RU2728870C2 - Polypeptides for treating oncological diseases - Google Patents
Polypeptides for treating oncological diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2728870C2 RU2728870C2 RU2017136183A RU2017136183A RU2728870C2 RU 2728870 C2 RU2728870 C2 RU 2728870C2 RU 2017136183 A RU2017136183 A RU 2017136183A RU 2017136183 A RU2017136183 A RU 2017136183A RU 2728870 C2 RU2728870 C2 RU 2728870C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ras
- gtpase
- peptide
- cells
- inhibitor
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 148
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 4
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 title abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 55
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 36
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 148
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 129
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 117
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 72
- 229940122242 GTPase inhibitor Drugs 0.000 description 62
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 49
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 40
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 37
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 36
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 17
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 16
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 16
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 12
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 11
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 7
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 6
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 5
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 3
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 101100193693 Kirsten murine sarcoma virus K-RAS gene Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000699762 Homo sapiens RNA 3'-terminal phosphate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229930191425 arganine Natural products 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 125000001844 prenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108010077182 raf Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000009929 raf Kinases Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108010007508 Farnesyltranstransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000007317 Farnesyltranstransferase Human genes 0.000 description 1
- 101150012162 H-RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 102000001291 MAP Kinase Kinase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108060006687 MAP kinase kinase kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000003149 breast fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010050749 geranylgeranyltransferase type-I Proteins 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003528 protein farnesyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к новым последовательностям полипептида, способного ингибировать активность RAS-ГТФазы, включающего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или любой другой фрагмент длиной не менее 6 из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1 или, по меньшей мере, на 60% идентичной ей последовательности.The present invention relates to the field of biotechnology and medicine, in particular, to new sequences of a polypeptide capable of inhibiting the activity of RAS-GTPase, comprising a functional fragment and a transport sequence, the functional fragment comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and / or any other fragment of length at least 6 of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, or at least 60% identical to the sequence.
Изобретение также относится к применению вышеуказанного полипептида для ингибирования сигнального пути MAPK/ERK, который гиперактивирован при многих онкологических заболеваниях, а также приготовления лекарственного средства для лечения злокачественной или доброкачественной опухоли.The invention also relates to the use of the above polypeptide for inhibiting the MAPK / ERK signaling pathway, which is overactive in many cancers, as well as the preparation of a medicament for the treatment of a malignant or benign tumor.
Уровень техникиState of the art
Ras самый распространенный онкоген опухолей человека, на который не действует ни один из зарегистрированных препаратов. Мутации генов Ras-GTP, приводящие к гиперактивации сигнального пути MAPK/ERK, встречаются в 25% всех опухолей человека. Мутации приводят к тому, что Ras-киназа постоянно находится в комплексе с GTP. Двойной комплекс Ras-GTP с высокой афинностью связывает Raf-киназу, в результате чего образуется активный тройной комплекс Ras-Raf-GTP, который фосфорилирует МЕК киназу и, тем самым, передает сигнал дальше по каскаду киназ, активируя пролиферативную активность. Сигналы, передаваемые по сигнальному пути RAS/MAPK/ERK, определяют активность опухолевой клетки, способность к росту, метастазированию, а также определяют сроки жизни раковых клеток. Выделенный полипептид связывается с активным комплексов Ras-GTP по сайту связывания Raf-киназы и препятствует образованию активного тройного комплекса Ras-Raf-GTP, тем самым, ингибируя сигнальный путь MAPK/ERK, вызывает остановку пролиферации и/или элиминацию клетки путем апоптоза.Ras is the most common human tumor oncogene, which is not affected by any of the registered drugs. Mutations in the Ras-GTP genes, leading to hyperactivation of the MAPK / ERK signaling pathway, occur in 25% of all human tumors. Mutations lead to the fact that Ras kinase is constantly in a complex with GTP. The double Ras-GTP complex binds Raf-kinase with high affinity, resulting in the formation of an active triple complex Ras-Raf-GTP, which phosphorylates MEK kinase and, thereby, transmits the signal further along the kinase cascade, activating proliferative activity. Signals transmitted along the RAS / MAPK / ERK signaling pathway determine the activity of a tumor cell, the ability to grow, metastasize, and also determine the life span of cancer cells. The isolated polypeptide binds to the active Ras-GTP complexes at the Raf-kinase binding site and prevents the formation of an active Ras-Raf-GTP triple complex, thereby inhibiting the MAPK / ERK signaling pathway, causing the arrest of proliferation and / or cell elimination by apoptosis.
Ключевая реакция активации Ras и дальнейшей передачи им сигнала заключается в связывании GTP. Поэтому активно исследовались подходы для воздействия именно на G-домен Ras. Эти подходы были основаны на попытках увеличении скорости гидролиза мутантной формы Ras (1,2) ингибировании обмена GDP-GTP (3, 4).The key response to Ras activation and further signaling is GTP binding. Therefore, approaches for influencing the Ras G-domain have been actively studied. These approaches were based on attempts to increase the rate of hydrolysis of the mutant form of Ras (1,2) by inhibiting the exchange of GDP-GTP (3, 4).
Большая частота мутаций Ras при злокачественных заболеваниях делает его привлекательной мишенью для противоопухолевой терапии. Способы достижения этой цели могут быть основаны на ингибировании ферментов посттрансляционной модификации Ras-белка. Наиболее частой мишенью для достижения этой цели являются фарнезилтрансфераза и геранил-геранилтрансфераза 1 (geranyl geranyl transferase I), которые участвуют в присоединении прениловой группы к аминокислотным остаткам ras белка. (Prenylation - процесс переноса прениловой группы (15-carbon farnesylor 20-carbon geranyl-geranyl) на цистеиновый остаток Ras на егоС-конце.) Описан ингибитор FTI - показавший себя как потенциальный кандидат в качестве противоопухолевого агента при Ras-активированных вариантах опухолей (5, 6, 7). Несмотря на то, что FTI проявил активность в отношении вариантов рака с мутациями H-RAS и N-RAS он оказался не активным в отношении опухолей с мутантными вариантами K-RAS. Поэтому, несмотря на то, что ряд ингибиторов фарнезилтрансферазы показали обнадеживающую противоопухолевую активность, необходимы поиски средств ингибирования мутантных форм K-RAS.The high frequency of Ras mutations in malignant diseases makes it an attractive target for anticancer therapy. Methods for achieving this goal can be based on the inhibition of enzymes of post-translational modification of the Ras protein. The most common targets for achieving this goal are farnesyltransferase and geranyl geranyl transferase I, which are involved in attaching the prenyl group to the amino acid residues of the ras protein. (Prenylation is the process of transferring a prenyl group (15-carbon farnesylor 20-carbon geranyl-geranyl) to the Ras cysteine residue at its C-terminus.) An FTI inhibitor has been described, which has shown itself as a potential candidate as an antitumor agent in Ras-activated variants of tumors (5 , 6, 7). Despite the fact that FTI was active against cancers with H-RAS and N-RAS mutations, it was inactive against tumors with mutant K-RAS variants. Therefore, despite the fact that a number of farnesyltransferase inhibitors have shown promising antitumor activity, it is necessary to search for means of inhibiting mutant forms of K-RAS.
В работе, появившейся в 2015 году (8), описывается использование пептидов для ингибирования Ras-GTP. Авторы провели компьютерный анализ пептидной библиотеки и выявили несколько циклических пептидов, обладающих свойствами ингибирования Ras и интернализации. Действие этих пептидов на клетки приводило к активации апотоза. Исследования in vivo авторами не проводилось.A work that appeared in 2015 (8) describes the use of peptides to inhibit Ras-GTP. The authors conducted a computer analysis of the peptide library and identified several cyclic peptides with Ras inhibition and internalization properties. The action of these peptides on cells led to the activation of apotosis. In vivo studies were not carried out by the authors.
Дополнительным мотивом к поиску технологий применения естественных белковых ингибиторов пролиферации стало открытие коротких последовательностей аминокислот (n=15-30), способных выполнять векторные (транспортные) функции в отношении пептидных последовательностей и соединений другой химической природы (РНК, ДНК) (9).An additional motive for the search for technologies for the use of natural protein inhibitors of proliferation was the discovery of short amino acid sequences (n = 15-30) capable of performing vector (transport) functions in relation to peptide sequences and compounds of a different chemical nature (RNA, DNA) (9).
До настоящего времени проблему восстановления нарушенной функции внутриклеточных белков пытались решать на основе методов доставки гена (генная терапия) (10). Однако эта технология до настоящего времени не получила широкого выхода в клиническую практику из-за ряда принципиальных проблем.Until now, attempts have been made to solve the problem of restoring the impaired function of intracellular proteins based on methods of gene delivery (gene therapy) (10). However, this technology has not yet been widely used in clinical practice due to a number of fundamental problems.
Альтернативный способ решения этой задачи, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы.An alternative way to solve this problem, based on the technology of peptide vectors that have the ability to penetrate into cells without damaging the plasma membrane, is very promising due to the weak immunogenicity of such compounds and the ability to transfer large enough molecules.
Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул имеющих патогенетическую направленность (11). Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной возможности создания индивидуальных химиопрепаратов на их основе, т.е. влияющих на патологические изменения свойственных данной конкретной опухоли (Perea S.E. и др., 2004).The combination of the possibility of targeted delivery of peptides into the cell and the detection of short functional domains in proteins regulating various cellular functions created the prerequisites for the design of molecules with a pathogenetic orientation (11). The relative simplicity of the synthesis of such molecules allows us to speak of the fundamental possibility of creating individual chemotherapy drugs based on them, i.e. affecting the pathological changes inherent in this particular tumor (Perea S.E. et al., 2004).
Открытие пептидов, способных проникать в клетку без участия мембранных белков и способных осуществлять внутриклеточный транспорт связанных с ними белковых фрагментов и олигонуклеотидов открывает новый этап в развитии биологии и медицины. Одним из эффективных переносчиков крупных молекул внутрь клеток является пептид pAntp. Его свойства известны, в частности, из публикаций Derossi D. et al.. The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes. // J. Biol. Chem. 269 (1994) 10444-10450 и Morris MC. et al. A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells. // Nat. Biotechnology. 19 (2001) 1173-1176.The discovery of peptides that can penetrate into a cell without the participation of membrane proteins and are capable of intracellular transport of protein fragments and oligonucleotides associated with them opens a new stage in the development of biology and medicine. One of the effective carriers of large molecules into cells is the pAntp peptide. Its properties are known, in particular, from the publications of Derossi D. et al .. The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes. // J. Biol. Chem. 269 (1994) 10444-10450 and Morris MC. et al. A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells. // Nat. Biotechnology. 19 (2001) 1173-1176.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей изобретения является создание нового химерного пептида, обладающего повышенным терапевтическим действием и не требующего сложной и трудоемкой схемы его получения.The objective of the invention is to create a new chimeric peptide that has an increased therapeutic effect and does not require a complex and time-consuming scheme for its preparation.
Техническим результатом настоящего изобретения является медико-биологический эффект, объективно проявляющийся в выраженном цитотоксическом действии указанного полипептида на опухолевые клетки таких заболеваний, как колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка рак яичника, миеломы, злокачественной лимфомы, а также фиброаденомы молочной железы, кроме того упрощение схемы получения химерного пептида за счет уменьшения общего количества стадий. Дополнительными техническими результатами являются возможность ингибировать белок-белковое взаимодействие, а также ингибировать мутантные формы K-RAS.The technical result of the present invention is a biomedical effect, objectively manifested in the pronounced cytotoxic effect of the specified polypeptide on tumor cells of diseases such as colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, cancer prostate cancer, stomach cancer, ovarian cancer, myeloma, malignant lymphoma, as well as breast fibroadenoma, in addition, simplification of the scheme for obtaining a chimeric peptide by reducing the total number of stages. Additional technical results are the ability to inhibit protein-protein interaction, as well as inhibit mutant forms of K-RAS.
Технический результат достигается благодаря получению полипептида с антипролиферативной активностью, а именно, способного ингибировать активность RAS-ГТФазы, содержащего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или любой другой фрагмент длиной не менее 6 из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1 или, по меньшей мере, на 60% идентичной ей последовательности.The technical result is achieved by obtaining a polypeptide with antiproliferative activity, namely, capable of inhibiting the activity of RAS-GTPase, containing a functional fragment and a transport sequence, while the functional fragment includes the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and / or any other fragment of at least 6 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or at least 60% sequence identical to it.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду с антипролиферативной активностью, а именно, способного ингибировать активность RAS-ГТФазы, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее фрагмент, длиной не менее 6 аминокислот, или по меньшей мере на 60% идентичную ей последовательность.In one embodiment, the present invention provides a polypeptide with antiproliferative activity, namely, capable of inhibiting RAS-GTPase activity, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, at least 6 amino acids in length, or at least 60% identical her consistency.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду с антипролиферативной активностью, а именно, способного ингибировать активность RAS-ГТФазы, содержащему функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the present invention relates to a polypeptide with antiproliferative activity, namely, capable of inhibiting RAS-GTPase activity, comprising a functional fragment and a transport sequence, the functional fragment comprising an amino acid sequence at least 60% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду с антипролиферативной активностью, при этом между функциональным фрагментом и транспортной последовательностью могут быть вставки различной химической природы.In one embodiment, the present invention relates to a polypeptide with antiproliferative activity, whereby there may be insertions of different chemical nature between the functional fragment and the transport sequence.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному пептиду с антипролиферативной активностью, содержащему функциональный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.In one preferred embodiment, the present invention relates to a chimeric peptide with antiproliferative activity, comprising a functional fragment comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или любой другой фрагмент длиной не менее 6 из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1 или, по меньшей мере, на 60% идентичной ей последовательности.In one embodiment, the present invention provides a functional peptide with antiproliferative activity comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and / or any other fragment of at least 6 amino acids in length from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or at least 60% identical sequence.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду, включающему аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60% идентичную последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1.In one embodiment, the present invention provides a functional peptide comprising an amino acid sequence at least 60% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.In one preferred embodiment, the present invention relates to a functional peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению указанного химерного пептида или функционального фрагмента для ингибирования активности RAS-ГТФазы.In another embodiment, the present invention relates to the use of said chimeric peptide or functional fragment for inhibiting RAS-GTPase activity.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению указанного химерного пептида или функционального фрагмента для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения онкологических заболеваний.In another embodiment, the present invention relates to the use of said chimeric peptide or functional fragment for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному пептиду или функциональному фрагменту, который может быть использован для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, включающей, колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.In one preferred embodiment, the present invention relates to a chimeric peptide or functional fragment that can be used to treat a cancer selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer. glands, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer, ovarian cancer, myeloma, and malignant lymphoma.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования сигнального пути MAPK/ERK с использованием химерного пептида или функционального фрагмента.In another embodiment, the present invention relates to a method for inhibiting the MAPK / ERK signaling pathway using a chimeric peptide or functional fragment.
