RU2717024C1 - Method for identifying functional m1 and m2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes - Google Patents
Method for identifying functional m1 and m2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2717024C1 RU2717024C1 RU2019118746A RU2019118746A RU2717024C1 RU 2717024 C1 RU2717024 C1 RU 2717024C1 RU 2019118746 A RU2019118746 A RU 2019118746A RU 2019118746 A RU2019118746 A RU 2019118746A RU 2717024 C1 RU2717024 C1 RU 2717024C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- macrophages
- pro
- cells
- csf
- polarized
- Prior art date
Links
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 85
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 claims description 41
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 31
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 31
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 31
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 31
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 24
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 14
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 13
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 19
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 18
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 18
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 18
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 14
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 14
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 9
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 9
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 8
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- -1 iNOS Proteins 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 102100025354 Macrophage mannose receptor 1 Human genes 0.000 description 7
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000002187 allostimulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 5
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 5
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 5
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 5
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 5
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 5
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 4
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 4
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 102000004452 Arginase Human genes 0.000 description 3
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 3
- 101100167135 Mus musculus Chil3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710129000 Arginase-1 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 description 2
- 102100036849 C-C motif chemokine 24 Human genes 0.000 description 2
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 102000053028 CD36 Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 206010051290 Central nervous system lesion Diseases 0.000 description 2
- 102100025877 Complement component C1q receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010037897 DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin Proteins 0.000 description 2
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 description 2
- 101000713078 Homo sapiens C-C motif chemokine 24 Proteins 0.000 description 2
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000946794 Homo sapiens C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000933665 Homo sapiens Complement component C1q receptor Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101150009252 Retnla gene Proteins 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 2
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LJUIOEFZFQRWJG-GHYFRYPYSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanylpropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)CSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LJUIOEFZFQRWJG-GHYFRYPYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100023702 C-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 1
- 102100023703 C-C motif chemokine 15 Human genes 0.000 description 1
- 102100023701 C-C motif chemokine 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036850 C-C motif chemokine 23 Human genes 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 102100039396 C-X-C motif chemokine 16 Human genes 0.000 description 1
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036189 C-X-C motif chemokine 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 description 1
- 101150011672 CCL9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021396 Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101150040584 Gpr18 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000978379 Homo sapiens C-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000978376 Homo sapiens C-C motif chemokine 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000978371 Homo sapiens C-C motif chemokine 18 Proteins 0.000 description 1
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713081 Homo sapiens C-C motif chemokine 23 Proteins 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000889133 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 16 Proteins 0.000 description 1
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000947193 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000969553 Homo sapiens Cell surface glycoprotein CD200 receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000978392 Homo sapiens Eotaxin Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 101100273566 Humulus lupulus CCL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 101100335387 Mus musculus Fpr-s1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260702 Mus musculus Tinagl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-O PAF Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-O 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 description 1
- 201000002661 Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000010632 Transcription Factor Activity Effects 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000025194 apoptotic cell clearance Effects 0.000 description 1
- 101150088826 arg1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108010042430 galactose receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- CZCBTSFUTPZVKJ-UHFFFAOYSA-N rose oxide Chemical compound CC1CCOC(C=C(C)C)C1 CZCBTSFUTPZVKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и биологии, а именно клеточной иммунологии, и касается способа идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови. Предложенный способ позволяет повысить эффективность определения макрофагов человека первого и второго типа с целью их последующего использования в фундаментальных исследованиях, а также при разработке новых клеточных технологий, в том числе в области регенеративной медицины.The invention relates to medicine and biology, in particular cellular immunology, and relates to a method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes. The proposed method allows to increase the efficiency of determination of human macrophages of the first and second type for the purpose of their subsequent use in basic research, as well as in the development of new cellular technologies, including in the field of regenerative medicine.
Макрофаги (Mϕ), являясь клетками врожденного иммунитета, выполняют в организме множество функций, что обусловлено их функциональной гетерогенностью и высокой пластичностью (Gordon S., Taylor P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity // Nat Rev Immunol. - 2005. - V. 5. - P. 953-964). Резидентные макрофаги обнаруживаются практически во всех тканях, где они могут составлять до 10-15% от общего числа клеток. Мϕ различной тканевой локализации обозначаются, как остеокласты (кости), альвеолярные макрофаги (легкие), микроглиальные клетки (ЦНС), гистиоциты (соединительная ткань), клетки Купфера (печень) и т.д. Поскольку эти популяции характеризуются специфическими транскрипционными профилями, то их можно рассматривать как множество разных и уникальных классов Мϕ (Gautier E.L., Shay Т., Miller J., et al. Gene expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages // Nat Immunol. - 2012. - V. 13. - P. 1118-1128). С другой стороны, основные функции макрофагов универсальны. Они играют ключевую роль в развитии тканей (формируя их архитектуру), в иммунном ответе на патогены (участвуя в запуске и разрешении воспалительной реакции), в контроле и мониторинге возможных нарушений в тканях (действуя в качестве «дозорных» и эффекторных клеток), и особенно, в поддержании тканевого гомеостаза (путем фагоцитоза апоптотических или стареющих клеток, а также участвуя в процессах ремоделирования и репарации тканей).Macrophages (Mϕ), being cells of innate immunity, perform many functions in the body due to their functional heterogeneity and high plasticity (Gordon S., Taylor PR Monocyte and macrophage heterogeneity // Nat Rev Immunol. - 2005. - V. 5. - P. 953-964). Resident macrophages are found in almost all tissues, where they can make up to 10-15% of the total number of cells. Mϕ of various tissue localization are designated as osteoclasts (bones), alveolar macrophages (lungs), microglial cells (CNS), histiocytes (connective tissue), Kupffer cells (liver), etc. Since these populations are characterized by specific transcriptional profiles, they can be considered as many different and unique classes of Mϕ (Gautier EL, Shay T., Miller J., et al. Gene expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages // Nat Immunol. - 2012 .-- V. 13. - P. 1118-1128). On the other hand, the main functions of macrophages are universal. They play a key role in the development of tissues (shaping their architecture), in the immune response to pathogens (participating in triggering and resolving the inflammatory response), in controlling and monitoring possible disorders in tissues (acting as “sentinel” and effector cells), and especially , in maintaining tissue homeostasis (by phagocytosis of apoptotic or aging cells, as well as participating in the processes of tissue remodeling and repair).
Пул резидентных Мϕ может пополняться за счет дифференцировки циркулирующих моноцитов при их попадании в ткани из кровотока. Макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) являются основными регуляторами дифференцировки моноцитов в макрофаги. При этом M-CSF стимулирует дифференцировку моноцитов в Мϕ, характеризующиеся М2/противовоспалительным фенотипом (про-М2 клетки), тогда как GM-CSF индуцирует дифференцировку моноцитов в Мϕ с М1/провоспалительным фенотипом (про-М1 клетки) (Jaguin М., Houlbert N., Fardel О., Lecureur V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin // Cell. Immunol. - 2013. -V. 281. - P. 51-61; Fleetwood A.J., Lawrence Т., Hamilton J.A., Cook A.D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation // J Immunol. - 2007. - V. 178. - P. 5245-5252).The pool of resident Mϕ can be replenished due to the differentiation of circulating monocytes when they enter the tissues from the bloodstream. Macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) are the main regulators of differentiation of monocytes into macrophages. In this case, M-CSF stimulates the differentiation of monocytes in Mϕ, characterized by M2 / anti-inflammatory phenotype (pro-M2 cells), while GM-CSF induces differentiation of monocytes in Mϕ with M1 / pro-inflammatory phenotype (pro-M1 cells) (Jaguin M., Houlbert N., Fardel O., Lecureur V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin // Cell. Immunol. - 2013. -V 281. - P. 51-61; Fleetwood AJ, Lawrence T., Hamilton JA, Cook AD Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation // J Immunol. - 2007 .-- V. 178. - P. 5245 -5252).
Как про-М1, так и про-М2 клетки могут быть поляризованы в Мϕ 1 или 2 типа под влиянием различных факторов микроокружения (поляризующих стимулов) (Roszer Т. Understanding the mysterious М2 macrophage through activation markers and effector mechanisms // Mediators of Inflammation. - 2015. - Article ID 816460; Tarique A.A., Logan J., Thomas E., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2015. - V. 53. - P. 676-688). В культуре in vitro в качестве M1-поляризующих сигналов могут выступать различные инфекционные агенты (например, липополисахарид [ЛПС] или провоспалительные цитокины (TNF-α или IFN-γ, по отдельности или в комбинации). М1 макрофаги характеризуются in vitro фенотипом IL-12highIL-23highIL-10low; активно секретируют реактивные метаболиты кислорода и оксид азота (ROS и NO) и воспалительные цитокины (IL-1β, TNF, IL-6); участвуют в развитии Th1-опосредованных иммунных реакций, обеспечивающих устойчивость к внутриклеточным патогенам и опухолям. В качестве М2-поляризующих сигналов могут выступать Th2-цитокины (IL-4 или IL-13 по отдельности или в комбинации); иммунные комплексы, которые одновременно связываются с Fc-γ и Toll-подобными рецепторами; различные иммуносупрессорные цитокины (IL-10, TGF-β), глюкокортикоиды и витамины (дексаметазон, витамин Д3). В 2008 г было предложено М2 макрофаги, поляризованные теми или иными стимулами, обозначать как М2а (IL-4, IL-13), М2b (иммунные комплексы) и М2с (IL-10, TGF-b, дексаметазон, витамин Д3) (Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization // Front Biosci. - 2008. - V. 13. - P. 453-461). Выделяют также M2d фенотип, который индуцируется в результате аденозин-зависимого "переключения" провоспалительных М1 макрофагов в М2 клетки с выраженными проангиогенными свойствами (Grinberg S., Hasko G., Wu D., Leibovich S.J. Suppression of PLCβ2 by endotoxin plays a role in the adenosine А2A receptor-mediated switch of macrophages from an inflammatory to an angiogenic phenotype // Am J Pathol. - 2009. - V. 175. - P. 2439-2453). Поскольку M2 поляризация Мϕ может происходить также в результате фагоцитоза апоптотических клеток, отдельно можно выделить М2апо фенотип М2 макрофагов (Fadok V.A, Bratton D.L., Konowal A., et al. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF // J Clin Invest. - 1998. - V. 101. - P. 890-898; De Oliveira Fulco Т., Andrade P.R., de Mattos Barbosa M.G., et al. Effect of apoptotic cell recognition on macrophage polarization and mycobacterial persistence // Infect Immunol. - 2014. - V. 82. - P. 3968-3978).Both pro-M1 and pro-M2 cells can be polarized in M 1 or 2 types under the influence of various microenvironment factors (polarizing stimuli) (Roszer T. Understanding the mysterious M2 macrophage through activation markers and effector mechanisms // Mediators of Inflammation. - 2015. - Article ID 816460; Tarique AA, Logan J., Thomas E., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2015. - V 53. - P. 676-688). In an in vitro culture, various infectious agents (eg, lipopolysaccharide [LPS] or pro-inflammatory cytokines (TNF-α or IFN-γ, individually or in combination) can act as M1-polarizing signals. M1 macrophages are characterized in vitro by the IL-12 phenotype high IL-23 high IL-10 low ; actively secrete reactive oxygen metabolites and nitric oxide (ROS and NO) and inflammatory cytokines (IL-1β, TNF, IL-6); are involved in the development of Th1-mediated immune responses that provide resistance to intracellular pathogens and tumors.As M2-polarizing signal Th2 cytokines (IL-4 or IL-13 alone or in combination) may appear; immune complexes that simultaneously bind to Fc-γ and Toll-like receptors; various immunosuppressive cytokines (IL-10, TGF-β), glucocorticoids and vitamins (dexamethasone, vitamin D3) In 2008, M2 macrophages polarized by various stimuli were proposed to be designated as M2a (IL-4, IL-13), M2b (immune complexes) and M2c (IL-10, TGF -b, dexamethasone, vitamin D3) (Martinez FO, Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization // Front Biosci. - 2008. - V. 13. - P. 453-461). M2d phenotype is also isolated, which is induced as a result of an adenosine-dependent "switch" of pro-inflammatory M1 macrophages into M2 cells with pronounced pro-angiogenic properties (Grinberg S., Hasko G., Wu D., Leibovich SJ Suppression of PLCβ2 by endotoxin plays a role in the adenosine A 2A receptor-mediated switch of macrophages from an inflammatory to an angiogenic phenotype // Am J Pathol. - 2009. - V. 175. - P. 2439-2453). Since M2 polarization of Mϕ can also occur as a result of phagocytosis of apoptotic cells, the M2apo phenotype of M2 macrophages can be isolated separately (Fadok VA, Bratton DL, Konowal A., et al. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine / paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF // J Clin Invest. - 1998. - V. 101. - P. 890-898; De Oliveira Fulco T., Andrade PR, de Mattos Barbosa MG, et al. Effect of apoptotic cell recognition on macrophage polarization and mycobacterial persistence // Infect Immunol. - 2014 .-- V. 82. - P. 3968-3978).
В целом, M2 макрофаги характеризуются in vitro фенотипом IL-12lowIL-23lowIL-10highTGF-βhigh; как правило, высоко экспрессируют акцепторные (scavenger), маннозные и галактозные рецепторы; участвуют в развитии Th2-опосредованных иммунных реакций, в ограничении воспаления, иммунорегуляции, ремоделировании тканей и ангиогенезе (Sica A., Mantovani А. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas // J Clin Invest. - 2012. - V. 122. - P. 787-795).In general, M2 macrophages are characterized by the in vitro phenotype IL-12 low IL-23 low IL-10 high TGF-β high ; as a rule, scavenger, mannose and galactose receptors are highly expressed; participate in the development of Th2-mediated immune responses, in limiting inflammation, immunoregulation, tissue remodeling, and angiogenesis (Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas // J Clin Invest. - 2012. - V. 122. - P. 787-795).
Развитие многих физиологических процессов невозможно без соответствующей поляризации Мϕ. Нарушение или отклонение дифференцировочной программы Мϕ может иметь потенциально опасные последствия. Например, неконтролируемая активация провоспалительных макрофагов 1 типа может вызывать деструкцию тканей, или способствовать опухолевой трансформации или нарушать метаболизм глюкозы, стимулируя резистентность к инсулину. В свою очередь, противовоспалительные макрофаги 2 типа, которые должны обеспечивать заживление ран, в условиях неконтролируемой активации и экспансии могут усиливать фиброгенез, провоцировать аллергические реакции, способствовать выживанию внутриклеточных патогенов, и опухолевой прогрессии.The development of many physiological processes is impossible without the corresponding polarization Mϕ. Violation or rejection of the differentiation program Mϕ can have potentially dangerous consequences. For example, uncontrolled activation of type 1 pro-inflammatory macrophages can cause tissue destruction, or promote tumor transformation or disrupt glucose metabolism, stimulating insulin resistance. In turn, type 2 anti-inflammatory macrophages, which should ensure wound healing, under conditions of uncontrolled activation and expansion, can enhance fibrogenesis, provoke allergic reactions, promote the survival of intracellular pathogens, and tumor progression.
В настоящее время отработаны различные протоколы генерации из моноцитов крови макрофагов 1 и 2 типа на основе использования соответствующих дифференцировочных факторов (GM-CSF или M-CSF) и/или поляризующих стимулов. Генерированные in vitro макрофаги предлагается использовать при разработке новых медицинских клеточных технологий. Так, M1-клетки могут быть использованы с целью усиления противоинфекционного, противовирусного или противоопухолевого иммунного ответа. В свою очередь, М2-клетки могут быть использованы с целью стимуляции репарации/регенерации, например, при лечении хронических, вялотекущих раневых процессов (при диабете, остеомиелите и т.д.) или для стимуляции нейрорегенерации у больных с органическими поражениями мозга, например, последствиями инсульта, хронической ишемией мозга и т.д. (RU 2637407, А61К 38/18, 2017; Останин А.А., Давыдова М.Н., Старостина Н.М., и др. Интраназальные ингаляции биоактивных факторов, продуцируемых М2 макрофагами, в лечении больных с органическими поражениями головного мозга // Мед иммунология. - 2018. - Т. 20. - С. 577-588). При этом принципиально важно, чтобы в конкретной клинической ситуации были использованы Мϕ определенного фенотипа - или М1/провоспалительного, или М2/противовоспалительного, поскольку по своим ключевым характеристикам они являются по сути оппозитными.Various protocols for generating macrophages of type 1 and 2 from blood monocytes based on the use of appropriate differentiating factors (GM-CSF or M-CSF) and / or polarizing stimuli have been developed. In vitro-generated macrophages are proposed for use in the development of new medical cell technologies. So, M1 cells can be used to enhance the anti-infectious, antiviral or antitumor immune response. In turn, M2 cells can be used to stimulate repair / regeneration, for example, in the treatment of chronic, sluggish wound processes (for diabetes, osteomyelitis, etc.) or to stimulate neuroregeneration in patients with organic brain lesions, for example, consequences of stroke, chronic cerebral ischemia, etc. (RU 2637407, А61К 38/18, 2017; Ostanin A.A., Davydova M.N., Starostina N.M., et al. Intranasal inhalations of bioactive factors produced by M2 macrophages in the treatment of patients with organic brain lesions / / Honey immunology. - 2018 .-- T. 20. - S. 577-588). At the same time, it is crucial that, in a specific clinical situation, Mϕ of a certain phenotype is used - either M1 / pro-inflammatory, or M2 / anti-inflammatory, because by their key characteristics they are essentially opposed.
Важно отметить, что разрабатываемые клеточные технологии относятся, как правило, к «персонализированной» медицине, и являются пациент-зависимыми, поскольку предполагают использование аутологичных Мϕ, генерированных in vitro из моноцитов периферической крови конкретного больного. Однако в силу различных причин (генетических особенностей, возраста, наличия сопутствующей патологии, количественных и/или функциональных нарушений в популяции циркулирующих моноцитов, и т.д.) может происходить нарушение процессов дифференцировки/поляризации Мϕ. В этом случае даже в условиях выполнения стандартов культуральных протоколов генерации и при использовании соответствующих М1 или М2 дифференцировочных/поляризующих факторов, получаемая популяция макрофагов по своим ключевым свойствам может не соответствовать ожидаемому функциональному фенотипу.It is important to note that the developed cellular technologies relate, as a rule, to “personalized” medicine, and are patient-dependent, since they involve the use of autologous Mϕ generated in vitro from peripheral blood monocytes of a particular patient. However, for various reasons (genetic characteristics, age, the presence of concomitant pathology, quantitative and / or functional disorders in the population of circulating monocytes, etc.), a differentiation / polarization process Mϕ may occur. In this case, even under the conditions of fulfilling the standards of cultural generation protocols and using the corresponding M1 or M2 differentiating / polarizing factors, the resulting macrophage population by its key properties may not correspond to the expected functional phenotype.
Очевидно, что использование таких «дефектных» Мϕ в лечебных целях может быть либо недостаточно эффективным, либо сопровождаться развитием нежелательных побочных реакций.Obviously, the use of such "defective" Mϕ for therapeutic purposes may either be insufficiently effective or be accompanied by the development of undesirable side reactions.
Вышесказанное диктует необходимость поиска маркера(-ов), позволяющих с высокой диагностической точностью идентифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.The above dictates the need to search for marker (s), allowing with high diagnostic accuracy to identify the M1 and M2 functional phenotypes of human macrophages generated in vitro from blood monocytes.
Известен метод идентификации типа макрофагов по экспрессии генов, который осуществляется при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Согласно данному методу, М1 и М2 макрофаги различаются по уровню экспрессии мРНК Arg1, Ym1, Fizz1, iNOS, CD38, Fpr2, Gpr18 (Raes G., De Baetselier P., Noe W., al. Differential expression of FIZZ1 and Ym1 in alternatively versus classically activated macrophages // J Leukoc Biol. - 2002. - V. 71. - P. 597-602; Jablonski K.A., Amici S.A., Webb L.M., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages // PLoS One. - 2015. - V. 10: e0145342). Однако данный подход существенно ограничен возможностью использования для идентификации различных типов макрофагов только у мышей, поскольку у человека указанные маркеры не определяются (Raes G., Van den Bergh R., De Baetselier P., et. al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells // J Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 6561-6562).A known method for identifying the type of macrophages by gene expression, which is carried out using the polymerase chain reaction in real time. According to this method, M1 and M2 macrophages differ in the level of mRNA expression of Arg1, Ym1, Fizz1, iNOS, CD38, Fpr2, Gpr18 (Raes G., De Baetselier P., Noe W., al. Differential expression of FIZZ1 and Ym1 in alternatively versus classically activated macrophages // J Leukoc Biol. - 2002. - V. 71. - P. 597-602; Jablonski KA, Amici SA, Webb LM, et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages // PLoS One . - 2015. - V. 10: e0145342). However, this approach is significantly limited by the possibility of using different types of macrophages for identification only in mice, since these markers are not detected in humans (Raes G., Van den Bergh R., De Baetselier P., et. Al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells // J Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 6561-6562).
Известен метод идентификации типа макрофагов по особенностям метаболизма L-аргинина, а именно, по анализу баланса активности аргиназы и NO-синтазы (Modolell М., Corraliza I.M., Link F., et al. Reciprocal regulation of the nitric oxide synthase/arginase balance in mouse bone marrow-derived macrophages by TH1 and TH2 cytokines // Eur J Immunol. - 1995. - V. 25. - P. 1101-1104; Munder M., Eichmann K., Modolell M. Alternative metabolic states in murine macrophages reflected by the nitric oxide synthase/arginase balance: competitive regulation by CD4+ T cells correlates with Th1/Th2 phenotype // J Immunol. - 1998. - V. 160. - P. 5347-5354). Согласно этому методу, формирование М1 фенотипа сопровождается сдвигом метаболизма аргинина в сторону активации NO-синтазы (iNOS) и увеличения продукции оксида азота (NO), которому принадлежит важная роль в микробицидной активности М1-клеток. Формирование М2 фенотипа сопровождается сдвигом метаболизма аргинина в сторону активации аргиназы-1, которая конкурирует с iNOS за L-аргинин и расщепляет его до орнитина и мочевины. М2-продуцируемый орнитин стимулирует пролиферацию и восстановление клеток посредством синтеза полиамина и коллагена, фиброза и активации других функций тканевого ремоделирования. Недостатком данного способа также является возможность его использования только для определения различных типов макрофагов мышей, но не Мϕ человека.A known method for identifying the type of macrophages by the characteristics of the metabolism of L-arginine, namely, by analyzing the balance of activity of arginase and NO synthase (Modolell M., Corraliza IM, Link F., et al. Reciprocal regulation of the nitric oxide synthase / arginase balance in mouse bone marrow-derived macrophages by TH1 and TH2 cytokines // Eur J Immunol. - 1995. - V. 25. - P. 1101-1104; Munder M., Eichmann K., Modolell M. Alternative metabolic states in murine macrophages reflected by the nitric oxide synthase / arginase balance: competitive regulation by CD4 + T cells correlates with Th1 / Th2 phenotype // J Immunol. - 1998. - V. 160. - P. 5347-5354). According to this method, the formation of the M1 phenotype is accompanied by a shift in arginine metabolism towards the activation of NO synthase (iNOS) and an increase in the production of nitric oxide (NO), which plays an important role in the microbicidal activity of M1 cells. The formation of the M2 phenotype is accompanied by a shift in arginine metabolism towards activation of arginase-1, which competes with iNOS for L-arginine and breaks it down to ornithine and urea. M2-produced ornithine stimulates cell proliferation and recovery through the synthesis of polyamine and collagen, fibrosis and the activation of other tissue remodeling functions. The disadvantage of this method is the possibility of its use only to determine the different types of macrophages of mice, but not human Mϕ.
Известен метод идентификации типа Мϕ по морфологической характеристике генерируемых клеточных популяций. Так, М1-клетки преимущественно имеют округлую или овоидную форму, а М2 - преимущественно представляют собой фибробластоподобные клетки или клетки с «fried-egg» морфологией. Это сравнительно простой метод диагностики, не требующий наличия сложного оборудования и больших временных затрат (Ploeger D.T., Hosper N.A., Schipper М., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of М1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts // Cell Commun Signal. - 2013. - V. 11: 29). Недостатком данного способа является качественный, субъективный характер оценки и его неточность, поскольку в общей популяции генерируемых in vitro макрофагов могут содержаться клетки, различающееся по своей морфологии.A known method for identifying type Mϕ by the morphological characteristics of the generated cell populations. So, M1 cells predominantly have a round or ovoid shape, and M2 cells are predominantly fibroblast-like cells or cells with a “fried-egg” morphology. This is a relatively simple diagnostic method that does not require complex equipment and time-consuming (Ploeger DT, Hosper NA, Schipper M., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1 / M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts // Cell Commun Signal. - 2013 .-- V. 11: 29). The disadvantage of this method is the qualitative, subjective nature of the assessment and its inaccuracy, since the general population of macrophages generated in vitro may contain cells that differ in their morphology.
Известен метод определения типа макрофагов по экспрессии различных поверхностных молекул, осуществляемый при помощи проточной цитометрии. Данный подход является одним из самых распространенных и достаточно простых методов оценки функционального фенотипа макрофагов. Так, например, показано, что М1 отличаются от М2-клеток повышенной экспрессией молекул, вовлеченных в активацию и ко-стимуляцию Т-лимфоцитов (HLA-DR, CD86, CD40), тогда как М2 макрофаги характеризуются повышенной экспрессией акцепторных scavenger-рецепторов (CD36, CD163) и маннозного CD206-рецептора (Lolmede K., Campana L, Vezzoli М., et al. Inflammatory and alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separate HMGB1- and MMP-9-dependent pathways. J Leukoc Biol. - 2009. - V. 85. - P. 779-787). Для M2a клеток, генерированных из моноцитов под действием поляризующих стимулов IL-4/IL-13, характерным признаком является повышенная экспрессия CD200R и DC-SIGN (CD209) (Koning N., van Eijk M., Pouwels W., et al. Expression of the inhibitory CD200 receptor is associated with alternative macrophage activation. J Innate Immun. - 2010. - V. 2. - P. 195-200; Relloso M.,
Существенным недостатком данного метода является отсутствие уникальных поверхностных маркеров, высоко специфичных для определенного фенотипа Мϕ. Так, например, экспрессия маннозного рецептора CD206 считается отличительным признаком М2-клеток, однако М1 макрофаги также экспрессируют этот антиген, хотя и с меньшей интенсивностью. Кроме того, уровень экспрессии CD206 может варьировать в зависимости от используемого дифференцировочного фактора. Например, экспрессия CD206 повышается на М-CSF-дифференцированных М2 макрофагах, однако GM-CSF также индуцирует экспрессию этого антигена М1-клетками на уровне, превышающем значения GM-CSF-дифференцированных М2-макрофагов.A significant drawback of this method is the lack of unique surface markers that are highly specific for a particular Mϕ phenotype. For example, expression of the mannose receptor CD206 is considered a hallmark of M2 cells, however, M1 macrophages also express this antigen, albeit with less intensity. In addition, the level of expression of CD206 may vary depending on the differentiating factor used. For example, the expression of CD206 is increased on M-CSF-differentiated M2 macrophages, however, GM-CSF also induces the expression of this antigen by M1 cells at a level exceeding the values of GM-CSF-differentiated M2 macrophages.
Недостатком данного метода является также то, что для идентификации типа макрофагов необходима сравнительная характеристика между собой двух (или более) клеточных популяций по уровню экспрессии (больше/меньше) тех или иных молекул. При этом не определены пороговые значения экспрессии каких-либо маркеров, которые позволяли бы с высокой специфичностью (SP) и чувствительностью (SN) верифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы генерированных in vitro макрофагов человека.The disadvantage of this method is also that the identification of the type of macrophages requires a comparative characteristic of two (or more) cell populations among themselves by the level of expression (more / less) of certain molecules. At the same time, threshold values for the expression of any markers were not determined that would allow verification of the M1 and M2 functional phenotypes of human macrophages generated in vitro with high specificity (SP) and sensitivity (SN).
Известен способ идентификации М1-подобных и М2-подобных макрофагов (поляризованных с помощью IFN-γ и IL-4, соответственно) по экспрессии поверхностных антигенов (US 2015057161, C12N5/0786, 2015). В качестве M1-специфических маркеров предлагается использовать CD120b, TLR2 и SLAMF7; в качестве М2-ассоциированных маркеров - CD1a, CD1b, CD93 и CD226. Несмотря на то, что эти паттерны поверхностных антигенов были выделены после проведения РНК-секвенирования и определения в качестве маркеров идентификации наиболее вероятных генов-кандидатов, предложенный способ имеет ряд ограничений и недостатков.A known method for identifying M1-like and M2-like macrophages (polarized using IFN-γ and IL-4, respectively) by expression of surface antigens (US 2015057161, C12N5 / 0786, 2015). As M1-specific markers it is proposed to use CD120b, TLR2 and SLAMF7; as M2-associated markers are CD1a, CD1b, CD93 and CD226. Despite the fact that these surface antigen patterns were isolated after RNA sequencing and identification of the most likely candidate genes as identification markers, the proposed method has a number of limitations and disadvantages.
Недостатком является, во-первых, то, что, для генерации М2-подобных макрофагов в качестве поляризующего стимула использовали IL-4, что является общепринятым подходом для получения М2а макрофагов. Следовательно, предлагаемый паттерн М2-ассоциированных маркеров (CD1a, CD1b, CD93, CD226) позволяет идентифицировать только одну популяцию М2 макрофагов М2а фенотипа. Эффективность предложенного метода в отношении идентификации других субпопуляций М2 макрофагов (про-М2-клеток, М2b, М2с, М2апо) не исследована. Во-вторых, в состав паттерна М1-специфических маркеров включен TLR2 (Toll-подобный рецептор бактериальных пептидогликанов), тогда как в ряде в ряде работ показано, что экспрессия TLR2 и, соответственно, способность отвечать на TLR2-агонисты (Pam3, Pam2CSK4) характерна не только для М1, но также и для М2 макрофагов (Quero L, Hanser Е., Manigold Т., Tiaden A.N., Kyburz D. TLR2 stimulation impairs anti-inflammatory activity of M2-like macrophages, generating a chimeric M1/M2 phenotype. Arthritis Res Ther. - 2017. - V. 19: 245; Schlaepfer E., Rochat M-A., Duo L, Speck R.F. Triggering TLR2, -3, -4, -5, and -8 Reinforces the Restrictive Nature of M1- and M2-Polarized Macrophages to HIV. J Virology. - 2014. - V. 88. - P. 9769-9781). Недостатком данного метода является также отсутствие установленных пороговых значений экспрессии М1- и М2-ассоциированных маркеров, а также каких-либо данных о диагностической точности (SP, SN) предложенного подхода.The disadvantage is, firstly, that, to generate M2-like macrophages, IL-4 was used as a polarizing stimulus, which is a generally accepted approach for obtaining M2a macrophages. Therefore, the proposed pattern of M2-associated markers (CD1a, CD1b, CD93, CD226) allows only one population of M2 macrophages of the M2a phenotype to be identified. The effectiveness of the proposed method in identifying other subpopulations of M2 macrophages (pro-M2 cells, M2b, M2c, M2apo) has not been studied. Second, TLR2 (Toll-like receptor of bacterial peptidoglycans) is included in the pattern of M1-specific markers, while several studies have shown that the expression of TLR2 and, accordingly, the ability to respond to TLR2 agonists (Pam3, Pam2CSK4) are characteristic not only for M1, but also for M2 macrophages (Quero L, Hanser E., Manigold T., Tiaden AN, Kyburz D. TLR2 stimulation impairs anti-inflammatory activity of M2-like macrophages, generating a chimeric M1 / M2 phenotype. Arthritis Res Ther. - 2017. - V. 19: 245; Schlaepfer E., Rochat MA., Duo L, Speck RF Triggering TLR2, -3, -4, -5, and -8 Reinforces the Restrictive Nature of M1- and M2-Polarized Macrophages to HIV. J Virology. - 2014 .-- V. 88. - P. 9769-9781). The disadvantage of this method is the lack of established threshold values for the expression of M1 and M2 associated markers, as well as any data on the diagnostic accuracy (SP, SN) of the proposed approach.
Известен метод идентификации М2с клеток по экспрессии мертирозинкиназы (MerTK), которая появляется на макрофагах в результате контакта с апоптотическими клетками и вовлекается в их фагоцитоз (Zizzo G., Hilliard В.А., Monestier М., Cohen P.L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. - 2012. - V. 189. - P. 3508-3520). Было показано, что экспрессия MerTK является специфичным маркером М2с клеток, дифференцированных в присутствии M-CSF с последующей поляризацией с помощью дексаметазона, или неполяризованных про-М2-клеток, имеющих фенотип CD14+CD16+CD163+CD204+CD206+CD209-. В то же время использование про-М1 дифференцирующего фактора (GM-CSF) не сопровождается значимым усилением экспрессии MerTK, в том числе в ответ на поляризующую стимуляцию дексаметазоном.A known method for the identification of M2c cells by the expression of merthyrosine kinase (MerTK), which appears on macrophages as a result of contact with apoptotic cells and is involved in their phagocytosis (Zizzo G., Hilliard B.A., Monestier M., Cohen PL Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. - 2012 .-- V. 189. - P. 3508-3520). It has been shown that the expression of MerTK is a specific marker of M2c cells differentiated in the presence of M-CSF followed by polarization with dexamethasone, or non-polarized pro-M2 cells having the phenotype CD14 + CD16 + CD163 + CD204 + CD206 + CD209-. At the same time, the use of pro-M1 differentiating factor (GM-CSF) is not accompanied by a significant increase in MerTK expression, including in response to polarizing stimulation with dexamethasone.
Недостатком метода является ограниченная сфера применения исключительно только в отношении M-CSF-дифференцированных М2с макрофагов, неполяризованных или поляризованных глюкортикоидами.The disadvantage of this method is the limited scope exclusively for M-CSF-differentiated M2c macrophages that are unpolarized or polarized by glucorticoids.
Известен метод идентификации типа макрофагов по характеру и уровню продукции ими цитокинов и хемокинов, которые определяются методами иммуноферментного и/или мультиплексного протеомного анализа. Согласно этому методу М1 макрофаги характеризуются продукцией TNFα, IL-1β, IFN-λ, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23 и хемокинов CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL15, CCL19, CCL20. Для М2а макрофагов характерна продукция TGF-β, IL-4, IL-10, IL-13, IGF-1, CCL13, CCL17, CCL22, CCL23, CCL24, CCL26. М2b макрофаги продуцируют IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α, CCL1, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3; для М2с - IL-10, TGF-β, IGF-1, PGE-2, CCL8, CCL17, CCL18, CCL22, CCL24, а M2d - IL-10, IL-12, TNFα, TGF-β, CCL5, CXCL10, CXCL16 (Mantovani A., Sica A., Sozzani S., Allavena P., Vecchi A., Locati M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. - 2004. - V. 25. - P. 677-686; Verreck F.A.W., de Boer T, Langenberg D.M.L., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. - 2004. - V. 101.-P. 4560-4565).A known method for identifying the type of macrophages by the nature and level of their production of cytokines and chemokines, which are determined by enzyme-linked immunosorbent and / or multiplex proteomic analysis. According to this method, M1 macrophages are characterized by the production of TNFα, IL-1β, IFN-λ, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23 and chemokines CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL15, CCL19, CCL20. M2a macrophages are characterized by the production of TGF-β, IL-4, IL-10, IL-13, IGF-1, CCL13, CCL17, CCL22, CCL23, CCL24, CCL26. M2b macrophages produce IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α, CCL1, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3; for M2c - IL-10, TGF-β, IGF-1, PGE-2, CCL8, CCL17, CCL18, CCL22, CCL24, and M2d - IL-10, IL-12, TNFα, TGF-β, CCL5, CXCL10, CXCL16 (Mantovani A., Sica A., Sozzani S., Allavena P., Vecchi A., Locati M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. - 2004. - V. 25. - P 677-686; Verreck FAW, de Boer T, Langenberg DML, et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco) bacteria. Proc Natl Acad Sci USA . - 2004. - V. 101.-P. 4560-4565).
Основным недостатком такого подхода является вариабельность продукции цитокинов/хемокинов, а также значительные технические сложности, связанные с необходимостью определения большого количества аналитов с использованием соответствующего оборудования и реагентики для мультиплексного анализа. Кроме того, при таком подходе опять же не определены пороговые значения уровня продукции тех или иных цитокинов/хемокинов, которые бы позволяли с высокой диагностической точностью различать секреторные паттерны, специфичные для М1 или М2 функциональных фенотипов Мϕ человека.The main disadvantage of this approach is the variability of the production of cytokines / chemokines, as well as significant technical difficulties associated with the need to determine a large number of analytes using appropriate equipment and reagents for multiplex analysis. In addition, with this approach, again, threshold values for the production level of certain cytokines / chemokines were not determined, which would make it possible to distinguish with high diagnostic accuracy secretory patterns specific for M1 or M2 functional phenotypes of human Mϕ.
Известен метод идентификации типа макрофагов по маркерам липидного метаболизма, которые оцениваются методом матричной лазерной десорбционно/ионизационной масс-спектрометрии (MALDI MSI) (Khamehgir-Silz Р., Schnitter F., Wagner А.Н., et al. Strategy for marker-based differentiation of pro- and anti-inflammatory macrophages using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Analyst. - 2018. - V. 143. - P. 4273-4282).A known method for identifying the type of macrophages by lipid metabolism markers, which are evaluated by matrix laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI MSI) (Khamehgir-Silz R., Schnitter F., Wagner A.N., et al. Strategy for marker-based differentiation of pro- and anti-inflammatory macrophages using matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry imaging. Analyst. - 2018 .-- V. 143. - P. 4273-4282).
Главным недостатком предложенного метода является то, что он не позволяет определить универсальные маркеры М1- и М2-клеток на метаболическом уровне из-за выраженной гетерогенности моноцитов/макрофагов, полученных от разных доноров. Кроме того, существенными недостатками предложенного метода являются значительная техническая сложность и, соответственно, высокая стоимость.The main drawback of the proposed method is that it does not allow us to determine universal markers of M1 and M2 cells at the metabolic level due to the pronounced heterogeneity of monocytes / macrophages obtained from different donors. In addition, significant disadvantages of the proposed method are significant technical complexity and, consequently, high cost.
Известен метод идентификации типа макрофагов на основе оценки спектральной характеристики Мϕ после их взаимодействия с органическим соединением (JP 2015006173, C12N5/0786, 2015). Особенностью данного органического соединения является то, что его окрашиваемость меняется при добавлении его к тому или иному типу Мϕ (М1 или М2), в результате чего регистрируются М1- или М2-специфичные спектральные характеристики.A known method for identifying the type of macrophages based on the assessment of the spectral characteristics of Mϕ after their interaction with an organic compound (JP 2015006173, C12N5 / 0786, 2015). A feature of this organic compound is that its colorability changes when it is added to a particular type of Mϕ (M1 or M2), as a result of which M1 or M2-specific spectral characteristics are recorded.
К недостаткам предложенного способа можно отнести значительную сложность его практического применения, связанную с необходимостью проведения спектрального анализа, а также недостаточно данных в патенте об «авторском» органическом соединении, что не позволяет оценить диагностическую точность идентификации типа макрофагов.The disadvantages of the proposed method include the significant complexity of its practical application, associated with the need for spectral analysis, as well as insufficient data in the patent on the "copyright" organic compound, which does not allow to evaluate the diagnostic accuracy of identification of the type of macrophages.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения рассматривается способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, заключающийся в оценке влияния клеток, полученных путем культивирования моноцитов периферической крови здоровых доноров в присутствии М1- или М2-поляризующих стимулов, на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ) (Mia S., Warnecke A., Zhang Х.-М., Malmstrom V., Harris RA. An optimized protocol for human M2 macrophages using M-CSF and IL-4/IL-10/TGF-β yields a dominant immunosuppressive phenotype. Scand J Immunol. - 2014. - V. 79. - P. 305-314). В способе-прототипе моноциты выделяют из мононуклеарных клеток (МНК) крови методом магнитной сепарации на бусах, покрытых анти-CD14-моноклональными антителами. Выделенные CD14-позитивные моноциты культивируют в течение 24 ч в присутствии поляризующих стимулов. В качестве М1-поляризующих сигналов используют комбинацию ЛПС и IFN-γ. В качестве М2-поляризующих стимулов используют 3 комбинации цитокинов: либо IL-4/IL-10, либо IL-4/IL-13, либо IL-4/IL-10/TGF-β. М1 и М2 макрофаги человека, генерированные in vitro из моноцитов крови, идентифицируют по их влиянию на пролиферативный ответ аутологичных Т-клеток в СКЛ. Для этого, генерированные М1- или М2-макрофаги со-культивируют с аутологичными МНК в соотношении 1:4-1:8 в течение 72 ч в присутствии моноклональных анти-CD3-антител. Уровень анти-CD3-стимулированного пролиферативного ответа аутологичных Т-клеток оценивают радиометрически по включению 3Н-тимидина. Согласно способу-прототипу M1(ЛПС/IFN-γ) макрофаги, генерированные из моноцитов крови здоровых доноров, усиливают пролиферацию Т-лимфоцитов, тогда как, M2(IL-4/IL-10) и M2(IL-4/IL-10/TGF-β) макрофаги снижают пролиферативный ответ аутологичных Т-клеток. Однако, М2 макрофаги, поляризованные с помощью IL-4/IL-13, значимо не влияют на интенсивность пролиферации в ауто-СКЛ. Способ-прототип был использован также для идентификации М1 и М2 макрофагов у пациентов с рассеянным склерозом (PC) и спондилоартритом (СпА). У больных с аутоиммунной патологией M2(IL-4/IL-10/TGF-β) макрофаги снижают пролиферацию аутологичных Т-клеток. Однако М1(ЛПС/IFN-γ) макрофаги больных СпА не усиливают, а у больных PC даже супрессируют пролиферацию Т-клеток в ауто-СКЛ, т.е. проявляют М2-подобные свойства. При этом какие-либо данные об эффектах двух других подтипов М2 макрофагов больных РС/СпА, поляризованных с помощью IL-4/IL-10 или IL-4/IL-13, в способе-прототипе отсутствуют.As a prototype of the present invention, a method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes is examined, which consists in assessing the effect of cells obtained by culturing healthy blood donor peripheral blood monocytes in the presence of M1 or M2 polarizing stimuli on the proliferative response T-lymphocytes in mixed culture of leukocytes (SCR) (Mia S., Warnecke A., Zhang H.-M., Malmstrom V., Harris RA. An optimized protocol for human M2 macrophages using M-CSF and IL-4 / IL -10 / TGF-β yields a dominant immunosuppressive phenotype. Scand J Immunol. - 2014 .-- V. 79. - P. 305-314). In the prototype method, monocytes are isolated from blood mononuclear cells (MNCs) by magnetic separation on beads coated with anti-CD14 monoclonal antibodies. Isolated CD14-positive monocytes were cultured for 24 hours in the presence of polarizing stimuli. As M1-polarizing signals, a combination of LPS and IFN-γ is used. Three combinations of cytokines are used as M2-polarizing stimuli: either IL-4 / IL-10, or IL-4 / IL-13, or IL-4 / IL-10 / TGF-β. M1 and M2 human macrophages generated in vitro from blood monocytes are identified by their influence on the proliferative response of autologous T cells in SCR. For this, the generated M1 or M2 macrophages are co-cultured with autologous MNCs in a ratio of 1: 4-1: 8 for 72 hours in the presence of monoclonal anti-CD3 antibodies. The level of anti-CD3-stimulated proliferative response of autologous T cells is evaluated radiometrically by incorporation of 3 H-thymidine. According to the prototype method M1 (LPS / IFN-γ), macrophages generated from blood monocytes from healthy donors enhance the proliferation of T lymphocytes, while M2 (IL-4 / IL-10) and M2 (IL-4 / IL-10 / TGF-β) macrophages reduce the proliferative response of autologous T cells. However, M2 macrophages polarized using IL-4 / IL-13 do not significantly affect the proliferation rate in auto-SCR. The prototype method was also used to identify M1 and M2 macrophages in patients with multiple sclerosis (PC) and spondylitis (SpA). In patients with autoimmune pathology M2 (IL-4 / IL-10 / TGF-β), macrophages reduce the proliferation of autologous T cells. However, the M1 (LPS / IFN-γ) macrophages of patients with SpA do not enhance, and in patients with PCs they even suppress the proliferation of T cells in auto-SCR, i.e. exhibit M2-like properties. In this case, any data on the effects of two other subtypes of M2 macrophages of patients with MS / SPA polarized using IL-4 / IL-10 or IL-4 / IL-13 are absent in the prototype method.
Недостатком данного способа является сам способ генерации макрофагов человека, в котором исключен этап дифференцировки моноцитов в про-М1 или про-М2 макрофаги под влиянием GM-CSF или M-CSF, соответственно. Авторы сразу используют краткосрочную, 24-часовую инкубацию CD14-позитивных моноцитов крови с М1- (ЛПС/IFN-γ) или М2- (IL-4/IL-10; IL-4/IL-13; IL-4/IL-10/TGF-β) поляризующими стимулами. В результате в культуре in vitro генерируются скорее всего М1- и М2-подобные активированные моноциты (но не дифференцированные макрофаги), что признают и сами авторы. Кроме того, для выделения моноцитов из периферической крови не обязательно использовать относительно дорогостоящий метод магнитной сепарации. Обогащенную популяцию моноцитов можно получить также более простым способом путем адгезии МНК периферической крови на пластике. Также недостатком способа-прототипа является то, что авторы предлагают идентифицировать М1 и М2 макрофаги человека, генерированные in vitro из моноцитов крови, по их влиянию на пролиферативный ответ аутологичных Т-клеток в СКЛ. В этом случае уровень пролиферации в ауто-СКЛ будет определяться не только М1/провоспалительным или М2\противовспалительным фенотипом макрофагов, но и функциональным состоянием самих Т-лимфоцитов, что особенно актуально при какой-либо патологии. Очевидно, что именно по этой причине предложенный подход оказался малоэффективным у больных с аутоиммунными заболеваниями. Также к недостаткам способа-прототипа можно отнести то, что авторы не показали его универсальности в отношении идентификации не только про-М1 или про-М2 клеток (т.е. макрофагов, генерированных из моноцитов крови в присутствии дифференцировочных GM-CSF или M-CSF факторов), но и в отношении идентификации других подтипов М2 макрофагов, поляризованных с помощью других известных стимулов (например, дексаметазона, или в результате фагоцитоза апоптотических клеток). Наконец, существенным недостатком способа-прототипа является также отсутствие установленных пороговых значений уровня пролиферативного ответа Т-клеток в СКЛ, которые позволяли бы с высокой диагностической точностью (специфичностью и чувствительностью) верифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы генерированных in vitro макрофагов человека.The disadvantage of this method is the very method of generating human macrophages, which excludes the stage of differentiation of monocytes into pro-M1 or pro-M2 macrophages under the influence of GM-CSF or M-CSF, respectively. The authors immediately use a short-term, 24-hour incubation of CD14-positive blood monocytes with M1- (LPS / IFN-γ) or M2- (IL-4 / IL-10; IL-4 / IL-13; IL-4 / IL- 10 / TGF-β) polarizing stimuli. As a result, in vitro culture, M1- and M2-like activated monocytes (but not differentiated macrophages) are most likely generated, which the authors themselves admit. In addition, it is not necessary to use the relatively expensive magnetic separation method to isolate monocytes from peripheral blood. An enriched population of monocytes can also be obtained in a simpler way by adhesion of peripheral blood MNCs on plastic. Another disadvantage of the prototype method is that the authors propose to identify M1 and M2 human macrophages generated in vitro from blood monocytes by their effect on the proliferative response of autologous T cells in SCR. In this case, the proliferation level in auto-SCR will be determined not only by the M1 / pro-inflammatory or M2 \ anti-inflammatory macrophage phenotype, but also by the functional state of the T-lymphocytes themselves, which is especially important for any pathology. Obviously, for this reason, the proposed approach was ineffective in patients with autoimmune diseases. The disadvantages of the prototype method include the fact that the authors did not show its universality in identifying not only pro-M1 or pro-M2 cells (i.e. macrophages generated from blood monocytes in the presence of differentiating GM-CSF or M-CSF factors), but also in relation to the identification of other subtypes of M2 macrophages polarized using other known stimuli (for example, dexamethasone, or as a result of phagocytosis of apoptotic cells). Finally, a significant drawback of the prototype method is the lack of established threshold values for the level of proliferative response of T cells in SCR, which would allow verification of the M1 and M2 functional phenotypes of human macrophages generated in vitro with high diagnostic accuracy (specificity and sensitivity).
Задачей изобретения является повышение диагностической точности способа идентификации макрофагов человека первого (М1) и второго (М2) типа.The objective of the invention is to increase the diagnostic accuracy of the method for identifying human macrophages of the first (M1) and second (M2) type.
Поставленная задача достигается тем, что в способе идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, заключающегося в оценке влияния клеток, полученных путем культивирования моноцитов периферической крови здоровых доноров в присутствии М1- или М2-поляризующих стимулов, на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ), сначала генерируют про-М1 и про-М2 макрофаги в течение 5 суток в присутствии GM-CSF и M-CSF, соответственно, затем в течение 2 суток индуцируют их поляризацию в М1 фенотип с помощью липополисахаридов (ЛПС), а также в М2а, М2с и М2апо фенотип с помощью IL-4, дексаметазона и апоптотических нейтрофилов, соответственно, после чего оценивают стимуляторную активность про-М1 и про-М2, а также поляризованных М1 и М2 макрофагов в отношении аллогенных Т-клеток, полученных от 2-3 здоровых доноров.This object is achieved in that in a method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes, which consists in assessing the effect of cells obtained by culturing peripheral blood monocytes from healthy donors in the presence of M1 or M2 polarizing stimuli on proliferative response of T-lymphocytes in a mixed culture of leukocytes (SCR), first pro-M1 and pro-M2 macrophages are generated for 5 days in the presence of GM-CSF and M-CSF, respectively, then they are induced for 2 days the polarization in the M1 phenotype using lipopolysaccharides (LPS), as well as in the M2a, M2c and M2apo phenotype using IL-4, dexamethasone and apoptotic neutrophils, respectively, after which the stimulatory activity of pro-M1 and pro-M2, as well as polarized M1, is evaluated and M2 macrophages in relation to allogeneic T cells obtained from 2-3 healthy donors.
Низкая стимуляторная активность про-М2 макрофагов в алло-СКЛ при значениях ИС<3,0 расч. ед. отличает их от про-М1 клеток со специфичностью 92% и чувствительностью 80%.Low stimulatory activity of pro-M2 macrophages in allo-SCR with IP values <3.0 calc. units distinguishes them from pro-M1 cells with a specificity of 92% and a sensitivity of 80%.
Низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<3,7 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, со специфичностью 91% и чувствительностью 80.4%.Low stimulatory activity of M2 (M2a, M2s, M2apo) macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells in allo-SCR with IP values <3.7 calc. units distinguishes them from M1 macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells with a specificity of 91% and a sensitivity of 80.4%.
Низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<2.95 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, со специфичностью 89% и чувствительностью 81%.Low stimulatory activity of M2 (M2a, M2c) macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells in allo-SCR with IP values <2.95 calc. units distinguishes them from M1 macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells, with a specificity of 89% and a sensitivity of 81%.
По нашему мнению предлагаемый способ является новым и обладает изобретательским уровнем.In our opinion, the proposed method is new and has an inventive step.
В современной литературе отсутствуют указания на предлагаемый способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, и по использованию данного способа для идентификации про-М1 и про-М2, генерированных из моноцитов крови в присутствии дифференцировочных факторов (GM-CSF и M-CSF, соответственно), а также М1 и М2 макрофагов, генерированных из про-М1 или про-М2 клеток под влиянием различных поляризующих сигналов (ЛПС для М1, и IL-4, дексаметазон, эффероцитоз для М2).There is no evidence in the modern literature on the proposed method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes, and for the use of this method for identifying pro-M1 and pro-M2 generated from blood monocytes in the presence of differentiating factors (GM- CSF and M-CSF, respectively), as well as M1 and M2 macrophages generated from pro-M1 or pro-M2 cells under the influence of various polarizing signals (LPS for M1, and IL-4, dexamethasone, efferocytosis for M2).
