RU2728361C1 - Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью - Google Patents
Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2728361C1 RU2728361C1 RU2019132876A RU2019132876A RU2728361C1 RU 2728361 C1 RU2728361 C1 RU 2728361C1 RU 2019132876 A RU2019132876 A RU 2019132876A RU 2019132876 A RU2019132876 A RU 2019132876A RU 2728361 C1 RU2728361 C1 RU 2728361C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- her2
- cells
- car
- product
- cell
- Prior art date
Links
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 10
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 10
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 10
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 abstract description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 6
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 abstract 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 101001068136 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 102100034459 Hepatitis A virus cellular receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000831286 Homo sapiens Protein timeless homolog Proteins 0.000 description 2
- 101000752245 Homo sapiens Rho guanine nucleotide exchange factor 5 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 2
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001005269 Arabidopsis thaliana Ceramide synthase 1 LOH3 Proteins 0.000 description 1
- 101001005312 Arabidopsis thaliana Ceramide synthase LOH1 Proteins 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100038497 Cytokine receptor-like factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000956427 Homo sapiens Cytokine receptor-like factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001024605 Homo sapiens Next to BRCA1 gene 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 101000668858 Spinacia oleracea 30S ribosomal protein S1, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 101000898746 Streptomyces clavuligerus Clavaminate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к биомедицинским клеточным продуктам, и может быть использовано для экспрессии анти-HER2 CAR. Полученный продукт обладает анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью и представлен популяциями анти-HER2 CAR-NK и анти-HER2 CAR-T клеток, а также лимфокин активированными киллерами с ограниченным периодом экспрессии химерного антигенного рецептора (3-5 суток). Продукт характеризуется ускоренным периодом получения (менее чем 9 суток), эффективность которого сопровождается одновременной активацией врожденного и адоптивного иммунного ответов, предназначенный для лечения пациентов с солидными опухолями, экспрессирующими рецептор эпидермального фактора роста (HER2). Заявляемый продукт получен из аутологичных мононуклеарных лимфоцитов, активированных препаратом человеческого рекомбинатного цитокина и подвергнутых генетической модификации с целью экспрессии анти-HER2 CAR. 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области онкологии, иммунологии, клеточных технологий и биоинженерии и может быть использовано для терапии солидных опухолей, в частности, рака молочной железы и рака яичников.
Известно, что применение клеточных продуктов на основе генетически модифицированных лимфоцитов, экспрессирующих CAR (chimeric antigen receptor, химерный антигенный рецептор) к различным дифференцировочным и опухоль-ассоциированным антигенам (в частности, HER 2), перспективно для лечения рецидивирующих или рефрактерных В-клеточных лейкозов и солидных опухолей различного гистогенеза.
Из уровня техники известен БМКП, аналогичный заявляемому, для терапии солидных опухолей «CAR-экспрессирующие NK-92 клетки в качестве клеточных терапевтических агентов» [WO 2015/193411 А1, 23.12.2015]. Патент описывает клеточный продукт, полученный из опухолевых клеток линии NK-92 с CAR к рецептору эпидермального фактора роста ErbB2, и включает в себя методы получения и идентификации эффекторных клеток из опухолевой клеточной культуры NK-92, экспрессирующих специфичный химерный антигенный рецептор к ErbB2 (содержащие лентивирусный вектор, кодирующий химерный антигенный рецептор ErbB2, состоящий из ErbB2-специфичного scFv фрагмента, шарнирного участка, трансмембранного и внутриклеточного доменов CD28 и внутриклеточного домена зета CD3). Основным недостатком описанного в патенте продукта является применение in vivo клеточной линии NK-92, являющейся злокачественной неходжкинской лимфомой, что несет в себе риски экспансии злокачественного клона с вытеснением нативного и бактериальной или вирусной контаминации. Помимо этого, использование
данной клеточной линии требует предварительного гамма-облучения, что чревато логистическими трудностями, или инкубирования с митомицином С, который, в свою очередь, невозможно полностью элиминировать из суспензии клеток, планируемой к введению пациенту.