Используемый в настоящем документе термин «химерный пептид» включает в себя пептид, имеющий определенную последовательность связывания функционального и транспортного фрагментов в химерной пептидной молекуле, дополнительно для связывания может использоваться любая последовательность любой длины, в том числе посредством дополнительных аминокислотных остатков (от 1 до 50), связывающих между собой два вышеуказанных фрагмента, при этом транспортная аминокислотная последовательность, как вариант, может быть присоединена к С-концу указанной функциональной последовательности посредством группы X, где X представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 50 аминокислотных остатков, а также могут использоваться вставки различной химической природы. Методы получения химерного пептида включают в себя как твердофазный метод, представлен в документах RU 2297241, 22.11.2004 и RU 2435783, 29.09.2010, так и генно-инженерный метод, представлен в документах RU 2297241, 22.11.2004 и RU 2435783, 29.09.2010. Исследование свойств данных химерных пептидов приведены в документе RU 2435783.As used herein, the term "chimeric peptide" includes a peptide having a specific binding sequence for functional and transport fragments in a chimeric peptide molecule, in addition, any sequence of any length can be used for binding, including through additional amino acid residues (from 1 to 50) linking the above two fragments together, while the transport amino acid sequence, as an option, can be attached to the C-terminus of the specified functional sequence through the group X, where X is an amino acid sequence containing from 1 to 50 amino acid residues, and can also be used inserts of various chemical nature. Methods for obtaining a chimeric peptide include both the solid-phase method, presented in
Пептиды 1-9 состоят из функциональной части Raf и интернализуемой последовательности pAntp или tat и отличаются по местоположению функциональной группы относительно N-, С- концов молекулы и по наличию вставки для пептида. Пептиды 4-9 имеют варианты по месторасположению функциональной группы относительно N-, С- концов, так функциональный фрагмент может располагаться у NH2- конца, так и у -СООН конца. Соответственно транспортная последовательность может располагаться у NH2- конца, так и у -СООН конца.Peptides 1-9 consist of a Raf functional moiety and an internalized pAntp or tat sequence and differ in the location of the functional group relative to the N-, C-termini of the molecule and in the presence of an insert for the peptide. Peptides 4-9 have variants in the location of the functional group relative to the N-, C-ends, so the functional fragment can be located at the NH 2 - end, and at the -COOH end. Accordingly, the transport sequence can be located at the NH 2 - end, and at the -COOH end.
Используемый в настоящем документе термин «функциональный фрагмент» или полипептид может представлять любую полипептидную последовательность размера не менее 6 из SEQ ID NO: 1, а также гомологичной ей на 60% и более последовательности. SEQ ID NO: 1 представляет фрагмент с 59 по 87 аминокислоту из белка RAF (UniProtKB - Р04049 (RAF 1 HUMAN)Used in this document, the term "functional fragment" or polypeptide can represent any polypeptide sequence of size not less than 6 of SEQ ID NO: 1, as well as homologous to it by 60% or more of the sequence. SEQ ID NO: 1 sets forth
(59)RVFLPNKQRTVVNVRNGMSLHDCLMKK(87)(59) RVFLPNKQRTVVNVRNGMSLHDCLMKK (87)
SEQ ID NO: 2 KQRTVVNVR представляет фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.SEQ ID NO: 2 KQRTVVNVR is a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Настоящее изобретение охватывает также последовательности гомологичные (идентичные) на 60% и более SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Гомология рассчитывается с помощью программ, известных для специалиста данной области.The present invention also encompasses sequences that are 60% or more homologous (identical) to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Homology is calculated using programs known to a person skilled in the art.
Настоящее изобретение охватывает также варианты аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Варианты аминокислотных последовательностей могут являться замещающими либо инсерционными вариантами.The present invention also encompasses amino acid sequence variants of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Amino acid sequence variants may be substitutional or insertional variants.
Настоящее изобретение охватывает также варианты аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, а также любые вставки и делеции 1-2 аминокислот или их аналогов.The present invention also encompasses variants of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, as well as any insertions and deletions of 1-2 amino acids or their analogs.
Как правило, инсерционные мутанты подразумевают добавление материала на неконечной точке пептида. Сюда может относиться включение нескольких остатков, иммунореактивного эпитопа или просто одного остатка. Добавляемый материал может подвергаться изменениям, например, метилирование, ацетилирование и т.п. Либо к N- или С-терминальному концу пептида могут добавляться дополнительные остатки.Typically, insertion mutants involve the addition of material at the non-endpoint of the peptide. This may include the inclusion of multiple residues, an immunoreactive epitope, or just one residue. The added material can undergo changes, for example, methylation, acetylation, and the like. Alternatively, additional residues can be added to the N- or C-terminal end of the peptide.
Что касается замещающих вариантов, то, как правило, они подразумевают замещение одной аминокислоты другой аминокислотой на одном или нескольких участках пептида. Замещение может использоваться для модулирования одного или нескольких свойств пептида, например, устойчивости к протеолизу, без потери других функций или свойств. Предпочтительно, чтобы подобные замещения были консервативными, иными словами, одна аминокислота замещается другой аминокислотой схожей формы и заряда. Консервативные замещения хорошо известны, к ним относятся, например, замены следующего типа: аланин на серии, аргинин на лизин, аспарагин на глутамин или гистидин, аспартат на глутамат, цистеин на серии, глутамин на аспарагин, глутамат на аспартат; глицин на пролин, гистидин на аспарагин или глутамин, изолейцин на лейцин или валин, лейцин на валин или изолейцин, лизин на арганин, метионин на лейцин или изолейцин, фенилаланин на тирозин, лейцин или метионин, серии на треонин, треонин на серии, триптофан на тирозин, тирозин на триптофан или фенилаланин, валин на изолейцин или лейцин.With regard to substitution options, they usually imply the replacement of one amino acid with another amino acid at one or more regions of the peptide. Substitution can be used to modulate one or more properties of the peptide, for example resistance to proteolysis, without losing other functions or properties. It is preferred that such substitutions are conservative, in other words, one amino acid is replaced with another amino acid of similar shape and charge. Conservative substitutions are well known and include, for example, substitutions of the following type: alanine for serine, arginine for lysine, asparagine for glutamine or histidine, aspartate for glutamate, cysteine for serine, glutamine for asparagine, glutamate for aspartate; glycine for proline, histidine for asparagine or glutamine, isoleucine for leucine or valine, leucine for valine or isoleucine, lysine for arganine, methionine for leucine or isoleucine, phenylalanine for tyrosine, leucine or methionine, series for threonine, threonine for series, tryptophan for tyrosine, tyrosine for tryptophan or phenylalanine, valine for isoleucine or leucine.
Ниже представлено обсуждение замены аминокислот пептида для получения эквивалента либо улучшенной молекулы второго поколения. Например, некоторые аминокислоты могут замещаться другими аминокислотами в структуре пептида/ белка без существенной потери в связывающей способности взаимодействия с такими структурами, как, например, участки связывания на молекулах носителя или участки антител, отвечающие за связывание антигена. Поскольку связывание является связыванием взаимодействия и в силу природы пептида/ белка, которая определяет биологическую функциональную активность такого пептида/ белка, замещение некоторых аминокислот может осуществляться в ряде пептида/ белка и в ряде кодирования ДНК; в результате будет получен белок со схожими свойствами. Таким образом, выдвигается предположение, что различные изменения могут вноситься в ряд ДНК генов без существенной потери их биологических свойств или активности (см. обсуждение ниже). Далее, аминокислоты, рассматриваемые в рамках настоящего изобретения, могут содержать изменения, например, метилирование, ацетилирование, миристилирование и т.п.The following is a discussion of amino acid substitution of a peptide to produce an equivalent or improved second generation molecule. For example, some amino acids can be substituted by other amino acids in the peptide / protein structure without significant loss of binding capacity to interact with structures such as, for example, binding sites on carrier molecules or antibody sites responsible for antigen binding. Since binding is a binding interaction and by virtue of the nature of the peptide / protein that determines the biological functional activity of such a peptide / protein, the substitution of some amino acids can occur in the peptide / protein series and in the DNA coding series; the result will be a protein with similar properties. Thus, it has been suggested that various changes can be introduced into a number of DNA genes without significant loss of their biological properties or activity (see discussion below). Further, amino acids contemplated within the scope of the present invention may contain alterations such as methylation, acetylation, myristylation, and the like.
При внесении таких изменений можно учесть индекс гидропатичности аминокислот. Важность индекса гидропатичности аминокислот для переноса биологической функции на пептид/ белок хорошо известна (Kyte and Doolittle, 1982). Допускается, что относительные свойства гидропатичности аминокислоты влияет на вторичную структуру получаемого пептида/ белка, что, в свою очередь, определяет взаимодействие пептида/ белка с другими молекулами, например, с ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и т.п.When making such changes, the amino acid hydropathicity index can be taken into account. The importance of the amino acid hydropathic index for transferring biological function to the peptide / protein is well known (Kyte and Doolittle, 1982). It is assumed that the relative hydropathic properties of an amino acid affect the secondary structure of the resulting peptide / protein, which in turn determines the interaction of the peptide / protein with other molecules, for example, with enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.
Каждая аминокислота имеет индекс гидропатичности, зависящий от ее гидропатичности и заряда (Kyte and Doolittle, 1982): изолейцин (+4,5), валин (+4,2), лейцин (+3,8), фенилаланин (+2,8), цистеин/ цистин (+2,5), метионин (+1,9), аланин (+1,8), глицин (-0,4), треонин (-0,7), серии (-0,8), триптофан (-0,9), тирозин (-1,3), пролин (-1,6), гистидин (-3,2), глутамат (-3,5), глутамин (-3,5), аспартат (-3,5), аспарагин (-3,5), лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).Each amino acid has a hydropathic index depending on its hydropathicity and charge (Kyte and Doolittle, 1982): isoleucine (+4.5), valine (+4.2), leucine (+3.8), phenylalanine (+2.8 ), cysteine / cystine (+2.5), methionine (+1.9), alanine (+1.8), glycine (-0.4), threonine (-0.7), series (-0.8 ), tryptophan (-0.9), tyrosine (-1.3), proline (-1.6), histidine (-3.2), glutamate (-3.5), glutamine (-3.5), aspartate (-3.5), asparagine (-3.5), lysine (-3.9) and arginine (-4.5).
Известно, что некоторые аминокислоты могут замещаться другими аминокислотами с аналогичным индексом или показателем гидропатичности с получением аналогичного пептида/ белка со схожей биологической активностью, т.е. получается эквивалентный по биологическим функциям пептид/ белок. При внесении таких изменений предпочтительными являются аминокислоты с индексом гидропатичности в пределах +-2, особенно приемлемым является показатель +-1, но самыми оптимальными являются индексы +-0,5.It is known that some amino acids can be substituted by other amino acids with a similar index or hydropathicity index to obtain a similar peptide / protein with similar biological activity, i.e. a peptide / protein equivalent in biological function is obtained. When making such changes, amino acids with a hydropathic index in the range of + -2 are preferred, an index of + -1 is especially acceptable, but the most optimal are indices of + -0.5.
Признанным является тот факт, что замещение схожих аминокислот может быть оптимальным с учетом гидропатичности. В Патенте США №4,554,101, ссылка на который приводится в настоящем документе, указывается, что максимальная локальная средняя гидропатичность белка (в зависимости от гидропатичности соседних аминокислот) совпадает с биологическим свойством белка. Как описано в Патенте США №4,554,101, аминокислотные остатки имеют следующие значения гидропатичности: аргинин (+3,0), лизин (+3,0), аспартат (+3,0+- 1), глутамат (+3,0+- 1), серии (+0,3), аспарагин (+0,2), глутамин (+0,2), глицин (0), треонин (-0,4), пролин (-0,5+- 1), аланин (-0,5), гистидин (-0,5), цистеин (-1,0), метионин (-1,3), валин (-1,5), лейцин (-1,8), изолейцин (-1,8), тирозин (-2,3), фениланин (-2,5), триптофан (-3,4).It is recognized that the substitution of similar amino acids can be optimal given hydropathicity. US Pat. No. 4,554,101, referred to herein, teaches that the maximum local average hydropathicity of a protein (depending on the hydropathicity of adjacent amino acids) matches the biological property of the protein. As described in US Pat. No. 4,554,101, amino acid residues have the following hydropathicity values: arginine (+3.0), lysine (+3.0), aspartate (+ 3.0 + - 1), glutamate (+ 3.0 + - 1), series (+0.3), asparagine (+0.2), glutamine (+0.2), glycine (0), threonine (-0.4), proline (-0.5 + - 1) , alanine (-0.5), histidine (-0.5), cysteine (-1.0), methionine (-1.3), valine (-1.5), leucine (-1.8), isoleucine (-1.8), tyrosine (-2.3), phenylanine (-2.5), tryptophan (-3.4).
Признанным является тот факт, что аминокислоту можно заместить другой аминокислотой со схожим значением гидропатичности, в результате все равно будет получен белок с эквивалентными биологическими и иммунологическими свойствами. При внесении таких изменений предпочтительными являются аминокислоты с показателем гидропатичности в пределах +-2, особенно приемлемым является показатель +-1, но самыми оптимальными являются индексы +-0,5.It is recognized that an amino acid can be replaced with another amino acid with a similar hydropathicity value, resulting in a protein with equivalent biological and immunological properties. When making such changes, amino acids with an index of hydropathicity in the range of + -2 are preferred, an index of + -1 is especially acceptable, but the most optimal indexes are + -0.5.
Как указано выше, замещение аминокислот основано преимущественно на относительной схожести заместителей боковых цепей аминокислоты, например, на их гидропатичности, заряде, размере и т.п.Примерами замещений, где учитываются упомянутые выше характеристики, хорошо известны, к ним относятся следующие: арганин и лизин, глутамат и аспартат, серии и треонин, глутамин и аспарагин, валин, лейцин и изолейцин. Тем не менее, изменения аминокислот в рамках настоящего изобретения могут быть и не консервативными, но все же входить в сферу применения настоящего изобретения до тех пор, пока пептиды сохраняют функцию связывания с клетками опухоли.As indicated above, amino acid substitutions are based primarily on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, for example, their hydropathicity, charge, size, etc. Examples of substitutions that take into account the above characteristics are well known, they include the following: arganine and lysine , glutamate and aspartate, serine and threonine, glutamine and asparagine, valine, leucine and isoleucine. However, amino acid changes within the scope of the present invention may not be conservative, but still fall within the scope of the present invention as long as the peptides retain the function of binding to tumor cells.
Еще одним примером приготовления пептидов в соответствии с изобретением является использование миметиков пептида. Миметики - это молекулы, в состав которых входят пептиды, копирующие элементы вторичной структуры белка. См., например, Johnson et al., 1993. Обоснованием использования миметиков пептида является то, что каркас пептидов белка существует преимущественно для построения боковых цепей аминокислоты таким образом, чтобы способствовать взаимодействию молекул, например, антитело и антиген. Ожидается, что миметик пептида обеспечит взаимодействия в молекулах, схожие с естественной молекулой. Такие принципы могут использоваться вместе с описанными выше принципами для получения молекул второго поколения, обладающих рядом естественных свойств Ras, но с измененными или даже улучшенными характеристиками. Например, замещение аминокислот для получения мотивов, обладающих лучшим связыванием с клетками опухоли, либо мотивов, которые можно изменять для связывания различных типов клеток опухоли с получением пептидов, более близких к Ras, разных для различных типов опухоли.Another example of the preparation of peptides in accordance with the invention is the use of peptide mimetics. Mimetics are molecules containing peptides that copy elements of the secondary structure of a protein. See, for example, Johnson et al., 1993. The rationale for the use of peptide mimetics is that the peptide backbone of a protein exists primarily to build amino acid side chains in such a way as to facilitate the interaction of molecules, such as antibody and antigen. The peptide mimetic is expected to provide interactions in molecules that are similar to the naturally occurring molecule. Such principles can be used in conjunction with the principles described above to produce second generation molecules that have a number of natural Ras properties, but with altered or even improved characteristics. For example, amino acid substitution to obtain motifs that have better binding to tumor cells, or motifs that can be modified to bind different types of tumor cells to obtain peptides closer to Ras, different for different types of tumors.
