RU2723160C1 - Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния - Google Patents
Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния Download PDFInfo
- Publication number
- RU2723160C1 RU2723160C1 RU2019125711A RU2019125711A RU2723160C1 RU 2723160 C1 RU2723160 C1 RU 2723160C1 RU 2019125711 A RU2019125711 A RU 2019125711A RU 2019125711 A RU2019125711 A RU 2019125711A RU 2723160 C1 RU2723160 C1 RU 2723160C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- sers
- nanoparticles
- sample
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 title abstract description 30
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 48
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 27
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 15
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 14
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 11
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 claims description 3
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005368 silicate glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 15
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 106
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 105
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 description 24
- 102100035176 Coiled-coil alpha-helical rod protein 1 Human genes 0.000 description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 18
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 16
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 16
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 12
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine hydrochloride Chemical compound Cl.ON WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- YAHRDLICUYEDAU-UHFFFAOYSA-N methylhexaneamine Chemical compound CCC(C)CC(C)N YAHRDLICUYEDAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- -1 benzyltriazolyl Chemical group 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910001923 silver oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- NDVLTYZPCACLMA-UHFFFAOYSA-N silver oxide Chemical compound [O-2].[Ag+].[Ag+] NDVLTYZPCACLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DZCRSVQAXDNLEY-UHFFFAOYSA-N 1-ethylsulfanyltetrazole Chemical compound CCSN1C=NN=N1 DZCRSVQAXDNLEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035353 Cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910013684 LiClO 4 Inorganic materials 0.000 description 1
- QENDFXAAWUTRRV-UHFFFAOYSA-N N-(3-azidopropyl)-6-[(2E)-3,3-dimethyl-2-[(2E,4E)-5-(1,3,3-trimethylindol-1-ium-2-yl)penta-2,4-dienylidene]indol-1-yl]hexanamide chloride Chemical compound [Cl-].CN1\C(=C\C=C\C=C\C2=[N+](CCCCCC(=O)NCCCN=[N+]=[N-])C3=C(C=CC=C3)C2(C)C)C(C)(C)C2=CC=CC=C12 QENDFXAAWUTRRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- PLKATZNSTYDYJW-UHFFFAOYSA-N azane silver Chemical compound N.[Ag] PLKATZNSTYDYJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000003989 dielectric material Substances 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- WVJKHCGMRZGIJH-UHFFFAOYSA-N methanetriamine Chemical compound NC(N)N WVJKHCGMRZGIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910021421 monocrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- OTCVAHKKMMUFAY-UHFFFAOYSA-N oxosilver Chemical class [Ag]=O OTCVAHKKMMUFAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);zirconium(4+) Chemical compound [O-2].[O-2].[Zr+4] RVTZCBVAJQQJTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 1
- 229910000108 silver(I,III) oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- VFWRGKJLLYDFBY-UHFFFAOYSA-N silver;hydrate Chemical compound O.[Ag].[Ag] VFWRGKJLLYDFBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Способ определения ДНК в биологических жидкостях, который заключается в подготовке наночастиц благородных металлов, выступающих в роли ГКР-усилителя; гибридизации мишени с направленно выбранным ковалентно ГКР-меченным комплементарным олигонуклеотидом; нанесении пробы с исследуемым соединением на поверхность наночастиц жидкой пробы с исследуемым соединением с образованием направленно упорядоченной за счет нековалентных взаимодействий структуры, включающей определяемую ДНК, ГКР-метку и олигонуклеотид; детектировании полученного гибридизированного ГКР-меченного дуплекса методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния. О качественном и количественном содержании ДНК судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах. Способ применим для определения малых количеств ДНК на фоне большого количества посторонних компонентов анализируемых биологических жидкостей. Технический результат - повышение чувствительности, селективности и экспрессности. 13 з.п. ф-лы, 22 ил., 2 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области аналитических и биоорганических исследований, может быть использовано в гематологии и онкологической диагностике, в биохимических исследованиях для молекулярного узнавания, качественного и количественного обнаружения определенных последовательностей нуклеиновых кислот, например, для обнаружения ДНК с заданной последовательностью промотора гена каталитической субъединицы теломеразы человека с высокими чувствительностью, селективностью и экспрессностью.
Уровень техники
Из уровня техники известны решения, позволяющие осуществлять молекулярную диагностику онкологических заболеваний. Мутации в структуре дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) являются причиной широкого спектра генетических заболевания, в том числе раковых. Обнаружение и определение поврежденных участков ДНК позволяет проводить прогнозирование и достоверную диагностику широкого класса заболеваний на ранних стадиях. На сегодняшний день для ранней диагностики заболеваний и своевременного лечения требуется определение ДНК с поврежденными фрагментами с высокой чувствительностью и точностью, поскольку даже небольшое изменение качественного и количественного состава биологических жидкостей могут быть вызваны началом широкого набора серьезных заболеваний. Однако современные методы не в полной мере удовлетворяют требованиям к чувствительности, экспрессности, доступности используемого оборудования и стоимости анализа, что приводит к необходимости пересмотра существующих и разработке новых, более чувствительных, селективных и менее ресурсозатратных экспресс-способов определения ДНК в таких биологических жидкостях, как кровь, моча, спинномозговая жидкость, слюна и др.
В настоящее время используемые методы основаны на идентификации последовательностей ДНК путем гибридизации комплементарных последовательностей с флуоресцентным методом обнаружения. В большинстве методов определения малых количеств нуклеиновых кислот, как правило, используется предварительная амплификация фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Одновременно по мере накопления в реакционной среде ПЦР амплифицированных фрагментов ДНК проводят их обнаружение. Известные из уровня техники решения, связанные с ПЦР-методами и описанные в работе [Fondevila М., Bcrsting С, Phillips С, de la Puente М., Consortium E.-N., Carracedo A., Morling L., Lareu M.V. Forensic SNP genotyping with SNaPshot: Technical considerations for the development and optimization of multiplexed SNP assays. Forensic Sci Rev. 2017. V. 29. P. 57-76] обладают высокой чувствительностью и возможностью одновременного определения 4-5 ДНК-мишеней.
Однако чувствительность ПЦР-методов зависит от эффективности амплификации ПЦР ДНК-фрагмента образца, которая, в свою очередь, снижается при наличии повреждений ДНК или ее фрагментации. Присутствие повреждений ДНК прежде всего обусловлено природой образцов. Более того, при мультиплексном определении нескольких молекул-мишеней на фоне большого количества ДНК, с последовательностью, отличающейся только на один нуклеотид, ошибки ПЦР начинают вносить существенный вклад в точность определения последовательности и резко падает чувствительность. Таким образом, возрастает предел обнаружения мутаций и возможность получения ложно-положительных результатов. Именно эти проблемы являются основными ограничениями при определении опухолевой ДНК в биологических жидкостях. Сильное фрагментирование ДНК, характерное для свободной ДНК во внеклеточных жидкостях, также зависит от природы и процедуры пробоотбора и служит препятствием достоверной и эффективной идентификации в диагностических системах на основе амплификации ДНК-мишени. При переходе к анализу фрагментов длиной менее 50 нуклеотидов, их выделение и последующая специфическая гибридизация праймеров для амплификации становятся практически невозможными. Кроме того, существует проблема блокирующих повреждений нуклеиновых кислот, наличие которых нарушает гибридизацию пробы и останавливает удлинение праймера в ПЦР, что препятствует обнаружению малых количеств ДНК. Это приводит к существенным ограничениям использования ДНК, выделенной из долго хранящихся биоматериалов. Образование неканонических структур ДНК-матрицей, например G(гуанин)-квадруплексов, также препятствует эффективной идентификации последовательности ДНК ПЦР-методами.
