RU2708558C1 - Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4 - Google Patents
Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2708558C1 RU2708558C1 RU2018144103A RU2018144103A RU2708558C1 RU 2708558 C1 RU2708558 C1 RU 2708558C1 RU 2018144103 A RU2018144103 A RU 2018144103A RU 2018144103 A RU2018144103 A RU 2018144103A RU 2708558 C1 RU2708558 C1 RU 2708558C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lymphocytes
- cells
- transduced
- tcr
- lymphoma cells
- Prior art date
Links
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 12
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims description 2
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 29
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 26
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 3
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу создания противоопухолевой иммунной защиты организма к клеткам лимфомы EL-4. Изобретение позволяет эффективно противостоять клеткам лимфомы EL-4. 1 ил., 3 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и касается Т-лимфоцитов, имеющих новый рецептор.
В процессе иммунного ответа на антигены бактерий, вирусов и опухолей в организме формируется популяция клеток памяти - лимфоцитов, способных к ускоренному и усиленному ответу на тот же антиген, введенный повторно. Встреча организма с антигеном ведет к дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в эффекторные клетки, а затем в клетки памяти. Это пул клеток, составляющий около 5% от общего количества лимфоцитов, способных длительно персистировать и осуществлять эффективный иммунный ответ при повторной встрече организма с антигеном (Rocha В., 1997; Jacob J. et al., 1997, Rocha В., 1999, Murali K.K. et al., 1998). Все известные методы вакцинации основаны на возникновении клеток памяти.
Специфическое узнавание антигена Т-лимфоцитами происходит благодаря наличию Т-клеточного рецептора (ТКР). ТКР состоит из α- и β-цепей, которые являются уникальными для каждого клона Т-лимфоцитов. Пул Т-лимфоцитов организма представляют собой смесь клеток, на поверхности каждой из которых присутствует своя уникальная комбинация α- и β-цепей ТКР, которая передается ее потомкам, образующимся в результате деления (клонам).
Получение Т-лимфоцитов с ТКР нужной специфичности происходит в несколько этапов:
1. Проведение Т-клеточного клонирования. В пуле Т-лимфоцитов индуцируют размножение отдельных клеток с нужной специфичностью ТКР путем добавления к ним специфического антигена. Чтобы получить достаточное количество таких клеток, проводят несколько раундов рестимуляции их пролиферации специфическим антигеном. В результате получают необходимое количество Т-лимфоцитов, несущих ту же комбинацию α- и β-цепей ТКР, что и исходная клетка (клон). Данная процедура требует значительных временных и технических затрат, связанных с длительностью роста индивидуальных клонов и необходимостью подбора и обеспечения достаточно сложных (иногда индивидуальных) условий их поддержания и дальнейшего тестирования.
2. Проведение генного клонирования, идентификация и определение нуклеотидных последовательностей α- и β-цепей каждого клона Т-лимфоцитов. Полученные генетические последовательности при помощи экспрессионных векторов вводят в активированные Т-лимфоциты, в результате чего их потомки приобретают способность к экспрессии ТКР с новой заданной специфичностью.
Этот подход был использован для адоптивной иммунотерапии опухолей в онкологии [Robbins PF, Morgan RA, Feldman SA., Yang JC, Sherry RM, Dudley ME, Wunderlich JR, Nahvi AV, Helman LJ, Mackall CL, Kammula US, Hughes MS, Restifo NP, Raffeld M, Lee CC, Levy CL, Li YF, El-Gamil M, Schwarz SL, Laurencot C, Rosenberg SA.Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1.J Clin Oncol. 2011 Mar 1; 29(7):917-24.; Blankenstein T, Leisegang M, Uckert W, Schreiber H. Targeting cancer-specific mutations by T cell receptor gene therapy. Curr Opin Immunol. 2015; 33:112-9].
Недостатки данного подхода: необходимость проведения процедуры клеточного клонирования. Использована полная конфигурация ТКР, состоящая из α- и β-цепей.
Ранее мы обнаружили, что среди Т-лимфоцитов присутствуют Т-лимфоциты с ТКР, специфичность которых к заданному антигену определяет только α-цепь [Казанский Д.Б. Трансгенные технологии создания иммунологической защиты организма. В сборнике докладов семинара Фонда перспективных исследований "Проблемные вопросы иммунологии", 03 октября 2014 г., Москва, ООО "Б-принт", 2015, С. 17-25]. Такие ТКР распознают антиген вне зависимости от того, в комбинации с какой β-цепью он присутствует на мембране Т-лимфоцита. Это дает возможность избежать процедуры клеточного клонирования и отказаться от трансгенного переноса α-цепей при получении ТКР с нужной специфичностью. В данном способе технология идентификации нужного рецептора сводится к получению библиотек кДНК из поликлональных клеток памяти и определению и секвенированию генов биологически активных α-цепей методом секвенирования нового поколения (NGS-секвенирования). Данный подход позволяет значительно сократить процедуру поиска и идентификации нужных рецепторов и облегчает техническое выполнение переноса в клеточный геном генетических конструкций благодаря уменьшению их размеров. Этот способ предполагает использование индивидуальных трансгенных α-цепей, которые при взаимодействии с эндогенными β-цепями, присутствующими в клетке, формируют ТКР для защиты от онкологических заболеваний.
В качестве одного из подходов для лечения некоторых раковых заболеваний (меланомы, лейкозов) используют лимфоциты с генетически модифицированным химерным рецептором (CAR) (С.Slaney, B.Scheidt, А. Davenport, P.Beavis, J.Westwood, S.Mardiana, D.Tscharke, S.Ellis, H. M. Prince, J.Trapani, R. Johnstone, M. Smyth, M.Teng, A. Ali, Z.Yu, S. Rosenberg, N. Restifo, P. Neeson, P. Darcy, M.Kershaw. Dual-specific Chimeric Antigen Receptor T Cells and an Indirect Vaccine Eradicate a Variety of Large Solid Tumors in an Immunocompetent, Self-antigen Setting. Clin Cancer Res; 23(10) May 15, 2017; Kershaw MH, Westwood JA, Darcy PK. Gene-engineered T cells for cancertherapy. Nat Rev Cancer 2013; 13:525-41.).
Недостаток данного подхода: CAR - это полностью искусственный рецептор, сочетающий элементы Т- и В-клеточных рецепторов. Для изготовления химерного рецептора приходится использовать фрагменты нескольких различных молекул и результирующий белок часто становится иммуногенным [Maus MV, Haas AR, Beatty GL, Albelda SM, Levine BL, Liu X, Zhao Y, Kalos M, June CH. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol Res. 2013 Jul; 1(1):26-31. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0006].
Известен подход, направленный на усиление иммунного ответа при помощи получения высокоаффинных ТКР путем отбора и мутагенеза цепей ТКР [Schendel D, Wilde S, Frankenberger В, Uckert W. High affinity T cell receptor and use thereof. Patent US 8697854 B2. Priority date 2008-11-24; Jakobsen BK, Harwood N, Liddy NR T cell receptors. Patent WO 2011001152 A1; Priority date 2009-07-03].
Отличие данного подхода от заявляемого состоит в использовании полной конфигурации ТКР, состоящей из α- и β-цепей.
Еще один способ терапии опухолей трансгенными ТКР - ретровирусная трансдукция Т-лимфоцитов в культуре in vitro с их последующей активацией и получением лимфокинактивированных киллеров [Schendel DJ. Expression of transgenic t cell receptors in lak-t cells. Patent US 20110020308 Al. Priority date: 2006-12-12].
Отличие данного подхода от предлагаемого в использовании полной конфигурации ТКР, состоящей из α- и β-цепей.
Известен метод усиления иммунного ответа на раковые опухоли и патогены, где описаны модифицированные Т-лимфоциты, одновременно экспрессирующие ТКР или химерный антигенный рецептор и антитело (Патент WO 2017147383A1 (2017-08-31)).
Недостатком данного метода в необходимости экспрессии трансгенной β-цепи ТКР и процедуры Т-клеточного клонирования для идентификации α- и β-цепей таких ТКР.
Предлагается метод усиления иммунного ответа путем модификации различных ТКР, приводящей к увеличению уровня их экспрессии на поверхности Т-лимфоцита (Патент WO 2016170320 A1 (2016-10-27)).
Недостатком данного метода является необходимость присутствия в генетической конструкции ТКР β-цепи и необходимость процедуры Т-клеточного клонирования для идентификации α- и β-цепей таких ТКР.
Задачей заявляемого изобретения является: разработка нового способа создания противоопухолевой иммунологической защиты с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов в системе in vitro и in vivo.
Задача решается получением Т-лимфоцитов с экспрессией α-цепи ТКР. Трансдукцию Т-лимфоцитов мыши проводили ретровирусными частицами, содержащими ген α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1, GenBank: DQ983579.1) с последующим адоптивным переносом модифицированных клеток мышам -реципиентам с целью оценки функциональной активности трансдуцированных клеток in vitro и in vivo.
Технический результат изобретения: разработан способ создания противоопухолевой иммунологической защиты с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов.
Изобретение иллюстрируется фиг. 1, табл. 1-3 и перечнем использованных последовательностей.
На фиг. 1 представлена оценка уровня трансдукции клеток вирусом Migr1-PGK-1-GFP методом проточной цитофлуориметрии. А- нетрансдуцированные клетки (контроль); Б- Т-клетки, трансдуцированные вирусом.
На табл. 1 представлена оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vitro. Соотношение киллер-мишень 10:1.
На табл. 2 представлена оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vivo. Абсолютное количество клеток лимфомы EL-4 на 6 день после адоптивного переноса Т-лимфоцитов. Соотношение киллер-мишень 10:1.
На табл. 3 представлена оценка защитной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vivo. Анализ клеток EL-4 в перитонеальной полости мышей B10.D2(R101) с адоптивно перенесенными трансдуцированными Т-лимфоцитами за 7, 14 и 28 дней до введения клеток опухоли. Соотношение киллер-мишень 10:1.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Создание генетических конструкций.
В работе для сборки частиц ретровируса использовали два ДНК-вектора с генетическими конструкциями. Для получения первого ДНК-вектора коммерческую генетическую конструкцию MigR1 (Addgene, США), содержащую ген зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP), модифицировали путем удаления из нее последовательности гена GFP и введения промотора PGK и гена α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1). Созданный вектор получил название MigR1-PGK-1D1a. Так как к цепи 1D1a не существует коммерческих антител, то для оценки уровня трансдукции была создана вторая генетическая конструкция, которая была получена также на основе MigR1 (Addgene, США) путем вставки промотора PGK в область сайта для множественного клонирования этой плазмиды. Полученный таким образом вектор MigR1-PGK-GFP, содержащий ген GFP, использовали в дальнейшей работе для контроля эффективности процедуры введения генетических конструкций в целевые клетки.
В качестве второго ДНК-вектора использовали коммерческую генетическую конструкцию pCL-Eco (Addgene, США). Данная плазмида содержит все гены белков, необходимых для сборки вирусной частицы с экотропной оболочкой (белок оболочки (env), полимераза (pol), ревертаза (rev), интеграза).
2. Получение частиц ретровирусов.
2.1. Трансфекция клеток линии HEK293T и получение среды, содержащей вирусные частицы.
2.1.1 Подготовка клеток HEK293T, пакующей вирусные частицы.
Клетки пакующей линии HEK293T выращивали в культуральном флаконе площадью 75 см2(Costar, США) в 12 мл стандартной ростовой среды DMEM (Панэко, Россия), содержащей с 4,5 г/л глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Панэко, Россия) до достижения конфлюэнтности 60-80%.
2.1.2. Трансфекция HEK293T, получение вирус-содержащей среды.
В 1,5 мл стерильной воды смешивали плазмиды MigR1-PGK-1D1a, содержащую ген α-цепи ТКР 1D1(SEQ ID NO 1), и pCl-Есо в соотношении 1:1 по 20 мкг каждой плазмиды. К смеси добавляли 75 мкл 2М CaCl2 и перемешивали путем пипетирования. Затем по каплям при помешивании вносили 750 мкл двукратного HBS буфера (50 мМ HEPES, рН 7.05; 10 мМ KCl, 12 мМ декстроза, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HPO4). Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре и по каплям вносили в среду роста, содержащуюся в культуральных флаконах с клетками пакующей линии. Трансфекцию клеток HEK293T проводили в течение 24 часов, после чего удаляли модифицированную ростовую среду и заменяли на стандартную среду роста DMEM.
Контроль эффективности трансфекции осуществляли при помощи белка GFP. Для этого параллельно при тех же условиях проводили трансфекцию клеток HEK293T плазмидами MigR1-PGK-GFP, содержащей ген GFP, и pCL-Eco. Наличие экспрессии белка GFP в клетках HEK293T оценивали при помощи флюоресцентного микроскопа (Nikon, Япония). Уровень трансфекции экстраполировали на клетки HEK293T с 1D1 геном (SEQ ID NO 1). Трансфекцию считают успешной, если не менее, чем у 60% клеток пакующей линии наблюдают флюоресценцию GFP. Сбор ростовой среды клеток HEK293T проводили через 48 и 72 часа после заражения клеток HEK293T плазмидами MigR1-PGK-1D1a и pCl-Есо. Полученную таким образом вирус-содержащую среду в свежем виде использовали для трансдукции Т-клеток мыши. Возможно замораживание вирус-содержащей среды при температуре -70°С. Допускается однократное размораживание.
3. Получение лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мыши.
Мышей линии B10.D2(R101) умерщвляли путем цервикальной дислокации и извлекали селезенку и лимфоузлы (мезентериальный, 2 подмышечных и 2 паховых). Селезенку помещали в гомогенизатор Поттера с 3 мл питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия), содержащей 10 мкг/мл ципрофлоксацина (KRK, Словения). После гомогенизации селезенки суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали и проводили гипотонический лизис эритроцитов. Для этого к осадку спленоцитов добавляли 360 мкл стерильной дистиллированной воды, пробирку встряхивали в течение 10-20 сек и добавляли 40 мкл 10-кратного фосфатно-солевого буфера и 6-7 мл 1-кратного фосфатно-солевого буфера. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в 3 мл питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия), содержащей 10 мкг/мл ципрофлоксацина (KRK, Словения).
Лимфатические узлы гомогенизировали описанным выше образом, осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали в 2 мл питательной среды RPMI-1640 (Панэко, Россия) и вносили в суспензию спленоцитов. Полученную смесь клеток осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин при 4°С, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали в 3 мл полной среды (ПС) для культивирования лимфоцитов, состоящей из питательной среды RPMI 1640 (Панэко, Россия) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (Панэко, Россия), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Merck, США), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 20 мМ HEPES (Панэко, Россия) и 10 мкг/мл ципрофлоксацина (KRK, Словения). Количество спленоцитов в суспензии подсчитывали в камере Горяева в присутствии смеси красителей 1% трипанового синего и 1% эозина в соотношении 1:1 и доводили до концентрации 107кл/мл.
3.1. Активация лимфоцитов мыши.
Смесь клеток селезенки и лимфатических узлов мыши в количестве 5×107 клеток помещали в 5 мл ПС в культуральные флаконы с площадью роста 25 см2 (Costar, США). В среду дополнительно вносили митоген Т-лимфоцитов конканавалин А (КонА, Sigma, США) до конечной концентрации 3 мкг/мл и интерлейкин-2 (ИЛ-2) до конечной концентрации 10 МЕ/мл (Neto Е.Н., Coelho A.L., Sampaio A.L. и др. Activation of human T lymphocytes via integrin signaling induced by RGD-disintegrins. Biochim.Biophys. Acta.2007, 1773(2): 176-84). Лимфоциты культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 24 часов. Данный подход обеспечивал активацию и пролиферацию только Т-лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов мыши (Neveu P.J., Perdoux D. Polyclonal activation of guinea pig spleen lymphocytes- Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. 1985; 78(4):401-405).
4. Трансдукция Т-лимфоцитов мыши вирусными частицами.
Трансдукцию активированных Т-лимфоцитов мыши вирусными частицами, содержащими ген α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1), проводили в два этапа.
1) Через 24 часа после активации подсчитывали количество спленоцитов с помощью камеры Горяева и переносили в 6-луночный планшет (Costar, США) из расчета 12×106 клеток на лунку. Затем среду отбирали и добавляли вирус-содержащую среду роста клеток HEK293T из расчета 6 мл среды на одну лунку и 3 мл ПС. Конечный объем среды в каждой лунке составлял 9 мл. В лунки планшета также вносили КонА (3 мкг/мл), ИЛ-2 (10МЕ/мл) и полибрен до конечной концентрации 8 мкг/мл. Клетки центрифугировали (спинокулировали) при 2000 g в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем лимфоциты помещали в СО2-инкубатор.
2) По истечении 16-20 часов культивирования проводили еще одну смену среды роста спленоцитов на вирус содержащую среду и повторно выполняли трансдукцию спленоцитов при тех же параметрах спинокуляции. По окончании второй спинокуляции спленоциты культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 2 часов, после чего проводили замену вирус-содержащей среды на свежую ПС, содержащую ИЛ-2 и КонА в указанных выше концентрациях, и продолжали культивирование в течение 48 часов при тех же условиях.
5. Оценку уровня трансдукции Т- лимфоцитов проводили путем анализа методом проточной цитометрии (FacsCantoII, Beckton Dickenson, США) с использованием флуоресцентно меченных антител к молекуле CD3, которая является специфическим маркером Т- лимфоцитов. Уровень трансдукции определяли по экспрессии белка GFP.
Анализ клеток на проточном цитофлуориметре. При анализе на проточном цитофлуориметре исключали слипшиеся клетки, а также мертвые клетки, окрашенные пропидий йодидом. Среди одиночных живых лимфоцитов определяли Т-лимфоциты по наличию маркера CD3, для которых оценивают уровень экспрессии белка GFP по флуоресценции в области спектра 520 нм.
5.1. Обработка результатов цитофлюориметрического анализа.
Результаты анализа клеток на проточном цитофлуориметре обрабатывали при помощи программного обеспечения FlowJo (Beckton Dickenson, США). Функциональную эффективность трансдуцированных Т-лимфоцитов определяли при уровне трансдукции не менее 50% (Фиг.).
6. Оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vitro.
Т-лимфоциты, трансдуцированные геном α-цепи 1D1 (SEQ ID NO 1), в количестве 500×103 клеток помещали в культуру с клетками лимфомы EL-4 в соотношении трансдуцированные Т-лимфоциты: EL-4 = 10:1. Культивирование проводили в 96 луночных пластиковых планшетах (Costar, США) в ПС во влажной атмосфере в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 в течение 48 часов. В качестве контроля использовали активированные нетрансдуцированные клетки, а также Т-клетки, трансдуцированные GFP, в аналогичном соотношении.
По истечении времени инкубации методом проточной цитофлуориметрии проводили анализ относительного количества опухолевых клеток, которые определяли при помощи флюоресцентно меченых антител к маркеру Кb (Табл. 1).
Было показано, что Т-лимфоциты, трансдуцированные геном α-цепи 1D1a (SEQ ID NO 1), значительно быстрее устраняют опухолевые клетки лимфомы EL-4 in vitro по сравнению с нетрансдуцированными клетками (контроль). При этом данный эффект являлся специфичным, т.к. в культуре с Т- лимфоцитами, трансдуцированными GFP, обнаруженное количество EL-4 было сопоставимо с контролем (14.1% и 17.2%, соответственно, Табл. 1).
7. Оценка функциональной активности трансдуцированных Т-лимфоцитов в системе in vivo.
7.1. Адоптивный перенос трансдуцированных Т-лимфоцитов. После оценки уровня трансдукции Т-лимфоциты, трансдуцированные ретровирусными частицами, содержащими ген α-цепи ТКР 1D1 (SEQ ID NO 1), вводили внутрибрюшинно мышам линии B10.D2(R101) из расчета 5,0×106 трансдуцированных клеток в 1 мл фосфатно-солевого буфера. В качестве контроля использовали нетрансдуцированные Т-лимфоциты, которые активировали и культивировали аналогично клеткам, подвергшимся трансдукции. Контрольные Т-лимфоциты вводили в количестве, равном количеству адоптивно перенесенных трансдуцированных Т- лимфоцитов.
7.2. Приготовление лаважа брюшной полости.
Через 6 дней после введения клеток опухоли и адоптивного переноса Т-лимфоцитов, мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации и извлекали клетки из брюшной полости. Для этого в перитонеальную полость мышей вводили 2 мл охлажденной среды RPMI-1640 и отбирали жидкость. Полученную клеточную суспензию отмывали центрифугированием (200×g, 5 мин) и подсчитывали количество клеток при помощи камеры Горяева в присутствии смеси красителей трипанового синего и эозина. Часть клеток (1×106) использовали для анализа на проточном цитофлуориметре, окрашивая флюоресцентно меченными антителами к молекуле Кb, для определения опухолевых клеток EL-4. Статистическую обработку данных проводили по статистическому критерию для малых выборок Манна-Уитни.
При адоптивном переносе трансдуцированных лимфоцитов в соотношении киллер: мишень 10:1 было обнаружено в 25 раз меньшее количество опухолевых клеток в лаваже мышей - реципиентов на 6 день после иммунизации EL-4 по сравнению с животными, которым вводили нетрансдуцированные лимфоциты (Табл. 2).
8. Определение продолжительности сохранения состояния иммунологической памяти у животных с перенесенными трансгенными Т-лимфоцитами.
Для оценки защитного потенциала трансдуцированных Т-лимфоцитов проводили адоптивный перенос трансдуцированных или нетрансдуцированных (контрольных) Т-лимфоцитов в количестве 5,0×106 клеток/мышь. Через 7, 14 или 28 дней мышей иммунизировали клетками лимфомы EL-4 в дозе 5,0×105 клеток/мышь. Таким образом, соотношение введенных Т-клеток и клеток EL-4 составило 10:1. Группы были составлены из 5 животных.
Защитный эффект трансдуцированных Т-лимфоцитов проявлялся следующим образом: введение лимфоцитов за 7 и 14 дней до иммунизации EL-4 способствовало полному либо ускоренному отторжению клеток опухоли к 6 дню и не проявлялся в случае адоптивного переноса за 28 дней до иммунизации (Табл. 3). Аналогичный защитный эффект наблюдали при соотношении киллер: мишень = 20:1.
Таким образом, при внутрибрюшинном адоптивном переносе трансдуцированных Т-лимфоцитов в соотношении 10:1 или 20:1 к клеткам лимфомы EL-4 формируется иммунологическая защита мышей дикого типа B10.D2 (R101) сроком на 14 дней.
Claims (1)
- Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты организма к клеткам лимфомы EL-4 при помощи трансдукции Т-лимфоцитов ретровирусными частицами, содержащими ген ТКР, представленный последовательностью SEQ ID NO:1, характеризующийся тем, что трансгенез Т-лимфоцитов мыши in vitro проводится путем введения гена только α-цепи ТКР, специфичного к клеткам опухоли, а затем производится адоптивный перенос животным Т-лимфоцитов, модифицированных ретровирусными частицами, содержащими ген ТКР, представленный последовательностью SEQ ID NO:1, с последующей функциональной оценкой активности Т-лимфоцитов in vivo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018144103A RU2708558C1 (ru) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018144103A RU2708558C1 (ru) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2708558C1 true RU2708558C1 (ru) | 2019-12-09 |
Family
ID=68836445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018144103A RU2708558C1 (ru) | 2018-12-13 | 2018-12-13 | Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2708558C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011020783A2 (en) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Roche Glycart Ag | Targeted immunoconjugates |
| RU2478396C2 (ru) * | 2008-11-05 | 2013-04-10 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО β-ГЕМОЛИТИЧЕСКИМИ СТРЕПТОКОККАМИ (БГС) |
| RU2630656C2 (ru) * | 2011-09-12 | 2017-09-11 | Джензим Корпорейшн | АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβTCR |
-
2018
- 2018-12-13 RU RU2018144103A patent/RU2708558C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2478396C2 (ru) * | 2008-11-05 | 2013-04-10 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО β-ГЕМОЛИТИЧЕСКИМИ СТРЕПТОКОККАМИ (БГС) |
| WO2011020783A2 (en) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Roche Glycart Ag | Targeted immunoconjugates |
| RU2630656C2 (ru) * | 2011-09-12 | 2017-09-11 | Джензим Корпорейшн | АНТИТЕЛА ПРОТИВ αβTCR |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗВЕЗДОВА Е.С. и др., КОРЕЦЕПТОРНАЯ ФУНКЦИЯ CD4 В ОТВЕТЕ НА МОЛЕКУЛУ MHC КЛАССА I, Молекулярная биология, том 42, N.4, с.662-672. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240301024A1 (en) | Use of icos-based cars to enhance antitumor activity and car persistence | |
| RU2770812C2 (ru) | Иммунокомпетентная клетка и экспрессирующий вектор, экспрессирующие регуляторные факторы иммунной функции | |
| RU2670147C1 (ru) | Вектор экспрессии car и car-экспрессирующие т-клетки | |
| CN106535925A (zh) | 基于car的免疫治疗 | |
| US9080152B2 (en) | Methods for proliferation of antigen-specific T cells | |
| US20100316603A1 (en) | Combination Immunogene Therapy | |
| WO2017184553A1 (en) | Cancer gene therapy targeting cd47 | |
| CN110857319B (zh) | 一种分离的t细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸及其应用 | |
| WO2019096115A1 (zh) | 分离的t细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸、表达载体、制备方法、药物组合物和应用 | |
| CN113896801A (zh) | 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
| RU2708558C1 (ru) | Способ создания противоопухолевой иммунологической защиты к клеткам лимфомы EL-4 | |
| KR20240026905A (ko) | 림프구의 단일 용기 확장 | |
| AU2018283319B2 (en) | Materials and methods for increasing immune responses | |
| US20250319144A1 (en) | Recombinant Armed Oncolytic Virus Composition and Use Thereof in TIL Adoptive Therapy | |
| US20200102537A1 (en) | Lrfft2 cell | |
| RU2706554C1 (ru) | Способ создания противоинфекционной иммунологической защиты к Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes с помощью трансгенеза Т-лимфоцитов | |
| US20210071142A1 (en) | Species of mrfft1 cell | |
| CN114729328A (zh) | Tmem59蛋白二聚体或嵌合表达受体改善t细胞功能 | |
| Immisch | Exploring potential human cancer neoantigens as targets for adoptive T cell therapy | |
| Garcés Lázaro | Restoring NK cells function against cancer. | |
| Brockstedt | Novel Antigen Delivery Approaches for Priming T Cell-mediated Immune Responses: Potential Application for Tumor Immunotherapy | |
| Snook | The Role of the T Cell Receptor in Determining CD4+ Differentiation and CD8+ Anti-Tumor Activity | |
| Sukumar | Mechanisms of Rejection of High Grade B Cell Lymphoma in Mice | |
| Spaggiari et al. | Tumor immunology: Basic aspects | |
| Thompson | The MHC class II associated invariant chain limits the immunogenicity of genetically modified human tumor cell vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210125 Effective date: 20210125 |