevention of various types of infections caused by gram-negative bacteria sensitive to the action of endolysin. These infections include endocarditis, respiratory infections (pneumonia), central nervous system infections (meningitis and brain abscesses), ear and eye infections (such as otitis media and keratitis), bacteremia, infections of skin structures and soft tissues (including wounds and burns), infections of bones and joints, infections of the urinary tract, infections of the gastrointestinal tract, and others. It is also possible to use drugs based on LysECD7 for the treatment of pneumonia associated with cystic fibrosis. With the introduction of a preparation containing an effective dose of the active substance, topically, by inhalation, intramuscularly, subcutaneously or intravenously, a favorable outcome of the course of an infectious disease and a rapid elimination of pathogens can be expected.
Также LysECD7 можно использовать для быстрой и точной диагностики с целью определения возбудителя инфекции и своевременного начала терапии, а также для определения чувствительности различных штаммов бактерии к данным ферментам. Возможно создание различных систем детекции и биосенсоров на их основе.LysECD7 can also be used for quick and accurate diagnostics in order to identify the causative agent of the infection and the timely initiation of therapy, as well as to determine the sensitivity of various bacterial strains to these enzymes. It is possible to create various detection systems and biosensors based on them.
Одной из наиболее важных проблем в медицине является образование грамотрицательными патогенами биопленок на различных поверхностях (в том числе медицинских инструментов). Бактерии внутри биопленок значительно меньше подвержены воздействию антимикробных средств и дезинфектантов. LysECD7 в виде раствора или любых других подходящих форм можно использовать для устранения биопленок, а также для дезинфекции инструментов (особенно используемых при различных хирургических манипуляциях), материалов, аппаратуры (в том числе аппаратов для искусственной вентиляции легких) и поверхностей.One of the most important problems in medicine is the formation of biofilms by gram-negative pathogens on various surfaces (including medical instruments). Bacteria inside biofilms are much less susceptible to antimicrobial agents and disinfectants. LysECD7, in solution or any other suitable form, can be used to remove biofilms, as well as disinfect instruments (especially those used in various surgical procedures), materials, equipment (including ventilators), and surfaces.
В ветеринарии и сельском хозяйстве LysECD7 также можно использовать для лечения и профилактики инфекций животных, вызываемых чувствительными грамотрицательными бактериями. In veterinary and agricultural medicine, LysECD7 can also be used to treat and prevent animal infections with susceptible gram-negative bacteria.
В пищевой промышленности LysECD7 можно использовать для предотвращения контаминации воды и пищевых продуктов чувствительными грамотрицательными бактериями, а также для удаления биопленок и дезинфекции различных поверхностей. In the food industry, LysECD7 can be used to prevent contamination of water and food with sensitive gram-negative bacteria, as well as to remove biofilms and disinfect various surfaces.
В этом случае технический результат достигается использованием антибактериальной композиции, которая содержит эффективное количество (дозу) рекомбинантного белка LysECD7 и фармацевтически приемлемый носитель.In this case, the technical result is achieved by using an antibacterial composition that contains an effective amount (dose) of the recombinant LysECD7 protein and a pharmaceutically acceptable carrier.
Технический результат достигается также использованием антибактериальной композиции, содержащей эффективное количество эндолизина LysECD7, пермеабилизатор и фармацевтически приемлемый носитель. В качестве пермеабилизаторов могут использоваться полимиксины и их производные, аминогликозиды, этилендиаминтетрауксусная кислота и ее соли (ЭДТА), лимонная кислота и др.The technical result is also achieved by using an antibacterial composition containing an effective amount of endolysin LysECD7, a permeabilizer and a pharmaceutically acceptable carrier. Polymyxins and their derivatives, aminoglycosides, ethylenediaminetetraacetic acid and its salts (EDTA), citric acid, etc. can be used as permeabilizers.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, добавки, эксципиенты вспомогательные вещества, дисперсионные среды, солюбилизирующие агенты, покрытия, консерванты, изотонические и абсорбционные агенты, поверхностно-активные вещества, пропелленты и тому подобное, которые являются фармацевтически совместимыми. Носитель (и) должен быть «приемлемым» в плане безвредности для субъекта, которому вводят препарат на основе объектов формулы изобретения в количествах, обычно используемых в лекарственных препаратах. Фармацевтически приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами композиции без превращения композиции в непригодную для применения по назначению. Кроме того, фармацевтически приемлемые носители пригодны для использования без проявления серьезных нежелательных реакций (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция). Побочные эффекты «неоправданы», когда их риск их появления превышает преимущество от применения композиции. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов вспомогательных веществ включают в себя любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как солевые растворы, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло / вода и микроэмульсии.The term "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, additives, excipients, adjuvants, dispersion media, solubilizing agents, coatings, preservatives, isotonic and absorbent agents, surfactants, propellants, and the like that are pharmaceutically compatible. The carrier (s) must be "acceptable" in terms of harmlessness to the subject to whom the drug is administered based on the subject matter of the claims in the amounts commonly used in drugs. Pharmaceutically acceptable carriers are compatible with the other ingredients of the composition without rendering the composition unusable for its intended use. In addition, pharmaceutically acceptable carriers are suitable for use without causing serious adverse reactions (such as toxicity, irritation, and allergic reaction). Side effects are "unjustified" when their risk of occurrence outweighs the benefit from the composition. Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable carriers or excipients of excipients include any of the standard pharmaceutical carriers such as saline solutions, water, and emulsions such as oil / water emulsions and microemulsions.
Термин «эффективное количество» относится к количеству, которое при применении или назначении с соответствующей частотой приема или в определенном режиме дозирования является достаточным для предотвращения или ингибирования роста бактерий или предотвращения развития, улучшения течения, уменьшения тяжести, продолжительности или прогрессирования инфекционного заболевания, вызывает регрессию заболевания или усиливает или улучшает профилактический или терапевтический эффект другого метода лечения, такого как антимикробная терапия.The term "effective amount" refers to an amount that, when used or administered at an appropriate frequency of administration or in a specific dosage regimen, is sufficient to prevent or inhibit bacterial growth or prevent the development, improve the course, reduce the severity, duration or progression of an infectious disease, cause regression of the disease or enhances or enhances the prophylactic or therapeutic effect of another treatment, such as antimicrobial therapy.
Термин «биопленка» относится к бактериям, которые прикрепляются к поверхностям и погружены в выделяемый ими внеклеточный матрикс. Биопленка представляет собой совокупность микроорганизмов, где клетки прилипают друг к другу на какой-либо поверхности. Эти адгезивные клетки часто погружены во внеклеточный матрикс из полимерного вещества. Биопленка представляет собой полимерную конгломерацию, обычно состоящую из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.The term "biofilm" refers to bacteria that attach to surfaces and are immersed in the extracellular matrix they release. A biofilm is a collection of microorganisms where cells adhere to each other on some surface. These adherent cells are often embedded in an extracellular matrix of polymeric material. Biofilm is a polymeric conglomeration usually composed of extracellular DNA, proteins, and polysaccharides.