На данный момент широкий круг задач биомедицинской диагностики решается путем применения спектроскопии гигантского, или поверхностно усиленного, комбинационного рассеяния (ГКР, англ. SERS - surface enhanced Raman spectroscopy). Значительное усиление сигнала комбинационного рассеяния (КР) достигается за счет использования наночастиц благородных металлов в качестве основы сенсорной системы. Известно, что наночастицы благородных металлов и нанокомпозиционные материалы на их основе способны усиливать сигнал комбинационного рассеяния в 106-1014 раз за счет их способности генерировать локальное электромагнитное поле, взаимодействующее с колебательными состояниями анализируемых органических молекул. Спектроскопия ГКР активно изучается более 30 лет, а в последнее десятилетие зарекомендовала себя в качестве одного из наиболее эффективных и многообещающих методов обнаружения биологических структур. Явление ГКР открывает новые возможности в создании сверхчувствительных диагностических методов анализа и понижении предела обнаружения по сравнению с известными методами. Современные методы не в полной мере удовлетворяют требованиям к чувствительности, экспрессности, доступности используемого оборудования и стоимости анализа, что приводит к необходимости пересмотра существующих и разработке новых, более чувствительных, селективных и менее ресурсозатратных экспресс-способов определения ДНК в таких биологических жидкостях, как кровь, моча, спинномозговая жидкость, слюна и др. Сложность анализа ДНК методом спектроскопии ГКР заключается в низкой воспроизводимости коэффициентов усиления сигнала, вызванной различной ориентацией фрагментов ДНК и низкими концентрациями поврежденных участков. В связи с этим необходим поиск приемов для улучшения метрологических характеристик определения с использованием сенсора. Наибольшего усиления и воспроизводимости сигнала ГКР возможно достичь путем структурирования и упорядочивания поверхности, с которой происходит регистрация аналитического сигнала. Наночастицы серебра (НЧС) активно используются в качестве усилителя сигнала КР за счет возможности создания наноструктур со сложной иерархией путем агрегации и высокой концентрацией горячих точек (англ. hot spots), в которых и реализуется локальный поверхностный плазмонный резонанс.
Из уровня техники известно решение, представленное в работе [Graham D., Thompson D.G., Smith W.E., Faulds K. Control of enhanced Raman scattering using a DNA-based assembly process of dye-coded nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 2008. V. 3. P. 548-551], описывающей селективное обнаружение ДНК методом спектроскопии ГКР с использованием модифицированных красителем НЧС, на поверхность которых иммобилизованы олигонуклеотиды. Предложенный подход позволяет обнаруживать ДНК по процессу агрегации наночастиц серебра (НЧС) посредством их модификации олигонуклеотидами и их направленного взаимодействия за счет комплементарности ДНК. В этом случае обнаружение основано на образовании димеров НЧС при гибридизации ДНК, которое происходит исключительно в присутствии мишени. При этом модифицированные красителем НЧС без гибридизации не давали усиления на спектрах ГКР. Предложенный подход демонстрирует высокую, сравнимую с ПЦР, чувствительность. Достижение повышенной чувствительности связано с наличием усиленных сигналов ГКР для димеров НЧС и отсутствием - в случае отдельных НЧС. ДНК сама по себе не дает сигнала ГКР, поскольку не имеет подходящего видимого хромофора и обладает низким адсорбционным сродством к поверхности ГКР-активных НЧС.
Однако известное решение детектирования последовательностей нуклеиновых кислот методом спектроскопии ГКР не является экспрессным. Предложенный подход требует предварительной агрегации НЧС посредством гибридизации с ДНК в течение 20-60 мин. При этом интенсивность аналитических сигналов существенно зависит от продолжительности и температурного режима агрегации, что приводит к дополнительным погрешностям в анализе. При этом отсутствие комплементарных взаимодействий приводит к получению сигналов на спектрах ГКР, что осложняет количественный анализ. Минимальная изученная концентрация фрагментов ДНК составляет 7.5⋅10-9 М, что может быть недостаточно для постановки диагноза на ранних стадиях рака.
Наиболее близким к заявляемому является способ измерения связанных с раком веществ, включая свободную ДНК, происходящую от раковых клеток, посредством спектроскопии КР (WO 2014181816 A1 (ЕА 201592123 А) «Raman quantification method of cancer-related substance» («Способ измерения связанных с раком веществ посредством спектроскопии комбинационного рассеяния света»)). Предложенный способ измерений включает этапы 1) приготовления биочипа с мезокристаллической областью из оксидов серебра, содержащей перекись серебра, 2) добавления по каплям сыворотки крови или раствора биологического образца к мезокристаллической области биочипа, избирательного захвата связанных с раком веществ, имеющих положительный заряд в образце, 3) облучения лазерным светом захваченных связанных с раком веществ и 4) последующего определения этих компонентов методом спектроскопии КР, при этом дают оценку раковым заболеваниям на основе интенсивности сигналов поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния света (SERS, ГКР).
Однако в известном решении невозможно селективное количественное определение ДНК с поврежденными фрагментами. Вывод о содержании связанных с раком веществ делают по свойственным для углерода D- и G-полосам и характерному пику для метиловой группы вблизи 2900 см-1, которые присутствуют у любых как белковых соединений, так и молекул ДНК. Некоторая селективность обеспечивается исключительно разделением положительно и отрицательно заряженных аналитов. Предложенная методика требует синтеза и использования квантовых кристаллов (100-200 нм), состоящих из квантовых точек серебра (5-10 нм), которые только после приложения электрического потенциала способны реагировать с определяемыми соединениями: как ДНК, так и белками. Описанный биочип обладает достаточно сложной конструкцией, что отрицательно влияет на воспроизводимость методик его получения и определения целевых аналитов, сужает круг определяемых соединений. Производство данного сенсора сложно осуществлять в больших масштабах. Кроме того, продемонстрирована возможность обнаружения ракового заболевания и оценка прогрессирования заболевания на реальных образцах крови, но количественных зависимостей содержания ДНК в исследуемых образцах для диагностирования рака на ранних стадиях с использованием описанного подхода получить не удалось. Таким образом, известный метод не позволил проводить достоверную количественную оценку содержания ДНК со строго заданной последовательностью с необходимыми чувствительностью: низким ПО<1⋅10-12 М, широким диапазоном определяемых концентраций: ДОК 1⋅10-12-1⋅10-7 М, высокой воспроизводимостью: sr<0.10 и селективностью по отношению к наиболее близким по строению: ДНК с отличной от определяемой последовательностью).
Технической проблемой является отсутствие способа определения ДНК с поврежденными фрагментами, обладающего высокими чувствительностью, селективностью и экспрессностью для диагностики онкологических заболеваний на ранних стадиях.
Данная техническая проблема решается за счет идентификации последовательности ДНК, селективного определение поврежденных ДНК, что включает в себя приготовление планарной ГКР-активной поверхности из наночастиц благородных металлов; последующую гибридизацию поврежденного фрагмента ДНК с различными комплементарными олигонуклеотидами, ковалентно модифицированных коммерчески доступными ГКР-метками; добавления капли раствора биологического образца на поверхность наночастиц, направленное структурирование определяемых соединений на ГКР-сенсорной поверхности за счет нековалентных взаимодействий; облучения монохроматическим пучком лазера и определение фрагментов ДНК в изучаемом образце методом спектроскопии ГКР на основе интенсивности сигналов на регистрируемых спектрах.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом изобретения является разработка способа для качественного и количественного определения ДНК в целях диагностики онкологических заболеваний, который позволяет использовать метод спектроскопии ГКР с высокими коэффициентами чувствительности (до 105 абс.ед.) и низким пределом обнаружения (ПО до 3 фМ), высокой селективностью (по отношению к молекулам ДНК с отличной последовательностью нуклеиновых кислот), широким диапазоном определяемых концентраций (ДОК от 1⋅10-14 до 1⋅10-7 М), высокими воспроизводимостью и прецизионностью (коэффициенты корреляции градуировочных зависимостей составляет не менее 0.97, относительное стандартное отклонение при нижней определяемой концентрации не более 0.08). Способ позволяет проводить узнавание фрагментов ДНК конъюгатами олигонуклеотидов с наночастицами для обнаружения и определения ДНК с определяемой последовательностью промотора гена каталитической субъединицы теломеразы человека с высокими чувствительностью, селективностью и экспрессностью для диагностики онкологических заболеваний на ранних стадиях, а именно на нулевой и первой стадиях, когда опухоль не вышла за пределы очага ее образования и не поразила соседние ткани либо успела врасти в окружающие ткани, но не распространилась в лимфатические узлы или другие части тела, при содержании молекул ДНК с повреждениями менее 1⋅10-11 М.