Воплощение настоящего изобретения подразумевает дополнительные меры, связанные с аминокислотной последовательностью, входящей в состав SEQ ID NO:l, либо с его фрагментом или производным элементом, который способствует трансдукции или интернализации противоракового пептида в клетку опухоли.The embodiment of the present invention involves additional measures associated with the amino acid sequence included in SEQ ID NO: l, or with a fragment or derivative thereof, which facilitates the transduction or internalization of the anticancer peptide into the tumor cell.
Используемый в настоящем документе термин «антипролиферативная активность» включает в себя способность ингибиторов циклиновых киназ или композиций, включающих ингибиторы циклиновых киназ, оказывать цитостатический и цитотоксический эффект на клетки злокачественной и доброкачественной опухоли.As used herein, the term "antiproliferative activity" includes the ability of cyclin kinase inhibitors or compositions comprising cyclin kinase inhibitors to exert a cytostatic and cytotoxic effect on cancer and benign tumor cells.
Используемый в настоящем документе термин «транспортная последовательность» включает в себя любую транспортную последовательность. Любая транспортная последовательность может быть использована при условии, что заявленная функциональная последовательность, включенная в любую другую полипептидную последовательность любого размера или любую другую структуру или молекулу, выполняет функции, указанные в настоящем документе. Может быть использована, в том числе, и последовательности пептида VP22 (pAntp) вируса простого герпеса в качестве транспортного агента для переноса ингибитора циклиновых киназ внутрь целевых клеток, например, ROIKIWFQNRRMKWKK. В конкретном случае область трансдукции белка также связывается либо соединяется иным образом с конъюгатом Ras-киназ / противоракового компонента. В другом случае область трансдукции белка - это белок ТАТ ВИЧ (Schwarze et al., 1999), добавление области трансдукции белка ускоряет доставку в клетку опухоли, включая клетки опухоли мозга, поскольку эта область позволяет преодолевать гематоэнцефалический барьер. Таким образом, в этом воплощении настоящего изобретения, несмотря на то, что область трансдукции белка ускоряет доставку к любой ткани, пептид Ras-киназу настоящего изобретения направляет весь комплекс исключительно в клетку опухоли, например, при раке головы или шеи, раке молочных желез либо раке мозга, и область трансдукции белка является преимущественно вспомогательным средством ускорения такой доставки и трансдукции комплекса противоракового препарата. Другие области трансдукции белка входят в предмет настоящего изобретения и хорошо известны.As used herein, the term "transport sequence" includes any transport sequence. Any transport sequence can be used, provided that the claimed functional sequence, included in any other polypeptide sequence of any size or any other structure or molecule, performs the functions set forth herein. Can be used, inter alia, and the sequence of the VP22 (pAntp) peptide of the herpes simplex virus as a transport agent for the transfer of the inhibitor of cyclin kinases into target cells, for example, ROIKIWFQNRRMKWKK . In a specific case, the protein transduction region also binds or otherwise binds to the Ras kinase / anti-cancer component conjugate. In another case, the protein transduction region is the HIV TAT protein (Schwarze et al., 1999), the addition of the protein transduction region accelerates delivery into the tumor cell, including brain tumor cells, since this region allows the blood-brain barrier to be crossed. Thus, in this embodiment of the present invention, although the protein transduction region accelerates delivery to any tissue, the Ras kinase peptide of the present invention directs the entire complex exclusively to the tumor cell, for example, in head or neck cancer, breast cancer or cancer the brain, and the protein transduction region is predominantly an auxiliary means of accelerating such delivery and transduction of the anticancer drug complex. Other areas of protein transduction are within the scope of the present invention and are well known.
Опытный специалист знает, что можно легко провести скрининг или тест варианта, чтобы определить, сохранил ли вариант противоопухолевые свойства. Иными словами, в соответствии с методикой, представленной в настоящем документе (см. Примеры), вариант аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или другой вариант интернализирующего пептида может сопрягаться с определимым маркером, введенным в клетку, и анализироваться на предмет интернализации клеткой. Предпочтительный метод анализа заключается в флуоресцентной микроскопии, хотя опытный специалист знает, что метод анализа следует подбирать в зависимости от используемого маркера. В дополнение или вместо этого метода in vitro можно использовать исследование in vivo. Например, вариант, сопряженный с определяемым маркером, вводится животному, к примеру, голой мыши с опухолью или раковой тканью, затем опухолевую ткань животного анализируют для определения маркера. Опытный специалист может использовать другие методы или варианты таких методов для выявления интернализирующего пептида, такого как SEQ ID NO:2, в клетке.The skilled artisan knows that it is easy to screen or test a variant to determine if the variant retains its anti-tumor properties. In other words, in accordance with the methodology presented herein (see Examples), a variant of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or another variant of an internalizing peptide can be conjugated with a detectable marker introduced into a cell and analyzed for internalization by the cell. The preferred assay method is fluorescence microscopy, although the skilled person knows that the assay method should be selected depending on the marker used. In addition to or instead of this in vitro method, an in vivo assay can be used. For example, a variant associated with a detectable marker is administered to an animal, for example, a nude mouse with a tumor or cancer tissue, then the tumor tissue of the animal is analyzed to determine the marker. The skilled artisan can use other methods or variations of such methods to detect an internalizing peptide, such as SEQ ID NO: 2, in a cell.
Используемый в настоящем документе термин «онкологическое заболевание» включает в себя как злокачественные, так и доброкачественные опухоли, включая колоректальный рак, рак почек, рак легкого, в том числе немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома, злокачественная лимфома.As used herein, the term "cancer" includes both malignant and benign tumors, including colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, including non-small cell lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, cancer uterus, prostate cancer, stomach cancer, ovarian cancer, myeloma, malignant lymphoma.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Рисунок 1. Сравнение изменений количества живых клеток при воздействии на культуру А549 последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы (пептид С из Таблицы 1, здесь и во всех последующих экспериментах).Figure 1. Comparison of changes in the number of living cells when exposed to the A549 culture with the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase (peptide C from Table 1, here and in all subsequent experiments).
Рисунок 2. Сравнение изменений количества живых клеток при воздействии на культуру Н460 последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы.Figure 2. Comparison of changes in the number of living cells upon exposure to the culture of H460 with the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase.
Рисунок 3. Сравнение изменений количества живых клеток при воздействии на культуру HI299 последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы.Figure 3. Comparison of changes in the number of living cells when exposed to the HI299 culture with the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase.
Рисунок 4. Воздействие последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на культуры клеток А549, Н460 и HI299, время инкубации 24 часа.Figure 4. Effect of the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase on cell cultures A549, H460 and HI299,
Рисунок 5. Воздействие последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на культуры клеток А549, Н460 и HI299, время инкубации 48 часов.Figure 5. Effect of the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase on cell cultures A549, H460 and HI299, incubation time 48 hours.
Рисунок 6. Результаты ЛДГ-теста клеток культуры А549 после 24 и 48 часов инкубации с пептидной последовательностью ингибитором Ras-ГТФазы, в концентрациях от 2 до 40 мкМ. Результаты контроля - клетки А549, инкубированные со средой, в течение 24 часов, приняты за 1.Figure 6. Results of LDH test of A549 culture cells after 24 and 48 hours of incubation with a peptide sequence with a Ras-GTPase inhibitor, at concentrations from 2 to 40 μM. Control results - A549 cells incubated with the medium for 24 hours were taken as 1.
Рисунок 7. Результаты ЛДГ-теста клеток культуры Н460 после 24 и 48 часов инкубации с пептидной последовательностью ингибитором Ras-ГТФазы, в концентрациях от 2 до 40 мкМ. Результаты контроля - клетки Н460, инкубированные со средой, в течение 24 часов, приняты за 1.Figure 7. Results of LDH test of H460 culture cells after 24 and 48 hours of incubation with a peptide sequence with a Ras-GTPase inhibitor at concentrations from 2 to 40 μM. Control results - H460 cells incubated with the medium for 24 hours were taken as 1.
Рисунок 8. Результаты ЛДГ-теста клеток культуры HI299 после 24 и 48 часов инкубации с пептидной последовательностью ингибитором Ras-ГТФазы, в концентрациях от 2 до 40 мкМ. Результаты контроля - клетки HI299, инкубированные со средой, в течение 24 часов, приняты за 1 Результаты ЛДГ-теста клеток культуры HI299 после 24 и 48 часов инкубации с пептидной последовательностью ингибитором Ras-ГТФазы, в концентрациях от 2 до 40 мкМ. Результаты контроля - клетки HI299, инкубированные со средой, в течение 24 часов, приняты за 1.Figure 8. Results of LDH test of HI299 culture cells after 24 and 48 hours of incubation with a peptide sequence with a Ras-GTPase inhibitor, at concentrations from 2 to 40 μM. Control results - HI299 cells incubated with the medium for 24 hours, taken as 1 Results of the LDH test of HI299 culture cells after 24 and 48 hours of incubation with a peptide sequence with a Ras-GTPase inhibitor, at concentrations from 2 to 40 μM. Control results - HI299 cells incubated with the medium for 24 hours were taken as 1.
Рисунок 9. Сравнение результатов ЛДГ-теста для культур А549, Н460 и HI299 при времени инкубации 24 часа и концентрации пептидного ингибитора Ras-ГТФазы от 2 до 40 мкМ.Figure 9. Comparison of the results of the LDH test for cultures A549, H460 and HI299 at an incubation time of 24 hours and a concentration of the peptide inhibitor of Ras-GTPase from 2 to 40 μM.
Рисунок 10. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток А549. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества PI-положительных частиц от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 10. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, 5-fluorouracil and etoposide on the A549 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of changes in the number of PI-positive particles on drug concentration,
Рисунок 11. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток А549. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества CFDA-SE - положительных клеток (живых) от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 11. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide Ras-GTPase inhibitor, 5-fluorouracil and etoposide on the A549 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of the change in the number of CFDA-SE - positive cells (living) on the drug concentration,
Рисунок 12. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток Н460. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества PI-положительных частиц от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 12. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, 5-fluorouracil and etoposide on the H460 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of changes in the number of PI-positive particles on drug concentration,
Рисунок 13. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток Н460. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества CFDA-SE - положительных клеток (живых) от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 13. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, 5-fluorouracil and etoposide on the H460 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of the change in the number of CFDA-SE - positive cells (living) on the drug concentration,
Рисунок 14. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток Н1299. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества PI-положительных частиц от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 14. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide Ras-GTPase inhibitor, 5-fluorouracil and etoposide on the H1299 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of changes in the number of PI-positive particles on drug concentration,
Рисунок 15. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток Н1299. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества CFDA-SE - положительных клеток (живых) от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 15. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, 5-fluorouracil and etoposide on the H1299 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of the change in the number of CFDA-SE - positive cells (living) on the drug concentration,
Рисунок 15. Сравнение цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, 5-фторурацила и этопозида на культуру клеток Н1299. Окраска CFDA-SE/PI, зависимость изменения количества CFDA-SE - положительных клеток (живых) от концентрации ЛС, время инкубации 24 часа.Figure 15. Comparison of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, 5-fluorouracil and etoposide on the H1299 cell culture. Coloring CFDA-SE / PI, dependence of the change in the number of CFDA-SE - positive cells (living) on the drug concentration,
Рисунок 16. Изменение уровня апоптоза и некроза в культуре клеток линии А549 при воздействии пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях 2-40 мкМ. Метод проточной цитофлуориметрии, окраска Annexin V-FITC (FL1) / PI (FL3).Figure 16. Changes in the level of apoptosis and necrosis in the A549 cell culture upon exposure to the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor at concentrations of 2-40 μM. Flow cytometry, Annexin V-FITC (FL1) / PI (FL3) stain.
Рисунок 17. Изменение уровня апоптоза и некроза в культуре клеток линии Н460 при воздействии пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях 2-40 мкМ. Метод проточной цитофлуориметрии, окраска Annexin V-FITC (FL1) / PI (FL3).Figure 17. Changes in the level of apoptosis and necrosis in the H460 cell culture upon exposure to the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor at concentrations of 2-40 μM. Flow cytometry, Annexin V-FITC (FL1) / PI (FL3) stain.
Рисунок 18. Изменение уровня апоптоза и некроза в культуре клеток линии HI299 при воздействии пептидного ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях 2-40 мкМ. Метод проточной цитофлуориметрии, окраска Annexin V-FITC (FL1) / PI (FL3).Figure 18. Changes in the level of apoptosis and necrosis in the culture of HI299 cells under the influence of the peptide inhibitor Ras-GTPase at concentrations of 2-40 μM. Flow cytometry, Annexin V-FITC (FL1) / PI (FL3) stain.
Рисунок 19. Исследование воздействия лекарственного средства ингибитора Ras-ГТФазы в концентрациях 2-40 мкМ на культуру А549 методом клеточного анализа iCELLIgence.Figure 19. Study of the effect of the Ras-GTPase inhibitor drug at concentrations of 2-40 μM on the A549 culture by the iCELLIgence cell assay.
Рисунок 20. Исследование воздействия лекарственного средства ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях 5-40 мкМ на культуру Н460 методом клеточного анализа iCELLIgence Исследование воздействия лекарственного средства ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях 5-40 мкМ на культуру Н460 методом клеточного анализа iCELLIgence.Figure 20. Study of the effect of the Ras-GTPase inhibitor drug at concentrations of 5-40 μM on the H460 culture by iCELLIgence cell analysis Study of the effect of the Ras-GTPase inhibitor drug at concentrations of 5-40 μM on the H460 culture by the iCELLIgence cell assay.
Рисунок 21. Исследование воздействия лекарственного средства ингибитора Ras-ГТФазы в концентрациях 5-40 мкМ на культуру HI299 методомклеточного анализа iCELLIgence.Figure 21. Study of the effect of the Ras-GTPase inhibitor drug at concentrations of 5-40 μM on the HI299 culture by the iCELLIgence cell assay.
Рисунок 22. Время удвоения клеточной популяции культуры клеток А549 при воздействии пептидного ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях В1 В2 - 10 мкМ, С1С2 - 20 мкМ, D1D2 - 40 мкМ, Al А2 - контрольный образец.Figure 22. Doubling time of the cell population of the A549 cell culture under the influence of the peptide inhibitor Ras-GTPase at the concentrations B1 B2 - 10 μM, C1C2 - 20 μM, D1D2 - 40 μM, Al A2 - control sample.
Рисунок 23. Время удвоения клеточной популяции культуры клеток Н460 при воздействии пептидного ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях В1 В2 - 10 мкМ, С1С2 - 20 мкМ, D1D2 - 40 мкМ, A1 А2 - контрольный образец.Figure 23. Doubling time of the cell population of the H460 cell culture under the influence of the peptide inhibitor Ras-GTPase at concentrations B1 B2 - 10 μM, C1C2 - 20 μM, D1D2 - 40 μM, A1 A2 - control sample.
Рисунок 24. Время удвоения клеточной популяции культуры клеток HI299 при воздействиипептидного ингибитора Ras-ГТФазыв концентрациях В1 В2 - 10 мкМ, С1С2 - 20 мкМ, D1D2 - 40 мкМ, A1 А2 - контрольный образец.Figure 24. Doubling time of the cell population of the HI299 cell culture under the influence of the peptide inhibitor Ras-GTPase at concentrations B1 B2 - 10 μM, C1C2 - 20 μM, D1D2 - 40 μM, A1 A2 - control sample.
Рисунок 25. Кривые выживаемости мышей линии С57 В1/6 (самцы) с внутрибрюшиннотрансплантированными клетками линии аденокарциномы легкого Lewis (LLC) при введении ингибитора Ras-ГТФазы.Figure 25. Survival curves of C57 B1 / 6 mice (males) with intraperitoneal transplanted cells of the Lewis lung adenocarcinoma line (LLC) when administered with a Ras-GTPase inhibitor.
Рисунок 26. Кривые выживаемости мышей линии С57 В1/6 (самки) с внутрибрюшиннотрансплантированными клетками линии аденокарциномы легкого Lewis (LLC) при введении ингибитора Ras-ГТФазы Кривые выживаемости мышей линии С57 В1/6 (самки) с внутрибрюшиннотрансплантированными клетками линии аденокарциномы легкого Lewis (LLC) при введении ингибитора Ras-ГТФазы.Figure 26. Survival curves of C57 B1 / 6 mice (females) with intraperitoneal transplanted cells of the Lewis lung adenocarcinoma line (LLC) with the administration of a Ras-GTPase inhibitor. Survival curves of C57 B1 / 6 mice (female) with intraperitoneal transplanted lung cells of the Lewis line (LLC) ) with the introduction of an inhibitor of Ras-GTPase.
Рисунок 27. Вид опухолей в контрольной (А) и опытной (В) группах на 14 день после перевивки опухолей Вид опухолей в контрольной (А) и опытной (В) группах на 14 день после перевивки опухолей.Figure 27. Type of tumors in the control (A) and experimental (B) groups on
Рисунок 28. Изменение объема подкожно трансплантированных опухолей аденокарциномы легкого человека (А549) в группах мышей линии BALBc (NUDE) (самки+самки) при внутривенном введении ингибитора Ras-ГТФазы в дозах 0,1 мг/мышь (5 мг/кг) и 0,2 мг/мышь (10 мг/кг).Figure 28. Change in the volume of subcutaneously transplanted tumors of human lung adenocarcinoma (A549) in groups of BALBc (NUDE) mice (females + females) after intravenous administration of a Ras-GTPase inhibitor at doses of 0.1 mg / mouse (5 mg / kg) and 0 , 2 mg / mouse (10 mg / kg).
Рисунок 29. Гистограмма изменения относительного объема опухолей для двух исследуемых групп мышей линии BALBc (NUDE) (самки + самки) при внутривенном введении ингибитора Ras-ГТФазы в дозах 0,1 мг/мышь (5 мг/кг) и 0,2 мг/мышь (10 мг/кг).Figure 29. Histogram of changes in the relative volume of tumors for two studied groups of BALBc (NUDE) mice (females + females) after intravenous administration of a Ras-GTPase inhibitor at doses of 0.1 mg / mouse (5 mg / kg) and 0.2 mg / mouse (10 mg / kg).
Рисунок 30. Кривые выживаемости мышей линии BALBc (NUDE) (самки + самки) с подкожно трансплантированной опухолью аденокарциномы легкого человека (А549) при внутривенном введении ингибитора Ras-ГТФазы в дозах 0,1 мг/мышь (5 мг/кг) и 0,2 мг/мышь (10 мг/кг). Кривые выживаемости мышей линии BALBc (NUDE) (самки+самки) с подкожно трансплантированной опухолью аденокарциномы легкого человека (А549) при внутривенном введении ингибитора Ras-ГТФазы в дозах 0,1 мг/мышь (5 мг/кг) и 0,2 мг/мышь (10 мг/кг).Figure 30. Survival curves of BALBc (NUDE) mice (females + females) with a subcutaneously transplanted human adenocarcinoma tumor (A549) with intravenous injection of a Ras-GTPase inhibitor at doses of 0.1 mg / mouse (5 mg / kg) and 0, 2 mg / mouse (10 mg / kg). Survival curves of BALBc (NUDE) mice (females + females) with a subcutaneously transplanted human adenocarcinoma tumor (A549) after intravenous administration of a Ras-GTPase inhibitor at doses of 0.1 mg / mouse (5 mg / kg) and 0.2 mg / mouse (10 mg / kg).
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Возможность осуществления изобретения с реализацией указанного назначения и достижением технического результата подтверждают следующие результаты исследований, однако приведенные результаты не ограничивают варианты использования заявленного технического решения.The possibility of carrying out the invention with the implementation of the specified purpose and the achievement of the technical result is confirmed by the following research results, however, the results presented do not limit the options for using the claimed technical solution.
Для исследования эффектов на опухолях человека использовали методы in vitro - перевивных культур опухолевых клеток и in vivo - ксенографные модели опухолей человека.To study the effects on human tumors, in vitro methods were used - graft cultures of tumor cells and in vivo - xenographic models of human tumors.
Исследование влияния пептида С (Таблица 1) было проведено на клеточных линиях человека НСТ116, НТ29 (аденокарциномы толстого кишечника) и А549 (аденокарцинома легких). Показано, что для этих моделей, внесение пептида С в культуральную среду вызывает индукцию апоптоза и остановку пролиферации. Наибольший цитотоксический эффект был получен для клеток линии А549. Результаты исследованийThe study of the effect of peptide C (Table 1) was carried out on human cell lines HCT116, HT29 (colon adenocarcinoma) and A549 (lung adenocarcinoma). It was shown that for these models, the introduction of peptide C into the culture medium induces apoptosis induction and stops proliferation. The greatest cytotoxic effect was obtained for A549 cells. Research results
Пример 1. Исследование специфической активности последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы с использованием МТТExample 1. Study of the specific activity of the sequence of a peptide inhibitor of Ras-GTPase using MTT
На культурах клеток А549, HI299 и Н460 была поставлена серия экспериментов по изучению цитотоксического воздействия последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы. Цитотоксический эффект был оценен несколькими методами. В первую очередь были поставлены эксперименты, в которых с помощью МТТ-теста оценивали количество живых клеток, оставшихся в культуре после воздействия последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в разных концентрациях. Время инкубации исследуемых клеточных культур с пептидным ингибитором Ras-ГТФазы, составляло 24 и 48 часов. Было проведено исследование воздействия на культуры лекарственного средства пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в различных концентрациях от 2 до 40 мкМ. Данный метод (МТТ-тест) основан на способности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых метаболически-активных клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (ДМСО).A series of experiments were performed on cell cultures A549, HI299, and H460 to study the cytotoxic effect of the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase. The cytotoxic effect was evaluated by several methods. First of all, experiments were carried out in which the number of living cells remaining in culture after exposure to the sequence of a peptide inhibitor of Ras-GTPase at different concentrations was estimated using the MTT test. The incubation time of the studied cell cultures with the peptide inhibitor of Ras-GTPase was 24 and 48 hours. A study was carried out on the effect of a peptide inhibitor of Ras-GTPase on cultures of the drug at various concentrations from 2 to 40 μM. This method (MTT test) is based on the ability of mitochondrial and cytoplasmic dehydrogenases of living metabolically active cells to reduce unstained forms of 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenylterazole (MTT reagent) to a blue crystalline pharmacan, soluble in dimethyl sulfoxide (DMSO).
При исследовании влияния пептидного ингибитора Ras-ГТФазына культуру клеток А549, было показано, что количество живых клеток уменьшается при увеличении концентрации в диапазоне от 2 до 40 мкМ, через 24 часа инкубации при концентрации 40 мкМпептидного ингибитора Ras-ГТФазы количество живых клеток снижается до 47%.When studying the effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase on the A549 cell culture, it was shown that the number of living cells decreases with an increase in concentration in the range from 2 to 40 μM, after 24 hours of incubation at a concentration of 40 μM of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, the number of living cells decreases to 47% ...
При увеличении времени инкубации до 48 часов было показано, что в диапазоне концентраций от 10 до 40 мкМ наблюдается снижение количества живых клеток, относительно 24 часов инкубации, а при воздействии низких доз пептидного ингибитора Ras-ГТФазы (2 мкМ, 5 мкМ) наблюдается увеличение количества живых клеток, относительно 24 часовой инкубации при тех же концентрациях.With an increase in the incubation time to 48 hours, it was shown that in the concentration range from 10 to 40 μM, a decrease in the number of living cells is observed, relative to 24 hours of incubation, and when exposed to low doses of the peptide inhibitor of Ras-GTPase (2 μM, 5 μM), an increase in the amount living cells, relative to 24 hour incubation at the same concentrations.
На рисунке 1 показано изменение количества живых клеток в культуре А549 (средние значения по трем экспериментам, в каждом эксперименте было поставлено три дубля) при 24 часовой и 48 часовой инкубации. Видно, что увеличение времени инкубации незначительно снижает количество живых клеток.Figure 1 shows the change in the number of living cells in the A549 culture (average values for three experiments, in each experiment, three duplicates were set) during 24 hours and 48 hours of incubation. It can be seen that an increase in the incubation time slightly decreases the number of living cells.
При концентрации 40 мкМ количество живых клеток составляло в среднем 37%. При исследовании цитотоксического влияния лекарственного средства последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на клетки линии Н460 также было показано, что снижение количества живых клеток происходит пропорционально увеличению концентрации К26К в диапазоне от 2 до 40 мкМ, достоверное снижение количества живых клеток относительно контрольных образцов наблюдается при увеличении концентрации более 10 мкМ. При концентрации 40 мкМ происходит снижение количества живых клеток на 46%.At a concentration of 40 μM, the number of living cells averaged 37%. When studying the cytotoxic effect of the drug of the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase on H460 cells, it was also shown that the decrease in the number of living cells is proportional to the increase in the concentration of K26K in the range from 2 to 40 μM; more than 10 μM. At a concentration of 40 μM, the number of living cells decreases by 46%.
При увеличении времени инкубации до 48 часов наблюдается рост клеток в образцах 2 и 5 мкМ, в образцах с концентрацией пептидного ингибитора Ras-ГТФазы 10 мкМ и более происходит снижение количества живых.With an increase in the incubation time to 48 hours, cell growth is observed in samples of 2 and 5 μM, in samples with a concentration of the peptide inhibitor of Ras-GTPase of 10 μM or more, a decrease in the number of live occurs.
На рисунке 2 представлено сравнение изменения количества живых клеток в культуре Н460 при воздействии последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в течение 24 и 48 часов.Figure 2 shows a comparison of the change in the number of living cells in the H460 culture upon exposure to the sequence of the peptide Ras-GTPase inhibitor for 24 and 48 hours.
Также, как и для линии А549, показано увеличение количества живых клеток при воздействии пептидного ингибитора в низких концентрациях 2 и 5 мкМ и инкубации 48 часов, что может свидетельствовать об обратимости воздействия. При увеличении времени инкубации до 48 часов происходит увеличение количества мертвых клеток, при концентрации пептидного ингибитора Ras-ГTФaзы20 мкМ и инкубации 24 часа количество живых клеток в культуре составляло 75,5%, при инкубации 48 часов - 65%.As well as for the A549 line, an increase in the number of living cells was shown when exposed to a peptide inhibitor at low concentrations of 2 and 5 μM and incubation for 48 hours, which may indicate the reversibility of the effect. With an increase in the incubation time to 48 hours, an increase in the number of dead cells occurs; at a concentration of the peptide inhibitor of Ras-GTPase of 20 μM and incubation for 24 hours, the number of living cells in the culture was 75.5%, with incubation for 48 hours - 65%.
При исследовании методом МТТ цитотоксического эффекта последовательности пептидного ингибитора на клетки линии H1299 также была обнаружена прямая концентрационная зависимость. Эффект, оказываемый на клетки культуры HI299 был выше, чем для А549 и Н460, так при концентрации 20 мкМ количество живых клеток через 24 часа инкубации составляло 48%, при увеличении концентрации до 40 мкМ количество живых клеток снижалось до 29%.Investigation of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor sequence on H1299 cells by the MTT method also revealed a direct concentration dependence. The effect on HI299 culture cells was higher than for A549 and H460, so at a concentration of 20 μM the number of living cells after 24 hours of incubation was 48%, with an increase in concentration to 40 μM, the number of living cells decreased to 29%.
При увеличении времени инкубации до 48 часов было обнаружено увеличение количества живых клеток при воздействии пептидного ингибитора в концентрациях 2 и 5 мкМ, и дальнейшее снижение количества живых клеток при воздействии пептидного ингибитора в концентрациях более 10 мкМ.With an increase in the incubation time to 48 hours, an increase in the number of living cells was found when exposed to a peptide inhibitor at concentrations of 2 and 5 μM, and a further decrease in the number of living cells when exposed to a peptide inhibitor at concentrations of more than 10 μM.
При сравнении полученных результатов МТТ-теста для линии HI299 было показано, что увеличение времени инкуации до 48 часов не приводит к достоверному увеличению цитотоксического эффекта (рисунок 3).When comparing the results of the MTT test for the HI299 line, it was shown that an increase in the incubation time up to 48 hours does not lead to a significant increase in the cytotoxic effect (Figure 3).
На основании проведенных исследований противоопухолевого эффекта лекарственного средства пептидного ингибитора Ras-ГТФазы методом МТТ было показано, что последовательность обладает выраженым цитотоксическим действием относительно исследуемых линий рака легкого человека (А549, Н460 и H1299). Эффект пропорционален концентрации лекарственного средства, однако низкие концентрации 2 и 5 мкМ вызывают обратимый эффект, в то время как, концентрации более 10 мкМ оказывают стойкий цитотоксический эффект. На рисунках 4 и 5 показано сравнение цитотоксического эффекта последовательности пептидного ингибитора относительно трех исследуемых линий.Based on the performed studies of the antitumor effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase drug by the MTT method, it was shown that the sequence has a pronounced cytotoxic effect relative to the studied lines of human lung cancer (A549, H460, and H1299). The effect is proportional to the drug concentration, however, low concentrations of 2 and 5 μM have a reversible effect, while concentrations above 10 μM have a persistent cytotoxic effect. Figures 4 and 5 show a comparison of the cytotoxic effect of the peptide inhibitor sequence relative to the three lines studied.
Показано, что наибольший эффект наблюдался при инкубации пептидного ингибитора с клетками HI299, данная культура оказалась наиболее чувствительной к воздействию.It was shown that the greatest effect was observed upon incubation of the peptide inhibitor with HI299 cells; this culture was the most sensitive to the effect.
Пример 2. Исследование цитотоксичностипептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы с помощью ЛДГ-тестаExample 2. Study of the cytotoxicity of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor using the LDH test
ЛДГ-тест, в отличие от МТТ-теста, показывающего количество живых, метаболически активных клеток, отражает количество погибших клеток за все время инкубации (отношение активности ЛДГ в среде инкубации в опытной лунке и в контрольной пропорционально количеству погибших клеток). ЛДГ-тест ставился через 24 и 48 часов инкубации клеток культур А549, H1299 и Н460 с пептидной последовательностью ингибитором Ras-ГТФазы. Анализ уровня ЛДГ проводился на автоматическом биохимическом анализаторе Olympus AU-400.The LDH test, in contrast to the MTT test, which shows the number of living, metabolically active cells, reflects the number of dead cells during the entire incubation time (the ratio of LDH activity in the incubation medium in the experimental well and in the control is proportional to the number of dead cells). The LDH test was performed after 24 and 48 hours of incubation of A549, H1299, and H460 cultures with a peptide sequence with a Ras-GTPase inhibitor. The analysis of the LDH level was carried out on an Olympus AU-400 automatic biochemical analyzer.
Проводилась оценка уровня ЛДГ после 24 часовой и 48 часовой инкубации культур клеток с пептидным ингибитopoмRas-ГTФaзы в концентрациях 2, 5, 10, 20 и 40 мкМ.The LDH level was assessed after 24 hours and 48 hours of incubation of cell cultures with a peptide inhibitor of Ras-GTPase at concentrations of 2, 5, 10, 20, and 40 μM.
Для культуры А549 было показано, что уровень ЛДГ в надосадочной жидкости возрастает пропорционально увеличению концентрации ингибитора и увеличивается при 48 часовой концентрации (Рисунок 6). Высота пика на рисунках соответствует относительному уровню ЛДГ и пропорциональна количеству погибших клеток.For culture A549, it was shown that the level of LDH in the supernatant increases in proportion to the concentration of the inhibitor and increases at a 48 hour concentration (Figure 6). The height of the peak in the figures corresponds to the relative level of LDH and is proportional to the number of dead cells.
При исследовании цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазына клетках Н460 также было обнаружено увеличение количества ЛДГ пропорциональное концентрации вносимого пептидного ингибитора.When studying the cytotoxic effect of the peptide inhibitor Ras-GTPase on H460 cells, an increase in the amount of LDH was also found proportional to the concentration of the introduced peptide inhibitor.
Рисунок 7. Результаты ЛДГ-теста клеток культуры Н460 после 24 и 48 часов инкубации с пептидной последовательностью ингибитором Ras-ГТФазы, в концентрациях от 2 до 40 мкМ. Результаты контроля - клетки Н460, инкубированные со средой, в течение 24 часов, приняты за 1.Figure 7. Results of LDH test of H460 culture cells after 24 and 48 hours of incubation with a peptide sequence with a Ras-GTPase inhibitor at concentrations from 2 to 40 μM. Control results - H460 cells incubated with the medium for 24 hours were taken as 1.
На рисунке 8 представлены результаты исследования цитотоксического эффекта последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазыотносительно культуры HI299.Figure 8 shows the results of a study of the cytotoxic effect of the sequence of the peptide Ras-GTPase inhibitor against the HI299 culture.
Результаты ЛДГ-теста для культуры H1299 также показали наличие концентрационной зависимости цитотоксического эффекта ЛС К26К и незначительное увеличение ЛДГ в надосадочной жидкости (количество мертвых/разрушенных клеток) при увеличении времени инкубации до 48 часов. При сравнении цитотоксического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, анализируемого методом ЛДГ-теста, на исследуемых культурах рака легкого человека, было установлено, что наибольший эффект наблюдается в культуре H1299 (Рисунок 9).The results of the LDH test for the H1299 culture also showed the presence of a concentration dependence of the cytotoxic effect of LS K26K and a slight increase in LDH in the supernatant (the number of dead / destroyed cells) with an increase in the incubation time to 48 hours. When comparing the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase, analyzed by the LDH test, on the studied cultures of human lung cancer, it was found that the greatest effect was observed in the culture of H1299 (Figure 9).
Т.о. с помощью метода ЛДГ-теста было показано, что исследуемое лекарственное средство на основе пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы, обладает выраженным цитотоксическим эффектом относительно клеток рака легкого человека. Цитотоксический эффект линейно зависит от концентрации внесенного в культуральную среду пептидного ингибитора Ras-ГТФазы и, в меньшей степени, зависит от времени инкубации.So using the LDH test method, it was shown that the investigated drug based on the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor has a pronounced cytotoxic effect against human lung cancer cells. The cytotoxic effect linearly depends on the concentration of the peptide Ras-GTPase inhibitor introduced into the culture medium and, to a lesser extent, depends on the incubation time.
Пример 3. Исследование цитотоксичностипептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазыс помощью метода проточной цитофлуориметрии окраской CFDA-SE/PIExample 3. Study of the cytotoxicity of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor using the CFDA-SE / PI staining flow cytometry method
Регистрируемая методом проточной цитофлюориметрии двойная окраска CFDA-SE/PI позволяет различать живые клетки, окрашивающиеся витальным красителем CFDA-SE, и мертвые, окрашивающиеся пропидий иодидом (PI). При исследовании противоопухолевого эффекта последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы методом окраски CFDA-SE/PI было проведено сравнение эффектов исследуемой последовательности и лекарственных препаратов (ЛП), применяемых в медицинской практике: 5-фторурацил и этопозид. Данные по оценке цитотоксичностипептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы и ЛП 5-ФУ и этопозид, в отношении культуры А549 по связыванию PI, регистрируемые по 3 каналу флюоресценции, представлены на рисунке 10. Данные по оценке цитотоксичности для культуры А549 по связыванию CFDA-SE, регистрируемые по 1 каналу флюоресценции, представлены на рисунке 11. Время инкубации составляло 24 часа.The CFDA-SE / PI double staining by flow cytofluorimetry makes it possible to distinguish between living cells stained with the vital CFDA-SE stain and dead cells stained with propidium iodide (PI). When studying the antitumor effect of the sequence of the peptide Ras-GTPase inhibitor by the CFDA-SE / PI staining method, a comparison was made between the effects of the studied sequence and the drugs (MP) used in medical practice: 5-fluorouracil and etoposide. Data on the assessment of the cytotoxicity of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor and LP 5-FU and etoposide, in relation to the A549 culture for PI binding, recorded by
Из приведенных результатов видно, что исследуемая последовательность пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, оказывает сопоставимый с 5-ФУ и этопозидом цитотоксический эффект на клетки линии А549. Данный эффект при концентрациях 10 и 20 мкМ выше, чем у 5-ФУ, но несколько ниже, чем эффект этопозида.The results show that the studied sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase has a cytotoxic effect comparable to 5-FU and etoposide on A549 cells. This effect at concentrations of 10 and 20 μM is higher than that of 5-FU, but slightly lower than the effect of etoposide.
Результаты исследования цитотоксического эффекта пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы и сравнение данного эффекта с эффектами ЛП 5-ФУ и этопозид представлены на рисунках 12-13. Показано, что цитотоксический исследуемых лекарственных препаратов имеет линейную зависимость от концентрации.The results of the study of the cytotoxic effect of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor and the comparison of this effect with the effects of LP 5-FU and etoposide are presented in Figures 12-13. It has been shown that the cytotoxicity of the investigational drugs has a linear dependence on concentration.
Эффект пептидного ингибитора Ras-ГТФазы для культуры Н460 превосходит цитотоксический эффект 5-фторурацила, но ниже, чем эффект этопозида.The effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase for the H460 culture is superior to the cytotoxic effect of 5-fluorouracil, but lower than the effect of etoposide.
При исследовании эффективности пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы в отношении клеток линии HI299 и сравнение эффектов с цитотоксическими эффектами 5-фторурацила и этопозида в равных концентрациях, методом проточной цитофлуориметрии с двойной окраской CFDA-SE/PI, было показано, что на данную клеточную культуру последовательность пептидного ингибитораоказывает стойкий цитотоксический эффект. Данный эффект выражается в увеличении количества PI-положительных частиц (мертвые клетки) и снижении клеток, положительных по CFDA-SE. На рисунке 14 представлен эффект трех исследуемых лекарственных средств, показано, что уровень PI-положительных частиц возрастает в зависимости от увеличения концентрации ЛС, и для линии HI299 цитотоксический эффект пептидного ингибитора Ras-ГТФазы превосходит эффекты 5-фторурацила и этопозида. Рисунок 15 отражает изменение количества живых клеток, положительных по CFDA-SE.When studying the effectiveness of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor against HI299 cells and comparing the effects with the cytotoxic effects of 5-fluorouracil and etoposide in equal concentrations, by flow cytometry with double staining CFDA-SE / PI, it was shown that for this cell culture the sequence peptide inhibitor has a persistent cytotoxic effect. This effect is expressed in an increase in the number of PI-positive particles (dead cells) and a decrease in cells positive for CFDA-SE. Figure 14 shows the effect of the three studied drugs, it is shown that the level of PI-positive particles increases depending on the increase in the drug concentration, and for the HI299 line the cytotoxic effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase exceeds the effects of 5-fluorouracil and etoposide. Figure 15 reflects the change in the number of living cells positive for CFDA-SE.
Исследование эффективности пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы в отношении клеток линий А549, Н460 и H1299 методом двойной окраской CFDA-SE/PI показало, что противоопухолевый эффект пептидного ингибитора Ras-ГТФазы сопоставим с цитотоксическим эффектом стандартных противоопухолевых препаратов 5-фторурацил и этопозид.The study of the effectiveness of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor against the A549, H460 and H1299 cell lines by the CFDA-SE / PI double staining method showed that the antitumor effect of the peptide Ras-GTPase inhibitor is comparable to the cytotoxic effect of the standard antitumor drugs 5-fluorouracil and etoposide.
Пример 4. Исследование цитотоксичностипептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазыс помощью метода проточной цитофлуориметрии окраской AnnexinV/PIExample 4. Study of the cytotoxicity of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor using the AnnexinV / PI staining flow cytofluorimetry method
Цитометрический анализ культур А549, HI 299 и Н460 проводили на проточномцитофлуориметреСуюпихРС 500 (BeckmanCoulter, США). Накопление производили до 10000 событий. Для настройки режимов компенсации и установки границ квадрантов использовали следующие контроли: неокрашенные клетки; клетки, окрашенные только Annexin V-FITC (без PI); клетки, окрашенные только PI (без Annexin V-FITC). В образце оценивали показатели прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния клеток, интенсивность флуоресценции Annexin V-FITC (FL1) и PI (FL3). После исключения дебриса (по показателям прямого и бокового светорассеяния) определяли количество Annexin+- и PI+-клеток в режиме DotPlot (двумерная гистограмма). Количество апоптотических Annexin+-клеток определяли в верхнем левом квадранте, клетки в позднем апоптозе (Annexin+PI+-клетки) оценивали в верхнем правом квадранте гистограммы. Сбор данных и компьютерную обработку осуществляли с использованием программного обеспечения прибора.Cytometric analysis of A549, HI 299, and H460 cultures was performed on a SuyupihRS 500 flow cytometer (Beckman Coulter, United States). Up to 10,000 events were accumulated. To adjust the compensation modes and set the boundaries of the quadrants, the following controls were used: unstained cells; cells stained with Annexin V-FITC only (no PI); cells stained with PI only (no Annexin V-FITC). In the sample, the indicators of direct (FSC) and lateral (SSC) light scattering of cells, the intensity of Annexin V-FITC (FL1) and PI (FL3) fluorescence were evaluated. After excluding debris (according to the forward and side scattering parameters), the number of Annexin + and PI + cells was determined in the DotPlot mode (two-dimensional histogram). The number of apoptotic Annexin + cells was determined in the upper left quadrant, cells in late apoptosis (Annexin + PI + cells) were estimated in the upper right quadrant of the histogram. Data collection and computer processing were performed using the instrument software.
С помощью метода проточной цитофлуориметрии можно выявить самые ранние события процесса апоптоза, уловив стадию, когда «принимается решение» о переходе границы жизнеспособности и самом пути клеточной смерти. Известно, что пропидиум иодид является маркером клеток, находящихся в позднем апоптозе или некрозе (при некрозе происходит нарушение целостности клеточной мембраны, что позволяет PI войти в клетку и связаться с ДНК). Существуют также флуоресцентные красители, способные пометить клетки, «решившие» идти по пути апоптоза. Наиболее ранним событием, предваряющим такое решение, является окисление липидов клеточных мембран, происходящее под влиянием избыточной продукции активных форм кислорода. При этом особенно уязвимы ненасыщенные жирно-кислотные хвосты кислых фосфолипидов, представленные в мембранах в основном фосфатидилсерином. Образование гидроперекисей фосфатидилсерина нарушает его взаимодействие с белками цитоскелетааннексинами и облегчает миграцию окисленного фосфатидилсерина с внутренней стороны мембранного бислояна наружную. По этой причине фосфатидилсерин, который в нормальной клетке практически полностью локализован с внутренней стороны бислоя, при индукции апоптоза начинает появляться и с внешней стороны мембраны. Экспрессия фосфатидилсерина на наружной поверхности мембраны наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Этим обстоятельством и пользуются исследователи для того, чтобы отличить нормальные жизнеспособные клетки от тех, у которых выявляется готовность к апоптозу. В качестве соединения, маркирующего апоптозные клетки, используют рекомбинантный белок аннексии V (Annexin V), конъюгированный с флуоресцентным красителем. Обычно с этой целью применяют флуоресцеинизотиоционат, FITC. Таким образом, внесение в клеточную суспензию двух меток - PI (для выявления некроза) и аннексина V-FITC (для выявления апоптоза) - позволяет одновременно оценить количество интактных, апоптотических и некротических клеток в данной суспензии (жизнеспособные клетки - отрицательные и по аннексину V, и по PI; клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза,- положительные по аннексину V и отрицательные по PI; клетки на поздней стадии апоптоза или уже погибшие - положительные и по аннексину V, и по PI; погибшие клетки - отрицательные по аннексину V и положительные по PI.Using the method of flow cytometry, it is possible to identify the earliest events of the apoptosis process, catching the stage when the "decision is made" about crossing the border of viability and the very path of cell death. It is known that propidium iodide is a marker of cells in late apoptosis or necrosis (with necrosis, the integrity of the cell membrane is disrupted, which allows PI to enter the cell and bind to DNA). There are also fluorescent dyes that can mark cells that "decide" to follow the path of apoptosis. The earliest event preceding such a decision is the oxidation of cell membrane lipids, which occurs under the influence of excessive production of reactive oxygen species. In this case, unsaturated fatty acid tails of acidic phospholipids, which are represented in membranes mainly by phosphatidylserine, are especially vulnerable. The formation of phosphatidylserine hydroperoxides disrupts its interaction with proteins cytoskeletannexins and facilitates the migration of oxidized phosphatidylserine from the inner side of the membrane bilayer to the outer. For this reason, phosphatidylserine, which in a normal cell is almost completely localized on the inner side of the bilayer, begins to appear on the outer side of the membrane upon induction of apoptosis. Expression of phosphatidylserine on the outer surface of the membrane is observed from the early stage of apoptosis to complete cell degradation. This circumstance is used by researchers in order to distinguish normal viable cells from those in which readiness for apoptosis is revealed. Recombinant annexin V protein (Annexin V) conjugated to a fluorescent dye is used as a compound for marking apoptotic cells. Fluorescein isothiocyanate, FITC, is commonly used for this purpose. Thus, the introduction of two labels into the cell suspension - PI (for detecting necrosis) and annexin V-FITC (for detecting apoptosis) - makes it possible to simultaneously estimate the number of intact, apoptotic and necrotic cells in a given suspension (viable cells are negative for annexin V, and PI; cells at an early stage of apoptosis are positive for annexin V and negative for PI; cells at a late stage of apoptosis or already dead are positive for both annexin V and PI; dead cells are negative for annexin V and positive by PI.
Было проведено исследование эффективности последовательности пептидногоингибитора Ras-ГТФазыс помощью метода проточной цитофлуориметрии и окраски AnnexinV/PI. Оценка цитотоксического и проапоптотического эффектов проводилась для концентраций пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазы - 2, 5, 10, 20 и 40 мкМ; время инкубации составило 24 часа.The efficacy of the Ras-GTPase peptide inhibitor sequence was investigated using flow cytometry and AnnexinV / PI staining. Evaluation of cytotoxic and proapoptotic effects was carried out for the concentrations of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor - 2, 5, 10, 20 and 40 μM; incubation time was 24 hours.
Показано, что для исследуемых клеточных культур внесение пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазывызывает индукцию апоптоза. Уровень апоптоза зависит от концентрации, как и уровень клеток, погибших по пути некроза. Для противоопухолевой терапии наиболее предпочтителен вариант гибели опухолевых клеток по пути апоптоза, т.к. не вызывает обширного воспаления и выхода в интерстициальное пространство продуктов клеточного распада и индукторов воспалительных реакций. Также наличие высокого уровня апоптоза косвенно свидетельствует о специфичности воздействия исследуемой последовательности, представляющей собой ингибитор Ras-ГТФазы. В исследуемых культурах опухолевых клеток уровень апоптоза при воздействии на клетки пептидной последовательности ингибитора Ras-ГТФазыотличался, на рисунках 16-18 представлены результаты сравнения уровней апоптоза и некроза, индуцированные внесением Л С пептидного ингибитора в культуральную среду исследуемых линий.It was shown that for the studied cell cultures, the introduction of the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor induces the induction of apoptosis. The level of apoptosis depends on the concentration, as does the level of cells that have died along the path of necrosis. For antitumor therapy, the most preferable option is the death of tumor cells along the pathway of apoptosis, because does not cause extensive inflammation and release into the interstitial space of cellular decay products and inducers of inflammatory reactions. Also, the presence of a high level of apoptosis indirectly indicates the specificity of the effect of the studied sequence, which is an inhibitor of Ras-GTPase. In the studied cultures of tumor cells, the level of apoptosis when cells were exposed to the peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor was different; Figures 16-18 show the results of a comparison of the levels of apoptosis and necrosis induced by the introduction of the LС peptide inhibitor into the culture medium of the studied lines.
Как видно из представленных результатов (рисунки 16-18), зависимости уровней апоптоза и некроза для клеточных линий А549 и Н460 при воздействии на них последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, имеют схожий вид. Уровень апоптоза при воздействии исследуемой пептидной последовательности в концентрации 40 мкМ и времени инкубации 24 часа возрастает до 35% в культуре А549 и до 40% в культуре Н460, а уровни некроза до 32% и 31% соответственно, а также кривые имеют схожий вид. В то же время эффект воздействия последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на клетки линии HI299 имел принципиальные особенности (рисунок 18), уровень индуцированного апоптоза в данной культуре был достоверно выше, чем уровень некроза. Количество клеток, вступивших в апоптоз (ранний + поздний апоптоз) при воздействии пептидного ингибитора Ras-ГТФазыв концентрации 10 мкМ в среднем составило 27,7%, при увеличении концентрации до 20 мкМ -38% и при концентрации 40 мкМ составило 45%.As can be seen from the presented results (Figures 16-18), the dependences of the levels of apoptosis and necrosis for cell lines A549 and H460 when exposed to the sequence of the peptide inhibitor of Ras-GTPase have a similar appearance. The level of apoptosis when exposed to the studied peptide sequence at a concentration of 40 μM and an incubation time of 24 hours increases to 35% in culture A549 and up to 40% in culture H460, and the levels of necrosis are up to 32% and 31%, respectively, and the curves are similar. At the same time, the effect of the action of the sequence of the peptide inhibitor Ras-GTPase on HI299 cells had fundamental features (Figure 18), the level of induced apoptosis in this culture was significantly higher than the level of necrosis. The number of cells that entered apoptosis (early + late apoptosis) when exposed to the peptide inhibitor Ras-GTPase at a concentration of 10 μM averaged 27.7%, with an increase in concentration to 20 μM -38% and at a concentration of 40 μM it was 45%.
Проведенное исследование видов клеточной гибели (апоптоз и некроз) при воздействии на клетки линий рака легкого человека методом проточной цитофлуориметрии с использованием двойной окраски Annexin V-FITC / PI, показало: исследуемаяпептидная последовательность ингибитора Ras-ГТФазы, обладает выраженным специфическим противоопухолевым действием в отношении культур клеток рака легкого человека. Данный эффект характеризуется индукцией клеточной гибели преимущественно по пути апоптоза. Уровень апоптоза,индуцированного внесением в культуральную среду пептидного ингибитора, зависит от типа клеток и обусловлен, по-видимому, молекулярно-генетическими особенностями клеточной линии.The conducted study of the types of cell death (apoptosis and necrosis) when exposed to cells of human lung cancer lines by flow cytometry using a double staining Annexin V-FITC / PI, showed: the studied peptide sequence of the Ras-GTPase inhibitor has a pronounced specific antitumor effect on cell cultures human lung cancer. This effect is characterized by the induction of cell death predominantly along the pathway of apoptosis. The level of apoptosis induced by the introduction of a peptide inhibitor into the culture medium depends on the cell type and is apparently due to the molecular genetic characteristics of the cell line.
Пример 5. Исследование влияния последовательностей фрагментов ингибитора Ras-ГТФазына клеточный рост.Example 5. Investigation of the effect of sequences of Ras-GTPase inhibitor fragments on cell growth.
Для динамического исследования влияния лимфоцитов, трансфецированныхплазмидами, содержащими гены различных вариантов рецепторов использовали прибор RTCA iCELLIgence, фирмы ACEA Biosciences (США). Принцип метода основан на измерении импеданса приповерхностного слоя на дне культуральной лунки. Величина импеданса пропорциональна количеству клеток в лунке (или если точнее, площади, занимаемой клетками). Значения сопротивления, измеренные для электродов в индивидуальных лунках, зависят от геометрии электрода, концентрации ионов в лунке и от наличия клеток, фиксированных на электродах. В отсутствие клеток, электрическое сопротивление в первую очередь определяется ионным составом среды на границе раствора/электрода и в растворе. В присутствии клеток, они присоединяются к сенсорной поверхности электрода и действуют как изолятор, что приводит к изменению локального ионного окружения на границе раствора/электрода, и увеличению сопротивления. Таким образом, чем больше клеток располагается на электроде, тем сильнее меняется сопротивление этого электрода. Уникальность системы для клеточного анализа iCELLIgence в том, что она основана на микроэлектронных биосенсорах, которые позволяют динамически и в реальном времени анализировать клеточный ответ без использования дополнительных маркеров или меток. Таким образом, добавление ингибиторов роста или цитотоксических агентов к культуре растущих клеток приводит к угнетению роста и/или гибели клеток, что сопровождается снижением регистрируемого импеданса, как абсолютного, так и по сравнению с контрольными лунками, где рост клеток продолжается. Измерение производится периодически в течение всего времени эксперимента, что позволяет регистрировать динамику роста в каждой лунке с заданной периодичностью. С применением метода клеточного анализа iCELLIgence было проведено исследование цитостатического воздействия последовательности фрагмента ингибитора Ras-ГТФазына клетки культур А549, Н1299 и Н460.To dynamically study the effect of lymphocytes transfected with plasmids containing genes of different receptor variants, we used the RTCA iCELLIgence device, ACEA Biosciences (USA). The principle of the method is based on measuring the impedance of the surface layer at the bottom of the culture well. The magnitude of the impedance is proportional to the number of cells in the well (or more precisely, the area occupied by the cells). The resistance values measured for the electrodes in individual wells depend on the geometry of the electrode, the ion concentration in the well, and the presence of cells fixed to the electrodes. In the absence of cells, the electrical resistance is primarily determined by the ionic composition of the medium at the solution / electrode interface and in solution. In the presence of cells, they attach to the sensor surface of the electrode and act as an insulator, which results in a change in the local ionic environment at the solution / electrode interface and an increase in resistance. Thus, the more cells are located on an electrode, the more the resistance of this electrode changes. The uniqueness of the iCELLIgence system for cellular analysis is that it is based on microelectronic biosensors, which allow dynamic and real-time analysis of the cellular response without the use of additional markers or labels. Thus, the addition of growth inhibitors or cytotoxic agents to the culture of growing cells leads to inhibition of cell growth and / or death, which is accompanied by a decrease in the recorded impedance, both absolute and in comparison with control wells, where cell growth continues. The measurement is carried out periodically throughout the entire experiment, which makes it possible to record the growth dynamics in each well with a given frequency. Using the iCELLIgence cellular analysis method, we studied the cytostatic effect of the sequence of the Ras-GTPase inhibitor fragment in the A549, H1299, and H460 cultures.
Для каждой клеточной линии было поставлено по пять экспериментов по исследованию влияния пептидного ингибитора Ras-ГТФазына рост клеток при его концентрациях в диапазоне 2-40 мкМ. При проведении экспериментов клетки вносились на планшет в количестве 20000 на лунку, инкубировались 3 часа для начального закрепления на дне планшета, а затем к культуральной среде добавлялось исследуемое вещество в различных концентрациях. На рисунках 19-21 представлены примеры графиков клеточного роста для культур А549, Н460 и Н1299.For each cell line, five experiments were performed to study the effect of the peptide inhibitor Ras-GTPase on cell growth at its concentrations in the range of 2-40 μM. During the experiments, cells were added to the plate in an amount of 20,000 per well, incubated for 3 hours for initial fixation on the bottom of the plate, and then the test substance was added to the culture medium at various concentrations. Figures 19-21 show examples of cell growth plots for cultures A549, H460 and H1299.
При исследовании цитостатического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в отношении клеток линии А549, было показано, что эффект имеет четкую концентрационную зависимость. При воздействии на клетки пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в концентрации 2 мкМ показатель клеточного индекса (отражает количество прикрепленных, живых клеток) снижается относительно контрольного образца в 1,2 раза, при воздействии пептидного ингибитора в концентрации 5 мкМ в 1,6 раза, при 10 мкМ в 2,14 раза, при 20 мкМ в 4 раза, а при воздействии на клетки А549 пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в концентрации 40 мкМ мы наблюдали полную остановку пролиферации со снижением клеточного индекса до отрицательных значений, т.е. клеток становилось меньше, чем было внесено изначально.When studying the cytostatic effect of a peptide inhibitor of Ras-GTPase on A549 cells, it was shown that the effect has a clear concentration dependence. When cells are exposed to a peptide inhibitor of Ras-GTPase at a concentration of 2 μM, the cell index (reflects the number of attached living cells) decreases relative to the control sample by 1.2 times, when exposed to a peptide inhibitor at a concentration of 5 μM, 1.6 times, at 10 μM by 2.14 times, at 20 μM by 4 times, and when A549 cells were exposed to the peptide Ras-GTPase inhibitor at a concentration of 40 μM, we observed a complete stop of proliferation with a decrease in the cell index to negative values, i.e. cells became less than it was originally introduced.
При исследовании воздействия пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на клетки линии Н460 также был обнаружен цитостатический эффект, определяющийся по снижению пролиферативной активности в культуре при внесении в среду пептидного ингибитора. Эффект имел концентрационную зависимость: при воздействии на клетки Н460 пептидного ингибитора в концентрации 5 мкМ клеточный индекс снижался в 1,3 раза, при воздействии концентрации 10 мкМ - в 1,5 раза, при воздействии 20 мкМ в 2,4 раза, при воздействии 40 мкМ в 4 раза по сравнению с контрольными образцами.Investigation of the effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase on H460 cells also revealed a cytostatic effect, which is determined by a decrease in proliferative activity in culture when the peptide inhibitor is added to the medium. The effect had a concentration dependence: when H460 cells were exposed to a peptide inhibitor at a concentration of 5 μM, the cell index decreased by 1.3 times, when exposed to a concentration of 10 μM, by 1.5 times, when exposed to 20 μM, by 2.4 times, when exposed to 40
При исследовании цитостатического эффекта пептидного ингибитора Ras-ГТФазы «методом пролиферации в реальном времени» с помощью клеточного анализа iCELLIgence на клетках культуры Н1299 был получен более слабый эффект, чем для культур А549 и Н460. Так значение клеточного индекса при воздействии на клетки HI299 пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в концентрации 5 мкМ снижалось в среднем в 1,1 раза, при воздействии 10 мкМ в 1,5 раза, при воздействии 20 мкМ в 1,6 раза, при воздействии 40 мкМ в 2,5 раза. Полученный низкий цитостатический эффект для клеток HI299 вполне согласуется с результатами о высоком цитотоксическом эффекте пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в отношении данной клеточной линии. Клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью, по-видимому, более подвержены проапоптотическому воздействию ингибитopaRas-ГTФaзы, в то же время клетки, уходящие из под его воздействия продолжают вступать в деление и размножаться.In the study of the cytostatic effect of the peptide Ras-GTPase inhibitor by the "real-time proliferation method" using the iCELLIgence cellular assay on the H1299 culture cells, a weaker effect was obtained than for the A549 and H460 cultures. Thus, the value of the cell index when exposed to HI299 cells with a peptide inhibitor of Ras-GTPase at a concentration of 5 μM decreased on average 1.1 times, when exposed to 10 μM - 1.5 times, when exposed to 20 μM - 1.6 times, when exposed to 40 μM 2.5 times. The obtained low cytostatic effect for HI299 cells is in good agreement with the results on the high cytotoxic effect of the peptide Ras-GTPase inhibitor on this cell line. Cells with a high proliferative activity, apparently, are more susceptible to the proapoptotic effect of the inhibitor of aRas-GTPase, at the same time, cells leaving under its influence continue to divide and multiply.
С помощью программного обеспечения клеточного анализатора iCELLIgence были получены результаты времени удвоения культуры при воздействии на клетки пептидного ингибитора Ras-ГТФазы. Для линии клеток А549 было показано, что при концентрации пептидного ингибитора 40 мкМ время удвоения клеточной популяции возрастает до 18,4 часа, в контроле время удвоения культуры составляло - 8,3 часа (рисунок 22).Using the software of the iCELLIgence cellular analyzer, the results of the culture doubling time were obtained when cells were exposed to a peptide inhibitor of Ras-GTPase. For the A549 cell line, it was shown that at a concentration of the peptide inhibitor of 40 μM, the doubling time of the cell population increases to 18.4 hours, in the control, the culture doubling time was 8.3 hours (Figure 22).
Анализ времени удвоения клеточной популяции в культуре клеток Н460 было несколько больше, чем для А549, даже в контроле, что свидетельствует о более медленной пролиферации данной линии клеток. Воздействие пептидного ингибитора Ras-ГТФазы характеризовалось увеличением времени удвоения популяции, имело концентрационную зависимость (Рисунок 23).Analysis of the doubling time of the cell population in the H460 cell culture was slightly longer than for the A549, even in the control, which indicates a slower proliferation of this cell line. The effect of the peptide inhibitor of Ras-GTPase was characterized by an increase in the doubling time of the population, had a concentration dependence (Figure 23).
При воздействии лекарственного средства пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на культуру клеток Н460 в концентрации 20 мкМ задержка времени удвоения пролиферации составила - 1,8 раза, при увеличении концентрации пептидного ингибитора до 40 мкМ - 2,1 раза.When the drug of the peptide inhibitor of Ras-GTPase was exposed to the H460 cell culture at a concentration of 20 μM, the delay in the proliferation doubling time was 1.8 times, with an increase in the concentration of the peptide inhibitor to 40 μM - 2.1 times.
На рисунке 24 представлено рассчитанное время удвоения популяции клеток культуры Н1299. Показано, что данная клеточная линия отличается более высокой пролиферативной активностью, так время удвоения популяции в контрольном образце составляло 8,1 часа (для линии А549 - 8,3, для Н460 - 10,4). При увеличении концентрации пептидного ингибитора Ras-ГТФазыдо 20 мкМ наблюдалось линейное увеличение времени удвоения (18,3 часа при 20 мкМ), однако, увеличение концентрации до 40 мкМ не привело к дальнейшей задержке пролиферации и составило 18,4 часа.Figure 24 shows the calculated doubling time of the cell population of the culture H1299. It was shown that this cell line is characterized by a higher proliferative activity, so the doubling time of the population in the control sample was 8.1 hours (for line A549 - 8.3, for H460 - 10.4). With an increase in the concentration of the peptide inhibitor Ras-GTPase to 20 μM, a linear increase in the doubling time was observed (18.3 hours at 20 μM), however, an increase in concentration to 40 μM did not lead to a further delay in proliferation and amounted to 18.4 hours.