Иллюстрации, поясняющие сущность изобретенияIllustrations explaining the essence of the invention
На иллюстрациях приведены поясняющие графические материалы, раскрывающие сущность изобретения. Указанные материалы не ограничивают объем притязаний заявителя и должны использоваться для пояснения существа заявленного технического решения.The illustrations show explanatory graphic materials that reveal the essence of the invention. These materials do not limit the scope of the applicant's claims and should be used to explain the essence of the claimed technical solution.
На фиг. 1 приведен график, отображающий бактерицидную активность различных концентраций LysECD7 против штамма A. baumannii Ts 50-16. В качестве контроля использовали клетки бактерий, инкубированные с буфером вместо белка. Число выживших колоний после 18 часов инкубации чашек Петри выражено в виде снижения log10 КОЕ/мл по сравнению с контролем. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.FIG. 1 is a graph depicting the bactericidal activity of various concentrations of LysECD7 against A. baumannii Ts 50-16 strain. As a control, bacterial cells incubated with buffer instead of protein were used. The number of surviving colonies after 18 hours of incubation of Petri dishes is expressed as a decrease in log10 CFU / ml compared to control. For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments. An asterisk (*) indicates a significant bactericidal effect.
На фиг. 2 приведен график сравнения активности эндолизина LysECD7 в концентрациях 10 и 100 мкг/мл против штамма A. baumannii Ts 50-16 в экспоненциальной (Эксп) и стационарной (Ст) фазах роста без добавления и с добавлением 0,5 мМ ЭДТА. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.FIG. 2 shows a graph comparing the activity of endolysin LysECD7 at concentrations of 10 and 100 μg / ml against A. baumannii Ts 50-16 strain in exponential (Exp) and stationary (St) growth phases without and with addition of 0.5 mM EDTA. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. NS - there is no statistically significant difference from the control culture without the addition of endolysin (p> 0.05, Mann-Whitney test). For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments. An asterisk (*) indicates a significant bactericidal effect.
На фиг. 3 приведен график, отображающий влияние pH и 0,5 мМ ЭДТА на антимикробную активность LysECD7 в концентрации 1 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.FIG. 3 is a graph showing the effect of pH and 0.5 mM EDTA on the antimicrobial activity of LysECD7 at a concentration of 1 μg / ml against A. baumannii Ts 50-16. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. NS - there is no statistically significant difference from the control culture without the addition of endolysin (p> 0.05, Mann-Whitney test). For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments.
На фиг. 4 приведен график влияния солей на литическую активность LysECD7 в концентрации 10 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Все остальные значения статистически достоверно отличаются от контроля. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.FIG. 4 shows a graph of the effect of salts on the lytic activity of LysECD7 at a concentration of 10 μg / ml against A. baumannii Ts 50-16. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. NS - there is no statistically significant difference from the control culture without the addition of endolysin (p> 0.05, Mann-Whitney test). All other values are statistically significantly different from the control. For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments.
На фиг. 5 приведен график, отображающий бактерицидную активность LysECD7 в концентрации 50 мкг/мл против различных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. НА - не было отмечено бактерицидной активности. Все значения статистически достоверно отличаются от контрольной культуры без добавления эндолизина (p < 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.FIG. 5 is a graph depicting the bactericidal activity of LysECD7 at a concentration of 50 μg / ml against various strains of gram-negative and gram-positive bacteria. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. HA - no bactericidal activity was observed. All values were statistically significantly different from the control culture without endolysin addition (p <0.05, Mann-Whitney test). For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments.
Далее приведены аминокислотные и нуклеотидные последовательности: первая из которых аминокислотная последовательность эндолизина бактериофага ECD7 (SEQ ID NO: 1); вторая - нуклеотидная последовательность эндолизина бактериофага ECD7 (SEQ ID NO: 2); третья - аминокислотная последовательность эндолизина LysECD7, модифицированного 8-гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 3); четвертая - нуклеотидная последовательность эндолизина LysECD7, модифицированного 8-гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 4).The following are amino acid and nucleotide sequences: the first of which is the amino acid sequence of endolysin of bacteriophage ECD7 (SEQ ID NO: 1); the second - the nucleotide sequence of endolysin of the bacteriophage ECD7 (SEQ ID NO: 2); the third is the amino acid sequence of LysECD7 endolysin modified with an 8-histidine tag (SEQ ID NO: 3); the fourth is the nucleotide sequence of LysECD7 endolysin modified with an 8-histidine tag (SEQ ID NO: 4).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention
Белок LysECD7 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 4) был получен рекомбинантным путем и содержит в одной рамке трансляции гистидиновую метку (8 His). Данный фермент представляет собой модифицированный 8-гистидиновой меткой рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2) семейства Myoviridae, поражающего клетки Acinetobacter baumannii. Предсказано, что в своей структуре он содержит два домена: пептидогликан-связывающий и лизоцим-подобный каталитический (мурамидазный), что и обеспечивает бактерицидную активность по отношению к клеточным стенкам бактерий.Protein LysECD7 (amino acid sequence SEQ ID NO: 3 and nucleotide sequence SEQ ID NO: 4) was obtained recombinantly and contains a histidine tag (8 His) in one translation frame. This enzyme is an 8-histidine-tagged recombinant endolysin of bacteriophage ECD7 (amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and nucleotide sequence SEQ ID NO: 2) of the Myoviridae family, affecting Acinetobacter baumannii cells. It is predicted that in its structure it contains two domains: peptidoglycan-binding and lysozyme-like catalytic (muramidase), which provides bactericidal activity against bacterial cell walls.
С помощью динамического лазерного светорассеяния было выявлено, что LysECD7 (белок размером 25,9 кДа) находится в растворе в виде частиц размером около 5 нм, что говорит о стабильности и способности сохранять мономеры. Using dynamic laser light scattering, it was revealed that LysECD7 (protein with a size of 25.9 kDa) is in solution in the form of particles with a size of about 5 nm, which indicates stability and the ability to preserve monomers.
Что касается антимикробных свойств, было показано, что LysECD7 оказывает бактерицидное действие на экспоненциально растущий клинический штамм A. baumannii Ts 50-16 в концентрации от 0,5 мкг/мл в 20 мM Tрис HCl буфере (pH 7.5). График дозозависимого эффекта приведен на фиг. 1.With regard to antimicrobial properties, it was shown that LysECD7 has a bactericidal effect on the exponentially growing clinical strain A. baumannii Ts 50-16 at a concentration of 0.5 μg / ml in 20 mM Tris HCl buffer (pH 7.5). A dose-response plot is shown in FIG. 1.
