RU2707071C2 - Способы детектирования антител против членов семейства сердечных рецепторов - Google Patents
Способы детектирования антител против членов семейства сердечных рецепторов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2707071C2 RU2707071C2 RU2017116436A RU2017116436A RU2707071C2 RU 2707071 C2 RU2707071 C2 RU 2707071C2 RU 2017116436 A RU2017116436 A RU 2017116436A RU 2017116436 A RU2017116436 A RU 2017116436A RU 2707071 C2 RU2707071 C2 RU 2707071C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigenic
- antigenic molecules
- labeling
- molecules
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 101
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 108
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 69
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 25
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 45
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 45
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 39
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 39
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 101710113174 Corticoliberin Proteins 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 17
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 14
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- 230000003551 muscarinic effect Effects 0.000 description 12
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- -1 their subunits Proteins 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 8
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 6
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 6
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 6
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000002164 acetylcholinergic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 5
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 4
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 4
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 4
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 4
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000895481 Homo sapiens Corticoliberin Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- GBONBLHJMVUBSJ-FAUHKOHMSA-N corticorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 GBONBLHJMVUBSJ-FAUHKOHMSA-N 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102100022725 Acetylcholine receptor subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100519702 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) PGA14 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000678746 Homo sapiens Acetylcholine receptor subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000007205 Muscarinic M2 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010008407 Muscarinic M2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108020000715 acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000002107 nanodisc Substances 0.000 description 2
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CFWHDFIMMOKKPM-UHFFFAOYSA-N 3,10-dimethoxypentacyclo[10.2.1.15,8.02,11.04,9]hexadeca-2,4(9),10-triene Chemical compound C12=C(OC)C=3C(C4)CCC4C=3C(OC)=C2C2CC1CC2 CFWHDFIMMOKKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 101150113697 ADA2B gene Proteins 0.000 description 1
- 102000017920 ADRB1 Human genes 0.000 description 1
- 102000017919 ADRB2 Human genes 0.000 description 1
- 102000017918 ADRB3 Human genes 0.000 description 1
- 108060003355 ADRB3 Proteins 0.000 description 1
- 102100030913 Acetylcholine receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040966 Acetylcholine receptor subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000017926 CHRM2 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000003037 Diastolic Heart Failure Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006068 Gq proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000052606 Gq-G11 GTP-Binding Protein alpha Subunits Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000726895 Homo sapiens Acetylcholine receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000965219 Homo sapiens Acetylcholine receptor subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000892264 Homo sapiens Beta-1 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000959437 Homo sapiens Beta-2 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000679245 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000782865 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000745163 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000745167 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000745175 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000822072 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000822103 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000822093 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000726901 Homo sapiens Neuronal acetylcholine receptor subunit beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100205871 Homo sapiens TADA2B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000657352 Homo sapiens Transcriptional adapter 2-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 102100022598 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100035585 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039908 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039909 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039907 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100021518 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100021511 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100021520 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100030912 Neuronal acetylcholine receptor subunit beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710150593 Protein beta Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091027076 Spiegelmer Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 208000008253 Systolic Heart Failure Diseases 0.000 description 1
- 102100034777 Transcriptional adapter 2-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100024858 Transcriptional adapter 2-beta Human genes 0.000 description 1
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- MJBWDEQAUQTVKK-IAGOWNOFSA-N aflatoxin M1 Chemical compound C=1([C@]2(O)C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O MJBWDEQAUQTVKK-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 102000030619 alpha-1 Adrenergic Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020004102 alpha-1 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000030484 alpha-2 Adrenergic Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020004101 alpha-2 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150008083 ant gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 229940097320 beta blocking agent Drugs 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003392 chemiluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011984 electrochemiluminescence immunoassay Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010247 heart contraction Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012194 insect media Substances 0.000 description 1
- 230000001057 ionotropic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006239 metabotropic receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004083 metabotropic receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9406—Neurotransmitters
- G01N33/9433—(Nor)adrenaline
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9406—Neurotransmitters
- G01N33/944—Acetylcholine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается способа детектирования в исследуемом образце присутствия и/или свойств связывания анализируемых антител, способных реагировать с одной или более антигенными молекулами, включающего (a) обеспечение первой антигенной молекулы, выбранной из CRF; (b) обеспечение второй антигенной молекулы, выбранной из CRF; (c) приведение первых антигенных молекул и вторых антигенных молекул в контакт с образцом с образованием комплексов, содержащих [первую антигенную молекулу]-[анализируемое антитело]-[вторую антигенную молекулу]; (d1) обеспечение средства иммобилизации и/или (d2) обеспечение второго средства мечения; и (e) обеспечение первого средства мечения; и (g) детектирование присутствия комплексов, образованных во время или после этапа (c). Группа изобретений также касается набора, применимого для осуществления указанного способа; применения указанного способа для диагностики присутствия или начала заболевания, связанного с семейством сердечных рецепторов. Группа изобретений обеспечивает быстрый, надежный, специфичный и чувствительный способ, который позволяет исследовать низкие количества аналита. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способам детектирования антител против членов семейства сердечных рецепторов, наборам для осуществления способов согласно изобретению, применению указанных способов согласно изобретению для диагностики, терапевтического лечения и/или профилактики одного или более заболеваний, связанных с одним или более членами семейства сердечных рецепторов, в частности, заболевания, выбранного из группы, состоящей из высокого кровяного давления, дилатационной кардиомиопатии, глаукомы, хронической усталости и деменции, а также применению указанных способов согласно изобретению для а) идентификации модуляторов свойств связывания антител против членов семейства сердечных рецепторов или b) идентификации терапевтических агентов для лечения одного или более из перечисленных выше заболеваний.
Сердечная недостаточность (СН) представляет собой патологическое поражение сердца, приводящее к недостаточному кровоснабжению тканей тела. Причинные факторы СН включают пониженную насосную функцию сердца (систолическую сердечную недостаточность) или неполноценное наполнение сердца (диастолическую сердечную недостаточность). СН является основной причиной смертности в западном мире и создает огромную финансовую и социальную проблему. Примерно 2% всех взрослых людей страдает СН, при этом повышение частоты встречаемости и распространенности заболевания коррелирует с возрастом (6-10% людей возрастом 65 лет и старше страдают СН).
Функция сердца контролируется вегетативной нервной системой. Передача сигнала запускается сердечными рецепторами, главным образом, адренергическими рецепторами (АР) и мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами (mAChR). Адренергические рецепторы (AR) принадлежат к суперсемейству сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR), которые являются мишенью катехоламинов, в частности, адреналина и норадреналина. У человека было описано девять AR, которые делят на три семейства: α1-адренергические рецепторы (α1-AR), α2-адренергические рецепторы (α2-AR) и β-адренергические рецепторы (β-AR). Было описано три подтипа β-AR: β1-AR, β2-AR и β3-AR, все из которых экспрессируются в сердце человека. AR регулируют многие физиологические процессы, включая пейсмейкерную активность сердца, сокращение миокарда и тонус мускулатуры сосудистых стенок. Особую клиническую значимость имеют β1-AR и β2-AR, при этом β1-AR представляет собой основной подтип в сердце. В связи с этим β1-AR является основной мишенью для класса терапевтически активных соединений, которые называются «β-блокаторами» и широко применяются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Помимо AR важную роль играют также ацетилхолиновые рецепторы (AChR). Существует два типа AChR: никотиновые AChR (nAChR) и мускариновые AChR (mAChR). nAChR являются ионотропными и, соответственно, функционируют как самостоятельные ионные каналы. mAChR являются метаботропными рецепторами (сопряженными с белками) и принадлежат суперсемейству сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR). mAChR инициируют, например, сердечные сокращения и сердечное давление. mAChR дополнительно делат на пять подтипов на основе их фармакологических свойств: M1 - М5. mAChR с нечетными номерами M1, М3 и М5 связаны с гетеротримерным G-белком Gq. mAChR с четными номерами М2 и М4 связаны с гетеротримерным G-белком Gi. Активация М2, например, приводит к снижению частоты сердечных сокращений.
