RU2726456C1

RU2726456C1 - Hepatitis b virus (hbv) inhibitor

Info

Publication number: RU2726456C1
Application number: RU2019131097A
Authority: RU
Inventors: Андрей Александрович Иващенко; Александр Васильевич Иващенко; Николай Филиппович Савчук; Олег Дмитриевич Митькин; Дмитрий Владимирович Кравченко; Сергей Николаевич Коваленко; Наталья Дмитриевна Бунятян
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательский институт ХимРар" (ООО "НИИ ХимРар")
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2020-07-14

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to organic chemistry, specifically to use of 4H-3,1-benzoxazin-4-one derivative of general formula 1

,

where R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ are optionally identical and are hydrogen, C₁-C₆ alkyl, halogen, C₁-C₆ alkoxy, oxycarbonyl of formula -OC(O)R, where R is C ₁ -C ₆ alkyl, as an inhibitor of hepatitis B virus for preparing a drug for treating hepatitis B. Also disclosed is a pharmaceutical composition comprising a compound of general formula 1.

EFFECT: technical result: use of 4H-3,1-benzoxazin-4-one derivative as an inhibitor of hepatitis B virus is disclosed.

7 cl, 1 tbl, 26 ex

Description

Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ.The present invention relates to new inhibitors of hepatitis B virus (HBV, HBV) as chemotherapeutic agents for the treatment of HBV.

Гепатит В - это инфекционное воспалительное заболевание печени, возникающее вследствие внедрения в организм вируса из семейства гепаднавирусов (ДНК-содержащие вирусы, репликация которых очуществляется через стадию РНК). Вирус гепатита В (ВГВ) обладает устойчивостью к физическим и химическим влияниям, (например, не погибает в замороженном состоянии около 20 лет, в холодильнике - 6 лет, а при комнатной температуре - около 3 месяцев). Он уничтожается при кипячении длительностью 30 минут, а при автоклавировании - через 5 минут [http://medbe.ru].Hepatitis B is an infectious inflammatory liver disease resulting from the introduction into the body of a virus from the hepadnavirus family (DNA-containing viruses, which replicate through the RNA stage). The hepatitis B virus (HBV) is resistant to physical and chemical influences (for example, it does not die in a frozen state for about 20 years, in a refrigerator for 6 years, and at room temperature for about 3 months). It is destroyed by boiling for 30 minutes, and by autoclaving - after 5 minutes [http://medbe.ru].

ВГВ вызывает как острые, так и хронические заболевания и подвергает людей высокому риску смерти от цирроза и рака печени. Острый гепатит В характеризуется неблагоприятным клиническим течением - в условиях стандартной терапии 1% случаев заканчивается летально, в 10% случаев заболевание переходит в хроническую форму. Развившийся хронический гепатит приводит, в свою очередь, к циррозу и первичному раку печени.HBV causes both acute and chronic illness and puts people at high risk of dying from cirrhosis and liver cancer. Acute hepatitis B is characterized by an unfavorable clinical course - under the conditions of standard therapy, 1% of cases are fatal, in 10% of cases the disease becomes chronic. The developed chronic hepatitis leads, in turn, to cirrhosis and primary liver cancer.

Россия относится к странам со средней степенью распространенности ВГВ. В 2016 году смертность от вирусных гепатитов составила около 1,4 млн человек [http://www.vector.nsc.ru/virusnyie-gepatity/]. Следует отметить, что 98% смертей обусловлены развитием конечных стадий хронических гепатитов В (ХГВ) и С (ХГС). Лечение острого и хронического гепатита В является одной из основных проблем здравоохранения.Russia belongs to the countries with an average HBV prevalence. In 2016, the death rate from viral hepatitis was about 1.4 million people [http://www.vector.nsc.ru/virusnyie-gepatity/]. It should be noted that 98% of deaths are caused by the development of the end stages of chronic hepatitis B (CHB) and C (CHC). Treatment of acute and chronic hepatitis B infection is a major public health concern.

Против вирусного гепатита В была разработана и с 1982 года стала доступна вакцина. Она представляет собой вирусную частицу и безопасна для организма. При ее введении в организме образуются специфичные антитела к вирусу гепатита В.A vaccine has been developed against viral hepatitis B and has been available since 1982. It is a viral particle and is safe for the body. When it is administered, specific antibodies to the hepatitis B virus are formed in the body.

Вакцина эффективно предотвращает инфекцию и ее хронические последствия на 95%. Однако предотвращение инфекции не снимает вопрос необходимости лечения как минимум 3 млн. больных хроническим гепатитом В в России и еще порядка 240-350 млн. в мире. Таким образом, хронический гепатит В продолжает оставаться глобальной проблемой.The vaccine effectively prevents infection and its chronic consequences by 95%. However, preventing infection does not remove the need to treat at least 3 million patients with chronic hepatitis B in Russia and about 240-350 million in the world. Thus, chronic hepatitis B continues to be a global problem.

В настоящее время существует только 2 варианта лечения ХГВ: иммуномодуляторами (препараты интерферона интерферон альфа-2а, пэгилированный интерферон альфа-2а) или аналогами нуклеотидов или нуклеозидов (АН). Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. К преимуществам терапии интерфероном можно отнести отсутствие генотипической резистентности вируса, а к недостаткам широкий спектр противопоказаний (например, декомпенсированный цирроз печени), широкий спектр побочных эффектов, включая слабость, гриппоподобные симптомы, депрессию, подавление функций костного мозга, обострение аутоиммунных заболеваний, а также неудобство использования (часто препарат вводится подкожно) [https://ru.wikipedia.org/]. У большинства людей терапия интерфероном не излечивает инфекцию ВГВ, а только подавляет репликацию вируса. Поэтому лечение ВГВ должно продолжаться в течение всей жизни [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/].Currently, there are only 2 treatment options for CHB: immunomodulators (interferon preparations, interferon alpha-2a, pegylated interferon alpha-2a) or nucleotide or nucleoside analogs (AN). Both methods have their own advantages and disadvantages. The advantages of interferon therapy include the absence of genotypic resistance of the virus, and the disadvantages include a wide range of contraindications (for example, decompensated liver cirrhosis), a wide range of side effects, including weakness, flu-like symptoms, depression, suppression of bone marrow function, exacerbation of autoimmune diseases, and inconvenience use (often the drug is injected subcutaneously) [https://ru.wikipedia.org/]. In most people, interferon therapy does not cure HBV infection, but only suppresses viral replication. Therefore, HBV treatment must be continued throughout life [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/].

Терапия аналогами нуклеотидов или нуклеозидов демонстрирует выраженное противовирусное действие, имеет удобный режим дозирования (перорально), сравнительно редкие побочные реакции. В настоящее время одобрено 5 препаратов-аналогов нуклеотидов или нуклеозидов для лечения ХГВ: ламивудин (аналог цитидина), энтекавир (нуклеозидный аналог гуанозина), телбивудин (нуклеозидный аналог тимидина), тенофовир (нуклеотидный аналог аденина), адефовир (нуклеозидный аналог аденина) [http://infectious.ru/docs/rekomendacii_gepatit_b.pdf]. Механизм действия указанных препаратов связан с ингибированием реакций обратной транскрипции РНК вируса гепатита В в одноцепочечную ДНК. Аналоги нуклеотидов или нуклеозидов хорошо переносятся пациентами, не вызывая значительных побочных эффектов. Однако, в некоторых случаях наблюдается лактатный ацидоз и нефротоксичность. Нуклеозиды ламивудин, телбивудин и нуклеотид адефовир морально устарели и не рекомендуются ввиду низкого порога резистентности и возможности формирования перекрестной резистентности вируса к энтекавиру и препаратам тенофовира соответственно. Прием энтекавира противопоказан при беременности; а тенофовир обладает нефротоксичностью [http://kna-s31.edu.27.ru/files/documents/898_gepatit_v.docx].Therapy with nucleotide or nucleoside analogs demonstrates a pronounced antiviral effect, has a convenient dosing regimen (oral), and relatively rare side reactions. There are currently 5 approved nucleotide or nucleoside analog drugs for the treatment of CHB: lamivudine (cytidine analog), entecavir (guanosine nucleoside analog), telbivudine (thymidine nucleoside analog), tenofovir (adenine nucleotide analog), adefovir (adenine nucleoside analog) [http : //infectious.ru/docs/rekomendacii_gepatit_b.pdf]. The mechanism of action of these drugs is associated with the inhibition of the reactions of reverse transcription of hepatitis B virus RNA into single-stranded DNA. Nucleotide or nucleoside analogs are well tolerated by patients without causing significant side effects. However, in some cases lactic acidosis and nephrotoxicity are observed. The nucleosides lamivudine, telbivudine and the nucleotide adefovir are obsolete and not recommended due to the low threshold of resistance and the possibility of cross-resistance of the virus to entecavir and tenofovir drugs, respectively. Taking entecavir is contraindicated in pregnancy; while tenofovir is nephrotoxic [http://kna-s31.edu.27.ru/files/documents/898_gepatit_v.docx].

Основной проблемой терапии ХГВ с помощью АН является возникающая устойчивость ВГВ к препаратам. В гене обратной транскриптазы вируса происходят мутации, которые предотвращают связывание препаратов с ферментом в активном сайте. При отмене терапии наблюдается быстрый рецидив заболевания, что не позволяет спрогнозировать сроки лечения.The main problem of CHB therapy with AN is the emerging HBV drug resistance. Mutations occur in the viral reverse transcriptase gene that prevent drugs from binding to an enzyme at the active site. With the cancellation of therapy, a rapid relapse of the disease is observed, which does not allow predicting the timing of treatment.

Для решения проблемы мировой эпидемии ХГВ необходим постоянный поиск новых препаратов для лечения гепатита В, способных воздействовать на жизненный цикл вируса в организме, которые могут быть использованы в комбинации с иммуномодулирующими агентами, что, в конечном итоге, должно привести к полной элиминации вируса из организма, недостижимой в настоящий момент.To solve the problem of the global CHB epidemic, it is necessary to constantly search for new drugs for the treatment of hepatitis B that can affect the life cycle of the virus in the body, which can be used in combination with immunomodulatory agents, which, ultimately, should lead to the complete elimination of the virus from the body. unattainable at the moment.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.The following are definitions of terms that are used in the description of this invention.

Термин «алкил», используемый здесь, относится к насыщенным с линейной или разветвленной цепью углеводородным радикалам, содержащим от одного до шести атомов углерода. Примеры алкильных радикалов C₁-С₆, включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил и трет-бутил.The term "alkyl", as used herein, refers to straight or branched chain saturated hydrocarbon radicals containing from one to six carbon atoms. Examples of C ₁ -C ₆ alkyl radicals include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, and tert-butyl.

«Арил» означает ароматическую моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 6 до 14 атомов углерода, преимущественно от 6 до 10 атомов углерода. Арил может содержать один или более «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными."Aryl" means an aromatic monocyclic or polycyclic system containing from 6 to 14 carbon atoms, preferably from 6 to 10 carbon atoms. Aryl may contain one or more "cyclic system substituents" which may be the same or different.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод. Предпочтительными являются фтор, хлор и бром."Halogen" means fluorine, chlorine, bromine and iodine. Fluorine, chlorine and bromine are preferred.

«Алкокси группа» означает группу -O-R, например, -О-СН₃."Alkoxy group" means an —OR group, for example —O — CH ₃ .

«Карбоксил» означает группу -СО₂Н или -CO₂R."Carboxyl" means a —CO ₂ H or —CO ₂ R group.

«Карбамоил» означает rpynny-CONR."Carbamoil" means rpynny-CONR.

«N-карбоксамид» означает группу -NCOR.“N-carboxamide” means a —NCOR group.

«N-сульфамид» означает группу -NSO₂R.“N-sulfamide” means a —NSO ₂ R.

«Оксикарбонил» означает группу -OCOR."Oxycarbonyl" means the -OCOR group.

Термин «необязательно замещенный» означает, что упомянутая группа может быть замещена в одном или более положениях любым одним или любой комбинацией радикалов.The term "optionally substituted" means that said group may be substituted at one or more positions with any one or any combination of radicals.

Термин «кристаллическая форма» означает структуру вещества, характеризующуюся упаковкой образующих ее молекул в один из видов кристаллической решетки.The term "crystalline form" means a structure of a substance characterized by the packing of its constituent molecules into one of the types of a crystal lattice.

Термин «поликристаллическая форма» означает структуру вещества, имеющую поликристаллическое строение, т.е. состоящую из множества мелких монокристаллов, т.е. кристаллитов определенной кристаллической формы.The term "polycrystalline form" means a structure of a substance having a polycrystalline structure, i.e. consisting of many small single crystals, i.e. crystallites of a certain crystalline form.

Термин «активный компонент» (лекарственное вещество) относится к физиологически активному веществу синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, бактериального и так далее) происхождения, обладающему фармакологической активностью, которое является активным ингредиентом фармацевтической композиции.The term "active ingredient" (drug substance) refers to a physiologically active substance of synthetic or other (biotechnological, plant, animal, bacterial, etc.) origin, which has pharmacological activity, which is an active ingredient of a pharmaceutical composition.

«Лекарственное начало» (лекарственная субстанция лекарственное вещество, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства)."Medicinal principle" (drug substance, drug-substance) means a physiologically active substance of synthetic or other (biotechnological, plant, animal, microbial and other) origin that has pharmacological activity and is an active principle of a pharmaceutical composition used for the production and manufacture of a medicinal preparation (means).

«Лекарственное средство (препарат)» означает вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. готовых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего."Medicinal product (preparation)" means a substance (or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition), in the form of tablets, capsules, injections, ointments and other ready-made forms intended for restoration, correction or change of physiological functions in humans and animals, as well as for treatment and disease prevention, diagnostics, anesthesia, contraception, cosmetology and others.

«Фармацевтическая композиция» означает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как, парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения."Pharmaceutical composition" means a composition comprising a compound of Formula 1 and at least one of the components selected from the group of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, auxiliary, dispensing and receiving means, delivery means, such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, humectants, emulsifiers, suspending agents, thickeners, sweeteners, fragrances, flavors, antibacterial agents, fungicides, lubricants, sustained delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage. Examples of suspending agents are ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, and mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be provided by a variety of antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, sorbic acid, and the like. The composition may also include isotonic agents such as sugars, sodium chloride and the like. Prolonged action of the composition can be provided by agents that slow down the absorption of the active principle, for example, aluminum monostearate and gelatin. Examples of suitable carriers, solvents, diluents, and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, as well as mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters (such as ethyl oleate). Examples of fillers are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate, and the like. Examples of grinders and spreading agents are starch, alginic acid and its salts, silicates. Examples of lubricants are magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, talc, and high molecular weight polyethylene glycol. A pharmaceutical composition for oral, sublingual, transdermal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, topical or rectal administration of an active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in a standard administration form, as a mixture with traditional pharmaceutical carriers. Suitable unit forms of administration include oral forms such as tablets, gelatin capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and buccal administration forms, aerosols, implants, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular administration forms and rectal administration forms.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные [Berge S.M. et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях. К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)-аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин."Pharmaceutically acceptable salt" means the relatively non-toxic organic and inorganic salts of acids and bases disclosed in the present invention. These salts can be obtained in situ during the synthesis, isolation, or purification of compounds, or they can be specially prepared. In particular, base salts can be specially prepared starting from the purified free base of the claimed compound and a suitable organic or inorganic acid. Examples of the salts obtained in this way are hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, bisulfates, phosphates, nitrates, acetates, oxalates, valeriates, oleates, palmitates, stearates, laurates, borates, benzoates, lactates, tosylates, citrates, maleates, fumarates, succinates, tartrates mesylates, malonates, salicylates, propionates, ethanesulfonates, benzenesulfonates, sulfamates and the like [Berge SM et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19). Salts of the claimed acids can also be specially prepared by reacting a purified acid with a suitable base, sodium, potassium, calcium, barium, zinc, magnesium, lithium and aluminum salts, the most desirable of which are sodium and potassium salts. Suitable inorganic bases from which metal salts can be derived are sodium hydroxide, carbonate, bicarbonate and hydride, potassium hydroxide and bicarbonate, potash, lithium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, zinc hydroxide. As organic bases from which salts of the claimed acids can be obtained, amines and amino acids are selected that are basic enough to form a stable salt and are suitable for medical use. Such amines include ammonia, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, diethylamine, triethylamine, benzylamine, dibenzylamine, dicyclohexylamine, piperazine, ethylpiperidine, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, and the like. In addition, tetraalkylammonium hydroxides such as, for example, choline, tetramethylammonium, tetraethylammonium, and the like can be used for salt formation. Basic amino acids - lysine, ornithine and arginine - can be used as amino acids.

«Фармацевтически приемлемые эксципиенты» означает применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или фармацевтические носители. «Фармацевтические носители» означает носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты."Pharmaceutically acceptable excipients" means diluents, auxiliary agents and / or pharmaceutical carriers used in the pharmaceutical field. "Pharmaceutical carriers" means carriers that are used in the pharmaceutical field to produce common forms, including: in oral forms, binders, lubricants, disintegrants, solvents, diluents, stabilizers, suspending agents, colorless agents, flavoring agents are used; antiseptic agents, solubilizers, stabilizers are used in injection forms; in local forms, bases, diluents, lubricants, antiseptic agents are used.

Предметом данного изобретения являются новые ингибиторы вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ, представляющие собой производные 4H-3,1-бензоксазин-4-она общей формулы 1The subject of this invention is new inhibitors of hepatitis B virus (HBV, HBV) as chemotherapeutic agents for the treatment of HBV, which are derivatives of 4H-3,1-benzoxazin-4-one of General formula 1

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ представляют собой необязательно одинаковые: водород, алкил, арил, галоген, гидроксил, алкокси, оксикарбонил, амин или замещенный амин, N-карбоксамид, N-сульфамид, карбоксил или карбамоил.where R ₁ , R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₈ , R ₉ are optionally the same: hydrogen, alkyl, aryl, halogen, hydroxyl, alkoxy, oxycarbonyl, amine or substituted amine , N-carboxamide, N-sulfamide, carboxyl or carbamoyl.

Согласно данному изобретению предпочтительными ингибиторами ВГВ общей формулы 1 являются соединения формул 1.1-1.13:According to the invention, preferred HBV inhibitors of general formula 1 are compounds of formulas 1.1-1.13:

6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4Н-3,1-бензоксазин-4-она 1.1;6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.1;

6-бром-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.2;6-bromo-2- (2-chlorophenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.2;

6-бром-2-(4-метоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3;6-bromo-2- (4-methoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.3;

6-бром-2-(4-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.4;6-bromo-2- (4-propoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.4;

2-(4-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.5;2- (4-chlorophenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.5;

2-(3-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.6;2- (3-propoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.6;

4-(4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил пропионата 1.7;4- (4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl propionate 1.7;

2-(3-бромфенил)-6,7-диметокси-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.8;2- (3-bromophenyl) -6,7-dimethoxy-4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.8;

6,7-диметокси-2-(4-этоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.9;6,7-dimethoxy-2- (4-ethoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.9;

4-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.10;4- (6-acetoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl acetate 1.10;

3-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.11;3- (6-acetoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl acetate 1.11;

2-(2-метилфенил)-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-6-ил ацетата 1.12;2- (2-methylphenyl) -4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-6-yl acetate 1.12;

8-метил-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.13.8-methyl-2- (2-chlorophenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.13.

Более предпочтительным ингибитором ВГВ общей формулы 1 является 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он 1.1, выбранный из ряда соединений 1.1-1.13 и их гидратов и/или сольватов:A more preferred HBV inhibitor of general formula 1 is 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.1, selected from the number of compounds 1.1-1.13 and their hydrates and / or solvates:

Патентуемые ингибиторы представляют собой соединения, не являющиеся новыми, поскольку их структурные формулы известны из коммерчески доступных баз данных и литературы [Hadfield, J.A. et al. Anti-Cancer Drugs, 1994, 5, 533-8; Fenton, G. et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 265-272]. Также 4H-3,1-бензоксазин-4-оны 1 хорошо известны в качестве ингибиторов сериновых протеаз [US 4665070, Syntex Inc. (СА), 12.05.1987], ингибиторов тканевого фактора VII [US 6180625, Novo Nordisk A/S (DK), 30.06.2001], гиперлипидемических средств [JP 1994009670, Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. (JP), 18.01.1994], антифиброзных агентов [US 9062076, Fibrotech Therapeuticus PTY LTD (AU), 23.06.2015 & WO 2011047432, 28.04.2011]; антипаркинсонических и противоинфекционных препаратов [JP 2007153860, Shipro Kasei Kaisha Ltd. (JP), 21.06.2007]; противовирусных агентов [JP 1999322611, Daiichi Sankyo Co., Ltd. (JP), 24.11.1999; Hsieh, P.-W. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14(18), 4751-754]. Однако в научной и патентной литературе отсутствуют данные об их биологической активности в отношении ВГВ инфекции. Отсутствуют источники, в которых соединения общей формулы 1 были бы описаны в качестве лекарственного средства для лечения вирусного гепатита. Авторы выявили и патентуют их новое свойство, а именно, способность ингибировать развитие вируса гепатита В (ВГВ, HBV), что является техническим решением в качестве предмета «применение продукта или способа по определенному (новому) назначению», а именно, в качестве лекарственного средства для лечения вирусного гепатита В, и таким образом 4H-3,1-бензоксазин-4-оны общей формулы 1 обладают новизной и изобретательским уровнем.The patented inhibitors are compounds that are not new, since their structural formulas are known from commercially available databases and literature [Hadfield, J.A. et al. Anti-Cancer Drugs 1994,5,533-8; Fenton, G. et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 265-272]. Also 4H-3,1-benzoxazin-4-ones 1 are well known as inhibitors of serine proteases [US 4665070, Syntex Inc. (CA), 05/12/1987], tissue factor VII inhibitors [US 6180625, Novo Nordisk A / S (DK), 06/30/2001], hyperlipidemic agents [JP 1994009670, Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. (JP), 18.01.1994], antifibrotic agents [US 9062076, Fibrotech Therapeuticus PTY LTD (AU), 23.06.2015 & WO 2011047432, 28.04.2011]; antiparkinsonian and anti-infective drugs [JP 2007153860, Shipro Kasei Kaisha Ltd. (JP), 21.06.2007]; antiviral agents [JP 1999322611, Daiichi Sankyo Co., Ltd. (JP) 11.24.1999; Hsieh, P.-W. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14 (18), 4751-754]. However, the scientific and patent literature lacks data on their biological activity against HBV infection. There are no sources in which the compounds of general formula 1 would be described as a medicament for the treatment of viral hepatitis. The authors have identified and patent their new property, namely, the ability to inhibit the development of hepatitis B virus (HBV, HBV), which is a technical solution as the subject of "the use of a product or method for a specific (new) purpose", namely, as a drug for the treatment of viral hepatitis B, and thus the 4H-3,1-benzoxazin-4-ones of general formula 1 possess novelty and inventive step.

Способ получения 4H-3,1-бензоксазин-4-онов 1.1-1.13 представлен на схеме 1. Он заключается в обработке замещенной бензойной кислоты 2 SOCl₂, что дает хлорангидрид замещенной бензойной кислоты 3. Последующая реакция хлорангидридов бензойной кислоты 3 с 2-аминобензойными кислотами 4 приводит к 4H-3,1-бензоксазин-4-онам 1 [Fenton, G. et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 265-272].The method for obtaining 4H-3,1-benzoxazin-4-ones 1.1-1.13 is shown in Scheme 1. It consists in the treatment of substituted benzoic acid 2 with SOCl ₂ , which gives the acid chloride of substituted benzoic acid 3. The subsequent reaction of benzoic acid chlorides 3 with 2-aminobenzoic acid acids 4 leads to 4H-3,1-benzoxazin-4-ones 1 [Fenton, G. et al. J. Med. Chem., 1989, 32, 265-272].

Схема 1. Получение 4H-3,1-бензоксазин-4-онов 1Scheme 1. Obtaining 4H-3,1-benzoxazin-4-ones 1

Согласно данному изобретению новый ингибитор ВГВ общей формулы 1, его гидрат и/или сольват представляет собой лекарственное начало для приготовления фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы для профилактики и лечения инфекции ВГВ у теплокровных животных и людей.According to the present invention, a new HBV inhibitor of general formula 1, its hydrate and / or solvate is a drug substance for preparing a pharmaceutical composition and a finished dosage form for the prevention and treatment of HBV infection in warm-blooded animals and humans.

Предметом данного изобретения является активный компонент, обладающий свойством ингибитора ВГВ, представляющий собой производные 4H-3,1-бензоксазин-4-она общей формулы 1.The subject of this invention is an active ingredient with HBV inhibitor properties, which are derivatives of 4H-3,1-benzoxazin-4-one of General formula 1.

Предпочтительно активный компонент представляет собой, 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он формулы 1.1.Preferably, the active ingredient is, 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one of formula 1.1.

Предметом данного изобретения является также фармацевтическая композиция в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, для лечения инфекции ВГВ у людей и теплокровных животных, включающая в свой состав ингибитор ВГВ общей формулы 1, его гидрат и/или сольват в терапевтически эффективном количестве и необязательно, фармацевтически приемлемые эксципиенты. Фармацевтическая композиция наряду с ингибитором общей формулы 1 или его гидратом и/или сольватом по настоящему изобретению может включать и другие активные субстанции, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов. При необходимости использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.The subject of this invention is also a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules or injections, placed in a pharmaceutically acceptable package for the treatment of HBV infection in humans and warm-blooded animals, comprising an HBV inhibitor of the general formula 1, its hydrate and / or solvate in a therapeutically effective an amount and, optionally, pharmaceutically acceptable excipients. The pharmaceutical composition along with the inhibitor of general formula 1 or its hydrate and / or solvate according to the present invention may include other active substances, provided that they do not cause undesirable effects. If necessary, use the pharmaceutical composition of the present invention in clinical practice, it can be mixed with conventional pharmaceutical carriers.

Предпочтительно предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он формулы 1.1 в терапевтически эффективном количестве.Preferably, the subject of this invention is a pharmaceutical composition comprising 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one of formula 1.1 in a therapeutically effective amount.

Предпочтительно предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, которой соединение общей формулы 1 содержится в количестве от 1 до 1000 мг.Preferably, the subject of the present invention is a pharmaceutical composition in which the compound of general formula 1 is contained in an amount of 1 to 1000 mg.

Более предпочтительным предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, которой соединение 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-он формулы 1.1 содержится в количестве от 1 до 1000 мг.A more preferred aspect of the present invention is a pharmaceutical composition in which the compound 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one of formula 1.1 is present in an amount of from 1 to 1000 mg.

Предметом данного изобретения является способ получения фармацевтической композиции смешением с инертным наполнителем и/или растворителем, по крайней мере, одного ингибитора ВГВ общей формулы 1 или его гидрата и/или сольвата в терапевтически эффективном количестве.The subject of this invention is a method for preparing a pharmaceutical composition by mixing with an inert filler and / or solvent at least one HBV inhibitor of the general formula 1 or a hydrate and / or solvate thereof in a therapeutically effective amount.

Предметом данного изобретения являются также терапевтические коктейли для лечения инфекции ВГВ, включающие в качестве одного из компонентов новое лекарственное средство общей формулы 1, его гидрат и/или сольват или новую фармацевтическую композицию, содержащие в качестве активного компонента по крайней мере один ингибитор ВГВ общей формулы 1 или его гидрат и/или сольват. Терапевтический коктейль для лечения инфекции ВГВ, наряду с фармацевтической композицией по данному изобретению, может включать другие известные препараты, предназначенные для лечения ВГВ, ВГС, ВИЧ или препараты, усиливающие иммунную систему пациента.The subject of this invention is also therapeutic cocktails for the treatment of HBV infection, comprising as one of the components a new drug of general formula 1, a hydrate and / or solvate thereof, or a new pharmaceutical composition containing at least one HBV inhibitor of general formula 1 as an active component or a hydrate and / or solvate thereof. A therapeutic cocktail for the treatment of HBV infection, along with the pharmaceutical composition of the present invention, may include other known drugs intended for the treatment of HBV, HCV, HIV, or drugs that enhance the patient's immune system.