Таким образом, при исследовании противоопухолевого эффекта последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в отношении культур рака легкого человекаА549, HI299 и Н460 было показано, что исследуемое лекарственное средство является потенциальным противоопухолевым препаратом. Обладает выраженной цитотоксической активностью, определяющейся в увеличении количества мертвых клеток и снижении количества живых клеток в культурах исследуемых линий. Исследуемое лекарственное средство индуцирует апоптоз в клетках рака легкого человека, причем, данный эффект зависит от типа клеточной линии. Цитотоксический и проапоптотический эффекты имеют прямую концентрационную зависимость. Цитостатический эффект последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, определяющейся в снижении пролиферативной активности клеток при внесении его в культуральную среду, также имеет концентрационную зависимость и различен для разного типа клеток.Thus, in the study of the antitumor effect of the sequence of the peptide Ras-GTPase inhibitor against human lung cancer cultures A549, HI299 and H460, it was shown that the investigated drug is a potential antitumor drug. It has a pronounced cytotoxic activity, which is determined by an increase in the number of dead cells and a decrease in the number of living cells in the cultures of the studied lines. The investigational drug induces apoptosis in human lung cancer cells, and this effect depends on the type of cell line. Cytotoxic and proapoptotic effects have a direct concentration dependence. The cytostatic effect of the sequence of a peptide inhibitor of Ras-GTPase, which is determined in a decrease in the proliferative activity of cells when introduced into the culture medium, also has a concentration dependence and is different for different types of cells.
Заключение.Conclusion.
Анализ эффективности лекарственного средства in vitro последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазывключал исследование оценки цитотоксического и цитостатического эффектов на клеточные культуры А549, HI299 и Н460. Методами МТТ-теста, ЛДГ-теста и методом проточной цитометрии с CFDA-SE/PI окраской был оценен цитотоксический эффект исследуемой последовательности. Методом проточнойцитометрии (окраска AnnexinV/PI) проведено исследование уровня апоптоза. Использование метода «пролиферации в реальном времени» RTCA iCELLIgence позволило оценить цитостатический эффект.The analysis of drug efficacy in vitro of the sequence of the peptide inhibitor Ras-GTPase included a study to assess the cytotoxic and cytostatic effects on cell cultures A549, HI299 and H460. The cytotoxic effect of the sequence under study was assessed using the MTT test, the LDH test, and flow cytometry with CFDA-SE / PI staining. The apoptosis level was studied by flow cytometry (AnnexinV / PI staining). Using the RTCA iCELLIgence "real-time proliferation" method made it possible to assess the cytostatic effect.
На основании проведенных исследований было показано, что исследуемое лекарственное средство пептидный ингибитор Ras-ГТФазы обладает выраженными противоопухолевыми свойствами в отношении культур клеток рака легкого человека.Based on the studies carried out, it was shown that the investigated drug, a peptide inhibitor of Ras-GTPase, has pronounced antitumor properties against human lung cancer cell cultures.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ IN VIVOIN VIVO PERFORMANCE STUDY RESULTS
Пример 6. Эффективность ингибитора Ras-ГТФазы в отношении опухолевых клеток Карцинома Льюиса (LCC)Example 6. Efficacy of a Ras-GTPase inhibitor against Lewis carcinoma (LCC) tumor cells
Было проведено изучение выживаемости мышей с внутрибрюшинно трансплантированными клетками аденокарциномы легкого Lewisnpn лечении лекарственным средством ингибитором Ras-ГТФазы. Животные были разделены на 4 основные группы:A survival study was carried out in mice with intraperitoneal transplanted Lewisnpn lung adenocarcinoma cells treated with a Ras-GTPase inhibitor drug. The animals were divided into 4 main groups:
Внутрибрюшинное введение 0,1 мг/мышь (5 мг/кг) ингибитора Ras-ГТФазы каждый день;Intraperitoneal administration of 0.1 mg / mouse (5 mg / kg) of Ras-GTPase inhibitor every day;
Внутрибрюшинное введение 0,2 мг/мышь (10 мг/кг) ингибитора Ras-ГТФазы, в 0,2 мл раствора 0,9% NaCl каждый день;Intraperitoneal injection of 0.2 mg / mouse (10 mg / kg) of Ras-GTPase inhibitor, in 0.2 ml of 0.9% NaCl solution every day;
Внутрибрюшинное введение 0,1 мг/мышь (5 мг/кг) ингибитора Ras-ГТФазы через день;Intraperitoneal administration of 0.1 mg / mouse (5 mg / kg) of Ras-GTPase inhibitor every other day;
Внутрибрюшинное введение 0,2 мг/мышь (10 мг/кг) ингибитора Ras-ГТФазы, в 0,2 мл раствора 0,9% NaCl через день;Intraperitoneal administration of 0.2 mg / mouse (10 mg / kg) of Ras-GTPase inhibitor, in 0.2 ml of 0.9% NaCl solution every other day;
Контрольные группы - животные с внутрибрюшинно трансплантированной аденокарциномой легкого Lewis, каждый/через день введение 0,2 мл раствора 0,9% NaCl.Control groups - animals with intraperitoneally transplanted Lewis lung adenocarcinoma, every / every other day administration of 0.2 ml of 0.9% NaCl solution.
В каждую группу входило 12 животных: 6 самцов + 6 самок.Each group consisted of 12 animals: 6 males + 6 females.
Выживаемость оценивалась до гибели 100% животных с успешно трансплантированными опухолями. Количество введений составило 12 инъекций для групп 1 и 2; и 6 инъекций для групп 3 и 4.The survival rate was assessed until the death of 100% of animals with successfully transplanted tumors. The number of injections was 12 injections for
Результаты проведенного исследования показали достоверные отличия в выживаемости для группы 4 -введение препарата в дозе 10 мг/кг через день от группы контроля. Достоверных отличий между группами самцы и самки получено не было.The results of the study showed significant differences in survival for group 4 - administration of the drug at a dose of 10 mg / kg every other day from the control group. No significant differences were found between the groups of males and females.
Сравнение полученных кривых выживаемости для режимов «каждый день» и «через день» показывают тенденцию улучшения выживаемости при режимах введения ингибитором Ras-ГТФазы через день (оба режима через день при равных разовых дозах показывают тенденцию к лучшей выживаемости в группах несмотря на более низкую суммарную дозу (рис. 25, рис. 26).Comparison of the obtained survival curves for the "every day" and "every other day" regimens show a tendency for an improvement in survival with the regimens of administration of the Ras-GTPase inhibitor every other day (both regimens every other day at equal single doses show a trend towards better survival in the groups despite the lower total dose (fig. 25, fig. 26).
Как показано на рисунках 25 и 26, наилучшая выживаемость была зафиксирована в группе №4 (доза 10 мг/кг, режим введения - через день) как для самцов, так и для самок. Сравнение режимов также демонстрирует тенденцию большей эффективности при введении препарата через день, хотя отличия для групп не достоверны. Таким образом, независимо от пола животных, показано, что при режиме введения препарата через день и разовой дозе 10 мг/кг достоверно увеличивается продолжительность жизни экспериментальных животных. Процент увеличения продолжительности жизни животных вычислялся по формуле:As shown in Figures 25 and 26, the best survival rate was recorded in group 4 (dose 10 mg / kg, administration mode - every other day) for both males and females. Comparison of the regimens also demonstrates a tendency of greater efficiency when the drug is administered every other day, although the differences for the groups are not significant. Thus, irrespective of the sex of the animals, it has been shown that the life expectancy of experimental animals is significantly increased when the drug is administered every other day and a single dose of 10 mg / kg. The percentage increase in the life span of animals was calculated by the formula:
УПЖ=(СПЖопыт-СПЖконтроль)СПЖконтроль×100%ALE = (ALE experience - ALE control ) ALE control × 100%
Было показано, что достоверные отличия, выявленные для групп 4 (самцы и самки), составляют 21% для самцов и 25% для самок. Для групп 1-3 увеличение продолжительности жизни животных достоверно от контрольной группы не отличалось.It was shown that significant differences identified for groups 4 (males and females) are 21% for males and 25% for females. For groups 1-3, the increase in the life span of animals did not differ significantly from the control group.
Динамики роста внутрибрюшинно трансплантированной опухоли - аденокарциномы легкого мышей линии С57 В1/6 на фоне введения ингибитора Ras-ГТФазыпри 2 схемах и 2 дозах применения оценивалась по увеличению веса животных - нарастанию асцита. Однако в проведенном исследовании наблюдалась ранняя гибель животных, первые погибшие на 8 день после перевивки опухолей, а изменения веса животных (нарастание асцита) достоверно не отличалось в исследованных группах.The dynamics of the growth of an intraperitoneally transplanted tumor - adenocarcinoma of the lung of C57 B1 / 6 mice against the background of the administration of the Ras-GTPase inhibitor at 2 schemes and 2 doses of application - was assessed by the increase in the weight of the animals - the increase in ascites. However, in this study, early death of animals was observed, the first ones that died on the 8th day after inoculation of tumors, and changes in the weight of animals (increase in ascites) did not differ significantly in the studied groups.
При исследовании эффективности ингибитора Ras-ГТФазы в отношении опухолевых клеток Карцинома Льюиса (LCC), было показано что наилучший противоопухолевый эффект достигается привведение препарата в дозе 10 мг/кг с интервалом через день. Для данной группы (4) получены достоверные отличия выживаемости относительно группы контроля.When studying the effectiveness of the Ras-GTPase inhibitor against tumor cells Lewis carcinoma (LCC), it was shown that the best antitumor effect is achieved by administering the drug at a dose of 10 mg / kg with an interval of every other day. For this group (4), significant differences in survival were obtained relative to the control group.
Пример 7. Эффективность ингибитора Ras-ГТФазына модели опухолевых клеток рака легоко человека (А549).Example 7. Efficacy of a Ras-GTPase inhibitor in a human lung cancer tumor cell model (A549).
Было проведено изучение динамики роста опухоли и выживаемости мышей с подкожнотрансплантированной опухолью - аденокарциномой легкого человека (А549) у мышей линии BALBc (NUDE) на фоне введения ингибитора Ras-ГТФазыпри 2 дозах применения. Животные были разделены на 2 основные группы:We studied the dynamics of tumor growth and survival of mice with a subcutaneous tumor - human lung adenocarcinoma (A549) in BALBc mice (NUDE) against the background of the administration of the Ras-GTPase inhibitor at 2 doses. The animals were divided into 2 main groups:
Внутривенное введение (5 мг/кг) ингибитора Ras-ГТФазы в 0,2 мл раствора 0,9% через день;Intravenous administration (5 mg / kg) of a Ras-GTPase inhibitor in 0.2 ml of a 0.9% solution every other day;
Внутривенное введение (10 мг/кг) ингибитора Ras-ГТФазы, в 0,2 мл раствора 0,9% NaCl через день;Intravenous administration (10 mg / kg) of Ras-GTPase inhibitor, in 0.2 ml of 0.9% NaCl solution every other day;
Контрольную группу составили животные с подкожнотрансплантированной опухолью аденокарциномы легкого человека (А549), введение через день 0,2 мл раствора 0,9% NaCl. В каждую группу входило 12 животных: 6 самцов + 6 самок.The control group consisted of animals with a subcutaneous tumor of adenocarcinoma of the human lung (A549), the introduction of 0.2 ml of a solution of 0.9% NaCl every other day. Each group consisted of 12 animals: 6 males + 6 females.
При исследовании динамики роста опухоли и выживаемости мышей линии BALBc (NUDE) с подкожно трансплантированной опухолью культуры А549 достоверных отличий между самцами и самками внутри каждой группы получено не было, поэтому данные самцы-самки были объединены. На рисунке 27 (фото) представлен типичный вид опухолей в контрольной (рисунок 27 А) и опытной группе 2 (рисунок 27 В) на 16 день после перевивки опухолей.When studying the dynamics of tumor growth and survival of BALBc (NUDE) mice with a subcutaneously transplanted tumor of the A549 culture, there were no significant differences between males and females within each group; therefore, these males-females were combined. Figure 27 (photo) shows a typical type of tumors in the control (Figure 27 A) and experimental group 2 (Figure 27 B) on the 16th day after tumor grafting.
Изучение динамики роста подкожно трансплантированной опухоли - аденокарциномы легкого человека у мышей NUDE на фоне введения ингибитора Ras-ГТФазыпри 2 дозах применения показало достоверное торможение роста опухоли.The study of the growth dynamics of a subcutaneously transplanted tumor - adenocarcinoma of the human lung in NUDE mice against the background of the administration of the Ras-GTPase inhibitor at 2 doses of use showed a significant inhibition of tumor growth.
Торможение роста составило (на момент 100% гибели группы контроля) для группы с режимом введения через день и дозой 10 мг/кг - 57,3%, а для группы с дозой 5 мг/кг -30,5% (рисунок 28).Growth inhibition was (at the time of 100% death of the control group) for the group with the every other day and a dose of 10 mg / kg - 57.3%, and for the group with a dose of 5 mg / kg -30.5% (Figure 28).
Как показано на рисунке 28, минимальные различия в объемах опухолей наблюдались с 8 дня после перевивки опухолей, после 1 инъекции ингибитора Ras-ГТФазы. На 22 день после перевивки (после 8 инъекций исследуемого лекарственного средства, в режиме введения через день) отличия между группами были максимальны (Таблица 3, рисунок 29).As shown in Figure 28, minimal differences in tumor volumes were observed from
На рисунке 29 представлены изменения относительного объема (относительно объема опухоли на момент начала введения ЛС) опухолей в исследуемых группах на 22 день после перевивки.Figure 29 shows changes in the relative volume (relative to the tumor volume at the time of initiation of drug administration) of tumors in the study groups on
Изучение динамики роста подкожно трансплантированной опухоли - аденокарциномы легкого человека у мышей NUDE на фоне введения ингибитора Ras-ГТФазыпри 2 дозах применения показало достоверное торможение роста опухоли в обеих группах, однако наилучший эффект был достигнут при внутривенном введении ЛС в дозе 0,2 мг/мышь (10 мг/кг).The study of the growth dynamics of a subcutaneously transplanted tumor - adenocarcinoma of the human lung in NUDE mice against the background of the administration of the Ras-GTPase inhibitor at 2 doses of use showed a significant inhibition of tumor growth in both groups, however, the best effect was achieved with the intravenous injection of drugs at a dose of 0.2 mg / mouse ( 10 mg / kg).
Анализ выживаемости показал, что применение обеих доз лечения (0,1 мг/мышь (5 мг/кг) и 0,2 мг/мышь (10 мг/кг)) при режиме введения через день существенно увеличивают время жизни экспериментальных животных. На момент 100% гибели животных в контрольной группе, получавшей инъекции NaCl, в группе с вводимой дозой 5 мг/кг было живо 66%, а в группе с дозой 10 мг/кг - 60% животных. При этом дальнейшее наблюдение показало, что в группе с дозой 10 мг/кг гибели животных не наблюдается при наблюдении более 10 дней после гибели всех животных в контрольной группе. В группе с дозой 5 мг/кг за этот период наблюдения осталось живо 33% животных (рисунок 30).Survival analysis showed that the use of both doses of treatment (0.1 mg / mouse (5 mg / kg) and 0.2 mg / mouse (10 mg / kg)) with the administration mode every other day significantly increased the survival time of experimental animals. At the time of 100% death of animals in the control group that received NaCl injections, 66% were alive in the group with an injected dose of 5 mg / kg, and 60% of the animals in the group with a dose of 10 mg / kg. At the same time, further observation showed that in the group with a dose of 10 mg / kg, the death of animals was not observed when observed for more than 10 days after the death of all animals in the control group. In the group with a dose of 5 mg / kg, 33% of the animals remained alive during this observation period (Figure 30).
