RU2723008C1 - Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение - Google Patents
Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2723008C1 RU2723008C1 RU2020116437A RU2020116437A RU2723008C1 RU 2723008 C1 RU2723008 C1 RU 2723008C1 RU 2020116437 A RU2020116437 A RU 2020116437A RU 2020116437 A RU2020116437 A RU 2020116437A RU 2723008 C1 RU2723008 C1 RU 2723008C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- rbd
- virus
- plasma
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 131
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 106
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 14
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 title abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims abstract description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 78
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 claims description 76
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 68
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 48
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 35
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 30
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 24
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 24
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 22
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 18
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 8
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 7
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 5
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 23
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 83
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 61
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 18
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 9
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 8
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 5
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 5
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001106322 Homo sapiens Rho GTPase-activating protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100537098 Mus musculus Alyref gene Proteins 0.000 description 1
- 101100269674 Mus musculus Alyref2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102100021446 Rho GTPase-activating protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 206010001053 acute respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150095908 apex1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Созданы генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцирующего рекомбинантный белок - рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV-2, который может быть использован для диагностических целей. Описан способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1; введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B. Создан штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. Разработан способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 включающий: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. Создан рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2. Создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека. Разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Разработан способ анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2. Изобретение предоставляет быструю и эффективную тест-систему для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Изобретение позволяет сократить время и упростить процедуру анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Также изобретение позволяет осуществить высокую и стабильную экспрессию рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. 8 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 8 пр.
Description
Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии и касается создания нового штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцирующего рекомбинантный белок - рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV-2, который может быть использован для диагностических целей.
Уровень техники.
В конце 2019 года в Китайской Народной Республике (КНР) произошла вспышка новой инфекции с эпицентром в городе Ухань (провинция Хубэй). Через некоторое время был обнаружен возбудитель данной инфекции, которым оказался неизвестный ранее коронавирус, получивший название SARS-CoV-2. В течение нескольких месяцев SARS-CoV-2 распространился по всему миру, став причиной пандемии, затронувшей более 200 стран. К 1 мая 2020 года количество заболевших превысило 3 млн человек, а количество погибших - 220 тыс.человек. При этом прогнозируется дальнейший рост заболеваемости и смертности, поскольку в большинстве стран эпидемия еще не достигла своего пика.
SARS-CoV-2 вызывает потенциально тяжелую острую респираторную инфекцию, которая получила название COVID-19. Для данного заболевания характерно наличие таких клинических симптомов, как повышение температуры тела (более чем в 90% случаев); кашель - сухой или с небольшим количеством мокроты (более чем в 80% случаев); отдышка (в 55% случаев); утомляемость (в 44% случаев); ощущение заложенности в грудной клетке (более чем в 20% случаев). Наиболее тяжелыми осложнениями COVID-19 являются пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др.
В настоящее время не зарегистрировано специфических средств лечения и профилактики COVID-19. В основном производится симптоматическое лечение. 1 апреля 2020 года Департамент здравоохранения Москвы издал приказ «О внедрении технологии использования свежезамороженной плазмы от доноров-реконвалесцентов COVID-19» для лечения пациентов с COVID-19 в терминальной стадии заболевания.
Реконвалесценты - это люди, организм которых успешно справился с заболеванием, и они выздоровели без осложнений. Это произошло, в частности, и потому, что их иммунная система выработала антитела, которые нейтрализуют вирус.Если ввести плазму крови реконвалесцентов, которая содержит такие антитела, другим пациентам, это может смягчить течение их болезни.
Однако, не все образцы плазмы реконвалесцентов содержат одинаковое количество вируснейтрализующих антител. Поэтому актуальным вопросом является разработка метода, который позволил бы проводить масштабный скрининг плазмы и сывороток крови доноров-реконвалесцентов COVID-19 с целью отбора наиболее перспективных для терапии образцов.
Известен способ оценки сыворотки реконвалесцентов путем определения титра вируснейтрализующих антител (Ch. Shen et al. Treatment of 5 Critically Ill Patients With COVID-19 With Convalescent Plasma. JAMA. 2020;323(16):1582-1589. doi:10.1001). Данный способ основан на том, что к клеткам Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) добавляют образцы сыворотки крови в различных разведениях и одновременно с этим заражают их коронавирусом SARS-CoV-2. Далее клетки инкубируют 37°С, 5% СО2 в течение 5 дней, затем оценивают цитопатическое действие вируса. Результат представляют как титр вируснейтрализующих антител (самое большое разведение сыворотки, которое показало ингибирующую активность SARS-CoV-2). К недостатком данного способа можно отнести длительный срок постановки анализа (5 дней) и необходимость придерживаться правил работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) II группы патогенности. Все это влечет за собой низкую производительность и высокую себестоимость данного анализа.
Кроме того, известен способ оценки плазмы реконвалесцентов путем определения титра вируснейтрализующих антител, в котором вместо коронавируса используются псевдотипированные лентивирусные частицы (PsV) (F.Wu Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications, medRxiv 2020.03.30.20047365). Данный способ включает в себя культивирование клеток 293Т/АСЕ2, к которым добавляют образцы сыворотки крови в различных разведениях и одновременно с этим вносят PsV, содержащие ген люциферазы. Через 48 часов оценивают активность люциферазы стандартным набором (Promega). Результат представляют как титр вируснейтрализующих антител (самое большое разведение сыворотки, при добавлении которого активность люциферазы уменьшается на 50%). Недостатками данного способа являются длительность процесса (48 часов), трудоемкость, необходимость в дорогом оборудовании и высококвалифицированном персонале.
Из литературных данных известно, что рецептор-связывающий домен (RBD) белка S коронавируса SARS-CoV, является основной мишенью для вируснейтрализующих антител. В публикации Z. Cao et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virol J 7, 299 (2010)) описан способ обнаружения антител к RBD в сыворотке крови пациентов, перенесших инфекцию SARS-CoV. Способ реализуется следующим образом: к адсорбированному в лунках планшета RBD-His добавляют серию разведений образцов сывороток пациентов и контрольные образцы. Связавшиеся с RBD антитела детектируют с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP). Затем добавляют субстрат для HRP и оценивают титр антител к RBD. Данный способ как наиболее близкий к заявляемому был выбран за прототип.Недостатком данного способа является то, что он не позволяет детектировать антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 в плазме крови реконвалесцентов COVID-19.
Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке быстрого способа анализа сыворотки и плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для определения образцов наиболее перспективных для терапии пациентов с COVID-19.
Раскрытие изобретения.
Задачей заявленного изобретения является создание эффективной тест-системы и способа для быстрого анализа сыворотки и плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для определения образцов сывороток и плазмы крови наиболее перспективных для терапии пациентов с COVID-19, а также способа для быстрого анализа сыворотки и плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
Технический результат представляет собой получение быстрой и эффективной тест системы для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в сокращении времени и упрощении процедуры анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Технический результат также представляет собой высокую и стабильную экспрессию рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Кроме того, технический результат заключается в неожиданно проявленном эффекте для анализа сыворотки и плазмы крови человека на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 отсутствии ложноположительных результатов у пациентов перенесших заболевание.
Технический результат достигается за счет разработки генетическая конструкции для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающий SEQ ID NO:1
Также технический результат достигается за разработки штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащего генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1
Также технический результат достигается за счет разработки способа получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, включающий:
- получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1;
- введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции;
- селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.
Также технический результат достигается за счет разработки рекомбинантного белока RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2, являющийся продуктом штамма клеток яичника китайского хомячка.
Также технический результат достигается за счет разработки способа получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающего:
- культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;
- хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;
- подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.
Также технический результат достигается за счет разработки тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющей собой набор реагентов, включающий:
- планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2;
- положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;
- отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;
- конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;
- 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;
- буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата;
- раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;
- раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;
- стоп-реагент.
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы, где:
- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят предварительно разведенные испытуемые образцы сывороток или плазмы крови человека;
- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С;
- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;
- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;
- проводят интерпретацию результатов.
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы, в соответствии с которым:
- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят серии 2х-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека;
- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С;
- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;
- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;
- проводят интерпретацию результатов.
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 (вариант 1).
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS - CoV-2 (вариант 2).
Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами, где на фиг.1 - 4 представлены результаты исследования.
Осуществление изобретения.
Краткое описание фигур.