Аутоантитела («аАb») играют важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Результаты недавних исследований указывают на патогенное и диагностическое значение антител («Аb») против сердечных рецепторов. Например, высокая концентрация аАb против α1-AR связана с повышенным кровяным давлением. Клинические исследования показывают значительную корреляцию повышенного титра аутоантител («аАb») против β1-AR у пациентов с СН по сравнению с контрольными здоровыми субъектами. Присутствие аАb против mAChR М2 связано с повышенным риском развития кардиомиопатии. Кроме того, была выявлена высокая частота встречаемости аАb против mAChR у пациентов с фибрилляцией (Semin. Immunopathol. 2014 May, 36(3), 351-63). В связи с ограниченной доступностью высокоэффективных способов скрининга эпидемиологическое исследование патогенного значения Аb против членов семейства сердечных рецепторов до сих пор не проводилось, и имеется мало доступных данных для дифференциальной диагностики и лечения сердечной дисфункции. Таким образом, разработка быстрого, специфичного, чувствительного и надежного способа детектирования аутоантител против конкретных сердечных рецепторов (субъединиц) может играть важную роль, в особенности если такой способ позволяет определять перекрестную реактивность. Такие способы дали бы возможность ранней или дифференциальной диагностики и могли бы иметь особое значение для предотвращения, лечения или контроля аутоиммунных расстройств, связанных с одним или более членами семейства сердечных рецепторов. Более того, желательно обеспечить дешевый и эффективный способ, который дополнительно позволил бы идентифицировать взаимодействия с модуляторами (т.е. активаторами, ингибиторами или молекулами, которые другим образом влияют на взаимодействие между антигеном и антителом и, соответственно, связывание одного или более члена семейства сердечных рецепторов с аАb или терапевтическим агентом).
Доступные на сегодняшний день способы исследования не могут обеспечить желаемую специфичность, масштабируемость, контролируемость, чувствительность и/или требуют большого количества биологического образца. Таким образом, существует необходимость в улучшении аналитических способов и технологий. Настоящее изобретение, определенное в формуле изобретения, позволяет преодолеть указанные выше проблемы предшествующего уровня техники с помощью предложенных способов, обеспечивающих повышенную скорость, специфичность и/или чувствительность, которые подходят также для автоматизации или высокоэффективного скрининга. Способы согласно настоящему изобретению приближены к физиологическим условиям, поскольку они позволяют антигену образовывать правильную трехмерную структуру. Это одно из основных отличий настоящего изобретения от способов, использующих белки или пептидные фрагменты, экспрессируемые в бактериях. Способы согласно изобретению подходят для автоматизации и осуществления в исследовательских и/или клинических лабораториях. Более того, способы согласно изобретению обеспечивают возможность идентификации специфичной перекрестной реактивности между патологическими или терапевтическими антителами и членами семейства сердечных рецепторов. Примечательно, что способы согласно настоящему изобретению благодаря их повышенной чувствительности и/или специфичности дают возможность дифференциального исследования взаимодействий, а также разработки улучшенных подходов и агентов для профилактики, диагностики и терапевтического лечения заболеваний или расстройств, связанных с членами семейства сердечных рецепторов.
Таким образом, согласно первому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ детектирования в исследуемом образце присутствия и/или свойств связывания анализируемых антител, способных реагировать с одной или более антигенными молекулами, где указанный способ включает следующие этапы:
(a) обеспечение одной или более первых антигенных молекул, с которыми могут взаимодействовать анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, причем указанная первая антигенная молекула выбрана из семейства сердечных рецепторов (CRF); и
(b) обеспечение одной или более вторых антигенных молекул, с которыми могут взаимодействовать анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, причем указанная вторая антигенная молекула выбрана из CRF; и
(с) одновременное или последовательное приведение указанных первых антигенных молекул, обеспеченных на этапе (а), и указанных вторых антигенных молекул, обеспеченных на этапе (b), в контакт с исследуемым образцом позволяющее анализируемым антителам, если они присутствуют в указанном образце, взаимодействовать с указанными антигенными молекулами с образованием комплексов, содержащих [первую антигенную молекулу]-[анализируемое антитело]-[вторую антигенную молекулу]; и
(d1) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (с) средства иммобилизации, позволяющее иммобилизировать указанную первую антигенную молекулу, присутствующую в указанных комплексах, образованных на этапе (с), соответственно, способную образовывать указанные комплексы на этапе (с), на твердой подложке до, или одновременно с, или после этапа (с); и/или
(d2) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (с) второго средства мечения, в результате чего происходит мечение указанной первой антигенной молекулы, присутствующей в указанных комплексах, образованных на этапе (с), соответственно, способной образовывать указанные комплексы на этапе (с), указанным вторым средством мечения до, или одновременно с, или после этапа (с); и (е) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (с) первого средства мечения, в результате чего происходит мечение указанной второй антигенной молекулы, присутствующей в указанных комплексах, образованных на этапе (с), соответственно, способной образовывать указанные комплексы на этапе (с) указанным первым средством мечения до, или одновременно с, или после этапа (с); и
(g) детектирование присутствия указанных комплексов, образованных во время или после этапа (с), с получением показателя присутствия анализируемых антител в указанном образце,
где указанные первое и второе средства мечения различаются, и где в указанном способе предпочтительно не используются средства радиоактивного мечения.
Другой вариант реализации способа согласно изобретению включает следующие этапы:
(a) обеспечение одной или более первых антигенных молекул, с которыми могут взаимодействовать анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, и где первая антигенная молекула выбрана из семейства сердечных рецепторов (CRF); и
(b) обеспечение одной или более вторых антигенных молекул, с которыми могут взаимодействовать анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, причем указанная вторая антигенная молекула выбрана из CRF; и
(с) одновременное или последовательное приведение указанных первых антигенных молекул, обеспеченных на этапе (а), и указанных вторых антигенных молекул, обеспеченных на этапе (b), в контакт с исследуемым образцом позволяющее анализируемым антителам, если они присутствуют в указанном образце взаимодействовать с указанными антигенными молекулами с образованием комплексов, содержащих [первую антигенную молекулу]-[анализируемое антитело]-[вторую антигенную молекулу]; и (d1) обеспечение до этапа (с) средства иммобилизации, позволяющее иммобилизировать указанную первую антигенную молекулу, присутствующую в указанных комплексах, образованных на этапе (с), соответственно, способную образовывать указанные комплексы на этапе (с), на твердой подложке до этапа (с); и/или
(d2) обеспечение второго средства мечения до этапа (с), позволяющее метить указанную первую антигенную молекулу, присутствующую в указанных комплексах, образованных на этапе (с), соответственно, способную образовывать указанные комплексы на этапе (с), указанным вторым средством мечения до этапа (с); и
(е) обеспечение первого средства мечения до этапа (с), позволяющее метить указанную вторую антигенную молекулу, присутствующую в указанных комплексах, образованных на этапе (с), соответственно, способную образовывать указанные комплексы на этапе (с), указанным первым средством мечения до этапа (с); и
(g) детектирование присутствия указанных комплексов, образованных во время или после этапа (с), с получением показателя присутствия анализируемых антител в указанном образце,
где указанные первое и второе средства мечения различаются и где указанный способ предпочтительно не включает применение средств радиоактивного мечения. Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению также исключено: а) применение средств радиоактивного мечения и любых этапов, включающих преципитацию, или b) применение средств радиоактивного мечения и любых этапов, включающих центрифугирование.
Согласно настоящему изобретению, первое и второе средства мечения выбраны таким образом, что они являются различным и обеспечивают различимые и, соответственно, раздельные сигналы, предпочтительно, сигналы, раздельно поддающиеся детектированию с помощью единственного измерения в ходе применимого способа детектирования. Согласно альтернативным вариантам реализации изобретения, антигенные фрагменты первых и вторых антигенных молекул являются идентичными или различными. Согласно другому варианту реализации изобретения первые и/или вторые антигенные молекулы заключают в мембраноподобное или мембранное окружение. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения анализируемые Аb из исследуемого образца представляют собой аАb конкретного субъекта или терапевтические Аb или диагностические Аb, при этом последние предпочтительно являются моноклональными. Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению один или более компонентов, выбранных из первого средства мечения, второго средства мечения, средства иммобилизации и модуляторов, обеспечивают до приведения указанных антигенов в контакт с указанными анализируемыми Аb, т.е. один или оба антигена являются меченными и, соответственно, иммобилизируются для получения первых и вторых антигенных молекул до образования указанных комплексов вместе с антителами.
Другой объект изобретения представляет собой применение in vitro способов согласно изобретению для диагностирования у субъекта заболевания или предрасположенности к заболеванию, связанному с функцией рецептора (или его части), являющегося членом семейства сердечных рецепторов («CRF»). Другой предмет изобретения представляет собой применение способов и/или наборов согласно изобретению для идентификации фармацевтически эффективного соединения для лечения и/или профилактики одного или более заболеваний, связанных с функцией рецептора (или его части), являющегося членом CRF, в частности, заболеваний, выбранных из высокого кровяного давления, дилатационной кардиомиопатии, глаукомы, хронической усталости и деменции, в частности, предпочтительное применение автоматизированного способа, в частности, высокоэффективного скринингового анализа («HTS»).
В предпочтительном варианте способы согласно настоящему изобретению представляют собой способы in vitro, которые помимо этапов, перечисленных выше, могут включать этапы, связанные с предварительной обработкой или исследованием образца, соответственно, дополнительной обработкой первичных или вторичных измерительных сигналов способа, в частности, связанных с детектированием присутствия указанных комплексов. Способы согласно изобретению могут частично или полностью осуществляться вручную или автоматически. Необязательно, один или более из этапов (а), (b), (с), (c1), (с2), (d), (d1), (d2), (е), (f) и (g), (h) и (i) способа согласно изобретению могут быть частично или полностью автоматизированными, включая подходящее роботизированное и сенсорное оборудование и/или компьютеризованную обработку и/или оценку первичных сигналов. Более того, специалисту в данной области техники известно, что для осуществления способов согласно изобретению предпочтительно требуется калибровка или стандартизация сигнала для того, чтобы обеспечить количественную оценку детектируемых сигналов и, соответственно, присутствия комплексов, подлежащих идентификации, например, с помощью внутреннего или внешнего стандарта, т.е. одного или более известных количеств референсных соединений (референсных Аb или комплексов).
Согласно альтернативным вариантам реализации настоящего изобретения первые антигены и вторые антигены идентичны или не идентичны (т.е. различны). Согласно дополнительным альтернативным вариантам реализации изобретения, первые и вторые антигены различаются и принадлежат к одному или разным членам CRF. Согласно другому варианту реализации изобретения первый и/или второй антиген заключают в мембраноподобное или мембранное окружение. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения способ дает возможность детектирования указанных Аb против члена CRF в концентрации от примерно 0,03 до 3 нг/мл, предпочтительно от 0,03 до 1 нг/мл и более предпочтительно от 0,03 до 0,1 нг/мл.
Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одну или более первых антигенных молекул обеспечивают до этапа (с) в иммобилизированном виде (например, присоединенной к твердой подложке), предпочтительно, до контакта с исследуемым образцом. Необязательно твердая подложка может быть представлена в жидкой форме (например, в виде дисперсии, суспензии или коллоида), в качестве альтернативы, указанная подложка может быть предложена, например, в виде микротитрационного планшета или любого материала, подходящего для аффинной хроматографии. Указанные иммобилизированные одну или более первые антигенные молекулы затем приводят одновременно или последовательно в контакт с исследуемым образцом и одной или более вторыми антигенными молекулами.
Иммобилизированные одна или более первые антигенные молекулы при контакте с указанным образцом могут образовывать промежуточные комплексы, содержащие первую антигенную молекулу и анализируемое антитело, где указанные одна или более первые антигенные молекулы иммобилизированы на твердой подложке, и образованный таким образом иммобилизированный промежуточный комплекс затем приводят в контакт с одной или более вторыми антигенными молекулами, присутствующими в растворе, с образованием описанных выше комплексов, содержащих первую антигенную молекулу, анализируемое антитело и вторую антигенную молекулу, прямо или непрямо иммобилизированную на твердой подложке через первую антигенную молекулу. Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одну или более первых антигенных молекул, меченных вторым средством мечения, обеспечивают до этапа (с).
Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одну или более первых антигенных молекул иммобилизируют на твердой подложке и обеспечивают до этапа (с). Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одну или более вторых антигенных молекул, меченных первым средством мечения, обеспечивают до этапа (с). Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одну или более первых антигенных молекул, иммобилизированных на твердой подложке, и одну или более вторых антигенных молекул, меченных первым средством мечения, обеспечивают до этапа (с). Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одну или более первых антигенных молекул, меченных вторым средством мечения, и одну или более вторых антигенных молекул, меченных первым средством мечения, обеспечивают до этапа (с). Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одна или более первых антигенных молекул иммобилизированы на твердой подложке, и одна или более вторых антигенных молекул мечены первым средством мечения, где указанные вторые антигенные молекулы предложены в растворе. Согласно другому варианту реализации способов согласно изобретению одна или более первых антигенных молекул иммобилизированы на твердой подложке, и одна или более вторых антигенных молекул мечены первым средством мечения, где указанные первые и вторые антигенные молекулы предложены в растворе. Другой вариант реализации способов согласно настоящему изобретению позволяет непосредственно отслеживать взаимодействия между (i) указанными анализируемыми антителами, присутствующими в образце, и (ii) указанными одной или более первыми антигенными молекулами и (iii) указанными одной или более вторыми антигенными молекулами в определенном порядке путем применения аналитического метода детектирования, известного в данной области техники (например, неконкурентных или конкурентных анализов), например, анализов по типу «сэндвич» или по типу резонансного переноса энергии (resonance energy transfer, RET), при этом последний тип анализа не требует иммобилизации и/или отделения указанных первых антигенных молекул от жидкой фазы. Другой вариант реализации способов согласно настоящему изобретению позволяет идентифицировать модуляторы, которые способны взаимодействовать с комплексами, образующимися на этапе (с), и/или которые способны препятствовать образованию комплексов в соответствии с этапом (с), согласно определению способа детектирования анализируемых антител в соответствии с настоящим изобретением. Соответственно, другой вариант реализации способов согласно настоящему изобретению также включает этап (f) обеспечения до, или одновременно с, или после этапа (с) одного или более исследуемых соединений, способных взаимодействовать с комплексами, образующимися на этапе (с), и/или способных препятствовать образованию указанных комплексов в соответствии с этапом (с), и одновременное или последовательное приведение указанных исследуемых соединений в контакт с указанным образцом, указанными одной или более первыми антигенными молекулами и/или указанными одной или более вторыми антигенными молекулами до, или одновременно с, или после этапа (с) или приведение в контакт указанных исследуемых соединений одновременно или последовательно с указанными комплексами, образующимися во время или после этапа (с). Согласно другому варианту реализации способов в соответствии с настоящим изобретением один или более модуляторов (т.е. «исследуемых соединений на предмет их способности взаимодействовать с указанными комплексами или образовывать комплексы») обеспечивают до этапа (с) способа детектирования антитела согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации способов согласно настоящему изобретению одно или более из указанных средств, выбранных из группы, состоящей из указанных средств иммобилизации, указанного второго средства мечения и указанного первого средства мечения, обеспечивают до этапа (с) способа детектирования аутоантитела в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложен набор, применимый для осуществления любых способов в соответствии с настоящим изобретением, содержащий (а) одну или более первых антигенных молекул, выбранных из CRF, определенных в одном или более способах согласно изобретению; (b) одну или более вторых антигенных молекул, выбранных из CRF, определенных в одном или более способах согласно изобретению; (c1) средство иммобилизации, определенное в одном или более способах согласно изобретению и/или (с2) второе средство мечения, определенное в одном или более способах согласно изобретению; и (d) первое средство мечения, определенное в одном или более способах согласно изобретению, и необязательно одно или более анализируемых антител, способных реагировать с одной или более первыми и вторыми антигенными молекулами, определенным в одном или более способах согласно изобретению. Согласно другому варианту реализации изобретения набор в соответствии с настоящим изобретением содержит (а) указанные первые антигенные молекулы, меченные вторым средством мечения, или (а) указанные первые антигенные молекулы, иммобилизированные на твердой подложке; и (b) указанные вторые антигенные молекулы, меченные первым средством мечения.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения, предложено применение любых способов или наборов согласно изобретению для диагностики присутствия, возникновения или распространения заболевания или дисфункции, связанной с одним или более членами семейства сердечных рецепторов, и/или для идентификации фармацевтически эффективного соединения для лечения и/или профилактики заболевания или дисфункции, связанной с одним или более членами семейства сердечных рецепторов. Другой предмет изобретения представляет собой применение одного или более членов, выбранных из группы семейства сердечных рецепторов (CRF), меченных двумя или более различными средствами мечения, которые предпочтительно дифференциально поддаются детектированию, для осуществления способа идентификации одного или более антител против одного или более членов CRF, создания наборов для осуществления указанных способов и их диагностического или терапевтического применения и их применения для идентификации терапевтически эффективных агентов для лечения заболевания или дисфункции, связанной с одним или более членами CRF, в частности, для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из высокого кровяного давления, дилатационной кардиомиопатии, глаукомы, хронической усталости и деменции.
В целом, все термины и фразы, употребляемые в настоящей заявке, имеют значение, соответствующее общим для специалиста в данной области техники. Однако приведенные ниже предпочтительные определения некоторых терминов и фраз могут дополнительно уточнять настоящее изобретение:
Термины «полипептид» и «белок» употребляются как синонимы.
Термин «образец» в соответствии с настоящим изобретением обозначает «образец, подлежащий анализу», который по существу включает жидкость, суспензию или дисперсию, предпочтительно, биологического и/или синтетического химического происхождения. Образец может быть получен с помощью хорошо известных методов и может состоять из выделенных биологических жидкостей, таких как кровь, плазма крови, сыворотка, спинномозговая жидкость, слюна, моча, семенная жидкость, слезная жидкость и другие. «Образец» может дополнительно включать волосы, ногтевые срезы, кал или другие экскременты, выделенные клетки, клеточные гомогенаты, тканевые гомогенаты или гомогенаты органов, полученные от животного (например, мыши, крысы, морской свинки, собаки, свиньи, приматов) или человека. Образцы тканей или образцы органов могут быть получены из любой ткани или органа путем, например, биопсии или мазка. Выделенные клетки могут быть получены из биологических жидкостей или тканей или органов с помощью методов разделения, таких как центрифугирование или сортировка клеток. В предпочтительном варианте клеточные образцы, образцы тканей или образцы органов получают из таких клеток, тканей или органов, которые экспрессируют, содержат, накапливают, концентрируют или продуцируют антигены, анализируемые антитела или модуляторы, указываемые в настоящей заявке. Образец может быть подвергнут обработке и/или модификации, известной специалисту в данной области техники, для обеспечения возможности хранения или дополнительной обработки в способе согласно изобретению. Например, специалисту в данной области техники известно, что образец можно разводить в подходящем буфере. Если образец получен из мочи, то любой биотин, содержащийся в образце, необходимо удалить, чтобы он не мешал точному детектированию биотина в случае его использования в качестве средства мечения способа согласно изобретению. В предпочтительном варианте образец может быть выбран из образца, полученного от субъекта с подозрением на заболевание или состояние, связанное с нарушением функции, или от субъекта с предполагаемым началом заболевания или состояния, связанного с нарушением функции, или от субъекта, страдающего указанным заболеванием или состоянием, связанным с нарушением функции (или от субъекта, у которого необходимо контролировать указанное состояние), которая связана с регуляцией сердечной функции или кровяного давления, или связанными заболеваниями (например, глаукомой, деменцией, хронической усталостью или сердечной аритмией). Согласно одному варианту реализации изобретения образец может представлять собой референсный образец и содержать анализируемые антитела и/или один или более модуляторов известного типа и в известном количестве, предпочтительно, и анализируемые антитела, и один или более модуляторов известного типа и в известном количестве. Это может иметь особую значение для идентификации модуляторов, описанных в настоящей заявке.
В целом, термин «антигенная молекула» в соответствии с настоящим изобретением обобозначает полученное синтетическим путем соединение, содержащее связанный (иммобилизированный и/или меченый) антиген, с которым может взаимодействовать анализируемое антитело и которое способно связываться с анализируемым антителом (одним или более) с образованием специфических комплексов, содержащих анализируемое антитело и антигенную молекулу.
Термин «антиген» в соответствии с настоящим изобретением обозначает любую молекулу из группы семейства сердечных рецепторов, их субъединиц, пептидов или фрагментов, с которыми анализируемое антитело может взаимодействовать и которые способны связываться с анализируемым антителом (одним или более) с образованием специфичных комплексов, содержащих анализируемое антитело и антигенную молекулу. Антиген может являться природным или синтетическим, и его модификации предпочтительно представляют собой такие модификации, которые не оказывают негативного влияния на связывающие свойства согласно способам в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «анализируемое антитело» в соответствии с настоящим изобретением обозначает любое антитело, способное связываться с антигеном (одним или более), являющимся членом CRF, и, соответственно, способное связываться с одним или более рецепторов, выбранных из группы, состоящей из адренергических рецепторов (AR) и ацетилхолинергических рецепторов (AChR), присутствие которых оценивают путем количественного и/или качественного анализа с помощью способов согласно изобретению, как дополнительно изложено в настоящей заявке, таких как α1-AR, α2-AR, β-AR, никотиновые AChR, мускариновые AChR и их субъединицы, пептиды, фрагменты и/или варианты.
Конкретные примеры членов CRF представляют собой: α1A-AR, α1B-AR, α1D-AR, α2A-AR, α2B-AR, α2C-AR, β1-AR, β2-AR, β3-AR, никотиновые нейрональные AChR, никотиновые мышечные AChR, мускариновые M1-AChR, мускариновые M2-AChR, мускариновые М3-AChR, мускариновые M4-AChR, мускариновые M5-AChR М5. Согласно изобретению, ортологичные или паралогичные последовательности также могут являться подходящими. Термин «анализируемое антитело» также обозначает моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, биспецифичное антитело или диатело, бивалентное антитело, мультиспецифичное антитело, синтетическое антитело, аптамер, шпигельмер, человеческое или гуманизированное антитело, а также их фрагменты или варианты, такие как, например, Fab-, Fv- или scFv-фрагменты, или химически модифицированное производное любых из указанных вариантов, например, конъюгаты антитело-лекарственное средство, доменные антитела, наноантитела или миметики антител (дарпины, «сконструированные белки с анкириновым повтором»). Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения, термин «анализируемые антитела» обозначает эндогенные аутоантитела, терапевтические антитела и/или диагностические антитела.
Термин «член семейства сердечных рецепторов» и, соответственно, «семейство сердечных рецепторов» (CRF) в соответствии с настоящим изобретением обозначает любой полипептид, выбранный из группы, состоящей из адренергических рецепторов (AR) и ацетилхолинергических рецепторов (AChR), таких как α1-AR, α2-AR, β-AR, никотиновые AChR, мускариновые AChR, и их субъединиц, пептидов, фрагментов и/или вариантов, в частности, α1A-AR, α1B-AR, α1D-AR, α2A-AR, α2B-AR, α2C-AR, β1-AR, β2-AR, β3-AR, нейрональных никотиновых AChR, никотиновых мышечных AChR, мускариновых Ml-AChR, мускариновых M2-AChR, мускариновых M3-AChR, мускариновых M4-AChR, мускариновых M5-AChR, включая их субъединицы, варианты, аналоги, производные, фрагменты, ортологичные и паралогичные последовательности, которые содержат связывающий антитело домен, более предпочтительно, обозначает указанные молекулы, имеющие природное происхождение. В предпочтительном варианте CRF представляет собой CRF животного происхождения (например, CRF мыши, крысы, морской свинки, собаки, свиньи, примата) или человеческого происхождения, более предпочтительно, CRF человека.
Согласно дополнительным альтернативным вариантам реализации способов согласно изобретению термин «CRF» обозначает непосредственно: а) адренергический рецептор (AR); b) ацетилхолинергический рецептор (AChR); с) адренергический α1-рецептор; d) адренергический α2-рецептор; е) адренергический β-рецептор; f) никотиновый ацетилхолинергический рецептор; g) мускариновый ацетилхолинергический рецептор; или его субъединицу, вариант, аналог, производное или фрагмент (для каждого случая), который содержит связывающий антитело домен, более предпочтительно, обозначает указанные молекулы, имеющие природное происхождение. В предпочтительном варианте CRF представляет собой CRF животного происхождения (например, мыши, крысы, морской свинки, собаки, свиньи, приматов) или человеческого происхождения, более предпочтительно, CRF человека, тогда как согласно другим вариантам реализации изобретения, указанное выше определение относится только к первой антигенной молекуле.
Подходящие полипептиды и соответствующие гены, кодирующие члены семейства CRF, хорошо известны специалисту в данной области техники. Члены CRF, полученные рекомбинантным путем, являются коммерчески доступными (например, из компании R&D Systems, Inc., Миннеаполис, Миннесота 55413, США, OriGene Technologies, Inc., Роквилл, Мерилэнд 20850, США) и хорошо известны из баз данных последовательностей белков и нуклеиновых кислот, таких как, например, EMBL, Genbank и другие. Для членов CRF человека на сегодняшний день доступны коды доступа баз данных, приведенные для конкретных рецепторных белков, однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается указанными белками.
Термин «адренергический рецептор» («AR») в соответствии с настоящим изобретением обозначает любой выделенный полипептид, имеющий встречающуюся в природе аминокислотную последовательность или любой ее вариант. Аминокислотные последовательности и последовательности гена, кодирующие AR, хорошо известны специалисту в данной области техники, например, из баз данных последовательностей, таких как UniProtKB или http://www.rcsb.org. Следующие последовательности приведены в качестве примера:
a) α1-адренергические рецепторы (α1-AR):
Р35348 (ADA1A HUMAN); Р35368 (ADA1B HUMAN); P25100 (ADA1D HUMAN);
b) α2-адренергические рецепторы (α2-AR):
P08913 (ADA2A HUMAN); PI8089 (ADA2B HUMAN); PI8825 (ADA2C HUMAN);
с) β-адренергические рецепторы (P-AR):
Р08588 (ADRB1 HUMAN); Р07550 (ADRB2 HUMAN); Р13945 (ADRB3 HUMAN).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения AR обозначает вариант AR, который отвечает за распространение патологии или дисфункции у животных (например, мыши, крысы, морской свинки, собаки, свиньи, примата) или человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения AR помещен в мембранное окружение.
Термин «ацетилхолинергический рецептор» («AChR») в соответствии с настоящим изобретением обозначает любой выделенный полипептид, имеющий встречающуюся в природе аминокислотную последовательность или любой вариант никотиновых (nAChR) или мускариновых (mAChR) AChR. На сегодняшний день идентифицировано 17 различных субъединиц nAChR, которые делят на субъединицы мышечного и нейронального типа (CHRNA1; CHRNA2; CHRNA3; CHRNA4; CHRNA5; CHRNA6; CHRNA7; CHRNA8; CHRNA9; CHRNA10; CHRNB1; CHRNB2; CHRNB3; CHRNB4; CHRND; CHRNE и CHRNG). Из указанных 17 субъединиц α2-α7 и β2-β4 были идентифицированы у людей. Никотиновые AChR представляют собой пентамеры указанных субъединиц, таким образом, существует широкий диапазон вариаций в пределах существующих биологических nAChR, которые можно разделить на мышечные и ганглиозные рецепторы и различные классы рецепторов ЦНС.
Аминокислотные последовательности и последовательности гена, кодирующего AChR, хорошо известны специалистам в данной области техники, например, из баз данных последовательностей, таких как UniProtKB или http://www.rcsb.org (следующие далее последовательности приведены в качестве примера: Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы (mAChR):
PI 1229 (АСМ1 HUMAN); P08172 (ACM2 HUMAN); P20309 (ACM3 HUMAN); P08173 (ACM4 HUMAN); P08912 (ACM5 HUMAN)),
так же как для никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) и их субъединиц (UE), например, из UniProtKB: α1 (Р02708); α2 (Q15822); α3 (P32297); α4 (P43681); α5 (P30532); α6 (Q15825); α7 (P36544); β1 (PI 1230); β2 (P17787); β3 (Q05901); β4 (P30926); γ (P07510); δ (Q07001); ε (Q04844).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения AChR обозначает вариант AChR, который отвечает за распространение патологии или дисфункции у животных (например, мыши, крысы, морской свинки, собаки, свиньи, примата) или человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения AChR помещен в мембранное окружение.
Термин «вариант» в соответствии с настоящим изобретением обозначает любой фрагмент, аналог, производное, гибридный белок, субъединицу или цепь субъединицы антигена, приведенного выше.
В предпочтительном варианте «вариант» может иметь по существу такие же биологические свойства, как соответствующие полипептиды или белки, указываемые выше, предпочтительно, с учетом их иммунологических свойств, и более предпочтительно, с учетом свойств, отвечающих за дисфункцию. Более того, следует понимать, что термин «вариант» в соответствии с настоящим изобретением обозначает любую аминокислотную последовательность, которая отличается в результате по меньшей мере одной аминокислотной замены, модификации, делеции и/или вставки, где указанная аминокислотная последовательность варианта предпочтительно остается по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной аминокислотной последовательности исходной последовательности соответствующего перечисленного полипептида или белка, предпочтительно, по всей длине конкретного полипептида или белка. Варианты могут являться аллельными вариантами или любыми другими видоспецифичными гомологами, паралогами или ортологами. Более того, варианты, указываемые в настоящей заявке, включают фрагменты соответствующих полипептидов или белков, перечисленных ранее в настоящей заявке в качестве членов CRF, при условии что указанные фрагменты имеют по существу такие же биологические или патофизиологические свойства. Более того, варианты, изложенные в настоящей заявке, включают гибридные белки соответствующих полипептидов или белков, перечисленных выше в настоящей заявке в качестве членов CRF, с полипептидами, которые подходят в качестве средств иммобилизации, средств связывания или средств мечения, при условии что такой гибридный белок по существу сохраняет такие же биологические, предпочтительно, иммунологические свойства соответствующего исходного полипептида или белка, приведенного выше в настоящей заявке в качестве члена CRF. Варианты могут дополнительно включать модификации указанных полипептидов или белков путем гликозилирования или любой другой химической или ферментативной модификации, при условии, что указанные варианты имеют по существу такие же биологические, предпочтительно иммунологические свойства, как описано выше. Варианты согласно изобретению могут включать так называемые «молчащие» замены, вставки и делеции, которые не изменяют или по существу не изменяют биологическую активность. Более конкретно, варианты в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы по одному или более аминокислотным остаткам, которые замещаются на консервативный или неконсервативный аминокислотный остаток, предпочтительно, консервативный аминокислотный остаток, или имеют такие замены, при которых один или более из аминокислотных остатков может включать замещенный радикал. Предполагается, что такие варианты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Более конкретно, «молчащие» варианты представляют собой такие варианты, которые различаются консервативными аминокислотными заменами. Такие замены представляют собой замены с замещением конкретной аминокислоты в полипептиде на другую аминокислоту, имеющую сходные химические характеристики. В этом отношении консервативными заменами следует считать замены между малыми алифатическими аминокислотами А, V, L и I; между гидроксильными остатками S и Т; между кислотными остатками D и Е; между амидными остатками N и Q; между основными остатками К и R и между ароматическими остатками F и Y (согласно однобуквенному коду аминокислот в соответствии с номенклатурой ИЮПАК). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения «вариант» имеет по существу такие же биологические свойства. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения используется «вариант» члена CRF, который отвечает за распространение патологии или дисфункции, т.е., связанный с заболеванием, связанным с семейством сердечных рецепторов у животного (например, мыши, крысы, морской свинки, собаки, свиньи, примата) или субъекта, представляющего собой человека.
Термин «биологические свойства» в соответствии с настоящим изобретением обозначает, в частности, связывающие свойства соответствующей перечисленной молекулы. В случае конкретного члена CRF указанный термин обозначает его способность образовывать комплекс с его биологическим, соответственно, (пато)физиологическим лигандом при подходящих условиях, в частности, с одной или более молекулами, выбранными из адреналина, норадреналина, ацетилхолина или других известных активных трансмиттеров. Необязательно термин «биологические свойства» может дополнительно включать конкретные специфические иммунологические свойства полипептидов, например, если они специфично поддаются детектированию с помощью одного и того же метода ИФА. В частности, член CRF проявляет по существу такие же «биологические свойства», как его вариант, если оба из них (а) могут взаимодействовать с анализируемыми антителами, (b) поддаются детектированию с помощью одного и того же метода ИФА и/или (с) поддаются детектированию с помощью способа детектирования в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации изобретения одна или более первых антигенных молекул и одна или более вторых антигенных молекул представляют собой один или более полипептидов, выбранных из группы, состоящей из α1A-AR, α1B-AR, α1D-AR, α2A-AR, α2B-AR, α2C-AR, β1-AR, β2-AR, β3-AR, nAChR и mAChR или их вариантов, субъединиц и фрагментов.
Термин «обеспечение до этапа (с) способа детектирования аутоантитела» согласно изобретению обозначает обеспечение до приведения в контакт указанных антигенных молекул и указанных анализируемых антител.