При действии LysECD7 на бактерии в стационарной фазе роста бактерицидный эффект в концентрации белка 10 мкг/мл и 100 мкг/мл пропадает, предположительно, из-за перестройки бактериальной клеточной стенки и отсутствия эффективной пермеабилизации мембраны. При этом добавление веществ, увеличивающих проницаемость мембран, (0,5 мМ ЭДТА) способствует проявлению литического эффекта, однако, он восстанавливается лишь на 47%, а не до уровня максимальной активности, которую фермент оказывает на бактерии в экспоненциальной фазе роста (фиг. 2).Under the action of LysECD7 on bacteria in the stationary growth phase, the bactericidal effect at a protein concentration of 10 μg / ml and 100 μg / ml disappears, presumably due to the rearrangement of the bacterial cell wall and the absence of effective membrane permeabilization. At the same time, the addition of substances that increase membrane permeability (0.5 mM EDTA) promotes the manifestation of the lytic effect, however, it is restored only by 47%, and not to the level of the maximum activity that the enzyme has on bacteria in the exponential growth phase (Fig. 2 ).
Анализ in vitro антибактериальной активности при различных значениях рН (от 5,0 до 9,0) показал, что в буфере Tрис HCl наиболее оптимальными значениями являются слабокислые (5,0-6,0), а также нейтральные и слабощелочные (7,5-8,0). Однако, при рН 6,5-7,0 наблюдается некоторое снижение активности, что, предположительно, связано с изменением заряда С-конца белка, отвечающего за эффективную пермеабилизацию. Добавление 0,5 мМ ЭДТА устраняет различия в эффективности и элиминирует эффект рН, что подтверждает предположение о влиянии заряда белка на способность проникать через наружную мембрану (фиг. 3). In vitro analysis of antibacterial activity at various pH values (from 5.0 to 9.0) showed that in Tris HCl buffer, the most optimal values are weakly acidic (5.0-6.0), as well as neutral and slightly alkaline (7.5 -8.0). However, at pH 6.5-7.0, a slight decrease in activity is observed, which is presumably associated with a change in the charge of the C-terminus of the protein, which is responsible for effective permeabilization. The addition of 0.5 mM EDTA eliminates the differences in efficacy and eliminates the effect of pH, which confirms the assumption about the influence of the protein charge on the ability to penetrate the outer membrane (Fig. 3).
5 мМ натрий фосфатный буфер (pH 7.5) является отличной заменой буферу, содержащему Трис, т.к. он более физиологичен по своему составу. Добавляя к LysECD7 в этом буфере различные концентрации солей щелочных металлов (NaCl и KCl), мы оценивали их влияние на бактерицидную активность. Было показано, что, начиная с концентрации с 25 мМ для KCl и 50 мМ для NaCl, наблюдается ингибирование действия фермента. Хотя в концентрации 250 мМ для обеих солей литический эффект частично восстанавливается, достигая 70-80% от исходного уровня (фиг. 4).5 mM Sodium Phosphate Buffer (pH 7.5) is an excellent substitute for Tris containing buffer. it is more physiological in its composition. By adding various concentrations of alkali metal salts (NaCl and KCl) to LysECD7 in this buffer, we evaluated their effect on bactericidal activity. It was shown that, starting from a concentration of 25 mM for KCl and 50 mM for NaCl, inhibition of the enzyme action is observed. Although at a concentration of 250 mM for both salts, the lytic effect is partially restored, reaching 70-80% of the initial level (Fig. 4).
Широта спектра действия оценивалась на 16 штаммах грамотрицательных бактерий различных родов и видов и 2 штаммах грамположительных бактерий различного происхождения: клинические изоляты и лабораторные штаммы (Таблица 1). Было показано, что LysECD7 оказывает различный по силе бактерицидный эффект по отношению ко всем изученным штаммам, кроме грамположительного Staphylococcus aureus Z 73-14 (фиг. 5).The breadth of the spectrum of action was assessed on 16 strains of gram-negative bacteria of various genera and species and 2 strains of gram-positive bacteria of different origins: clinical isolates and laboratory strains (Table 1). It was shown that LysECD7 has a different potency bactericidal effect in relation to all studied strains, except for the gram-positive Staphylococcus aureus Z 73-14 (Fig. 5).
Таблица 1. Спектр антимикробной активности LysECD7 против грамотрицательных бактерий. + наличие эффекта, - отсутствие эффекта.Table 1. Spectrum of antimicrobial activity of LysECD7 against gram-negative bacteria. + presence of an effect, - no effect.
Таким образом, эндолизин LysECD7 без добавления различных пермеабилизаторов или ковалентно связанных пенетрирующих пептидов способен проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий и расщеплять пептидогликан, что в конечном итоге приводит к гибели бактерий. Значительное снижение количества колоний, выросших на чашках Петри, после инкубации бактерий и белка в течение небольшого количества времени, говорит о высокой активности LysECD7. Таким образом, данный эндолизин является перспективной молекулой для борьбы с патогенами группы ESKAPE.Thus, LysECD7 endolysin, without the addition of various permeabilizers or covalently linked penetrating peptides, is able to penetrate the outer membrane of gram-negative bacteria and degrade peptidoglycan, which ultimately leads to the death of bacteria. A significant decrease in the number of colonies grown on Petri dishes after incubation of bacteria and protein for a short amount of time indicates a high activity of LysECD7. Thus, this endolysin is a promising molecule for the fight against pathogens of the ESKAPE group.
Пример 1. Получение штамма бактериофага Escherichia coli ECD7 и его лизата. Example 1. Obtaining a bacteriophage strain Escherichia coli ECD7 and its lysate.
Для получения штамма бактериофага Escherichia coli ECD7, активного в отношении Escherichia coli, бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.To obtain a bacteriophage strain of Escherichia coli ECD7, active against Escherichia coli , a bacterial culture of the host strain in a titer of 10 8 CFU / ml was inoculated into a culture vessel on an oblique dense nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (37°C), затем на полученный газон культуры засевали маточный бактериофаг в титре 106 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стеклянный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре 37°C и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.The host strain was cultivated for 3 hours at the optimum temperature for its growth (37 ° C), then the uterine bacteriophage in a titer of 10 6 pfu / ml was inoculated onto the resulting culture lawn, the culture vessel (glass microbiological mattress) was hermetically sealed, and the bacteriophage was cultured in for 13 hours at an optimal temperature of 37 ° C and a layer of air thickness above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm.
Для получения фаголизата бактериофаг суспендировали с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды. Полученную жидкость отсасывали в стерильную емкость, добавляли хлороформ и выдерживали в течение 30 минут при непрерывной аэрации. Далее центрифугировали раствор в течение 30 минут при 6000 об./мин, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.To obtain phagolysate, the bacteriophage was suspended from the surface of the dense nutrient medium with physiological saline in an amount of 0.04 ml per 1 cm 2 of the surface of the dense nutrient medium. The resulting liquid was aspirated into a sterile container, chloroform was added and kept for 30 minutes with continuous aeration. Then the solution was centrifuged for 30 minutes at 6000 rpm, the supernatant was sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.2 μm, and the resulting filtrate was passed through a column containing an agent affinity for endotoxin.