Другим известным аналогом является терапевтический продукт на основе однородной популяции CAR-T, либо CAR-NK клеток «Терапия конструктами химерных антигенных рецепторов (CAR) и Т-клетками (CAR-Т) или NK клетками (CAR-NK), экспрессирующими CAR конструкты» [WO 2016/201300 A1, 15.12.2016]. Изобретение характеризует клеточный продукт, состоящий из однородного пула CAR-клеток (CAR-T клеток или CAR-NK), подвергшихся предварительной селекции, последующей трансфекции и добавлением цитокинов и антиген-стимулирующих агентов. Недостатком данного продукта является однородность его популяционного состава CAR-клеток: CAR-T или CAR-NK, что сопряжено с методологическими трудностями, т.к. на этапе селекции таргетной популяции CAR - клеток происходят значительные потери клеточного продукта.
Другой аналогичный клеточный продукт на основе CAR-T, описанный в патенте «Универсальные Т-клетки киллеры» [WO 2016116601, 28.07.2016], предполагается получать из генетически модифицированных неиммуногенных NK, несущих рецептор Т-клеток. Недостатком приведенного продукта является происхождение CAR-T клеток, которые в данном случаев являются аллогенными, что, помимо необходимости в предварительной селекции и последующей модификации NK клеток в Т-клетки с экспрессией TcR рецептора, сопряжено с модификацией клеток с целью снижения их иммуногенности.
Известен аналогичный продукт для CAR-T клеточной терапии, описанный в патенте «Химерные антигенные рецепторы для терапии опухолей» [WO 2018067992, 12.04.2018], представленный пулом Т или NK клеток с химерным рецептором к антигенам В-клеток, генетически
модифицированных в целях экспрессии рецептора к новым антиген связывающим сайтам молекул CD20 или CD22. Предназначен для терапии В-клеточных лейкозов. Основное показание к применению продукта и является, с другой стороны, его основным недостатком, т.к. данный продукт не может применяться в терапии солидных опухолей ввиду их значительного отличия от гемобластозов.
Известен продукт на основе CAR-T клеток, описанный в патенте «Химерные антигенные рецепторы, направленные на TIM1» [WO/2018/132695, 19.07.2018], который включает в себя однородный пул либо Т-, либо NK- клеток с химерным антигенным рецептором к Т-клеточному иммуноглобулину и опухоль-ассоциированному антигену муциновому домену 1 (TIM1, T-cell immunoglobulin and mucin domain 1). Недостатком данного продукта, помимо однородного состава применяемой клеточной популяции, является невозможность его назначения при раке яичника и/или раке молочной железы ввиду значимого повышения уровня экспрессии рецептора TIM1 на злокачественных клеток при колоректальном раке.
Также известен клеточный продукт, описанный в патенте «Методы и компоненты для трансдукции и обогащения лимфоцитов и их регулирования» [WO/2018/161064, 07.09.2018], представленный только популяцией трансдуцированных Т и/или NK клеток. Данный продукт не содержит популяции лимфокин-активированных киллеров, что является его основным недостатком, т.к. наличие данной популяции наряду с CAR-T клетками обеспечивает более высокую эффективность продукта в сравнении с применением CAR-T-NK без лимфокин-активированных киллеров.
Прототипом заявляемого изобретения является БМКП, описанный в патенте «Улучшенный метод генерации генетически модифицированных клеток» [ЕР 3018200 A1, 11.05.2016]. Прототип описывает БМКП на основе популяций CAR-T-NK клеток, подвергнутых поэтапно трансдукции и активации различными цитокинами (предпочтительно INFγ), антиген-
стимулирующими агентами и антиген-презентирующими клетками, подвернутыми гамма-излучению или обработке митомицином С. Упомянутый метод включает в себя следующие этапы вне зависимости от их очередности: невирусную трансфекцию культуры мононуклеарных клеток (в том числе цитокин-индуцированных клеток) одной или более нуклеиновой кислотой, кодирующей Т-клеточный рецептор и/или химерный антигенный рецептор (к рецепторам CD19, CD123, CD20, CD23, CRLF2, CD44v6, CD33, CS1 CD38, Her2, EGFr и СА125) или их комбинацию; добавление к культуре мононуклеарных клеток / цитокин-индуцированных клеток антиген презентирующих («вспомогательных» или «питательных») клеток; добавление одного или более антиген стимулирующих агентов. Недостатком этого метода является необходимость в генерации искусственных антиген презентирующих клеток, для чего необходимо их инкубирование с препаратом митомицин С, который невозможно полностью элиминировать перед введением реципиенту клеточного продукта, или подвергание клеток гамма-облучению, что являет собой технические и логистические затруднения. Отказаться от этапа добавления искусственных антиген презентирующих клеток также не представляется целесообразным ввиду их благотворного влияния на трансфицированные клетки [1], в связи с чем в предлагаемом нами методе может использоваться супернатант от антиген презентирующих клеток при культивировании цитокин-индуцированных клеток с химерным антигенным рецептором. Другим недостатком этого метода является использование векторов с различными вариантами генетических структур (транспозоны, транспозазы, нуклеазы «цинковые пальцы», sleeping beauty, PiggyBac, TALEs и проч), обеспечивающих интеграцию вводимого генетического конструкта в геном клетки, что требует проведения глубокого секвенирования перед введением клеточного продукта реципиенту и сопряжено с необходимостью в генерации более многочисленного клеточного продукта. Помимо этого, подобные процессы несут риски эктопической вставки, что может иметь неблагоприятные
последствия в виде потери эффективности вводимого реципиенту клеточного продукта или формирования из последнего злокачественных клонов. [2]
Целью представляемого нами изобретения является терапия рака яичника и молочной железы биомедицинским клеточным продуктом на основе анти-HER2 CAR-T-NK и лимфокин-активированных киллеров.