На фиг.1
представлено схематическое изображение генетической конструкции для экспрессии рецептор-связывающего домена (RBD) вируса SARS-CoV2, где
SP - сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию белка в культуральную жидкость;
RBD - рецептор-связывающий домен RBD вируса SARS-CoV2;
His-tag - гистидиновая метка, обеспечивающая очистку белка методом аффинной хроматографии.
На фиг.2
Представлена схема плазмидного вектора р1-RBD-CoV-2, где
CMV- промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека;
генетическая конструкция - разработанная генетическая конструкция SEQ ID NO:1, экспрессирующая рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV2;
poly(A) - сигнал полиаденилирования;
EBV ori - последовательность начала репликации вируса Эпштейна-Барра;
AmpR promoter- промотор гена устойчивости к ампициллину;
Amp - ген устойчивости к ампициллину, который кодирует фермент β-лактамазу, который расщепляет β-лактамное кольцо ампициллина и некоторых других антибиотиков;
ori- последовательность начала репликации;
TK promoter - промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека;
HygroВ - ген устойчивости к Hygromicin B, который кодирует фермент фосфатазу, которая инактивирует этот антибиотик путем его фосфорилирования.
HindIII, XhoI - сайты узнавания для соответствующих рестриктаз.
На фиг.3
представлена электрофореграмма белкового препарата RBD после аффинной очистки, где
М - маркер молекулярного веса;
1.- образец белка RBD 0.75 мкг/мкл;
2.- образец белка RBD 1 мкг/мкл;
3.- образец белка RBD 0.5 мкг/мкл;
4.- образец белка RBD 0.25 мкг/мкл.
На фиг.4
представлены результаты масс спектрального анализа белкового препарата RBD после аффинной очистки, где
[М]+- распределение молекулярных масс однозарядного иона;
[М]2+- распределение молекулярных масс двузарядного иона.
В экспериментальных исследованиях установлено, что большинство антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в отношении вида коронавируcов (MERS, SARS и др.) специфически связываются с различными эпитопами рецептор-связывающего домена белка S (spike) (Hofmann H. et al. S protein of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus mediates entry into hepatoma cell lines and is targeted by neutralizing antibodies in infected patients. Journal of Virology. 2004, 78(12):6134-42; He Y. Receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein contains multiple conformation-dependent epitopes that induce highly potent neutralizing antibodies. Journal of Immunology. 2005, 174(8):4908-15; He Y. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324(2):773-81.). Установлено, что нейтрализующей активностью обладают антитела, препятствующие связыванию белка S вируса SARS-CoV-2 с рецептором ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) на клетках человека. Рецептор-связывающий домен (RBD) является структурным доменом белка S, образующим сайт связывания с рецептором ACE2, поэтому антитела способные связываться с белком RBD могут блокировать контакт с рецептором и, как следствие, препятствовать проникновению вируса в клетки человека. Поэтому введение сыворотки или плазмы доноров-реконвалесцентов COVID-19, содержащей антитела к белку RBD вируса SARS-CoV-2, пациентам с COVID-19 является перспективным средством терапии.
Таким образом, анализ сыворотки или плазмы крови доноров-реконвалесцентов COVID-19 на наличие антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2 позволит отбирать наиболее перспективные образцы сыворотки или плазмы, которые обладают терапевтическим эффектом.
В результате проведенной работы была создана генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающая SEQ ID NO:1.
Данная конструкция включает лидерный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина G человека слитый с геном RBD вируса SARS-CoV-2 и гистидиновой меткой.
Лидерные пептиды - это сигнальные последовательности, которые играют центральную роль в нацеливании и транслокации почти всех секретируемых белков и многих интегральных мембранных белков как у прокариот, так и у эукариот.От выбора сигнального пептида напрямую зависит секреция рекомбинантного белка. Использование лидерного пептида тяжелой цепи иммуноглобулина G человека позволяет обеспечить высокие уровни продукции рекомбинантного белка RBD в культуральную среду.
Гистидиновая метка - это нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 аминокислотных остатков гистидина. Данная метка необходима для последующей очистки белка на иммобилизованных металл-аффинных сорбентах. В данном методе используется способность гистидина связываться с хелатным ионом переходного металла, таким, как никель (Ni2+). Главными преимуществами использования гистидиновой метки является ее небольшой размер, легкость синтеза и отсутствие влияния на функции белка, его специфическую активность и структуру.
Кроме того, в результате проведенной работы была создан штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1 и разработан способ его получения, включающий: получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1; введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.
Также, был создан рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2 и способ его получения, включающий: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.
Кроме того, была создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющая собой набор реагентов, включающий: планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2; положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2; отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2; конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена; 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов; буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата; раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина; раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода; стоп-реагент.
Также был разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий: внесение в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 положительного контроля, отрицательного контроля, а также предварительно разведенных испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека; проведение инкубации указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение 1-кратного раствора конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение хромоген-субстратного раствора в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С; остановку пероксидазной реакции путем добавления в каждую лунку стоп-реагента; измерение оптической плотности на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм; проведение интерпретации результатов.
Особенностью данного способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 является то, что для интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают с отсекающим значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле:
Cut off=А450К- ср+3 х SD А450К-,
где: Cut off - отсекающие значения оптической плотности,
А450К- ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,
SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,
при этом образец считают положительным, если после проведения анализа оптическая плотность в лунках планшета с опытным образцом при длине волны 450 нм в 2,5 раза превышает отсекающие значения оптической плотности Cut off.
Также был разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий: внесение в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 положительного контроля, отрицательного контроля, а также серии 2х-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека; проведение инкубации указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение 1-кратного раствора конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение хромоген-субстратного раствора в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С; остановку пероксидазной реакции путем добавления в каждую лунку стоп-реагента; измерение оптической плотности на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм; проведение интерпретации результатов.
Особенностью данного способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека является то, что при интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают со значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле
Cut off=А450К- ср+3 х SD А450К-,
где: Cut off - отсекающие значения оптической плотности,
А450К- ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,
SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,
при этом титр антител определяют как наибольшее разведение образца сыворотки или плазмы крови человека, при анализе которого получают оптическую плотность при длине волны 450 нм в 2 раза превышающую отсекающие значения оптической плотности Cut off.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Разработка дизайна генетической конструкции, содержащей лидерный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, ген RBD вируса SARS-CoV-2 и гистидиновую метку.
На первом этапе работы авторы разработали дизайн генетической конструкции, позволяющей эффективно экспрессировать рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих и выполнять его хроматографическую очистку.
Для этого был выбран ген рецептор-связывающего домена (RBD) белка S коронавируса SARS-CoV-2, слитый с сигнальным пептидом тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, обеспечивающий секрецию белка в культуральную жидкость и гистидиновой меткой для очистки рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии. Таким образом, была разработана генетическая конструкция SEQ ID NO:1.
Схема генетической конструкции и представлена на Фиг.1. Разработанная генетическая конструкция была синтезирована в ЗАО «Евроген». Таким образом, была получена конструкция pAL-TA-RBD-CoV-2.
Далее с помощью методов генной инженерии разработанная генетическая конструкция из pAL-TA-RBD-CoV-2 была клонирована с использованием эндонуклеаз рестрикции HindIII и XhoI в плазмидный вектор для эписомальной экспрессии в клеточных линиях млекопитающих, и полученная плазмида была названа p1-RBD-CoV-2 (Фиг.2). Далее полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах и очищали при помощи коммерческого набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген /кат.№BC124).
Таким образом, в результате проведенной работы была получена плазмида p1-RBD-CoV-2, обеспечивающая экспрессию гена RBD вируса SARS-CoV-2.
Пример 2. Получение штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 был получен на основе клеточной линии CHO-S. Это коммерческая клеточная линия на основе клеток яичника китайского хомячка СНО, адаптированная к культивированию в плотной суспензии в специальной культуральной среде для повышенной экспрессии белка.
Клетки CHO-S культивировали в шейкер-инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин в питательной среде HyClone HyCell TransFx-C transfection media (GE Healthcare, США) с добавлением 8 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), до достижения плотности 2*106 кл/мл 1 литр суспензии. Далее полученную суспензию трансфицировали плазмидным вектором p1-RBD-CoV-2, содержащим генетическую конструкцию SEQ ID NO:1, при помощи 1 мг/мл реагента Polyethylenimine (Polyscience, США) согласно инструкции производителя. Затем в течение 2 недель проводили селекцию трансфицированных клеток на антибиотике гигромицин Б. Данный антибиотик был выбран, поскольку плазмидный вектор p1-RBD-CoV-2 содержит ген устойчивости к антибиотику Hygromycin B.