Процент увеличения продолжительности жизни животных вычислялся по формуле:The percentage increase in the life span of animals was calculated by the formula:
УПЖ=(СПЖопыт- СПЖконтроль)/СПЖконтроль×100%ALE = (ALE experience - ALE control ) / ALE control × 100%
Получены достоверные отличия с контролем для групп 1 и 2, в группе 1 (0,1 мг/мышь (5 мг/кг)) увеличение продолжительности жизни животных составило 16% относительно контрольной группы; в группе 2 (0,2 мг/мышь (10 мг/кг)) увеличение продолжительности жизни животных составило 36,3% относительно контрольной группы. Т.о. для подкожно трансплантированной опухоли культуры А549 (рак легкого, человек), также как и в случае с клетками аденокарциномы легкого Lewis, было доказано увеличение выживаемости при введении ингибитора Ras-ГТФазы по схеме введения препарата через день.Significant differences were obtained with the control for
ЗаключениеConclusion
Исследование эффективности ингибитора Ras-ГТФазы в отношении опухолевых клеток карцинома Льюиса (LCC) при двух дозах и двух интервалах ведения выявило достоверное увеличение продолжительности жизни животных в группе с введением лекарственного средства в дозе 0,2 мг/мышь (10 мг/кг) с интервалом через день. Различия между самцами и самками были незначительны и увеличение продолжительности жизни относительно контрольной группы составляло 21% для самцов и 25% для самок. Для опытных групп с введением лекарственного средства каждый день увеличение продолжительности жизни животных достоверно от контрольной группы не отличалось. Изменение увеличения объема опухоли из клеток карциномы Льюиса (LCC) имели большой разброс данных и различия между группами были недостоверны.The study of the efficacy of the Ras-GTPase inhibitor against Lewis carcinoma (LCC) tumor cells at two doses and two intervals of administration revealed a significant increase in the life expectancy of animals in the group with the introduction of the drug at a dose of 0.2 mg / mouse (10 mg / kg) with an interval in one day. Differences between males and females were insignificant and the increase in life span relative to the control group was 21% for males and 25% for females. For the experimental groups with the introduction of the drug every day, the increase in the life expectancy of animals did not differ significantly from the control group. The change in the increase in tumor volume from Lewis carcinoma cells (LCC) had a wide range of data and differences between groups were not significant.
Исследования динамики роста опухоли и выживаемости мышей с подкожно трансплантированной опухолью - аденокарциномой легкого человека (А549) у мышей линии BALBc (NUDE) на фоне введения ингибитора Ras-ГТФазы были проведены при 2 дозах применения (0,1 мг/мышь (5 мг/кг) и 0,2 мг/мышь (10 мг/кг)) и схеме введения ЛС через день. Показано, что введение ЛС - ингибитора Ras-ГТФазы в исследуемых группах увеличивает продолжительность жизни и тормозит развитие опухоли. Было получено, что наибольший эффект оказывает доза 0,2 мг/мышь (10 мг/кг), на 36,3% увеличилась продолжительность жизни животных относительно контрольной группы, а торможение роста опухоли составило (на момент 100% гибели группы контроля) - 57,3%.Studies of the dynamics of tumor growth and survival of mice with a subcutaneously transplanted tumor - human lung adenocarcinoma (A549) in BALBc mice (NUDE) against the background of administration of a Ras-GTPase inhibitor were carried out at 2 doses (0.1 mg / mouse (5 mg / kg ) and 0.2 mg / mouse (10 mg / kg)) and the drug administration schedule every other day. It has been shown that the administration of drugs, an inhibitor of Ras-GTPase, in the studied groups increases the lifespan and inhibits the development of the tumor. It was found that a dose of 0.2 mg / mouse (10 mg / kg) had the greatest effect, the life expectancy of animals increased by 36.3% relative to the control group, and the inhibition of tumor growth was (at the time of 100% death of the control group) - 57 , 3%.
Т.о. было показано, что лекарственное средство на основе пептидного ингибитора Ras-ГТФазы, обладает противоопухолевым эффектом в отношении клеток немелкоклеточного рака легкого человека (А549).So it has been shown that a drug based on a peptide inhibitor of Ras-GTPase has an antitumor effect on human non-small cell lung cancer cells (A549).
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВLIST OF USED SOURCES
1. Ahmadian MR, Stege Р, Scheffzek К, Wittinghofer A. Confirmation of the arginine-finger hypothesis for the GAP-stimulated GTP-hydrolysis reaction of Ras. Nat Struct Biol. 1997 Sep; 4(9): 686-9.1. Ahmadian MR, Stege P, Scheffzek K, Wittinghofer A. Confirmation of the arginine-finger hypothesis for the GAP-stimulated GTP-hydrolysis reaction of Ras. Nat Struct Biol. 1997 Sep; 4 (9): 686-9.
2. 2. Scheffzek K, Ahmadian MR, Kabsch W, Wiesmuller L, Lautwein A, Schmitz F, Wittinghofer A. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants.Science. 1997 Jul 18; 277(5324): 333-8.2. 2. Scheffzek K, Ahmadian MR, Kabsch W, Wiesmuller L, Lautwein A, Schmitz F, Wittinghofer A. The Ras-RasGAP complex: a structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science. 1997
3. Colombo S, Peri F, Tisi R, Nicotra F, Martegani E. Design and characterization of a new class of inhibitors of ras activation. Ann N Y AcadSci 2004; 1030: 52-61.3. Colombo S, Peri F, Tisi R, Nicotra F, Martegani E. Design and characterization of a new class of inhibitors of ras activation. Ann N Y AcadSci 2004; 1030: 52-61.
4. Hocker HJ, Cho KJ, Chen CY, Rambahal N, Sagineedu SR, Shaari K, et al. Andrographolide derivatives inhibit guanine nucleotide exchange and abrogate oncogenic Ras function. ProcNatlAcadSci USA 2013; 110: 10201-64. Hocker HJ, Cho KJ, Chen CY, Rambahal N, Sagineedu SR, Shaari K, et al. Andrographolide derivatives inhibit guanine nucleotide exchange and abrogate oncogenic Ras function. ProcNatlAcadSci USA 2013; 110: 10201-6
5. Cortes J., Albitar M., Thomas D., Giles F., Kurzrock R., Thibault A., et al., Efficacy of the farnesyltransferase inhibitor R1 15777 in chronic myeloid leukemia and other hematologic malignancies, Blood, 2003, 101, 1692-16975. Cortes J., Albitar M., Thomas D., Giles F., Kurzrock R., Thibault A., et al., Efficacy of the farnesyltransferase inhibitor R1 15777 in chronic myeloid leukemia and other hematologic malignancies, Blood, 2003, 101, 1692-1697
6. Alsina M., Fonseca R., Wilson E.F., Belle A.N., Gerbino E., Price-Troska Т., et al., Farnesyltransferase inhibitor tipifarnib is well tolerated, induces stabilization of disease, and inhibits farnesylation and oncogenic/tumor survival pathways in patients with advanced multiple myeloma, Blood, 2004, 103, 3271-32776. Alsina M., Fonseca R., Wilson EF, Belle AN, Gerbino E., Price-Troska T., et al., Farnesyltransferase inhibitor tipifarnib is well tolerated, induces stabilization of disease, and inhibits farnesylation and oncogenic / tumor survival pathways in patients with advanced multiple myeloma, Blood, 2004, 103, 3271-3277
7. Kim E.S., Kies M.S., Fossella F.V., Glisson B.S., Zaknoen S., Statkevich P., et al., Phase II study of the farnesyltransferase inhibitor lonafarnib with paclitaxel in patients with taxane-refractory/ resistant nonsmall cell lung carcinoma, Cancer, 2005, 104, 561-5697. Kim ES, Kies MS, Fossella FV, Glisson BS, Zaknoen S., Statkevich P., et al., Phase II study of the farnesyltransferase inhibitor lonafarnib with paclitaxel in patients with taxane-refractory / resistant nonsmall cell lung carcinoma, Cancer , 2005, 104, 561-569
8. Upadhyaya P, Qian Z, Seiner NG, Clippinger SR1, Wu Z, Briesewitz R, Pei D. - Inhibition of Ras signaling by blocking Ras-effector interactions with cyclic peptides. - AngewChemlnt Ed Engl. 2015 Jun 22; 54(26): 7602-6. doi: 10.1002/anie.201502763. Epub 2015 May 78. Upadhyaya P, Qian Z, Seiner NG, Clippinger SR 1 , Wu Z, Briesewitz R, Pei D. - Inhibition of Ras signaling by blocking Ras-effector interactions with cyclic pedes. - AngewChemlnt Ed Engl. 2015
9. Fawell S., Seery J. et al., 1994; Vives E., Brodin P., Lebleu B. 1997; Kaplan I.M. et al., 2005; Gupta B. et al., 2005; Fernandez-Carneado J. et al., 20059. Fawell S., Seery J. et al., 1994; Vives E., Brodin P., Lebleu B. 1997; Kaplan I.M. et al., 2005; Gupta B. et al., 2005; Fernandez-Carneado J. et al., 2005
10. Георгиев Г.П. 2000; Wender P.A. et al., 2000; Барышников А.Ю. 200410. Georgiev G.P. 2000; Wender P.A. et al., 2000; Baryshnikov A.Yu. 2004
11. Schutze-Redelmeier M.P. и др., 2004; Trehin R., Merkle H.P., 2004; Cong-Mei Wu и др., 200411. Schutze-Redelmeier M.P. et al., 2004; Trehin R., Merkle H. P., 2004; Cong-Mei Wu et al., 2004
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136183A RU2728870C2 (en) | 2017-10-12 | 2017-10-12 | Polypeptides for treating oncological diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136183A RU2728870C2 (en) | 2017-10-12 | 2017-10-12 | Polypeptides for treating oncological diseases |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017136183A RU2017136183A (en) | 2019-04-12 |
| RU2017136183A3 RU2017136183A3 (en) | 2019-08-15 |
| RU2728870C2 true RU2728870C2 (en) | 2020-07-31 |
Family
ID=66168105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017136183A RU2728870C2 (en) | 2017-10-12 | 2017-10-12 | Polypeptides for treating oncological diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2728870C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025127968A3 (en) * | 2023-12-14 | 2025-08-07 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Российский Научный Центр Рентгенорадиологии" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (Фгбу "Рнцрр" Минздрава России). | Ras-gtpase inhibitor and use thereof to treat oncological diseases |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2257911C2 (en) * | 1999-08-13 | 2005-08-10 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Methods and compositions applicable for modulation of antiogenesis using protein kinases raf and ras |
| RU2435783C1 (en) * | 2010-09-29 | 2011-12-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс" | Chimeric peptide and pharmaceutical composition for treating cancer |
| WO2015001045A2 (en) * | 2013-07-03 | 2015-01-08 | Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Pro-apoptotic ras and raf peptides |
| CA2950780A1 (en) * | 2014-06-17 | 2015-12-23 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Method for treating cancer using a combination of chk1 and atr inhibitors |
-
2017
- 2017-10-12 RU RU2017136183A patent/RU2728870C2/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2257911C2 (en) * | 1999-08-13 | 2005-08-10 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Methods and compositions applicable for modulation of antiogenesis using protein kinases raf and ras |
| RU2435783C1 (en) * | 2010-09-29 | 2011-12-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс" | Chimeric peptide and pharmaceutical composition for treating cancer |
| WO2015001045A2 (en) * | 2013-07-03 | 2015-01-08 | Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Pro-apoptotic ras and raf peptides |
| CA2950780A1 (en) * | 2014-06-17 | 2015-12-23 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Method for treating cancer using a combination of chk1 and atr inhibitors |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PUNIT UPADHYAYA et al., Inhibition of Ras Signaling by Blocking Ras-Effector Interactions with Cyclic Peptides, Angewandte Chemie International Edition Vol. 54, No. 26, pp. 7602-7606, 2015. * |
| БОЖЕНКО В.К. и др. Исследование влияния интернализуемого пептида P16INK4A на краткосрочные культуры опухолей человека, Вопросы онкологии, 2009, Т.55, N 4, С.451-454. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025127968A3 (en) * | 2023-12-14 | 2025-08-07 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Российский Научный Центр Рентгенорадиологии" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (Фгбу "Рнцрр" Минздрава России). | Ras-gtpase inhibitor and use thereof to treat oncological diseases |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017136183A3 (en) | 2019-08-15 |
| RU2017136183A (en) | 2019-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gao et al. | Mitochondrion-targeted supramolecular “nano-boat” simultaneously inhibiting dual energy metabolism for tumor selective and synergistic chemo-radiotherapy | |
| KR20160064726A (en) | Conjugate of Cell Penetrating Peptides-Anti-cancer Agent and Composition Comprising the Same | |
| JP2020534289A (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
| US9314497B2 (en) | E2F as a target of hormone refractory prostate cancer | |
| RU2728870C2 (en) | Polypeptides for treating oncological diseases | |
| KR102324242B1 (en) | Novel aptamer and its uses | |
| CN114605501A (en) | Polypeptide FIP-21 capable of antagonizing RNA binding activity of FUS protein and application thereof | |
| RU2435783C1 (en) | Chimeric peptide and pharmaceutical composition for treating cancer | |
| US20220177547A1 (en) | Ferritin nanocage for multi-displaying trail trimer and cancer-targeting peptide and use thereof as anticancer agent | |
| RU2369402C1 (en) | Chimeric peptide for epithelial and mesenchymal malignant neoplasms treatment | |
| PT1869185E (en) | Conjugate comprising p21 protein for the treatment of cancer | |
| US8969515B2 (en) | Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases | |
| WO2021239667A1 (en) | New therapy for the treatment of tumors | |
| US20130196933A1 (en) | Methods and Compositions Inhibiting Tumor Cell Proliferation | |
| WO2013056255A1 (en) | Methods and compositions for inhibiting tumor cell proliferation | |
| KR100898866B1 (en) | Compositions and methods for inducing apoptosis using the original oncogene protein DEV and transgenic fruit flies expressing DEV | |
| KR102267463B1 (en) | cancer antigen peptide | |
| Kapan et al. | Toward Mitochondrial Targeting of Resistant Triple-Negative Breast Cancer Using Triphenylphosphonium-Conjugated Antimicrobial Peptides | |
| US20110142918A1 (en) | Anti-angiogenic compositions and therapeutic applications thereof | |
| KR20250139993A (en) | Intracellular localization of bioluminescence resonance energy transfer system and use thereof | |
| WO2025127968A2 (en) | Ras-gtpase inhibitor and use thereof to treat oncological diseases | |
| JP2009500314A (en) | Gene regulation | |
| HK1196766B (en) | Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases | |
| WO2005019451A1 (en) | Nucleic acid construct for expressing pdk-1 activity inhibitor | |
| Notario et al. | Targeting EWS/FLI1 Driven Signaling Pathways as Therapy for Tumors of the Ewing’s Sarcoma Family |