Предлагаемое нами изобретение представляет собой БМКП со специфической противоопухолевой активностью, представленный тремя популяциями клеток: анти-HER2 CAR-T, анти-HER2 CAR -NK и лимфокин-активированными киллерами с ограниченным периодом экспрессии химерного антигенного рецептора (3-5 суток), характеризующийся ускоренным периодом получения (менее чем 9 суток), чья эффективность сопровождается одновременной активацией врожденного и адоптивного иммунного ответов, предназначенный для лечения пациентов с солидными опухолями, экспрессирующими рецептор эпидермального фактора роста (HER2). Заявляемый продукт получен из аутологичных мононуклеарных лимфоцитов, активированных препаратом человеческого рекомбинатного цитокина и подвергнутых генетической модификации с целью экспрессии анти-HER2 CAR.
Сходство прототипа с заявляемым изобретением заключается в выборе аутологичного биологического материала как источника эффекторных клеток, включение популяции цитокин-активированных клеток (в том числе, генетически модифицированных), использование HER2 в качестве мишени для конструкции химерного антигенного рецептора.
Преимуществами заявленного изобретения в сравнении с прототипом являются: 1) в состав предлагаемого БМКП входят 3 клеточные эффекторные популяции, которые формируют состав заявляемого продукта, обеспечивая его эффективность посредством прямого специфического противоопухолевого воздействия и через активацию врожденного звена иммунитета; 2) четко ограниченный во времени (3-5 суток) период существования клона CAR-T и CAR-NK клеток, экспрессирующего
таргетный рецептор, что обеспечивает снижение побочных эффектов, обусловленных неспецифическим межклеточным взаимодействием, а также замещением аутологичного клона Т-лимфоцитов химерным; 3) отсутствие необходимости в глубоком секвенировании продукта перед его использованием, требующем увеличенного объема продукта в сравнении с заявляемым; 4) отсутствие необходимости введения дополнительной клеточной фракции (антиген-презентирующих клеток), сопряженной с опасностью использования гамма-излучения и контаминации продукта митамицином; 5) отсутствие контаминации конечного продукта нефармакопейными препаратами (в частности, OKT3, рекомбинантные цитокины и т.д.); 6) снижение риска контаминации конечного продукта микроорганизмами за счет ускоренного (менее чем 9 суток) периода его получения.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение биомедицинского клеточного продукта (БМКП) со специфической противоопухолевой активностью, представленного тремя популяциями клеток: анти-HER2 CAR-NK, анти-HER2 CAR-T-клетками и лимфокин-активированныи киллерами с ограниченным периодом экспрессии химерного антигенного рецептора (3-5 суток), характеризующегося ускоренным периодом получения (менее чем 9 суток), чья эффективность сопровождается одновременной активацией врожденного и адоптивного иммунного ответов.