Таким образом, в результате проведенной работы впервые был получен штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. При этом продукция указанного белка составляет от 5 мг/л до 10 мг/л.
Пример 3. Способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 с помощью созданного штамма-продуцента.
Разработанный способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 включает следующие этапы:
1) культивирование штамма-продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2
2) отбор культуральной среды
3) хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
4) подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Культивирование клеток штамма-продуцента проводили в течение 7 дней в Шейкер-инкубаторе Multitron (Infors HT, Швейцария) при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин. Ежедневно определяли выживаемость клеток в суспензии при помощи счетчика клеток TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, США). По истечении 7 дней культивирования клеточную суспензию осаждали центрифугированием 5000 об/мин. Культуральную жидкость осветляли при помощи фильтрации через шприцевые фильтры Millipore Express (PES) HP 0.45 мкм (Merckmillipore, Германия).
Далее проводили хроматографическую очистку белка из осветленной культуральной жидкости на приборе AKTA start (GE Healthcare, США). К прибору подключали хроматографическую колонку HisTag HP protein purification column (5 мл) и уравновешивали буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4). Далее осветленную культуральную жидкость (100 мл) разбавляли в несколько раз буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4) и наносили на уравновешенную колонку со скоростью 5 мл/мин. После окончания нанесения, колонку промывали 100 мл буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4) со скоростью 5 мл/мин. После окончания промывки связавшийся белок элюировали с колонки буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 500 мМ иммидазол, рН=7.4) со скоростью 1 мл/мин. Так проводили 10 очисток по 100 мл. Фракции после очистки замораживали при температуре -20°С.Фракции после первичной очистки размораживали при комнатной температуре и концентрировали при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra -50, -10K (Millipore, Ирландия) до концентрации белка 1-2 мг/мл. Концентрацию белка измеряли при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000c. Далее колонку HiTrap desalting column уравновешивали буфером (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия) на скорости 5 мл/мин. После уравновешивания скорость потока снижали до 1 мл/мин. Препарат с концентрацией 1-2 мг/мл наносили на колонку через шприц в объеме 1 мл. Собирали первый пик по UV280 соответствующий целевому рекомбинантному белку RBD. Суммарно проводили 5-10 циклов очистки. Полученные после второй стадии очистки фракции препарата объединяли и измеряли концентрацию белка на спектрофотометре Nanodrop 2000c. Далее препарат доводили буфером (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия) до концентрации 1 мг/мл, разливали по 1 мл и хранили при температуре -20°С.
Выход рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 после хроматографической очистки составил от 5 мг до 10 мг с литра культуральной среды (по результатам трех независимых экспериментов). Что является показателем эффективности разработанного способа получения, так как белки коронавируса относятся к группе сложнополучаемых в традиционных системах бактериальной экспрессии.
Подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 проводили при помощи белкового электрофореза в полиакриламидном геле, а также масс-спектрометрического анализа.
Для проведения белкового электрофореза готовили 12%-ный разделяющий полиакриламидный гель и 6%-ный фокусирующий полиакриламидный гель. Образцы очищенного рекомбинантного белка RBD разводили до различной концентрации (1 мкг/мкл, 0.75 мкг/мл, 0.5 мкг/мкл, 0.25 мкг/мл) буфером образца с содержанием В-меркаптоэтанола. Далее образцы прогревали при температуре 98°С в течении 5 мин и вносили в гель. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad, США, кат.№165-8000). Далее гель окрашивали реагентом EZBlue™ Gel Staining Reagent (Sigma-Aldrich, США, кат.№G1041) и проявляли при помощи гель-документирующей системы Gel Doc EZ system (Bio-Rad, США). Результаты электрофореграммы представлены на Фиг.3.
По результатам электрофореграммы подвижность рекомбинантного белка RBD в денатурирующих условиях соответствовала ≈30 кДа, что обусловлено его гликозилированием (масса аминокислотной последовательности без учета гликозилирования составляет около 25кДа). Таким образом, при первичном анализе препарата были подтверждена его ожидаемая молекулярная масса.
Более детальное подтверждение подлинности препарата осуществляли при помощи масс-спектрометрического анализа по следующей схеме:
1. Гидролиз белка трипсином в растворе.
25 мкг рекомбинантного белка RBD растворяли в 20 mM бикарбонате аммония и добавляли до 100 мкл 25 мМ бикарбоната аммония (рH 8,3). В полученную реакционную смесь добавляли последовательно 1 мкл 1M ДТТ и 10 мкл 110 mM йодацетамида. После проведения реакции (56°С, 30 мин в темноте) к смеси добавляли 4 мкл 1M ДТТ для нейтрализации не связавшегося иодацетамида. К оставшейся части добавляли только трипсин, при этом, в обоих случаях соотношение белок: фермент составляло 25: 1. Реакцию вели при 37°С в течение 17 ч. Полученную реакционную смесь высушивали досуха с помощью вакуумного концентратора (Savant SPD121P, Thermo Scientific, США) и растворяли в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Образец обессоливали на колонках, содержащих обращено фазовую мембрану (аналог С18), образец элюировали 90% раствором ацетонитрила в воде. Для нанесения брали 4 мкл образца в 90% ацетонитриле и смешивали их с 1 мкл насыщенного раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты в 30%-ном растворе ацетонитрила, содержащем 0,5% ледяной уксусной кислоты по объему, на стальной мишени, которую затем подсушивали на воздухе при комнатной температуре.
2. MALDI-масс-спектрометрический анализ.
Анализ пептидов проводили на время-пролетном MALDI-масс-спектрометре Ultraflextreme («Bruker Daltonics», Германия). Детектирование положительных ионов проводили в режиме рефлектрона при напряжениях: на ионном источнике IS1 – 20,12 кВ, IS2 – 17,82 кВ; на линзах – 7,47 кВ, рефлектроне Ref1 – 21,07 кВ, Ref2 – 10,80 кВ. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 650 до 5000 Th. В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолитических фрагментов трипсина и кератина, которые исключались из окончательных списков детектируемых масс.
3. Анализ данных масс-спектрометрии.
Обработка масс-спектров проводилась с помощью программного обеспечения Flex Analysis 3.4 (Bruker Daltonik GMBH, Германия). К масс-спектрам применялись сглаживание по алгоритму Savizky Golay (ширина 0,2 m/z, 1цикл), и вычитание базовой линии согласно алгоритму TopHat. Использовались следующие параметры детекции пиков: алгоритм детекции пиков - SNAP2, соотношение сигнал/шум - 3, максимальное число пиков в спектре - 500). Поиск и идентификация белков методом «пептидного отпечатка» («peptide mass fingerprint») осуществляли с помощью программного комплекса Proteinscape (версия 4, «Bruker Daltonik GMBH, Германия), использовались следующие параметры поиска: точность определения массы - 50 ppm; возможные посттрансляционные модификации - окисление метионина, гистидина, триптофана.
В результате масс-спектрального анализа было продемонстрировано, что рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 присутствует в растворе в виде одно и двухзарядного иона, и имеет молекулярную массу 31кДа, что четко коррелирует с данными электрофореза (Фиг.4).
Результаты исследования рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 при помощи белкового электрофореза в полиакриламидном геле, а также масс-спектрометрического анализа убедительно доказали его подлинность.
Таким образом, в результате проведенной работы впервые был получен рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2. Данный белок образует стабильную складчатую структуру.
Пример 5. Тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с использованием рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Авторами впервые была создана тест-система на основе иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, в которой рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2, полученный с помощью штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 (примеры 1-3), является мишенью для антител, выявляемых в крови реконвалесцентов COVID-19.
Тест-система представляет собой набор реагентов, включающий:
1) планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2;
2) положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2;
3) отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2;
4) конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;
5) 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;
6) буфер для разведения, содержащий буферный раствор для разведения сыворотки или плазмы и конъюгата;
7) раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;
8) раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;
9) стоп-реагент, содержащий 1 М раствор серной кислоты.
Пример 6. Способ применения тест-системы для иммуноферментного анализа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа (описанной в примере 5) для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов, наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Наиболее перспективными для терапии являются образцы сыворотки или плазмы крови, которые содержат вируснейтрализующие антитела. Из литературных данных известно, что белок RBD коронавирусов является одной из основных мишеней для вируснейтрализующих антител Z. Cao et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virol J 7, 299 (2010)).
В данном исследовании был проведен сравнительный анализ 218 образцов реконвалесцентной плазмы и сыворотки крови пациентов, перенесших COVID-19. Каждый образец был исследован с помощью разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа (описанной в примере 5) и проанализирован на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) методом прямой вируснейтрализации вируса SARS-CoV-2 на культуре клеток.
Иммуноферментный анализ с использованием разработанной тест системы был проведен согласно следующему протоколу.
1. Приготовление рабочих растворов.
Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).
Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать. (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).
1. Проведение анализа.
1.1 Внести контрольные и испытуемые образцы сывороток
Освободить планшет из упаковки и внести в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.
В остальные лунки планшета внести по 90 мкл буфера для разведения, а затем добавить по 10 мкл, предварительно разведенных в 20 раз испытуемых образцов (по две лунки на каждый образец).
Планшет заклеить пленкой и выдержать в течение 1 ч при температуре от+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.2 Промывание.
После окончания инкубации удалить жидкость из лунок и промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов, на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость окончательно удалить и подсушить планшет постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
2. 3 Внесение конъюгата.
В каждую лунку внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрыть липкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.4 Промывание.
После окончания инкубации промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.
2.5 Внесение хромоген-субстратного раствора.
В каждую лунку внести по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировать в течение 15 минут в темном месте при температуре от+20°С.
2.6 Остановка пероксидазной реакции.
Остановить реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провести учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.
2.8. Регистрация результатов
Измерить величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А450) в течение 10 мин после остановки реакции.
Вычислить среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (А450К-) и положительного (А450К+) контролей по формулам 1 и 2.
А450 К- ср=(А450 К- 1+А450А К- 2)/2 (1)
где:
- А450 К- 1 - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,
- А450 К- 2 - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.
А450 К+ ср=(А450 К+ 1+А450А К+ 2)/2 (2)
где:
- А450 К+ 1 - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,
- А450 К+ 2 - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.
Вычислить среднее значение А450 для каждой опытной пробы (А450ОПср) по формуле 3:
А450ОПср=(А450ОП1+А450ОП2)/2 (3)
где:
- А450ОП1 - значение оптической плотности пробы 1,
- А450ОП2 - значение оптической плотности пробы 2.
При этом результаты измерения, полученные на контрольных образцах, должны удовлетворять следующим требованиям:
1. Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А450К+ ср) - не менее 0,6;
2. Значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А450К- ср) - менее 0,2.
При получении иных показателей исследование необходимо повторить.
2.9 Интерпретация результатов.
Для интерпретации результатов вычисляют отсекающие значения оптической плотности А450 (Cut off).
Значение Cut off вычисляют по формуле:
Cut off=А450К- ср+3 х SD А450К-,
где:
- SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается положительным, если А450ОПср выше, чем значение Cut off в 2,5 раза.
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А450ОПср не превышает значение значение Cut off в 2,5 раза.
Реакцию вируснейтрализации ставили в варианте: постоянная доза вируса - разведения сыворотки или плазмы крови.
В лунки планшета вносили 2х-кратные разведения сыворотки или плазмы крови начиная с разведения 1/20 до 1/1280 в объеме 50 мкл/лунку в 3 повторах.
В отдельные лунки вносят контрольные образцы:
- разведения контрольной плазмы с известным титром ВНА по 50 мкл/лунку (контроль проведения) в 3 повторах.
- по 50 мкл контрольной негативной плазмы (не обладающей вируснейтрализующей активностью) в разведении 1/20, в 3 повторах (контроль плазмы).
- по 100 мкл ростовой среды в 3 повторах (РС) (контроль клеток).
- по 50 мкл РС и 50 мкл вируссодержащей суспензии с концентрацией 2000 TCID(tissue culture infective dose 50/мл (контроль дозы вируса) в 3 повторах.
Далее во все лунки, кроме контроля клеток, вносили по 50 мкл вируссодержащей суспензии с концентрацией 2000 TCID50/мл.
В качестве контроля вирусной активности (Контроль вируса) в отдельные лунки планшета вносили разведения вируссодержащей суспензии (внутренний контроль вносимых доз вируса при исследования нейтрализующей активности плазмы).
Далее планшет инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С в течение 60 минут.
Затем во все лунки планшета инокулировали по 20000 клеток Vero E6 в объеме 100 мкл/лунку (концентрация клеток 2×105 клеток/мл) в свежеприготовленной РС. Планшеты с клетками инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С в течение 96 часов до полного проявления цитопатического действия вируса в вирусном контроле в ожидаемом диапазоне.
Оценку вирусной продукции по цитопатическому действию (ЦПД) осуществляли на основе анализа жизнеспособности клеток при помощи микроскопирования, с целью визуального определения границы вирусного повреждения клеток.
Вируснейтрализующую активность плазмы/сыворотки оценивали визуально под микроскопом через 96 часов после инфицирования по ингибированию ЦПД вируса в культуре клеток Vero E6. Каждое из разведений плазмы/сыворотки испытывали в трех параллельных лунках. Результатом исследования являлось заключение о нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток Vero E6 при воздействии плазмы/сыворотки крови. За титр ВНА исследуемой плазмы/сыворотки принимали высшее ее разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2 лунках из 3.
Результаты сравнительного анализа образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 с помощью двух методов: иммуноферментного анализа на антитела к рекомбинантному белку RBD с помощью разработанной тест-системы и на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) методом прямой вируснейтрализации коронавируса SARS-CoV-2 на культуре клеток представлены в таблице 1. Результаты зависимости оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА распределились следующим образом (Таблица 2).
Таблица 1. Результаты сравнительного анализа образцов плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19
Таблица 1.
| № | Титр вируснейтралиующих антител, 1/ | Значение оптической плотности образца при разведении в 200 раз (OD450) |
| 1 | 320 | 2,87 |
| 2 | 1280 | 2,85 |
| 3 | 320 | 2,78 |
| 4 | 1280 | 2,75 |
| 5 | 640 | 2,72 |
| 6 | 640 | 2,70 |
| 7 | 128 | 2,34 |
| 8 | 1024 | 2,26 |
| 9 | 40 | 2,02 |
| 10 | 128 | 1,93 |
| 11 | 512 | 1,88 |
| 12 | 640 | 1,87 |
| 13 | 40 | 1,83 |
| 14 | 1024 | 1,80 |
| 15 | 320 | 1,76 |
| 16 | 80 | 1,75 |
| 17 | 320 | 1,74 |
| 18 | 320 | 1,74 |
| 19 | 128 | 1,69 |
| 20 | 128 | 1,56 |