В соответствии с данным изобретением способ профилактики и лечения инфекции ВГВ у животных и людей заключается во введении пациенту новой фармацевтической композиции по данному изобретению или нового терапевтического коктейля по данному изобретению.In accordance with this invention, a method for the prevention and treatment of HBV infection in animals and humans consists in administering to a patient a new pharmaceutical composition according to this invention or a new therapeutic cocktail according to this invention.

Лекарственные средства могут вводиться через ингалятор, перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно).Medicines can be administered via an inhaler, orally, or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically).

Клиническая дозировка средства общей формулы 1 или его гидрата и/или сольвата у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10~800 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции ингибитора по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10~800 мг ингибитора общей формулы 1 или его гидрат и/или сольват. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени.The clinical dosage of the agent of general formula 1 or its hydrate and / or solvate in patients can be adjusted depending on the therapeutic efficacy and bioavailability of the active ingredients in the body, the rate of their metabolism and excretion from the body, as well as depending on the age, sex and stage of the patient's disease. the daily dose in adults is usually 10 ~ 800 mg. Therefore, during the preparation of the inhibitor according to the present invention from the pharmaceutical composition in the form of dosage units, it is necessary to take into account the above-mentioned effective dosage, while each dosage unit of the drug should contain 10 ~ 800 mg of the inhibitor of general formula 1 or its hydrate and / or solvate. As directed by your doctor or pharmacist, these drugs may be taken multiple times over specific periods of time.

Настоящее изобретение далее будет описано в связи с определенными вариантами осуществления, которые не предназначены для ограничения его объема. Напротив, настоящее изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем формулы изобретения. Таким образом, следующие примеры, которые включают в себя конкретные варианты, иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.The present invention will be further described in connection with certain embodiments, which are not intended to limit its scope. On the contrary, the present invention covers all alternatives, modifications and equivalents that may be included within the scope of the claims. Thus, the following examples, which include specific variations, illustrate but do not limit the present invention.

Пример 1. Синтез 4-трет-бутилбензоил хлорида 3.1.Example 1. Synthesis of 4-tert-butylbenzoyl chloride 3.1.

К суспензии 4-трет-бутилбензойной кислоты 2.1 (0,178 г, 1 ммоль) в сухом толуоле (5 мл) добавляли SOCl₂ (0,14 мл, 2 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 16 ч, после чего растворитель отгоняли в вакууме. К остатку добавляли еще сухой толуол (5 мл), затем упаривали на роторном испарителе досуха. Получали 0,196 г (100%) 4-трет-бутилбензоил хлорида 3.1. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,07 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,50 (д, J=8,0 Гц, 2Н).SOCl ₂ (0.14 ml, 2 mmol) was added to a suspension of 4-tert-butylbenzoic acid 2.1 (0.178 g, 1 mmol) in dry toluene (5 ml). The reaction mixture was boiled under reflux for 16 h, after which the solvent was distilled off in vacuo. More dry toluene (5 ml) was added to the residue, then evaporated to dryness on a rotary evaporator. 0.196 g (100%) of 4-tert-butylbenzoyl chloride 3.1 was obtained. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 2H).

Пример 2. Синтез 6-бром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.1.Example 2. Synthesis of 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.1.

Раствор 4-трет-бутилбензоил хлорида 3.1 (0,196 г, 1 ммоль) в сухом пиридине (5 мл) добавляли к раствору 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) в сухом пиридине (5 мл) при 10°С при интенсивном перемешивании. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем разбавляли водой (30 мл). Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой (5 мл), сушили и перекристаллизовывали из EtOH (5 мл). Получали 0,180 г (50%) 6-6ром-2-[4-(трет-бутил)фенил]-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.1. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,23 (с, 1Н), 8,13 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,07 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,65 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,60 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 1,36 (с, 9Н).A solution of 4-tert-butylbenzoyl chloride 3.1 (0.196 g, 1 mmol) in dry pyridine (5 ml) was added to a solution of 2-amino-5-bromobenzoic acid 4.1 (0.216 g, 1 mmol) in dry pyridine (5 ml) at 10 ° C with vigorous stirring. The reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, then diluted with water (30 ml). The formed precipitate was filtered off, washed with water (5 ml), dried and recrystallized from EtOH (5 ml). 0.180 g (50%) of 6-6rom-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.1 was obtained. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.23 (s, 1H), 8.13 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H).

Пример 3. Синтез 2-хлорбензоил хлорида 3.2.Example 3. Synthesis of 2-chlorobenzoyl chloride 3.2.

Аналогично примеру 1 из 2-хлорбензойной кислоты 2.2 (0,157 г, 1 ммоль) получали 0,175 г (100%) 2-хлорбензоил хлорида 3.2.Analogously to example 1, from 2-chlorobenzoic acid 2.2 (0.157 g, 1 mmol), 0.175 g (100%) of 2-chlorobenzoyl chloride 3.2 was obtained.

Пример 4. Синтез 6-бром-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.2.Example 4. Synthesis of 6-bromo-2- (2-chlorophenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.2.

Аналогично примеру 2 из 2-хлорбензоил хлорида 3.2 (0,175 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) получали 0,172 г (51%) 6-бром-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.2. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,28 (с, 1Н), 7,99 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,94 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,62 (д, J-8,0 Гц, 1Н), 7,55-7,50 (м, 2Н), 7,44 (т, J=8,0 Гц, 1Н).Analogously to example 2, from 2-chlorobenzoyl chloride 3.2 (0.175 g, 1 mmol) and 2-amino-5-bromobenzoic acid 4.1 (0.216 g, 1 mmol), 0.172 g (51%) 6-bromo-2- (2-chlorophenyl ) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.2. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.28 (s, 1H), 7.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.62 (d, J-8.0 Hz, 1H), 7.55-7.50 (m, 2H), 7.44 (t, J = 8.0 Hz, 1H).

Пример 5. Синтез 4-метоксибензоил хлорида 3.3.Example 5. Synthesis of 4-methoxybenzoyl chloride 3.3.

Аналогично примеру 1 из 4-метоксибензойной кислоты 2.3 (0,152 г, 1 ммоль) получали 0,171 г (100%) 4-метоксибензоил хлорида 3.3.Analogously to example 1, from 4-methoxybenzoic acid 2.3 (0.152 g, 1 mmol), 0.171 g (100%) of 4-methoxybenzoyl chloride 3.3 was obtained.

Пример 6. Синтез 6-бром-2-(4-метоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3.Example 6 Synthesis of 6-bromo-2- (4-methoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.3.

Аналогично примеру 2 из 4-метоксибензоил хлорида 3.3 (0,171 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) получали 0,172 г (51%) 6-бром-2-(4-метоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,23 (с, 1H), 8,18 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,92 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,54 (д, J-8,0 Гц, 1Н), 7,02 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 3,88 (с, 3Н).Analogously to example 2, from 4-methoxybenzoyl chloride 3.3 (0.171 g, 1 mmol) and 2-amino-5-bromobenzoic acid 4.1 (0.216 g, 1 mmol), 0.172 g (51%) 6-bromo-2- (4-methoxyphenyl ) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.3. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.23 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.54 (d, J-8.0 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H).

Пример 7. Синтез 4-пропоксибензоил хлорида 3.4.Example 7. Synthesis of 4-propoxybenzoyl chloride 3.4.

