RU2723164C1 - Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении - Google Patents
Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении Download PDFInfo
- Publication number
- RU2723164C1 RU2723164C1 RU2019131652A RU2019131652A RU2723164C1 RU 2723164 C1 RU2723164 C1 RU 2723164C1 RU 2019131652 A RU2019131652 A RU 2019131652A RU 2019131652 A RU2019131652 A RU 2019131652A RU 2723164 C1 RU2723164 C1 RU 2723164C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- dose
- leukocytapheresis
- product
- progenitor cells
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 title description 8
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 claims abstract description 15
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000013925 CD34 antigen Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108050003733 CD34 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims abstract description 3
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 abstract description 5
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920002189 poly(glycerol 1-O-monomethacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002629 repopulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для расчета трансплантационной дозы CD34-позитивных клеток-предшественниц в донорском лекоцитаферезном продукте. Способ расчета включает мечение клеточного материала флуорохром-конъюгированными моноклональными антителами к маркерам CD34 и CD45 с одновременным окрашиванием флуоресцентным ДНК-тропным красителем 7-аминоактиномицином D. Далее определяют содержания CD34-позитивных предшественниц гемопоэза методами гемоцитометрии и лазерной проточной цитофлуориметрии. При расчете трансплантационной дозы учитывают коэффициенты изменения целостности мембран гемопоэтических стволовых клеток - 0,985, 0,971, 0,958, 0,947 и 0,930, соответственно, для 1, 2, 3, 4 и 5-ых суток хранения клеточного материала до трансплантации реципиенту при температуре плюс 2 ÷ плюс 6°C. Расчет осуществляется по формулам 1 и 2:
где CD34+ относ. - относительное содержание CD34+ клеток-предшественниц гемопоэза в лекоцитаферезном продукте; CD34 абс. - количество клеток-предшественниц, которое определяется как число событий с высокой экспрессией антигена CD34, низкой экспрессией антигена CD45 и низкой гранулярностью, подсчитанное в полигональном регионе «HSC 1»; kn - коэффициент изменения целостности мембран CD34+ клеток на n-ый день хранения; CD45 абс. - количество лейкоцитов в образце, которое определяется как число событий позитивных по антигену CD45, подсчитанное в прямоугольном регионе «CD45+»; доза CD34+ - трансплантационная доза CD34+ клеток-предшественниц гемопоэза в лекоцитаферезном продукте; С (лейк.) - концентрация лейкоцитов в образце, кл/мкл; V - объем лекоцитаферезного продукта, мкл; m - масса тела реципиента CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, кг. Использование данного способа позволяет при расчете дозы CD34+ клеток учитывается изменение целостности их мембран при хранении в условиях охлаждения до трансплантации. 7 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной иммунологии, и может быть использовано для расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза в донорском лейкоцитаферезном продукте (ЛП), предназначенном для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) взрослым и детям. При расчете дозы CD34+ клеток учитывается изменение целостности их мембран при хранении в условиях охлаждения до трансплантации.
Одним из эффективных методов лечения онкогематологических заболеваний является трансплантация клеток-предшественниц гемопоэза, которые обеспечивают восстановление всех ростков кроветворения [1]. Трансплантационная доза клеток-предшественниц считается ключевым фактором успеха трансплантации, она представляет собой расчетное значение этих клеток в трансплантационном материале.
Проблема планирования и прогнозирования сохранения необходимой дозы клеток-предшественниц до пересадки стоит достаточно остро. При подготовке донорского ЛП в ряде случаев проходит несколько суток от момента его получения до трансплантации. Интервал времени, затраченный на этап получения клеток-предшественниц методом лейкоцитафереза, весьма варьирует. Центр получения клеточного продукта и трансплантационный центр могут быть территориально разобщены между собой, что требует затрат времени на логистику. Зачастую трансплантационный материал подвергается длительной высокотехнологичной обработке с очисткой от нежелательных клеточных фракций и, наоборот, с обогащением целевыми функционально-активными клетками. В обязательном порядке должны быть учтены временные затраты на так называемый входной количественный контроль материала.
