RU2728240C1 - Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты) - Google Patents
Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2728240C1 RU2728240C1 RU2019139317A RU2019139317A RU2728240C1 RU 2728240 C1 RU2728240 C1 RU 2728240C1 RU 2019139317 A RU2019139317 A RU 2019139317A RU 2019139317 A RU2019139317 A RU 2019139317A RU 2728240 C1 RU2728240 C1 RU 2728240C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phospholipase
- ala
- strain
- asp
- gcc
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 title claims abstract 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 20
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 29
- 241000187176 Streptomyces violaceoruber Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102220213553 rs1026192345 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102220471249 M-phase inducer phosphatase 1_S82A_mutation Human genes 0.000 claims abstract description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101001105683 Homo sapiens Pre-mRNA-processing-splicing factor 8 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100021231 Pre-mRNA-processing-splicing factor 8 Human genes 0.000 claims description 18
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 9
- 102220075081 rs796052766 Human genes 0.000 claims description 8
- 241000131376 Aspergillus auratus Species 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 37
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 59
- 102000006447 Phospholipases A2 Human genes 0.000 description 52
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 38
- 102100039131 Integrator complex subunit 5 Human genes 0.000 description 23
- 101710092888 Integrator complex subunit 5 Proteins 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 21
- 102100039134 Integrator complex subunit 4 Human genes 0.000 description 20
- 101710092887 Integrator complex subunit 4 Proteins 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 9
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 6
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- BGGAIXWIZCIFSG-XDTLVQLUSA-N Ala-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BGGAIXWIZCIFSG-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 4
- CPSHGRGUPZBMOK-CIUDSAMLSA-N Arg-Asn-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CPSHGRGUPZBMOK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- OTUQSEPIIVBYEM-IHRRRGAJSA-N Arg-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OTUQSEPIIVBYEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- BMNVSPMWMICFRV-DCAQKATOSA-N Arg-His-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CN=CN1 BMNVSPMWMICFRV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- FTMRPIVPSDVGCC-GUBZILKMSA-N Arg-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FTMRPIVPSDVGCC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- NTXNUXPCNRDMAF-WFBYXXMGSA-N Asn-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C)C(O)=O)=CNC2=C1 NTXNUXPCNRDMAF-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 4
- YGHCVNQOZZMHRZ-DJFWLOJKSA-N Asn-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YGHCVNQOZZMHRZ-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 4
- VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- KDFQZBWWPYQBEN-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KDFQZBWWPYQBEN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N Asp-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O UGIBTKGQVWFTGX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 4
- QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N Asp-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 4
- BPTFNDRZKBFMTH-DCAQKATOSA-N Asp-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N BPTFNDRZKBFMTH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 4
- OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N Gln-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N OYTPNWYZORARHL-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 4
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N Leu-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O FOEHRHOBWFQSNW-KATARQTJSA-N 0.000 description 4
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- CANPXOLVTMKURR-WEDXCCLWSA-N Lys-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN CANPXOLVTMKURR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 4
- SVSQSPICRKBMSZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SVSQSPICRKBMSZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QPQDWBAJWOGAMJ-IHPCNDPISA-N Phe-Asp-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 QPQDWBAJWOGAMJ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 4
- NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 4
- WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WFHRXJOZEXUKLV-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 4
- BSTPNLNKHKBONJ-HTUGSXCWSA-N Phe-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O BSTPNLNKHKBONJ-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 4
- APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N Pro-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- VGVCNKSUVSZEIE-IHRRRGAJSA-N Pro-Phe-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGVCNKSUVSZEIE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- FZXOPYUEQGDGMS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FZXOPYUEQGDGMS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- WUXCHQZLUHBSDJ-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WUXCHQZLUHBSDJ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 4
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 4
- NFMPFBCXABPALN-OWLDWWDNSA-N Thr-Ala-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O NFMPFBCXABPALN-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 4
- FWTFAZKJORVTIR-VZFHVOOUSA-N Thr-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FWTFAZKJORVTIR-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 4
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 108010078114 alanyl-tryptophyl-alanine Proteins 0.000 description 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 4
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 4
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- CUOMGDPDITUMIJ-HZZBMVKVSA-N Ala-Phe-Thr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 CUOMGDPDITUMIJ-HZZBMVKVSA-N 0.000 description 3
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- WLVLIYYBPPONRJ-GCJQMDKQSA-N Asn-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WLVLIYYBPPONRJ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 3
- MYRLSKYSMXNLLA-LAEOZQHASA-N Asn-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MYRLSKYSMXNLLA-LAEOZQHASA-N 0.000 description 3
- HRGGPWBIMIQANI-GUBZILKMSA-N Asp-Gln-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRGGPWBIMIQANI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- NWAHPBGBDIFUFD-KKUMJFAQSA-N Asp-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NWAHPBGBDIFUFD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- HLRLXVPRJJITSK-IFFSRLJSSA-N Gln-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HLRLXVPRJJITSK-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 3
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- HTTSBEBKVNEDFE-AUTRQRHGSA-N Glu-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HTTSBEBKVNEDFE-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 3
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- ZSWGJYOZWBHROQ-RWRJDSDZSA-N Glu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSWGJYOZWBHROQ-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 3
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N Glu-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N Glu-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- ZQNCUVODKOBSSO-XEGUGMAKSA-N Glu-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZQNCUVODKOBSSO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 3
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- FXLVSYVJDPCIHH-STQMWFEESA-N Gly-Phe-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FXLVSYVJDPCIHH-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 3
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 3
- UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N Ile-Phe-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(O)=O UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N 0.000 description 3
- FJUKMPUELVROGK-IHRRRGAJSA-N Leu-Arg-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N FJUKMPUELVROGK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N UCRJTSIIAYHOHE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- ZUQACJLOHYRVPJ-DKIMLUQUSA-N Phe-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ZUQACJLOHYRVPJ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 3
- AGTHXWTYCLLYMC-FHWLQOOXSA-N Phe-Tyr-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AGTHXWTYCLLYMC-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 3
- NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHDVNAKDACFHPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- MMGJPDWSIOAGTH-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MMGJPDWSIOAGTH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N Thr-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JMGJDTNUMAZNLX-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 3
- KRGDDWVBBDLPSJ-CUJWVEQBSA-N Thr-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KRGDDWVBBDLPSJ-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 3
- JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JWHOIHCOHMZSAR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- DJSYPCWZPNHQQE-FHWLQOOXSA-N Tyr-Tyr-Gln Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 DJSYPCWZPNHQQE-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 3
- KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N Val-Arg-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKHRWGYHBZORMQ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010044348 lysyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N Ala-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asn-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTUXCUWQIBZIF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- HHABWQIFXZPZCK-ACZMJKKPSA-N Cys-Gln-Ser Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N HHABWQIFXZPZCK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101150079981 HSP150 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- RVOMPSJXSRPFJT-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVOMPSJXSRPFJT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 2
- 101710096328 Phospholipase A2 Proteins 0.000 description 2
- IDCKUIWEIZYVSO-WFBYXXMGSA-N Ser-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C)C(O)=O)=CNC2=C1 IDCKUIWEIZYVSO-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- KYKKKSWGEPFUMR-NAKRPEOUSA-N Ser-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KYKKKSWGEPFUMR-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 2
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- SKHCUBQVZJHOFM-NAKRPEOUSA-N Ala-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SKHCUBQVZJHOFM-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N Ala-Gly-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 PEIBBAXIKUAYGN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N Ala-Phe-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N DXTYEWAQOXYRHZ-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 1
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- MZRBYBIQTIKERR-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MZRBYBIQTIKERR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CZUHPNLXLWMYMG-UBHSHLNASA-N Arg-Phe-Ala Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CZUHPNLXLWMYMG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- FRSGNOZCTWDVFZ-ACZMJKKPSA-N Asp-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FRSGNOZCTWDVFZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N Asp-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GGBQDSHTXKQSLP-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N GGBQDSHTXKQSLP-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101150004278 CYC1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 1
- VZKXOWRNJDEGLZ-WHFBIAKZSA-N Cys-Asp-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O VZKXOWRNJDEGLZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- JSYULGSPLTZDHM-NRPADANISA-N Gln-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSYULGSPLTZDHM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- QPRZKNOOOBWXSU-CIUDSAMLSA-N Glu-Asp-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N QPRZKNOOOBWXSU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N Glu-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PMSMKNYRZCKVMC-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Arg Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DCQMJRSOGCYKTR-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WGCKDDHUFPQSMZ-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN WGCKDDHUFPQSMZ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- KEPWSUPUFAPBRF-DKIMLUQUSA-N Lys-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O KEPWSUPUFAPBRF-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494875 Naja naja Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010047320 Pepsinogen A Proteins 0.000 description 1
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- LXVLKXPFIDDHJG-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LXVLKXPFIDDHJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- WXUBSIDKNMFAGS-IHRRRGAJSA-N Ser-Arg-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WXUBSIDKNMFAGS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BRGQQXQKPUCUJQ-KBIXCLLPSA-N Ser-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BRGQQXQKPUCUJQ-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO QKQDTEYDEIJPNK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N Ser-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- PAOYNIKMYOGBMR-PBCZWWQYSA-N Thr-Asn-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O PAOYNIKMYOGBMR-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- VULNJDORNLBPNG-SWRJLBSHSA-N Thr-Glu-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O VULNJDORNLBPNG-SWRJLBSHSA-N 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N Thr-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JQAWYCUUFIMTHE-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N Thr-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- MNMYOSZWCKYEDI-JRQIVUDYSA-N Tyr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MNMYOSZWCKYEDI-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- MHAHQDBEIDPFQS-NHCYSSNCSA-N Val-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C MHAHQDBEIDPFQS-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UXODSMTVPWXHBT-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N UXODSMTVPWXHBT-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical group 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025801 glycyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Разработан способ получения в дрожжах Saccharomyces cerevisiae секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2, включающей последовательность фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, в том числе несущей мутации S31A, S82A и N108Q, и содержащей на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина. Заявляемый способ включает биосинтез предшественника целевого белка, представляющего собой вариант фосфолипазы А2, содержащей инсерцию интеина между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76. Также изобретение включает в себя четыре белка-предшественника, которые кодируются последовательностями SEQ ID N: 1-4 соответственно. Удаление инсерции интеина и превращение белка-предшественника в активный целевой белок происходит путем автокаталитического процессинга. 5 н.п. ф-лы, 11 пр., 1 табл., 2 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается разработки способа получения секретируемой в дрожжах, полностью функциональной фосфолипазы А2.
Фосфолипаза А2 (Pla2) катализирует гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицерофосфолипидов (фосфолипидов) - соединений, являющихся основными компонентами мембран всех живых клеток и по этой причине содержащихся во многих продуктах животного и растительного происхождения. Многообразие молекулярных форм фосфолипидов определяется типом фосфатной группы (холин, этаноламин, инозит или серии) и строением остатков жирных кислот.
Pla2 является одним из востребованных ферментов на рынке ферментных препаратов (ФП). В пищевой промышленности ее применяют для улучшения качества майонеза, дегуммирования растительных масел, изготовления хлебобулочных изделий, молочных продуктов, а также при производстве сыра [Бакланов 2008; 
& Dennis, 1982]. Другими областями применения Pla2 являются текстильная промышленность, кормопроизводство, а также синтез искусственных фосфолипидов, востребованных, в частности, в фармакологии и парфюмерии [De Maria et al., 2007; Hoogevest & Wendel, 2014; Liu et al., 2015]. Интенсивное использование Pla2 ожидают в топливно-энергетической промышленности для получения биодизеля [Cesarini et al., 2015].
Из числа ФП, содержащих Pla2 наиболее известны следующие:
• ФП Maxapal® А2 (DSM), получаемый микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантного штамма грибов Aspergillus niger,
• ФП «DENAZYME PLA2» или «PLA2 Nagase» (Nagase Corporation), основу которого составляет Pla2 Streptomyces violaceoruber, получаемый микробиологическим синтезом с использованием продуцентов рода Streptomyces;
• ФП «Lecitase L10» (Novozymes A/S), получаемый очисткой из поджелудочной железы свиней.
ФП Pla2 получают с использованием природных или рекомбинантных штаммов-продуцентов. Однако, независимо от происхождения, коммерческие ФП Pla2 характеризуются высокой себестоимостью, которая обусловлена низкой продукцией, проистекающей из особенностей биосинтеза этого фермента, в частности, из его способности связывать и гидролизовать фосфолипиды клеточных мембран, вызывая их разрушение, приводящее к гибели продуцирующих клеток.
Преимущества природных продуцентов Pla2 обусловлены их относительно хорошей адаптацией к биосинтезу этого токсичного фермента [Sugiyama et. al. 2002; WO 2004/097012].
Один из механизмов адаптации иллюстрируют грибные продуценты Pla2. Большинство из них синтезируют секретируемые Pla2 в виде незрелых про-ферментов с пониженной активностью. Их активация осуществляется внутриклеточно на поздних стадиях секреции под действием специализированных протеиназ. В результате из клеток в культуральную среду выходят зрелые, полностью активные Pla2 [WO 2004/097012]. Такая стратегия биосинтеза токсичных белков, способных в случае преждевременной активации нанести повреждения клеткам-продуцентам, широко распространена в природе, а также является традиционной для использования в биотехнологии.
Известен также родственный способ продукции токсичных белков. От предыдущего он отличается тем, что продуцирующие клетки не обеспечивают внутриклеточного созревания и секретируют во внеклеточную среду про-ферменты, которые остаются в неактивном или слабоактивном состоянии в течение неопределенно долгого времени до момента активации. В этом случае про-ферменты называют зимогенами1, (1 Зимоген (zymogen) [греч. zyme - закваска и genes - порождающий, рождающийся] - функционально неактивный или слабоактивный профермент, который активируется при посттрансляционном удалении из молекулы фрагмента, способствующего поддержанию латентного состояния (напр., зимоген пепсиногена превращается в пищеварительный фермент пепсин при расщеплении на соответствующие пептиды)) и их активация осуществляется за пределами клеток под действием других ферментов, либо автокаталитически при изменении внешних условий (например, рН). В последнем случае говорят про самоактивируемый зимоген. В частности, в форме неактивных зимогенов продуцируются факторы свертывания крови животных [Stubbs & Bode 1994]. Получение фосфолипаз А2 в форме природных или искусственных зимогенов до сих пор не было известно.
