RU2711920C1 - Epithelial cell cultivation additive - Google Patents
Epithelial cell cultivation additive Download PDFInfo
- Publication number
- RU2711920C1 RU2711920C1 RU2019116136A RU2019116136A RU2711920C1 RU 2711920 C1 RU2711920 C1 RU 2711920C1 RU 2019116136 A RU2019116136 A RU 2019116136A RU 2019116136 A RU2019116136 A RU 2019116136A RU 2711920 C1 RU2711920 C1 RU 2711920C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chitosan
- cells
- cultivation
- salt form
- nutrient medium
- Prior art date
Links
- 239000000654 additive Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title abstract description 16
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 102
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims abstract description 65
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 97
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 16
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 82
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 70
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 36
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 34
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 30
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 21
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 20
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 17
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 15
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 14
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 9
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007888 film coating Substances 0.000 description 2
- 238000009501 film coating Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 239000004381 Choline salt Substances 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000000996 L-ascorbic acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229920006321 anionic cellulose Polymers 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019417 choline salt Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000019305 fibroblast migration Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
- A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
- A61K31/722—Chitin, chitosan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается добавки для ускорения пролиферации клеточных культур в условиях in vitro, что может быть востребовано в химико-фармацевтической промышленности при получении значительного пула клеток-продуцентов биологически активных веществ, в медицине для быстрого накопления как ксеногенных, так и аутологичных клеток пациентов для заместительной терапии или 3D-биопечати органных конструктов, в токсикологии для тестирования на клеточных тест-системах косметических средств, детергентов, консервантов и инсектицидов, а также для изучения механизма действия и прогностического скрининга лекарственных препаратов и др.The invention relates to the field of biotechnology and relates to additives for accelerating the proliferation of cell cultures in vitro, which may be in demand in the pharmaceutical industry upon receipt of a significant pool of producer cells of biologically active substances, in medicine for the rapid accumulation of xenogenic and autologous cells patients for replacement therapy or 3D bioprinting of organ constructs, in toxicology for testing on the cell test systems of cosmetics, detergents, canned food nt and insecticides, as well as to study the mechanism of action and prognostic screening of drugs, etc.
Достигнутый в последние десятилетия прогресс в области молекулярной и клеточной биологии обусловил существенный рост числа отраслей, в которых востребованы клеточные технологии. В частности, в биотехнологии клеточные культуры широко используются в качестве продуцентов при производстве вакцин, гормонов и других секретируемых веществ, а также в качестве биологических тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ и при установлении степени токсичности новых химических веществ (мутагенов, канцерогенов, детергентов, консервантов, косметических средств, изделий медицинского назначения). Суспензионные культуры нашли применение в вирусологии для выращивания и накопления вирусов. В медицине клеточные технологии применяют в заместительной терапии (ткане- и остеогенез), для диагностики и лечения ряда наследственных заболеваний. Кроме того, роль клеточных культур различного происхождения крайне высока при решении ряда общебиологических задач, таких как установление сущности важнейших и сложнейших механизмов дифференцировки, специализации, старения клеток, их биологической активности, злокачественной трансформации и многого другого. Клеточные линии необходимы для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.The progress achieved in recent decades in the field of molecular and cellular biology has led to a significant increase in the number of industries in which cellular technology is in demand. In particular, in biotechnology, cell cultures are widely used as producers in the production of vaccines, hormones and other secreted substances, as well as biological test objects in testing new pharmacological substances and in establishing the degree of toxicity of new chemicals (mutagens, carcinogens, detergents, preservatives, cosmetics, medical devices). Suspension cultures have found application in virology for the cultivation and accumulation of viruses. In medicine, cell technology is used in replacement therapy (tissue and osteogenesis), for the diagnosis and treatment of a number of hereditary diseases. In addition, the role of cell cultures of various origins is extremely high in solving a number of general biological problems, such as establishing the essence of the most important and complex mechanisms of differentiation, specialization, aging of cells, their biological activity, malignant transformation, and much more. Cell lines are needed to preserve the gene pool of endangered species of animals and plants.
В большинстве случаев успех применения клеточных технологий обусловлен наличием достаточного количества клеточного материала, с чем связаны значительные проблемы. Прежде всего, проблемы касаются источника клеток: как известно, в условиях in vitro первичные культуры клеток, полученные из тканей животных и человека, обладают ограниченным пролиферативным потенциалом и нуждаются в целом спектре стимуляторов роста. Чтобы усилить пролиферацию клеток и повысить практический выход клеточного материала, в рецептуру стандартных (коммерческих) питательных сред вводят различные модифицирующие добавки. In most cases, the success of the use of cellular technology is due to the presence of a sufficient amount of cellular material, which is associated with significant problems. First of all, the problems relate to the source of the cells: as is known, in vitro conditions, primary cell cultures obtained from animal and human tissues have a limited proliferative potential and require a whole spectrum of growth stimulants. To enhance cell proliferation and increase the practical yield of cellular material, various modifying additives are introduced into the formulation of standard (commercial) culture media.
В частности, известен способ повышения выхода биомассы клеток млекопитающих путем добавления в питательную среду экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки (см. патент РФ №. 2588666 по кл. МПК C12N 5/00, опуб. 10.07.2016), продукта ферментативного разложения мяса рыб или экстракта из мяса рыб (патент РФ № 2333242 по кл. МПК C12N 5/02, опуб. 10.09.2008), солей холина (патент РФ № 2563353 по кл. МПК C12N 5/02, опуб. 20.09.2015), железа в виде различных железосодержащих соединений (патент РФ № 2663794 по кл. МПК C12N 5/02, опуб. 09.08.2018). Известна композиция (см. патент РФ № 2341270 по кл. МПК А61К35/12, опуб. 20.08.2008), содержащая кондиционированную культуральную среду, полученную при культивировании лейкоцитов периферической крови и стволовых и/или прогениторных клеток в среде, а также разрушенные культивируемые клетки. Также известен способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека в результате их культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека и тромбоцитарный фактор роста PDGF (патент РФ № 2536992, по кл. МПК C12N 5/02, опуб. 27.12.2014).In particular, there is a method for increasing the yield of biomass of mammalian cells by adding lyophilically dried medical leeches to the nutrient medium (see RF patent No. 2588666,
Однако предложенные добавки либо дорогостоящи, либо их получение является многоэтапным, трудоемким и высокозатратным процессом, либо они не обеспечивают быстрое ускорение пролиферации клеток. Последнее влечет за собой довольно серьезные осложнения, поскольку длительное накопление необходимого объема клеточного материала может привести к утере исходных свойств клеток и исчерпанию их пролиферативного потенциала. Более того, возникает необходимость частой смены питательной среды из-за протекающих в культуре метаболических процессов, что существенно увеличивает себестоимость получаемого продукта и делает применение клеточной технологии экономически несостоятельным.However, the proposed additives are either expensive, or their preparation is a multi-stage, time-consuming and high-cost process, or they do not provide rapid acceleration of cell proliferation. The latter entails quite serious complications, since long-term accumulation of the required volume of cellular material can lead to the loss of the initial properties of cells and the exhaustion of their proliferative potential. Moreover, there is a need for a frequent change of the nutrient medium due to metabolic processes in the culture, which significantly increases the cost of the resulting product and makes the use of cell technology economically unsound.
Наиболее близким к заявляемой является добавка к стандартной питательной среде для культивирования различных типов клеток в виде полиэлектролитного комплекса (ПЭК) анионного производного целлюлозы и катионного хитозана (степень деацетилирования СД = 50−100 мольн.%, средневязкостная молекулярная масса ММ = 10−3000 кДа) (см. патент Японии № 3311074 по кл. МПК С12М3/00, С12N11/10, опуб. 05.08.2002). ПЭК получают смешением этих противоположно заряженных полимеров в дистиллированной воде или буферной среде. Для повышения водорастворимости ПЭК используют водные растворы метанола, этанола, ацетона и т.п. Физико-химические показатели реакционной смеси, в которой формируется ПЭК, варьируются в широких пределах: рН может колебаться от 3 до 9, ионная сила – от 0 до 1.0, а температура может достигать значения +60°С. Относительная концентрация этих двух полимеров в ПЭК зависит от типа культивируемых клеток, состава питательной среды и может варьироваться в пределах от 0.25 до 4.0. Кроме того, она определяет способ применения ПЭК: либо путем его прямого внесения в питательную среду, либо путем нанесения на поверхность культуральной посуды (пластика, стекла, полиэтилена, металла и др.) в качестве пленочного покрытия.Closest to the claimed is an additive to a standard nutrient medium for culturing various types of cells in the form of a polyelectrolyte complex (PEC) of anionic cellulose derivative and cationic chitosan (degree of deacetylation of DM = 50-100 mol%, medium viscosity molecular weight MM = 10-3000 kDa) (see Japan patent No. 3311074 according to class IPC С12М3 / 00, С12N11 / 10, publ. 05.08.2002). PECs are prepared by mixing these oppositely charged polymers in distilled water or a buffer medium. To increase the water solubility of PEC, aqueous solutions of methanol, ethanol, acetone, etc. are used. Physicochemical parameters of the reaction mixture in which PEC is formed vary widely: pH can range from 3 to 9, ionic strength from 0 to 1.0, and temperature can reach + 60 ° С. The relative concentration of these two polymers in the PEC depends on the type of cultured cells, the composition of the nutrient medium and can vary from 0.25 to 4.0. In addition, it determines the method of applying PEC: either by directly introducing it into the nutrient medium, or by applying to the surface of culture dishes (plastic, glass, polyethylene, metal, etc.) as a film coating.
Однако, даже следовые количества метанола, этанола, ацетона и т.п. в составе ПЭК, высокие кислотность и ионная сила среды, а также повышение температуры среды, в которой формируется ПЭК, могут негативно отразиться как на функциональных свойствах полимерных компонентов комплекса, так и на процессах адгезии и пролиферации клеточных культур. Кроме того, при определенном составе полимеров образующийся ПЭК плохо растворим в воде, что делает невозможным введение ПЭК в состав питательной среды и предусматривает его использование только для получения пленочного покрытия на культуральной посуде. Следует также отметить, что ПЭК в клеточных технологиях используется, в основном, в качестве субстрата для клеток, поскольку он существенно повышает адгезивные свойства опорозависимых культур. Задача ускорения адгезии и пролиферации клеточных культур в изобретении не ставилась.However, even trace amounts of methanol, ethanol, acetone, etc. As a part of PEC, high acidity and ionic strength of the medium, as well as an increase in the temperature of the medium in which PEC is formed, can negatively affect both the functional properties of the polymer components of the complex and the processes of adhesion and proliferation of cell cultures. In addition, with a certain composition of polymers, the resulting PEC is poorly soluble in water, which makes it impossible to introduce PEC in the composition of the nutrient medium and provides for its use only for obtaining a film coating on culture dishes. It should also be noted that PEC in cell technology is used mainly as a substrate for cells, since it significantly increases the adhesive properties of oporozavisimy cultures. The task of accelerating the adhesion and proliferation of cell cultures in the invention was not posed.
Технической проблемой заявляемого изобретения является создание добавки для культивирования эпителиальных клеток, обеспечивающей повышение пролиферативных свойств клеток.The technical problem of the claimed invention is the creation of additives for the cultivation of epithelial cells, providing an increase in the proliferative properties of cells.
Техническим результатом изобретения является ускорение адгезии и пролиферации клеток млекопитающих в условиях in vitro в ранние сроки культивирования.The technical result of the invention is to accelerate the adhesion and proliferation of mammalian cells in vitro in the early stages of cultivation.
Технический результат достигается тем, что добавка для культивирования эпителиальных клеток на основе хитозана, согласно изобретению, представляет собой хитозан в солевой форме, полученной при взаимодействии хитозана с органической кислотой, выбранной из аскорбиновой или аспарагиновой или аминокапроновой или гликолевой кислоты при мольном соотношении хитозан:кислота 0.4−1.6.The technical result is achieved in that the additive for the cultivation of epithelial cells based on chitosan, according to the invention, is chitosan in salt form obtained by the interaction of chitosan with an organic acid selected from ascorbic or aspartic or aminocaproic or glycolic acid with a molar ratio of chitosan: acid 0.4 −1.6.
При этом хитозан имеет молекулярную массу 30 – 200 кДа, а добавка представляет собой стерильный водный раствор или лиофильно высушенный порошок хитозана в солевой форме.In this case, chitosan has a molecular weight of 30 - 200 kDa, and the additive is a sterile aqueous solution or lyophilized dried chitosan powder in salt form.
Добавку получают по реакции солеобразования хитозана в водной среде с биоактивными функциональными лигандами, в частности, анионами фармакопейных органических кислот − аспарагиновой или аскорбиновой или аминокапроновой или гликолевой. The additive is obtained by the reaction of salt formation of chitosan in an aqueous medium with bioactive functional ligands, in particular, anions of pharmacopoeial organic acids - aspartic or ascorbic or aminocaproic or glycolic.
Данные фармакопейные органические кислоты биологически безвредны в используемых количествах, биосовместимы с тканями организма и не вызывают токсического действия. Кроме того, аскорбиновая и аспарагиновая кислоты снижают окислительное повреждение культивируемых клеток человека и обладают эффектом стимулирования выработки коллагена в фибробластах, что существенно повышает адгезивную активность клеточных культур. Гликолевая кислота благодаря низкому молекулярному весу свободно проникает сквозь плазматическую мембрану и запускает процессы регенерации в тканях, а также стимулирует синтез структур внеклеточного матрикса (гликопротеидов, протеогликанов и др.). Аминокапроновая кислота способствует ускорению пролиферации эпителиальных клеток.These pharmacopoeial organic acids are biologically harmless in the quantities used, are biocompatible with body tissues and do not cause toxic effects. In addition, ascorbic and aspartic acids reduce oxidative damage to cultured human cells and have the effect of stimulating the production of collagen in fibroblasts, which significantly increases the adhesive activity of cell cultures. Due to its low molecular weight, glycolic acid freely penetrates the plasma membrane and triggers regeneration processes in tissues, and also stimulates the synthesis of extracellular matrix structures (glycoproteins, proteoglycans, etc.). Aminocaproic acid accelerates the proliferation of epithelial cells.
В соответствии с настоящим изобретением могут применяться различные типы клеток млекопитающих. Для культивирования клеток может быть использована любая стандартная питательная среда, адекватно соответствующая потребностям клеточной культуры. Среда может быть дополнена любыми компонентами, необходимыми для поддержания культивируемых клеток.Various types of mammalian cells can be used in accordance with the present invention. For culturing cells, any standard nutrient medium adequate to the needs of the cell culture can be used. The medium may be supplemented with any components necessary to maintain cultured cells.
Важным условием осуществления настоящего изобретения является порядок введения компонентов в питательную среду. Сначала в питательную среду вносится аликвотное количество водного раствора модифицирующей добавки в виде хитозана в солевой форме и аспарагиновой или аскорбиновой или аминокапроновой или гликолевой кислоты. Смесь тщательно перемешивается (не более 1 минуты) и в нее незамедлительно вносится суспензия клеток. Такое решение позволяет инициировать клетки к ускоренной пролиферации.An important condition for the implementation of the present invention is the order of introduction of the components in a nutrient medium. First, an aliquot of the aqueous solution of the modifying additive in the form of chitosan in salt form and aspartic or ascorbic or aminocaproic or glycolic acid is introduced into the nutrient medium. The mixture is thoroughly mixed (no more than 1 minute) and a suspension of cells is immediately introduced into it. This solution allows cells to initiate accelerated proliferation.
Изобретение поясняется иллюстрациями, где на фиг. 1 – 3 представлены результаты культивирования различных клеток в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С: (а) − в питательной среде DMEM с 10% FBS, (б) – в питательной среде DMEM с 10% FBS и с добавкой, а именно:The invention is illustrated by illustrations, where in FIG. Figures 1-3 show the results of the cultivation of various cells under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C: (a) in DMEM nutrient medium with 10% FBS, (b) in DMEM nutrient medium with 10% FBS and additive, namely:
на фиг. 1. – формирование монослоя дермальных фибробластов через 48 часов культивирования без добавки (пример 1) и с добавкой на основе солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты (пример 2); in FIG. 1. - the formation of a monolayer of dermal fibroblasts after 48 hours of cultivation without additives (example 1) and with the addition based on the salt form of chitosan and aspartic acid (example 2);
на фиг. 2. – формирование монослоя эпителиоподобных клеток линии МА-104 через 48 часов культивирования без добавки (пример 7) и с добавкой на основе солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты (пример 8); in FIG. 2. - the formation of a monolayer of epithelial-like cells of the MA-104 line after 48 hours of cultivation without additives (example 7) and with the addition based on the salt form of chitosan and aspartic acid (example 8);
на фиг. 3. – адгезия и распластывание эпителиоподобных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования без добавки (пример 7) и с добавкой на основе солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты (пример 9); in FIG. 3. - adhesion and spreading of epithelial-like cells of the MA-104 line after 1 hour of cultivation without additives (example 7) and with the addition based on the salt form of chitosan and ascorbic acid (example 9);
на фиг. 4. представлены адгезия и распластывание нормальных кератиноцитов человека через 1 час культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С: (а) − в смеси питательных сред DMEM и F12 (3:1) с 10% FBS (пример 12), (б) − в смеси питательных сред DMEM и F12 (3:1) с 10% FBS и с добавкой на основе солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты (пример 16).in FIG. Figure 4 shows the adhesion and spreading of normal human keratinocytes after 1 hour of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C: (a) in a mixture of DMEM and F12 (3: 1) culture media with 10% FBS (example 12), (b) in a mixture of nutrient media DMEM and F12 (3: 1) with 10% FBS and with the addition of the salt form of chitosan and aminocaproic acid (example 16).
Приготовление добавки.Cooking additives.
В качестве исходных реагентов для получения добавки используют воздушно-сухой порошок хитозана с СД ≥ 75−80 мольн.% и ММ = 30–200 кДа, аспарагиновую или аскорбиновую или аминокапроновую или гликолевую кислоты квалификации х.ч, бидистиллированную воду, дегазированную от CO2 и О2 кипячением при 100°С в течение 1 часа. As the starting reagents for the preparation of the additive, air-dried chitosan powder with DM ≥ 75–80 mol% and MM = 30–200 kDa, asparaginic or ascorbic or aminocaproic or glycolic acids of qualification chemically pure, bidistilled water degassed from CO 2 is used and O 2 by boiling at 100 ° C for 1 hour.
Готовят растворы хитозана концентрации 2.9–5.9·10-5 осново-моль/мл в водном растворе органической кислоты при соблюдении мольного соотношения [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.4–1.6. Процесс растворения компонентов проводят по стандартной методике при комнатной температуре. Навески хитозана и аспарагиновой или аскорбиновой или аминокапроновой кислоты, либо навеску хитозана и объем гликолевой кислоты помещают в стерильную колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения компонентов (формирования солевой формы) не более 2 часов и фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤0.45 мкм. Хранят в стерильной посуде при +4°С не более 2 суток. Для культивирования клеток в питательную среду вносят водный раствор модифицированной добавки и незамедлительно добавляют суспензию клеточной культуры. Оптимальное количество вводимой модифицирующей добавки определяют в предварительных опытах с использованием стандартной питательной среды с индикатором рН. Вводимый объем модифицирующей добавки не должен изменять уровень кислотности (рН) культуральной среды, что контролируется постоянством цвета питательной среды с индикатором рН.Solutions of chitosan with a concentration of 2.9–5.9 · 10 -5 basic mol / ml in an aqueous solution of an organic acid are prepared in compliance with the molar ratio [chitosan (−NН 2 )] / [acid] = 0.4–1.6. The process of dissolving the components is carried out according to standard methods at room temperature. Samples of chitosan and aspartic or ascorbic or aminocaproic acid, or a sample of chitosan and a volume of glycolic acid are placed in a sterile flask of a given volume, the calculated amount of bidistilled water is added, mixed until the components are completely dissolved (salt form) for no more than 2 hours and filtered through a Millipore filter with pore diameter ≤0.45 μm. Store in a sterile container at + 4 ° C for no more than 2 days. To cultivate the cells, an aqueous solution of the modified additive is added to the nutrient medium and a suspension of the cell culture is added immediately. The optimal amount of modifying additive introduced is determined in preliminary experiments using a standard nutrient medium with a pH indicator. The injected volume of the modifying additive should not change the level of acidity (pH) of the culture medium, which is controlled by the constant color of the nutrient medium with a pH indicator.
Из полученных растворов хитозана в аспарагиновой или аскорбиновой или аминокапроновой или гликолевой кислоте при необходимости может быть получена высушенная до порошкообразного состояния лиофилизированная солевая форма хитозана и аспарагиновой или аскорбиновой или аминокапроновой или гликолевой кислоты. При этом, срок хранения лиофилизированной солевой формы (полисоли) при +4°С увеличивается до 3−5 лет. Перед использованием лиофилизированную солевую форму растворяют в расчетном количестве бидистиллированной воды (не более 30 минут), вносят аликвотное количество модифицирующей добавки в питательную среду и незамедлительно добавляют суспензию клеточной культуры.From the obtained solutions of chitosan in aspartic or ascorbic or aminocaproic or glycolic acid, if necessary, a lyophilized salt form of chitosan and aspartic or ascorbic or ascorbic or aminocaproic or glycolic acid can be dried to a powder. At the same time, the shelf life of the lyophilized salt form (polysalt) at + 4 ° C increases to 3-5 years. Before use, the lyophilized salt form is dissolved in the calculated amount of double-distilled water (not more than 30 minutes), an aliquot of the modifying additive is added to the nutrient medium, and the cell culture suspension is immediately added.
Состав модифицированной добавки, отношение концентраций компонентов модифицированной добавки, а также аликвотное количество модифицированной добавки, вносимое в питательную среду, определяет специалист, исходя из конкретных характеристик культивируемых клеток, состава питательной среды, в которой выращивают клетки, и условий их роста.The composition of the modified additive, the ratio of the concentrations of the components of the modified additive, as well as an aliquot of the modified additive introduced into the nutrient medium, is determined by a specialist based on the specific characteristics of cultured cells, the composition of the nutrient medium in which the cells are grown, and the conditions for their growth.
Культивирование клеток.The cultivation of cells.
Настоящее изобретение может применяться при любом способе выращивания клеток в любом удобном объеме питательной среды. Для культивирования клеток может быть использована любая питательная среда, которая соответствует потребностям клеточной культуры. Среда может быть дополнена любыми компонентами, необходимыми для поддержания культивируемых клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяется среда DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), дополненная 10% FBS и 1% антибиотиков. В других вариантах осуществления изобретения применяется смесь сред DMEM и F12 (3:1) с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков.The present invention can be applied to any method of growing cells in any convenient volume of culture medium. Any culture medium that meets the needs of the cell culture can be used to cultivate the cells. The medium may be supplemented with any components necessary to maintain cultured cells. In some embodiments of the present invention, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics is used. In other embodiments, a mixture of DMEM and F12 (3: 1) media is added with 10% FBS and 1% antibiotics.
Могут применяться различные типы клеток млекопитающих, в том числе опорозависимые. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки млекопитающих выбирают из линии эпителиоподобных клеток эмбриональной почки макаки резус (MA-104). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки млекопитающих являются человеческими дермальными фибробластами и кератиноцитами, выделенными из фрагментов кожи здоровых взрослых доноров, подвергшихся косметической операции.Various types of mammalian cells can be used, including oporozoa. In some embodiments, the mammalian cells are selected from the epithelial-like cell line of the embryonic kidney of rhesus macaque (MA-104). In some embodiments, the mammalian cells are human dermal fibroblasts and keratinocytes isolated from skin fragments of healthy adult donors undergoing cosmetic surgery.
Для получения суспензии одиночных клеток клеточные линии выращивают в стандартной ростовой среде до фазы предконфлюэнтного монослоя. Затем монослой обрабатывают 0.25% раствором трипсина. Полученную взвесь клеток дважды отмывают центрифугированием в большом объеме свежей среды и вносят в питательную среду для культивирования сразу после внесения аликвотного количества модифицирующей добавки в виде солевой формы хитозана и аспарагиновой или аскорбиновой или аминокапроновой или гликолевой кислоты. Культивирование проводят при соответствующих условиях, необходимых для поддержания роста клеток.To obtain a suspension of single cells, cell lines are grown in standard growth medium to the pre-confluent monolayer phase. Then the monolayer is treated with 0.25% trypsin solution. The resulting suspension of cells is washed twice by centrifugation in a large volume of fresh medium and introduced into the culture medium immediately after the introduction of an aliquot of the modifying additive in the form of a salt form of chitosan and aspartic or ascorbic or aminocaproic or glycolic acid. Cultivation is carried out under appropriate conditions necessary to maintain cell growth.
Оценку ростовых свойств питательной среды с модифицирующей добавкой проводят путем сравнения скорости пролиферации клеток, а также времени их адгезии и распластывания относительно той же культуры клеток, выросшей в такой же питательной среде без модифицирующей добавки. Для объективизации исследования проводят по три опытных посева.The growth properties of the nutrient medium with the modifying additive are evaluated by comparing the cell proliferation rate and the time of their adhesion and spreading relative to the same cell culture grown in the same nutrient medium without the modifying additive. To objectify the research, three experimental crops are carried out.
Наблюдение за пролиферацией, адгезией и распластыванием клеток выполняют на инвертированном микроскопе Биолам П. После инкубации культуры в течение определенного времени (в зависимости от конкретного эксперимента) неприкрепившиеся клетки удаляют. Клетки, прикрепившиеся к субстрату, фиксируют 70% раствором этилового спирта в течение 10 мин при 20°С, окрашивают 0.04% раствором трипанового синего и подсчитывают в камере Горяева.Observation of cell proliferation, adhesion and spreading is performed on an inverted Biolam P. microscope. After incubation of the culture for a certain time (depending on the particular experiment), non-adherent cells are removed. Cells attached to the substrate are fixed with 70% ethyl alcohol for 10 min at 20 ° C, stained with 0.04% trypan blue solution and counted in a Goryaev’s chamber.
В качестве количественного критерия оценки пролиферативных свойств питательной среды используют относительный индекс пролиферации (ОИП), который рассчитывают по формуле:As a quantitative criterion for assessing the proliferative properties of a nutrient medium, use the relative proliferation index (IPR), which is calculated by the formula:
ОИП = NT / NК ,IPR = N T / N K
где NT – количество клеток, снятых с чашки с тестируемой средой; NК – количество клеток, снятых с чашки с контрольной средой.where N T is the number of cells taken from the cup with the test medium; N K is the number of cells taken from a plate with a control medium.
Настоящее изобретение более подробно поясняется на отдельных примерах, которые не могут рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.The present invention is explained in more detail in separate examples, which cannot be construed as limiting the scope of the invention.
Ниже приведены примеры культивирования различных эпителиальных клеток без заявляемой добавки и в её присутствии, а в таблице представлена количественная оценка пролиферативных свойств питательных сред на моделях эпителиальных и эпителиоподобных клеток.The following are examples of the cultivation of various epithelial cells without the claimed additives and in its presence, and the table provides a quantitative assessment of the proliferative properties of culture media on models of epithelial and epithelial-like cells.
Пример 1. Контроль пролиферации фибробластов. Example 1. Control of proliferation of fibroblasts.
Фибробласты получают методом спонтанной миграции клеток из биоптатов кожи здоровых взрослых доноров, подвергшихся косметической операции. Фрагменты кожи (3–5 мм) промывают фосфатным буфером, помещают в чашки Петри (Costar), накрывают покровным стеклом и заливают средой DMEM (Sigma) с 10% FBS (Hyclone) и смесью антибиотиков (Sigma). Клетки выращивают в инкубаторе с 5% СО2 при температуре 37°С. Миграция фибробластов начинается через 3–5 суток. На 14–20-е сутки из сформировавшегося монослоя получают суспензию клеток путем обработки смесью 0.25%-ного трипсина и 0.02%-ного ЭДТА.Fibroblasts are obtained by spontaneous cell migration from skin biopsies from healthy adult donors undergoing cosmetic surgery. Fragments of the skin (3-5 mm) are washed with phosphate buffer, placed in Petri dishes (Costar), covered with a coverslip and filled with DMEM (Sigma) with 10% FBS (Hyclone) and a mixture of antibiotics (Sigma). Cells are grown in an incubator with 5% CO 2 at a temperature of 37 ° C. Fibroblast migration begins in 3-5 days. On the 14–20th day, a suspension of cells is obtained from the formed monolayer by treatment with a mixture of 0.25% trypsin and 0.02% EDTA.
В стерильные чашки Петри вносят ростовую среду DMEM (Sigma), дополненную 10% FBS (Hyclone) и 1% антибиотиков (Sigma), и суспензию суточной культуры фибробластов (2–7 пассаж) из расчета 200 тыс.кл./мл. Клетки выращивают 48 часов в условиях насыщающей влажности в инкубаторе с 5% СО2 при 37єС. Питательную среду не меняют до окончания срока наблюдения.In sterile Petri dishes, DMEM growth medium (Sigma), supplemented with 10% FBS (Hyclone) and 1% antibiotics (Sigma), and a suspension of daily fibroblast culture (2–7 passage) at a rate of 200 thousand cells / ml are added. Cells are grown for 48 hours in saturating humidity conditions in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C. The nutrient medium is not changed until the end of the observation period.
Доля адгезированных фибробластов через 1 час культивирования в стандартных условиях составляет 55.5%, доля распластанных клеток – 77.2%. Время формирования зрелого монослоя клеток превышает 60 часов. Относительный индекс пролиферации (ОИП) фибробластов в стандартной среде через 48 часов культивирования составляет 1.The proportion of adherent fibroblasts after 1 hour of cultivation under standard conditions is 55.5%, the proportion of spread cells is 77.2%. The formation time of a mature monolayer of cells exceeds 60 hours. The relative proliferation index (IPR) of fibroblasts in a standard medium after 48 hours of cultivation is 1.
Пример сформированного монослоя дермальных фибробластов через 48 часов культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS приведен на Фиг. 1 (а).An example of a monolayer of dermal fibroblasts formed after 48 hours of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM culture medium with 10% FBS is shown in FIG. 1 (a).
Пример 2. Все этапы выделения и культивирования фибробластов аналогичны примеру 1. Отличие в том, что в стандартную питательную среду дополнительно вводят аликвотное количество стерильного водного раствора солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты, полученной из хитозана с ММ = 200 кДа при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.2, а затем незамедлительно вносят суспензию фибробластов. Example 2. All stages of isolation and cultivation of fibroblasts are similar to example 1. The difference is that an aliquot of a sterile aqueous solution of the salt form of chitosan and aspartic acid obtained from chitosan with MM = 200 kDa at a molar ratio of [chitosan ( −NH 2 )] / [acid] = 1.2, and then immediately add a suspension of fibroblasts.
Доля адгезированных фибробластов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой в виде солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты составляет 92.4%, доля распластанных клеток – 96.5%. Время формирования зрелого монослоя клеток не превышает 48 часов. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.7.After 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and aspartic acid, the proportion of adhered fibroblasts is 92.4%, the proportion of spread cells is 96.5%. The formation time of a mature cell monolayer does not exceed 48 hours. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.7.
Пример сформированного монослоя дермальных фибробластов через 48 часов культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS и модифицирующей добавкой на основе солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты и хитозана приведен на Фиг. 1 (б).An example of a monolayer of dermal fibroblasts formed after 48 hours of cultivation under saturated humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM nutrient medium with 10% FBS and a modifying additive based on the salt form of chitosan and aspartic acid and chitosan is shown in FIG. 1 (b).
Пример 3. Все этапы выделения и культивирования фибробластов аналогичны примеру 2. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аскорбиновой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.6.Example 3. All stages of isolation and cultivation of fibroblasts are similar to example 2. The difference is that the salt form of chitosan and ascorbic acid obtained in the molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 1.6.
Доля адгезированных фибробластов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой в виде солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты составляет 80.6%, доля распластанных клеток – 89.7%. Время формирования зрелого монослоя клеток 48 часов. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 1.7.The fraction of adherent fibroblasts after 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and ascorbic acid is 80.6%, the proportion of spread cells is 89.7%. The formation of a mature cell monolayer is 48 hours. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 1.7.
Пример 4. Все этапы выделения и культивирования фибробластов аналогичны примеру 3. Отличие в том, что стерильный водный раствор хитозана и аскорбиновой кислоты получают из лиофилизированного порошка солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты.Example 4. All stages of isolation and cultivation of fibroblasts are similar to example 3. The difference is that a sterile aqueous solution of chitosan and ascorbic acid is obtained from a lyophilized powder of the salt form of chitosan and ascorbic acid.
Доля адгезированных фибробластов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты составляет 80.7%, доля распластанных клеток – 89.3%. Время формирования зрелого монослоя клеток 48 часов. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 1.7.The fraction of adherent fibroblasts after 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and ascorbic acid is 80.7%, the proportion of spread cells is 89.3%. The formation of a mature cell monolayer is 48 hours. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 1.7.
Пример 5. Все этапы выделения и культивирования фибробластов аналогичны примеру 2. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аминокапроновой кислоты, полученную из хитозана с ММ = 30 кДа при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.8. Example 5. All stages of isolation and cultivation of fibroblasts are similar to example 2. The difference is that the salt form of chitosan and aminocaproic acid obtained from chitosan with MM = 30 kDa at a molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 0.8.
Доля адгезированных фибробластов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты составляет 88.5%, доля распластанных клеток – 98.4%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 48 часов. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.8.The fraction of adherent fibroblasts after 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and aminocaproic acid is 88.5%, the proportion of spread cells is 98.4%. The formation time of a mature monolayer of cells is less than 48 hours. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.8.
Пример 6. Все этапы выделения и культивирования фибробластов аналогичны примеру 2. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и гликолевой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.4.Example 6. All stages of isolation and cultivation of fibroblasts are similar to example 2. The difference is that the salt form of chitosan and glycolic acid obtained in the molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 0.4.
Доля адгезированных фибробластов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и гликолевой кислоты составляет 74.9%, доля распластанных клеток – 85.4%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 54 часов. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 1.4.The fraction of adherent fibroblasts after 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and glycolic acid is 74.9%, the proportion of spread cells is 85.4%. The formation time of a mature cell monolayer is less than 54 hours. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 1.4.
В таблице (примеры №1–6) приведена количественная оценка пролиферативных свойств питательных сред на модели человеческих дермальных фибробластов: доля адгезированных и распластанных клеток через 1 час культивирования, время формирования монослоя и относительный индекс пролиферации фибробластов в стандартной питательной среде DMEM и с модифицирующей добавкой.The table (examples No. 1–6) shows a quantitative assessment of the proliferative properties of culture media on a model of human dermal fibroblasts: the proportion of adherent and spread cells after 1 hour of cultivation, the monolayer formation time and the relative fibroblast proliferation index in a standard DMEM nutrient medium and with a modifying additive.
Представленные данные показывают, что предлагаемая добавка существенно улучшает ростовые качества питательной среды в отношении дермальных фибробластов. Доля (%) адгезированных и распластанных клеток через 1 час культивирования превышает таковые в контроле в 1.7 и 1.3 раза, соответственно, при использовании солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты, в 1.5 и 1.2 раза при использовании солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты, в 1.6 и 1.3 раза при использовании солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты, в 1.2 и 1.1 раза при использовании солевой формы хитозана и гликолевой кислоты. По сравнению с контролем, где время формирования монослоя клеток превышает 60 часов, время формирования зрелого монослоя клеток при использовании модифицирующей добавки не превышает 48–54 часов, что говорит о способности модифицированной среды стимулировать рост культуры в более ранние сроки. Относительный индекс пролиферации фибробластов в модифицированной питательной среде всегда выше, чем в контроле, что также свидетельствует о существенном ускорении роста клеточной популяции фибробластов.The presented data show that the proposed additive significantly improves the growth quality of the nutrient medium in relation to dermal fibroblasts. The proportion (%) of adherent and spread cells after 1 hour of cultivation exceeds those in the control 1.7 and 1.3 times, respectively, when using the salt form of chitosan and aspartic acid, 1.5 and 1.2 times when using the salt form of chitosan and ascorbic acid, 1.6 and 1.3 times when using the salt form of chitosan and aminocaproic acid, 1.2 and 1.1 times when using the salt form of chitosan and glycolic acid. Compared to the control, where the formation time of the cell monolayer exceeds 60 hours, the formation time of the mature cell monolayer when using a modifying additive does not exceed 48–54 hours, which indicates the ability of the modified medium to stimulate the growth of the culture at an earlier date. The relative fibroblast proliferation index in the modified nutrient medium is always higher than in the control, which also indicates a significant acceleration of the growth of the fibroblast cell population.
Пример 7. Контроль пролиферации клеток линии МА-104. Культура MA-104 предоставлена Российской коллекцией клеточных культур позвоночных ИНЦ РАН (г. Санкт-Петербург).Example 7. Control of proliferation of cells of the line MA-104. Culture MA-104 is provided by the Russian collection of vertebrate cell cultures of the Russian Academy of Sciences (St. Petersburg).
В стерильные чашки Петри вносят ростовую среду DMEM (Sigma), дополненную 10 % FBS (Hyclone) и 1% антибиотиков (Sigma), и суспензию суточной культуры клеток линии МА-104 из расчета 110 тыс.кл./мл. Клетки выращивают 48 часов в условиях насыщающей влажности в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Питательную среду не меняют до окончания срока наблюдения.In sterile Petri dishes, DMEM growth medium (Sigma), supplemented with 10% FBS (Hyclone) and 1% antibiotics (Sigma), and a suspension of daily culture of MA-104 cell line at a rate of 110 thousand cells / ml are added. Cells are grown for 48 hours in saturating humidity conditions in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C. The nutrient medium is not changed until the end of the observation period.
Доля адгезированных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в стандартных условиях составляет 84.0%, доля распластанных клеток – 56.4%. Время формирования зрелого монослоя клеток превышает 48 часов. ОИП клеток линии МА-104 в стандартной среде через 48 часов культивирования составляет 1.The fraction of adherent MA-104 cells after 1 hour of cultivation under standard conditions is 84.0%, the proportion of spread cells is 56.4%. The formation time of a mature monolayer of cells exceeds 48 hours. The IPR of the MA-104 cell line in standard medium after 48 hours of cultivation is 1.
Пример сформированного монослоя эпителиоподобных клеток линии МА-104 через 48 часов культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS приведен на Фиг. 2 (а).An example of a formed monolayer of epithelium-like cells of the MA-104 line after 48 hours of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM culture medium with 10% FBS is shown in FIG. 2 (a).
Пример адгезии и распластывания эпителиоподобных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS приведен на Фиг. 3 (а).An example of adhesion and spreading of epithelial-like cells of the MA-104 line after 1 hour of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM culture medium with 10% FBS is shown in FIG. 3 (a).
Пример 8. Все этапы культивирования клеток линии МА-104 аналогичны примеру 7. Отличие в том, что в стандартную питательную среду дополнительно вводят аликвотное количество стерильного водного раствора солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты, полученной из хитозана с ММ = 200 кДа при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.2, а затем незамедлительно вносят суспензию клеток линии МА-104. Example 8. All stages of culturing the MA-104 cell line are similar to Example 7. The difference is that an aliquot of a sterile aqueous solution of the salt form of chitosan and aspartic acid obtained from chitosan with MM = 200 kDa at a molar ratio of [additional] is added to the standard nutrient medium [ chitosan (−NH 2 )] / [acid] = 1.2, and then immediately add a suspension of cells of the MA-104 line.
Доля адгезированных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты составляет 99.3%, доля распластанных клеток – 97.7%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 48 часов. ОИП клеток линии МА-104 в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 4.5.After 1 hour of cultivation in nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and aspartic acid, the proportion of adhered MA-104 cell line is 99.3%, the proportion of spread out cells is 97.7%. The formation time of a mature monolayer of cells is less than 48 hours. The IPR of MA-104 cells in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 4.5.
Пример сформированного монослоя эпителиоподобных клеток линии МА-104 через 48 часов культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS и модифицирующей добавкой на основе солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты приведен на Фиг. 2 (б).An example of the formed monolayer of epithelial-like cells of the MA-104 line after 48 hours of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM nutrient medium with 10% FBS and a modifying additive based on the salt form of chitosan and aspartic acid is shown in FIG. 2 (b).
Пример 9. Все этапы культивирования клеток линии МА-104 аналогичны примеру 8. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аскорбиновой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.6.Example 9. All stages of culturing the MA-104 cell line are similar to Example 8. The difference is that the salt form of chitosan and ascorbic acid obtained in a molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 1.6.
Доля адгезированных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты составляет 87.8%, доля распластанных клеток – 81.2%. Время формирования зрелого монослоя клеток 48 часов. ОИП клеток линии МА-104 в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 3.8.After 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with the salt form of chitosan and ascorbic acid, the proportion of adhered MA-104 cell line is 87.8%, the proportion of spread out cells is 81.2%. The formation of a mature cell monolayer is 48 hours. The IPR of MA-104 cells in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 3.8.
Пример адгезии и распластывания эпителиоподобных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS и модифицирующей добавкой на основе солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты приведен на Фиг. 3 (б).An example of the adhesion and spreading of epithelial-like cells of the MA-104 line after 1 hour of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM with 10% FBS and a modifying additive based on the salt form of chitosan and ascorbic acid is shown in FIG. . 3 (b).
Пример 10. Все этапы культивирования клеток линии МА-104 аналогичны примеру 8. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аминокапроновой кислоты, полученную из хитозана с ММ = 30 кДа при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.8.Example 10. All stages of cultivation of MA-104 cell lines are similar to Example 8. The difference is that the salt form of chitosan and aminocaproic acid obtained from chitosan with MM = 30 kDa at a molar ratio of [chitosan (−NН 2 ) is used as a modifying additive ] / [acid] = 0.8.
Доля адгезированных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты составляет 98.9%, доля распластанных клеток – 98.6%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 48 часов. ОИП клеток линии МА-104 в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 4.6.After 1 hour of cultivation in nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and aminocaproic acid, the proportion of adhered MA-104 cell lines is 98.9%, and the proportion of spread out cells is 98.6%. The formation time of a mature monolayer of cells is less than 48 hours. The IPR of MA-104 cells in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 4.6.
Пример 11. Все этапы культивирования клеток линии МА-104 аналогичны примеру 8. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и гликолевой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.4.Example 11. All stages of culturing the MA-104 cell line are similar to Example 8. The difference is that the salt form of chitosan and glycolic acid obtained in the molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 0.4.
Доля адгезированных клеток линии МА-104 через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и гликолевой кислоты составляет 85.2%, доля распластанных клеток – 78.1%. Время формирования зрелого монослоя клеток 48 часов. ОИП клеток линии МА-104 в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.5.After 1 hour of cultivation in nutrient medium supplemented with the salt form of chitosan and glycolic acid, the proportion of adhered MA-104 line cells is 85.2%, the proportion of spread out cells is 78.1%. The formation of a mature cell monolayer is 48 hours. The IPR of MA-104 cells in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.5.
В таблице (примеры №7–11) приведена количественная оценка пролиферативных свойств питательных сред на модели эпителиоподобных клеток животного происхождения (линия МА-104). The table (examples No. 7–11) provides a quantitative assessment of the proliferative properties of culture media in a model of epithelial-like cells of animal origin (line MA-104).
Представленные данные показывают, что предлагаемая добавка существенно улучшает ростовые качества питательной среды в отношении клеток линии МА-104. Доля (%) адгезированных и распластанных клеток через 1 час культивирования превышает таковые в контроле в 1.2 и 1.7 раза, соответственно, при использовании солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты, в 1.1 и 1.4 раза при использовании солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты, в 1.2 и 1.8 раза при использовании солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты, в 1.1 и 1.4 раза при использовании солевой формы хитозана и гликолевой кислоты. По сравнению с контролем, где время формирования монослоя клеток превышает 48 часов, время формирования зрелого монослоя клеток линии МА-104 при использовании модифицирующей добавки составляет 48 часов и менее, что говорит о способности модифицированной среды стимулировать рост культуры в более ранние сроки. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде всегда выше, чем в контроле, что также свидетельствует о существенном ускорении роста клеточной популяции фибробластов.The presented data show that the proposed additive significantly improves the growth quality of the nutrient medium in relation to cells of the MA-104 line. The fraction (%) of adherent and spread cells after 1 hour of cultivation exceeds those in the control 1.2 and 1.7 times, respectively, when using the salt form of chitosan and aspartic acid, 1.1 and 1.4 times when using the salt form of chitosan and ascorbic acid, 1.2 and 1.8 times when using the salt form of chitosan and aminocaproic acid, 1.1 and 1.4 times when using the salt form of chitosan and glycolic acid. Compared to the control, where the formation time of the cell monolayer exceeds 48 hours, the formation time of the mature monolayer of MA-104 cells using a modifying additive is 48 hours or less, which indicates the ability of the modified medium to stimulate the growth of the culture at an earlier date. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium is always higher than in the control, which also indicates a significant acceleration of the growth of the fibroblast cell population.
Пример 12. Контроль пролиферации нормальных кератиноцитов человека. Культуру нормальных кератиноцитов человека получают из биоптатов кожи здоровых взрослых доноров по модифицированному методу Рейнвальда.Example 12. Control of the proliferation of normal human keratinocytes. A culture of normal human keratinocytes is obtained from skin biopsies from healthy adult donors using the modified Reinwald method.
В стерильные чашки Петри вносят смесь ростовых сред DMEM (Sigma) и F12 (3:1), дополненную 10% FBS (Hyclone) и 1% антибиотиков (Sigma), и суспензию суточной культуры кератиноцитов из расчета 250 тыс.кл./мл. Клетки выращивают 48 часов в условиях насыщающей влажности в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Питательную среду не меняют до окончания срока наблюдения.A mixture of DMEM growth media (Sigma) and F12 (3: 1), supplemented with 10% FBS (Hyclone) and 1% antibiotics (Sigma), and a suspension of daily keratinocyte culture at a rate of 250 thousand cells / ml are added to sterile Petri dishes. Cells are grown for 48 hours in saturating humidity conditions in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C. The nutrient medium is not changed until the end of the observation period.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в стандартных условиях составляет 20.8%, доля адгезированных и распластанных клеток – 61.6%. Формирование зрелого монослоя клеток протекает свыше 72 часов. Относительный индекс пролиферации кератиноцитов в стандартной среде через 48 часов культивирования составляет 1.The proportion of adhered keratinocytes after 1 hour of cultivation under standard conditions is 20.8%, the proportion of adherent and spread cells is 61.6%. The formation of a mature monolayer of cells proceeds over 72 hours. The relative index of keratinocyte proliferation in standard medium after 48 hours of cultivation is 1.
Пример адгезии и распластывания нормальных кератиноцитов человека через 1 час культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в смеси питательных сред DMEM и F12 (3:1) с 10% FBS приведен на Фиг. 4 (а).An example of adhesion and spreading of normal human keratinocytes after 1 hour of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in a mixture of nutrient media DMEM and F12 (3: 1) with 10% FBS is shown in FIG. 4 (a).
Пример 13. Все этапы выделения и культивирования кератиноцитов аналогичны примеру 12. Отличие в том, что в стандартную питательную среду DMEM / F12 дополнительно вводят аликвотное количество стерильного водного раствора солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты, полученной из хитозана с ММ = 200 кДа при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.0, а затем незамедлительно вносят суспензию клеток линии МА-104. Example 13. All stages of the isolation and cultivation of keratinocytes are similar to example 12. The difference is that an aliquot of a sterile aqueous solution of the salt form of chitosan and aspartic acid obtained from chitosan with MM = 200 kDa at a molar ratio is additionally introduced into the standard DMEM / F12 nutrient medium [chitosan (−NH 2 )] / [acid] = 1.0, and then immediately add a suspension of cells of the MA-104 line.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты составляет 51.4%, доля распластанных клеток – 91.5%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 56 часов. ОИП кератиноцитов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 3.1.After 1 hour of cultivation in nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and aspartic acid, the proportion of adhered keratinocytes is 51.4%, and the proportion of spread cells is 91.5%. The formation time of a mature monolayer of cells is less than 56 hours. The IPR of keratinocytes in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 3.1.
Пример 14. Все этапы выделения и культивирования кератиноцитов аналогичны примеру 13. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аскорбиновой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.3.Example 14. All stages of the isolation and cultivation of keratinocytes are similar to example 13. The difference is that the salt form of chitosan and ascorbic acid obtained in a molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 1.3.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты составляет 50.0%, доля распластанных клеток – 78.9%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 60 часов. ОИП кератиноцитов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.7.After 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and ascorbic acid, the proportion of adhered keratinocytes is 50.0%, and the proportion of spread cells is 78.9%. The formation time of a mature cell monolayer is less than 60 hours. The IPR of keratinocytes in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.7.
Пример 15. Все этапы выделения и культивирования кератиноцитов аналогичны примеру 14. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аскорбиновой кислоты, полученную из хитозана с ММ = 30 кДа при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.8.Example 15. All stages of the isolation and cultivation of keratinocytes are similar to example 14. The difference is that the salt form of chitosan and ascorbic acid obtained from chitosan with MM = 30 kDa at a molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive. / [acid] = 0.8.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты составляет 50.9%, доля распластанных клеток – 80.1%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 54 часов. ОИП кератиноцитов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.8.After 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and ascorbic acid, the proportion of adhered keratinocytes is 50.9%, and the proportion of spread cells is 80.1%. The formation time of a mature cell monolayer is less than 54 hours. The IPR of keratinocytes in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.8.
Пример 16. Все этапы выделения и культивирования кератиноцитов аналогичны примеру 15. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и аминокапроновой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 1.0.Example 16. All stages of the isolation and cultivation of keratinocytes are similar to example 15. The difference is that the salt form of chitosan and aminocaproic acid obtained in the molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 1.0.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты составляет 53.0%, доля распластанных клеток – 85.5%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 56 часов. ОИП кератиноцитов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 3.0.The proportion of adhered keratinocytes after 1 hour of cultivation in a nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and aminocaproic acid is 53.0%, the proportion of spread cells is 85.5%. The formation time of a mature monolayer of cells is less than 56 hours. The IPR of keratinocytes in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 3.0.
Пример адгезии и распластывания нормальных кератиноцитов человека через 1 час культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в смеси питательных сред DMEM и F12 (3:1) с 10% FBS и модифицирующей добавкой на основе солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты приведен на Фиг. 4 (б).An example of adhesion and spreading of normal human keratinocytes after 1 hour of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in a mixture of nutrient media DMEM and F12 (3: 1) with 10% FBS and a modifying additive based on the salt form of chitosan and aminocaproic acid is shown in FIG. 4 (b).
Пример 17. Все этапы выделения и культивирования кератиноцитов аналогичны примеру 13. Отличие в том, что в качестве модифицирующей добавки используют солевую форму хитозана и гликолевой кислоты, полученную при мольном соотношении [хитозан(−NН2)] / [кислота] = 0.5.Example 17. All stages of the isolation and cultivation of keratinocytes are similar to example 13. The difference is that the salt form of chitosan and glycolic acid obtained in the molar ratio of [chitosan (−NH 2 )] is used as a modifying additive / [acid] = 0.5.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и гликолевой кислоты составляет 48.5%, доля распластанных клеток – 80.2%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 60 часов. ОИП кератиноцитов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.3.After 1 hour of cultivation in nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and glycolic acid, the proportion of adhered keratinocytes is 48.5%, and the proportion of spread cells is 80.2%. The formation time of a mature cell monolayer is less than 60 hours. The IPR of keratinocytes in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.3.
Пример 18. Все этапы выделения и культивирования кератиноцитов аналогичны примеру 17. Отличие в том, что аликвотное количество стерильного водного раствора солевой формы хитозана и гликолевой кислоты получают из лиофилизированного порошка солевой формы хитозана и гликолевой кислоты.Example 18. All stages of the isolation and cultivation of keratinocytes are similar to example 17. The difference is that an aliquot of a sterile aqueous solution of the salt form of chitosan and glycolic acid is obtained from lyophilized powder of the salt form of chitosan and glycolic acid.
Доля адгезированных кератиноцитов через 1 час культивирования в питательной среде с добавкой солевой формы хитозана и гликолевой кислоты составляет 48.8%, доля распластанных клеток – 80.9%. Время формирования зрелого монослоя клеток менее 60 часов. ОИП кератиноцитов в модифицированной питательной среде через 48 часов культивирования составляет 2.3.After 1 hour of cultivation in nutrient medium supplemented with a salt form of chitosan and glycolic acid, the proportion of adhered keratinocytes is 48.8%, and the proportion of spread cells is 80.9%. The formation time of a mature cell monolayer is less than 60 hours. The IPR of keratinocytes in a modified nutrient medium after 48 hours of cultivation is 2.3.
В таблице (примеры №12–18) приведена количественная оценка пролиферативных свойств питательных сред на модели нормальных человеческих кератиноцитов. The table (examples No. 12–18) provides a quantitative assessment of the proliferative properties of culture media on a model of normal human keratinocytes.
Представленные данные показывают, что предлагаемая добавка существенно улучшает ростовые качества питательной среды в отношении культуры кератиноцитов. Доля (%) адгезированных и распластанных клеток через 1 час культивирования превышает таковые в контроле в 2.5 и 1.5 раза, соответственно, при использовании солевой формы хитозана и аспарагиновой кислоты, в 2.4−2.5 и 1.3 раза при использовании солевой формы хитозана и аскорбиновой кислоты, в 2.6 и 1.4 раза при использовании солевой формы хитозана и аминокапроновой кислоты, в 2.3 и 1.3 раза при использовании солевой формы хитозана и гликолевой кислоты. По сравнению с контролем, где время формирования монослоя клеток составляет 72 часа и более, время формирования зрелого монослоя кератиноцитов при использовании модифицирующей добавки составляет 54−60 часов и менее, что говорит о способности модифицированной среды стимулировать рост культуры в более ранние сроки. ОИП фибробластов в модифицированной питательной среде всегда выше, чем в контроле, что также свидетельствует о существенном ускорении роста клеточной популяции фибробластов. The data presented show that the proposed supplement significantly improves the growth quality of the nutrient medium in relation to the culture of keratinocytes. The proportion (%) of adherent and spread cells after 1 hour of cultivation exceeds those in the control 2.5 and 1.5 times, respectively, when using the salt form of chitosan and aspartic acid, 2.4–2.5 and 1.3 times when using the salt form of chitosan and ascorbic acid, 2.6 and 1.4 times when using the salt form of chitosan and aminocaproic acid, 2.3 and 1.3 times when using the salt form of chitosan and glycolic acid. Compared to the control, where the formation time of the cell monolayer is 72 hours or more, the formation time of the mature keratinocyte monolayer using a modifying additive is 54-60 hours or less, which indicates the ability of the modified medium to stimulate the growth of the culture at an earlier date. The IPR of fibroblasts in a modified nutrient medium is always higher than in the control, which also indicates a significant acceleration of the growth of the fibroblast cell population.
Получение водного раствора модифицирующей добавки путем растворения хитозана в водном растворе органической кислоты или путем растворения в воде порошка лиофилизированной солевой формы, полученной из соответствующего водного раствора хитозана и органической кислоты, не влияет на пролиферативные свойства модифицированной питательной среды. В обоих случаях введение в стандартную питательную среду модифицирующей добавки значимо ускоряет адгезию, распластывание и пролиферацию клеточных культур в условиях in vitro.The preparation of an aqueous solution of a modifying additive by dissolving chitosan in an aqueous solution of an organic acid or by dissolving in water a powder of a lyophilized salt form obtained from the corresponding aqueous solution of chitosan and an organic acid does not affect the proliferative properties of the modified nutrient medium. In both cases, the introduction of a modifying additive into a standard nutrient medium significantly accelerates the adhesion, spreading, and proliferation of cell cultures in vitro.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019116136A RU2711920C1 (en) | 2019-05-27 | 2019-05-27 | Epithelial cell cultivation additive |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019116136A RU2711920C1 (en) | 2019-05-27 | 2019-05-27 | Epithelial cell cultivation additive |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2711920C1 true RU2711920C1 (en) | 2020-01-24 |
Family
ID=69184214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019116136A RU2711920C1 (en) | 2019-05-27 | 2019-05-27 | Epithelial cell cultivation additive |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2711920C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2782600C1 (en) * | 2021-12-03 | 2022-10-31 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Method for increasing the proliferative potential of three-dimensional tumor cell cultures |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009043319A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Cpn Spol. S.R.O. | Preparation for wound healing and prevention of bandage adhesion to the wound, containing chitosan-glucan |
| RU2461575C2 (en) * | 2010-08-02 | 2012-09-20 | Анна Борисовна Шиповская | Method for forming chitosan film coating and chitosan film coating |
| RU2657826C1 (en) * | 2017-07-14 | 2018-06-15 | Общество с Ограниченной Ответственностью "Гелиос" | Composition for producing hydrogel |
-
2019
- 2019-05-27 RU RU2019116136A patent/RU2711920C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009043319A1 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Cpn Spol. S.R.O. | Preparation for wound healing and prevention of bandage adhesion to the wound, containing chitosan-glucan |
| RU2461575C2 (en) * | 2010-08-02 | 2012-09-20 | Анна Борисовна Шиповская | Method for forming chitosan film coating and chitosan film coating |
| RU2657826C1 (en) * | 2017-07-14 | 2018-06-15 | Общество с Ограниченной Ответственностью "Гелиос" | Composition for producing hydrogel |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2782600C1 (en) * | 2021-12-03 | 2022-10-31 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Method for increasing the proliferative potential of three-dimensional tumor cell cultures |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lei et al. | Bone marrow-derived mesenchymal stem cells laden novel thermo-sensitive hydrogel for the management of severe skin wound healing | |
| Xu et al. | Injectable biodegradable hybrid hydrogels based on thiolated collagen and oligo (acryloyl carbonate)–poly (ethylene glycol)–oligo (acryloyl carbonate) copolymer for functional cardiac regeneration | |
| TWI637055B (en) | Preparation method of pluripotent stem cells, preparation of pluripotent stem cells using the same, improvement agent, and differentiation induction method of the pluripotent stem cells | |
| Rickert et al. | The importance of angiogenesis in the interaction between polymeric biomaterials and surrounding tissue | |
| KR20100065338A (en) | Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof | |
| EP3196293B1 (en) | Three-dimensional cell culture system and cell culture method using same | |
| Gugerell et al. | Adipose-derived stem cells cultivated on electrospun l-lactide/glycolide copolymer fleece and gelatin hydrogels under flow conditions–aiming physiological reality in hypodermis tissue engineering | |
| KR101660877B1 (en) | Chemically cross-linked hyaluronic acid hydrogel particle, preparation method thereof and spheroid formation method using it | |
| CN105079783A (en) | Pharmaceutical composition and preparation method and application thereof | |
| CN109689858A (en) | Methods for generating mesoderm and/or endothelial colony-forming cell-like cells with in vivo angiogenic capacity | |
| DE69530409T2 (en) | BIOMATERIAL CONTAINING EPITHELIC CELLS AND THEIR USE AS A TRANSPLANT | |
| CN101001652A (en) | Cross-linked collagen matrix for producing a skin equivalent | |
| JP7658611B2 (en) | Hydrogel for cell culture, gel kit, method for producing cell culture product, and method for producing hydrogel for cell culture | |
| EP3406704A1 (en) | Modification method for cell culture product in adhered state | |
| RU2711920C1 (en) | Epithelial cell cultivation additive | |
| RU2320720C2 (en) | Method for culturing fibroblasts for substitution therapy | |
| KR101815390B1 (en) | Medium Composition Materials for Cell Culture | |
| Azari et al. | Evaluation of in vitro coculture of keratinocytes derived from foreskin and adipose‐derived mesenchymal stem cells (AMSCs) on a multilayer oxygen‐releasing electrospun scaffold based on PU/PCL. Sodium percarbonate (SPC)‐gelatine/PU | |
| US20220214329A1 (en) | Nanocellulose 3D Matrix for Cultivating Human and Animal Cells in Vitro | |
| Liu et al. | Silk fibroin biohydrogel composites for loading and ordered release of multiple active ingredients with enhanced bioactivity | |
| RU2439147C1 (en) | Method of stimulation in vitro pluripotent hemopoetic stem cells | |
| WO2019221639A1 (en) | Method for producing a collagen-laminin matrix for healing skin ulcers, burns and wounds in humans | |
| Zhang et al. | Bioprinted M2 macrophage-derived extracellular vesicle mimics attenuate foreign body reaction and enhance vascularized tissue regeneration | |
| CN115463083A (en) | Injectable hydrogel material and preparation and application methods thereof | |
| DE102017005048A1 (en) | Cell cultures containing poly (oxazoline) stabilizers and use of poly (oxazoline) s for the stabilization of cell cultures |