Аналогично примеру 1 из 4-пропоксибензойной кислоты 2.4 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,199 г (100%) 4-пропоксибензоил хлорида 3.4.Analogously to example 1, from 4-propoxybenzoic acid 2.4 (0.180 g, 1 mmol), 0.199 g (100%) of 4-propoxybenzoyl chloride 3.4 was obtained.

Пример 8. Синтез 6-бром-2-(4-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.4.Example 8. Synthesis of 6-bromo-2- (4-propoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.4.

Аналогично примеру 2 из 4-пропоксибензоил хлорида 3.4 (0,199 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-бромбензойной кислоты 4.1 (0,216 г, 1 ммоль) получали 0,177 г (49%) 6-бром-2-(4-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.3. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,22 (с, 1H), 8,18 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,92 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,53 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,00 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 3,99 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,82 (ск, J=7,2 Гц, 2Н), 1,06 (т, J=7,2 Гц, 3Н).Analogously to example 2, from 4-propoxybenzoyl chloride 3.4 (0.199 g, 1 mmol) and 2-amino-5-bromobenzoic acid 4.1 (0.216 g, 1 mmol), 0.177 g (49%) 6-bromo-2- (4-propoxyphenyl ) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.3. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.22 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.99 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82 (ck, J = 7.2 Hz, 2H), 1.06 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Пример 9. Синтез 4-хлорбензоил хлорида 3.5.Example 9. Synthesis of 4-chlorobenzoyl chloride 3.5.

Аналогично примеру 1 из 4-хлорбензойной кислоты 2.5 (0,157 г, 1 ммоль) получали 0,175 г (100%) 4-хлорбензоил хлорида 3.5.Analogously to example 1, from 4-chlorobenzoic acid 2.5 (0.157 g, 1 mmol), 0.175 g (100%) of 4-chlorobenzoyl chloride 3.5 was obtained.

Пример 10. Синтез 2-(4-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.5.Example 10. Synthesis of 2- (4-chlorophenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.5.

Аналогично примеру 2 из 4-хлорбензоил хлорида 3.5 (0,175 г, 1 ммоль) и 2-аминобензойной кислоты 4.2 (0,137 г, 1 ммоль) получали 0,131 г (51%) 2-(4-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.5. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,27 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,16 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,96 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,72 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,63 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,45 (д, J=8,0 Гц, 2Н).Analogously to example 2, from 4-chlorobenzoyl chloride 3.5 (0.175 g, 1 mmol) and 2-aminobenzoic acid 4.2 (0.137 g, 1 mmol), 0.131 g (51%) 2- (4-chlorophenyl) -4H-3,1- benzoxazin-4-one 1.5. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8 , 0 Hz, 2H).

Пример 11. Синтез 3-пропоксибензоил хлорида 3.6.Example 11. Synthesis of 3-propoxybenzoyl chloride 3.6.

Аналогично примеру 1 из 3-пропоксибензойной кислоты 2.6 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,197 г (99%) 3-пропоксибензоил хлорида 3.6.Analogously to example 1, from 3-propoxybenzoic acid 2.6 (0.180 g, 1 mmol), 0.197 g (99%) of 3-propoxybenzoyl chloride 3.6 was obtained.

Пример 12. Синтез 2-(3-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.6.Example 12 Synthesis of 2- (3-propoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.6.

Аналогично примеру 2 из 3-пропоксибензоил хлорида 3.6 (0,197 г, 1 ммоль) и 2-аминобензойной кислоты 4.2 (0,137 г, 1 ммоль) получали 0,124 г (44%) 2-(3-пропоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.6. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,16 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,95 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,79 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,72 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,68 (с, 1Н), 7,63 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,48 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,20 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 4,04 (т, J=7,2 Гц, 2Н), 1,82 (ск, J=7,2 Гц, 2Н), 1,06 (т, J=7,2 Гц, 3Н).Analogously to example 2, from 3-propoxybenzoyl chloride 3.6 (0.197 g, 1 mmol) and 2-aminobenzoic acid 4.2 (0.137 g, 1 mmol), 0.124 g (44%) 2- (3-propoxyphenyl) -4H-3,1- benzoxazin-4-one 1.6. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.95 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.63 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.04 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1, 82 (ck, J = 7.2 Hz, 2H), 1.06 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Пример 13. Синтез 4-пропионилоксибензоил хлорида 3.7.Example 13. Synthesis of 4-propionyloxybenzoyl chloride 3.7.

Аналогично примеру 1 из 4-пропионилоксибензойной кислоты 2.7 (0,194 г, 1 ммоль) получали 0,206 г (97%) 4-пропионилоксибензоил хлорида 3.7.Analogously to example 1, from 4-propionyloxybenzoic acid 2.7 (0.194 g, 1 mmol), 0.206 g (97%) of 4-propionyloxybenzoyl chloride 3.7 was obtained.

Пример 14. Синтез 4-(4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил пропионата 1.7.Example 14 Synthesis of 4- (4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl propionate 1.7.

Аналогично примеру 2 из 4-пропионилоксибензоил хлорида 3.7 (0,206 г, 1 ммоль) и 2-аминобензойной кислоты 4.2 (0,137 г, 1 ммоль) получали 0,097 г (33%) 4-(4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил пропионата 1.7. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,24 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 8,16 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,96 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,72 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,63 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,37 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 2,66 (кв, J=7,2 Гц, 2Н), 1,16 (т, J=7,2 Гц, 3Н).Analogously to example 2, from 4-propionyloxybenzoyl chloride 3.7 (0.206 g, 1 mmol) and 2-aminobenzoic acid 4.2 (0.137 g, 1 mmol), 0.097 g (33%) 4- (4-oxo-4H-3,1-benzoxazine -2-yl) phenyl propionate 1.7. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.24 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.96 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8 , 0 Hz, 2H), 2.66 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Пример 15. Синтез 3-бромбензоил хлорида 3.8.Example 15. Synthesis of 3-bromobenzoyl chloride 3.8.

Аналогично примеру 1 из 3-бромбензойной кислоты 2.8 (0,201 г, 1 ммоль) получали 0,220 г (100%) 3-бромбензоил хлорида 3.8.Analogously to example 1, from 3-bromobenzoic acid 2.8 (0.201 g, 1 mmol), 0.220 g (100%) of 3-bromobenzoyl chloride 3.8 was obtained.

Пример 16. Синтез 2-(3-бромфенил)-6,7-диметокси-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.8.Example 16. Synthesis of 2- (3-bromophenyl) -6,7-dimethoxy-4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.8.

Аналогично примеру 2 из 3-бромбензоил хлорида 3.8 (0,220 г, 1 ммоль) и 2-амино-4,5-диметоксибензойной кислоты 4.3 (0,197 г, 1 ммоль) получали 0,188 г (52%) 2-(3-бромфенил)-6,7-диметокси-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.8. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,31 (с, 1Н), 8,14 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,75 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,52 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,43 (с, 1Н), 7,16 (с, 1Н), 3,98 (с, 3Н), 3,92 (с, 3Н).Analogously to example 2, from 3-bromobenzoyl chloride 3.8 (0.220 g, 1 mmol) and 2-amino-4,5-dimethoxybenzoic acid 4.3 (0.197 g, 1 mmol), 0.188 g (52%) 2- (3-bromophenyl) - 6,7-dimethoxy-4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.8. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.31 (s, 1H), 8.14 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.52 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.92 (s , 3H).