Термин «детектирование (определение) присутствия и/или свойств связывания» согласно изобретению обозначает качественное и/или количественное детектирование относительного или абсолютного количества или концентрации анализируемого вещества, предпочтительно, количественное детектирование. Сигнал может быть получен путем прямого или непрямого измерения. Прямое измерение относится к измерению количества или концентрации одного или более выделяемых в реакции веществ и/или продуктов реакции на основе сигнала, который получен от самого/самих одного или более выделяемых в реакции веществ и/или продуктов реакции, и интенсивности, которая прямо коррелирует с количеством молекул одного или более выделяемых в реакции веществ реакции и/или продуктов реакции в реакционном объеме. Такой сигнал может быть получен, например, путем измерения интенсивности или значения специфических физических или химических свойств одного или более выделяемых в реакции веществ реакции и/или продуктов реакции. Непрямое измерение включает измерение сигнала, полученного от вторичного компонента (т.е. компонента, который сам по себе не является выделяемым в реакции соединением или продуктом реакции) или средства передачи биологических данных или амплификационных систем, называемых в настоящей заявке «средствами мечения», например, измеримых клеточных или трансмембранных ответов, лигандов или продуктов ферментативных реакций, например, с помощью флуорофоров, хромофоров, концентрации ионов, которое можно осуществлять с помощью оптического, электрического и/или электронного оборудования. Для измерения продуктов ферментативной реакции количество субстрата предпочтительно является насыщающим. Необязательно субстрат также может быть помечен с помощью поддающейся детектированию метки до проведения реакции. В предпочтительном варианте партнеров реакции приводят в контакт с субстратом в течение подходящего периода времени, которое соответствует времени, необходимому для достижения поддающегося детектированию количества одного или более продуктов реакции, которые предполагается получить, таких как поддающийся измерению сигнал. Вместо измерения количества или концентрации одного или более продуктов реакции можно измерять время, необходимое для достижения данного (например, поддающегося детектированию) количества или концентрации одного или более продуктов реакции.
Согласно изобретению, термин «детектирование (определение) присутствия и/или свойств связывания» включает все средства для определения количества выделяемого в реакции вещества и/или продукта реакции, известные специалисту в данной области техники. Указанные средства включают способы и устройства для осуществления иммунологических анализов, в которых могут использоваться меченные или иммобилизированные молекулы в аналитических реакциях различных форматов (например, реакциях по типу «сэндвич», конкурентных реакциях и т.д.). Указанные анализы подходят для генерации сигнала, показывающего присутствие или отсутствие выделяемых в реакции веществ и/или продуктов реакции. Более того, сигнал предпочтительно может прямо или не прямо коррелировать (например, быть пропорциональным или обратно пропорциональным) с количеством выделяемых в реакции веществ и/или продуктов реакции, присутствующих в реакционном объеме. Указанные способы предпочтительно включают биосенсоры, оптические устройства, сопряженные с иммунологическими анализами, биочипы и аналитические устройства, такие как спектрометры или устройства для хроматографии. Дополнительно способы включают способы на основе ИФА, в которых используются необязательно предварительно обработанные или предварительно покрытые микротитрационные планшеты, микрочипы, матрицы на основе пробирок или чипы, полностью автоматизированные или роботизированные иммунологические анализы (доступные, например, для проведения с помощью аналитических систем Roche-Elecsys™, Abbott-AxSYM™ или Brahms Kryptor™). В предпочтительном варианте «детектирование присутствия и/или свойств связывания» включает этапы, которые позволяют объединить партнеров реакции на подходящий период времени с получением поддающегося детектированию сигнала.
Термин «связывание» в соответствии с настоящим изобретением включает как ковалентное, так и нековалентное связывание. Термин «специфичное связывание» относится к аффинности связывания, превышающей по меньшей мере в 3 раза, предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, и более предпочтительно, по меньшей мере в 50 раз аффинность связывания с другими молекулами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термин «связывание» обозначает связывание партнеров связывания в анализе связывания in vitro при подходящих условиях, предпочтительно, в условиях, соответствующих инструкциям производителя аналитической системы или по существу соответствующих способам согласно определению, приведенному далее в настоящей заявке в разделе Примеры. В целом, «связывание» относится к аффинности связывания (Ко, которая обозначает отношение константы диссоциации к константе ассоциации), составляющей примерно от 10-14 М до 10-7 М, предпочтительно, примерно от 10-13 М до 10-9 М.
Термин «модулятор» согласно изобретению обозначает любое биологическое или химическое соединение, макромолекулу (например, имеющую массу более чем примерно 5 кДа), малую молекулу (например, имеющую массу менее чем примерно 5 кДа или даже менее чем примерно 800 Да), выделенное или очищенное соединение или их смесь, неочищенный экстракт или гомогенаты выбранных клеток, ткани или органа, природное соединение или синтетическое соединение, содержащее один или более пептидов, полипептидов (например, поликлональные или моноклональные антитела, включая одноцепочечные антитела, диатела, мультиспецифичные антитела, гуманизированные антитела, гибридные антитела или их фрагменты, такие как Fv, Fab и F(ab)2 фрагменты), аптамеры, шпигельмеры, нуклеиновые кислоты и/или малые молекулы.
Термин «антигенная молекула, помещенная в мембранное окружение», согласно изобретению обозначает, что указанная антигенная молекула, которая может происходить из трансмембранного белка, находится в модельной мембране другой амфифильной структуры, которая включает любое подходящее синтетическое, природное или искусственное окружение, например, клеточную, мембранную, везикулярную, мицеллярную или липосомальную структуру, в результате чего указанная антигенная молекула сохраняет свою функциональную и/или структурную целостность и способна взаимодействовать с перечисленными выше анализируемыми антителами и, таким образом, позволяет образование указанного комплекса.
Аналитические способы для белков, помещенных в мембранное окружение, хорошо известны специалисту в данной области техники, например, из технологий и способов, которые используют искусственные или биомиметические мембраны или липидные бислои (в настоящей заявке «модельные мембраны»). Модельные мембраны широко применяются для исследования свойств мембранных белков, и многие из них подходят для осуществления способов согласно настоящему изобретению, в частности, мембраны, предотвращающие денатурацию указанной антигенной молекулы.
Термин «модельная мембрана» согласно изобретению обозначает любую липосому или везикулу, например, созданные искусственным путем везикулы, содержащие один или более липидных слоев в сферической геометрии. Такие липосомы и везикулы также используются в качестве наполнителей для транспорта липидов, белков и малых молекул и могут использоваться для введения фармацевтических препаратов. Везикулы или липосомы можно получать путем разрыва биологических мембран выбранных клеточных культур, тканей, органов или субклечтоных структур (например, ядра, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума, митохондрий), например, путем обработки ультразвуком и/или экструзии и последующей повторной самосборки липидных структур, что обеспечивает возможность мечения, например, с помощью красителей, полипептидов или других средств мечения. «Модельные мембраны» также могут включать липидные бислои, собранные синтетическим путем in vitro. Указанные мембраны могут быть сделаны из одного или более синтетических и/или природных липидов.
Термин «модельные мембраны» может дополнительно включать, например, черные липидные мембраны (BLM), везикулы, липидные бислои, липосомы, мицеллы, бицеллы, гибридные бислои (включая гидрофобный монослой и липидный монослой) и нанодиски, которые могут быть заякорены, закреплены или привязаны к твердой фазе или твердому субстрату, и которые могут необязательно быть представлены вместе со спейсером или подложкой (например, полиэтиленгликолями, олигонуклеотидами, пептидами, полипептидами (например, стрептавидином) или гидрогелями), позволяющими поддерживать расстояние между мембраной и/или указанной выше антигенной молекулой и твердым субстратом. В предпочтительном варианте спейсер или подложка представляет собой гидрофильную молекулу. В отличие от везикулы или клеточной мембраны, указанный выше закрепленный бислой может иметь плоскую структуру, которая удерживается на твердой подложке. Таким образом, только верхняя поверхность бислоя подвергается воздействию раствора. Например, способ получения пртеолипосомы известен из заявки на европейский патент №1992688 А1, в которой получение липосомы описано в Примерах 1-20.
Термин «мицеллы» согласно изобретению обозначает другой тип модельных мембран без липидного бислоя. В водных растворах мицеллы представляют собой совокупность амфифильных молекул (например, детергентов), гидрофильные части которых контактируют с полярным растворителем, а гидрофобные части находятся в центре. Мицеллы способны солюбилизировать мембранные белки путем их частичного погружения и экранирования их гидрофобных поверхностей от полярного растворителя. Термин «бицеллы» обозначает еще один тип модельных мембран, которые, как правило, состоят из двух липидов, один из которых образует липидный бислой, тогда как другой является амфифильным, таким образом, образуется подобная мицеллам структура, в которой центральная часть бислоя экранирована от окружающих молекул растворителя. Термин «нанодиски» обозначает сегмент липидного бислоя, погруженный в амифифильное белковое, липидное покрытие или покрытие из слоя детергента. Мембранные белки также могут быть встроены и солюбилизированы с помощью нанодисков.
Термин «заболевание, связанное с семейством сердечных рецепторов» («DRCRF»), согласно изобретению обозначает любое расстройство или дисфункцию, которая связана с одним или более членами CRF, предпочтительно, полипептидом, который представляет собой AR или AChR согласно определению выше, более предпочтительно, относящимся к одному, двум или трем из указанных членов CRF.
Термин «DRCRF» согласно изобретению предпочтительно обозначает хроническое или периодическое расстройство, которое выбрано из группы, состоящей из гипертензивной дисфункции, высокого кровяного давления, дилатационной кардиомиопатии, глаукомы, хронической усталости, деменции и аутоиммунных расстройств, в частности, хронических указанных расстройств и более предпочтительно одного из указанных расстройств аутоиммунной природы.
Термин «средство иммобилизации» согласно изобретению обозначает любой реагент и/или способ, который подходит для иммобилизации указанных первых антигенных молекул на твердой подложке согласно знаниям специалистов в данной области техники, предпочтительно, с поддержанием их структурной и/или функциональной целостности. Тип твердой подложки и применимые условия в соответствии с настоящим изобретением не отличаются от обычно используемых материалов, способов и условий, используемых в известных методах иммунологического анализа. Твердая подложка для применения в соответствии с настоящим изобретением может включать планшеты для ИФА, используемые в известных современных методах ИФА, или же для применения согласно настоящему изобретению можно использовать любую другую подходящую подложку, такую как микротитрационные планшеты (содержащие 96, 384, 1536 или 3456 или более лунок) или их части, пробирки, частицы, магнитные гранулы, нитроцеллюлозу, устройства на основе чипов и т.д. Материалы, подходящие для применения в качестве твердой подложки, которые можно использовать в соответствии с идеей настоящего изобретения, хорошо известны в данной области техники и включают, например, коммерчески доступные материалы колонки, полистироловые гранулы и другие носители, латексные гранулы, магнитные гранулы, коллоидный металл, стеклянные поверхности, силанилированные поверхности, силиконизированные поверхности и чипы для применения в методах на основе белковых микрочипов, нитроцеллюлозные носители, целлюлозные носители, мембраны, модельные мембраны, стабилизированные липосомы или клетки (например, дурациты (Duracyte™)), лунки, соответственно, поверхности реакционных планшетов, сосудов или микротитрационных планшетов, пластиковых пробирок и т.д.
Указанные первые антигенные молекулы могут быть иммобилизированы на любом носителе, известном специалисту в данной области техники. Примеры таких носителей включают инертные материалы и представляют собой такие инертные материалы, как стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилоза, природная и модифицированная целлюлоза, полиакриламид, агароза, магнетит и золото. Носитель может быть растворимым или нерастворимым. В случае нерастворимого носителя указанный носитель представляет собой твердое вещество или коллоид и может необязательно быть представлен в виде суспензии.
Подходящие средства иммобилизации указанных антигенных молекул известны и включают, но не ограничиваются указанными, ионные, гидрофобные или ковалентные взаимодействия. Также может являться подходящим применение указанного средства иммобилизации в суспензии, например, полых микрогранул или микросфер, возможно различного типа, которые необязательно являются меченными, и каждая из которых необязательно содержит различные антигенные молекулы. Способы получения суспензий, например, на основе твердофазных химических реакций и фотомечения защитных групп, известны из патента США 5 744 305.
Термин «мечение» в соответствии с настоящим изобретением обозначает прямое или непрямое мечение. Прямое мечение включает прямое (ковалентное или нековалентное) присоединение метки («зонда») к молекуле, которую предполагается пометить. Непрямое мечение включает связывание (ковалентное или нековалентное) второго лиганда с молекулой, которую предполагается пометить. Такой второй лиганд специфично связывается с молекулой, которую предполагается пометить (например, с аффинностью, превышающей по меньшей мере в 3 раза, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз и более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз аффинность связывания с другими молекулами), в аналитических условиях. Указанный второй лиганд также может быть связан с подходящим средством мечения и/или может связываться с третьим лигандом, который связывается со вторым лигандом. Применение второго лиганда или лиганда более высокого порядка можно применять для увеличения или амплификации сигнала. Подходящие вторые лиганды и лиганды более высокого порядка могут включать антитела, вторичные антитела и хорошо известную систему стрептавидин-биотин (Vector Laboratories, Inc.). Более того, молекула, которую предполагается пометить, или субстрат также могут быть «помечены» одним или более зондами/метками, известными в данной области техники. Такие зонды затем могут служить мишенями для лигандов более высокого порядка. Подходящие зонды включают биотин, диоксигенин, гистидиновую метку, глутатион-8-трансферазу, FLAG-метку (N-DYKDDDDK-C), зеленый флуоресцентный белок (GFP), myc-метку, гемагглютинин вируса гриппа А (НА), мальтоза-связывающий белок и другие. В случае пептида или полипептида зонд в целом располагается на N- и/или С-конце или вблизи от N- и/или С-конца.
Более того, молекула, которую предполагается пометить, или субстрат также может быть предложен с подходящей «спейсерной» молекулой, известной в данной области техники, для предотвращения в случае объемных молекул любых стерических затруднений, связанных со свойствами связывания из-за пространственных ограничений. Термин «первое средство мечения» согласно изобретению обозначает средство прямого или непрямого детектируемого мечения, предпочтительно, выбранного из группы ферментов, радиоактивных веществ или изотопов, красителей или их предшественников, используемых для хемолюминесценции, биолюминесценции, флуоресценции и магнитного мечения (например «магнитных гранул», включая парамагнитные и суперпарамагнитные метки). «Первое средство мечения» поддается детектированию с помощью подходящего способа детектирования, известного в данной области техники. Подходящие метки могут дополнительно включать частицы золота, латексные гранулы, сложный эфир акридиния, люминол и рутений. Ферментативно активные метки включают, например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, люциферазу и их производные. Подходящие субстраты для прямого или непрямого детектирования включают ди-амино-бензидин (DAB), 3, 3-5, 5'-тетраметилбензидин, NBT-BCIP (4-нитросиний тетразолий хлорид и 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат, CDP-StAR™ (Amersham Biosciences), ECL™ (Amersham Biosciences) и другие соединения, известные в данной области техники. Подходящая комбинация фермент-субстрат может обеспечивать повышение или снижение количества окрашенного продукта или выделяемого в реакции вещества (хромофора, флуоресценции, хемо- или биолюминесценции), который детектируется с помощью известных способов (например, с использованием фотометра, фотоумножителя и светочувствительной пленки или системы камер). Такие же методы применяются для количественной оценки при измерении конечного результата, производительности или скорости ферментативной реакции.
Известные флуоресцентные метки включают флуоресцентные красители и белки (такие как GFP и его производные), Су3, Су5, Texas Red, флуоресцеин и серию красителей Alexa (например Alexa 568) и квантовые точки. Многие подходящие флуоресцентные метки являются коммерчески доступными. Примеры флуоресцентных белков включают, но не ограничиваются указанными, зеленые, желтые, голубые, синие и красные флуоресцентные белки.
Подходящие хемолюминесцентные или биолюминесцентные метки могут включать прокариотические люцеферазы (например, бактериальные lux-кодируемые люциферазы) или эукариотические люцеферазы (например, кодируемые геном luc люцеферазы светлячка), а также варианты, обладающие отличными или измененными оптическими свойствами, такие как люциферазы, которые испускают свет различного цвета, например, люциферазы из огневки Photinus pyralis, из губки Suberities domuncula и гриба Mycena fungi. Более того, подходящими могут являться фотобелки, например, активируемые кальцием фотобелки, и их специфически сконструированные варианты, испускающие свет, как правило, в диапазоне от 200 до 1100 нм или в видимом спектре (т.е. от 350 до 800 нм), например, обелин из морского полипа Obelia longissima или экворин, например, из светящейся медузы Aequorea victoria или из других организмов, необязательно в мембранном окружении.
Подходящие радиоактивные метки включают S35, I125, Р32, Р33 и другие нуклиды. Радиоактивную метку можно выявить с помощью любого известного и подходящего способа, например, с помощью светочувствительной пленки или люминесцентного визуализатора.