Пример 1. Получение БМКП с заявленными характеристиками
Из донорской лейкотромбомассы были выделены периферические мононуклеарные лимфоциты, на вторые сутки ряда были получены лимфокин-активированные киллеры, на третьи сутки с момента выделения провели трансфекцию лимфокин-активированных киллеров вектором с химерным антигенным рецептором HER2. На 4-5 сутки после выделения периферических мононуклеарных клеток провели иммунофенотипическое исследование полученных популяций клеток методом проточной цитофлюориметрии (BD FACSCanto II, США), согласно которому CAR-T
клетки составили 25% и имели фенотип анти-HER2+CD25+CD3+; CAR-NK клетки достигали 2% и имели фенотип анти-HER2+CD16+CD56+; в общей сложности доля анти-HER2 CAR-T-NK клеток составила 34%. Лимфокин-активированные киллеры составили 43% и имели фенотипам CD16+CD56+CD38+, CD16+CD56+CD25+, CD16+CD58+CD38+ и CD16+CD58+CD25+. Повторно иммунофенотип клеток оценили спустя 5 суток после проведения трансфекции, при этом выявилось значительное снижение анти-HER2 CAR-T-NK клеток (анти-HER2 положительных клеток): с 34% до 3%. Цитотоксическая способность полученных пулов клеток оценивалась на вторые сутки после проведения трансфекции с помощью МТТ-теста (Labsystems Multiscan MS, США, длина волны 540 нм) на HER2 позитивных культур SKOV3 (рак яичника) и SkBr3 (рак молочной железы). В соотношении клеток-эффекторов к опухолевым 5:1 цитотоксичность на культуре SKOV3 составила 85%, на SkBr3 - 89%. Данный пример продемонстрировал наличие в продукте двух популяций клеток (анти-HER2 CAR-T-NK и ЛАКи); ограниченный период экспрессии химерного антигенного рецептора анти-HER2 (5 суток); специфическую противоопухолевую активность на HER2 экспрессирующих опухолевых клеточных линиях и ускоренный период получения - клетки были получены в течение 4 суток.
Пример 2. Влияние заявленного БМКП на показатели врожденного иммунитета у реципиента
Иммунодефицитные мыши модели инбредной линии BALB/nude с привитой опухолью SKOV3 (n=10) получали терапию лимфокин-активированными киллерами и анти-HER2 CAR-T-NK в течение 15 дней в режиме 5*10^5 клеток каждый 3й день с момента привития опухоли. В результате в сравнении с контрольной группой наблюдалось торможение роста опухоли (ТРО) 38%. Сывороточные цитокины в группе наблюдения были повышены в сравнении с контрольной группой (результаты представлены в табл. 1): ФНО-альфа на 50% (среднее значение 8 пг/мл
(интервал 6-9 пг/мл) в контрольной группе и 12 пг/мл (11-13 пг/мл) в группе наблюдения); ИЛ6 на 44% (среднее значение 6 пг/мл (интервал 5-7 пг/мл) и 8,6 пг/мл (7,5-10 пг/мл) соответственно) и ИЛ1 на 82% (среднее значение 4,3 пг/мл (интервал 3-5 пг/мл) и 7,8 пг/мл (6,3-8,2 пг/мл) соответственно). Данный пример продемонстрировал специфическую противоопухолевую активность в виде TPO38% у мышей с привитой HER-2 положительной опухолью и активацию врожденного иммунитета в виде повышения концентрации сывороточных цитокинов.