| 21 | 160 | 1,56 |
| 22 | 128 | 1,51 |
| 23 | 320 | 1,49 |
| 24 | 160 | 1,47 |
| 25 | 1024 | 1,46 |
| 26 | 80 | 1,45 |
| 27 | 40 | 1,43 |
| 28 | 80 | 1,43 |
| 29 | 80 | 1,42 |
| 30 | 1024 | 1,42 |
| 31 | 160 | 1,34 |
| 32 | 256 | 1,39 |
| 33 | 1280 | 1,38 |
| 34 | 64 | 1,33 |
| 35 | 160 | 1,32 |
| 36 | 320 | 1,32 |
| 37 | 160 | 1,30 |
| 38 | 80 | 1,17 |
| 39 | 160 | 1,16 |
| 40 | 256 | 1,15 |
| 41 | 128 | 1,14 |
| 42 | 128 | 1,13 |
| 43 | 160 | 1,12 |
| 44 | 160 | 1,10 |
| 45 | 16 | 1,09 |
| 46 | 256 | 1,09 |
| 47 | 160 | 1,08 |
| 48 | 256 | 1,08 |
| 49 | 640 | 1,06 |
| 50 | 256 | 1,06 |
| 51 | 320 | 1,05 |
| 52 | 80 | 1,05 |
| 53 | 256 | 1,04 |
| 54 | 160 | 1,03 |
| 55 | 128 | 1,02 |
| 56 | 128 | 1,00 |
| 57 | 64 | 0,99 |
| 58 | 40 | 0,98 |
| 59 | 20 | 0,97 |
| 60 | 64 | 0,97 |
| 61 | 40 | 0,97 |
| 62 | 512 | 0,95 |
| 63 | 256 | 0,94 |
| 64 | 32 | 0,93 |
| 65 | 40 | 0,91 |
| 66 | 40 | 0,89 |
| 67 | 20 | 0,85 |
| 68 | 20 | 0,84 |
| 69 | 80 | 0,84 |
| 70 | 128 | 0,83 |
| 71 | 16 | 0,82 |
| 72 | 64 | 0,82 |
| 73 | 64 | 0,81 |
| 74 | 256 | 0,81 |
| 75 | 320 | 0,80 |
| 76 | 40 | 0,78 |
| 77 | 128 | 0,78 |
| 78 | 20 | 0,78 |
| 79 | 16 | 0,78 |
| 80 | 20 | 0,75 |
| 81 | 256 | 0,74 |
| 82 | 256 | 0,74 |
| 83 | 16 | 0,72 |
| 84 | 20 | 0,72 |
| 85 | 20 | 0,72 |
| 86 | 64 | 0,72 |
| 87 | 20 | 0,71 |
| 88 | 20 | 0,71 |
| 89 | 16 | 0,70 |
| 90 | 40 | 0,70 |
| 91 | 20 | 0,68 |
| 92 | 1024 | 0,68 |
| 93 | 32 | 0,68 |
| 94 | 80 | 0,68 |
| 95 | 20 | 0,65 |
| 96 | 16 | 0,65 |
| 97 | 20 | 0,64 |
| 98 | 64 | 0,64 |
| 99 | 20 | 0,64 |
| 100 | 20 | 0,63 |
| 101 | 16 | 0,63 |
| 102 | 40 | 0,63 |
| 103 | 32 | 0,62 |
| 104 | 20 | 0,62 |
| 105 | 20 | 0,61 |
| 106 | 64 | 0,61 |
| 107 | 40 | 0,60 |
| 108 | 32 | 0,60 |
| 109 | 640 | 0,59 |
| 110 | 64 | 0,59 |
| 111 | 40 | 0,57 |
| 112 | 20 | 0,57 |
| 113 | 20 | 0,57 |
| 114 | 20 | 0,56 |
| 115 | 128 | 0,55 |
| 116 | 32 | 0,55 |
| 117 | 320 | 0,54 |
| 118 | 64 | 0,52 |
| 119 | 16 | 0,51 |
| 120 | 256 | 0,51 |
| 121 | 20 | 0,51 |
| 122 | 20 | 0,51 |
| 123 | 64 | 0,50 |
| 124 | 16 | 0,50 |
| 125 | 20 | 0,50 |
| 126 | 64 | 0,49 |
| 127 | 80 | 0,49 |
| 128 | 20 | 0,48 |
| 129 | 32 | 0,48 |
| 130 | 20 | 0,46 |
| 131 | 16 | 0,45 |
| 132 | 20 | 0,45 |
| 133 | 640 | 0,45 |
| 134 | 20 | 0,44 |
| 135 | 20 | 0,44 |
| 136 | 80 | 0,44 |
| 137 | 20 | 0,43 |
| 138 | 64 | 0,43 |
| 139 | 20 | 0,42 |
| 140 | 20 | 0,42 |
| 141 | 20 | 0,42 |
| 142 | 20 | 0,41 |
| 143 | 20 | 0,41 |
| 144 | 80 | 0,41 |
| 145 | 20 | 0,39 |
| 146 | 160 | 0,39 |
| 147 | 20 | 0,38 |
| 148 | 16 | 0,38 |
| 149 | 160 | 0,35 |
| 150 | 32 | 0,35 |
| 151 | 20 | 0,35 |
| 152 | 32 | 0,35 |
| 153 | 20 | 0,34 |
| 154 | 16 | 0,33 |
| 155 | 20 | 0,32 |
| 156 | 16 | 0,32 |
| 157 | 16 | 0,32 |
| 158 | 32 | 0,32 |
| 159 | 16 | 0,32 |
| 160 | 16 | 0,31 |
| 161 | 16 | 0,31 |
| 162 | 20 | 0,30 |
| 163 | 20 | 0,30 |
| 164 | 32 | 0,30 |
| 165 | 16 | 0,30 |
| 166 | 32 | 0,29 |
| 167 | 32 | 0,27 |
| 168 | 128 | 0,27 |
| 169 | 32 | 0,27 |
| 170 | 20 | 0,26 |
| 171 | 16 | 0,26 |
| 172 | 64 | 0,25 |
| 173 | 20 | 0,24 |
| 174 | 32 | 0,24 |
| 175 | 32 | 0,23 |
| 176 | 16 | 0,23 |
| 177 | 16 | 0,22 |
| 178 | 16 | 0,21 |
| 179 | 16 | 0,21 |
| 180 | 32 | 0,21 |
| 181 | 16 | 0,21 |
| 182 | 16 | 0,21 |
| 183 | 20 | 0,21 |
| 184 | 20 | 0,20 |
| 185 | 16 | 0,20 |
| 186 | 32 | 0,20 |
| 187 | 16 | 0,19 |
| 188 | 1024 | 0,19 |
| 189 | 16 | 0,19 |
| 190 | 40 | 0,18 |
| 191 | 16 | 0,18 |
| 192 | 20 | 0,18 |
| 193 | 16 | 0,18 |
| 194 | 16 | 0,18 |
| 195 | 16 | 0,17 |
| 196 | 16 | 0,16 |
| 197 | 32 | 0,16 |
| 198 | 16 | 0,15 |
| 199 | 32 | 0,14 |
| 200 | 16 | 0,13 |
| 201 | 16 | 0,13 |
| 202 | 32 | 0,13 |
| 203 | 32 | 0,13 |
| 204 | 0 | 0,13 |
| 205 | 16 | 0,12 |
| 206 | 32 | 0,12 |
| 207 | 64 | 0,12 |
| 208 | 32 | 0,11 |
| 209 | 16 | 0,11 |
| 210 | 0 | 0,10 |
| 211 | 16 | 0,08 |
| 212 | 16 | 0,08 |
| 213 | 16 | 0,08 |
| 214 | 32 | 0,07 |
| 215 | 160 | 0,07 |
| 216 | 128 | 0,07 |
| 217 | 16 | 0,07 |
| 218 | 0 | 0,06 |
Таблица 2. Распределение зависимости оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА.
Таблица 2.
| Значение оптической плотности образца при разведении в 200 раз (OD450) | Титр ВНА от 1/64 и выше | Титр ВНА ниже 1/64 |
| 1,1 - 2,8 | 94% | 6% |
| 0,72 - 1 | 65% | 35% |
| 0,3-0,7 | 29% | 71% |
| До 0,2 | 3,8% | 96,2 |
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы для анализа сыворотки или плазмы крови пациентов, перенесших COVID-19 и обладающих вируснейтрализующей активностью (титр 1/64 и выше), составляет от 96,8%. Установлена корреляция между уровнем оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА, представленная в таблице 2. А время проведения анализ составляет 2,5 часа.
Пример 7. Способ применения разработанной тест-системы для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ применения разработанной тест-системы (пример 5) для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
Для исследования было отобрано 10 образцов плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19.
Иммуноферментный анализ с использованием разработанной тест системы был проведен согласно следующему протоколу.
1. Приготовление рабочих растворов.
Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).
Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать. (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).
2. Проведение анализа.
2.1 Внести контрольные и испытуемые образцы сывороток
Освободить планшет из упаковки и внести в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.
В остальные лунки планшета внести серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец).
Планшет заклеить пленкой и выдержать в течение 1 ч при температуре от+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.2 Промывание.
После окончания инкубации удалить жидкость из лунок и промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов, на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость окончательно удалить и подсушить планшет постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
2. 3 Внесение конъюгата.
В каждую лунку внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрыть липкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.4 Промывание.
После окончания инкубации промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.
2.5 Внесение хромоген-субстратного раствора.
В каждую лунку внести по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировать в течение 15 минут в темном месте при температуре от+20°С.
2.6 Остановка пероксидазной реакции.
Остановить реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провести учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.
2.8. Регистрация результатов
Измерить величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А450) в течение 10 мин после остановки реакции.
Вычислить среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (А450К-) и положительного (А450К+) контролей по формулам 1 и 2.
А450К- ср=(А450К- 1+А450А К- 2)/2 (1)
где:
- А450К- 1 - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,
- А450К- 2 - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.
А450К+ ср=(А450К+ 1+А450А К+ 2)/2 (2)
где:
- А450К+ 1 - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,
- А450К+ 2 - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.