Как в способе-прототипе, так и в способах-аналогах для идентификации М1 и М2 макрофагов предлагается оценивать те или иные отдельные фенотипические и/или функциональные параметры. Либо уровень экспрессии антигенов гистосовместимости II класса (HLA-DR), ко-стимуляторных молекул (CD86, CD40), акцепторных scavenger-рецепторов (CD36, CD163) и маннозного CD206-рецептора, либо уровень и спектр секретируемых цитокинов/хемокинов, либо уровень экспрессии и активности различных ферментативных систем. Однако, диагностическая точность таких подходов остается неопределенной, поскольку не установлены пороговые значения тех или иных параметров, которые позволяли бы с высокой специфичностью и чувствительностью верифицировать М1 и М2 функциональные фенотипы генерированных in vitro макрофагов человека.Both in the prototype method and in analogue methods for identifying macrophages M1 and M2, it is proposed to evaluate certain individual phenotypic and / or functional parameters. Either the expression level of histocompatibility class II antigens (HLA-DR), co-stimulatory molecules (CD86, CD40), acceptor scavenger receptors (CD36, CD163) and mannose CD206 receptor, or the level and spectrum of secreted cytokines / chemokines, or the expression level and the activity of various enzymatic systems. However, the diagnostic accuracy of such approaches remains uncertain, since threshold values of certain parameters have not been established that would allow verification of the M1 and M2 functional phenotypes of human macrophages generated in vitro with high specificity and sensitivity.
Нами предлагается оценивать только один параметр, а именно, выраженность стимуляторной активности макрофагов в алло-СКЛ. По нашему мнению именно этот показатель является интегративным, поскольку детерминируется совокупностью вышеперечисленных клеточных параметров. Очевидно, что макрофаги М1/провоспалительного фенотипа, которые высоко экспрессируют молекулы, вовлеченные в активацию и ко-стимуляцию Т-лимфоцитов (HLA-DR, CD86, CD40), а также активно секретируют иммунорегуляторные (IL-12, IL-23), но не иммуносупрессорные (IL-10, TGF-β) цитокины будут индуцировать более выраженный пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на аллоантигены в СКЛ, чем макрофаги оппозитного М2/противовоспалительного фенотипа.We propose to evaluate only one parameter, namely, the severity of the stimulatory activity of macrophages in allo-SCR. In our opinion, this particular indicator is integrative, since it is determined by the totality of the above cellular parameters. Obviously, the M1 macrophages / pro-inflammatory phenotype, which highly express the molecules involved in the activation and co-stimulation of T-lymphocytes (HLA-DR, CD86, CD40), and also actively secrete immunoregulatory (IL-12, IL-23), but non-immunosuppressive (IL-10, TGF-β) cytokines will induce a more pronounced proliferative response of T-lymphocytes to alloantigens in SCR than macrophages of the opposite M2 / anti-inflammatory phenotype.
В способе-прототипе совсем не оценивают про-М1 и про-М2 клетки, генерированные из моноцитов крови в присутствии дифференцировочных GM-CSF или M-CSF факторов, а для поляризации моноцитов в М1 и М2 макрофаги используют достаточно дорогостоящие реактивы, а именно различные рекомбинантные цитокины (ЛПС/IFN-γ - для поляризации в М1-макрофаги; IL-4/IL-10/IL-13/TGF-β - для поляризации в М2-макрофаги). Предложенный способ позволяет оценивать практически все известные на сегодняшний день популяции М1 и М2 клеток, включая как про-М1 и про-М2 клетки, а также полученные из них поляризованные М1 и М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофаги, используя при этом более доступные средства. Поляризацию про-М1 и про-М2 клеток в М1 макрофаги осуществляют с помощью ЛПС (без IFN-γ), в М2 макрофаги М2а фенотипа - с помощью IL-4, в М2с фенотипа - с помощью дексаметазона и М2апо фенотипа - с помощью апоптотических нейтрофилов.In the prototype method, pro-M1 and pro-M2 cells generated from blood monocytes in the presence of differentiating GM-CSF or M-CSF factors are not evaluated at all, and rather expensive reagents are used for polarizing monocytes in M1 and M2, namely, various recombinant cytokines (LPS / IFN-γ for polarization in M1 macrophages; IL-4 / IL-10 / IL-13 / TGF-β for polarization in M2 macrophages). The proposed method allows to evaluate almost all populations of M1 and M2 cells known to date, including both pro-M1 and pro-M2 cells, as well as the polarized M1 and M2 (M2a, M2c, M2apo) macrophages obtained from them, using the more accessible funds. The pro-M1 and pro-M2 cells are polarized in M1 macrophages using LPS (without IFN-γ), in M2 macrophages of M2a phenotype - using IL-4, in M2c phenotype - using dexamethasone and M2apo phenotype - using apoptotic neutrophils .
В способе-прототипе М1 и М2 макрофаги идентифицируют в смешанной культуре лейкоцитов (СКЛ) по их влиянию на пролиферацию аутологичных Т-клеток, т.е. тестируемые макрофаги со-культивируют с Т-лимфоцитами, полученными от одного и того же человека. Такой подход не исключает вероятности того, что уровень пролиферативного ответа в СКЛ и, соответственно, точность определения фенотипа тестируемых макрофагов будет во многом зависеть, в том числе, от функционального состояния самих Т-клеток. Наличие каких-либо Т-клеточных дисфункций может приводить к искажению результатов идентификации. В предложенном способе тестируемые макрофаги со-культивируют в СКЛ с аллогенными Т-лимфоцитами, полученными от 2-3 здоровых доноров, что исключает возможность негативного влияния функционального статуса Т-клеток на результат оценки функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов.In the prototype method M1 and M2, macrophages are identified in a mixed culture of leukocytes (SCR) by their effect on the proliferation of autologous T cells, i.e. tested macrophages co-cultured with T-lymphocytes obtained from the same person. This approach does not exclude the likelihood that the level of proliferative response in SCR and, accordingly, the accuracy of determining the phenotype of the tested macrophages will largely depend, including on the functional state of the T cells themselves. The presence of any T-cell dysfunctions can lead to a distortion of the identification results. In the proposed method, the tested macrophages are co-cultured in SCR with allogeneic T-lymphocytes obtained from 2-3 healthy donors, which excludes the possibility of negative influence of the functional status of T-cells on the result of the assessment of the functional M1 and M2 macrophage phenotype.
На основе полученных нами данных предлагается изобретение, направленное на повышение диагностической точности идентификации макрофагов человека первого (М1) и второго (М2) типа.Based on our data, we propose an invention aimed at improving the diagnostic accuracy of identification of human macrophages of the first (M1) and second (M2) type.
Предложенный способ идентификации макрофагов человека первого (М1) и второго (М2) типа осуществляется следующим образом.The proposed method for identifying human macrophages of the first (M1) and second (M2) type is as follows.
Мононуклеарные клетки (МНК) человека получают центрифугированием гепаринизированной венозной крови (из расчета 50 Ед/мл гепарина) в градиенте плотности фиколла-верографина в течение 20 мин при 3000 об/мин. Собранные из интерфазы МНК двукратно отмывают, подсчитывают количество, и ресуспендируют в культуральной среде RPMI-1640, дополненной 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ пирувата натрия, 0,3 мг/мл L-глутамина, 1% незаменимых аминокислот, 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Биолот, Россия), в присутствии рекомбинантного GM-CSF человека (для генерации про-М1 Мϕ) или рекомбинантного M-CSF человека (для генерации про-М2 Мϕ) в дозе 50 нг/мл. Затем МНК в концентрации 4×106/мл инкубируют в течение 1 часа при 37°С и 5% СО2 в стерильных пластиковых чашках Петри или флаконах площадью 25 см2 (Falcon), в зависимости от количества выделенных клеток. После удаления неприлипших к пластику клеток, адгезивные клетки, из которых не менее 90-93% экспрессируют CD14 - линейный маркер моноцитов, культивируют в полной культуральной среде в течение 7 сут при 37°С и 5% СО2.Human mononuclear cells (MNCs) are obtained by centrifugation of heparinized venous blood (at the rate of 50 U / ml heparin) in the density gradient of ficoll-verographin for 20 min at 3000 rpm. The MNCs collected from the interphase are washed twice, the amount is counted, and resuspended in RPMI-1640 culture medium supplemented with 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM sodium pyruvate, 0.3 mg / ml L-glutamine, 1% essential amino acids, 10% fetal calf serum (FBS, Biolot, Russia), in the presence of recombinant human GM-CSF (to generate pro-M1 Mϕ) or recombinant human M-CSF (to generate pro-M2 Mϕ) at a dose of 50 ng / ml. Then, MNCs at a concentration of 4 × 10 6 / ml were incubated for 1 hour at 37 ° C and 5% CO 2 in sterile plastic Petri dishes or 25 cm 2 vials (Falcon), depending on the number of cells isolated. After removal of cells that did not adhere to the plastic, adhesive cells, of which at least 90-93% express CD14, a linear marker of monocytes, are cultured in a complete culture medium for 7 days at 37 ° C and 5% CO 2 .
Для генерации М1 и М2 макрофагов в культуры GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток или M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток на 5-й день добавляют поляризующие стимулы: для генерации М1 макрофагов используют липополисахарид (ЛПС; 10 мкг/мл), для М2а -интерлейкин-4 (ИЛ-4; 20 нг/мл), для М2с - дексаметазон (Декс; 50 нг/мл).For the generation of M1 and M2 macrophages in cultures of GM-CSF-differentiated pro-M1 cells or M-CSF-differentiated pro-M2 cells, polarizing stimuli are added on the 5th day: lipopolysaccharide (LPS; 10 μg / ml) is used to generate M1 macrophages for M2a - interleukin-4 (IL-4; 20 ng / ml), for M2s - dexamethasone (Dex; 50 ng / ml).
Для генерации М2апо Мϕ к монослою GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток добавляют нейтрофилы, подвергшиеся спонтанному апоптозу (количество AnnexinV+PI- клеток на ранних стадиях апоптоза и AnnexinV+PI+ клеток на поздних стадиях апоптоза составляло в среднем 61 и 12%, соответственно), в количестве 1-2×106/мл (из расчета ≈ 10 нейтрофилов на макрофаг) и инкубируют в течение 60 мин при 37°С и 5% CO2.To generate M2apo Mφ to the monolayer GM-CSF-differentiated pro-M1 cells was added neutrophils subjected to spontaneous apoptosis (number AnnexinV + PI - cells in the early stages of apoptosis and AnnexinV + PI + cells in late stages of apoptosis averaged 61 and 12%, respectively), in an amount of 1-2 × 10 6 / ml (based on ≈ 10 neutrophils per macrophage) and incubated for 60 min at 37 ° C and 5% CO 2 .
По окончании срока генерации культуральную среду удаляют, а полученные про-М1 и про-М2 клетки, а также поляризованные М1 и М2 макрофаги отделяют от пластика при помощи механической диссоциации, подсчитывают количество клеток и определяют их жизнеспособность (по исключению трипанового синего).At the end of the generation period, the culture medium is removed, and the obtained pro-M1 and pro-M2 cells, as well as polarized M1 and M2 macrophages, are separated from the plastic using mechanical dissociation, the number of cells is counted and their viability is determined (with the exception of trypan blue).