Еще одним способом природной адаптации организмов к биосинтезу Pla2 считается изменение фосфолипидного состава клеточных мембран и исключение из них компонентов, к которым продуцируемый фермент проявляет наибольшее сродство. В результате адаптации снижается токсическое действие Pla2 на клетку-хозяина и, как следствие, появляется возможность увеличения продукции фермента [Sugiyama et al., 2002].
Даже при наличии адаптации использование природных штаммов для производства Pla2 сопряжено с экономическими ограничениями. Как правило, для достижения высокого выхода фермента штамм-продуцент необходимо культивировать с использованием специального оборудования и комплексных сред, содержащих, в том числе, жировой компонент [Valero, 2012]. При этом организм-хозяин, как правило, синтезирует множество изоформ не только целевой Pla2, но и других липаз, которые изменяют специфичность и селективность ФП и способны ухудшать его свойства, а глубокая очистка целевого фермента представляется экономически неоправданной.
В этой связи оптимальным способом увеличения производства высококачественных ФП является разработка рекомбинантных технологий, обеспечивающих экспрессию целевой Pla2 в клетках специально подобранного реципиентного микроорганизма.
Будем различать рекомбинантные производные природных ферментов, аминокислотная последовательность которых идентична природным прототипам и не содержит целенаправленно-введенных искусственных модификаций, и рекомбинантные производные природных ферментов, аминокислотная последовательность которых была искусственно модифицирована в результате генно-инженерных манипуляций и не идентична природным прототипам. Будем называть первые РПМ(-), а вторые РПМ(+) природных ферментов.
Также будем различать специфическую активность Pla2, выявляемую в специальных условиях, например, при постоянном рН, в присутствии высокой концентрации ионов кальция Са2+ на лецитиновом субстрате, солюбилизированного с использованием растворителя ПАВ «Тритон Х-100», а также специфическую активность, выявляемую на яичном желтке, не содержащем никаких посторонних добавок. Первую будем называть «специальной», а вторую - «собственной» активностью Pla2. Некоторые Pla2 обладают высокой «специальной» и низкой «собственной» активностью (Чеперегин с соавт. 2019). В то же время действие Pla2 на клетки в процессе биосинтеза и перспективы промышленного применения определяются уровнем «собственной», а не «специальной» активности, и полностью функциональная РПМ(+) Pla2 должна обладать показателями «специальной» и «собственной» активности, сходными с показателями природного фермента.
В настоящее время дрожжи удерживают статус эффективных и продвинутых эукариотических систем экспрессии генов [Gasser et al. 2013; Singh et al. 2016; Zahrl et al. 2017; Raveendran et al. 2018]. Они обладают низким уровнем продукции собственных секретируемых белков, но при этом способны обеспечить эффективную секрецию в культуральную среду целевых рекомбинантных продуктов.
Известно, что, не обладая собственными фосфолипазами А2, дрожжи способны продуцировать РПМ(-) природных ферментов. В частности, известно о продукции в дрожжах РПМ(-) Pla2 индийской кобры Naja naja naja [Lefkowitz et al. 1999] и РПМ(-) Pla2 штамма бактерий 2917 S. violaceoruber [Liu et al. 2015]. Однако у этих РПМ(-) Pla2 зафиксирована низкая «специальная» активность, 50-80 ед/мг [Lefkowitz et al. 1999] и 170 ед/мг [Liu et al., 2015], что существенно ниже показателей высокоактивных Pla2, синтезируемых природными продуцентами, штаммом S.violaceoruber А-2688 - 1000 ед/мг [Sugiyama et. al. 2002; http://wayback.archive-it.org/7993/20171031055659/ https://www.fda.gov/downloads/Food/IngredientsPackadngLabeling/GRAS/NoticeInventon,/UCM263914.pdf] или штаммами грибов - 648 ед/мг и выше [WO 2004/097012], составляющих основу коммерческих препаратов. Кроме того, показано, что РПМ(-) Pla2 штамма бактерий 2917 S. violaceoruber обладает близким к нулю показателем «собственной» активности [Чеперегин с соавт. 2019]. В этой связи, даже несмотря на высокую продукцию, составлявшую 30 и 200 мг/л, соответственно, указанные РПМ(-) Pla2 должны быть отнесены к низкоактивным ферментам, а их потенциальное промышленное применение -к компромиссным технологиям.
Известно об эффективной экспрессии в дрожжах высокоактивных РПМ(+) Pla2 [Чеперегин с соавт. 2019]. Однако вследствие внесенных изменений эти РПМ(+) приобретают высокую «собственную» активность только в присутствии дополнительных количеств ионов кальция Са2+ [Чеперегин с соавт. 2019]. В отсутствие дополнительных количеств кальция эти РПМ(+) Pla2 являются низкоактивными ферментами, для применения которых требуются компромиссные технологии.
Примеров разработки на основе дрожжей продуцентов РПМ(-) или РПМ(+) Pla2, обладающих высокой «собственной» активностью, в открытых источниках информации не обнаружено. В то же время именно они востребованы для промышленного производства.
Природная Pla2 бактерий S. violaceoruber является уникальной ферментом, не имеющим «загрязняющей» липазной активности, в связи с чем ее использование снижает потери при дегуммировании масел [Liu et al., 2015]. Из источников информации известны две природные Pla2 S. violaceoruber: высокоактивная Pla2 штамма А-2688 [Sugiyama et. al., 2002], называемая далее Pla22 [Чеперегин с соавт. 2019], и низкоактивная Pla2 штамма 2917 [Liu et al., 2015]. Информация об экспрессии в дрожжах раскрыта для низкоактивной Pla2 [Liu et al., 2015], а также для РПМ(+) Pla22 [Чеперегин с соавт. 2019], на базе которой разработан негликозилированный вариант Pla22ng, несущий мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln в сайтах N-гликозилирования [Чеперегин с соавт. 2019].
Последовательности вариантов Pla22 и Pla22ng фосфолипазы А2 используют в качестве основы для разработки заявляемого изобретения. Препарат природной высокоактивной фосфолипазы А2 штамма S. violaceoruber А-2688 [Sugiyama et. al., 2002], производят в форме коммерческого препарата «Pla2 Nagase».
Задача заявляемой группы изобретений состоит в разработке способа получения в дрожжах Saccharomyces cerevisiae секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2.