Пример 17. Синтез 4-этоксибензоил хлорида 3.9.Example 17 Synthesis of 4-ethoxybenzoyl chloride 3.9.

Аналогично примеру 1 из 4-этоксибензойной кислоты 2.9 (0,166 г, 1 ммоль) получали 0,185 г (100%) 4-этоксибензоил хлорида 3.9.Analogously to example 1, from 4-ethoxybenzoic acid 2.9 (0.166 g, 1 mmol), 0.185 g (100%) of 4-ethoxybenzoyl chloride 3.9 was obtained.

Пример 18. Синтез 6,7-диметокси-2-(4-этоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.9. Аналогично примеру 2 из 4-этоксибензоил хлорида 3.9 (0,185 г, 1 ммоль) и 2-амино-4,5-диметоксибензойной кислоты 4.3 (0,197 г, 1 ммоль) получали 0,157 г (48%) 6,7-диметокси-2-(4-этоксифенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.9. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,15 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,39 (с, 1H), 7,02 (с, 1H), 6,95 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 4,10 (кв, J=7,2 Гц, 2Н), 3,98 (с, 3Н), 3,92 (с, 3Н), 1,44 (т, J=7,2 Гц, 3Н).Example 18 Synthesis of 6,7-dimethoxy-2- (4-ethoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.9. Analogously to example 2, from 4-ethoxybenzoyl chloride 3.9 (0.185 g, 1 mmol) and 2-amino-4,5-dimethoxybenzoic acid 4.3 (0.197 g, 1 mmol), 0.157 g (48%) 6,7-dimethoxy-2- (4-ethoxyphenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.9. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.39 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.95 (d , J = 8.0 Hz, 2H), 4.10 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 1.44 (t , J = 7.2 Hz, 3H).

Пример 19. Синтез 4-ацетоксибензоил хлорида 3.10.Example 19. Synthesis of 4-acetoxybenzoyl chloride 3.10.

Аналогично примеру 1 из 4-ацетоксибензойной кислоты 2.10 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,195 г (98%) 4-ацетоксибензоил хлорида 3.10.Analogously to example 1, from 4-acetoxybenzoic acid 2.10 (0.180 g, 1 mmol), 0.195 g (98%) of 4-acetoxybenzoyl chloride 3.10 was obtained.

Пример 20. Синтез 4-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.10.Example 20 Synthesis of 4- (6-acetoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl acetate 1.10.

Аналогично примеру 2 из 4-ацетоксибензоил хлорида 3.10 (0,195 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-ацетоксибензойной кислоты 4.4 (0,195 г, 1 ммоль) получали 0,136 г (40%) 4-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.10. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,25 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 7,91 (с, 1Н), 7,76 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,70 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,36 (д, J=8,0 Гц, 2Н), 2.37 (с, 3Н), 2.32 (с, 3Н).Analogously to example 2, from 4-acetoxybenzoyl chloride 3.10 (0.195 g, 1 mmol) and 2-amino-5-acetoxybenzoic acid 4.4 (0.195 g, 1 mmol), 0.136 g (40%) 4- (6-acetoxy-4-oxo -4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl acetate 1.10. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.91 (s, 1H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.32 (s, 3H).

Пример 21. Синтез 3-ацетоксибензоил хлорида 3.11.Example 21. Synthesis of 3-acetoxybenzoyl chloride 3.11.

Аналогично примеру 1 из 3-ацетоксибензойной кислоты 2.11 (0,180 г, 1 ммоль) получали 0,194 г (98%) 3-ацетоксибензоил хлорида 3.11.Analogously to example 1, from 3-acetoxybenzoic acid 2.11 (0.180 g, 1 mmol), 0.194 g (98%) of 3-acetoxybenzoyl chloride 3.11 was obtained.

Пример 22. Синтез 3-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.11.Example 22 Synthesis of 3- (6-acetoxy-4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl acetate 1.11.

Аналогично примеру 2 из 3-ацетоксибензоил хлорида 3.11 (0,194 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-ацетоксибензойной кислоты 4.4 (0,195 г, 1 ммоль) получали 0,119 г (35%) 3-(6-ацетокси-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-2-ил)фенил ацетата 1.11. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,10 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,94 (с, 1Н), 7,91 (с, 1Н), 7,76 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,70 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,62 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,40 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 2.37 (с, 3Н), 2.32 (с, 3Н).Analogously to example 2, from 3-acetoxybenzoyl chloride 3.11 (0.194 g, 1 mmol) and 2-amino-5-acetoxybenzoic acid 4.4 (0.195 g, 1 mmol), 0.119 g (35%) 3- (6-acetoxy-4-oxo -4H-3,1-benzoxazin-2-yl) phenyl acetate 1.11. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.76 (d , J = 8.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.32 (s, 3H).

Пример 23. Синтез 2-метилбензоил хлорида 3.12.Example 23. Synthesis of 2-methylbenzoyl chloride 3.12.

Аналогично примеру 1 из 2-метилбензойной кислоты 2.12 (0,136 г, 1 ммоль) получали 0,153 г (99%) 2-метилбензоил хлорида 3.12.Analogously to example 1, from 2-methylbenzoic acid 2.12 (0.136 g, 1 mmol), 0.153 g (99%) of 2-methylbenzoyl chloride 3.12 was obtained.

Пример 24. Синтез 2-(2-метилфенил)-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-6-ил ацетата 1.12.Example 24 Synthesis of 2- (2-methylphenyl) -4-oxo-4H-3,1-benzoxazin-6-yl acetate 1.12.

Аналогично примеру 2 из 2-метилбензоил хлорида 3.12 (0,153 г, 1 ммоль) и 2-амино-5-ацетоксибензойной кислоты 4.4 (0,195 г, 1 ммоль) получали 0,115 г (39%) 2-(2-метилфенил)-4-оксо-4H-3,1-бензоксазин-6-ил ацетата 1.12. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 7,97 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,87 (с, 1H), 7,68 (д, J=8,0 Гц, 1Н), 7,59 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,41 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 7,34-7,28 (м, 2Н), 2.70 (с, 3Н), 2.30 (с, 3Н).Analogously to example 2, from 2-methylbenzoyl chloride 3.12 (0.153 g, 1 mmol) and 2-amino-5-acetoxybenzoic acid 4.4 (0.195 g, 1 mmol), 0.115 g (39%) 2- (2-methylphenyl) -4- oxo-4H-3,1-benzoxazin-6-yl acetate 1.12. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H ), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34-7.28 (m, 2H), 2.70 (s , 3H), 2.30 (s, 3H).

Пример 25. Синтез 8-метил-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.13.Example 25 Synthesis of 8-methyl-2- (2-chlorophenyl) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.13.