Аллостимуляторную активность макрофагов определяют по их способности стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток в смешанной культуре лейкоцитов (алло-СКЛ). Для этого МНК (1×105/лунку), полученные от 2-3 здоровых доноров крови, культивируют в 96-луночном круглодонном планшете в RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной сыворотки AB(IV) группы, в отсутствие (контроль) или присутствии различных типов макрофагов (в соотношении МНК:Мϕ=10:1). Пролиферацию Т-клеток оценивают радиометрически на 5 сутки по включению [3Н]-тимидина, который вносят за 18 часов до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Аллостимуляторную активность Мϕ выражают в виде индекса стимуляции (ИС), который рассчитывают как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мϕ к уровню спонтанной пролиферации МНК (без макрофагов).Allostimulatory activity of macrophages is determined by their ability to stimulate the proliferation of allogeneic T cells in a mixed culture of leukocytes (allo-SCR). For this, MNCs (1 × 10 5 / well) obtained from 2-3 healthy blood donors were cultured in a 96-well round-bottom plate in RPMI-1640 containing 10% inactivated serum AB (IV) group, in the absence (control) or the presence of various types of macrophages (in the ratio of MNC: Mϕ = 10: 1). T-cell proliferation was evaluated radiometrically on day 5 by the incorporation of [3H] -thymidine, which was introduced 18 hours before the end of cultivation at a dose of 1 μC / well. Allostimulatory activity of Mϕ is expressed as a stimulation index (IS), which is calculated as the ratio of the proliferative response of MNCs in the presence of Mϕ to the level of spontaneous proliferation of MNCs (without macrophages).
Приведенные ниже примеры конкретной реализации способа иллюстрируют диагностическую точность предложенного способа идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови.The following examples of a specific implementation of the method illustrate the diagnostic accuracy of the proposed method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes.
Пример 1.Example 1
Из моноцитов крови здоровых доноров генерировали GM-CSF-дифференцированные про-М1 и M-CSF-дифференцированные про-М2 макрофаги, после чего оценили их стимуляторную активность в алло-СКЛ. На рис. 1 показана аллостимуляторная активность GM-CSF-дифференцированных про-М1 и M-CSF-дифференцированных про-М2 макрофагов. Данные представлены в виде M±SEM. Видно, что по сравнению с про-М1 клетками индекс стимуляции про-М2 клеток в алло-СКЛ был в 2 раза ниже, составляя в среднем 2,28 против 4,6 расч. ед. (pU<0,05).From blood monocytes of healthy donors, GM-CSF-differentiated pro-M1 and M-CSF-differentiated pro-M2 macrophages were generated, after which their stimulatory activity in allo-SCR was evaluated. In fig. 1 shows the allostimulatory activity of GM-CSF-differentiated pro-M1 and M-CSF-differentiated pro-M2 macrophages. Data are presented as M ± SEM. It can be seen that, compared with pro-M1 cells, the stimulation index of pro-M2 cells in allo-SCR was 2 times lower, averaging 2.28 versus 4.6 calc. units (p U <0.05).
На рис. 2 представлена ROC-кривая (receiver-operator curve, ROC), иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения индекса стимуляции GM-CSF-дифференцированных про-М1 и M-CSF-дифференцированных про-М2 макрофагов в алло-СКЛ. ROC-анализ операционных характеристик теста и построенная характеристическая ROC-кривая показали, что площадь под кривой (AUC) для данного теста составила 0.90 (95% ДИ 0,76-1,03, р=0,001). В соответствии с классификацией Swets J.A. площадь под ROC-кривой от 0,5 до 0,7 свидетельствует об относительно невысокой точности диагностического теста (Swets J.A. Measuring the accuracy of diagnostic systems. Science. - 1988. - V. 240. - P. 1285-1293). Если площадь под ROC-кривой варьирует от 0,7 до 0,9, то предложенный тест может быть использован в диагностических целях. Площадь под ROC-кривой выше 0,9 характеризует тест, обладающий наиболее высокой диагностической точностью. Поскольку в нашем случае площадь под ROC-кривой составляла 0,90, это свидетельствует о том, что оценка уровня аллостимуляторной активности Мϕ, генерированных in vitro из моноцитов крови, может быть использована для идентификации GM-CSF-дифференцированных про-М1 и M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток.In fig. Figure 2 presents a ROC curve (receiver-operator curve, ROC) illustrating the relationship between sensitivity and specificity for different points of separation of the stimulation index of GM-CSF-differentiated pro-M1 and M-CSF-differentiated pro-M2 macrophages in allo SCR. The ROC analysis of the operational characteristics of the test and the constructed characteristic ROC curve showed that the area under the curve (AUC) for this test was 0.90 (95% CI 0.76-1.03, p = 0.001). According to Swets J.A. classification the area under the ROC curve from 0.5 to 0.7 indicates the relatively low accuracy of the diagnostic test (Swets J.A. Measuring the accuracy of diagnostic systems. Science. - 1988. - V. 240. - P. 1285-1293). If the area under the ROC curve varies from 0.7 to 0.9, then the proposed test can be used for diagnostic purposes. The area under the ROC curve above 0.9 characterizes the test with the highest diagnostic accuracy. Since in our case the area under the ROC curve was 0.90, this suggests that an assessment of the level of allostimulatory activity of Mϕ generated in vitro from blood monocytes can be used to identify GM-CSF-differentiated pro-M1 and M-CSF differentiated pro-M2 cells.
Построение характеристической ROC-кривой обеспечивает не только понимание того, что определенный тест является диагностически полезным и информативным, но позволяет также определить наиболее оптимальную точку разделения, т.е. такое пороговое значение теста, выше (или ниже) которого можно наиболее эффективно проводить диагностическую процедуру (Петри А., Сэбин К. Наглядная медицинская статистика. Москва: Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2009. - С. 108-110).The construction of the characteristic ROC curve provides not only the understanding that a certain test is diagnostically useful and informative, but also allows you to determine the most optimal separation point, i.e. such a threshold value of the test, above (or below) which it is possible to carry out the diagnostic procedure most effectively (Petri A., Sabin K. Visual medical statistics. Moscow: Publishing Group "GEOTAR-Media", 2009. - P. 108-110).
Поэтому следующим шагом в оценке построенной ROC-кривой стало определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения. Для индекса стимуляции про-М1 и про-М2 клеток в алло-СКЛ точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (80%) и специфичности (92%) было пороговое значение <3,0 расч. ед. (отношение правдоподобия 9,60).Therefore, the next step in assessing the constructed ROC curve was to determine the sensitivity, specificity, and likelihood ratio for various separation points. For the stimulation index of pro-M1 and pro-M2 cells in allo-SCR, the separation point corresponding to the maximum sensitivity (80%) and specificity (92%) was the threshold value <3.0 calc. units (likelihood ratio 9.60).
Таким образом, низкая стимуляторная активность про-М2 макрофагов в алло-СКЛ при значениях ИС<3,0 расч. ед. отличает их от про-М1 клеток со специфичностью 92% и чувствительностью 80%.Thus, the low stimulatory activity of pro-M2 macrophages in allo-SCR with IP values <3.0 calc. units distinguishes them from pro-M1 cells with a specificity of 92% and a sensitivity of 80%.
Пример 2.Example 2
Из моноцитов крови здоровых доноров генерировали GM-CSF-дифференцированные про-М1, которые затем были поляризованы в М1 макрофаги с помощью ЛПС (М1лпс), или в М2 макрофаги с помощью или ИЛ-4 (М2а, М2ил-4), или дексаметазона (М2с, М2декс) или фагоцитоза апоптотических нейтрофилов (М2апо), после чего оценили их стимуляторную активность в алло-СКЛ. На рис. 3 показана аллостимуляторная активность М1 (М1Лпс) и М2 (М2ил-4, - М2декс, М2Апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток. Данные представлены в виде M±SEM. Видно, что по сравнению с поляризованными М1 макрофагами индекс стимуляции всех трех субтипов поляризованных М2 макрофагов (М2ил-4, М2декс, М2апо) в алло-СКЛ был более чем в 5 раз ниже, составляя в среднем 2,25, 2,21 и 2,58 расч. ед. для М2ил-4, М2декс, М2Апо, соответственно, против 12,4 расч. ед. для М1лпс (pU<0,001).GM-CSF-differentiated pro-M1 was generated from blood monocytes of healthy donors, which were then polarized in M1 macrophages using LPS (M1 LPS ), or in M2 macrophages using either IL-4 (M2a, M2 il-4 ), or dexamethasone (M2c, M2 dex ) or phagocytosis of apoptotic neutrophils (M2 apo ), after which their stimulatory activity in allo-SCR was evaluated. In fig. Figure 3 shows the allostimulatory activity of M1 (M1 Lps ) and M2 (M2 il-4 , M2 dex , M2 Apo ) macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells. Data are presented as M ± SEM. It can be seen that, compared with polarized M1 macrophages, the stimulation index of all three subtypes of polarized M2 macrophages (M2 il-4 , M2 dex , M2 apo ) in allo-SCR was more than 5 times lower, averaging 2.25, 2, 21 and 2.58 calc. units for M2 il-4 , M2 dex , M2 Apo , respectively, against 12.4 calc. units for M1 lps (p U <0.001).
На рис. 4 представлена ROC-кривая, иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения индекса стимуляции М1 и М2 (М2а, М2с и М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, в алло-СКЛ. ROC-анализ операционных характеристик теста и построенная характеристическая ROC-кривая показали, что площадь под кривой (AUC) для данного теста составила 0.96 (95% ДИ 0,92-0,99, p<0,0001).In fig. Figure 4 presents the ROC curve illustrating the relationship between sensitivity and specificity for different points of separation of the stimulation index M1 and M2 (M2a, M2c and M2 apo ) of macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells into allo-SCR. The ROC analysis of the operational characteristics of the test and the constructed characteristic ROC curve showed that the area under the curve (AUC) for this test was 0.96 (95% CI 0.92-0.99, p <0.0001).
Определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения показало, что для индекса стимуляции в алло-СКЛ М1 и М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (80,4%) и специфичности (91%) было пороговое значение <3,7 расч. ед. (отношение правдоподобия 9,04).The determination of the sensitivity, specificity and likelihood ratio for various separation points showed that for the stimulation index in allo-SCR M1 and M2 (M2a, M2c, M2apo) macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells, the separation point corresponding to the maximum indicators of sensitivity (80.4%) and specificity (91%) had a threshold value of <3.7 calc. units (likelihood ratio 9.04).
Таким образом, низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с, М2апо) макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<3,7 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из GM-CSF-дифференцированных про-М1 клеток, со специфичностью 91% и чувствительностью 80.4%.Thus, the low stimulatory activity of M2 (M2a, M2c, M2apo) macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells in allo-SCR with IP values <3.7 calc. units distinguishes them from M1 macrophages polarized from GM-CSF-differentiated pro-M1 cells with a specificity of 91% and a sensitivity of 80.4%.