Известно несколько способов характеристики трансплантационного материала на предмет наличия в нем клеток-предшественниц, обладающих репопулирующими свойствами. Такую информацию в первую очередь дает определение способности клеток-предшественниц гемопоэза к образованию колоний в специально созданных лабораторных условиях [2]. Однако в результате культурального исследования получение заключения возможно не ранее чем через 10 суток, поэтому этот метод не может в полной мере соответствовать требованиям трансплантационных центров по оценке количественных характеристик клеточного материала.
Благодаря открытию иммунофенотипических характеристик клеток-предшественниц гемопоэза, а именно, высокой экспрессии на мембране маркера CD34, стала возможна их иммунологическая идентификация [3, 4]. Уточнение свойств клеток-предшественниц, широкое использование гибридомных технологий для производства моноклональных антител к клеточным маркерам, внедрение метода лазерной проточной цитофлуориметрии привело к разработке и совершенствованию методов учета CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза. Следует указать, что эти методы используют лазерную проточную цитофлуориметрию, как подход, позволяющий проанализировать тысячи клеток за несколько минут и получить достоверный результат [5].
Известен способ количественного определения CD34+ клеток в кроветворной ткани с использованием тройного мечения клеток за счет связывания с моноклональными антитела к маркерам CD34 и CD45 и окрашивания флуоресцентным ДНК-тропным красителем 7-аминоактиномицином D (7-AAD) [6, 7]. Способ позволяет рассчитать процентное количество клеток-предшественниц как долю от всех клеток, помеченных по CD45 и негативных по 7-AAD. Поскольку 7-AAD проникает только через разрушенные мембраны, то способ позволяет исключить из анализа все нежизнеспособные лейкоциты. С помощью этого метода также возможно рассчитать абсолютное количество CD34-позитивных клеток-предшественниц и число CD45-позитивных клеток, относящихся к лейкоцитарному ростку. Способ предполагает использование только проточного цитофлуориметра (одноплатформенный метод), что достигается использованием искусственных флуоресцирующих частиц с известной концентрацией. Очевидным недостатком способа является возможная неточность расчета трансплантационной дозы, связанная с иммунофенотипической негативностью некоторых клеток-предшественниц гемопоэза по маркеру CD45. Внедрение этого метода невозможно без наличия высококвалифицированного персонала, прошедшего валидационное тестирование. Кроме того, расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза на основании оценки образца лейкоцитаферезного продукта сразу после его получения не учитывает возможное снижение жизнеспособности клеток при хранении. При использовании данного способа невозможно прогнозирование эффективной дозы жизнеспособных клеток-предшественниц гемопоэза [4, 8].
Известен способ количественного определения CD34+ клеток в кроветворной ткани с использованием двухплатформенного подхода, предполагающего применение проточного цитофлуориметра, в сочетании с гематологическим анализатором или микроскопом. Способ основан на одновременной окраске кроветворной ткани моноклональными антителами к маркеру CD34 и флуоресцирующим низкомолекулярным ДНК-тропным красителем Sytol6, который определяется на всех ядросодержащих клетках крови, окрашивая живые клетки с наибольшей интенсивностью, а некротические и позднеапоптотические - с наименьшей [9]. Способ позволяет с высокой точностью рассчитать процентное количество клеток-предшественниц как долю от всех Syto16-позитивных клеток [4]. Однако разграничение жизнеспособных клеток по степени флуоресценции Syto16 является весьма субъективным. Применение данного способа не дает убедительной информации о числе разрушенных клеток даже в день получения клеточного материала.
Все вышеперечисленные способы направлены на идентификацию и количественное определение клеток-предшественниц в продукте лейкоцитафереза сразу после его получения. Указанные подходы не позволяют прогнозировать трансплантационную дозу клеток-предшественниц с учетом изменения жизнеспособности клеток при хранении более 24 часов в условиях охлаждения. Прототип заявляемого способа отсутствует.
Задача заявляемого изобретения состоит в создании нового, более точного способа расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц, учитывающего изменение целостности мембран CD34-позитивных клеток ЛП, при хранении клеточного материала от 1 до 5 суток с момента получения до трансплантации в условиях охлаждения (плюс 2 ÷ плюс 6°C).
Поставленная задача решается тем, что для расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц используют моноклональные антитела к антигенам CD34, CD45 и флуоресцентный ДНК-тропный краситель 7-AAD, который применяют для оценки целостности клеточных мембран в качестве самостоятельного предиктора нежизнеспособности клеток. Подсчет CD34+ клеток осуществляют в пределах CD45+7-AAD- клеток двухплатформенным методом с использованием проточного цитофлуориметра и гематологического анализатора. Количество CD34+ клеток в зависимости от времени хранения корректируется с помощью коэффициента kn. Данный коэффициент вывели экспериментально на основании изменения целостности мембран CD34+ клеток, которую определяли по проникновению витального флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD через поврежденные мембраны клеток. Для этого 50 продуктов лейкоцитафереза периферической крови доноров хранили в условиях, позволяющих сдерживать бактериальную контаминацию - при охлаждении до плюс 2 ÷ плюс 6°C в течение 5 дней. Окрашивание кроветворной ткани проводили с использованием тройного мечения клеток за счет связывания с моноклональными антитела к маркерам CD34 и CD45 и красителем 7-AAD. Снижение жизнеспособности клеток фиксировали методом проточной цитофлуориметрии через каждые 24 часа в течение 5 дней. На протяжении всего эксперимента не изменяли клоны антител к CD45 и CD34 и поддерживали идентичные условия для проведения иммунологических реакций и окрашивания клеток.
Зависимость изменения целостности мембран CD34+ клеток от времени хранения и коэффициенты изменения целостности мембран этих клеток представлены в таблице 1. Коэффициенты изменения целостности мембран CD34+ клеток, необходимые для определения процента жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток на n-й день хранения, вычисляли по формуле:
где kn - коэффициент изменения целостности мембран клеток;
an - увеличение проницаемости мембран клеток для красителя 7-AAD, %.
Значимое снижение жизнеспособности CD34+ клеток наблюдалось через 1 сутки хранения в среднем на 1,53% (р < 0,05). Выявили, что при продолжении хранения проницаемость мембран клеток ЛП для флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD увеличивалась.
Изобретение иллюстрировано фигурами 1-7.
Способ осуществляется следующим образом:
Этап 1. Иммунологическое мечение клеток с одновременной окраской флуоресцентным ДНК-тропным красителем. Для этого определяют концентрацию лейкоцитов образца, используя гематологический анализатор, и готовят клеточную суспензию с концентрацией клеток 5×103 кл / мкл методом разведения. В цитометрическую пробирку вносят 50 мкл клеточного образца, затем добавляют по 5 мкл моноклональных антител к маркерам CD45 и CD34, которые были конъюгированы с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) соответственно, и 5 мкл флуоресцентного ДНК-тропного красителя 7-AAD. Пробирку встряхивают на медицинском вихревом смесителе и осуществляют инкубацию при температуре плюс 20 ÷ плюс 25°C в темноте для предотвращения разрушения FITC и РЕ под воздействием света. В пробирку добавляют 1 мл лизирующего раствора на основе хлорида аммония, не содержащего фиксирующих компонентов, встряхивают, проводят лизирование в течение 5 минут в темноте при температуре плюс 20 ÷ плюс 25°C.
Этап 2. Оценка результатов иммунологической реакции и ДНК-окрашивания на лазерном проточном цитофлуориметре. Анализ реакции осуществляют непосредственно после ее окончания не позднее 1 часа с момента постановки. Пробирки помещают в пробозаборник лазерного проточного цитофлуориметра. Каждая частица образца, пересекающая луч лазера, анализируется прибором, как отдельное событие. Учитывают прямое светорассеяние (FSC), боковое светорассеяние (SSC) и флуоресценцию с длинами волн для FITC, РЕ и 7-AAD. Используют протокол по гейтированию и логическим ограничениям, рекомендованный Международным обществом по гематотерапии и тканевой инженерии (ISHAGE - International Society for Hematotherapy and Graft Engineering) [4] (фиг. 1-7). Определяют абсолютное число CD45+ и CD34+ клеток, процент CD34-позитивных клеток-предшественниц.
На фигуре 1 представлен прямоугольный регион «CD45+», который ограничивает CD45-позитивные клетки среди всех событий, пересекающих луч лазера, исключая ядросодержащие эритроидные элементы, нелизированные эритроциты, разрушенные клетки. Среди CD45-позитивных клеток выделен полигональный регион лимфоцитов - «Lympho», который включает клетки с высокой экспрессией антигена CD45 и низкими значениями гранулярности.
На фигуре 2 представлен полигональный регион «CD34+», характеризующийся высокой экспрессией маркера CD34. Этот график ограничивается событиями, попадающими в регион CD45-позитивных 7-AAD-негативных клеток.
На фигуре 3 представлен полигональный регион «CD45dim», исключающий события с высокой и средней экспрессией маркера CD45, ограниченный событиями, экспрессирующими антиген CD34 на высоком уровне.
На фигуре 4 представлен полигональный регион «HSC 1», состоящий из клеток с высокой экспрессией CD34, низкой экспрессией CD45 и по иммунофенотипу соответствующий клеткам-предшественницам гемопоэза. Этот график ограничивается событиями, попадающими в регион «CD45dim».
На фигуре 5 представлен полигональный регион «HSC 2», который включает только события из региона «Lympho». В процессе измерения образца проводят визуальный контроль и корректировку регионов «Lympho» и «HSC 2», не допуская попадания в регионы клеток со средней гранулярностью. При помощи средств программного обеспечения прибора производят копирование формы региона «HSC 2» на график фигуры 4 в виде региона «HSC 1», что контролирует попадание в данный регион только низкогранулярных недифференцированных клеток.
На фигуре 6 представлен полигональный регион «Debris», который отражает события, относящиеся к разрушенным клеткам и клеточным обломкам.
На фигуре 7 представлен прямоугольный регион «7-AAD+», в который попадают все нежизнеспособные клетки образца, информацию о данных событиях учитывают при формировании количества CD34-позитивных предшественников гемопоэза.
Анализируют по 100 тысяч событий в каждой пробе, что обеспечивает высокую достоверность получаемых результатов. Настройки прибора сохраняют на протяжении всего эксперимента.
Этап 3. Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза. Для этого подсчитывают относительное содержание CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза (CD34+ относ.) по формуле 2, которые выделены при последовательном гейтировании из региона CD45-позитивных клеток.
где CD34 абс. - количество клеток-предшественниц, которое определяется, как число событий с высокой экспрессией антигена CD34, низкой экспрессией антигена CD45 и низкой гранулярностью, подсчитанное в полигональном регионе «HSC 1»;
kn - коэффициент изменения целостности мембран CD34+ клеток на n-ый день хранения (Таблица 1);
CD45 абс. - количество лейкоцитов в образце, которое определяется, как число событий позитивных по антигену CD45, подсчитанное в прямоугольном регионе «CD45+».
Вычисляют трансплантационную дозу CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза {Доза CD34+) по формуле 3.
где CD34+ относ. - относительное содержание CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, %;
С (лейк.) - концентрация лейкоцитов в образце, кл / мкл;
V - объем ЛП, мкл;
m - масса тела больного - реципиента CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, кг.
Представленные ниже клинические примеры подтверждают возможность использования заявляемого способа при количественном определении гемопоэтических стволовых клеток в ЛП и расчете трансплантационной дозы клеток-предшественниц.
Пример 1
ЛП, полученный от донора М. за одну процедуру афереза, имеет следующие характеристики: CD34 абс. = 337 событий, CD45 абс. = 68133 событий, С (лейк.) = 201000 кл / мкл, V=200000 мкл, m=35 кг, время хранения 4 суток при температуре плюс 2 ÷ плюс 6°C, k4=0,947.
Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце без учета поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:
Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце по заявляемому способу с учетом поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:
Пример 2
ЛП, полученный от донора П. за одну процедуру афереза, имеет следующие характеристики: CD34 абс. = 580 события, CD45 абс. = 99069 событий, С {лейк.)=194000 клеток/мкл, V=390000 мкл, m=90 кг, время хранения 3 суток при температуре плюс 2 плюс 6°C, k3=0,958.
Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце без учета поправочных коэффициентов (коэффициент сокращается, так как равен единице) по формулам 2, 3:
Расчет трансплантационной дозы клеток-предшественниц в образце по заявляемому способу с учетом поправочных коэффициентов по формулам 2, 3:
При расчете по заявляемому способу содержание CD34+ клеток в образце характеризуется более точно с учетом изменения целостности мембран целевых клеток. Приведенные примеры подтверждают актуальность использования заявляемого способа для расчета трансплантационный дозы клеток-предшественниц в ЛП при хранении клеточного материала более 24 часов.
Неочевидность предложенного решения вытекает из недостаточности современных представлений об изменении целостности клеточных мембран разных популяций ядросодержащих клеток крови при длительном хранении в условиях охлаждения.
Список литературы
1. Трансфузиология: Клиническое руководство / под ред. М.Ф. Заривчацкого. - Пермь: ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России, 2014. - 900 с.
2. Цырлова А.И. Функциональная гетерогенность стволовых кроветворных клеток: выявление методами колониеобразования in vitro. Автореф. дисс. … канд. биол. наук. Новосибирск, 2000. - 19 с.
3. Civin С.I., Strauss L.S. J. Immunol. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell sutface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1 a cell. 1984, 133:157-164.
4. Пат. 2513511 РФ, G01N 33/533, C12N 5/0789. Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани / Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. (Россия). - №2012154857/15; Заявлено 19.12.2012; Опубл. 20.04.2014; Бюл. №11.
5. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, et. al. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematotherapy. 1996, 5:213-226.
6. Dauber K., et al. Enumeration of viable CD34+ cells by flow cytometry in blood, bone marrow and cord blood: results of a study of the novel BD™ stem cell enumeration kit. Cytotherapy. 2011, 13:449-458.
7. Keeney M, Chin-Yee I, Weir J, et. al. Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. Cytometry. 1998, 34:61-70.
8. Gratama J.W., Kraan J., Keeney M, and al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34+ hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy. 2003, 5 (1) 55-65;
9. Методическое пособие к лабораторным занятиям по специальному курсу «Патология клетки» для студентов биологического факультета / авт.-сост.: С.В. Глушен, Т.В. Романовская, В.В. Гринев. - Минск, 2009. - 43 с.
Claims (11)
- Способ расчета трансплантационной дозы клеток-предшественниц гемопоэза в донорском лекоцитаферезном продукте, включающий мечение клеточного материала флуорохром-конъюгированными моноклональными антителами к маркерам CD34 и CD45 с одновременным окрашиванием флуоресцентным ДНК-тропным красителем 7-аминоактиномицином D и определение содержания CD34-позитивных предшественниц гемопоэза методами гемоцитометрии и лазерной проточной цитофлуориметрии, отличающийся тем, что при расчете трансплантационной дозы учитывают коэффициенты изменения целостности мембран гемопоэтических стволовых клеток - 0,985, 0,971, 0,958, 0,947 и 0,930, соответственно, для 1, 2, 3, 4 и 5-ых суток хранения клеточного материала до трансплантации реципиенту при температуре плюс 2 ÷ плюс 6°C, осуществляется по формулам 1 и 2:
-
-
- где CD34+ относ. - относительное содержание CD34+ клеток-предшественниц гемопоэза в лекоцитаферезном продукте;
- CD34 абс. - количество клеток-предшественниц, которое определяется как число событий с высокой экспрессией антигена CD34, низкой экспрессией антигена CD45 и низкой гранулярностью, подсчитанное в полигональном регионе «HSC 1»;
- kn - коэффициент изменения целостности мембран CD34+ клеток на n-ый день хранения;
- CD45 абс. - количество лейкоцитов в образце, которое определяется как число событий позитивных по антигену CD45, подсчитанное в прямоугольном регионе «CD45+»;
- Доза CD34+ - трансплантационная доза CD34+ клеток-предшественниц гемопоэза в лекоцитаферезном продукте;
- С (лейк.) - концентрация лейкоцитов в образце, кл / мкл;
- V - объем лекоцитаферезного продукта, мкл;
- m - масса тела реципиента CD34-позитивных клеток-предшественниц гемопоэза, кг.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019131652A RU2723164C1 (ru) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019131652A RU2723164C1 (ru) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2723164C1 true RU2723164C1 (ru) | 2020-06-09 |
Family
ID=71067805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019131652A RU2723164C1 (ru) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2723164C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2513511C1 (ru) * | 2012-12-19 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) | Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани |
| RU2657758C2 (ru) * | 2011-12-22 | 2018-06-15 | Иеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. | Комбинированная терапия для стабильного и долговременного приживления трансплантата |
-
2019
- 2019-10-07 RU RU2019131652A patent/RU2723164C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2657758C2 (ru) * | 2011-12-22 | 2018-06-15 | Иеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. | Комбинированная терапия для стабильного и долговременного приживления трансплантата |
| RU2513511C1 (ru) * | 2012-12-19 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) | Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ИСАЕВА Н.В. и др. Особенности получения и хранения гемопоэтических стволовых клеток для аутотрансплантации при онкогематологических заболеваниях // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины, 2015, стр.278-280. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pasut et al. | Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry | |
| Jones et al. | Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis | |
| Tirino et al. | Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives | |
| Goodell | Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP) | |
| Gao et al. | Functional effects of TGF-β1 on mesenchymal stem cell mobilization in cockroach allergen–induced asthma | |
| Muir et al. | Autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells modulate molecular markers of inflammation in dogs with cruciate ligament rupture | |
| Markey et al. | Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells | |
| Halim et al. | Isolation and characterization of mouse innate lymphoid cells | |
| Njoroge et al. | Characterization of viable autofluorescent macrophages among cultured peripheral blood mononuclear cells | |
| Kobayashi et al. | Canine hair‐follicle keratinocytes enriched with bulge cells have the highly proliferative characteristic of stem cells | |
| Thieme et al. | The TreaT-assay: a novel urine-derived donor kidney cell-based assay for prediction of kidney transplantation outcome | |
| Shaharuddin et al. | Characterisation of human limbal side population cells isolated using an optimised protocol from an immortalised epithelial cell line and primary limbal cultures | |
| Medvinsky et al. | Analysis and manipulation of hematopoietic progenitor and stem cells from murine embryonic tissues | |
| RU2723164C1 (ru) | Способ расчета дозы клеток-предшественниц гемопоэза в лейкоцитаферезном продукте путем учета изменения целостности клеточных мембран при хранении | |
| Blancas et al. | Identifying behavioral phenotypes and heterogeneity in heart valve surface endothelium | |
| Hsu et al. | Assessment of the immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSCs) | |
| Miyata et al. | Allogeneic T cells cause acute renal injury after hematopoietic cell transplantation | |
| Rimac et al. | Role of flow cytometry in evaluation of the cellular therapy products used in haematopoietic stem cell transplantation | |
| Fang et al. | Isolation of murine embryonic hemogenic endothelial cells | |
| Szardien et al. | Bone marrow-derived cells contribute to cell turnover in aging murine hearts | |
| Tremblay et al. | In vitro colony assays for characterizing tri-potent progenitor cells isolated from the adult murine pancreas | |
| Shams et al. | The satellite cell Colony forming cell assay as a tool to measure self-renewal and differentiation potential | |
| Preti et al. | Multi-site evaluation of the BD Stem Cell Enumeration Kit for CD34+ cell enumeration on the BD FACSCanto II and BD FACSCalibur flow cytometers | |
| JPWO2004005496A1 (ja) | 臍帯血、骨髄、末梢血等に含まれる新規な未分化幹細胞集団 | |
| Del Rio et al. | Impaired repair properties of endothelial colony‐forming cells in patients with granulomatosis with polyangiitis |