Технический результат достигается способом определения фрагментов поврежденной ДНК, заключающимся в том, что на планарную ГКР-активную поверхность, включающую наночастицы благородных металлов (оптический сенсор) наносят предварительно подготовленный раствор, образованный при гибридизации жидкой пробы с исследуемым фрагментом поврежденной ДНК с комплементарным олигонуклеотидом, ковалентно модифицированным ГКР-меткой, облучают монохроматическим пучком лазера и определение фрагментов ДНК в изучаемом образце методом спектроскопии ГКР проводят по интенсивности сигналов на регистрируемых спектрах. Оптический сенсор представляет собой нанесенные на материал-носитель наночастицы благородных металлов, в качестве которых используют серебро или золото, а в качестве материала-носителя используют диэлектрический химически инертный материал, выбранный из ряда, включающего оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, диоксид циркония, силикатное стекло. При этом наночастицы имеют размеры 20-90 нм и характеризуются полосой плазмонного резонанса 420-650 нм, для нанесения используют 10-500 мкмоль благородного металла в расчете на 1 мм2 поверхности носителя с последующей сушкой. Для нанесения пробы (предварительно подготовленного раствора, образованног при гибридизации жидкой пробы с исследуемым фрагментом поврежденной ДНК с комплементарным олигонуклеотидом, ковалентно модифицированным ГКР-меткой) и однократного анализа используют поверхность площадью 4×4 мм2. Гибридизацию проводят путем нагрева и выдерживания раствора в течение 5-10 мин при температуре 90-100°С, с последующим охлаждением до комнатной температуры, при этом в качестве олигонуклеотидов для гибридизации использованы олигонуклеотиды, длина которых выбирается с учетом химической структуры ГКР-метки, из расчета конечного расстояния 1-5 нм между ГКР-индикатором и наночастицами металла для осуществления резонансного взаимодействия на поверхности наночастиц, а в качестве ГКР-индикаторов предпочтительно использовать вещества, дающие наибольшее разрешение и количество характеристичных полос на спектрах ГКР, например родаминовые и цианиновые красители, в частности R6G и Су3. Для проведения гибридизации предпочтительно использовать ГКР-меченный олигонуклеотид взятый в мольном соотношении от 1:10 до 10:1 к определяемой ДНК. Для качественного и количественного анализа жидкие пробы наносят путем их накалывания на поверхность наночастиц, предпочтительно наносить на поверхность жидкие пробы объемом 10-50 мкл для определения ДНК с концентрациями 10-15-10-2 М. Предпочтительно после нанесения жидкой пробы на ГКР-сенсорную поверхность выдержать образец при комнатной температуре в течение времени, необходимого для равномерного распределения пробы по поверхности сенсора и возможности фокусировки лазера. В среднем оптимальный промежуток времени между нанесением пробы на сенсор и регистрацией сигнала ГКР составляет от 5 до 60 мин. При проведении анализа предпочтительно использовать монохроматическое лазерное излучение с длиной волны наиболее близкой к максимуму поглощения раствора ГКР-индикатора из диапазона длин волн 450-1100 нм и мощностью, не превышающей 10% от номинальной величины, при облучении сенсора с нанесенной пробой не более 10 с, при этом о качественном и количественном содержании ДНК судят по положению и интенсивности полос при 1360, 1380, 1470, 1510, 1570, 1590 и 1650 см-1 с допустимой величиной погрешности не более 10 см-1.
Последовательность нуклеиновых кислот в структуре ГКР-меченного олигонуклеотида выбирается из соображений комплементарности нуклеиновых кислот: А (аденин) - Т (тимин), G (гуанин) - С (цитозин) к необходимой мишени.
Диагностика онкологических заболеваний осуществляется за счет идентификации последовательности ДНК, селективного определение поврежденных ДНК, что включает в себя приготовление планарной ГКР-активной поверхности из наночастиц благородных металлов; последующую гибридизацию поврежденного фрагмента ДНК с различными комплементарными олигонуклеотидами, ковалентно модифицированных коммерчески доступными ГКР-метками; добавления капли раствора биологического образца на поверхность наночастиц, направленное структурирование определяемых соединений на ГКР-сенсорной поверхности за счет нековалентных взаимодействий; облучения монохроматическим пучком лазера и определение фрагментов ДНК в изучаемом образце методом спектроскопии ГКР на основе интенсивности сигналов на регистрируемых спектрах.
Способность селективно связывать и равномерно структурировать анализируемое вещество по поверхности ГКР-сенсорного устройства подтверждается регистрацией идентичных по интенсивности аналитических сигналов по всей площади поверхности наноструктур (n=10; Р=0.95); способность контролировать расположение ГКР-метки относительно наноструктур благородного металла подтверждается регистрацией различных по усилению аналитических концентраций для идентичных концентраций ДНК с различным расположением ГКР-метки. Это позволяет детектировать ДНК с низкими пределами обнаружения методом спектроскопии ГКР, за счет образования квадруплексов ковалентно ГКР-меченных олигонуклеотидов с определяемой ДНК-мишенью на поверхности сенсорного устройства. Заявляемый оптический сенсор позволяет регистрировать усиленный и воспроизводимый сигнал комбинационного рассеяния, интенсивность которого зависит от концентрации определяемой ДНК-мишени в нанесенном образце за счет присутствия ГКР-меток в олигонуклетидном остатке.
Высокочувствительное обнаружение ДНК методом спектроскопии ГКР осуществляется за счет их селективной гибридизации с использованием олигонуклеотидов, ковалентно модифицированных ГКР-красителями (ГКР-метками, ГКР-индикаторами), которые встраиваются в состав дуплекса после гибридизации зонда с мишенью.
Представленный способ пригоден для работы с портативным, коммерчески доступным, серийным оборудованием вне лабораторных условий. Таким образом, с использованием заявляемого оптического планарного сенсора возможно высокочувствительное и селективное качественное и количественное определение присутствующих в образце молекул ДНК.
Заявляемый способ применим для определения малых количеств ДНК на фоне большого количества посторонних мешающих компонентов анализируемых реальных биологических жидкостей: крови, мочи, церебральной жидкости и др. Данный результат достигается за счет дополнительного селективного связывания фрагментов ДНК с направленно выбранными ковалентно ГКР-меченными олигонуклеотидами на поверхности наночастиц. Кроме того, за счет направленного структурирования и упорядочивания, а также контроля расстояния от ГКР-метки до поверхности наночастиц регистрируется воспроизводимый на всей сенсорной поверхности усиленный сигнал ГКР. Усиление сигнала комбинационного рассеяния в 103-1014 раз достигается за счет дополнительного оборачивания гибридизованного дуплекса ДНК вокруг металлических наночастиц, выступающих в качестве ГКР-усилителя благодаря нековалентным взаимодействиям. Предлагаемый способ определения ДНК демонстрирует отсутствие сигналов для произвольных ДНК на спектрах гигантского комбинационного рассеяния (фиг. 5, 6), что позволяет надежно количественно определять необходимые ДНК на уровне 10-14 М. Заявленный способ анализа позволяет эффективно предконцентрировать и селективно связывать анализируемое вещество, подбирать ковалентно ГКР-меченный олигонуклеотид для образования дуплекса из соображений комплементарности: А (аденин) - Т (тимин) и G (гуанин) - С (цитозин), и длины Якоря 15-25 нуклеиновых кислот и Промотора 10-50 нуклеиновых кислот, содержащего ГКР-метку, обнаруживать аналит с коэффициентом усиления до 1014, в том числе за счет сохранения структуры ДНК. При этом также стоит отметить потенциальное устранение мешающего влияния посторонних компонентов различных биологических жидкостей.
Таким образом, использование предлагаемого способа анализа позволяет детектировать сигнал ГКР с высоким коэффициентом чувствительности, высокой селективностью, широким диапазоном определяемых концентраций, высокой воспроизводимостью и прецизионностью.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлена схемы контрольных экспериментов (а) и образования квадруплекса ДНК (б) с ковалентно ГКР-меченными олигонуклеотидами, содержащими комплементарные последовательности, с различными длинами цепи в присутствии наночастиц благородных металлов. Знак «звездочка» обозначает ГКР-метку, знак «молния» указывает на появление усиленного специфического сигнала ГКР.
На фиг. 2 представлены структуры ковалентно меченных ГКР-индикаторами: R6G и Су3, олигонуклеотидов.
На фиг. 3 представлены типичные изображения, полученные методом сканирующей электронной микроскопии, иллюстрирующие морфологию наноструктурированных серебряных поверхностей, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса серебра (а-е). Позициями на фигурах обозначены изображения с различными масштабами: а - 500 нм, б, г - 2 мкм, в - 50 мкм, д - 10 мкм, е - 20 мкм.
На фиг. 4 представлены фотографии подготовленных к анализу и исходных полученных пластинок, покрытых слоем наночастиц серебра.
На фиг. 5 представлены спектры ГКР фонового сигнала оптических планарных ГКР-сенсоров, полученные с использованием λех=514 нм. Позициями на фигурах обозначены спектры для образцов: 1 - ГКР-сенсорного покрытия без пробы и ГКР-сенсорного покрытия с нанесением гибридизованных с A/R6G проб: 2 - Якорь1, 3 - Якорь2, 4 - обратный комплементарный Якорь2, 5 - обратный комплементарный Промотор, и 6 - Якорь1-Промотор и 7 - Якорь2-Промотор, нанесенных в объеме 10 мкл и концентрации 1⋅10-6 М на планарную поверхность наночастиц серебра, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 6 представлены спектры ГКР фонового сигнала оптических планарных ГКР-сенсоров, полученные с использованием λех=633 нм. Позициями на фигурах обозначены спектры для образцов: 1 - ГКР-сенсорного покрытия без пробы и ГКР-сенсорного покрытия с нанесением гибридизованных с A/R6G проб: 2 - Якорь1, 3 - Якорь2, 4 - обратный комплементарный Якорь2, 5 - обратный комплементарный Промотор, и 6 - Якорь1-Промотор и 7 - Якорь2-Промотор, нанесенных в объеме 10 мкл и концентрации 1⋅10-6 М на планарную поверхность наночастиц серебра, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 7 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образцов ГКР-меченных олигонуклеотидов, предварительно гибридизованных с Якорь1-Промотор. Позициями на фигурах обозначены спектры для образцов: 1 - А/Су3, 2 - В/Су3, 3 - С/Су3 и 4 - D/Су3, нанесенных в объеме 10 мкл и концентрации 1⋅10-6 М на планарную поверхность наночастиц серебра, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 8 представлены зависимости интенсивностей при различных рамановских сдвигах (
1382, 
1469 и 
1590 см-1) для олигонуклеотидных остатков А/Су3, В/Су3, С/Су3 и D/Су3 концентрации 1⋅10-6 М (λех=514 нм).
На фиг. 9 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=633 нм для образцов ГКР-меченных олигонуклеотидов, предварительно гибридизованных с Якорь1-Промотор. Позициями на фигурах обозначены спектры для образцов: 1 - А/Су3, 2 - В/Су3, 3 - С/Су3 и 4 - D/Су3, нанесенных в объеме 10 мкл и концентрации 1⋅10-6 М на планарную поверхность наночастиц серебра, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 10 представлены зависимости интенсивностей при различных рамановских сдвигах (
1383, 
1470 и 
1590 см-1) для олигонуклеотидных остатков А/Су3, В/Су3, С/Су3 и D/Су3, гибридизованных с Якорь1-Промотором в концентрации 1⋅10-6 М (λех=633 нм).
На фиг. 11 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образцов ГКР-меченных олигонуклеотидов, предварительно гибридизованных с Якорь1 -Промотором. Позициями на фигурах обозначены спектры для образцов: 1 - A/R6G, 2 - B/R6G, 3 - C/R6G и 4 - D/R6G, нанесенных в объеме 10 мкл и концентрации 1⋅10-6 М на планарную поверхность наночастиц серебра, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 12 представлены зависимости интенсивностей при различных рамановских сдвигах (
1361, 
1508, 
1572 и 
1650 см-1) для олигонуклеотидных остатков A/R6G, B/R6G, C/R6G и D/R6G, гибридизованных с Якорь1-Промотором в концентрации 1⋅10-6 М (λех=514 нм).
На фиг. 13 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λex=633 нм для образцов ГКР-меченных олигонуклеотидов, предварительно гибридизованных с Якорь1-Промотором. Позициями на фигурах обозначены спектры для образцов: 1 - A/R6G, 2 - B/R6G, 3 - C/R6G и 4 - D/R6G, нанесенных в объеме 10 мкл и концентрации 1⋅10-6 М на планарную поверхность наночастиц серебра, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 14 представлены зависимости интенсивностей при различных рамановских сдвигах (
1362, 
1510 и 
1650 см-1) для олигонуклеотидных остатков A/R6G, B/R6G, C/R6G и D/R6G концентрации 1⋅10-6 М (λех=633 нм).
На фиг. 15 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образца A/R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрациях 1⋅10-14-1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 16 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образца A/R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрациях 1⋅10-14-1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 17 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образца B/R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрацией 1⋅10-7 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 18 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образца B/R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрациях 1⋅10-14-1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 19 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=514 нм для образца C/R6G, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрацией 1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 20 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=633 нм для образца А/Су3, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрацией 1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 21 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=633 нм для образца С/Су3, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрацией 1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
На фиг. 22 представлены спектры ГКР, полученные с использованием λех=633 нм для образца D/Су3, нанесенного в объеме 10 мкл и концентрацией 1⋅10-6 М на планарную поверхность НЧС, полученных пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса.
Осуществление изобретения
В настоящем изобретении приняты следующие обозначения и термины:
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГКР - гигантское комбинационное рассеяние
ДМАА - диметиламиламин
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - диметилформамид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОК - диапазон определяемых концентраций
НЧС - наночастицы серебра
Обратный комплементарный Якорь/Промотор - олигонуклеотидная последовательность в обратном порядке нуклеотидов относительно последовательности, комплементарной последовательности Якорь/Промотор
ОФ-ВЭЖХ - обращенно-фазовая ВЭЖХ
ПО - предел обнаружения
Промотор - участок олигонуклеотидной последовательности, узнаваемый РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции (фиг. 1)
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РЭМ - растровая электронная микроскопия
Спектр ГКР - спектр комбинационного рассеяния с сигналами, усиленными за счет эффекта поверхностного плазмонного резонанса на наноструктурах благородных металлов
Трис-HCl - раствор трисаминометана с соляной кислотой
ЭДТА - этилендиаминтетрацетат натрия
Якорь - участок олигонуклеотидной последовательности, взаимодействующий с наночастицами металла (фиг. 1)
А - аденин
С - цитозин
ESI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением
G - гуанин
PAGE - денатурирующий полиакриловый гель
SERS - surface enhanced Raman spectroscopy
T - тимин
TAMRA - раствор трет-бутиламин/вода, 1:3 об./об.
ТВТА - трис(бензилтриазолил)амин
Химические символы / сокращения имеют свои обычные значения: °С (градус (градусы) Цельсия), нм (нанометр (нанометры)), мкм (микрометр (микрометры)), см (сантиметр (сантиметры)), мин (минута (минуты)), с (секунда (секунды)), мин (минута (минуты)), ч (час (часы)), мкл (микролитр (микролитры)), мкг (микрограмм (микрограммы)), М (моль (моли) в литре), мкМ (микромоль (микромоли) в литре), пМ (пикомоль (пикомоли) в литре), л (литр (литры)), мл (миллилитр (миллилитры)), мкл (микролитр (микролитры)), г (грамм (граммы)), мг (миллиграмм (миллиграммы)), моль (моли), ммоль (миллимоль (миллимоли)), масс. % (массовый процент (массовые проценты)), об. % (объемный процент (объемные проценты)), м.м. (молекулярная масса).
Заявляемый способ анализа состоит из трех ключевых этапов: подготовки наночастиц благородных металлов, выступающих в роли ГКР-усилителя; образования дуплекса ДНК-мишени с направленно выбранным ковалентно ГКР-меченным комплементарным олигонуклеотидом; нанесения пробы с исследуемым соединением на поверхность наночастиц жидкой пробы с исследуемым соединением с образованием направленно упорядоченной за счет нековалентных взаимодействий структуры (фиг. 1), включающей определяемую ДНК, ГКР-метку и олигонуклеотид; детектирование полученного гибридизированного ГКР-меченного дуплекса (фиг. 2), методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния и о качественном и количественном содержании определяемой ДНК судят по положению и интенсивности полос на регистрируемых спектрах. При этом в качестве материала-носителя может быть выбран любой другой из диэлектрических химически инертных материалов, в частности наиболее распространенных для этой цели материалов, таких как оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, целлюлоза, диоксид циркония, что существенно не изменит эффект, а в качестве ГКР-усилителя могут быть выбраны любые наночастицы благородных металлов, размерами 20-90 нм, имеющие полосу плазмонного резонанса в области 420-650 нм и способные усиливать сигнал комбинационного рассеяния модельных ГКР-индикаторов: R6G и Су3, в концентрации не более 1⋅10-8 М.