Список литературы
1. Roy A., Krzykwa Е., Lemieux R. Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures. Journal of hematotherapy and stem cell research 2001; 10(6):873-80. https://doi.org/10.1089/152581601317210962
2. Li Y., Huo Y., Yu L. Quality Control and Nonclinical Research on CAR-T Cell Products: General Principles and Key Issues. Research Immunology 2019; 5 (1):122-131. https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.12.003
Claims (1)
- Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью, представленный популяциями анти-HER2 CAR-NK клеток с фенотипом анти-HER2+CD16+CD56+CD3-, анти-HER2 CAR-T клеток с фенотипом анти-HER2+CD25+CD3+, лимфокин активированных киллеров с фенотипом CD16+CD56+CD38+, CD16+CD56+25+, CD16+CD58+CD25+, CD16+CD58+CD38+, которые получают путем выделения из донорской лейкотромбомассы периферических мононуклеарных лимфоцитов с получением из них лимфокин-активированных киллеров, последующей модификацией части клеток этой популяции путем введения нуклеиновой кислоты с целью экспрессии химерного антигенного рецептора HER2 для получения популяций анти-HER2 CAR-NK клеток и анти-HER2 CAR-T-клеток.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019132876A RU2728361C1 (ru) | 2019-10-16 | 2019-10-16 | Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019132876A RU2728361C1 (ru) | 2019-10-16 | 2019-10-16 | Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2728361C1 true RU2728361C1 (ru) | 2020-07-29 |
Family
ID=72085464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019132876A RU2728361C1 (ru) | 2019-10-16 | 2019-10-16 | Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2728361C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786210C1 (ru) * | 2022-10-07 | 2022-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) | Биомедицинский клеточный продукт со специфической противоопухолевой активностью, представленный популяциями лимфокин-активированных киллеров и анти-HER2 CAR-γδΤ-ОИЛ и анти-HER2 CAR-T-NK |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2400238C1 (ru) * | 2009-03-04 | 2010-09-27 | Леонид Валентинович Загребин | Способ получения депонированных лимфокин-активированных киллеров |
| EP3018200A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-11 | Fondazione Matilde Tettamanti e Menotti de Machi Onlus | Improved method for the generation of genetically modified cells |
| EA201791442A1 (ru) * | 2015-03-30 | 2018-05-31 | Антродженезис Корпорейшн | Способы лечения гематологических нарушений, солидных опухолей или инфекционных заболеваний с применением естественных клеток-киллеров |
-
2019
- 2019-10-16 RU RU2019132876A patent/RU2728361C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2400238C1 (ru) * | 2009-03-04 | 2010-09-27 | Леонид Валентинович Загребин | Способ получения депонированных лимфокин-активированных киллеров |
| EP3018200A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-11 | Fondazione Matilde Tettamanti e Menotti de Machi Onlus | Improved method for the generation of genetically modified cells |
| EA201791442A1 (ru) * | 2015-03-30 | 2018-05-31 | Антродженезис Корпорейшн | Способы лечения гематологических нарушений, солидных опухолей или инфекционных заболеваний с применением естественных клеток-киллеров |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GAURAV NAYYAR et al., Overcoming Resistance to Natural Killer Cell Based Immunotherapies for Solid Tumors, 2019, Front Oncol, v.9, art. 51, p.1-28. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786210C1 (ru) * | 2022-10-07 | 2022-12-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) | Биомедицинский клеточный продукт со специфической противоопухолевой активностью, представленный популяциями лимфокин-активированных киллеров и анти-HER2 CAR-γδΤ-ОИЛ и анти-HER2 CAR-T-NK |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | CAR-NK cells for cancer immunotherapy: from bench to bedside | |
| JP7378439B2 (ja) | 造血幹細胞における遺伝子編集のための方法および組成物 | |
| AU2018204208B2 (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy | |
| AU2015343013A1 (en) | Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells | |
| CN111902533A (zh) | 产生自然杀伤细胞的方法 | |
| Van Caeneghem et al. | Antigen receptor-redirected T cells derived from hematopoietic precursor cells lack expression of the endogenous TCR/CD3 receptor and exhibit specific antitumor capacities | |
| Paulos et al. | Adoptive immunotherapy: good habits instilled at youth have long-term benefits | |
| Yoon et al. | Transfer of Her-2/neu specificity into cytokine-induced killer (CIK) cells with RNA encoding chimeric immune receptor (CIR) | |
| RU2728361C1 (ru) | Биомедицинский клеточный продукт с анти-HER2 специфической противоопухолевой активностью | |
| WO2022095903A1 (zh) | 靶向pd-1h(vista)的抗肿瘤免疫治疗方法 | |
| Cochlovius et al. | Human melanoma therapy in the SCID mouse: In vivo targeting and reactivation of melanoma‐specific cytotoxic T cells by bi‐specific antibody fragments | |
| Shevchenko et al. | In Vitro Model of Suppression of the Alloantigen Response by Tolerogenic Dendritic Cells Transfected with Personalized DNA Constructs Encoding HLA Epitopes | |
| CN120249400A (zh) | 一种基因工程载体、肿瘤趋化性工程细胞及其在实体瘤中的应用 | |
| WO2025095114A1 (ja) | 改善された白血球の製造方法 | |
| Drawz et al. | Adoptive immunotherapy | |
| Provasi et al. | 654. Editing Human Lymphocyte Specificity for Safe and Effective Adoptive Immunotherapy of Leukemia | |
| NZ714574A (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy | |
| NZ714574B2 (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy | |
| HK1193431A (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy | |
| HK1193431B (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy | |
| NZ726162B2 (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy |