RU2713111C1 - Test strip for determining content of ethyl alcohol in blood by electrochemical method using a portable amperometric cell - Google Patents
Test strip for determining content of ethyl alcohol in blood by electrochemical method using a portable amperometric cell Download PDFInfo
- Publication number
- RU2713111C1 RU2713111C1 RU2019106533A RU2019106533A RU2713111C1 RU 2713111 C1 RU2713111 C1 RU 2713111C1 RU 2019106533 A RU2019106533 A RU 2019106533A RU 2019106533 A RU2019106533 A RU 2019106533A RU 2713111 C1 RU2713111 C1 RU 2713111C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- alcohol
- blood
- enzyme
- ethanol
- test strip
- Prior art date
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 167
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 title claims abstract description 83
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 24
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims abstract description 12
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 239000010439 graphite Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 13
- GOPYZMJAIPBUGX-UHFFFAOYSA-N [O-2].[O-2].[Mn+4] Chemical class [O-2].[O-2].[Mn+4] GOPYZMJAIPBUGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N manganese dioxide Chemical compound O=[Mn]=O NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 46
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 46
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 46
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 15
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 15
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- -1 p-chloromercuribenzoate ion Chemical class 0.000 description 13
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 11
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 9
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 8
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 8
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 8
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 8
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 6
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 6
- 239000011173 biocomposite Substances 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000926178 Tubulanus polymorphus Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Natural products O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);octadecacyanide Chemical compound [Fe+2].[Fe+2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000010411 electrocatalyst Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229960003351 prussian blue Drugs 0.000 description 3
- 239000013225 prussian blue Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 229920008790 Amorphous Polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 102000003983 Flavoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010057573 Flavoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004700 cobalt complex Chemical class 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- YOXHCYXIAVIFCZ-UHFFFAOYSA-N cyclopropanol Chemical compound OC1CC1 YOXHCYXIAVIFCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 2
- 239000012776 electronic material Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002346 layers by function Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);diacetate Chemical compound [Mn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000858 peroxisomal effect Effects 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 2
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 2
- 229940001470 psychoactive drug Drugs 0.000 description 2
- 239000004089 psychotropic agent Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-M 7,8-dimethyl-4-oxo-10-(2,3,4,5-tetrahydroxypentyl)benzo[g]pteridin-2-olate Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC([O-])=NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001605 Alcohol poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000824799 Canis lupus dingo Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 150000000996 L-ascorbic acids Chemical class 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000007891 compressed tablet Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BFWIGFAPOQYXKN-UHFFFAOYSA-N cyclopropane;hydrate Chemical compound O.C1CC1 BFWIGFAPOQYXKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004070 electrodeposition Methods 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940071125 manganese acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000013110 organic ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002907 osmium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000506 psychotropic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 150000007968 uric acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области химии, биосенсорики и обеспечению безопасности и здоровья человека и может быть использовано для количественного определения содержания этилового спирта в крови человека. Принципиальная схема производственного цикла изготовления тест-полоски для определения этанола в крови электрохимическим методом представлена на Фиг. 1.The invention relates to the field of chemistry, biosensorics and to ensure safety and human health and can be used to quantify the content of ethyl alcohol in human blood. A schematic diagram of the production cycle for the manufacture of test strips for determining ethanol in the blood by the electrochemical method is presented in FIG. 1.
Этиловый спирт (этанол) имеет существенную хозяйственную значимость: он используется как растворитель в фармацевтике, в быту и в промышленности, в качестве добавки к топливу, входит в состав антифризов, часто служит в качестве дезинфектанта. Этанол используется в качестве исходного материала в химическом синтезе. Он присутствует в составе различных пищевых продуктов и напитков, существенно влияя на их потребительские свойства.Ethyl alcohol (ethanol) has significant economic significance: it is used as a solvent in pharmaceuticals, in the home, and in industry, as an additive to fuel, is a part of antifreeze agents, and often serves as a disinfectant. Ethanol is used as a starting material in chemical synthesis. It is present in various foods and drinks, significantly affecting their consumer properties.
Поскольку этанол является наиболее известным и доступным в быту психотропным веществом, его практическая значимость для населения во многом определяется юридическими нормами, регулирующими его содержание в крови водителей. В настоящее время порядок тестирования водителей на неалкогольные психотропные средства определяется Приказом Министерства здравоохранения РФ от 15.06.2015 года №344н «О проведении обязательного медицинского освидетельствования водителей транспортных средств», вступившим в силу 26 марта 2016 года. С 03.07.2018 г вступила в силу поправка в законодательство, согласно которой степень опьянения водителей определяется по анализу крови. С указанной даты вступил в силу Федеральный закон от 3 апреля 2018 года N 62-ФЗ, которым были внесены изменения в статью 12.8 КоАП РФ «Управление транспортным средством водителем, находящимся в состоянии опьянения, передача управления транспортным средством лицу, находящемуся в состоянии опьянения». Согласно этой поправке, «административная ответственность, предусмотренная настоящей статьей и частью 3 статьи 12.27 настоящего Кодекса, наступает в случае установленного факта употребления вызывающих алкогольное опьянение веществ, который определяется наличием абсолютного этилового спирта в концентрации, превышающей возможную суммарную погрешность измерений, а именно, наличием абсолютного этилового спирта в концентрации 0,3 и более грамма на один литр крови». С учетом молекулярной массы этанола равной 46 г/моль, это эквивалентно 6,52 мМ.Since ethanol is the most well-known and accessible psychotropic substance in everyday life, its practical significance for the population is largely determined by legal standards that regulate its content in the blood of drivers. Currently, the procedure for testing drivers for non-alcoholic psychotropic drugs is determined by Order No. 344n of the Ministry of Health of the Russian Federation dated June 15, 2015 “On Conducting a Mandatory Medical Examination of Vehicle Drivers”, which entered into force on March 26, 2016. On July 3, 2018, an amendment to the law came into force, according to which the degree of intoxication of drivers is determined by a blood test. From this date, Federal Law of April 3, 2018 N 62-ФЗ entered into force, which amended Article 12.8 of the Code of Administrative Offenses of the Russian Federation “Driving a vehicle while intoxicated, transferring control of a vehicle to a person while intoxicated”. According to this amendment, “the administrative responsibility provided for by this article and
Процедура выявления водителей, не способных адекватно контролировать свои действия по управлению транспортным средством, разделена на два самостоятельных этапа. Первичное тестирование проводится сотрудниками полиции на месте остановки водителя на дороге с применением портативного алкотестера. Развернутое тестирование водителя представляет собой медицинское освидетельствование в медицинском учреждении. Такое освидетельствование проводится, в случае, если водитель отказался проходить проверку на алкотестере. Также проведение медицинского освидетельствования в медицинском учреждении необходимо для выявления присутствия в организме неалкогольных психотропных средств, которые не могут быть выявлены с помощью алкотестеров.The procedure for identifying drivers who are not able to adequately control their actions to drive a vehicle is divided into two independent stages. Initial testing is carried out by police at the driver's stop on the road using a portable breathalyzer. Extensive driver testing is a medical examination in a medical facility. Such a survey is carried out if the driver refused to pass the test on the breathalyzer. Also, conducting a medical examination in a medical institution is necessary to detect the presence in the body of non-alcoholic psychotropic drugs that cannot be detected using breathalyzers.
В настоящее время ни в России, ни в других странах мира не выпускаются доступные для применения в быту портативные устройства для определения этанола непосредственно в крови. Задача по самоконтролю содержания этанола в крови решается водителями путем определения содержания паров этанола в выдыхаемом воздухе с помощью портативных дыхательных алкостестеров. Популярными среди массовых потребителей являются такие модели приборов этого типа, как Ritmix rat 350, AT 6000, Динго Е010, Alcohunter professional, Carline Alco 200, Inspector at 200, Alcosafe KX-7000s. Однако, зависимость содержания этанола в крови и выдыхаемом воздухе не имеет строгого и однозначного характера: на нее влияют такие факторы, как пол и возраст человека, особенности его метаболизма, влажность и температура окружающего воздуха. За счет этого возникает риск недостоверного определения этанола в собственной крови на основании показателей дыхательных алкотестеров. Это может привести к наложению мер административной ответственности на водителя, обнаружившего, что содержание этанола в выдыхаемом им воздухе соответствует нормативам.At present, portable devices for determining ethanol directly in the blood are not available either in Russia or in other countries of the world. The task of self-monitoring the ethanol content in the blood is solved by drivers by determining the content of ethanol vapor in the exhaled air using portable respiratory alkostesters. Popular among mass consumers are such models of devices of this type as Ritmix rat 350, AT 6000, Dingo E010, Alcohunter professional, Carline Alco 200, Inspector at 200, Alcosafe KX-7000s. However, the dependence of the ethanol content in the blood and exhaled air is not strict and unambiguous: it is influenced by factors such as gender and age of a person, especially his metabolism, humidity and ambient temperature. Due to this, there is a risk of an unreliable determination of ethanol in one’s own blood based on respiratory breath tester indicators. This can lead to the imposition of administrative responsibility measures on the driver who finds that the ethanol content in the air exhaled by them complies with the standards.
Таким образом, ужесточение законодательства РФ делает актуальным вопрос о разработке устройства, позволяющего проводить определение содержания этанола в крови прямым способом. Удобным решением для этой цели является принцип электрохимической детекции с использованием высокоспецифичного фермента, распознающей целевой аналит - этиловый спирт. Данный принцип успешно реализован в портативных глюкометрах, рутинно используемых в быту для определения в крови глюкозы. На рынке массово представлены такие марки портативных глюкометров, как OneTouch (США), Contour (Ascensia Diabetes Care, Германия), Диаконт (Россия), Accu-Chek Active (Roche, США) Сателлит экспресс (Элта, Россия). Основой одноразовый электродов для этих глюкометров - так называемых тест-полосок является фермент глюкозооксидаза, выделяемая из плесневых грибов (Aspergillus niger, Penicillium funiculosum и других).Thus, toughening of the legislation of the Russian Federation makes urgent the question of developing a device that allows the determination of ethanol in the blood in a direct way. A convenient solution for this purpose is the principle of electrochemical detection using a highly specific enzyme that recognizes the target analyte - ethyl alcohol. This principle has been successfully implemented in portable glucometers routinely used in everyday life for determining glucose in the blood. Such brands of portable glucometers as OneTouch (USA), Contour (Ascensia Diabetes Care, Germany), Diaconte (Russia), Accu-Chek Active (Roche, USA) Satellite Express (Elta, Russia) are massively represented on the market. The basis of disposable electrodes for these glucometers, the so-called test strips, is the glucose oxidase enzyme isolated from molds (Aspergillus niger, Penicillium funiculosum and others).
Важной предпосылкой успешного решения поставленной задачи изобретения по созданию тест-полоски для определения этанола в крови является наличие источника фермента, способного с высокой избирательностью распознавать целевой аналит в составе крови и генерировать электрохимический сигнал (катодный или анодный ток). Таким ферментом могут служить алкогольоксидазы различных видов дрожжей, плесневых грибов и бактерий. Среди них особое место занимают метилотрофные дрожжи, которые благодаря наличию исключительно мощного промотора ген алкогольоксидазы (АОХ1) часто используются в качестве основы для создания рекомбинантных продуцентов практически важных белков. Метилотрофные дрожжи - это эукариотические организмы, которые способны усваивать метиловый спирт как единый источник углерода и энергии. Большинство этих организмов принадлежат к родам: Pichia, Candida, Hansenula и Torulopsis [Kurtzman C.P. Synonymy of the yeast genera Hansenula and Pichia demonstrated through comparisons of deoxyribonucleic acid relatedness // Antonie Van Leeuwenhoek. 1984. v. 50. p. 209-217]. Путь обмена метанола сравнительно простой и охватывает три последовательные стадии окисления метанола до углекислоты. Первую стадию этого процесса катализирует алкогольоксидаза (ЕС. 1.1.3.13).An important prerequisite for the successful solution of the problem of the invention to create a test strip for determining ethanol in the blood is the presence of an enzyme source capable of highly selective recognition of the target analyte in the blood and generating an electrochemical signal (cathodic or anode current). Alcohol oxidases of various types of yeast, molds, and bacteria can serve as such an enzyme. Among them, methylotrophic yeast occupies a special place, which due to the presence of an exceptionally powerful promoter, the alcohol oxidase gene (AOX1) is often used as the basis for the creation of recombinant producers of practically important proteins. Methylotrophic yeast is eukaryotic organisms that can metabolize methyl alcohol as a single source of carbon and energy. Most of these organisms belong to the genera: Pichia, Candida, Hansenula and Torulopsis [Kurtzman C.P. Synonymy of the yeast genera Hansenula and Pichia demonstrated through comparisons of deoxyribonucleic acid relatedness // Antonie Van Leeuwenhoek. 1984. v. 50. p. 209-217]. The methanol exchange pathway is relatively simple and covers three successive stages of the oxidation of methanol to carbon dioxide. The first stage of this process is catalyzed by alcohol oxidase (EC. 1.1.3.13).
СН3ОН+O2→CH2O+H2O2 CH 3 OH + O 2 → CH 2 O + H 2 O 2
В этой реакции участвует молекулярный кислород, и образуются два токсичных продукта - формальдегид и пероксид водорода. Это обуславливает особую клеточную локализацию (компартментализацию) фермента в специальных органеллах, называемых микротельцами, или пероксисомами [Suiter G., Harder W., Veenhuis M. Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts // FEMS Microbiol. Rev. 1993. v. 11. p. 285-296]. Органеллы диаметром 0,2-1,5 мкм отделены от цитозоля одинарной мембраной и часто содержат кристалловидную сердцевину, уложенную молекулами АО. Кроме АО в пероксисомах содержится каталаза, которая разрушает токсичный пероксид водорода. Формальдегид, образующийся в ходе ферментативной реакции под действием АО, диффундирует из пероксисом в цитозоль, где окисляется до углекислого газа в процессе двух дегидрогеназных реакций.Molecular oxygen is involved in this reaction, and two toxic products are formed - formaldehyde and hydrogen peroxide. This leads to a special cellular localization (compartmentalization) of the enzyme in special organelles called microbodies or peroxisomes [Suiter G., Harder W., Veenhuis M. Structural and functional aspects of peroxisomal membranes in yeasts // FEMS Microbiol. Rev. 1993. v. 11. p. 285-296]. Organelles with a diameter of 0.2-1.5 μm are separated from the cytosol by a single membrane and often contain a crystalline core laid by AO molecules. In addition to AO, peroxisomes also contain catalase, which destroys toxic hydrogen peroxide. Formaldehyde formed during the enzymatic reaction under the influence of AO diffuses from peroxisome into the cytosol, where it is oxidized to carbon dioxide in the course of two dehydrogenase reactions.
Алкогольоксидаза - ключевой фермент для метилотрофного обмена метилотрофных дрожжей. Этот фермент является флавопротеином, который содержит флавинадениндинуклеотид (ФАД) как простетическую группу, связанную с апоферментом нековалентными связями. Активный белок является октамером (Рис. 1), который складывается из восьми идентичных ФАД-содержащих субъединиц с общей молекулярной массой 600 кДа.Alcohol oxidase is a key enzyme for methylotrophic metabolism of methylotrophic yeast. This enzyme is a flavoprotein that contains flavin adenine dinucleotide (FAD) as a prosthetic group linked to the coenzyme by non-covalent bonds. The active protein is an octamer (Fig. 1), which consists of eight identical FAD-containing subunits with a total molecular weight of 600 kDa.
Ферментативную активность проявляет октамер АО, что подтверждается отсутствием каталитической активности после диссоциации фермента в 80% глицерине на ФАД-зависимые мономеры. Реактивация наблюдается при разведении раствора и связана с реассоциацией октамера. Также было отмечено, что если перед диссоциацией АО заранее исключить ФАД из холофермента, то в случае дальнейшего его внесения ни реактивация, ни реассоциация не происходят [Evers М., Harder W., Veenhuis М. In vitro dissociation and reassembly of peroxisomal alcohol oxidase of Hansenula polymorpha and Pichia pastoris // FEBS Lett. 1995. v. 368. p. 293-296].The octamer AO exhibits enzymatic activity, which is confirmed by the absence of catalytic activity after dissociation of the enzyme in 80% glycerol into FAD-dependent monomers. Reactivation is observed upon dilution of the solution and is associated with the reassociation of the octamer. It was also noted that if FAD was previously excluded from the holoenzyme before dissociation of AO, then if it is further added, neither reactivation nor reassociation occurs [Evers M., Harder W., Veenhuis M. In vitro dissociation and reassembly of peroxisomal alcohol oxidase of Hansenula polymorpha and Pichia pastoris // FEBS Lett. 1995. v. 368. p. 293-296].
Белок имеет достаточно низкую изоэлектрическую точку: например, pI АО из Candida pastoris составляет 5,7. Алкогольоксидазу выделяют в высокоочищенном состоянии из нескольких видов метилотрофных дрожжей. Как обычно, процедура очистки фермента включает несколько стадий: механическое разрушение клетки, фракционное осаждение сульфатом аммония, ионообменная хроматография на анионитах и гель-фильтрация на сефадексах. Искомая активность очищенного фермента изменяется в широких пределах - от 5 до 30 и даже 50 мкмоль/(мин×мг) в зависимости от вида дрожжей и схемы очистки. В окисленном состоянии флавопротеин имеет максимумы поглощения при 212, 274, 375 и 460 нм с острым пиком при 396 нм для алкогольоксидаз из Н. polymorpha и P. pastoris. Восстановление АО субстратом (простейшим алифатическим спиртом) приводит к частичному понижению пиков при 375, 396 и 460 нм. Разница при поглощении при 460 нм между окисленной и восстановленной субстратом формами фермента служит для определения содержания окисленного флавина в АО (ΔεмМ=11,3мМ-1×см-1). В обычных препаратах фермента наряду с каталитически активной окисленной формой фермента обнаружена стабильная «красная» семихинонная форма АО (до 35%), которая не восстанавливается дальше ни метанолом, ни сульфитом или дитионитом натрия. Кроме того, до 30-35% может достигать содержание так называемой некомпетентной ФАД-зависимой формой АО, также не способной восстанавливаться при наличии метанола [Geissler J., Ghisla S., Kroneck P. Flavin-dependent alcohol oxidase from yeast. Studies on the catalytic mechanism and inactivation during turnover // Eur. J. Biochem. 1986. v. 160. p. 93-100]. Генерацией этих неактивных форм АО объясняется значительная вариабельность в искомых активностях хроматографически чистых препаратах фермента.The protein has a fairly low isoelectric point: for example, the pI AO from Candida pastoris is 5.7. Alcohol oxidase is isolated in a highly purified state from several types of methylotrophic yeast. As usual, the enzyme purification procedure involves several stages: mechanical destruction of the cell, fractional precipitation with ammonium sulfate, ion exchange chromatography on anion exchangers, and gel filtration on Sephadex. The desired activity of the purified enzyme varies widely - from 5 to 30 and even 50 μmol / (min × mg) depending on the type of yeast and purification scheme. In the oxidized state, flavoprotein has absorption maxima at 212, 274, 375 and 460 nm with an acute peak at 396 nm for alcohol oxidases from H. polymorpha and P. pastoris. The reduction of AO with a substrate (the simplest aliphatic alcohol) leads to a partial decrease in peaks at 375, 396 and 460 nm. The difference in the absorption at 460 nm between the oxidized and reduced forms of the enzyme substrate used to determine the content of oxidized flavin in AO (Δε = 11,3mM mM -1 × cm -1). In the usual preparations of the enzyme, along with the catalytically active oxidized form of the enzyme, a stable “red” seven-quinone form of AO was found (up to 35%), which is not further reduced by either methanol, sodium sulfite or dithionite. In addition, up to 30-35% can reach the content of the so-called incompetent FAD-dependent form of AO, also not able to recover in the presence of methanol [Geissler J., Ghisla S., Kroneck P. Flavin-dependent alcohol oxidase from yeast. Studies on the catalytic mechanism and inactivation during turnover // Eur. J. Biochem. 1986. v. 160. p. 93-100]. The generation of these inactive forms of AO explains the significant variability in the desired activities of chromatographically pure enzyme preparations.
Алкогольоксидазы из разных видов дрожжей имеют сходную первичную структуру и близкие спектры кругового дихроизма, что свидетельствует о подобии вторичной структуры белков. Кинетические характеристики ферментов разного происхождения также схожи, хотя некоторые отличия в кинетических параметрах есть, особенно в Км относительно субстратов [Pavlishko Н., Gayda Н., Gonchar М. Alcohol oxidase and its bioanalytical application // Visnyk of L'viv Univ. Biology series. 2004. v. 35, p. 3-22] (Таблица 1).Alcohol oxidases from different types of yeast have a similar primary structure and similar circular dichroism spectra, which indicates the similarity of the secondary structure of proteins. The kinetic characteristics of enzymes of different origin are also similar, although there are some differences in kinetic parameters, especially in km relative to substrates [Pavlishko N., Gayda N., Gonchar M. Alcohol oxidase and its bioanalytical application // Visnyk of L'viv Univ. Biology series. 2004. v. 35, p. 3-22] (Table 1).
AO не является высокоспецифичным ферментом и, кроме метанола способна окислять другие первичные спирты - от этанола до гексанола, практически не действуя на их вторичные и третичные изомеры. Каталитическая активность фермента понижается с увеличением длины углеродной цепи субстрата. Например, если эффективность окисления метанола для АО из Н. polymorpha принять за 100%, то этанол окисляется с относительной скоростью 35-50%, пропанол-1 - 25-60%, бутанол-1 - 13-53%. В таблице приведены значения Км для разных спиртов для АО из разных видов дрожжей.AO is not a highly specific enzyme and, in addition to methanol, it is able to oxidize other primary alcohols - from ethanol to hexanol, with virtually no effect on their secondary and tertiary isomers. The catalytic activity of the enzyme decreases with increasing length of the carbon chain of the substrate. For example, if the efficiency of methanol oxidation for AO from N. polymorpha is taken as 100%, then ethanol is oxidized at a relative rate of 35-50%, propanol-1 - 25-60%, butanol-1 - 13-53%. The table shows the Km values for different alcohols for AO from different types of yeast.
Молекулярный кислород является вторым субстратом для АО, и его концентрация влияет на каталитическую активность фермента и кинетические параметры АО относительно спиртов. Например, Км по метанолу, определенная в насыщенных кислородом растворах, втрое выше по сравнению со значением Км, полученным в условиях насыщения воздухом. Кроме молекулярного кислорода для алкогольоксидазной реакции акцепторами электронов могут являться: никатинамидадениндинуклеотид (НАД+), ферроцианид калия, 2,6-дихлорфенолидофенол, метил фиолетовый, цитохром С, метиленовый синий.Molecular oxygen is the second substrate for AO, and its concentration affects the catalytic activity of the enzyme and the kinetic parameters of AO relative to alcohols. For example, Km in methanol, determined in oxygenated solutions, is three times higher than the value of Km obtained under conditions of air saturation. In addition to molecular oxygen for the alcohol oxidase reaction, electron acceptors can be: nicatinamide adenine dinucleotide (NAD +), potassium ferrocyanide, 2,6-dichlorophenolidophenol, methyl violet, cytochrome C, methylene blue.
Температурный оптимум для АО разного происхождения немного отличается. Больше всего температурный оптимум сдвинут в область высоких температур для фермента из Н. polymorpha (до 45°С). При повышении температуры прослеживается сильное уменьшение значений Км для всех субстратов, кроме метанола, для которого Км постоянна до 55°С [Pavlishko Н., Gayda Н., Gonchar М. Alcohol oxidase and its bioanalytical application // Visnyk of L'viv Univ. Biology series. 2004. v. 35, p. 3-22].The temperature optimum for AO of different origin is slightly different. Most of all, the temperature optimum is shifted to the high temperature region for the H. polymorpha enzyme (up to 45 ° С). With increasing temperature, there is a significant decrease in Km values for all substrates except methanol, for which Km is constant up to 55 ° C [Pavlishko N., Gayda N., Gonchar M. Alcohol oxidase and its bioanalytical application // Visnyk of L'viv Univ. Biology series. 2004. v. 35, p. 3-22].
Алкогольоксидаза из H. polymorpha существенно отличается от аналогичных ферментов из других метилотрофных дрожжей и рН-оптимумом. Этот фермент имеет широкий диапазон оптимума рН - от 7 до 11, тогда как для других АО характерны острые пики максимумов активности при рН~8. Кроме того, АО из Н. polymorpha устойчива к ингибировнию хлоридами, а АО из P. pastoris очень чувствительна к действию этого аниона.Alcohol oxidase from H. polymorpha differs significantly from similar enzymes from other methylotrophic yeast and pH optimum. This enzyme has a wide pH optimum range from 7 to 11, while other AOs are characterized by sharp peaks of activity maxima at pH ~ 8. In addition, AO from N. polymorpha is resistant to inhibition by chlorides, and AO from P. pastoris is very sensitive to the action of this anion.
Продукт алкогольоксидазной реакции - пероксид водорода - негативно влияет на каталитические свойства АО, инактивирует фермент. АО большинства видов дрожжей теряют половину активности при концентрации Н2О2 в диапазоне от 1 до 10 мМ, тогда как фермент из P. pastoris устойчив к инактивирующему действию пероксида водорода, сохраняя активность в 1 М Н2О2 на протяжении 20 мин при 30°С. Пероксид водорода, возможно, окисляет определенную функциональную группу активного центра фермента, поскольку глутатион реактивирует фермент. Наличие каталазы уменьшает инактивацию, однако не полностью. Другой продукт ферментативной реакции под действием АО - альдегид - в больших концентрациях инактивирует фермент. Вероятно, это связано со способностью карбонильных групп реагировать с функциональными группами белка, богатыми лизином. Алкогольоксидаза полностью инактивируется реагентами на сульфогидрильную группу (1 мМ п-хлормеркурибензоат ионом и 10 мМ йодацетамидом), ионами тяжелых металлов (1 мМ Cd2+, Cu2+, Hg2+, Ag+), азидом натрия, цианидом калия. Цианид калия при концентрации 6 мМ является причиной отщепления ФАД от холофермента при инкубации как цельных клеток, так и клеточных экстрактов на протяжении 2 часов при 37С [5]. Также отмечено, что фермент ингибируется хелатирующими агентами, кроме ЭДТА (этилдиаминтетраацетатом).The product of the alcohol oxidase reaction - hydrogen peroxide - negatively affects the catalytic properties of AO, inactivates the enzyme. AO of most yeast species lose half of their activity at a concentration of H 2 O 2 in the range from 1 to 10 mM, while the enzyme from P. pastoris is resistant to the inactivating effect of hydrogen peroxide, while maintaining activity in 1 M H 2 O 2 for 20 min at 30 ° C. Hydrogen peroxide, possibly, oxidizes a certain functional group of the active center of the enzyme, since glutathione reactivates the enzyme. The presence of catalase reduces inactivation, but not completely. Another product of the enzymatic reaction under the action of AO - aldehyde - in high concentrations inactivates the enzyme. This is probably due to the ability of carbonyl groups to react with protein functional groups rich in lysine. Alcohol oxidase is completely inactivated by reagents on the sulfohydryl group (1 mM p-chloromercuribenzoate ion and 10 mM iodoacetamide), heavy metal ions (1 mM Cd 2+ , Cu 2+ , Hg 2+ , Ag + ), sodium azide, potassium cyanide. Potassium cyanide at a concentration of 6 mM is the cause of the cleavage of FAD from the holoenzyme during incubation of both whole cells and cell extracts for 2 hours at 37 ° C [5]. It is also noted that the enzyme is inhibited by chelating agents, in addition to EDTA (ethyldiaminetetraacetate).
Механизм каталитического действия АО мало изучен. Если сравнивать с субстратами других флавинооксидаз, например, оксидаз аминокислот или лактатоксидаз, то, С-Н-связи в молекуле спирта, которые подвергаются окислению, намного меньше поляризованы с соседними функциональными группами. В случае окисления аминокислот или лактата реакцию инициирует образование α-карбоаниона путем отщепления Н+ от С-Н связи через возможное образование ковалентного аддукта между заданным карбоанионом и N5-атомом окисленного флавина (Flox). Завершается реакция формированием восстановленного флавина (Flred) и продукта реакции. Цикл завершается реокислением Flred кислородом. Описанный путь маловероятен для С-Н группы спиртов, поскольку нет механизма стабилизации карбоаниона, поэтому для АО предложен радикальный механизм. Предполагаются два одноэлектронных перехода от субстрата к Flox. Эта гипотеза подтверждается фактом инактивации фермента под действием «суицидных» субстратов - циклопропанола и циклопропангидрата, которые дают промежуточный комплекс между флавинсемихиноном и β-пропионатрадикалом [Sherry B., Abeles R. Mechanism of action of methanol oxidase, reconstitution of methanol oxidase with 5-deazoflavin, and inactivation of methanol oxidase by cyclopropanol // Biochemistry. 1985. v. 24. p. 2594-2605]. Кинетическая схема всего каталитического процесса под действием АО (Фиг. 2) включает четыре этапа: 1) формирование комплекса Михаэлиса между ферментом и субстратом; 2) восстановительный этап, включающий скорость-лимитирующий процесс разрыва С-Н связи субстрата; 3) реакция комплекса восстановленного фермента и альдегида с молекулярным кислородом; 4) медленное отщепление продукта из комплекса окисленного фермента и продукта.The mechanism of the catalytic action of AO is poorly understood. If compared with substrates of other flavin oxidases, for example, amino acid oxidases or lactic oxidases, then the C-H bonds in the alcohol molecule, which undergo oxidation, are much less polarized with neighboring functional groups. In the case of the oxidation of amino acids or lactate, the reaction initiates the formation of an α-carboanion by cleavage of the H + from the C — H bond through the possible formation of a covalent adduct between the target carboanion and the N 5 -atom of the oxidized flavin (Fl ox ). The reaction ends with the formation of reduced flavin (Fl red ) and the reaction product. The cycle ends with the reoxidation of Fl red with oxygen. The described path is unlikely for the CH group of alcohols, since there is no mechanism for stabilizing the carbon anion, and therefore a radical mechanism has been proposed for AO. Two single-electron transitions from the substrate to Fl ox are assumed. This hypothesis is supported by the fact that the enzyme is inactivated by suicidal substrates, cyclopropanol and cyclopropane hydrate, which provide an intermediate complex between flavinsemiquinone and β-propionate radical [Sherry B., Abeles R. Mechanism of action of methanol oxidase, reconstitution of methanol oxidase with 5-deazoflavin , and inactivation of methanol oxidase by cyclopropanol // Biochemistry. 1985. v. 24. p. 2594-2605]. The kinetic scheme of the entire catalytic process under the action of AO (Fig. 2) includes four stages: 1) the formation of the Michaelis complex between the enzyme and the substrate; 2) the recovery phase, including the speed-limiting process of breaking С-Н bond of the substrate; 3) the reaction of the complex of the reduced enzyme and aldehyde with molecular oxygen; 4) the slow cleavage of the product from the complex of the oxidized enzyme and the product.
В литературе описано много примеров использования алкогольоксидаз для создания датчиков для определения этанола и других алифатических спиртов. Биосенсорные системы на основе этих ферментов обладают высокой чувствительностью анализа за счет эффекта усиления, вызванного способностью одной молекулы фермента катализировать реакции нескольких молекул субстрата. В биосенсорных системах для изготовления сенсоров для определения спиртов помимо алкогольоксидазы используется NAD + зависимая алкогольдегидрогеназа (АДГ). Алкогольдегидрогеназа обратимо окисляет простые алифатические и ароматические спирты (1):The literature describes many examples of the use of alcohol oxidases to create sensors for the determination of ethanol and other aliphatic alcohols. Biosensor systems based on these enzymes have a high analysis sensitivity due to the amplification effect caused by the ability of one enzyme molecule to catalyze the reactions of several substrate molecules. In biosensor systems, in addition to alcohol oxidase, NAD + dependent alcohol dehydrogenase (ADH) is used to manufacture sensors for detecting alcohols. Alcohol dehydrogenase reversibly oxidizes simple aliphatic and aromatic alcohols (1):
Сенсоры на основе алкогольдегидрогеназы более специфичны и стабильны, чем биосенсоры на основе АО. Датчики на основе АДГ обладают хорошей операционной стабильностью RSD=3-5% (за 10 измерений) [Svensson K., Bulow L., Kriz D. Investigation and evaluation of a method for determination of ethanol with the SIRE Biosensor P100, using alcohol dehydrogenase as recognition element // Biosensors & Bioelectronics. 2005. v. 21. p. 705-711], пределы детекции таких датчиков достигают 10-13 мкМ [Tsai Y., Huang J., Chiu C. Amperometric ethanol biosensor based on poly(vinyl alcohol)-multiwalled carbon nanotube-alcohol dehydrogenase biocomposite // Biosensors & Bioelectronics. 2007. v. 22. p. 3051-3056]. Однако сенсоры на основе АДГ требуют постоянного пополнения выщелачиваемого кофактора NAD+, что усложняет конструкцию датчиков. Прямое электрохимическое восстановление кофактора достигается либо при включении в систему медиатора, способствующего подщелачиванию среды, либо при поддержании высокого потенциала, в результате чего наблюдается пассивация (загрязнение) поверхности электрода.Alcohol dehydrogenase-based sensors are more specific and stable than AO-based biosensors. ADH-based sensors have good operational stability RSD = 3-5% (over 10 measurements) [Svensson K., Bulow L., Kriz D. Investigation and evaluation of a method for determination of ethanol with the SIRE Biosensor P100, using alcohol dehydrogenase as recognition element // Biosensors & Bioelectronics. 2005. v. 21. p. 705-711], the detection limits of such sensors reach 10-13 μM [Tsai Y., Huang J., Chiu C. Amperometric ethanol biosensor based on poly (vinyl alcohol) -multiwalled carbon nanotube-alcohol dehydrogenase biocomposite // Biosensors & Bioelectronics. 2007. v. 22. p. 3051-3056]. However, ADH-based sensors require constant replenishment of the leached NAD + cofactor, which complicates the design of the sensors. Direct electrochemical recovery of the cofactor is achieved either when a mediator is included in the system, which promotes alkalization of the medium, or while maintaining a high potential, as a result of which passivation (contamination) of the electrode surface is observed.
Алкогольоксидаза, продуцируемая метилотрофными дрожжами родов Hansenula, Pichia, Candida катализирует окисление низкомолекулярных алифатических спиртов до соответствующих альдегидов, используя молекулярный кислород как акцептор электронов. Благодаря сильному окисляющему действию О2 реакция, катализируемая АО, необратима (2):Alcohol oxidase produced by methylotrophic yeast of the genera Hansenula, Pichia, Candida catalyzes the oxidation of low molecular weight aliphatic alcohols to the corresponding aldehydes using molecular oxygen as an electron acceptor. Due to the strong oxidizing effect of O 2, the reaction catalyzed by AO is irreversible (2):
Биосенсоры на основе АО просты в аппаратурном оформлении, позволяют определять этанол в сложных образцах благодаря высокой специфичности фермента. Детекция спирта при использовании амперометрических сенсоров проводится либо по количеству потребляемого молекулярного кислорода, либо по количеству образующегося в ходе каталитической реакции пероксида водорода. При этом катодный ток восстановления молекулярного кислорода протекает при потенциале - 600 мВ, а анодный ток окисления пероксида - при потенциале +600 мВ относительно электрода сравнения (Ag/AgCl).AO-based biosensors are simple in hardware design and allow the determination of ethanol in complex samples due to the high specificity of the enzyme. Alcohol is detected using amperometric sensors either by the amount of molecular oxygen consumed or by the amount of hydrogen peroxide generated during the catalytic reaction. In this case, the cathodic recovery current of molecular oxygen flows at a potential of 600 mV, and the anodic current of peroxide oxidation at a potential of +600 mV relative to the reference electrode (Ag / AgCl).
а) устройство амперометрических сенсоров на основе алкогольоксидазы, детектирующие потребляемый в ходе ферментативной реакции молекулярный кислородa) the device of amperometric sensors based on alcohol oxidase, detecting the molecular oxygen consumed during the enzymatic reaction
Чаще всего используются кислородные датчики Кларк-типа для детекции молекулярного кислорода. Электрод Кларка состоит из платинового катода, на котором восстанавливается кислород, и электрода сравнения, обычно это Ag/AgCl. Платиновый катод покрывается полупроницаемой мембраной, через которую диффундирует O2, и погружается в раствор электролита (обычно используется раствор хлорида калия). При подаче на катод потенциала -600 мВ относительно электрода сравнения молекулярный кислород восстанавливается (согласно схеме, иллюстрирующей реакции, протекающие на рабочем электроде и электроде сравнения), и генерируется ток пропорциональный количеству восстановленного кислорода:Clark-type oxygen sensors are most commonly used to detect molecular oxygen. The Clark electrode consists of a platinum cathode, on which oxygen is reduced, and a reference electrode, usually Ag / AgCl. The platinum cathode is coated with a semipermeable membrane through which O 2 diffuses and immersed in an electrolyte solution (usually a solution of potassium chloride is used). When a potential of -600 mV is applied to the cathode relative to the reference electrode, molecular oxygen is restored (according to the diagram illustrating the reactions that occur on the working electrode and reference electrode), and a current is generated proportional to the amount of reduced oxygen:
Сенсоры спиртов, детектирующие потребляемый молекулярный кислород, различаются кислородчувствительными полупроницаемыми мембранами, на которые иммобилизуют фермент, а также способами иммобилизации АО на мембраны. Так, в работе [Wen G., Zhang Y., Shuang S. Application of a biosensor for monitoring of ethanol // Biosensors & Bioelectronics. 2007. v. 23, p. 121-129] в качестве полупроницаемой мембраны использовалась яичная скорлупа, на которой был иммобилизован фермент при помощи 0,3% раствора хитозана.Alcohol sensors detecting the consumed molecular oxygen differ in oxygen-sensitive semipermeable membranes onto which the enzyme is immobilized, as well as in the ways of AO immobilization on the membranes. So, in [Wen G., Zhang Y., Shuang S. Application of a biosensor for monitoring of ethanol // Biosensors & Bioelectronics. 2007. v. 23, p. 121-129] an egg shell was used as a semipermeable membrane on which the enzyme was immobilized using a 0.3% chitosan solution.
Разработанный таким образом биосенсор обладает достаточно низким пределом детекции - 30 мкМ и хорошей операционной стабильностью (RSD=3,2% за 11 измерений). Следует отметить очень хорошую стабильность при хранении такого датчика (86.4% первоначальной активности сенсора сохраняется при хранении 3 месяца).The biosensor developed in this way has a rather low detection limit of 30 μM and good operational stability (RSD = 3.2% for 11 measurements). It should be noted very good storage stability of such a sensor (86.4% of the initial sensor activity is stored for 3 months).
Кислородчувствительную мембрану из тефлона [Akyilmaz E., Dinckaya Е. А mushroom (Agaricus bisporus) tissue homogenate based alcohol oxidase electrode for alcohol determination in serum // Talanta. 2000. v. 53. p. 505-509] также успешно использовали для создания биосенсора, основанного на гомогенате ткани плодовых тел шампиньона Agaricus bisporus, который обладает алкогольоксидазной (ЕС 1.1.3.13) активностью. Полученный датчик обладает хорошей операционной стабильностью (RSD=2,31% за 10 измерений) и позволяет определять спирт в больших концентрациях, область линейности такого биосенсора 0,2-20 мМ. Хотя датчик прост в изготовлении, однако обладает хорошей операционной стабильностью лишь при повышенной температуре (Т=35°С), что ограничивает возможности его применения.Teflon oxygen-sensitive membrane [Akyilmaz E., Dinckaya E. A mushroom (Agaricus bisporus) tissue homogenate based alcohol oxidase electrode for alcohol determination in serum // Talanta. 2000. v. 53. p. 505-509] was also successfully used to create a biosensor based on the homogenate of the tissue of the fruiting bodies of the champignon Agaricus bisporus, which has an alcohol oxidase (EC 1.1.3.13) activity. The resulting sensor has good operational stability (RSD = 2.31% for 10 measurements) and allows you to determine the alcohol in high concentrations, the linearity of such a biosensor is 0.2-20 mm. Although the sensor is easy to manufacture, however, it has good operational stability only at elevated temperatures (T = 35 ° C), which limits its application.
б) амперометрические сенсоры на основе алкогольоксидазы, детектирующие пероксид водорода, образующийся в ходе ферментативной реакцииb) amperometric sensors based on alcohol oxidase, detecting hydrogen peroxide generated during the enzymatic reaction
Электрохимически можно детектировать пероксид водорода с использованием амперометрических датчиков, измеряя анодный или катодный отклик, благодаря, соответственно, окислению или восстановлению пероксида водорода на поверхности рабочего электрода. Биосенсоры, полагающиеся на прямую детекцию пероксида водорода, составляют, так называемые, сенсоры первого поколения (Фиг. 3).Hydrogen peroxide can be electrochemically detected using amperometric sensors, measuring the anode or cathode response, due, respectively, to the oxidation or reduction of hydrogen peroxide on the surface of the working electrode. Biosensors that rely on direct detection of hydrogen peroxide comprise the so-called first-generation sensors (Fig. 3).
К сенсорам первого поколения можно отнести и датчики на основе графитовой пасты. A. Morales и F. Cespedes в 1997 году описали амперометрический сенсор на основе полимерного композита, состоящего из эпоксидной смолы, графитового порошка и АО [Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas Е. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. v. 43. N. 23. p. 3575-3579], который был помещен в специальную трубку, связанную с электрохимической цепью. Активность фермента в такой пасте сохраняется в течение трех месяцев. Однако следует отметить, что полученный датчик позволяет определять спирт лишь в высоких концентрациях (область линейности 0,01-0,63 М), что сужает область его применения. Также стали изготавливаться датчики с использованием трафаретной печати (screen-printed), которые напрямую детектируют пероксид водорода. Например, «screen-printed» сенсор описан в работе [Patel N.G., Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases // Sensors snd Actuators. 2001. v. В 75. p. 101-110]. Фермент иммобилизовали на поверхности рабочего платинового электрода при помощи поликарбомаил сульфонатного гидрогеля (ПКС) (Фиг. 4).The sensors of the first generation include sensors based on graphite paste. A. Morales and F. Cespedes in 1997 described an amperometric sensor based on a polymer composite consisting of epoxy resin, graphite powder and AO [Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas E. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase- graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. v. 43. N. 23. p. 3575-3579], which was placed in a special tube connected to the electrochemical circuit. The enzyme activity in such a paste lasts for three months. However, it should be noted that the resulting sensor allows you to detect alcohol only in high concentrations (linearity range 0.01-0.63 M), which narrows the scope of its application. Sensors also began to be manufactured using screen printing (screen-printed), which directly detect hydrogen peroxide. For example, a “screen-printed” sensor is described in [Patel N.G., Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases // Sensors snd Actuators. 2001. v. B 75. p. 101-110]. The enzyme was immobilized on the surface of the working platinum electrode using polycarbomoyl sulfonate hydrogel (PCB) (Fig. 4).
Преимущества сенсоров, изготовленных с использованием трафаретной печати, в легкости их производства и возможности изготовления сенсоров малых размеров, к тому же они обладают широкой областью линейности по этиловому спирту (0,01-3 мМ), хорошей операционной стабильностью (RSD=1,9% за 8 измерений) [Liden Н., Vijayakumar A., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. of Pharm. & Biomed. Anal. 1998. v. 17. p. 1111-1128].The advantages of sensors made using screen printing in the ease of their production and the possibility of manufacturing sensors of small sizes, moreover, they have a wide range of linearity in ethyl alcohol (0.01-3 mm), good operational stability (RSD = 1.9% for 8 measurements) [Liden N., Vijayakumar A., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. of Pharm. & Biomed. Anal. 1998. v. 17. p. 1111-1128].
Однако высокий потенциал (+600 мВ [Patel N.G., Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases // Sensors snd Actuators. 2001. v. В 75. p. 101-110], +1100 мВ [Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas E. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. v. 43. N. 23. p. 3575-3579]), необходимый для окисления пероксида водорода, может вызывать ряд проблем, связанных с окислением при этом потенциале некоторых веществ (аскорбиновая и мочевая кислоты), присутствующих в реальных исследуемых образцах. Чтобы избавиться от этого недостатка поверхность электрода часто модифицируют электрокатализаторами (медиаторами), способствующими снижению необходимого потенциала. Медиаторы осуществляют перенос электронов между пероксидом водорода и электродом. Такие датчики называются биосенсорами второго поколения. В качестве электрокатализатора часто используются комплексы кобальта, осмия, ферроцен, Берлинская лазурь. Например, разработан датчик [Karyakin A., Karyakina Е., Gorton L. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis // Talanta. 1996. v. 43. p. 1597-1606], который состоит из стеклоуглеродного рабочего электрода, модифицированного Берлинской лазурью путем электрохимического осаждения, на поверхности которого образована тонкая пленка из АО и перфторполиэлектролита (ПФП). Применение Берлинской лазури позволяет снизить рабочий потенциал до 0 В по сравнению с Ag/AgCl. Полученный датчик имеет предел детекции 0,05 мМ, относительно стабилен при использовании (величина ответа падает менее чем на 10% за 6 часов измерений).However, high potential (+600 mV [Patel NG, Meier S., Cammann K. Screen-printed biosensors using different alcohol oxidases // Sensors snd Actuators. 2001. v. B 75. p. 101-110], +1100 mV [ Morales A., Cespedes F., Martinez-Fabregas E. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. 1998. v. 43. N. 23. p. 3575-3579]), necessary for the oxidation of hydrogen peroxide, can cause a number of problems associated with the oxidation at this potential of certain substances (ascorbic and uric acids) present in the real samples under study. To get rid of this drawback, the electrode surface is often modified with electrocatalysts (mediators), which reduce the required potential. Mediators carry out the transfer of electrons between hydrogen peroxide and the electrode. Such sensors are called biosensors of the second generation. Complexes of cobalt, osmium, ferrocene, and Prussian blue are often used as an electrocatalyst. For example, a sensor was developed [Karyakin A., Karyakina E., Gorton L. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis // Talanta. 1996. v. 43. p. 1597-1606], which consists of a glassy carbon working electrode modified by Berlin blue by electrochemical deposition, on the surface of which a thin film of AO and perfluoropolyelectrolyte (PFP) is formed. The use of Prussian blue reduces the operating potential to 0 V compared to Ag / AgCl. The resulting sensor has a detection limit of 0.05 mm, is relatively stable when used (the response value drops by less than 10% after 6 hours of measurement).
Также в качестве электрокатализатора для окисления пероксида водорода может использоваться кобальт. Модификацию комплексом кобальта с органическим лигандом использовали М. Boujtita и J. Hart при создании «screen-printed» сенсора для определения спирта в пиве (от 5.19% об.) [Boujtita М., Hart J., Pittson R. Development of a disposable ethanol biosensor based on a chemically modified screen-printed electrode coated with alcohol // Biosensors & Bioelectronics. 2000. v. 15. p. 257-263] (Фиг. 5):Also, cobalt can be used as an electrocatalyst for the oxidation of hydrogen peroxide. Modification with a cobalt complex with an organic ligand was used by M. Boujtita and J. Hart to create a “screen-printed” sensor for detecting alcohol in beer (from 5.19% vol.) [Boujtita M., Hart J., Pittson R. Development of a disposable ethanol biosensor based on a chemically modified screen-printed electrode coated with alcohol // Biosensors & Bioelectronics. 2000. v. 15. p. 257-263] (Fig. 5):
Альтернативный подход для решения проблем, связанных с высоким рабочим потенциалом, это использование другого акцептора электронов для регенерации окисленной формы кофактора ФАД. Идеальный метод заключается в прямом переносе электронов между активным центром, обычно расположенным внутри молекулы фермента, и поверхностью электрода. Пока это еще малоразработанные методики (биосенсоры третьего поколения), поскольку АО не может непосредственно соприкасаться с поверхностью электрода, что объясняется стерическими затруднениями и высоким реакционным барьером.An alternative approach to solving problems associated with high working potential is to use another electron acceptor to regenerate the oxidized form of the FAD cofactor. The ideal method is direct electron transfer between the active center, usually located inside the enzyme molecule, and the electrode surface. So far, these are still poorly developed techniques (third-generation biosensors), since AO cannot directly come into contact with the electrode surface, which is explained by steric difficulties and a high reaction barrier.
Другим подходом решения этой проблемы является использование двух ферментов для создания сенсоров (Фиг. 6). Например, разработан пастовый графитовый электрод на основе двух ферментов - алкогольоксидазы и перокидазы хрена [Liden Н., Vijayakumar А., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. of Pharm. & Biomed. Anal. 1998. v. 17. p. 1111-1128]. При этом рабочий потенциал составил -50 мВ по сравнению с электродом сравнения (Ag/AgCl), благодаря чему было исключено влияние электрохимически мешающих соединений. Такой датчик позволяет определять спирт в достаточно широком диапазоне (область линейности 0.02-2 мМ), однако процесс изготовления длителен (более 20 часов) и датчик нестабилен (активность падает на 71% при измерениях в течение недели).Another approach to solving this problem is to use two enzymes to create sensors (Fig. 6). For example, a paste graphite electrode based on two enzymes — alcohol oxidase and horseradish peroxidase [Liden N., Vijayakumar A., Gorton L. Rapid alcohol determination in plasma and urine by column liquid chromatography with biosensor detection // J. of Pharm. & Biomed. Anal. 1998. v. 17. p. 1111-1128]. In this case, the working potential was -50 mV compared with the reference electrode (Ag / AgCl), due to which the influence of electrochemically interfering compounds was excluded. Such a sensor allows detecting alcohol in a rather wide range (linearity range 0.02–2 mM), however, the manufacturing process is long (more than 20 hours) and the sensor is unstable (activity drops by 71% when measured over a week).
Биферментные электроды могут быть как с прямым переносом электронов, так и с медиаторным. Наиболее часто в качестве медиаторов при изготовлении биферментных сенсоров используются ферроцен, ферроцианид калия, комплексы осмия. В последнее время создаются сенсоры, сочетающие сразу несколько альтернативных способов снижения рабочего потенциала и повышения чувствительности датчика. Так был разработан сенсор второго поколения на основе биокомпозита, включающего два фермента - АО и пероксидазу хрена (ПХ), в виде спрессованных таблеток-электродов (диаметр до 1,3 см) [Guzman-Vazquez de Prada А., Pena N., Mena М. Graphite-Teflon composite bienzyme amperometric biosensors for monitoring of alcohols // Biosensors & Bioelectronics. 2003. v. 18. p. 1279-1288.] (Фиг. 7). Наряду с низким пределом детекции (5,3 мкМ) такой биосенсор способен «самообновляться» за счет полирования поверхности, что делает данный способ изготовления датчика экономически выгодным. Разработанный таким образом достаточно стабильный датчик (за 3 месяца хранения при 0°С нет значительных потерь ферментативной активности) обладает удовлетворительной операционной стабильностью (RSD=6,1% за 10 измерений).Bienzyme electrodes can be either direct electron transfer or mediator. Most often, ferrocene, potassium ferrocyanide, and osmium complexes are used as mediators in the manufacture of bienzyme sensors. Recently, sensors have been created that combine several alternative ways to reduce the working potential and increase the sensitivity of the sensor. So a second-generation sensor based on a biocomposite was developed, which includes two enzymes - AO and horseradish peroxidase (HRP), in the form of compressed tablet electrodes (diameter up to 1.3 cm) [Guzman-Vazquez de Prada A., Pena N., Mena M. Graphite-Teflon composite bienzyme amperometric biosensors for monitoring of alcohols // Biosensors & Bioelectronics. 2003. v. 18. p. 1279-1288.] (Fig. 7). Along with a low detection limit (5.3 μM), such a biosensor is able to "self-renew" due to surface polishing, which makes this method of manufacturing a sensor economically viable. A sufficiently stable sensor designed in this way (for 3 months of storage at 0 ° C there is no significant loss of enzymatic activity) has satisfactory operational stability (RSD = 6.1% for 10 measurements).
Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении настоящего изобретения, состоит в разработке устройства сменного пластинчатого электрода, обеспечивающего возможность достоверного определения содержания этилового спирта в крови электрохимическим методом в диапазоне концентраций от 1 до 32 мМ с использованием коммерчески доступных амперометрических датчиков.The technical problem that can be solved by implementing the present invention consists in developing a removable plate electrode device that can reliably determine the ethyl alcohol content in the blood by the electrochemical method in the concentration range from 1 to 32 mm using commercially available amperometric sensors.
Техническая проблема решена путем создания тест-полоски, представляющей собой электрохимический сенсор с планарными углеродными электродами, покрытыми электрохимически активным медиаторным слоем, на поверхность которого наносится ферментативная смесь. Ферментативная смесь (биокомпозит) обеспечивает специфическое окисление этанола с образованием электроактивного компонента. Состав ферментативной смеси обеспечивает быстрое растворение компонентов при контакте с анализируемым образцом крови. Концентрация образовавшегося электроактивного компонента пропорциональна концентрации этанола в анализируемом образце крови. В состав биокомпозита входит фермент алкогольоксидаза, медиатор электронного переноса, детергент, высокомолекулярные спирты. Нанесение смеси проводится на рабочую поверхность электродов с помощью робота с перистальтическим дозатором.The technical problem was solved by creating a test strip, which is an electrochemical sensor with planar carbon electrodes coated with an electrochemically active mediator layer, on the surface of which an enzymatic mixture is applied. The enzymatic mixture (biocomposite) provides specific oxidation of ethanol with the formation of an electroactive component. The composition of the enzymatic mixture provides rapid dissolution of the components in contact with the analyzed blood sample. The concentration of the resulting electroactive component is proportional to the concentration of ethanol in the analyzed blood sample. The biocomposite contains the enzyme alcohol oxidase, an electron transfer mediator, a detergent, and high molecular weight alcohols. The mixture is applied to the working surface of the electrodes using a robot with a peristaltic batcher.
В качестве альтернативного метода обеспечения электрохимического контакта между угольным электродом и оксидазой используют покрытие для электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров, полученное с использованием гидрозоля диоксида марганца по способу, описанному в патенте РФ №2419785 «Гидрозоль для формирования покрытий электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров и биосенсоров, способ его получения, электрохимический сенсор и биосенсор, способы их получения и применение» (патентообладатель ООО «Чипдетект», приоритет от 6 июля 2010 г).As an alternative method of providing electrochemical contact between a carbon electrode and oxidase, a coating for electrochemical peroxide-sensitive sensors obtained using a manganese dioxide hydrosol is used according to the method described in RF patent No. 2419785 “Hydrosol for coating electrochemical peroxide-sensitive sensors and biosensors, method its preparation, electrochemical sensor and biosensor, methods for their preparation and application ”(patent holder of Chipdetect LLC, priority is from July 6, 2010).
Гидрозоль диоксида марганца получают, проводя реакцию сопропорционирования между ионами Mn2+ и MnO4 - в водном растворе, подбирая противоионы и концентрации солей таким образом, чтобы в результате образовался стабильный золь MnO2. Роль стабилизатора в этом случае выполняют отрицательно заряженные противоионы (например, ацетат-ионы), которые, адсорбируясь на поверхности образующихся частиц MnO2, придают им одноименный заряд и препятствуют агломерации.Manganese dioxide hydrosol is prepared by conducting the reaction between soproportsionirovaniya Mn 2+ ions and MnO 4 - in an aqueous solution, selecting the counterions and the concentration of salts so that the resulting sol formed stable MnO 2. In this case, the role of the stabilizer is played by negatively charged counterions (for example, acetate ions), which, being adsorbed on the surface of the formed MnO 2 particles, give them the same charge and prevent agglomeration.
Принцип работы медиатора на поверхности полученного таким образом пероксид-чувствительного сенсора проиллюстрирован на Фиг. 8. Он состоит в том, что пероксид водорода, окисляясь на поверхности электрода, восстанавливает MnO2 до оксидов Mn (II) и (III), которые при потенциале +250 - +500 мВ (относительно графитового или Ag/AgCl электрода сравнения) тут же электрохимически окисляются на электроде до MnO2. На рисунке ниже представлена схема амперометрической детекции Н2О2 на электроде, модифицированном пероксид-чувствительным слоем MnO2.The principle of operation of the mediator on the surface of the peroxide-sensitive sensor thus obtained is illustrated in FIG. 8. It consists in the fact that hydrogen peroxide, oxidizing on the surface of the electrode, reduces MnO 2 to oxides Mn (II) and (III), which at a potential of +250 - +500 mV (relative to a graphite or Ag / AgCl reference electrode) the same electrochemically oxidized on the electrode to MnO 2 . The figure below shows the scheme of amperometric detection of H 2 O 2 on an electrode modified with a peroxide-sensitive layer of MnO 2 .
Для получения ферментативного пероксид-чувствительного биосенсора на поверхность пероксид-чувствительного сенсора наносят фермент алкогольоксидазу в составе ферментативной смеси, не содержащей феррицианид калия. На Фиг. 8 представлена схема электрохимической детекции этанола при помощи алкогольоксидазного биосенсора на основе медиатора MnO2. Этанол окисляется кислородом воздуха при участии фермента алкогольоксидазы на поверхности электрода, при этом образуется пероксид водорода, который электрохимически регистрируется пероксид-чувствительным слоем сенсора.To obtain an enzymatic peroxide-sensitive biosensor, an alcohol oxidase enzyme is applied to the surface of the peroxide-sensitive sensor as part of an enzymatic mixture that does not contain potassium ferricyanide. In FIG. 8 is a diagram of the electrochemical detection of ethanol using an alcohol oxidase biosensor based on the MnO 2 mediator. Ethanol is oxidized by atmospheric oxygen with the participation of the alcohol oxidase enzyme on the electrode surface, and hydrogen peroxide is formed, which is electrochemically detected by the peroxide-sensitive layer of the sensor.
Следующие фигуры чертежей поясняют сущность изобретения:The following figures of the drawings explain the invention:
Фиг. 1. Схема производственного цикла изготовления тест-полоски для определения этанола в крови электрохимическим методом.FIG. 1. Scheme of the production cycle for the manufacture of test strips for determining ethanol in the blood by the electrochemical method.
Фиг. 2. Схема реакции каталитического окисления этилового спирта с прямой детекцией пероксида водорода.FIG. 2. Scheme of the reaction of catalytic oxidation of ethyl alcohol with direct detection of hydrogen peroxide.
Фиг. 3. Схема реакции каталитического окисления этилового спирта с прямой детекцией пероксида водорода.FIG. 3. Scheme of the reaction of catalytic oxidation of ethyl alcohol with direct detection of hydrogen peroxide.
Фиг. 4. Схематическое изображение сенсора, изготовленного с использованием трафаретной печати.FIG. 4. Schematic illustration of a sensor made using screen printing.
Фиг. 5. Принцип действия «screen-printed» сенсора, модифицированного органическим комплексом кобальта.FIG. 5. The principle of operation of the "screen-printed" sensor, modified with an organic cobalt complex.
Фиг. 6. Принцип действия биферментного сенсора на основе прямого переноса электронов.FIG. 6. The principle of operation of the bienzyme sensor based on direct electron transfer.
Фиг. 7. Принцип действия биферментного сенсора с использованием медиатора (ферроцена).FIG. 7. The principle of operation of the bienzyme sensor using a mediator (ferrocene).
Фиг. 8. Принцип работы покрытия для электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров, полученного с использованием гидрозоля диоксида марганца пероксид-чувствительного сенсора.FIG. 8. The principle of operation of the coating for electrochemical peroxide-sensitive sensors obtained using a manganese dioxide hydrosol of peroxide-sensitive sensor.
Фиг. 9. Принцип послойного формирования тест-полоски и капиллярной ячейкиFIG. 9. The principle of layer-by-layer formation of the test strip and capillary cell
Фиг. 10. Схема расположения функциональных слоев в составе тест-полоски и капиллярной ячейкиFIG. 10. Layout of functional layers in the composition of the test strip and capillary cell
Фиг. 11. Зависимость величины ответов сенсоров на основе алкогольоксидаз P. pastoris (А) и Н. polymorpha (Б) от числа измерений. Условия измерения: 4×10-3 М этанола в составе крови человека, комнатная температура.FIG. 11. The dependence of the responses of sensors based on alcohol oxidases P. pastoris (A) and N. polymorpha (B) on the number of measurements. Measurement conditions: 4 × 10 -3 M ethanol in human blood, room temperature.
Осуществление изобретения иллюстрируется Примером 1 «Получение тест-полосок для электрохимического определения этанола в крови с использованием феррицианида железа в качестве медиатора в ферментативной смеси» и Примером 2 «Получение тест-полосок для электрохимического определения этанола в крови с использованием пероксид-чувствительного слоя на основе диоксида марганца».The implementation of the invention is illustrated by Example 1 "Obtaining test strips for the electrochemical determination of ethanol in the blood using ferricyanide as a mediator in the enzyme mixture" and Example 2 "Obtaining test strips for the electrochemical determination of ethanol in the blood using a peroxide-sensitive layer based on dioxide Manganese. "
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Пример 1. Получение тест-полосок дли электрохимического определении этанола в крови с использованием феррицианида железа в качестве медиатора в ферментативной смеси.Example 1. Obtaining test strips for the electrochemical determination of ethanol in the blood using iron ferricyanide as a mediator in the enzymatic mixture.
Изготовление электродов (тест-полосок) выполняют методом трафаретной печати на пластиковой подложке.The manufacture of electrodes (test strips) is performed by screen printing on a plastic substrate.
Для приготовления растворов используют деионизированную воду с электропроводностью 17,5 МОм/см при 25°С, полученную при помощи установки для очистки воды Milli-Q (США).For the preparation of solutions, deionized water with an electrical conductivity of 17.5 MΩ / cm at 25 ° C, obtained using a Milli-Q water treatment plant (USA), is used.
Углеродную (графеновую) пасту с размером частиц 8-9 мкм и удельным сопротивлением 0,3 Ом/мкм2 производства Gwent Electronic Materials Ltd (Великобритания), каталожный номер C2171023D1 наносят на пластиковую подложку толщиной 0,5 мм из аморфного полиэтилентерифталата (ПЭТ-А) плотностью 1,33 г/см3 (ООО «Техпластик», Россия) путем продавливания через трафарет с полимерной сеткой и эмульсией (толщина 13-15 мкм) из расчета 0,3 мл суспензии на см2 подложки. Сушка пасты проводится при 130°С в течение 30 мин. Нанесение пасты на полимерную подложку производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань).Carbon (graphene) paste with a particle size of 8-9 μm and a specific resistance of 0.3 Ω / μm 2 manufactured by Gwent Electronic Materials Ltd (Great Britain), catalog number C2171023D1 is applied to a plastic substrate 0.5 mm thick from amorphous polyethylene terephthalate (PET-A) ) with a density of 1.33 g / cm 3 (OOO Techplastic, Russia) by forcing through a stencil with a polymer mesh and emulsion (thickness 13-15 μm) at the rate of 0.3 ml of suspension per cm 2 of substrate. The paste is dried at 130 ° C for 30 minutes. The paste is applied to the polymer substrate using the WSC-160A semi-automatic screen printing machine (WINON, Taiwan).
Принцип послойного формирования тест-полоски и капиллярной ячейки и схема расположения функциональных слоев в составе тест-полоски и капиллярной ячейки представлены на Фиг. 9 и 10, соответственно. Нанесение изолирующего слоя (резистивная паста) на полимерную подложку с графитовыми электродами производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань). Сушка пасты проводится при 130°С в течение 30 мин.The principle of layer-by-layer formation of the test strip and capillary cell and the arrangement of functional layers in the composition of the test strip and capillary cell are shown in FIG. 9 and 10, respectively. The application of an insulating layer (resistive paste) on a polymer substrate with graphite electrodes is carried out using a WSC-160A semi-automatic screen printing machine (WINON, Taiwan). The paste is dried at 130 ° C for 30 minutes.