Вычислить среднее значение А450 для каждой опытной пробы (А450ОПср) по формуле 3:
А450ОПср=(А450ОП1+А450ОП2)/2 (3)
где:
- А450ОП1 - значение оптической плотности пробы 1,
- А450ОП2 - значение оптической плотности пробы 2.
При этом результаты измерения, полученные на контрольных образцах, должны удовлетворять следующим требованиям:
1. Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А450К+ ср) - не менее 0,6;
2. Сзначение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А450К- ср) - менее 0,2.
При получении иных показателей исследование необходимо повторить.
2.9 Интерпретация результатов.
Для интерпретации результатов вычисляют отсекающие значения оптической плотности А450 (Cut off).
Значение Cut off вычисляют по формуле:
Cut off=А450К- ср+3 х SD А450К-,
где:
- SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.
Титр антител вычисляли как последнее разведение образца, в котором А450ОПср выше, чем значение Cut off в 2 раза
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 3.
Таблица 3. Титры антител к RBD в образцах плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19.
Таблица 3.
| Номер пациента | Титр антител к RBD |
| 1 | 1:512 |
| 2 | 1:256 |
| 3 | 1:64 |
| 4 | 1:32 |
| 5 | 1:256 |
| 6 | 1:128 |
| 7 | 1:512 |
| 8 | 1:256 |
| 9 | 1:128 |
| 10 | 1:256 |
Таким образом, результаты проведенного исследования, доказывают, что разработанная тест-система может быть использована для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
Специалисту среднего уровня понятно, что данная тест система может также использоваться для детекции антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови людей, для оценки напряженности иммунного ответа после введения вакцины, содержащей своем составе рецептор-связывающий домен RBD вируса SARS-CoV-2 или его ген.
Пример 8 Сравнение тест-систем для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с различными вариантами адсорбированных белков коронавируса по их способности неспецифически определять антитела против сезонного коронавируса человека ОС43.
Задача данного эксперимента заключалась в сравнении нескольких тест-систем для иммуноферментного анализа, основанных на использовании рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 (разработанная тест-система), или рекомбинантного полноразмерного белка S вируса SARS-CoV-2, или разрушенного вируса SARS-CoV-2, по их способности неспецифически связываться с антителами к сезонному коронавирусу ОС43, который циркулирует в популяции человека.
На первом этапе полноразмерный белок S вируса SARS-CoV-2, или вирус SARS-CoV-2, инактивированный нагреванием при температуре 56°С в течении 30 мин и разрушенный воздействием УЗ (в течение 1 минуты на ультразвуковом гомогенизаторе soniprep 150 Plus, MSE), наносили в лунки планшетов для иммуноферментного анализа в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл и адсорбировали ночь при температуре+4°С.
Таким образом, к началу эксперимента было подготовлено 3 планшета:
1. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2, являющийся частью разработанной тест-системы (пример 5);
2. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2;
3. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука.
Затем подготовили рабочие растворы необходимые для анализа (тест-система пример 5).
Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).
Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).
Далее в лунки каждого из 3 планшетов нанесли:
1) положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2 (тест-система, пример 5) в 2 повторах по 100 мкл;
2) отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2 (тест-система, пример5) в 2 повторах по 100 мкл;
3) образцы сыворотки крови пациентов, которые перенесли заболевание, вызванное сезонным коронавирусом ОС43, но при этом не болели COVID-19 (10 образцов), разведенные в 200 раз в 2 повторах по 100 мкл.
Далее все планшеты заклеили пленкой и выдержали в течение 1 ч при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
После окончания инкубации удалили жидкость из лунок и промыли планшеты 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов. Затем жидкость окончательно удалили и подсушили планшеты постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
Далее в каждую лунку внесли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшеты закрыли липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
После окончания инкубации промыли планшеты 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.
Затем в каждую лунку всех 3 планшетов внесли по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от 20°С
После этого остановили реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провели учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.
Далее измерили величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А450) в течение 10 мин после остановки реакции.
Вычислили среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (А450К-) и положительного (А450К+) контролей для каждого планшета по формулам 1 и 2.
А450 К- ср=(А450 К- 1+А450А К- 2)/2 (1)
где:
- А450 К- 1 - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,
- А450 К- 2 - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.
А450 К+ ср=(А450 К+ 1+А450А К+ 2)/2 (2)
где:
- А450 К+ 1 - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,
- А450 К+ 2 - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.
Вычислили среднее значение А450 для каждой опытной пробы (А450ОПср) по формуле 3:
А450ОПср=(А450ОП1+А450ОП2)/2 (3)
где:
- А450 ОП1 - значение оптической плотности пробы 1,
- А450 ОП2 - значение оптической плотности пробы 2.
Для интерпретации результатов вычислили отсекающие значения оптической плотности А450 (Cut off).
Значение Cut off вычислили по формуле:
Cut off=А450К- ср+3 х SD А450К-,
где:
- SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А450ОПср выше, чем значение Cut off в 2,5 раза.
Для планшета с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2:
Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А450К+ ср) составило 1,960.
Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А450К- ср) составило 0,052.
Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.
Значение Cut off составляет:
Cut off=0,052+3 х 0,0000125=0,052038
В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А450ОПср было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,052038=0,13).
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А450ОПср не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,052038=0,13).
Для планшета с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2:
Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А450К+ ср) составило 2,008.
Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А450К- ср) составило 0,064.
Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.
Значение Cut off составляет:
Cut off=0,064+3 х 0,0001805=0,064542
В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А450ОПср было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,064542=0,16).
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А450ОПср не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,064542=0,16).
Для планшета с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука:
Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А450К+ ср) составило 2,081
Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А450К- ср) составило 0,061.
Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.
Значение Cut off составляет:
Cut off=0,061+3 х 0,0001325=0,0613975.
В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А450ОПср было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,0613975=0,15).
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А450ОПср не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,0613975=0,15).
Полученные результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Средняя оптическая плотность опытных и контрольных образцов, полученная в результате проведения сравнительного анализа тест-систем для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с различными вариантами адсорбированных белков коронавируса по их способности неспецифически определять антитела против сезонного коронавируса человека ОС43.
Таблица 4.
| Исследуемый образец | RBD | Полноразмерный белок S | Вирус SARS-CoV-2 |
| 1 | 0,055 | 0,159 | 0,132 |
| 2 | 0,060 | 0,493 | 0,519 |
| 3 | 0,053 | 0,152 | 0,414 |
| 4 | 0,054 | 0,142 | 0,117 |
| 5 | 0,055 | 0,268 | 0,436 |
| 6 | 0,055 | 0,143 | 0,134 |
| 7 | 0,048 | 0,065 | 0,136 |
| 8 | 0,048 | 0,351 | 0,581 |
| 9 | 0,049 | 0,130 | 0,090 |
| 10 | 0,049 | 0,159 | 0,281 |
| K- | 0,052 | 0,064 | 0,061 |
| K+ | 1,960 | 2,008 | 2,081 |
Неожиданно было выявлено, что использование разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 (тест-система по примеру 5) для анализа сыворотки и плазмы крови человека на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 не дает ложноположительных результатов у пациентов перенесших заболевание, вызванное сезонным коронавирусом человека ОС43, тогда как при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S наблюдалось 30% ложноположительных результатов, а при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука наблюдалось 50% ложноположительных результатов.
Результаты проведенного исследования можно объяснить тем, что полученный авторами рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 имеет низкий процент гомологии с вирус-связывающим доменом белка S вируса ОС43. Таким образом, использование рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 (по сравнению с полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2 или разрушенным вирусом SARS-CoV-2) в тест-системе для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека для определения антител к вирусу SARS-CoV-2 приведет к получению более точных и достоверных результатов.
Пример 9. Оценка результатов, полученных при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека в различных экспериментальных условиях.
В данном исследовании использовали тест-систему для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека (пример 5), в качестве исследуемого образца выбрали плазму крови человека с известным титром антител против белка RBD вируса SARS-CoV-2 (1:512). Была проведена серия экспериментов, в которых анализ титра антител против белка RBD вируса SARS-CoV-2 проводился по протоколу, описанному в примере 7, за исключением 1 параметра, который был изменен.
Эксперимент №1. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7 (контроль).
Эксперимент №2. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+36°С.
Эксперимент №3. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+38°С.
Эксперимент №4. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила+36°С.
Эксперимент №5. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с коньюгатом, которая составила+38°С.