Задача решена путем:
- разработки способа получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2, осуществляемого путем получения и введения в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, включающий последовательность нативной, содержащей сайты N-гликозилирования, или мутантной, не содержащей сайтов N-негликозилирования, фосфолипазы А2 штамма S. violaceoruber А-2688, содержащей инсерцию интеина между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76, а также имеющей на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина, с последующим биосинтезом этого белка-предшественника и его автокаталитическим процессингом с образованием целевого продукта;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3 в составе нативной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, для осуществления заявляемого способа;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3, несущего мутацию Cys11Tyr, в составе нативной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, для осуществления заявляемого способа;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Neosartorya aurata NRRL 4378 в составе фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, несущей мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln, для осуществления заявляемого способа;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3, несущего мутацию Cys11Tyr, в составе фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, несущей мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln, для осуществления заявляемого способа.
Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2
Решение задачи включает следующие этапы:
- используя методы молекулярной биологии и генетической инженерии, клонируют структурный ген интеина PRP8 штамма P. chrysogenum (Int4), интеина PRP8 штамма P. chrysogenum, несущего мутацию Cys11Tyr (Int4Y), и интеина PRP8 штамма N. aurata NRRL 4378 (Int5);
- с использованием структурного гена, кодирующего РПМ(-) Pla22 [Чеперегин с соавт. 2019], получают генетические конструкции SEQ ID N1 и SEQ ID N2, кодирующие белок - предшественник для получения фосфолипазы А2 путем автокаталитического процессинга, представляющий собой гликозилированную фосфолипазу А2 штамма S. violaceoruber А-2688, содержащую инсерцию интеина Int4 или интеина Int4Y, соответственно, между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76 и имеющую на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина;
- с использованием структурного гена, кодирующего РПМ(+) Pla22ng [Чеперегин с соавт. 2019], получают генетические конструкции SEQ ID N3 и SEQ ID N4, кодирующие белок - предшественник для получения фосфолипазы А2 путем автокаталитического процессинга, представляющий собой негликозилированную фосфолипазу А2 штамма А-2688 S. violaceoruber, несущую мутации S31A, S82A и N108Q и содержащую инсерцию интеина Int5 или интеина Int4Y, соответственно, между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76 и имеющую на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина;
- полученные генетические конструкции SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 и SEQ ID N4 вводят в клетки дрожжей S. cerevisiae. Для этого используют реципиентные штаммы, векторы, промоторы, лидерные области, которые идентичны или аналогичны описанным ранее [Чеперегин с соавт. 2019, RU 2460795 и RU 2522479] и не являются существенными признаками изобретения. В результате получают штаммы-продуценты заявляемых белков-предшественников;
- осуществляют культивирование каждого из полученных штаммов дрожжей, содержащих генетические конструкции SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 и SEQ ID N4, для чего используют условия, обеспечивающие экспрессию этих конструкций, идентичные или аналогичные описанным ранее [Чеперегин с соавт. 2019, RU 2460795 и RU 2522479], не являющиеся существенными признаками изобретения. В результате культивирования каждого штамма получают культуральную жидкость, содержащую секретированный заявляемый белок-предшественник, который в результате автокаталитического процессинга образует целевой продукт; анализ активности которого доказывает, что он представляет собой полностью функциональную фосфолипазу А2.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг. 1 - Схема конструирования фрагментов ДНК, кодирующих заявляемые белки-предшественники. Условные обозначения: pINT - плазмида pInt4, pInt4Y или pInt5; INT -последовательность ДНК, кодирующая интеин Int4, Int4Y или Int5; PlaN и PlaC - последовательности ДНК, кодирующие N-концевую (с 1 по 75 остаток) и С-концевую (с 76 по 122 остаток) части фосфолипазы А2 в составе заявляемых белков-предшественников; pPla - плазмиды pUC18x-Pla22 или pUC18x-Pla22ng; Pla-хх - последовательность ДНК, кодирующая заявляемый белок-предшественник
Фиг. 2. ПААГ-электрофореграмма белков культуральной жидкости дрожжей штаммов D-Pla22ng(Int5) и D-Pla22ng(Int4Y) до (-) и после (+) процессинга, проведенного в течение 69 часов при комнатной температуре. Показано положение белковых полос соответствующих белкам-предшественникам (Pla22ng(Int)), интеинам Int5 и Int4Y, а также зрелой фосфолипазе А2 (Pla22ng).
Пример 1. Клонирование структурного гена интеина Int4
Фрагмент ДНК, кодирующий мини-интеин PRP8 P. chrysogenum (GeneBank АМ042015.1), называемый Int4, получают с использованием ПЦР. ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы Phusion (ThermoFisher). Матрицей служит тотальная геномная ДНК штамма P. chrysogenum ВКПМ F-3, очищенная по стандартной методике [Kaiser et. al., 1994]. Фрагмент ДНК, кодирующий Int4 амплифицируют с использованием праймеров:
После открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI амплифицированный фрагменты ДНК клонируют в лабораторном векторе pUC19mx, производном стандартного вектора pUC19, содержащем модифицированный полилинкер в окружении сайтов узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.
В результате клонирования получают плазмиду pInt4, содержащую последовательность структурного гена интеина Int4.
Пример 2. Клонирование структурного гена интеина Int4Y
Фрагмент ДНК, кодирующий мутантный вариант мини-интеина PRP8 P. chrysogenum (GeneBank АМ042015.1), называемый Int4Y, клонируют, как описано в примере 1, но для амплификации используют праймеры:
В результате клонирования получают плазмиду pInt4Y, содержащую последовательность структурного гена мутантного интеина Int4Y, содержащего замену Cys11Tyr.
Пример 3. Синтез структурного гена интеина Int5
Фрагмент ДНК SEQ ID N1, кодирующий интеин Nau PRP8 штамма N. aurata NRRL 4378, называемый Int5, получают в виде синтетического BamHI/XhoI фрагмента ДНК. Этот фрагмент клонируют в лабораторной плазмиде pUC18x. В результате получают плазмиду pInt5, содержащую последовательность структурного гена интеина Int5.
Пример 4. Конструирование гена Pla22
Фрагмент ДНК, заключающий структурный ген фосфолипазы А2, называемый Pla22, кодирующий аминокислотную последовательность зрелой фосфолипазы А2 штамма S. violaceoruber А-2688 (GenBank АЕМ88445), получают с использованием ПЦР. Матрицей для ПЦР служит последовательность синтетического гена Pla2 [Чеперегин с соавт. 2019]. Фрагмент ДНК, содержащий этот ген, клонирован по сайтам BamHI/XhoI в векторе pUC18x, являющемся производным стандартного вектора pUC18 и содержащем в составе модифицировонного полилинкера сайт узнавания рестриктазы XhoI вместо сайта EcoRI.
Искомый фрагмент ДНК получают в 2 этапа. На первом этапе с помощью ПЦР получают 2 перекрывающихся фрагмента ДНК:
- фрагмент 1 получают, используя праймер 
и 
- фрагмент 2 получают, используя праймер 
и 
Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля и на следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование очищенных фрагментов ДНК. С этой целью проводят ПЦР с использованием смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N168 и N1272. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BamHI и XhoI клонируют в плазмиде pUC18x, расщепленной по тем же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pUC18x-Pla22, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.
Полученная плазмида pUC18x-Pla22 содержит BamHI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий вариант Pla22 фосфолипазы А2, аминокислотная последовательность которой заключает остаток треонина в позиции 46 (замена Ser46Thr) и остатки фенилаланина и глицина на С-конце в позициях 121 и 122, соответственно (замена Leu121(PheGly)). Плазмиду pUCT8x-Pla22 используют для получения гена мутантного варианта фосфолипазы и для инсерции последовательностей ДНК, кодирующих интеины.
Пример 5. Конструирование гена Pla22ng
Фрагмент ДНК, заключающий структурный ген Pla22ng, кодирующий мутантный вариант фосфолипазы, из аминокислотной последовательности которой исключают три сайта N-гликозилирования, получают с помощью ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР используют ДНК плазмиды pUC18x-Pla22. ПЦР осуществляют в 2 этапа.
На первом этапе последовательность мутантного гена получают в виде 4 фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР и имеющих попарно перекрывающиеся концы:
- фрагмент 1 получают, используя праймер 
и 
- фрагмент 2 получают, используя праймер 
и 
- фрагмент 3 получают, используя праймер 
и 
- фрагмент 4 получают, используя праймер 
и 
Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля, используя с этой целью набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706).
На следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование 4 очищенных фрагментов ДНК. С этой целью проводят ПЦР с использованием смеси фрагментов 1, 2, 3 и 4 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N1346 и N169. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BamHI и XhoI клонируют в плазмиде pUC18x (Пример 4), расщепленной по тем же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pUC18x-Pla22ng, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.
Полученная плазмида pUC18x-Pla22ng содержит BamHI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий мутантную фосфолипазу, содержащую 3 замены: Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln, инактивирующие все 3 потенциальных сайта N-гликозилирования. Мутантный вариант фосфолипазы называют Pla22ng.
Плазмиду pUC18x-Pla22ng используют для инсерции последовательностей ДНК, кодирующих интеины.
Пример 6. Получение фрагментов ДНК, кодирующих заявляемые интеин-содеожащие белки-предшественники
Заявляемые белки-предшественники нативной, содержащей сайты N-гликозилирования, фосфолипазы А2, содержащие инсерции интеинов Int4 или Int4Y, называют Pla22(Int4) и Pla22(Int4Y), соответственно. Для получения последовательностей ДНК, кодирующих эти белки, используют плазмиду pUC18x-Pla22.
Заявляемые белки-предшественники мутантной, не содержащей сайтов N-негликозилирования, фосфолипазы А2, содержащие инсерции интеинов Int5 или Int4Y, называют Pla22ng(Int5) и Pla22ng(Int4Y), соответственно. Для получения последовательностей ДНК, кодирующих эти белки, используют плазмиду pUC18x-Pla22ng.
Для конструирования фрагментов ДНК, кодирующих заявляемые белки-предшественники, содержащие интеиновые инсерции, используют технологию ПЦР-опосредованного лигирования перекрывающихся последовательностей ДНК по схеме Фиг. 1. Для этого используют универсальные праймеры для амплификации dir 
и rev 
Кроме них, для получения последовательностей ДНК, кодирующих белки-предшественники Pla22(Int4), Pla22(Int4Y) и Pla22ng(Int4Y), используют праймеры Р1 
и Р2 
а для получения последовательности ДНК, кодирующей белок-предшественник Pla22ng(Int5) используют праймеры Р1 
и Р2 
Для ПЦР используют ДНК-полимеразу Phusion (ThermoFisher Scientific, F-#F530S).
В результате ПЦР-лигирования получают BamHI/XhoI фрагменты ДНК, заключающие последовательности ДНК SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 и SEQ ID N4, кодирующие заявляемые белки-предшественники Pla22(Int4), Pla22(Int4Y), Pla22ng(Int5) и Pla22ng(Int4Y), соответственно.
Эти фрагменты ДНК используют для конструирования экспрессионных плазмид, штаммов-продуцентов и получения соответствующих вариантов фосфолипазы А2.
Пример 7. Конструирование экспрессионных плазмид для биосинтеза заявляемых белков-предшественников в дрожжах S. cerevisiae
Экспрессионные плазмиды конструируют путем лигирования трех фрагментов ДНК.
Фрагментом 1 служит XhoI/HindIII фрагмент ДНК лабораторного бирепликонного вектора pPDX3 [RU 2460795]. Данный фрагмент содержит, начиная от сайта XhoI: область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей S. cerevisiae; фрагмент ДНК, обеспечивающий репликацию и селекцию плазмид pPDX3 в клетках Е. coli; фрагмент ДНК эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, обеспечивающий способность плазмид pPDX3 поддерживаться в клетках дрожжей S. cerevisiae в эписомном многокопийном состоянии; структурные гены URA3 и PGK1 дрожжей S. cerevisiae, обеспечивающие селективное поддержание плазмид pPDX3 в штаммах, имеющих соответствующие хромосомные мутации [RU 2460795, RU 2515913 и др.].
Фрагментом 2 является «регуляторный» HindIII/BglII фрагмент ДНК, кодирующий промотор GAL1, используемый для экспрессии, и лидерную область matHH, направляющую секрецию вариантов фосфолипазы А2 в дрожжах S. cerevisiae.
Для конструирования «регуляторного» фрагмента ДНК используют плазмиду pUC18x-GAL1matHH-GH, содержащую ген зрелого соматропина, слитый с фрагментом ДНК, кодирующим лидерный полипептид, включающий последовательности сигнального пептида mat и удвоенной про-области белка HSP150 дрожжей S. cerevisiae [RU 2460795].
Конструирование проводят путем замещения NcoI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GAL1matHH-GH, кодирующего соматропин, на синтетический двуцепочечный фрагмент ДНК, заключающий сайт узнавания рестриктазы BglII и полученный в результате отжига двух олигонуклеотидов:
В результате клонирования получают плазмиду pUC18x-GAL1matHH-(BglII), в составе которой в последовательности ДНК, кодирующей лидерный полипептид matHH, сконструирован сайт рестриктазы BglII, формируемый кодоном аргинина, входящим в сайт узнавания протеиназы Кех2, и кодоном серина, следующим непосредственно за кодоном аргинина.
Плазмида pUC18x-GAL1matHH-(BglII) служит источником «регуляторного» HindIII/BglII фрагмента ДНК (Фрагмента 2).
Фрагментом 3 служит BamHI/XhoI фрагмент ДНК заключающий последовательность ДНК SEQ ID N1 или SEQ ID N2 или SEQ ID N3 или SEQ ID N4, кодирующий заявляемый белок-предшественник Pla22(Int4), Pla22(Int4Y), Pla22ng(Int5) или Pla22ng(Int4Y), соответственно.
В частности,
- плазмиду pPDX3-Pla22(Int4) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N1;
- плазмиду pPDX3-Pla22(Int4Y) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N2;
- плазмиду pPDX3-Pla22ng(Int5) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N3;
- плазмиду pPDX3-Pla22ng(Int4Y) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N4.
Полученные экспрессионные плазмиды серии pPDX3 содержат в своем составе последовательности ДНК, кодирующие заявляемые белки-предшественники, слитые с последовательностями ДНК, кодирующими промотор GAL1 дрожжей S.cerevisiae и лидерный полипептид matHH, заключающий в своем составе удвоенную (НН) про-области белка HSP150 дрожжей S. cerevisiae. Эти плазмиды используют для трансформации клеток реципиентных штаммов дрожжей S. cerevisiae и наработки соответствующих образцов фосфолипазы А2.
Пример 8. Конструирование штаммов-продуцентов заявляемых белков-предшественников с использованием лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae
Для конструирования штаммов-продуцентов клетки лабораторного реципиентного штамма S. cerervisiae beta-0 [Чеперегин с соавт. 2019] трансформируют с использованием полученных экспрессионных плазмид серии pPDX3. Трансформацию осуществляют с использованием литий ацетата как описано [Gietz & Schiestl 2007]. В результате трансформации получают штаммы-продуценты серии В. В частности,
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4) получают штамм B-Pla22(Int4), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4Y) получают штамм B-Pla22(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4Y).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int5) получают штамм B-Pla22ng(Int5), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int5).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int4Y) получают штамм B-Pla22ng(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int4Y).
Пример 9. Конструирование штаммов-продуцентов заявляемых белков-предшественников с использованием лабораторного реципиентного штамма S. cerervisiae D721W
Для конструирования штаммов-продуцентов клетки лабораторного реципиентного штамма S. cerervisiae D721W [RU 2460795] трансформируют с использованием полученных экспрессионных плазмид серии pPDX3. Трансформацию осуществляют по методу Ito [Ito et al. 1983]. В результате трансформации получают штаммы-продуценты серии D.
В частности,
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4) получают штамм D-Pla22(Int4), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4Y) получают штамм D-Pla22(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4Y).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int5) получают штамм D-Pla22ng(Int5), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int5).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int4Y) получают штамм D-Pla22ng(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int4Y).
Пример 10. Получение заявляемых белков-предшественников и продуктов их процессинга Для получения заявляемых белков-предшественников осуществляют культивирование сконструированных штаммов-продуцентов. С этой целью:
- штаммы-продуценты серии В культивируют на жидкой среде YPDG (дрожжевой экстракт - 1%; бактопептон - 2%; глюкоза - 2%; галактоза - 2%; вода - остальное) в течение 96 ч до стационарной фазы роста с использованием ротационного шейкера со скоростью 250 об/мин при температуре 22°С.
- штаммы-продуценты серии D культивируют на жидкой среде 223 (дрожжевой экстракт - 2%; бактопептон - 2%; глюкоза - 3%; вода - остальное) в течение 96 ч до стационарной фазы роста с использованием ротационного шейкера со скоростью 250 об/мин при температуре 22°С.
По завершении культивирования штаммов-продуцентов обеих серий получают образцы культуральной жидкости, которые освобождают от клеток дрожжей путем центрифугирования в течение 10 мин с ускорением 16000 g и последующего переноса образцов над осадочной жидкости в подходящие чистые емкости.
В результате получают свободные от клеток дрожжей обработанные образцы культуральной жидкости, каждый из которых содержит один из заявляемых белков-предшественников, Pla22(Int4) или Pla22(Int4Y) или Pla22ng(Int5) или Pla22ng(Int4Y), который не обязательно очищают и концентрируют, однако обязательно подвергают автокаталитическому процессингу.
На фиг. 2 приведены результаты автокаталитического процессинга белков-предшественников Pla22ng(Int5) и Pla22ng(Int4Y), продуцированных штаммами D-Pla22ng(Int5) и D-Pla22ng(Int4Y), соответственно, который осуществляют при комнатной температуре в течение 69 часов.
В результате автокаталитического процессинга получают образцы целевого продукта.
Пример 11. Оценка «специальной» и «собственной» активности образцов целевого продукта
Определение «специальной» активности образцов целевого продукта проводят с использованием рН-титратора по методике «Инструментального определения активности в стандартных условиях с использованием рН-титратора» [Чеперегин с соавт. 2019]. Для калибровки используют образец коммерческого препарата «Pla2 Nagase». В результате измерения получают данные о величине «специальной» активности каждого образца целевого продукта, выраженной в единицах активности коммерческого препарата «Pla2 Nagase». Другими словами, получают данные об относительной активности каждого образца целевого продукта и контрольного препарата «Pla2 Nagase».
На основании полученных данных для каждого образца целевого продукта готовят контрольный образец «Pla2 Nagase», расчетное значение «специальной» активности которого равно активности соответствующего образца целевого продукта. В результате формируют экспериментальные пары, состоящие из образца целевого продукта и разведенного контрольного образца «Pla2 Nagase.
В каждой экспериментальной паре проводят повторное измерение «специальной» активности. Результаты измерения активности образцов целевого продукта выражают в виде доли от активности соответствующего контрольного образца «Pla2 Nagase» и заносят в табл. 1.
Затем в каждой экспериментальной паре проводят измерение «собственной» активности разведенного контрольного образца «Pla2 Nagase» и образца целевого продукта. Измерение проводят по методике «Инструментального определения активности на яичном желтке» [Чеперегин с соавт. 2019]. Как и в случае измерения «специальной» активности, результаты измерения «собственной» активности образца целевого продукта выражают в виде доли от активности соответствующего контрольного образца «Pla2 Nagase» и заносят в табл. 1.
Результаты, приведенные в табл. 1 подтверждают, что заявляемый способ обеспечивает получение образцов целевого продукта, обладающих показателями «специальной» и «собственной» активности, сходными с показателями коммерческого препарата Pla2-Nagase. Наличие у образцов целевого продукта показателей «специальной» и «собственной» активности, сходных с показателями коммерческого препарата Pla2-Nagase, доказывает, что целевой продукт является полностью функциональной фосфолипазой А2.
Преимущества заявляемого способа:
- микробиологический синтез целевого продукта осуществляют с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae, традиционно признаваемых безопасными для получения ферментов для пищевой промышленности, к которым относится фосфолипаза А2;
- способ позволяет получать нативную фосфолипазу А2, то есть содержащую сайты N-гликозилирования, или мутантную, то есть не содержащую сайтов N-гликозилирования;
- при осуществлении способа могут быть применены разные интеины, в том числе мутантные;
- способ не требует больших трудозатрат, поскольку целевой продукт является секретируемым, а процесс образования целевого продукта из его предшественника - протекает самопроизвольно;
- способ не нуждается в использовании протеаз, поскольку процессинг белка-предшественника осуществляется на основе автокаталитического механизма;
- способ обеспечивает получение целевого продукта, ключевые показатели которого, характеризующие не только «специальную», но и «собственную» активность, находятся на уровне показателей коммерческого препарата «Pla2-Nagase» и, таким образом, соответствуют показателям природной высокоактивной фосфолипазы А2.
Литература
Бакланов К.В. Совершенствование технологии высококалорийных майонезов - М: 2008, с. 23
Чеперегин С.Э., Санникова Е.П., Малышева А.В., Клебанов Ф.А., Козлов Д.Г. (2019) Высокоактивные модифицированные варианты рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber для эффективного биосинтеза в дрожжах. Биотехнология, 2019, Т. 35, №3, С. 30-41. doi: 10.21519/0234-2758-2019-35-3-30-41
Cesarini S. Moving towards a Competitive Fully Enzymatic Biodiesel Process / S. Cesarini, F.I.J. Pastor, P.M. Nielsen, P. Diaz. // Sustainability. - 2015. - V.7 (6). - P. 7884-7903. doi: 10.3390/su7067884
De Maria L., Vind J., 
, Svendsen A., Patkar S. (2007). Phospholipases and their industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol, 74: 290-300. DOI 10.1007/s00253-006-0775-x
Gasser В., Prielhofer R., Marx H., et al. Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiol., 2013, 8(2), 191-208. doi: 10.2217/fmb. 12.133.v
Gietz R.D., Schiestl R.H. Quick and easy yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc., 2007, 2 (1), 35-37. doi: 10.1038/nprot.2007.14
Hoogevest P., Wendel A. (2014). The use of natural and synthetic phospholipids as pharmaceutical excipients. Eur J Lipid Sci Technol., 116(9): 1088-1107. doi: 10.1002/ejlt.201400219.
Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol., 1983,153(1): 163-168.
Kaiser et. al. (1994) Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
Lefkowitz L.J., Deems R.A., Dennis E.A. (1999). Expression of Group IA Phospholipase A2 in Pichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis. Biochemistry, 38, 14174-14184.
Liu A., Yu X.-W., Sha C, Xu Y. (2015). Streptomyces violaceoruber phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming. Appl Biochem Biotechnol, 17'5(6): 3195-3206. DOI 10.1007/s 12010-015-1492-7
Raveendran S., Parameswaran В., Ummalyma S.B., Abraham A., Mathew A.K., Madhavan A., Rebello S., Pandey A. Applications of Microbial Enzymes in Food Industry. Food Technol Biotechnol, 2018, 56(1), 16-30. doi: 10.17113/ftb.56.01.18.5491.
Stubbs M.T., Bode W. Coagulation factors and their inhibitors. Curr Opin Struct Biol., 1994,4(6):823-832. doi:10.1016/0959-440x(94)90263-1
Singh R., Kumar M., Mittal A., Mehta P.K. Microbial enzymes: industrial progress in 21st century. 3 Biotech., 2016, 6(2), 174. doi: 10.1007/s13205-016-0485-8.
Sugiyama M., Ohtan K., Izuhara M., Koike Т., Suzuki K., Imamura S., Misaki H. (2002). A Novel Prokaryotic Phospholipase A2. Characterization, gene cloning, and solution structure. The Journal of Biological Chemistry, 277(22): 20051-20058.
Valero F. (2012). Heterologous expression systems for lipases: A review. In Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology; Sandoval, G., Ed.; Springer Science Business Media: New York, NY, USA, 2012; Volume 861, pp. 161-178.
Zahrl R.J., 
, Mattanovich D., Gasser B. Systems biotechnology for protein production in Pichia pastoris. FEMS Yeast Res., 2017, 17(7), fox068. doi: 10.1093/femsyr/fox068
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика)
<120> Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты)
<160> 4
<210> 1
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(846)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (242)…(702)
<223> Sequence encodes native intein PRP8 of Penicillium chrysogenum
<221> misc_feature
<222> (703)…(846)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (847)…(852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 1
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30
AGT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ser Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80
AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TGC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Cys Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu
85 90 95
GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336
Asp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg
100 105 110
CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys
115 120 125
ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432
Ile Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140
GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480
Val Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val
145 150 155 160
GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528
Glu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg Ser
165 170 175
CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576
Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp
180 185 190
TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624
Ser Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser
195 200 205
GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672
Glu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr
210 215 220
CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720
Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys
225 230 235 240
AGT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768
Ser Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr
245 250 255
GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT AAC AGT ACC GCC TGG ACC 816
Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp Thr
260 265 270
TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852
Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly ***
275 280
<210> 2
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(846)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (242)…(702)
<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of Penicillium chrysogenum, enclosing mutation Cys11Tyr
<221> misc_feature
<222> (703)…(846)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (847)…(852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 2
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30
AGT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ser Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80
AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu
85 90 95
GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336
Asp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg
100 105 110
CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys
115 120 125
ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432
Ile Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140
GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480
Val Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val
145 150 155 160
GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528
Glu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg Ser
165 170 175
CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576
Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp
180 185 190
TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624
Ser Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser
195 200 205
GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672
Glu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr
210 215 220
CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720
Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys
225 230 235 240
AGT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768
Ser Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr
245 250 255
GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT AAC AGT ACC GCC TGG ACC 816
Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp Thr
260 265 270
TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852
Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly ***
275 280
<210> 3
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688, enclosing mutations Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(873)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (242)…(723)
<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of the strain Neosartorya aurata NRRL 4378
<221> misc_feature
<222> (724)…(867)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (847)…(852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 3
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30
GCT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ala Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80
AAA GGT ACT AGA TTA TTG AGA TAT GAT GGT TCT GAA ATT GAA GTT CAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Glu Val Gln
85 90 95
GAT GTC AAA GAA GGT GAT TTG TTA TTG GGT CCA GAT GGA GGT CCA AGA 336
Asp Val Lys Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Gly Pro Arg
100 105 110
AGA GCT TTT AAC ATA GTT TCA GGT GAA GAT AGG TTG TAT AGA GTT AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Ser Gly Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Val Lys
115 120 125
ATT GAC GGT TCT GTT GAG GAT TTA GTT GTT ACT CCT AAT CAT ATC TTG 432
Ile Asp Gly Ser Val Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140
GTC TTT CAT AGA GAA CAG AAA GCT AGG GAT AAA GAA GAT GAT CAA TTG 480
Val Phe His Arg Glu Gln Lys Ala Arg Asp Lys Glu Asp Asp Gln Leu
145 150 155 160
CCA GAA TCT TAT GAC ACA GTT GAA ATG ACA GCA GCT GAG TTT GCT GCT 528
Pro Glu Ser Tyr Asp Thr Val Glu Met Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala
165 170 175
TTA TCT GCT GAA GAT AGA TCA AGA TAT AGA GCA TTC AGG TCT CCA TCT 576
Leu Ser Ala Glu Asp Arg Ser Arg Tyr Arg Ala Phe Arg Ser Pro Ser
180 185 190
TTC GAT TTG TCT GAA AAA GCT GTA CCT ACT AAT CAC AGA TTT GCT ATT 624
Phe Asp Leu Ser Glu Lys Ala Val Pro Thr Asn His Arg Phe Ala Ile
195 200 205
AAG GAT ATT AGA TTA GAA TTG GAG ACT ACT GAA TGG GCA GGA TTT AGA 672
Lys Asp Ile Arg Leu Glu Leu Glu Thr Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg
210 215 220
GTC GAT AAA GAT CAA TTG TAT TTG AGG CAT GAT TAC TTA GTT TTG CAT 720
Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His
225 230 235 240
AAT AGT TTC GAC GCC AAC AAG GCT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG 768
Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys Ala Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu
245 250 255
GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC 816
Asp Met Lys Arg Val Cys Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala
260 265 270
TGT CAG AGT ACC GCC TGG ACC TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT 864
Cys Gln Ser Thr Ala Trp Thr Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly
275 280 285
TAA CTCGAG 873
***
<210> 4
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688, enclosing mutations Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(846)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (1)…(241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (242)…(702)
<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of Penicillium chrysogenum, enclosing mutation Cys11Tyr
<221> misc_feature
<222> (703)…(846)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature
<222> (847)…(852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 4
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30
GCT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ala Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80
AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu
85 90 95
GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336
Asp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg
100 105 110
CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys
115 120 125
ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432
Ile Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140
GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480
Val Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val
145 150 155 160
GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528
Glu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg Ser
165 170 175
CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576
Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp
180 185 190
TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624
Ser Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser
195 200 205
GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672
Glu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr
210 215 220
CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720
Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys
225 230 235 240
GCT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768
Ala Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr
245 250 255
GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT CAG AGT ACC GCC TGG ACC 816
Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Gln Ser Thr Ala Trp Thr
260 265 270
TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852
Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly ***
275 280
<---
Claims (5)
1. Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2, осуществляемый путем получения и введения в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, включающий последовательность нативной, содержащей сайты N-гликозилирования, или мутантной, не содержащей сайтов N-гликозилирования, фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, содержащей инсерцию интеина между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76, а также имеющей на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина, с последующим биосинтезом этого белка-предшественника и его автокаталитическим процессингом с образованием целевого продукта.