В качестве ГКР-меченного олигонуклеотида выбирают олигонуклеотид, комплементарный по последовательности нуклеиновых кислот к ДНК-мишени (по принципу комплементарного соответствия нуклеиновых кислот: А (аденин) - Т (тимин) и G (гуанин) - С (цитозин)), при этом предпочтительно использовать олигонуклеотид, состоящий из 25-75 нуклеиновых кислот (Якорь: 15-25 нуклеиновых кислот и Промотор: 10-50 нуклеиновых кислот), что обеспечивает длину олигонуклеотида 10-50 А и расстояние ГКР-метки 1-5 нм от поверхности наночастиц благородных металлов.
Детектирование полученного гибридизированного ГКР-меченного дуплекса, методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния осуществляется на коммерчески доступных КР-спектрометрах с хотя бы одним источником монохроматического излучения в видимом диапазоне: 500-1100 нм. О качественном и количественном содержании ДНК судят по наличию и интенсивности характеристических полос на регистрируемых спектрах ГКР, а именно при характеристических рамановских сдвигах: ок. 1360, 1380,1470, 1510, 1570, 1590 и 1650 см-1.
Представленные ниже примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, но не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.
Все приведенные ниже реагенты являются коммерчески доступными. Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С; в ходе всех экспериментов для приготовления водных растворов и промывки суспензий использовали деионизированную воду высокой чистоты, очищенную с использованием установки «Milli-Q», «МПИроге»; спектры ГКР зарегистрированы на КР-спектрометре «Renishaw inVia Reflex» с фокусным расстоянием 250 мм, размером пятна лазера 1-300 мкм, при этом все спектры ГКР сняты с использованием 50×-го объектива и с временем экстинкции 10 с, юстировку прибора проводили с использованием монокристаллических пластин кремния в качестве стандарта; оптические фотографии снимались на конфокальном микроскопе «Leica DMLM» с разрешением до 2.5 мкм; разделение неоднородных систем проводилось с помощью центрифуги «Centrifuge 5804», «Eppendorf»; для фильтрования использовали насосный фильтр «MillexLCR» («Millipore», с порами 450 мкм); взвешивание препаратов проводили с точностью ±0.02 мг на аналитических весах «Discovery», «OHAUS»; точные объемы жидкостей отбирали с использованием автоматических дозаторов «Eppendorf» с диапазонами объемов: 2-20, 10-100, 20-200, 100-1000 и 500-5000 мкл; гомогенизацию неоднородных систем ультразвуковым облучением проводили в УЗ-ванне «Elmasonic Р», «Elma», механическую гомогенизацию неоднородных систем проводили с использованием или мини-ротатора «Bio RS-24», «BioSan», или планетарной мельницы «PULVERISETTE», «FRITSCH», или магнитной мешалки «RCT basic», «IKA» с возможностью подогрева.
Пример 1. Способ селективного детектирования заданного фрагмента ДНК с олигонуклеотидом, меченным ГКР-индикатором Су3
В качестве ГКР-усилителя использовали планарный оптический ГКР-сенсор, представляющий собой нанесенные на поверхность тонкой стеклянной пластинки наночастицы серебра до толщины не более 10 мкм. Получение наночастиц осуществляли следующим образом: к 100 мл свежеприготовленного 0.17 М водного раствора нитрата серебра по каплям со стеклянной палочки при постоянном перемешивании добавляли ~ 30 мл 0.1 М водного раствора гидроксида натрия до полного выпадения черно-коричневого осадка оксида серебра(I):
Затем осадок Ag2O тщательно промывали деионизованной водой (трижды порциями по 100 мл воды), далее добавляли 100 мл воды и по каплям 7 мл концентрированного раствора аммиака при постоянном перемешивании для образования водного раствора аммиачного комплекса серебра:
После полного растворения осадка дополнительно добавляли 25 мл концентрированного раствора аммиака для предотвращения выпадения оксида серебра(I) в процессе аэрозольного распыления аммиачного комплекса. 
количества аммиака существенно ухудшали микроструктуру образующихся в процессе пиролиза серебряных колец. Полученный раствор разбавляли до 170 мл водой. Прозрачный 0.01 М раствор комплекса серебра фильтровали через мембранный фильтр, затем разбавляли в 8 раз водой до концентрации [Ag(NH3)2]OH 12.5 мМ. В контейнер установки ультразвукового аэрозольного ингалятора переносили 50 мл конечного раствора. Два покровных стекла предварительно отмывали в ацетонитриле и нагревали на дне химического стакана до 290-320°С. На неубалайзер устанавливали патрубок-переходник с диаметром ~1 см. Использовали параметры распыления: 7 на «УЗ» и 1 на «Воздух». Таким образом, серебро наносили на поверхность покровного стекла ультразвуковым серебряным дождем аммиачного комплекса серебра(I). Сначала серебро распылялось в виде тумана, затем в виде капель размером 1-5 мкм, которые при попадании на нагретую до 290-320°С поверхность стекла испарялись. При этом протекали следующие реакции:
В процессе нанесения серебра сохраняли расстояние от сопла до пластинок 1.5-2 см. Сопло перемещали медленными, равномерными круговыми движениями по всей поверхности пластин. Распыление проводили по 5 мин с перерывом на 5 мин для полного прогрева поверхности покровного стекла. После расходования всего объема аммиачного комплекса серебра полученные пластинки дополнительно выдерживали при нагреве в течение 15 мин. Морфологию получаемых сенсорных наноструктурированных поверхностей контролировали методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (фиг. 3). Затем полученные пластинки 24×24 мм2 нарезали алмазным надфилем на сенсорные поверхности размером 4×4 мм2 (фиг. 4).
На следующей стадии проводили процедуру гибридизации определяемой ДНК путем добавления олигонуклеотида, ковалентно меченного ГКР-индикатором с направленно подобранной последовательностью НК, что гарантирует селективность анализа, а интенсивность полос, свойственная для ГКР-индикаторов и контролируемое расстояние от ГКР-метки до поверхности наноструктур металла, обеспечивает высокую чувствительность анализа. Для получения меченных последовательностей олигонуклеотидов (фиг. 2) использовали автоматизированную методику синтеза, приведенную в работе авторов [V.М. Farzan, Е.A. Ulashchik, Y.V. Martynenko-Makaev, М.V. Kvach, I.О. Aparin, V.A. Brylev, Т.A. Prikazchikova, S.Y. Maklakova, A.G. Majouga, A.V. Ustinov, G.A. Shipulin, V.V. Shmanai, V.A. Korshun and T.S. Zatsepin. Automated solid-phase click synthesis of oligonucleotide conjugates: From small molecules to diverse n-acetylgalactosamine clusters. Bioconjug. Chem. 2017. V. 28. P. 2599-2607]. 5'-Алкин-модифицированные олигонуклеотиды получали в синтезаторах олигонуклеотидов ASM-2000 («Biosset») или ММ-12 («Bioautomation») с использованием амидофосфитного метода. Защищенные 2'-дезоксирибонуклеозид-3'-фосфорамидиты, Unylinker-CPG (500 
) и S-этилтио-1H-тетразол были приобретены у «ChemGenes». Раствор азида 6-R6G (100 мМ) и медного катализатора CuI⋅Р(OEt)3 (100 мМ) в апротонном биполярном растворителе (диметилсулфоксиде (ДМСО), диметилфорамиде (ДМФА) или диметиламиламине (ДМАА), 100 мкл) добавляли к 5'-алкин-модифицированным олигонуклеотидам, связанным с твердой фазой в колонке (1 мкмоль) 5 раз каждые 30 мин. Через 3 ч твердый носитель тщательно промывали (10×150 мкл ДМСО, затем 3×150 мкл ацетонитрила) с последующим снятием защиты у цианоэтильных групп (2×10% диэтиламина в ацетонитриле (10 мин) и полное снятие защиты с использованием смеси TAMRA (трет-бутиламин/вода, 1:3 об./об.) при 55°С в течение ночи. Раствор выпаривали и аликвоту анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ESI-MS).
Полученные олигонуклеотиды дважды очищали денатурирующим полиакриловым гелем (PAGE), а затем методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и (ОФ-ВЭЖХ). Гель-электрофорез денатурированных олигонуклеотидов проводили в 15% PAGE, содержащем 7 М мочевины в трис-боратном буфере (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ борная кислота, 1 мМ этилендиаминтетрацетат натрия (ЭДТА), рН 8.3). Олигонуклеотиды извлекали из геля путем электроэлюции с помощью Elutrap (Whatman) в трис-боратном буфере (5 мМ Трис-HCl, 5 мМ борная кислота, 0.1 мМ ЭДТА, рН 8.3). Анализ методом ВЭЖХ и очистку олигонуклеотидов проводили с использованием хроматографической колонны 2.1×50 мм Jupiter С18 (5 мкм, «Phenomenex»), буфера А: 10 мМ диизопропиламин и 15 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанол и буфера Б: 10 мМ диизопропиламин, 15 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанол и 80% ацетонитрил. Соли промывали буфером А (4 цикла), а затем 100% буфера Б (2 цикла) при скорости потока 0.3 мл/мин и температуре 45°С. Структуру полученных олигонуклеотидов подтверждали методом ESI-MS с использованием системы Agilent 1260-Bruker Maxis Impact. Масс-спектрометрический анализ олигонуклеотидов проводился в отрицательном режиме (капиллярное напряжение 3500 В), и регистрируемые спектры пересчитывали методом максимальной энтропии.
Полученный 5'-алкин-модифицированных олигонуклеотид модифицировали малыми молекулами ГКР-индикаторов. Полученный олигонуклеотид готовили в твердой фазе и связывали с 5'-алкинфосфорамидитом. Клик-модификацию проводили на твердой фазе путем добавления 10 мМ раствора азида, 100 мМ CuI⋅Р(OEt)3 4×100 мкл (азида 2 экв.) в течение 4 ч с последующим промыванием. В большинстве случаев олигонуклеотиды отщепляли от носителя и снимали защиту в синтезаторе, используя 1,2-этилендиамин/толуол, 1:1 об./об., в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим промыванием (4×150 мкл ацетонитрила) и элюирование 50% ацетонитрилом в воде или снятие защиты с использованием раствора АМА (концентрированный водный аммиак и 40% водный метиламин, 1:1 об./об.) в течение 30 мин при 65°С. В случае R6G снятие защиты проводили с использованием раствора TAMRA при 55°С в течение ночи. В случае Су5 использовали две схемы снятия защиты (концентрированный водный раствор аммиака при комнатной температуре в течение 2 и 18 ч). Для переключения фазы раствора 5'-алкин-модифицированный олигонуклеотид (2 нмоль) растворяли в 1 М ацетате триэтиламмония (30 мкл). Затем добавляли 20 мкл раствора медного катализатора в 60% ДМСО (15 мМ трис(бензилтриазолил)амин (ТВТА) и 13 мМ сульфата меди (II)), а затем 4 мкл 10 мМ азида Су5 в ДМСО и 140 мкл 80% ДМСО. Раствор дегазировали и дважды заполняли аргоном в вакуумном центрифужном концентраторе, а затем добавляли дегазированный раствор аскорбиновой кислоты (0.25 М, 6 мкл). Реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре, и олигонуклеотидный продукт осаждали 4% LiClO4 в ацетоне (1 мл). Очистку и анализ методом ВЭЖХ проводили, как описано выше.
При выборе последовательности НК в структуре ГКР-меченного олигонуклеотида руководствовались его комплементарностью определяемой ДНК: А (аденин) - Т (тимин), G (гуанин) - С (цитозин) для последующего образования водородных связей в парных комплексах (дуплексах) с длиной Якоря 15-25 нуклеиновых кислот и длиной Промотора 10-50 нуклеиновых кислот. В качестве модельной определяемой ДНК рассмотрена структура Якорь1-Промотор (табл. 1, фиг. 1), повреждение в которой обозначено «с» и встречается при раке мочевого пузыря [Avogbe Р.Н., Manel A., Vian Е., Durand G., Forey N., Voegele C, Zvereva M., Hosen I., Meziani S., De Tilly В., Polo G., Lole O., Francois P., Delhomme T.M., Carreira C, Monteiro-Reis S., Henrique R., Abedi-Ardekani В., Byrnes G., Foil M., Weiderpass E., McKay J., Jeronimo C, Scelo G., Le Calvez-Kelma F. Urinary TERT promoter mutations as non-invasive biomarkers for the comprehensive detection of urothelial cancer. EBioMedicine 2019. V. 44. P. 431-438]. Конкретные определяемые последовательности нуклеиновых кислот и поврежденных фрагментов задаются типом диагностируемого заболевания согласно ранее известным данным биохимических исследований [Descotes F., Kara N., Decaussin-Petrucci M., Piaton E., Geiguer F., Rodriguez-Lafrasse C, Terrier J.E., Lopez J., Ruffion A. Non-invasive prediction of recurrence in bladder cancer by detecting somatic TERT promoter mutations in urine Br. J. Cane. V. 117. P. 583-587].
К структуре выбранной ДНК комплементарны следующие олигонуклеотиды: A/R6G, А/Су3, B/R6G, В/Су3, C/R6G, С/Су3, D/R6G и D/Су3, которые отличаются либо природой ГКР-метки (R6G или Су3), либо длиной последовательности (А, В, С или D) (табл. 1). В качестве побочных присутствующих последовательностей ДНК рассмотрены обратный комплементарный Якорь1 (аналогичной длины, но отличной последовательности НК), обратный комплементарный Промотор (отличной длины и отличной последовательности НК) и Якорь1-Промотор (отличной длины, но с присутствием аналогичного по последовательности НК фрагмента) (табл. 1). Гибридизацию проводили путем нагревания эквимолярной смеси мишени и ГКР-меченного олигонуклеотида от 23 до 95°С, выдерживали при 95°С в течение 5 мин, затем охлаждали до 23°С. Гибридизированные обратный комплементарный Якорь1, обратный комплементарный Промотор и Якорь1 с комплементарными ГКР-меченными фрагментами олигонуклеотидов: A/R6G, А/Су3, B/R6G, В/Су3, C/R6G, С/Су3, D/R6G и D/Су3 на спектрах ГКР имеют только фоновые сигналы с использованием лазерного излучения λех=514 и 633 нм (фиг. 5 и 6). Наноструктуры серебра на спектрах ГКР также не обладают собственными интенсивными полосами с использованием лазерного излучения λех=514 и 633 нм (фиг. 5 и 6). Не гибридизированный с комплементарным ГКР-меченным олигонуклеотидом Якорь1 не имел характеристических полос аналитических сигналов с использованием лазерного излучения λех=514 и 633 нм (фиг. 5 и 6).
Спектры ГКР для образца ДНК Якорь1-Промотор, гибридизованного с олигонуклеотидами, ковалентно меченными Су3 при λех=514 нм имели одинаковое положение характеристических пиков: 1382, 1469 и 1590 см-1, вне зависимости от длины олигонуклеотида (фиг. 7). При изменении длины олигонуклеотида возникал различный коэффициент усиления сигналов ГКР (фиг. 8), что свидетельствовало о различных расстояниях между ГКР-меткой и поверхностью наноструктур, и, как следствие, подтверждало закрепление и гибридизацию ДНК и упорядоченное расположение аналита по поверхности наноструктур (фиг. 1).
Спектры ГКР для образца ДНК Якорь1-Промотор, гибридизованного с олигонуклеотидами, ковалентно меченными Су3 при λех=633 нм имели одинаковое положение характеристических пиков: 1383, 1470 и 1590 см-1, вне зависимости от длины олигонуклеотида (фиг. 9). При изменении длины олигонуклеотида возникал различный коэффициент усиления сигналов ГКР (фиг. 10), что свидетельствовало о различных расстояниях между ГКР-меткой и поверхностью наноструктур, и, как следствие, подтверждало закрепление и гибридизацию ДНК (фиг. 1). Вывод о присутствии ДНК с заданной последовательностью НК делали по присутствию на спектрах ГКР перечисленных характеристических сигналов.
Для детектирования анализируемых веществ с концентрациями 10-14-10-2 М используют жидкие пробы объемом 10-30 мкл путем их накалывания на поверхность сенсора. Для обеспечения высокой скорости анализа при большом отношении сигнал/шум и отсутствии появления ложной спектральной информации, мощность лазерного излучения не превышает 10% от номинальной величины при продолжительности набора спектров ДНК в составе ГКР-меченного дуплекса не более 10 с. Превышение указанных параметров может привести к фотоповреждению образца.
Пример 2. Способ селективного детектирования заданного фрагмента ДНК с олигонуклеотидом, меченным ГКР-индикатором R6G
Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в качестве ГКР-индикатора, ковалентно закрепленного на олигонуклеотиде, использовали R6G.
Спектры ГКР для образца ДНК Якорь1-Промотор, гибридизованного с олигонуклеотидами, ковалентно меченными R6G при λех=514 нм имели одинаковое положение характеристических пиков: 1361, 1508, 1572 и 1650 см-1, вне зависимости от длины олигонуклеотида (фиг. 11). При изменении длины олигонуклеотида возникал различный коэффициент усиления сигналов ГКР (фиг. 12), что свидетельствовало о различии в расстояниях между ГКР-меткой и поверхностью наноструктур, и, как следствие, подтверждало закрепление и гибридизацию ДНК и упорядоченное расположение аналита по поверхности наноструктур (фиг. 1).
Спектры ГКР для образца ДНК Якорь1-Промотор, гибридизованного с олигонуклеотидами, ковалентно меченными R6G при λех=633 нм имели одинаковое положение характеристических пиков: 1362, 1510 и 1650 см-1, вне зависимости от длины олигонуклеотида (фиг. 13). При изменении длины олигонуклеотида возникал различный коэффициент усиления сигналов ГКР (фиг. 14), что свидетельствовало о различных расстояниях между ГКР-меткой и поверхностью наноструктур, и, как следствие, подтверждало закрепление и гибридизацию ДНК (фиг. 1). Вывод о присутствии ДНК с заданной последовательностью НК делали по присутствию на спектрах ГКР перечисленных характеристических сигналов.
Пример 3. Способ селективного определения заданного фрагмента ДНК с олигонуклеотидом, меченным ГКР-индикатором R6G с концентрацией в интервале 10-14-10-6 М
Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в качестве металлических наночастиц использовали частицы серебра, полученные следующим образом: при непрерывном интенсивном перемешивании к 90 мл 1.11⋅10-3 М нитрата серебра быстро добавляли 10 мл раствора гидроксиламин гидрохлорида (1.5⋅10-2 М) с гидроксидом натрия (3⋅10-2 М). Получали НЧС с максимумом поглощения при 418 нм с шириной на полувысоте ~100 нм и достаточно монодисперсным распределением НЧС по размерам (d ≈ 34 нм). Спектры ГКР для образца ДНК Якорь1-Промотор, гибридизованного с олигонуклеотидами, ковалентно меченными R6G при λех=514 нм имели идентичное с примером 1 положение характеристических пиков. При этом изменяли содержание определяемого Якорь1 в интервале концентраций 10-14-10-6 М в присутствии ГКР-меченного олигонуклеотида A/R6G (фиг. 15 и 16), B/R6G (фиг. 17 и 18), C/R6G (фиг. 19) и D/R6G. Равномерность распределения целевого аналита продемонстрирована регистрацией 30 спектров ГКР в разных точках по поверхности ГКР-сенсорного элемента (диаметр пятна лазера составлял ок. 3 μм, площадь ГКР-сенсорного элемента во всех примерах ок. 16 см2) с воспроизведением интенсивностей сигналов при характеристических для ГКР-меченных олигонуклеотидов рамановских сдвигах на регистрируемых спектрах (фиг. 17 и 19). Воспроизводимость аналитических сигналов составляла менее 5% (фиг. 17 и 19). Вывод о качественном составе и количественном содержании осуществляли по наличию характеристических полос на спектрах ГКР и интенсивности полученных сигналов по градуировочным зависимостям (табл. 2) соответственно.
Пример 4. Способ селективного определения заданного фрагмента ДНК с олигонуклеотидом, меченным ГКР-индикатором Су3 с концентрацией в интервале 10-14-10-6 М
Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в качестве металлических наночастиц использовали частицы серебра, полученные следующим образом: при непрерывном интенсивном перемешивании к 90 мл раствора гидроксиламин гидрохлорида (1.67⋅10-3 М) с гидроксидом натрия (3.33⋅10-3 М) добавляли 10 мл раствора 1⋅10-2 М нитрата серебра. Предполагалось получение НЧС с максимумом поглощения при 408 нм с шириной на полувысоте ~80 нм и достаточно монодисперсным распределением НЧС по размерам (d ≈ 23 нм). В получаемых золях серебра окончательная кислотность среды была нейтральная, рН 7. Реакция восстановления протекала моментально, в течение нескольких секунд. Коллоиды серебра проявляли ГКР-активность сразу после их синтеза. Спектры ГКР для образца ДНК Якорь1-Промотор, гибридизованного с олигонуклеотидами, ковалентно меченными Су3 при λex=633 нм имели идентичное с примером 1 положение характеристических пиков. В качестве модельной определяемой ДНК рассмотрена структура Якорь2-Промотор (табл. 1), которая имеет в своей структуре фрагмент Якорь1-Промотор. К структуре выбранной ДНК комплементарны следующие олигонуклеотиды: A/R6G, А/Су3, B/R6G, В/Су3, C/R6G, С/Су3, D/R6G и D/Су3, которые отличаются либо природой ГКР-метки (R6G или Су3), либо длиной последовательности (А, В, С или D) (табл. 1). В качестве побочной присутствующей последовательности ДНК рассмотрена обратный комплементарный Якорь2 (аналогичной длины, но отличной последовательности НК) (табл. 1). Гибридизацию проводили путем нагревания эквимолярной смеси мишени и ГКР-меченного олигонуклеотида от 23 до 95°С, выдерживали при 95°С в течение 5 мин, затем охлаждали до 23°С. Гибридизированная последовательность обратный комплементарный Якорь2 с комплементарными ГКР-меченными фрагментами олигонуклеотидов: A/R6G, А/Су3, B/R6G, В/Су3, C/R6G, С/Су3, D/R6G и D/Су3 на спектрах ГКР имеют только фоновые сигналы с использованием лазерного излучения λех=514 и 633 нм (фиг. 5 и 6). Не гибридизированный с комплементарным ГКР-меченным олигонуклеотидом Якорь2-Промотор не имел характеристических полос аналитических сигналов с использованием лазерного излучения λех=514 и 633 нм (фиг. 5 и 6). В идентичных условиях изменяли содержание определяемого Якорь2-Промотор в интервале концентраций 10-14-10-6 М в присутствии ГКР-меченного олигонуклеотида А/Су3 (фиг. 20), В/Су3, С/Су3 (фиг. 21) и D/Су3 (фиг. 22). Воспроизводимость аналитических сигналов составляла менее 5%. Вывод о качественном составе и количественном содержании осуществляли по наличию характеристических полос на спектрах ГКР и интенсивности полученных сигналов по градуировочным зависимостям соответственно (табл. 2).
Как видно из приведенных примеров, в то время как известные способы давали возможность невоспроизводимого определения лишь отдельных ДНК за достаточно продолжительное время анализа, составлявшее в ряде случаев до нескольких часов с использованием дорогостоящего и громоздкого оборудования, заявленный нами способ анализа позволяет предконцентрировать и селективно связывать анализируемое вещество, обнаруживать ДНК за счет оптических явлений, в том числе на поверхности наночастиц с использованием ковалентных и нековалентных взаимодействий.
Для детектирования ДНК, присутствующих в пробе на уровне концентраций 10-14-10-2 М, предпочтительно использовать жидкие пробы объемом 10-50 мкл путем их накалывания на поверхность наночастиц благородного металла.
Для обеспечения высокой экспрессности анализа при высоком отношении сигнал / шум и отсутствии появления ложной спектральной информации, мощность лазерного излучения не должна превышать 10% от номинальной величины при продолжительности набора спектров для ковалентно меченной молекулы ДНК не более 10 с. При этом для проведения анализа используют монохроматическое лазерное излучение с длиной волны наиболее близкой к максимуму поглощения раствора ГКР-индикатора из диапазона длин волн 450-1100 нм.
Для проведения анализа помимо стационарных КР-спектрометров возможно использование портативных приборов с вышеперечисленными длинами волн для регистрации спектров ГКР. Таким образом, предлагаемое техническое решение эффективно для использования в целях мобильного высокочувствительного и высокоточного входного контроля и идентификации молекул ДНК, ускоренного контроля образцов биологических жидкостей, для окончательного контроля и диагностики как в лабораторных, так и в «полевых» условиях.