Эксперимент №6. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с хромогеном, которая составила+15°С.
Эксперимент №7. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+25°С.
Эксперимент №8. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №9. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 350 оборотов/минуту.
Эксперимент №10. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №11. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 350 оборотов/минуту.
Полученные результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5. Титр антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2, полученный в экспериментах №1-11.
Таблица 5.
| Эксперимент № | |||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Титр IgG к белку RBD |
1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 | 1:512 |
Как видно из представленных данных, изменение температуры, скорости перемешивания при инкубации с исследуемыми образцами и антителами, а также температуры при инкубации с хромогеном в указанном диапазоне значений, не влияет на полученный результат.
Кроме того, была проведена серия экспериментов, в котором разработанная тест система (пример 5) использовалась для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов, наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Эксперименты проводили по протоколу, описанному в примере 6, за исключением 1 параметра, который был изменен.
Эксперимент №12. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6 (контроль).
Эксперимент №13. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+36°С.
Эксперимент №14. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+38°С.
Эксперимент №15. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила+36°С.
Эксперимент №16. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с коньюгатом, которая составила+38°С.
Эксперимент №17. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с хромогеном, которая составила+15°С.
Эксперимент №18. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+25°С.
Эксперимент №19. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №20. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 350 оборотов/минуту.
Эксперимент №21. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №22. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 350 оборотов/минуту.
Полученные результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6. Среднее значение оптической плотности опытного образца (A450ОПср) при длине волны 450 нм, полученное в серии экспериментов №12-22.
Таблица 6.
| Эксперимент № | |||||||||||
| 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | |
| A450 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 | 1,69 |
Как видно из представленных данных, изменение температуры, скорости перемешивания при инкубации с исследуемыми образцами и антителами, а также температуры при инкубации с хромогеном в указанном диапазоне значений, не влияет на полученный результат.А время проведения анализ составляет 2,5 часа.
Таким образом, разработаны генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 и способ его получения, а также тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, которая позволяет быстро и эффективно проводить тест для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Claims (55)
1. Генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающая SEQ ID NO:1.
2. Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1.
3. Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD по п. 2, включающий:
- получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1;
- введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции;
- селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.
4. Рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2, являющийся продуктом штамма по п. 2.
5. Способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 по п. 4, включающий:
- культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD по п. 2;
- хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;
- подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.
6. Тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющая собой набор реагентов, включающий:
- планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2;
- положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;
- отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;
- конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;
- 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;
- буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата;
- раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;
- раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;
- стоп-реагент.
7. Способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы по п. 6, где:
- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2, вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят предварительно разведенные испытуемые образцы сывороток или плазмы крови человека;
- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15°С до +25°С;
- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;
- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;
- проводят интерпретацию результатов.
8. Способ для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы по п. 6, в соответствии с которым:
- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2, вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят серии 2-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека;
- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15ºС до +25ºС;
- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;
- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;
- проводят интерпретацию результатов.
9. Способ по п. 7, в котором для интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают с отсекающим значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле
Cut off = А450К- ср + 3 х SD А450К-,
где:
Cut off - отсекающие значения оптической плотности,
А450К- ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,
SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,
при этом образец считают положительным, если после проведения анализа оптическая плотность в лунках планшета с опытным образцом при длине волны 450 нм в 2,5 раза превышает отсекающие значения оптической плотности Cut off.
10. Способ по п. 8, в котором при интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают со значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле
Cut off = А450К- ср + 3 х SD А450К-,
где:
Cut off - отсекающие значения оптической плотности,
А450К- ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,
SD А450К- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,
при этом титр антител определяют как наибольшее разведение образца сыворотки или плазмы крови человека, при анализе которого получают оптическую плотность при длине волны 450 нм, в 2 раза превышающую отсекающие значения оптической плотности Cut off.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020116437A RU2723008C9 (ru) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
| PCT/RU2021/000295 WO2021246910A1 (ru) | 2020-05-19 | 2021-07-09 | РЕКОМБИНАНТНЫЙО БЕЛОК RBD SARS-CoV-2 И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020116437A RU2723008C9 (ru) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2723008C1 true RU2723008C1 (ru) | 2020-06-08 |
| RU2723008C9 RU2723008C9 (ru) | 2021-02-09 |
Family
ID=71067974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020116437A RU2723008C9 (ru) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2723008C9 (ru) |
| WO (1) | WO2021246910A1 (ru) |
Cited By (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2730897C1 (ru) * | 2020-07-01 | 2020-08-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
| CN111732655A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-02 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用 |
| CN111733141A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-10-02 | 清华大学深圳国际研究生院 | 一种可分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 |
| RU2733832C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
| RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
| CN111909261A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909260A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909263A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909262A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925440A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925444A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925443A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925442A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925441A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925439A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 快速筛选新冠病毒rbd特异性全人源中和性单克隆抗体方法 |
| CN111978394A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-11-24 | 珠海龄值生物科技有限公司 | 用于covid-19患者特异性免疫疗法的多克隆制剂的制备方法 |
| RU2746520C1 (ru) * | 2020-07-27 | 2021-04-14 | Дмитрий Сергеевич Цопов | Определение активности фактора виллебранда как способ лабораторной диагностики тяжести течения инфекции sars-cov-2 |
| CN112666348A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-04-16 | 山西高等创新研究院 | 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用 |
| CN113030483A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-25 | 山东省大健康精准医疗产业技术研究院 | 一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用 |
| CN113185583A (zh) * | 2020-07-01 | 2021-07-30 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种预防SARS-CoV-2重组蛋白疫苗及其制备方法 |
| RU2752862C1 (ru) * | 2021-04-09 | 2021-08-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 коронавируса SARS-CoV-2, иммуносорбент, содержащий цельновирионный очищенный антиген, полученный на основе указанного штамма и тест-система ИФА для выявления антител классов M, G и A к коронавирусу SARS-CoV-2 с использованием указанного иммуносорбента |
| CN113292640A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-08-24 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 |
| RU2754930C1 (ru) * | 2021-07-05 | 2021-09-08 | Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" | Рекомбинантная плазмида pVNV-GL-RBDind, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих |
| RU2760090C1 (ru) * | 2021-03-15 | 2021-11-22 | Зубейда Маратовна Мирхайдарова | Способ лечения постковидного синдрома биоматериалом "Аллоплант" |
| RU2760301C1 (ru) * | 2020-12-21 | 2021-11-23 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| RU2761879C1 (ru) * | 2021-07-27 | 2021-12-13 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| CN113801206A (zh) * | 2020-06-15 | 2021-12-17 | 上海市公共卫生临床中心 | 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法 |
| WO2022032368A1 (pt) * | 2020-08-14 | 2022-02-17 | Instituto Butantan | Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado, antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2, inativado, composição antigênica, kits e seus usos. |
| WO2022045935A1 (en) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Joint Stock Company "Biocad" | Aav5-based vaccine against sars-cov-2 |
| RU2776484C1 (ru) * | 2021-07-02 | 2022-07-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Рекомбинантная ДНК, обеспечивающая получение рекомбинантного белка Cov1, обладающего иммуногенными свойствами в отношении вируса SARS-CoV-2 |