Аналогично примеру 2 из 2-хлорбензоил хлорида 3.2 (0,175 г, 1 ммоль) и 2-амино-3-метилбензойной кислоты 4.5 (0,151 г, 1 ммоль) получали 0,117 г (43%) 8-метил-2-(2-хлорфенил)-4H-3,1-бензоксазин-4-она 1.13. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8,02-7,95 (м, 2Н), 7,78 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,55-7,50 (м, 3Н), 7,44 (т, J=8,0 Гц, 1Н), 2.65 (с, 3Н).Analogously to example 2, from 2-chlorobenzoyl chloride 3.2 (0.175 g, 1 mmol) and 2-amino-3-methylbenzoic acid 4.5 (0.151 g, 1 mmol), 0.117 g (43%) of 8-methyl-2- (2-chlorophenyl) ) -4H-3,1-benzoxazin-4-one 1.13. ¹ H NMR (400 MHz, DMSO) δ: 8.02-7.95 (m, 2H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55-7.50 (m, 3H), 7.44 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.65 (s, 3H).

Пример 26. Исследование подавления развития ВГВ в культуре гепатомы человека HepG2 и цитотоксического эффекта ингибиторов ВГВ общей формулы 1.Example 26. Investigation of the suppression of the development of HBV in the culture of human hepatoma HepG2 and the cytotoxic effect of HBV inhibitors of general formula 1.

В экспериментальной in vitro модели инфекции вируса гепатита В использовалась линия гепатомы человека HepG2, которая для способности к инфицированию ВГВ и поддержанию полного цикла его репликации in vitro стабильно трансфицировала геном NTCP.In an experimental in vitro model of hepatitis B virus infection, the human hepatoma line HepG2 was used, which was stably transfected with the NTCP genome for the ability to infect HBV and maintain the full cycle of its replication in vitro.

В качестве источника инфекционных вирусных частиц для инфицирования клеточной линии HepG2/NTCP была выбрана клеточная линия гепатомы человека HepAD38, несущая стабильно интегрированный геном вируса ВГВ под контролем тетрациклин-регулируемого промотора, и секретирующая вирусные частицы в культуральную среду в отсутствие терациклина.As a source of infectious viral particles for the infection of the HepG2 / NTCP cell line, the human hepatoma cell line HepAD38 was chosen, which carries a stably integrated HBV virus genome under the control of a tetracycline-regulated promoter and secretes viral particles into the culture medium in the absence of teracycline.

Препарат ВГВ получали с использованием линии HepAD38 по следующему протоколу: Клетки HepAD38 пассировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллин/стрептомицин и заменимые аминокислоты. Культуральную среду отбирали раз в 2 дня, осветляли центрифугированием (200 g, 15 мин) и хранили при 4°С не дольше 7 дней. Далее к культуральным средам добавляли сухой ПЭГ 8000 до конечной концентрации 7,5%, и инкубировали при 4°С на ротационной платформе в течение ночи. Вирусный преципитат отделяли центрифугированием (2000 g, 30 мин) и осадок суспендировали в 1/100 первоначального объема в среде OPTI-MEM. Полученный таким образом вирусный препарат аликвотировали и хранили при -80°СHBV was prepared using the HepAD38 line according to the following protocol: HepAD38 cells were passaged in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin / streptomycin, and nonessential amino acids. The culture medium was taken every 2 days, clarified by centrifugation (200 g, 15 min), and stored at 4 ° C for no longer than 7 days. Then, dry PEG 8000 was added to the culture media to a final concentration of 7.5% and incubated at 4 ° C on a rotary platform overnight. The viral precipitate was separated by centrifugation (2000 g, 30 min) and the pellet was suspended in 1/100 of the original volume in OPTI-MEM medium. The thus obtained viral preparation was aliquoted and stored at -80 ° C.

Инфицирование проводили следующим образом: Клеточную суспензию HepG2-NTCP распределяли по 96-луночным планшетам по 2000 клеток на каждую лунку. После прикрепления клеток (в тот же или на следующий день) исходный раствор удаляли аспирацией и к каждой лунке добавляли по 50 мкл раствора тестируемых соединений, растворенных в среде OPTI-MEM (с финальной концентрацией ДМСО 2%), или OPTI-MEM с 2% ДМСО (в лунки положительного и отрицательного контролей инфекции) и по 50 мкл мкл препарата ВГВ, разведенного в среде OPTI-MEM с 2% ДМСО (кроме отрицательного контроля инфекции). После инкубации в течение 24 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа СО₂, среду с ВГВ удаляли аспирацией и к культурам добавляли 200 мкл культуральной среды ДМЕМ, содержащей соответствующие тестируемые соединения в интересующей концентрации. Клетки инкубировали дополнительно в течение 6 дней при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа СО₂. Далее, клеточные супернатанты (50 мкл) исследовали на содержание вирусного антигена ИФА анализом при помощи коммерческого набора HBeAg ELISA 4.0 (Creative Diagnostics, каталожный номер DEIA003) по протоколу производителя набора и измеряли оптическую плотность каждой анализируемой лунки при длине волны 450 нм, используя планшетный денситометр.Infection was carried out as follows: The HepG2-NTCP cell suspension was dispensed into 96-well plates with 2000 cells per well. After cell attachment (on the same or the next day), the stock solution was removed by aspiration and 50 μl of a solution of test compounds dissolved in OPTI-MEM medium (with a final concentration of DMSO 2%) or OPTI-MEM with 2% was added to each well. DMSO (in the wells of positive and negative infection controls) and 50 µl µl of HBV preparation diluted in OPTI-MEM medium with 2% DMSO (except for negative infection control). After incubation for 24 hours in a humidified atmosphere containing 5% carbon dioxide CO ₂ , the HBV medium was removed by aspiration and 200 µl of DMEM culture medium containing the respective test compounds at the concentration of interest was added to the cultures. The cells were incubated for an additional 6 days at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO ₂ carbon dioxide. Next, cell supernatants (50 μl) were examined for viral antigen by ELISA analysis using a commercial HBeAg ELISA 4.0 kit (Creative Diagnostics, catalog number DEIA003) according to the kit manufacturer's protocol, and the optical density of each assay well was measured at 450 nm using a plate densitometer ...

Claims

1. Application of the 4H-3,1-benzoxazin-4-one derivative of general formula 1

where R ₁ , R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₈ , R _{9 are} optionally the same and represent hydrogen, C ₁ -C ₆ alkyl, halogen, C ₁ -C ₆ alkoxy, oxycarbonyl of the formula -OC (O) R, where R is C ₁ -C ₆ alkyl, as an inhibitor of the hepatitis B virus for the preparation of a medicament for the treatment of hepatitis B.

2. Use according to claim 1, wherein the derivative is 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one of formula 1.1

3. The use of a 4H-3,1-benzoxazin-4-one derivative of general formula 1, as defined in claim 1, which has the properties of an HBV inhibitor as an active component of a pharmaceutical composition for the treatment of hepatitis B.

4. Use according to claim 3, wherein the derivative is 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one of formula 1.1 as defined in claim 2 , as an active ingredient.

5. A pharmaceutical composition having the properties of an HBV inhibitor for use in the treatment of hepatitis B infection, containing in a therapeutically effective amount 4H-3,1-benzoxazin-4-one derivatives of general formula 1, as defined in claim 1, and pharmaceutically acceptable additives ...

6. A pharmaceutical composition according to claim 5, comprising 6-bromo-2- [4- (tert-butyl) phenyl] -4H-3,1-benzoxazin-4-one of formula 1.1 as defined in claim 2.

7. The pharmaceutical composition according to PP. 5, 6, in which the pharmaceutically acceptable additives are selected from diluents, auxiliary agents and carriers used in the pharmaceutical field.