Полученный элюат представлял собой очищенный фаголизат и содержал бактериофаги в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл очищенного фаголизата (ЕЭ/мл).The resulting eluate was a purified phagolysate and contained bacteriophages in a titer of 10 11 PFU / ml in the absence of bacteria, ingredients of the used culture medium and at an endotoxin concentration of less than 50 units of endotoxin per 1 ml of purified phagolysate (EU / ml).
Пример 2. Получение экспрессионного вектора, несущего кодирующую последовательность LysECD7. Example 2. Obtaining an expression vector carrying the coding sequence LysECD7.
Кодирующую последовательность эндолизина LysECD7 получали методом ПЦР-амплификации с помощью ген-специфичных праймеров (Таблица 2) из лизата бактериофагов. Полученную нуклеотидную последовательность поместили в экспрессионную кассету pET42b (+). Корректность сборки векторной конструкций проверяли методом секвенирования по Сэнгеру. Для очистки рекомбинантного продукта с помощью аффинной хроматографии, кодирующая последовательность LysECD7 была слита с последовательностью, кодирующей 8-гистидиновую метку на С-конце. The LysECD7 endolysin coding sequence was obtained by PCR amplification using gene-specific primers (Table 2) from bacteriophage lysate. The resulting nucleotide sequence was placed in the pET42b (+) expression cassette. The correctness of the assembly of the vector constructs was checked by the Sanger sequencing method. To purify the recombinant product by affinity chromatography, the LysECD7 coding sequence was fused to the C-terminus 8-histidine tag coding sequence.
Таблица 2. Последовательности праймеров, используемых для получения кодирующей последовательности LysECD7.Table 2. Sequences of primers used to obtain the coding sequence for LysECD7.
Таким образом, была получена генно-инженерная конструкция на основе вектора pET42b (+), кодирующая последовательность LysECD7, для дальнейшей экспрессии рекомбинантного фермента.Thus, a genetically engineered construct based on the pET42b (+) vector encoding the LysECD7 sequence was obtained for further expression of the recombinant enzyme.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка LysECD7 и его очистка. Example 3. Obtaining the recombinant LysECD7 protein and its purification.
Экспрессионный вектор помещали в компетентные клетки E. coli штамма BL21(DE3) pLysS с помощью протокола трансформации по методу «heat shock». The expression vector was placed into competent cells of E. coli strain BL21 (DE3) pLysS using a heat shock transformation protocol.
Клетки E. coli подращивали в среде LB (37°C, 240 rpm) до OD600 = 0,55-0,65 и проводили индукцию с помощью 1 мM ИПТГ при 37°C в течение 3 часов. Полученные клетки осаждали центрифугированием (6000 g, 10 мин, при 4°C), ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мM Трис HCl pH 8,0, 250 мM NaCl, 0,1 мM ЭДТА), инкубировали с 100 мкл/мл лизоцима при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем разрушали с помощью обработки ультразвуком. Полученный лизат центрифугировали при 10000 g в течение 30 минут при 4°C, а затем супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0.2 мкм. Очитка проводилась на хроматографе NGC Discovery™ 10 (Bio-Rad, США) с использованием колонки HisTrap FF на 5 мл (GE Healthcare, Германия), заряженной Ni2+ ионами. Лизат смешивали с 30 мM имидазола и 1 мM MgCl2 и наносили на колонку, предварительно уравновешенную с помощью буфера, содержащего 20 мM Трис HCl pH 8,0, 250 мM NaCl, 30 мM имидазола. Фракции белка элюировали с сорбента с помощью линейного градиента до 100% буфера, содержащего 20 мM Tрис HCl pH 8,0, 250 мM NaCl, 500 мM имидазола. Собранные фракции диализовали против буфера 20 мM Tрис HCl pH 7,5. Чистоту белка определяли с помощью электрофореза 16% SDS-PAGE. E. coli cells were grown in LB medium (37 ° C, 240 rpm) to OD600 = 0.55-0.65 and induction was performed with 1 mM IPTG at 37 ° C for 3 hours. The resulting cells were precipitated by centrifugation (6000 g, 10 min, at 4 ° C), resuspended in a buffer containing 20 mM Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), incubated with 100 μL / ml lysozyme at room temperature for 30 minutes and then destroyed by sonication. The resulting lysate was centrifuged at 10000 g for 30 minutes at 4 ° C, and then the supernatant was filtered through a filter with a pore size of 0.2 μm. The cleaning was carried out on an NGC Discovery ™ 10 chromatograph (Bio-Rad, USA) using a 5 ml HisTrap FF column (GE Healthcare, Germany) charged with Ni 2+ ions. The lysate was mixed with 30 mM imidazole and 1 mM MgCl 2 and loaded onto the column, pre-equilibrated with a buffer containing 20 mM Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 30 mM imidazole. Protein fractions were eluted from the sorbent using a linear gradient to 100% buffer containing 20 mM Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 500 mM imidazole. The collected fractions were dialyzed against 20 mM Tris HCl pH 7.5 buffer. Protein purity was determined by electrophoresis 16% SDS-PAGE.
Концентрацию белков определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (Implen NanoPhotometer, IMPLEN, Германия). Концентрация рассчитывалась с учетом коэффициента поглощения E0,1% 280нм.The protein concentration was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm (Implen NanoPhotometer, IMPLEN, Germany). The concentration was calculated taking into account the absorption coefficient E 0.1% 280nm .
Таким образом, рекомбинантный эндолизин LysECD7 был получен биотехнологическим путем и подготовлен для дальнейших экспериментов по оценке бактерицидной активности.Thus, the recombinant endolysin LysECD7 was obtained biotechnologically and prepared for further experiments to assess the bactericidal activity.
Пример 4. Изучение антибактериальных свойств LysECD7. Example 4. Study of the antibacterial properties of LysECD7.