Пример 3.Example 3
Из моноцитов крови здоровых доноров генерировали M-CSF-дифференцированные про-М2, которые затем были поляризованы в М1 макрофаги с помощью ЛПС (М1Лпс), или в М2 макрофаги с помощью ИЛ-4 (М2а, М2ил-4), или дексаметазона (М2с, М2декс), после чего оценили их стимуляторную активность в алло-СКЛ.From blood monocytes of healthy donors, M-CSF-differentiated pro-M2 was generated, which were then polarized in M1 macrophages using LPS (M1 LPS ), or in M2 macrophages using IL-4 (M2a, M2 il-4 ), or dexamethasone (M2s, M2 dex ), after which their stimulatory activity in allo-SCR was evaluated.
На рис. 5 показана аллостимуляторная активность М1 (М1лпс) и М2 (М2ил-4, М2декс) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток. Данные представлены в виде M±SEM. Видно, что по сравнению с поляризованными М1 макрофагами индекс стимуляции М2 макрофагов, поляризованных с помощью ИЛ-4 или дексаметазона, в алло-СКЛ был почти в 3 раз ниже, составляя в среднем 2,42 и 2,41 расч. ед. для М2Ил-4 и М2ДЕкс, соответственно, против 6,56 расч. ед. для М1Лпс (pU<0.01).In fig. Figure 5 shows the allostimulatory activity of M1 (M1 LPS ) and M2 (M2 il-4 , M2 dex ) macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells. Data are presented as M ± SEM. It can be seen that, compared with polarized M1 macrophages, the stimulation index of M2 macrophages polarized using IL-4 or dexamethasone in allo-SCR was almost 3 times lower, averaging 2.42 and 2.41 calculations. units for M2 IL-4 and M2 DEx , respectively, against 6.56 calc. units for M1 Lps (p U <0.01).
На рис. 6 представлена ROC-кривая, иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения индекса стимуляции М1 и М2 (М2а и М2с) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, в алло-СКЛ. ROC-анализ операционных характеристик теста и построенная характеристическая ROC-кривая показали, что площадь под кривой (AUC) для данного теста составила 0.89 (95% ДИ 0,79-0,99, р<0,0001).In fig. Figure 6 presents the ROC curve illustrating the relationship between sensitivity and specificity for different points of separation of the stimulation index M1 and M2 (M2a and M2c) of macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells into allo-SCR. The ROC analysis of the operational characteristics of the test and the constructed characteristic ROC curve showed that the area under the curve (AUC) for this test was 0.89 (95% CI 0.79-0.99, p <0.0001).
Определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия для различных точек разделения показало, что для индекса стимуляции в алло-СКЛ М1 и М2 (М2а, М2с) макрофагов, поляризованных из М-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, точкой разделения, соответствующей максимальным показателям чувствительности (81%) и специфичности (89%) было пороговое значение <2,95 расч. ед. (отношение правдоподобия 7,3).The determination of the sensitivity, specificity and likelihood ratio for various separation points showed that for the stimulation index in allo-SCR M1 and M2 (M2a, M2c) macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells, the separation point corresponding to the maximum sensitivity indicators (81%) and specificity (89%) had a threshold value of <2.95 calc. units (likelihood ratio 7.3).
Таким образом, низкая стимуляторная активность М2 (М2а, М2с) макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, в алло-СКЛ при значениях ИС<2.95 расч. ед. отличает их от М1 макрофагов, поляризованных из M-CSF-дифференцированных про-М2 клеток, со специфичностью 89% и чувствительностью 81%.Thus, the low stimulatory activity of M2 (M2a, M2c) macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells in allo-SCR with IP values <2.95 calc. units distinguishes them from M1 macrophages polarized from M-CSF-differentiated pro-M2 cells, with a specificity of 89% and a sensitivity of 81%.
Приведенные примеры представлены для иллюстрации, но не для ограничения объема заявленного изобретения. Другие варианты изобретения будут полностью очевидны специалистам в данной области.The examples are presented to illustrate, but not to limit the scope of the claimed invention. Other embodiments of the invention will be readily apparent to those skilled in the art.
Данное изобретение предлагает достаточно эффективный способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови, который отличается высокой диагностической точностью (специфичность на уровне 89-92% и чувствительность на уровне 80-81%), а также универсальностью подхода, поскольку позволяет идентифицировать различные популяции М1 и М2 макрофагов, включая про-М1 и про-М2 клетки, а также поляризованные различными стимулами М1 и М2 макрофаги. Упрощение способа идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека достигается за счет оценки только одного, интегрального параметра - индекса стимуляторной активности тестируемых макрофагов в алло-СКЛ.This invention provides a sufficiently effective method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes, which is characterized by high diagnostic accuracy (specificity at the level of 89-92% and sensitivity at the level of 80-81%), as well as the universality of the approach, since it allows the identification of different populations of M1 and M2 macrophages, including pro-M1 and pro-M2 cells, as well as macrophages polarized by various stimuli M1 and M2. A simplification of the method for identifying the functional M1 and M2 phenotype of human macrophages is achieved by evaluating only one integral parameter - the index of stimulatory activity of the tested macrophages in allo-SCR.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019118746A RU2717024C1 (en) | 2019-06-17 | 2019-06-17 | Method for identifying functional m1 and m2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019118746A RU2717024C1 (en) | 2019-06-17 | 2019-06-17 | Method for identifying functional m1 and m2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2717024C1 true RU2717024C1 (en) | 2020-03-17 |
Family
ID=69898613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019118746A RU2717024C1 (en) | 2019-06-17 | 2019-06-17 | Method for identifying functional m1 and m2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2717024C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739572C1 (en) * | 2020-12-06 | 2020-12-25 | Игорь Юрьевич Малышев | Modified anti-inflammatory macrophage, a method for production and use thereof |
| RU2792602C1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-03-22 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) | Method for obtaining primary macrophage lines with pro-inflammatory properties |
-
2019
- 2019-06-17 RU RU2019118746A patent/RU2717024C1/en active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BARROS M.H.M. et al. Macrophage polarisation: an immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages, PloS one, 2013,V. 8, N. 11, p.e80908. * |
| MIA S. et al. An optimized protocol for human M2 macrophages using M‐CSF and IL‐4/IL‐10/TGF‐β yields a dominant immunosuppressive phenotype, Scandinavian journal of immunology, 2014, V. 79, N. 5, p.305-314. * |
| MIA S. et al. An optimized protocol for human M2 macrophages using M‐CSF and IL‐4/IL‐10/TGF‐β yields a dominant immunosuppressive phenotype, Scandinavian journal of immunology, 2014, V. 79, N. 5, p.305-314. BARROS M.H.M. et al. Macrophage polarisation: an immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages, PloS one, 2013, V. 8, N. 11, p.e80908. WANG N. et al. Molecular mechanisms that influence the macrophage m1-m2 polarization balance, Frontiers in immunology, 2014, V. 5, p.614-614. НИКОНОВА А.А. и др. Особенности противовирусной активности разных типов человеческих макрофагов, Иммунология, 2016, V. 37, N. 6, с.300-305. * |
| WANG N. et al. Molecular mechanisms that influence the macrophage m1-m2 polarization balance, Frontiers in immunology, 2014, V. 5, p.614-614. * |
| НИКОНОВА А.А. и др. Особенности противовирусной активности разных типов человеческих макрофагов, Иммунология, 2016, V. 37, N. 6, с.300-305. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739572C1 (en) * | 2020-12-06 | 2020-12-25 | Игорь Юрьевич Малышев | Modified anti-inflammatory macrophage, a method for production and use thereof |
| RU2792602C1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-03-22 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) | Method for obtaining primary macrophage lines with pro-inflammatory properties |
| RU2810558C1 (en) * | 2023-05-02 | 2023-12-27 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Method of selecting medicinal products for pharmacological induction of mitochondrial dysfunction in macrophages for antitumor therapy |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Winkler et al. | Activation of group 2 innate lymphoid cells after allergen challenge in asthmatic patients | |
| Demedts et al. | Different roles for human lung dendritic cell subsets in pulmonary immune defense mechanisms | |
| Dzionek et al. | Plasmacytoid dendritic cells: from specific surface markers to specific cellular functions | |
| Wojtan et al. | Macrophage polarization in interstitial lung diseases | |
| Bellinghausen et al. | Enhanced production of CCL18 by tolerogenic dendritic cells is associated with inhibition of allergic airway reactivity | |
| US20190336539A1 (en) | A method of treatment | |
| Chakraborty et al. | Impact of Treg on other T cell subsets in progression of fibrosis in experimental lung fibrosis | |
| Nakajima et al. | Lung transplantation: infection, inflammation, and the microbiome | |
| Liu et al. | NMAAP1 expressed in BCG-activated macrophage promotes M1 macrophage polarization | |
| Götz et al. | Oxidative stress enhances dendritic cell responses to Plasmodium falciparum | |
| LaVoy et al. | A single bout of dynamic exercise by healthy adults enhances the generation of monocyte-derived-dendritic cells | |
| Garay et al. | Crosstalk between PKA and Epac regulates the phenotypic maturation and function of human dendritic cells | |
| IL285460B2 (en) | Kits, compositions and methods for evaluating immune system status | |
| RU2717024C1 (en) | Method for identifying functional m1 and m2 phenotype of human macrophages generated in vitro from blood monocytes | |
| Lebre et al. | Aberrant function of peripheral blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells in atopic dermatitis patients | |
| Huang et al. | Multiple sclerosis: interferon-beta induces CD123+ BDCA2− dendritic cells that produce IL-6 and IL-10 and have no enhanced type I interferon production | |
| Talker et al. | Transcriptomic signature and metabolic programming of bovine classical and nonclassical monocytes indicate distinct functional specializations | |
| Kim et al. | The role of the microbiota in myelopoiesis during homeostasis and inflammation | |
| JP2024507587A (en) | Regulatory T cell (Treg) extracellular vesicle compositions and methods | |
| Ford et al. | In vitro differentiated human cd4+ t cells produce hepatocyte growth factor | |
| Chen et al. | Modulation of glucose metabolism by 2-Deoxy-D-Glucose (2DG) promotes IL-17 producing human T cell subsets | |
| EP4578454A1 (en) | Compositions comprising platelet derived extracellular vesicles | |
| RU2590696C2 (en) | Agent for differentiation of monocyte-like cells | |
| Al Abadey | Investigating microglial responses to nalfurafine in pro-and anti-inflammatory conditions | |
| Jamal Jameel | Systemic immune pathologies in the infectious defense against respiratory viruses in different endotypes of severe asthma |