Далее проводится нанесение ферментативной смеси. В качестве источника алкогольоксидазы используют фермент из Hansenula polymorpha (ЕС 1.1.3.13) с активностью 7,7 ед на мг сухого вещества (22 ед/мг белка) по метанолу производства Sigma (Германия) или фермент из Pichia pastoris (ЕС 1.1.3.13) с активностью 28 ед/мг белка (37 мг/мл) по метанолу производства Sigma (Германия).Next, the application of the enzymatic mixture. An enzyme from Hansenula polymorpha (EC 1.1.3.13) with an activity of 7.7 units per mg dry matter (22 units / mg protein) according to methanol produced by Sigma (Germany) or an enzyme from Pichia pastoris (EU 1.1.3.13) is used as an alcohol oxidase source. with an activity of 28 u / mg protein (37 mg / ml) according to methanol manufactured by Sigma (Germany).
Ферментативную смесь объемом 3 мл готовят по следующему протоколу:An enzymatic mixture of 3 ml is prepared according to the following protocol:
1. К 9 мг детергента Тритон Х-100 добавляют 1 мл воды, тщательно перемешивают;1. To 9 mg of Triton X-100 detergent add 1 ml of water, mix thoroughly;
2. Готовят раствор поливинилового спирта с концентрацией 6 мг/мл. Для этого навеску поливинилового спирта заливают водой и выдерживают в течение 24 часов при комнатной температуре для набухания полимера, а затем полученную вязкую массу нагревают в течение 10-30 мин до 90°С, добиваясь полного растворения;2. Prepare a solution of polyvinyl alcohol with a concentration of 6 mg / ml. To do this, a weighed portion of polyvinyl alcohol is poured with water and incubated for 24 hours at room temperature to swell the polymer, and then the resulting viscous mass is heated for 10-30 minutes to 90 ° C, achieving complete dissolution;
3. К навеске феррицианида железа 65,4 мг добавляют 1 мл воды;3. To a portion of ferrous ferricyanide 65.4 mg add 1 ml of water;
4. К навеске алкогольоксидазы массой 60 мг добавляют 1 мл раствора Тритона Х-100 (см. п. 1), перемешивают пипетированием до полного растворения;4. To a sample of alcohol oxidase weighing 60 mg add 1 ml of a solution of Triton X-100 (see p. 1), mix by pipetting until completely dissolved;
5. К 1 мл раствора алкогольоксидазы с Тритоном Х-100 (см. п. 4) добавляют 1 мл раствора феррицианида железа (см. п. 3), перемешивают и добавляют 1 мл раствора поливинилового спирта(см. п. 2)5. To 1 ml of an alcohol oxidase solution with Triton X-100 (see p. 4) add 1 ml of a solution of ferricyanide of iron (see p. 3), mix and add 1 ml of a solution of polyvinyl alcohol (see p. 2)
6. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре в темноте, а затем осветляют центрифугированием в течение 5 мин при 16 тыс. g.6. The mixture is kept for 1 hour at room temperature in the dark, and then clarified by centrifugation for 5 min at 16 thousand g.
Конечные концентрации реагентов в смеси составляют:The final concentrations of the reagents in the mixture are:
- Алкогольоксидаза, 20 мг/мл- Alcohol oxidase, 20 mg / ml
- Феррицианид железа, 21,8 мг/мл- Ferricyanide iron, 21.8 mg / ml
- Тритон Х-100, 3 мг/мл- Triton X-100, 3 mg / ml
- Поливиниловый спирт, 2 мг/мл- Polyvinyl alcohol, 2 mg / ml
Нанесение ферментной смеси на полимерную подложку с электродами из углеродной пасты, производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань). Сушка ферментной смеси на электродах осуществляется при 24°С и относительной влажности не более 20%. Расход смеси составляет 3 мл на 62 370 мм2.The application of the enzyme mixture on a polymer substrate with carbon paste electrodes is carried out using a WSC-160A semi-automatic screen printing machine (WINON, Taiwan). The drying of the enzyme mixture on the electrodes is carried out at 24 ° C and relative humidity not more than 20%. The flow rate of the mixture is 3 ml per 62,370 mm 2 .
Область тест-полоски с ферментативным слоем подвергают ламинированию с помощью пленки 3М Anti-fog hydrophilic film (3М Science Applied for life, США, каталожный номер 9962) с целью формирования капиллярного канала.The region of the test strip with the enzymatic layer is subjected to lamination using a 3M Anti-fog hydrophilic film (3M Science Applied for life, USA, catalog number 9962) in order to form a capillary channel.
Для проведения измерений используется 2-х электродная схема с приложенным потенциалом на рабочий электрод (графит) от -100 до 400 мВ относительно электрода сравнения (графитовый или Ag/AgCl). При попадании анализируемого вещества (этанола) вместе с образцом крови в капиллярную ячейку происходит каталитическое окисление этанола с выделением пероксида водорода или превращения медиатораFor measurements, a 2-electrode circuit with an applied potential on the working electrode (graphite) from -100 to 400 mV relative to the reference electrode (graphite or Ag / AgCl) is used. When the analyte (ethanol) enters the capillary cell together with a blood sample, catalytic oxidation of ethanol occurs with the release of hydrogen peroxide or the transformation of a mediator
Для проведения расчетов используют модель убывающего во времени диффузионного тока при постоянном потенциале. Согласно этой модели, зависимость тока от времени подчиняется уравнению Котгрелла:To carry out the calculations, a model of a diffusing current decreasing in time at a constant potential is used. According to this model, the dependence of current on time obeys the Cotgrell equation:
где
Тестирование работоспособности тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha, проводят с помощью потенциостата-гальваностата IPC-2000 (Хронас, Россия). В качестве стандартных образцов используют кровь человека, собранную в пробирки с антикоагулянтом BD Vacutainer (каталожный номер 368841). К крови добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 0,1, 1. 2, 4, 8, 16 и 32 мМ (в качестве стокового используют водный этанол с концентрацией 10%, полученный из абсолютированного этанола производства ЗАО НПО Химсинтез).The performance testing of test strips obtained using the alcohol pastases P. pastoris and H. polymorpha is carried out using an IPC-2000 potentiostat-galvanostat (Chronas, Russia). As standard samples use human blood collected in test tubes with the anticoagulant BD Vacutainer (catalog number 368841). Ethanol is added to the blood to a final concentration of 0.1, 1. 2, 4, 8, 16 and 32 mM (water ethanol with a concentration of 10% obtained from absolute ethanol manufactured by NPO Khimsyntez CJSC is used as stock).
Оценку эффективности измерения этанола с помощью тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha, выполняют по следующим параметрам; область линейности (мМ), предел обнаружения этанола (мкМ), чувствительность, нА/(с мМ⋅см2), время ответа (сек), операционная стабильность (RSD, %,10 измерений). Результаты измерений представлены на Фиг. 11 и Таблице 2.Evaluation of the effectiveness of measuring ethanol using test strips obtained using the alcohol oxidases P. pastoris and H. polymorpha is performed according to the following parameters; linearity region (mM), ethanol detection limit (μM), sensitivity, nA / (with mM⋅cm 2 ), response time (sec), operational stability (RSD,%, 10 measurements). The measurement results are presented in FIG. 11 and Table 2.
Испытания полученных тест-полосок, полученных с использованием феррицианида железа в качестве медиатора и алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha при оптимальных условиях измерения спирта показывают, что несмотря на более высокую активность в выбранных оптимальных условиях сенсор на основе алкогольоксидазы P. pastoris менее стабилен, чем сенсор на основе алкогольоксидазы Н. polymorpha. Величина ответа сенсора падает с ростом числа измерений, разброс значений ответа сенсора составляет 18% при концентрации вводимого в ячейку спирта 32 мМ, и более 100% при добавлении спирта в концентрациях 4 и 8 мМ, наиболее значимых для потребителя.Tests of the test strips obtained using iron ferricyanide as a mediator and alcohol pastases P. pastoris and H. polymorpha under optimal conditions for measuring alcohol show that despite the higher activity under the selected optimal conditions, the sensor based on alcohol pastase P. pastoris is less stable, than a sensor based on alcohol polyoxidase N. polymorpha. The magnitude of the response of the sensor decreases with increasing number of measurements, the scatter of the values of the response of the sensor is 18% when the concentration of alcohol introduced into the cell is 32 mM, and more than 100% when alcohol is added at concentrations of 4 and 8 mM, which are most significant for the consumer.
Пример 2. Получение тест-полосок для электрохимического определения этанола в крови с использованием пероксид-чувствительного слоя на основе диоксида марганца.Example 2. Obtaining test strips for the electrochemical determination of ethanol in the blood using a peroxide-sensitive layer based on manganese dioxide.
Изготовление электродов (тест-полосок) выполняют методом трафаретной печати на пластиковой подложке, как описано в примере 1.The manufacture of electrodes (test strips) is performed by screen printing on a plastic substrate, as described in example 1.
Углеродную (графеновую) пасту с размером частиц 8-9 мкм и удельным сопротивлением 0,3 Ом/мкм2 производства Gwent Electronic Materials Ltd (Великобритания), каталожный номер C2171023D1 наносят на пластиковую подложку толщиной 0,5 мм из аморфного полиэтилентерифталата (ПЭТ-А) плотностью 1,33 г/см3 (ООО «Техпластик», Россия) путем продавливания через трафарет с полимерной сеткой и эмульсией (толщина 13-15 мкм) из расчета 0,3 мл суспензии на см2 подложки. Сушка пасты проводится при 130°С в течение 30 мин. Нанесение пасты на полимерную подложку производится с помощью полуавтоматического станка для трафаретной печати WSC-160A (WINON, Тайвань).Carbon (graphene) paste with a particle size of 8-9 μm and a specific resistance of 0.3 Ω / μm 2 manufactured by Gwent Electronic Materials Ltd (Great Britain), catalog number C2171023D1 is applied to a plastic substrate 0.5 mm thick from amorphous polyethylene terephthalate (PET-A) ) with a density of 1.33 g / cm 3 (OOO Techplastic, Russia) by forcing through a stencil with a polymer mesh and emulsion (thickness 13-15 μm) at the rate of 0.3 ml of suspension per cm 2 of substrate. The paste is dried at 130 ° C for 30 minutes. The paste is applied to the polymer substrate using the WSC-160A semi-automatic screen printing machine (WINON, Taiwan).