Ночную культуру бактериальных клеток (OD600 = 1,2-1,4) использовали в качестве культуры бактерий в стационарной фазе роста или разбавляли в 30 раз средой LB и подращивали до экспоненциальной фазы роста (OD600 = 0,6). Клетки осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин) и ресуспендировали в таком же объеме 20 мM Tрис HCl pH 7,5. Суспензию разводили в 100 раз в том же буфере до конечной плотности около 106 клеток/мл. После 100 мкл бактериальной суспензии смешивали со 100 мкл белка в требуемой концентрации в 96-луночном планшете. В качестве отрицательного контроля использовали буфер без добавления белка. Смесь инкубировали при 37°C в течение 30 минут (на качалке 200 rpm) и затем разбавляли в 10 раз фосфатно-солевым буфером (pH 7,4). 100 мкл каждого разведения наносили на чашки Петри с агаризованной средой LB. Колонии на чашках подсчитывали после ночной инкубации (18 часов) при 37°С. Все эксперименты проводились в трех независимых повторностях.An overnight culture of bacterial cells (OD600 = 1.2-1.4) was used as a culture of bacteria in the stationary growth phase or diluted 30 times with LB medium and grown to an exponential growth phase (OD600 = 0.6). The cells were pelleted by centrifugation (3000 g, 10 min) and resuspended in the same volume of 20 mM Tris HCl pH 7.5. The suspension was diluted 100-fold in the same buffer to a final density of about 10 6 cells / ml. After 100 μl, the bacterial suspension was mixed with 100 μl of protein at the desired concentration in a 96-well plate. Buffer without added protein was used as negative control. The mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes (on a shaker 200 rpm) and then diluted 10-fold with phosphate buffered saline (pH 7.4). 100 μl of each dilution was applied to Petri dishes with LB agar medium. Colonies on the plates were counted after overnight incubation (18 hours) at 37 ° C. All experiments were carried out in three independent replicates.
Антибактериальную активность выражали в виде log10 от числа колоний, либо в виде остаточной активности LysECD7 (%) по сравнению с контролем без добавления фермента.Antibacterial activity was expressed as log10 of the number of colonies, or as residual LysECD7 activity (%) compared to the control without enzyme addition.
В ходе экспериментов по изучению антимикробных свойств LysECD7 было выявлено, что фермент оказывает бактерицидное действие на экспоненциально растущие клетки клинического штамма A. baumannii Ts 50-16 в концентрации от 0,5 мкг/мл (фиг. 1). Однако, при действии на бактерии в стационарной фазе роста бактерицидный эффект пропадает, предположительно, из-за снижения способности белка проникать сквозь наружную мембрану. При этом при добавлении веществ, увеличивающих проницаемость мембран, (0,5 мМ ЭДТА) литический эффект частично восстанавливается (фиг. 2).During experiments to study the antimicrobial properties of LysECD7, it was revealed that the enzyme has a bactericidal effect on exponentially growing cells of the clinical strain A. baumannii Ts 50-16 at a concentration of 0.5 μg / ml (Fig. 1). However, when bacteria are exposed to the stationary growth phase, the bactericidal effect disappears, presumably due to a decrease in the ability of the protein to penetrate the outer membrane. In this case, with the addition of substances that increase membrane permeability (0.5 mM EDTA), the lytic effect is partially restored (Fig. 2).
Пример 5. Изучения влияния рН, солей и буферов на активность LysECD7. Example 5. Study of the effect of pH, salts and buffers on the activity of LysECD7.
Влияние рН, солей и буферов (Трис HCl pH 7,5 и натрий или калий фосфатный буфер pH 7,5) на специфическую активность эндолизина оценивали на экспоненциально растущем штамме A. baumannii Ts 50-16. Для изучения влияния рН бактерии инкубировали с белком по вышеуказанному протоколу (Пример 3) в 20 мM Tрис HCl буфере с различными значениями рН (от 5.0 до 9.0). Эффект ЭДТА на бактерицидную активность при различных значениях pH оценивали с добавлением 0,5 мM пермеабилизатора во время инкубации бактериальной суспензии с эндолизином. При подборе оптимального для действия физиологичного буфера изучали 5, 10, 50 мM натрий или калий фосфатный буферы (pH 7,5). А для оценки влияния солей щелочных металлов к белку в 5 мM натрий фосфатном буфере (pH 7,5) добавляли различные концентрации солей NaCl или KCl (0, 10, 25, 50, 100, 150, 250 и 500 мM).The effect of pH, salts and buffers (Tris HCl pH 7.5 and sodium or potassium phosphate buffer pH 7.5) on the specific activity of endolysin was assessed on the exponentially growing A. baumannii Ts 50-16 strain. To study the effect of pH, bacteria were incubated with protein according to the above protocol (Example 3) in 20 mM Tris HCl buffer with different pH values (from 5.0 to 9.0). The effect of EDTA on bactericidal activity at different pH values was evaluated with the addition of 0.5 mM permeabilizer during incubation of the bacterial suspension with endolysin. When selecting the optimal physiological buffer for the action, 5, 10, 50 mM sodium or potassium phosphate buffers (pH 7.5) were studied. And to assess the effect of alkali metal salts on the protein in 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), various concentrations of NaCl or KCl salts (0, 10, 25, 50, 100, 150, 250 and 500 mM) were added.
Антибактериальную активность выражали в виде остаточной активности LysECD7 (%) по сравнению с контролем без добавления фермента.Antibacterial activity was expressed as residual LysECD7 activity (%) compared to the control without enzyme addition.
Было показано, что при различных значениях рН оптимальными для действия фермента являются слабокислые, а также нейтральные и слабощелочные условия. При рН 6,5-7,0 наблюдается некоторое снижение активности, однако добавление 0,5 мМ ЭДТА элиминирует эффект рН (фиг. 3).It was shown that at different pH values weakly acidic, as well as neutral and slightly alkaline conditions are optimal for the enzyme action. At pH 6.5-7.0, a slight decrease in activity is observed, however, the addition of 0.5 mM EDTA eliminates the effect of pH (Fig. 3).
Более физиологичным является 5 мМ натрий фосфатный буфер (pH 7,5). При добавлении к LysECD7 в этом буфере различных концентраций NaCl и KCl начиная с 25 мМ для KCl и 50 мМ для NaCl, наблюдалось ингибирование действия фермента. Хотя в концентрации 250 мМ для обеих солей литический эффект частично восстанавливается (фиг. 4).More physiological is 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5). When different concentrations of NaCl and KCl were added to LysECD7 in this buffer, starting from 25 mM for KCl and 50 mM for NaCl, inhibition of the enzyme action was observed. Although at a concentration of 250 mM for both salts, the lytic effect is partially restored (Fig. 4).
Пример 6. Изучения спектра активности LysECD7. Example 6. Study of the spectrum of activity of LysECD7.
Спектр активности фермента изучали по вышеуказанному протоколу в буфере 20 мM Tрис HCl (Пример 3) с использованием 16 штаммов грамотрицательных бактерий различных родов и видов и 2 штаммов грамположительных бактерий. Все использованные штаммы депонированы в коллекциях ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» и Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск).The spectrum of enzyme activity was studied according to the above protocol in a buffer of 20 mM Tris HCl (Example 3) using 16 strains of gram-negative bacteria of various genera and species and 2 strains of gram-positive bacteria. All used strains were deposited in the collections of the National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamalei ”and the State Collection of Pathogenic Microorganisms and Cell Cultures (GKPM-Obolensk).
Таблица 3. Использованные в исследовании бактериальные штаммы и клинические изоляты и их источник получения.Table 3. Bacterial strains and clinical isolates used in the study and their source.