Анализ общеизвестных источников информации показал, что способ определения ДНК, основанный на использовании наночастиц благородных металлов, гибридизации мишени с направленно выбранным ковалентно ГКР-меченным комплементарным олигонуклеотидом, позволяющим образовывать направленно упорядоченную за счет нековалентных взаимодействий структуры, включающей определяемую ДНК, ГКР-метку и олигонуклеотид, для детектирования и определения ДНК методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния, не известен.
Claims (14)
1. Способ определения фрагментов поврежденной ДНК, характеризующийся тем, что на планарную ГКР-активную поверхность, включающую наночастицы благородных металлов, наносят предварительно подготовленный раствор, образованный при гибридизации жидкой пробы с исследуемым фрагментом поврежденной ДНК с комплементарным олигонуклеотидом, ковалентно модифицированным ГКР-меткой, облучают монохроматическим пучком лазера и определение фрагментов ДНК в изучаемом образце методом спектроскопии ГКР проводят по интенсивности сигналов на регистрируемых спектрах.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве наночастиц благородных металлов используют серебро или золото.
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что наночастицы имеют размеры 20-90 нм и характеризуются полосой плазмонного резонанса 420-650 нм.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве материала-носителя для наночастиц используют диэлектрический химически инертный материал, выбранный из ряда, включающего оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, диоксид циркония, силикатное стекло.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют 10-500 мкмоль благородного металла в расчете на 1 мм2 поверхности носителя с последующей сушкой.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для нанесения пробы и однократного анализа используют поверхность площадью 4×4 мм2.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что гибридизацию проводят путем нагрева и выдерживания раствора в течение 5-10 мин при температуре 90-100°С, с последующим охлаждением до комнатной температуры.
8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве ГКР-индикаторов используют родаминовые и цианиновые красители.
9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве олигонуклеотидов для гибридизации используют олигонуклеотиды, длина которых выбирается из расчета конечного расстояния 1-5 нм между ГКР-индикатором и наночастицами металла.
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что количество ГКР-меченного олигонуклеотида используют в мольном соотношении от 1:10 до 10:1 к определяемой ДНК.
11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют жидкие пробы путем их накалывания на поверхность наночастиц.
12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют жидкие пробы объемом 10-50 мкл с концентрацией ДНК 10-15-10-2 М.
13. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что при проведении анализа используют монохроматическое лазерное излучение с длиной волны наиболее близкой к максимуму поглощения раствора ГКР-индикатора из диапазона длин волн 450-1100 нм и мощностью, не превышающей 10% от номинальной величины, при облучении сенсора с нанесенной пробой не более 10 с.
14. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что о качественном и количественном содержании ДНК судят по положению и интенсивности полос при 1360, 1380, 1470, 1510, 1570, 1590 и 1650 см-1 с допустимой величиной погрешности не более 10 см-1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019125711A RU2723160C1 (ru) | 2019-08-15 | 2019-08-15 | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019125711A RU2723160C1 (ru) | 2019-08-15 | 2019-08-15 | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2723160C1 true RU2723160C1 (ru) | 2020-06-09 |
Family
ID=71067642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019125711A RU2723160C1 (ru) | 2019-08-15 | 2019-08-15 | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2723160C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112795565A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-14 | 南京邮电大学 | 检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法 |
| RU2764807C1 (ru) * | 2020-10-05 | 2022-01-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ) | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
| CN114438215A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-06 | 山东中医药大学 | 一种基于dna超支化自组装检测肺癌标志物的sers探针和试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016205971A1 (es) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Pontificia Universidad Catolica De Chile | Método ultrasensible de detección de biomarcador de cáncer gástrico |
| JPWO2014181816A1 (ja) * | 2013-05-08 | 2017-02-23 | 有限会社マイテック | 癌関連物質のラマン定量方法 |
| RU2639498C1 (ru) * | 2016-08-03 | 2017-12-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя бластомикоза blastomyces dermatitidis |
-
2019
- 2019-08-15 RU RU2019125711A patent/RU2723160C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2014181816A1 (ja) * | 2013-05-08 | 2017-02-23 | 有限会社マイテック | 癌関連物質のラマン定量方法 |
| WO2016205971A1 (es) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Pontificia Universidad Catolica De Chile | Método ultrasensible de detección de biomarcador de cáncer gástrico |
| RU2639498C1 (ru) * | 2016-08-03 | 2017-12-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя бластомикоза blastomyces dermatitidis |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DUNCAN GRAHAM et al. "Control of enhanced Raman scattering using a DNA-based assembly process of dye-coded nanoparticles", Nature Nanotechnology, vol 3, pages 548-551 (2008). * |
| DUNCAN GRAHAM et al. "Control of enhanced Raman scattering using a DNA-based assembly process of dye-coded nanoparticles", Nature Nanotechnology, vol 3, pages 548-551 (2008). M. Fondevila et al. "Forensic SNP genotyping with SNaPshot: Technical considerations for the development and optimization of multiplexed SNP assays", Forensic Science Review, vol. 21, January 2017. * |
| M. Fondevila et al. "Forensic SNP genotyping with SNaPshot: Technical considerations for the development and optimization of multiplexed SNP assays", Forensic Science Review, vol. 21, January 2017. RU 2639498 C1, 21.12.2017. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2764807C1 (ru) * | 2020-10-05 | 2022-01-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (МГУ) | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ |
| CN112795565A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-05-14 | 南京邮电大学 | 检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法 |
| CN112795565B (zh) * | 2021-02-04 | 2024-01-23 | 南京邮电大学 | 检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法 |
| CN114438215A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-06 | 山东中医药大学 | 一种基于dna超支化自组装检测肺癌标志物的sers探针和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4885712B2 (ja) | ローリングサークル増幅およびｓｅｒｓ検出による生体分子の分析方法 | |
| Isola et al. | Surface-enhanced Raman gene probe for HIV detection | |
| CN110455764B (zh) | 肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测系统 | |
| Wang et al. | Gold nanoparticle probes | |
| US6174677B1 (en) | Advanced surface-enhanced Raman gene probe systems and methods thereof | |
| EP3111214B1 (en) | Digital lspr for enhanced assay sensitivity | |
| JP5701896B2 (ja) | ラマン活性分子がナノ粒子二量体の接合部に位置する二量体コア−シェルナノ粒子、その用途およびその製造方法 | |
| US20090170070A1 (en) | Increased specificity of analyte detection by measurement of bound and unbound labels | |
| CN108359715B (zh) | Poly A介导的可调控纳米金探针及其制备与应用 | |
| Lim et al. | Sensitive detection of microRNA using QCM biosensors: sandwich hybridization and signal amplification by TiO 2 nanoparticles | |
| RU2723160C1 (ru) | Способ обнаружения и определения днк с заданной последовательностью методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния | |
| WO2010087121A1 (ja) | 核酸分析デバイス、及び核酸分析装置 | |
| JP2007524347A (ja) | マイクロアレイ形式のアッセイにおける、万能ナノ粒子プローブを用いた標識不要の遺伝子発現プロファイリング | |
| JP2003510065A (ja) | 分析物検出のためのレセプターを有する粒子構造体 | |
| Vo-Dinh et al. | Surface-enhanced Raman scattering for biomedical diagnostics and molecular imaging | |
| Park et al. | Highly sensitive and selective detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticle MutS enzymes and a micro cantilever resonator | |
| KR101742211B1 (ko) | 마이크로 rna의 초민감성 정량 분석 방법 및 장치 | |
| US9551025B2 (en) | Nucleic acid structure complex including nucleic acids, Raman-active molecules, and metal particles, method of preparing the same, and method of detecting target material by using the nucleic acid structure complex | |
| Wang et al. | The application of nanoparticles in biochips | |
| Yao et al. | Spatially reinforced Au nano-cavities as a reaction nano-reservoir for trace analysis of DNA hybridization | |
| RU2764807C1 (ru) | НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ МУТАЦИЙ С228Т И C250T В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT И СПОСОБ ЕЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
| EP4428247A1 (en) | Method of amplification or detection of target material using nanoparticles | |
| Itoh et al. | Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy: Electromagnetic mechanism and biomedical applications | |
| Languirand et al. | Nanoscale Optical Biosensors and Biochips for Cellular Diagnostics | |
| Languirand et al. | 9 Nanoscale Optical |