Коллоидный раствор диоксида марганца получают, как описано в патенте РФ №2419785, по реакции сопропорционирования ацетата марганца (II) с перманганатом калия:A colloidal solution of manganese dioxide is obtained, as described in the patent of the Russian Federation No. 2419785, by the reaction of the proportionation of manganese (II) acetate with potassium permanganate:
3(СН3СОО)2Mn⋅4H2O+2KMnO4→5MnO2+2CH3COOK+4СН3СООН+2H2O3 (CH 3 COO) 2 Mn⋅4H 2 O + 2KMnO 4 → 5MnO 2 + 2CH 3 COOK + 4CH 3 COOH + 2H 2 O
Исходные растворы реагентов готовят па деионизованной воде в следующих концентрациях: ацетат марганца в концентрации 3,0×10-4 М, перманганата калия в концентрации 2,2×10-4 М. Концентрации реагентов в исходных растворах подбирают таким образом, чтобы они соответствовали стехиометрическим коэффициентам в приведенном выше уравнении реакции. Равные объемы растворов реагентов смешивают и интенсивно встряхивают в течение 5 минут. Полученные коллоидные растворы MnO2 подлежат хранению не более 30 дней при комнатной температуре.Stock solutions of reagents are prepared with deionized water in the following concentrations: manganese acetate at a concentration of 3.0 × 10 -4 M, potassium permanganate at a concentration of 2.2 × 10 -4 M. The concentration of reagents in the stock solutions is selected so that they correspond to stoichiometric coefficients in the above reaction equation. Equal volumes of reagent solutions are mixed and shaken vigorously for 5 minutes. The obtained colloidal solutions of MnO 2 should be stored for no more than 30 days at room temperature.
Пероксид-чувствительный электрод изготовляют, модифицируя полученным гидрозолем диоксида марганца поверхность пленарных графитовых электродов (см. описание в примере 1). На поверхность графитового планарного электрода наносят каплю гидрозоля диоксида марганца, электрод высушивают на воздухе при комнатной температуре, промывают водой, и прогревают электроды 1 час при 60°С в термостате и хранят при комнатной температуре.A peroxide-sensitive electrode is produced by modifying the surface of plenary graphite electrodes with the obtained manganese dioxide hydrosol (see the description in Example 1). A drop of a manganese dioxide hydrosol is applied to the surface of a graphite planar electrode, the electrode is dried in air at room temperature, washed with water, and the electrodes are heated for 1 hour at 60 ° C in a thermostat and stored at room temperature.
Далее на электрод наносят ферментативную смесь, идентичную описанной в примере 1, с тем отличием, что она не содержит феррицианида железа в качестве медиатора.Next, an enzymatic mixture identical to that described in Example 1 is applied to the electrode, with the difference that it does not contain iron ferricyanide as a mediator.
Тестирование работоспособности тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha и модифицированной гидрозолем диоксида марганца поверхности пленарных графитовых электродов, проводят с помощью потенциостата-гальваностата IPC-2000 (Хронас, Россия), как описано в примере 1. В качестве стандартных образцов используют кровь человека, собранную в пробирки с антикоагулянтом BD Vacutainer (каталожный номер 368841). К крови добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 0,1, 1, 2, 4, 8, 16 и 32 мМ (в качестве стокового использовали водный этанол с концентрацией 10%, полученный из абсолютированного этанола производства ЗАО НПО Химсинтез).The testing of the performance of test strips obtained using alcohol pastases P. pastoris and N. polymorpha and a surface of plenary graphite electrodes modified with a manganese dioxide hydrosol is carried out using an IPC-2000 potentiostat-galvanostat (Chronas, Russia), as described in Example 1. As standard samples use human blood collected in test tubes with the anticoagulant BD Vacutainer (catalog number 368841). Ethyl alcohol was added to the blood to a final concentration of 0.1, 1, 2, 4, 8, 16, and 32 mM (water ethanol with a concentration of 10% obtained from absolute ethanol manufactured by NPO Khimsyntez CJSC was used as stock).
Оценку эффективности измерения этанола с помощью тест-полосок, полученных с использованием алкогольоксидаз P. pastoris и Н. polymorpha, выполняют по тем же параметрам, что и в примере 1: область линейности (мМ), предел обнаружения этанола (мкМ), чувствительность, нА/(с мМ⋅см2), время ответа (сек), операционная стабильность (RSD, %,10 измерений). Результаты измерений представлены в Таблице 3.Evaluation of the effectiveness of measuring ethanol using test strips obtained using the alcohol pastases P. pastoris and H. polymorpha is performed according to the same parameters as in example 1: linearity region (mm), ethanol detection limit (μM), sensitivity, nA / (with mM ⋅ cm 2 ), response time (sec), operational stability (RSD,%, 10 measurements). The measurement results are presented in Table 3.
Испытания полученных тест-полосок, полученных с использованием с использованием модифицированной гидрозолем диоксида марганца поверхности планарных графитовых электродов при оптимальных условиях измерения этилового спирта показывают, что этот метод позволяет существенно улучшить все функциональные показатели тест-полоски. При этом наблюдается сглаживание отличий между сенсорами, полученными на основе алкогольоксидазы P. pastoris и Н. polymorpha. В этом варианте для получения биосенсоров с диапазоном чувствительности от 0,1 до 32 мМ могут быть использованы оба фермента.Tests of the test strips obtained using the surface of planar graphite electrodes using a modified manganese dioxide hydrosol under optimal conditions for measuring ethyl alcohol show that this method can significantly improve all the functional parameters of the test strip. In this case, there is a smoothing of differences between the sensors obtained on the basis of the alcohol oxidase P. pastoris and H. polymorpha. In this embodiment, both enzymes can be used to produce biosensors with a sensitivity range of 0.1 to 32 mM.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019106533A RU2713111C1 (en) | 2019-03-07 | 2019-03-07 | Test strip for determining content of ethyl alcohol in blood by electrochemical method using a portable amperometric cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019106533A RU2713111C1 (en) | 2019-03-07 | 2019-03-07 | Test strip for determining content of ethyl alcohol in blood by electrochemical method using a portable amperometric cell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2713111C1 true RU2713111C1 (en) | 2020-02-03 |
Family
ID=69624857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019106533A RU2713111C1 (en) | 2019-03-07 | 2019-03-07 | Test strip for determining content of ethyl alcohol in blood by electrochemical method using a portable amperometric cell |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2713111C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU223204U1 (en) * | 2023-05-22 | 2024-02-07 | София Петровна Баклагина | Test strip for the qualitative determination of methanol in alcohol-containing products |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2419785C1 (en) * | 2010-07-06 | 2011-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ЧипДетект" | Hydrosol for forming coatings of electrochemical peroxide-sensitive sensors and biosensors, method of producing said hydrosol, electrochemical sensor and biosensor, use and production methods thereof |
| RU175461U1 (en) * | 2017-07-18 | 2017-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) | DEVICE FOR DETERMINING THE CONTENT OF GLUCOSE, LACTATE, ETHANOL AND STARCH IN THE JOINT PRESENCE |
-
2019
- 2019-03-07 RU RU2019106533A patent/RU2713111C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2419785C1 (en) * | 2010-07-06 | 2011-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ЧипДетект" | Hydrosol for forming coatings of electrochemical peroxide-sensitive sensors and biosensors, method of producing said hydrosol, electrochemical sensor and biosensor, use and production methods thereof |
| RU175461U1 (en) * | 2017-07-18 | 2017-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) | DEVICE FOR DETERMINING THE CONTENT OF GLUCOSE, LACTATE, ETHANOL AND STARCH IN THE JOINT PRESENCE |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| АСУЛЯН Л.Д. и др. Биосенсоры для экспресс-определения спиртов на основе дрожжей Pichia Angusta и Hansenula Polymorphia, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта // Известия ТулГУ, Естественные науки, вып.1, 2008, * |
| ЗАЙЦЕВА Д.Ю. и др. Биосенсор на основе алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha NCYC 495 LN для определения метилового и этилового спиртов // Известия ТулГУ, Естественные науки, вып.4, 2016, стр.64-74. * |
| ЗАЙЦЕВА Д.Ю. и др. Биосенсор на основе алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha NCYC 495 LN для определения метилового и этилового спиртов // Известия ТулГУ, Естественные науки, вып.4, 2016, стр.64-74. АСУЛЯН Л.Д. и др. Биосенсоры для экспресс-определения спиртов на основе дрожжей Pichia Angusta и Hansenula Polymorphia, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта // Известия ТулГУ, Естественные науки, вып.1, 2008, стр.169-176. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU223204U1 (en) * | 2023-05-22 | 2024-02-07 | София Петровна Баклагина | Test strip for the qualitative determination of methanol in alcohol-containing products |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI450967B (en) | Homogeneously-structured nano-catalyst/enzyme composite electrode, fabricating method and application of the same | |
| Barsan et al. | An alcohol oxidase biosensor using PNR redox mediator at carbon film electrodes | |
| Malik et al. | An improved enzyme nanoparticles based amperometric pyruvate biosensor for detection of pyruvate in serum | |
| Aynacı et al. | An amperometric biosensor for acetylcholine determination prepared from acetylcholinesterase-choline oxidase immobilized in polypyrrole-polyvinylsulpfonate film | |
| JP5022285B2 (en) | Biosensor for measuring neutral fat | |
| Clark Jr | [41] The hydrogen peroxide sensing platinum anode as an analytical enzyme electrode | |
| JP6526572B2 (en) | Flavin-binding glucose dehydrogenase with improved thermal stability | |
| JP2013500728A (en) | Sensor for fructosyl peptidyl oxidase and glycated protein assays | |
| US20150267178A1 (en) | Protein having flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase activity | |
| Pérez et al. | Amperometric bienzymatic biosensor for L-lactate analysis in wine and beer samples | |
| US20190257781A1 (en) | Glucose redox reaction and composition for glucose measurement using flavin compound (as amended) | |
| KR20050019139A (en) | Method of measuring glucose concentration and glucose sensor with the use of glucose dehydrogenase | |
| White et al. | Mediated amperometric biosensors | |
| Tremey et al. | Designing an O2‐insensitive glucose oxidase for improved electrochemical applications | |
| Kim et al. | Construction of engineered fructosyl peptidyl oxidase for enzyme sensor applications under normal atmospheric conditions | |
| Bardeletti et al. | Amperometric enzyme electrodes for substrate and enzyme activity determinations | |
| Kausaite-Minkstimiene et al. | Reagent-less amperometric glucose biosensor based on a graphite rod electrode layer-by-layer modified with 1, 10-phenanthroline-5, 6-dione and glucose oxidase | |
| JP2009244013A (en) | Biosensor for measuring neutral fat | |
| Kulys et al. | The determination of glucose, hypoxanthine and uric acid with use of bi-enzyme amperometric electrodes | |
| JP7032906B2 (en) | Composition for glucose redox reaction and glucose measurement using flavin compound | |
| Laurinavicius et al. | Amperometric glyceride biosensor | |
| Mieliauskiene et al. | Amperometric determination of acetate with a tri-enzyme based sensor | |
| JP5380888B2 (en) | Method for quantitative determination of glucose and quantitative composition | |
| JP2010051312A (en) | Electrochemically measuring method for glucose using glucose dehydrogenase | |
| Tu et al. | RETRACTED: A nano-molar sensitive disposable biosensor for determination of dopamine |