Антибактериальную активность выражали в виде остаточной активности LysECD7 (%) по сравнению с контролем без добавления фермента.Antibacterial activity was expressed as residual LysECD7 activity (%) compared to the control without enzyme addition.
Было показано, что LysECD7 оказывает бактерицидный эффект по отношению ко всем изученным штаммам, кроме грамположительного Staphylococcus aureus Z 73-14 (фиг. 5).It was shown that LysECD7 has a bactericidal effect against all strains studied, except for the gram-positive Staphylococcus aureus Z 73-14 (Fig. 5).
На фигуре 1 показана бактерицидная активность различных концентраций LysECD7 против штамма A. baumannii Ts 50-16. В качестве контроля использовали клетки бактерий, инкубированные с буфером вместо белка. Число выживших колоний после 18 часов инкубации чашек Петри выражено в виде снижения log10 КОЕ/мл по сравнению с контролем. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.Figure 1 shows the bactericidal activity of various concentrations of LysECD7 against A. baumannii Ts 50-16 strain. As a control, bacterial cells incubated with buffer instead of protein were used. The number of surviving colonies after 18 hours of incubation of Petri dishes is expressed as a decrease in log10 CFU / ml compared to control. For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments. An asterisk (*) indicates a significant bactericidal effect.
На фигуре 2 показана бактерицидная актерицидная активность эндолизина LysECD7 в концентрациях 10 и 100 мкг/мл против штамма A. baumannii Ts 50-16 в экспоненциальной (Эксп) и стационарной (Ст) фазах роста без добавления и с добавлением 0,5 мМ ЭДТА. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.Figure 2 shows the bactericidal actericidal activity of endolysin LysECD7 at concentrations of 10 and 100 μg / ml against A. baumannii Ts 50-16 strain in exponential (Exp) and stationary (St) growth phases without and with addition of 0.5 mM EDTA. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. NS - there is no statistically significant difference from the control culture without the addition of endolysin (p> 0.05, Mann-Whitney test). For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments. An asterisk (*) indicates a significant bactericidal effect.
На фигуре 3 показано влияние pH и 0,5 мМ ЭДТА на антимикробную активность LysECD7 в концентрации 1 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.Figure 3 shows the effect of pH and 0.5 mM EDTA on the antimicrobial activity of LysECD7 at a concentration of 1 μg / ml against A. baumannii Ts 50-16. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. NS - there is no statistically significant difference from the control culture without the addition of endolysin (p> 0.05, Mann-Whitney test). For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments.
На фигуре 4 показано влияние солей на литическую активность LysECD7 в концентрации 10 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Все остальные значения статистически достоверно отличаются от контроля. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.Figure 4 shows the effect of salts on the lytic activity of LysECD7 at a concentration of 10 μg / ml against A. baumannii Ts 50-16. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. NS - there is no statistically significant difference from the control culture without the addition of endolysin (p> 0.05, Mann-Whitney test). All other values are statistically significantly different from the control. For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments.
На фигуре 5 показана бактерицидная активность LysECD7 в концентрации 50 мкг/мл против различных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. НА - не было отмечено бактерицидной активности. Все значения статистически достоверно отличаются от контрольной культуры без добавления эндолизина (p < 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.Figure 5 shows the bactericidal activity of LysECD7 at a concentration of 50 μg / ml against various strains of gram-negative and gram-positive bacteria. The residual enzyme activity (%) is shown in comparison with the control. HA - no bactericidal activity was observed. All values were statistically significantly different from the control culture without endolysin addition (p <0.05, Mann-Whitney test). For all experiments, mean values of standard deviations are shown after three independent experiments.
Список литературыList of references
Abdelkader K. et al. The Preclinical and Clinical Progress of Bacteriophages and Their Lytic Enzymes: The Parts are Easier than the Whole // Viruses. - 2019. - Vol.11. - P.96.Abdelkader K. et al. The Preclinical and Clinical Progress of Bacteriophages and Their Lytic Enzymes: The Parts are Easier than the Whole // Viruses. - 2019. - Vol.11. - P.96.
Briers Y, Walmagh M, Lavigne R. Use of bacteriophage endolysin EL188 and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa // J. Appl. Microbiol. - 2011. - Vol.110, №3. - P.778-785.Briers Y, Walmagh M, Lavigne R. Use of bacteriophage endolysin EL188 and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa // J. Appl. Microbiol. - 2011. - Vol.110, No. 3. - P.778-785.
Briers Y. et al. Art-175 is a highly efficient antibacterial against multidrug-resistant strains and persisters of Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents Chemother. - 2014. - Vol.58, №7. - P.3774-3784.Briers Y. et al. Art-175 is a highly efficient antibacterial against multidrug-resistant strains and persisters of Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents Chemother. - 2014. - Vol.58, No. 7. - P.3774-3784.
Briers Y. et al. Engineered endolysin-based “Artilysins” to combat multidrug-resistant gram-negative pathogens // mBio. - 2014. - Vol.5, №4. - e01379-14.Briers Y. et al. Engineered endolysin-based “Artilysins” to combat multidrug-resistant gram-negative pathogens // mBio. - 2014. - Vol.5, No. 4. - e01379-14.
Dong H. et al. Activity of Stenotrophomonas maltophilia Endolysin P28 against both Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria // Front Microbiol. - 2015. - Vol.6. - P.1299.Dong H. et al. Activity of Stenotrophomonas maltophilia Endolysin P28 against both Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria // Front Microbiol. - 2015. - Vol.6. - P.1299.
Fischetti V.A. Bacteriophage endolysins: A novel anti-infective to control Gram-positive pathogens // Int. J. Med. Microbiol. - 2010. - Vol.300, №6. - P.357-362.Fischetti V.A. Bacteriophage endolysins: A novel anti-infective to control Gram-positive pathogens // Int. J. Med. Microbiol. - 2010. - Vol.300, No. 6. - P.357-362.
Guo M. et al. A Novel Antimicrobial Endolysin, LysPA26, against Pseudomonas aeruginosa // Front Microbiol. - 2017. - Vol.8. - P.293.Guo M. et al. A Novel Antimicrobial Endolysin, LysPA26, against Pseudomonas aeruginosa // Front Microbiol. - 2017. - Vol.8. - P.293.
Huang G. et al. Antibacterial properties of Acinetobacter baumannii phage Abp1 endolysin (PlyAB1) // BMC Infectious Diseases. - 2014. - Vol.14. - P.681.Huang G. et al. Antibacterial properties of Acinetobacter baumannii phage Abp1 endolysin (PlyAB1) // BMC Infectious Diseases. - 2014. - Vol.14. - P.681.
Lai M.-J. et al. Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phage 6AB2 endolysin (LysAB2) against both Gram-positive and Gram-negative bacteria // Appl Microbiol Biotechnol. - 2011. - Vol.90. - P.529-539.Lai M.-J. et al. Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phage 6AB2 endolysin (LysAB2) against both Gram-positive and Gram-negative bacteria // Appl Microbiol Biotechnol. - 2011. - Vol.90. - P.529-539.