| WO2023239265A1 (ru) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Общество с ограниченной ответственностью "Бетувакс" | Гибридный ген для получения рекомбинантного rbd-антигена |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023128813A1 (ru) * | 2021-12-30 | 2023-07-06 | Общество с ограниченной ответственностью "Бетувакс" | Антигены для индукции иммунитета против вируса sars-cov-2 и генные конструкции для их экспрессии |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2253870C1 (ru) * | 2004-04-26 | 2005-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ЭПИТОПЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ, И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ |
| US20170096455A1 (en) * | 2014-03-20 | 2017-04-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for chimeric coronavirus spike proteins |
| CN106928326B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-12-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一种基于二聚化的受体结合区亚单位的冠状病毒疫苗 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1884303A (zh) * | 2005-06-20 | 2006-12-27 | 中国医学科学院基础医学研究所 | SARS－CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其高量表达与纯化和用途 |
| RU2325655C9 (ru) * | 2006-08-10 | 2008-11-27 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | Иммуноферментная тест-система для определения поверхностного антигена вируса гепатита в и способ определения поверхностного антигена вирусного гепатита в |
| RU2615447C1 (ru) * | 2015-11-13 | 2017-04-04 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Синтетическая ДНК, кодирующая интерлейкин-7 человека, содержащий ее экспрессионный вектор (варианты), штамм-продуцент интерлейкина-7 человека и способ получения интерлейкина-7 человека |
| CN111088283B (zh) * | 2020-03-20 | 2020-06-23 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗 |
-
2020
- 2020-05-19 RU RU2020116437A patent/RU2723008C9/ru active
-
2021
- 2021-07-09 WO PCT/RU2021/000295 patent/WO2021246910A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2253870C1 (ru) * | 2004-04-26 | 2005-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Диагностические системы" | РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ЭПИТОПЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ, И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ БЕЛКОВ КОРОНАВИРУСА (SARS-CoV), СВЯЗАННОГО С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ СИНДРОМОМ |
| US20170096455A1 (en) * | 2014-03-20 | 2017-04-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for chimeric coronavirus spike proteins |
| CN106928326B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-12-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一种基于二聚化的受体结合区亚单位的冠状病毒疫苗 |
Cited By (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801206A (zh) * | 2020-06-15 | 2021-12-17 | 上海市公共卫生临床中心 | 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法 |
| CN111733141A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-10-02 | 清华大学深圳国际研究生院 | 一种可分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 |
| CN111733141B (zh) * | 2020-06-19 | 2022-02-18 | 清华大学深圳国际研究生院 | 一种可分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 |
| CN111732655A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-02 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用 |
| RU2730897C1 (ru) * | 2020-07-01 | 2020-08-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ SARS-COV-2 В СОСТАВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ АНТИТЕЛ КЛАССОВ IgM, IgG, IgA В СЫВОРОТКЕ/ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ COVID-19 |
| CN111732655B (zh) * | 2020-07-01 | 2021-10-22 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用 |
| CN113185583A (zh) * | 2020-07-01 | 2021-07-30 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种预防SARS-CoV-2重组蛋白疫苗及其制备方法 |
| CN111978394A (zh) * | 2020-07-13 | 2020-11-24 | 珠海龄值生物科技有限公司 | 用于covid-19患者特异性免疫疗法的多克隆制剂的制备方法 |
| CN111978394B (zh) * | 2020-07-13 | 2021-05-11 | 珠海龄值生物科技有限公司 | 用于covid-19患者特异性免疫疗法的多克隆制剂的制备方法 |
| RU2746520C1 (ru) * | 2020-07-27 | 2021-04-14 | Дмитрий Сергеевич Цопов | Определение активности фактора виллебранда как способ лабораторной диагностики тяжести течения инфекции sars-cov-2 |
| RU2733832C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
| RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
| WO2022032368A1 (pt) * | 2020-08-14 | 2022-02-17 | Instituto Butantan | Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado, antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2, inativado, composição antigênica, kits e seus usos. |
| CN115925899A (zh) * | 2020-08-19 | 2023-04-07 | 重庆医科大学 | 新型冠状病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925441A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925442A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925443A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909261A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925444A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925439A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 快速筛选新冠病毒rbd特异性全人源中和性单克隆抗体方法 |
| CN116023477A (zh) * | 2020-08-19 | 2023-04-28 | 重庆医科大学 | 新型冠状病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909263A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN114933650A (zh) * | 2020-08-19 | 2022-08-23 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111925440A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909262A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| CN111909260A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-11-10 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
| WO2022045935A1 (en) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Joint Stock Company "Biocad" | Aav5-based vaccine against sars-cov-2 |
| RU2783313C1 (ru) * | 2020-08-28 | 2022-11-11 | Акционерное общество "БИОКАД" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| CN112666348A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-04-16 | 山西高等创新研究院 | 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测蛋白组及应用 |
| RU2760301C1 (ru) * | 2020-12-21 | 2021-11-23 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| WO2022139631A1 (en) * | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Joint Stock Company "Biocad" | Aav5-based vaccine for induction of specific immunity and/or prevention of sars-cov-2-related infection |
| CN113030483A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-25 | 山东省大健康精准医疗产业技术研究院 | 一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用 |
| CN113030483B (zh) * | 2021-02-25 | 2024-04-02 | 山东省大健康精准医疗产业技术研究院 | 一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用 |
| RU2760090C1 (ru) * | 2021-03-15 | 2021-11-22 | Зубейда Маратовна Мирхайдарова | Способ лечения постковидного синдрома биоматериалом "Аллоплант" |
| RU2752862C1 (ru) * | 2021-04-09 | 2021-08-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 коронавируса SARS-CoV-2, иммуносорбент, содержащий цельновирионный очищенный антиген, полученный на основе указанного штамма и тест-система ИФА для выявления антител классов M, G и A к коронавирусу SARS-CoV-2 с использованием указанного иммуносорбента |
| CN113292640B (zh) * | 2021-06-18 | 2021-12-24 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 |
| CN113292640A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-08-24 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 |
| RU2776484C1 (ru) * | 2021-07-02 | 2022-07-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Рекомбинантная ДНК, обеспечивающая получение рекомбинантного белка Cov1, обладающего иммуногенными свойствами в отношении вируса SARS-CoV-2 |
| RU2754930C1 (ru) * | 2021-07-05 | 2021-09-08 | Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" | Рекомбинантная плазмида pVNV-GL-RBDind, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617 в клетках млекопитающих |
| RU2761879C1 (ru) * | 2021-07-27 | 2021-12-13 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 |
| RU2795160C1 (ru) * | 2022-06-10 | 2023-04-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Бетувакс" | Гибридный ген, состоящий из рецептора RBD поверхностного белка S коронавируса SARS-CoV-2, эпитопов S14P5 и S21P2, Fc-фрагмента, для получения рекомбинантного антигена и его применения в составе вакцинной композиции против коронавирусной инфекции |
| WO2023239265A1 (ru) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Общество с ограниченной ответственностью "Бетувакс" | Гибридный ген для получения рекомбинантного rbd-антигена |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021246910A8 (ru) | 2022-02-03 |
| WO2021246910A1 (ru) | 2021-12-09 |
| RU2723008C9 (ru) | 2021-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2723008C1 (ru) | Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение | |
| US11054429B1 (en) | SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein binding | |
| CN111781354B (zh) | 新型冠状病毒中和性抗体滴度检测elisa试剂盒 | |
| CN113009154B (zh) | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 | |
| CN113009153B (zh) | 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用 | |
| Figueiredo et al. | Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay based on Araraquara virus recombinant nucleocapsid protein | |
| CN113447651A (zh) | 筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用 | |
| US20220026428A1 (en) | Detection of antibodies to sarsr-cov | |
| CN111665365A (zh) | 一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒 | |
| CN114088940A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒elisa抗体检测试剂盒 | |
| CN110006866B (zh) | 一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒 | |
| US20240229066A1 (en) | Infectious recombinant vesicular stomatitis virus (rvsv) bearing the spike glycoprotein s of sars-cov-2 and uses thereof | |
| KR102694894B1 (ko) | 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 변이주의 중화항체 검출용 조성물 및 이를 포함하는 중화항체 검출 방법 및 키트 | |
| US7919256B2 (en) | Method for detecting Borna disease virus infection | |
| CN111579789B (zh) | 一种用荧光法快速检测水痘病毒滴度的方法 | |
| Li et al. | Development of a rapid neutralizing antibody test for SARS-CoV-2 and its application for neutralizing antibody screening and vaccinated serum testing | |
| CN114560929A (zh) | 针对冠状病毒np蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN114371286A (zh) | 一种检测新冠病毒中和抗体的试剂盒及其制备方法 | |
| Li et al. | The HIV-1 matrix protein p17 activates the transcription factors c-Myc and CREB in human B cells. | |
| HK40037839A (en) | Detection of sarsr-cov antibodies | |
| Gormley | SARS-CoV-2 and the immune response; the establishment of a SARS-CoV-2 neutralization assay and subsequent immune utilization | |
| Han et al. | SARS-CoV-2 ORF9b Antagonizes Type I and III Interferons by Targeting Multiple Components of RIG-I/MDA-5-MAVS, 2 TLR3-TRIF, and cGAS-STING Signaling Pathways 3 | |
| CN121114426A (zh) | 一种检测发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体的elisa试剂盒及其应用方法 | |
| Chen et al. | ZDHHC14 and APT2 regulate the palmitoylation of HSV-2 gB | |
| KR100264341B1 (ko) | 후천성면역결핍바이러스-1o형 특이항원 및 그의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200819 Effective date: 20200819 |
|
| TH4A | Reissue of patent specification | ||
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20210218 |