2. Белок-предшественник для осуществления способа по п. 1, кодируемый последовательностью SEQ ID N: 1 и содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3 в составе нативной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688.
3. Белок-предшественник для осуществления способа по п. 1, кодируемый последовательностью SEQ ID N: 2 и содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3, несущего мутацию Cys11Tyr, в составе нативной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688.
4. Белок-предшественник для осуществления способа по п. 1, кодируемый последовательностью SEQ ID N: 3 и содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Neosartorya aurata NRRL 4378 в составе мутантной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, несущей мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln.
5. Белок-предшественник для осуществления способа по п. 1, кодируемый последовательностью SEQ ID N: 4 и содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3, несущего мутацию Cys11Tyr, в составе фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber А-2688, несущей мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019139317A RU2728240C1 (ru) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019139317A RU2728240C1 (ru) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2728240C1 true RU2728240C1 (ru) | 2020-07-28 |
Family
ID=72085697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019139317A RU2728240C1 (ru) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2728240C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119899821A (zh) * | 2024-07-01 | 2025-04-29 | 华南理工大学 | 一种紫红链霉菌磷脂酶a2突变体及其应用 |
-
2019
- 2019-12-03 RU RU2019139317A patent/RU2728240C1/ru active
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| GASSER B. et al., Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research, Future Microbiology, 2013, Vol.8, N2, pp.191-208 * |
| LEFKOWITZ L. J. et al., Expression of Group IA Phospholipase A2inPichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis, Biochemistry, 1999, Vol.43, N38, pp.14174-14184. * |
| VIND J. et al., Phospholipases and their industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, Vol.74, pp.290-300. * |
| ВЕЛЬКОВ В.В., С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков, Клинико-лабораторный консилиум, 2009, т.31, н.6, стр.28-33 * |
| ЧЕПЕРЕГИН С.Э. и др, Высокоактивные модифицированные варианты рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber для эффективного биосинтеза в дрожжах, БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2019, т.35, н.3, стр.30-41 * |
| ЧЕПЕРЕГИН С.Э. и др, Высокоактивные модифицированные варианты рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber для эффективного биосинтеза в дрожжах, БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2019, т.35, н.3, стр.30-41. ВЕЛЬКОВ В.В., С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков, Клинико-лабораторный консилиум, 2009, т.31, н.6, стр.28-33. VIND J. et al., Phospholipases and their industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, Vol.74, pp.290-300. GASSER B. et al., Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research, Future Microbiology, 2013, Vol.8, N2, pp.191-208. LEFKOWITZ L. J. et al., Expression of Group IA Phospholipase A2inPichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis, Biochemistry, 1999, Vol.43, N38, pp.14174-14184. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119899821A (zh) * | 2024-07-01 | 2025-04-29 | 华南理工大学 | 一种紫红链霉菌磷脂酶a2突变体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1275711B1 (de) | Lipase/Acyltransferase aus Candida parapsilosis | |
| US10738288B2 (en) | Efficient phospholipase C mutant that does not rely on zinc ions | |
| US7247463B2 (en) | Enzymes with lipase/acyltransferase activity, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof | |
| CN108239648B (zh) | 高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法 | |
| CN108795837A (zh) | 一种高效表达磷脂酶d的枯草芽孢杆菌工程菌 | |
| RU2728240C1 (ru) | Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты) | |
| CN111684065A (zh) | 随机酯交换脂肪酶 | |
| KR102181315B1 (ko) | 활성 개선된 리조무코르 미에헤이 유래 변이 리파제 및 효모를 이용한 재조합 생산 방법 | |
| US7229817B2 (en) | Recombinant porcine liver esterases, their use and a method for the production thereof | |
| Simatupang et al. | Lipolytic activity of Itb1. 1 and Lk3 thermostable lipases expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris | |
| RU2716087C1 (ru) | Фосфолипаза А2 для экспрессии в дрожжах (варианты) | |
| EP1130100A1 (en) | Modified lipolytic enzymes and their use | |
| WO2007105264A1 (ja) | 新規ホスホリパーゼｃ | |
| JP6857927B1 (ja) | ホスファチジルグリセロール特異的な新規酵素 | |
| JP2017060424A (ja) | リパーゼ、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、リパーゼの製造法、グリセロ脂質を加水分解する方法及びグリセロ脂質の加水分解物を製造する方法 | |
| KR101837130B1 (ko) | 효모 캔디다 뷰티리 sh-14 유래의 신규 리파아제 및 그의 용도 | |
| KR101596435B1 (ko) | 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제 | |
| Wicka-Grochocka et al. | Cloning, expression in Komagataella phaffii, and biochemical characterization of recombinant sequence variants of Pseudomonas sp. S9 GDSL-esterase | |
| DK2784160T3 (en) | Novel gene derived from tidal metagenome and novel protein, which is obtained therefrom, and exhibits koaktivitet of phospholipase and lipase | |
| JP5302189B2 (ja) | スフィンゴミエリナーゼ | |
| JP4679923B2 (ja) | 新規ホスホリパーゼｃ | |
| Kim et al. | Constitutive overexpression of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase in E. coli fed-batch culture | |
| JP5330334B2 (ja) | 食品用酵素剤 | |
| KR0180570B1 (ko) | 신규한 플라스미드 pKLE와 이를 이용한 리파제의 대량생산방법 | |
| WO2012105565A1 (ja) | 酵素及びその製造方法 |