Larpin Y. et al. In vitro characterization of PlyE146, a novel phage lysin that targets Gram-negative bacteria // PLoS ONE. - 2018. - Vol.13, №2. - e0192507.Larpin Y. et al. In vitro characterization of PlyE146, a novel phage lysin that targets Gram-negative bacteria // PLoS ONE. - 2018. - Vol.13, No. 2. - e0192507.
Matsuzaki S. et al. Bacteriophage therapy: a revitalized therapy against bacterial infectious diseases // J Infect Chemother. - 2005. - Vol.11. - P.211-219.Matsuzaki S. et al. Bacteriophage therapy: a revitalized therapy against bacterial infectious diseases // J Infect Chemother. - 2005. - Vol.11. - P.211-219.
Oliveira H. et al. Phage-Derived Peptidoglycan Degrading Enzymes: Challenges and Future Prospects for In Vivo Therapy // Viruses. - 2018. - Vol.10. - P.292.Oliveira H. et al. Phage-Derived Peptidoglycan Degrading Enzymes: Challenges and Future Prospects for In Vivo Therapy // Viruses. - 2018. - Vol.10. - P.292.
Prestinaci F., Pezzotti P., Pantosti A. Antimicrobial resistance: a global multifaceted phenomenon // Pathog. Glob. Health. - 2015. - Vol.109, №7. - P.309-318. Prestinaci F., Pezzotti P., Pantosti A. Antimicrobial resistance: a global multifaceted phenomenon // Pathog. Glob. Health. - 2015. - Vol.109, No. 7. - P.309-318.
Rodríguez-Rubio L. et al. Phage lytic proteins: biotechnological applications beyond clinical antimicrobials // Crit. Rev. Biotechnol. - 2016. - Vol.36, №10. - P.542-552.Rodríguez-Rubio L. et al. Phage lytic proteins: biotechnological applications beyond clinical antimicrobials // Crit. Rev. Biotechnol. - 2016. - Vol.36, No. 10. - P.542-552.
World Health Organization. Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. - Geneva: WHO, 2017. - 7p.World Health Organization. Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. - Geneva: WHO, 2017 .-- 7p.
Международный патент № 2011134998 A1, 03.11.2011.International patent No. 2011134998 A1, 03.11.2011.
Международный патент № 2015071437 A1, 21.05.2015.International patent No. 2015071437 A1, May 21, 2015.
Патент РФ № 2112800, 29.03.1996.RF patent No. 2112800, 03/29/1996.
Патент РФ № 2113476, 29.03.1996.RF patent No. 2113476, 29.03.1996.
Патент РФ № 2412243, 16.06.2009.RF patent No. 2412243, 16.06.2009.
Патент РФ № 2439151, 24.06.2010.RF patent No. 2439151, 24.06.2010.
Патент РФ № 2455355, 19.04.2011.RF patent No. 2455355, 19.04.2011.
Патент РФ № 2455355, 29.04.2011.RF patent No. 2455355, 29.04.2011.
Патент РФ № 2518303, 29.06.2012.RF patent No. 2518303, 29.06.2012.
Патент РФ № 2628312, 16.03.2015.RF patent No. 2628312, 03.16.2015.
Патент РФ № 2662985, 28.12.2015.RF patent No. 2662985, 28.12.2015.
Патент США № 20160281074 A1, 29.09.2016.US patent No. 20160281074 A1, 09/29/2016.
Патент США № 8846865 B2, 30.09.2014.US patent No. 8846865 B2, 30.09.2014.
Патент США № 8846865 B2, 30.09.2014.US patent No. 8846865 B2, 30.09.2014.
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD AFKQAGRELG VSVEWGGDWV SFKDGVHFQL 120
PHSKYPDPK 129 MFKLSQRSKD RLVGVHPDLV KVVHRALELT
RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD
PHSKYPDPK 129
AAAGTCGTTC ATCGTGCATT AGAACTGACT CCGGTCGATT TTGGTATTAC GGAAGGTGTA 120
CGTAGTCTAG AAACGCAAAA GAAATATGTT GCGGAAGGTA AATCTAAGAC TATGAAATCT 180
CGTCATCTTC ACGGTTTAGC GGTTGACGTT GTAGCGTATC CGAAAGATAA GGATACATGG 240
AACATGAAAT ACTACCGCAT GATCGCGGAT GCATTTAAAC AAGCTGGTCG AGAATTGGGT 300
GTTTCTGTTG AATGGGGTGG GGATTGGGTA TCGTTTAAAG ACGGTGTTCA TTTTCAGCTA 360
CCACACAGCA AATACCCAGA TCCAAAATAA 390 ATGTTTAAAT TATCTCAAAG AAGCAAAGAT
AAAGTCGTTC ATCGTGCATT AGAACTGACT
CGTAGTCTAG AAACGCAAAA GAAATATGTT GCGGAAGGTA AATCTAAGAC TATGAAATCT 180
CGTCATCTTC ACGGTTTAGC GGTTGACGTT GTAGCGTATC CGAAAGATAA GGATACATGG 240
AACATGAAAT ACTACCGCAT GATCGCGGAT GCATTTAAAC AAGCTGGTCG AGAATTGGGT 300
GTTTCTGTTG AATGGGGTGG GGATTGGGTA TCGTTTAAAG ACGGTGTTCA TTTTCAGCTA 360
CCACACAGCA AATACCCAGA TCCAAAATAA 390
RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD AFKQAGRELG VSVEWGGDWV SFKDGVHFQL 120
PHSKYPDPKL EHHHHHHHH 139 MFKLSQRSKD RLVGVHPDLV KVVHRALELT
RHLHGLAVDV VAYPKDKDTW NMKYYRMIAD
PHSKYPDPKL EHHHHHHHH 139
AAAGTCGTTC ATCGTGCATT AGAACTGACT CCGGTCGATT TTGGTATTAC GGAAGGTGTA 120
CGTAGTCTAG AAACGCAAAA GAAATATGTT GCGGAAGGTA AATCTAAGAC TATGAAATCT 180
CGTCATCTTC ACGGTTTAGC GGTTGACGTT GTAGCGTATC CGAAAGATAA GGATACATGG 240
AACATGAAAT ACTACCGCAT GATCGCGGAT GCATTTAAAC AAGCTGGTCG AGAATTGGGT 300
GTTTCTGTTG AATGGGGTGG GGATTGGGTA TCGTTTAAAG ACGGTGTTCA TTTTCAGCTA 360
CCACACAGCA AATACCCAGA TCCAAAACTC GAGCACCACC ACCACCACCA CCACCACTAA 420 ATGTTTAAAT TATCTCAAAG AAGCAAAGAT
AAAGTCGTTC ATCGTGCATT AGAACTGACT
CGTAGTCTAG AAACGCAAAA GAAATATGTT GCGGAAGGTA AATCTAAGAC TATGAAATCT 180
CGTCATCTTC ACGGTTTAGC GGTTGACGTT GTAGCGTATC CGAAAGATAA GGATACATGG 240
AACATGAAAT ACTACCGCAT GATCGCGGAT GCATTTAAAC AAGCTGGTCG AGAATTGGGT 300
GTTTCTGTTG AATGGGGTGG GGATTGGGTA TCGTTTAAAG ACGGTGTTCA TTTTCAGCTA 360
CCACACAGCA AATACCCAGA TCCAAAACTC GAGCACCACC ACCACCACCA CCACCACTAA 420
<---<---
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019114137A RU2730615C1 (en) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against gram-negative bacteria: pseudomonas aeruginosa, acinetobacter baumannii, klebsiella pneumoniae and salmonella typhi (embodiments) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019114137A RU2730615C1 (en) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against gram-negative bacteria: pseudomonas aeruginosa, acinetobacter baumannii, klebsiella pneumoniae and salmonella typhi (embodiments) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2730615C1 true RU2730615C1 (en) | 2020-08-24 |
Family
ID=72237851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019114137A RU2730615C1 (en) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against gram-negative bacteria: pseudomonas aeruginosa, acinetobacter baumannii, klebsiella pneumoniae and salmonella typhi (embodiments) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2730615C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114807104A (en) * | 2022-04-11 | 2022-07-29 | 西南大学 | Klebsiella pneumoniae phage lyase and its preparation method and application |
| RU2781050C1 (en) * | 2021-09-28 | 2022-10-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Bactericidal pharmaceutical composition for topical application in the form of an endolysin-containing bactericidal gel |
| EP4297767A4 (en) * | 2021-02-25 | 2024-08-07 | Intron Biotechnology, Inc. | ANTIBACTERIAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF GRAM-NEGATIVE BACTERIAL INFECTIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2518303C2 (en) * | 2012-06-29 | 2014-06-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | ANTIBACTERIAL COMPOSITION, STRAIN OF BACTERIOPHAGE Escherichia coli, USED FOR OBTAINING THEREOF |
| US8846865B2 (en) * | 2009-08-24 | 2014-09-30 | Lysando Ag | Endolysin OBPgpLYS |
-
2019
- 2019-05-08 RU RU2019114137A patent/RU2730615C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8846865B2 (en) * | 2009-08-24 | 2014-09-30 | Lysando Ag | Endolysin OBPgpLYS |
| RU2518303C2 (en) * | 2012-06-29 | 2014-06-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | ANTIBACTERIAL COMPOSITION, STRAIN OF BACTERIOPHAGE Escherichia coli, USED FOR OBTAINING THEREOF |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| БД "GenBank" последовательность под номером NC_041936, размещена 01.03.2017. * |
| БД "UniProtKB" последовательность под номером A0A220NTE5, размещена 25.10.2017. * |
| БД "UniProtKB" последовательность под номером A0A220NTE5, размещена 25.10.2017. БД "GenBank" последовательность под номером NC_041936, размещена 01.03.2017. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4297767A4 (en) * | 2021-02-25 | 2024-08-07 | Intron Biotechnology, Inc. | ANTIBACTERIAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF GRAM-NEGATIVE BACTERIAL INFECTIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| RU2781050C1 (en) * | 2021-09-28 | 2022-10-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Bactericidal pharmaceutical composition for topical application in the form of an endolysin-containing bactericidal gel |
| RU2790481C1 (en) * | 2021-09-28 | 2023-02-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Antibacterial composition based on endolysins and drugs in form of gel or spray, using it |
| CN114807104A (en) * | 2022-04-11 | 2022-07-29 | 西南大学 | Klebsiella pneumoniae phage lyase and its preparation method and application |
| CN114807104B (en) * | 2022-04-11 | 2024-02-20 | 西南大学 | Klebsiella pneumoniae phage lytic enzyme and its preparation method and application |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102575240B (en) | new endolysin OBPgpLYS | |
| JP6034187B2 (en) | Antimicrobial agent | |
| US7758856B2 (en) | Bacteriophage for the treatment of bacterial biofilms | |
| JP6769871B2 (en) | E. Treatment with coli-infected phage | |
| CN108697744B (en) | Phage therapy for pseudomonas infection | |
| CN101977616B (en) | Method for producing a mixture of bacteriophages and the use thereof in the therapy of antibiotic-resistant staphylococci | |
| JP2016208985A (en) | Methods for reducing biofilms | |
| US12280080B2 (en) | Antibacterial composition and uses thereof | |
| US20150231199A1 (en) | Peptides and their uses | |
| JP2017534684A (en) | Phage therapy | |
| Lim et al. | Eradication of drug-resistant Acinetobacter baumannii by cell-penetrating peptide fused endolysin | |
| RU2730615C1 (en) | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against gram-negative bacteria: pseudomonas aeruginosa, acinetobacter baumannii, klebsiella pneumoniae and salmonella typhi (embodiments) | |
| CN107922461A (en) | Wide spectrum anti-infective peptides | |
| US10499655B2 (en) | Reagents and methods for inhibiting or disrupting biofilm | |
| US10435671B2 (en) | Bacteriophage strains against proteus mirabilis and use thereof | |
| RU2628312C2 (en) | Antibacterial composition for prevention or treatment of hospital infections (versions), bacteriophage stamps used to obtain such composition | |
| RU2730613C1 (en) | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against bacteria pseudomonas aeruginosa, klebsiella pneumoniae, escherichia coli, salmonella typhi and staphylococcus haemolyticus (embodiments) | |
| RU2730614C1 (en) | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as antimicrobial agent directed against bacteria pseudomonas aeruginosa, klebsiella pneumoniae, escherichia coli, salmonella typhi and staphylococcus haemolyticus (embodiments) | |
| RU2730616C1 (en) | Antibacterial composition (embodiments) and use of protein as an antimicrobial agent directed against acinetobacter baumannii bacteria, (embodiments) | |
| US20040146490A1 (en) | Antibacterial therapy for multi-drug resistant bacteria | |
| US20220024992A1 (en) | Compositions and methods comprising lysocins as bioengineered antimicrobials for use in targeting gram-negative bacteria | |
| WO2016146037A1 (en) | Inhibitor used to inhibit/disintegrate biofilm and application thereof | |
| RU2703043C1 (en) | Bacteriophage lytic enzyme and antibacterial composition based thereon | |
| RU2813626C1 (en) | Modified endolysin and antibacterial compositions based thereon for treating infections caused by acinetobacter baumannii, pseudomonas aeruginosa, klebsiella pneumoniae, escherichia coli bacteria | |
| Homem et al. | Potential biomolecules of microbial origin against infectious diseases |