Подходящие способы детектирования для осуществления настоящего изобретения также включают преципитацию (в частности, иммунопреципитацию), электрохемилюминесценцию (генерируемую электрическим путем хемилюминесценцию), биолюминесценцию, РИА (радиоиммунологический анализ), ИФА (иммуноферментный анализ), иммуноферментные «сэндвич»-тесты, иммунологические «сэндвич«-анализы (ECLIA), усиленный диссоциацией лантанидный флюоресцентный иммуноанализ (DELFIA™, PerkinElmer Inc., США), сцинтилляционный анализ сближения (SPA), турбидиметрию, нефелометрию, турбидиметрию или нефелометрию с латексным усилением, анализ латекс-агглютинации или твердофазные иммунные анализы, при этом указанный способ предпочтительно не включает преципитацию.
Дополнительно способы, известные в данной области техники (такие как электрофорез в геле, двумерный электрофорез в геле, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ), Вестерн-блоттинг и масс-спектрометрия) могут необязательно использоваться в комбинации со способами мечения или другими способами детектирования, описанными выше.
Термин «второе средство мечения» согласно изобретению обозначает любое прямо или непрямо поддающееся детектированию средство мечения, выбранное из группы, включающей ферменты, радиоактивные вещества или изотопы, красители или их предшественники для хемолюминесцентного, биолюминесцентного, флуоресцентного и магнитного мечения (например, «магнитные гранулы», включая парамагнитные и суперпарамагнитные метки). В предпочтительном варианте «первое средство мечения» представляет собой нерадиоактивную метку, более предпочтительно, «первое средство мечения» и «второе средство мечения» являются нерадиоактивными. Употребление термина «второе средство мечения» обозначает, что указанное «второе средство мечения» не идентично «первому средству мечения». Специалисту в данной области техники известно, как выбрать первое и второе средство мечения таким образом, чтобы сигналы от первого и второго средства мечения поддавались дифференциальному детектированию в способе детектирования согласно изобретению. Подходящее второе средство мечения выявляется с помощью подходящего способа детектирования, известного в данной области техники, например, способа на основе резонансного переноса энергии (RET). В предпочтительном варианте «второе средство мечения» включает средство мечения, подходящее для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) или резонансного переноса энергии хемолюминесценции (CRET), как известно специалисту в данной области техники. Специалист в данной области техник выбирает подходящее второе средство мечения с учетом типа первого средства мечения таким образом, чтобы сигнал RET поддавался детектированию и был различимым. Например, генерирование сигнала RET и выбор подходящего средства мечения может обеспечить дополнительную информацию о типе и кинетике образования комплекса и структурных признаках образованных комплексов. Последовательности:
Seq. ID No. 1 Последовательность ДНК LUC
Seq. ID No. 2 Последовательность белка LUC
Seq. ID No. 3 Праймер P1 Luc Fw
Seq. ID No. 4 Праймер P2 Luc Rv
Seq. ID No. 5 кДНК B1
Seq. IDNo. 6 AA B1
Seq. ID No. 7 Праймер Р3 В 1 Fw
Seq. ID No. 8 Праймер P4 B1 Rv
Seq. ID No. 9 кДНК B1-Luc
Seq. ID No. 10 AA B1-Luc
Seq. ID No. 11 кДНК В2
Seq. ID No. 12 AA B2
Seq. ID No. 13 Праймер P5 B2 Fw
Seq. ID No. 14 Праймер P6 B2 Rv
Seq. ID No. 15 кДНК B2 Luc
Seq. ID No. 16 AA B2 Luc
Seq. ID No. 17 кДНК М2
Seq. ID No. 18 AA M2
Seq. ID No. 19 Праймер P7 M2 Fw
Seq. ID No. 20 Праймер P8 M2 Rv
Seq. ID No. 21 кДНК M2 Luc
Seq. ID No. 22 AA M2 Luc
Seq. ID No. 23 Праймер P9 B2 2B5 Вас Fw
Seq. ID No. 24 Праймер P 10 B2 2B5 Вас Rv
Следующие далее примеры и сравнительные примеры иллюстрируют настоящее изобретение и не ограничивают его объем. Экспериментальное исследование:
Материалы:
ДНК-праймеры были получены из компании Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США); вектор pSP-luc+NF был получен из компании Promega GmbH (Мангейм, Германия); вектор pIRESneo был получен из компании Clontech (Пало-Альто, калифорния, США); вектор pFastBacl и клетки насекомых High Five™ были получены из компании Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США); пробирки из полистирола, покрытые антителами PGA14 (Selenotest LIA), были получены из ICI immunochemical intelligence GmbH (Берлин, Германия). Если иное не указано, другие реагенты и химические вещества были получены из Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Мюнхен, Германия) или Merck KGaA (Дармштадт, Германия); ферменты были получены из компании Promega (Мэдисон, Висконсин, США) или New England Biolabs (Ипсвич, Массачесетс, США).
Пример 1: Конструирование гибридных белков
Пример 1А: Конструирование гибридного белка β1-адренергический рецептор-люцифераза ДНК (последовательность Seq. ID No. 1), кодирующую аминокислоты 2-551 люциферазы светлячка (Seq. ID No. 2 в плазмиде pSP-luc+NF), амплифицировали с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием праймеров PI (Seq. ID No. 3) и Р2 (Seq. ID No. 4), содержащих сайты рестикции EcoRI и BamHI соответственно. Плазмиду pIRESneo переваривали с помощью рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и BamHI; полученный фрагмент замещали на ДНК, кодирующую люциферазу светлячка, полученную в результате указанный выше ПЦР, с получением, таким образом, плазмиды pIRESneo-Luc. кДНК (Seq. ID No. 5), кодирующую аминокислоты 1-469 человеческого β1-адренергического рецептора (Seq. ID No. 6), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров РЗ (Seq. ID No. 7) и Р4 (Seq. ID No. 8), содержащих сайты рестрикции EcoRV и EcoRI соответственно. pIRESneo-Luc переваривали с помощью рестрикционных эндонуклеаз EcoRV и EcoRI и полученный фрагмент замещали на последовательность ДНК, кодирующую человеческий β1-адренергический рецептор, полученный в результате предыдущей ПЦР, с получением вектора pIRESneo-B1-Luc, содержащего последовательность Seq. ID No. 9, кодирующую меченный гибридный белок Seq. ID No. 10.
Пример 1В: Конструирование гибридного белка β2-адренергический рецептор-люцифераза кДНК (Seq. ID No. 11), кодирующую аминокислоты 1-413 человеческого β2-адренергического рецептора (Seq. ID No. 12), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р5 (Seq. ID No. 13) и Р6 (Seq. ID No. 14), содержащих сайты рестрикции NotI и EcoRI соответственно. pIRESneo-Luc переваривали с помощью рестрикционных эндонуклеаз NotI и EcoRI и полученный фрагмент замещали на последовательность ДНК, кодирующую β2-адренергический рецептор, полученный в результате предыдущей ПЦР, с получением вектора pIRESneo-B2-Luc, содержащего Seq. ID No. 15, кодирующую меченный гибридный белок Seq. ID No. 16.
Пример 1С: Конструирование гибридного белка мускариновый рецептор М2-люцифераза кДНК (Seq. ID No. 17), кодирующую аминокислоты 1-466 мускаринового рецептора М2 (Seq. ID No. 18), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р7 (Seq. ID No. 19) и Р8 (Seq. ID No. 20), содержащих сайты рестрикции EcoRV и EcoRI соответственно. Плазмиду pIRESneo-Luc переваривали с помощью рестрикционных эндонуклеаз EcoRV и EcoRI и полученный фрагмент замещали на последовательность ДНК, кодирующую мускариновый рецептор М2, полученный в результате предыдущей ПЦР, с получением вектора pIRESneo-M2-Luc, содержащего Seq. ID No. 21, кодирующую меченый гибридный белок Seq. ID No. 22.
Пример ID: Конструирование гибридного белка β2-адренергический рецептор-эпитоп, распознаваемый антителами PGA14 кДНК (Seq. ID No. 11), кодирующую аминокислоты 1-413 β2-адренергического рецептора (Seq. ID No. 12), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р9 (Seq. ID No. 23) и P10 (Seq. ID No. 24), содержащих сайты рестрикции BamHI и HindIII соответственно (Р10 содержит последовательность, кодирующую эпитоп, состоящий из 16 аминокислот и распознаваемый антителами PGA 14). Вектор pFastBacl переваривали с помощью рестрикционных эндонуклеаз BamHI и HindIII и полученный фрагмент замещали на последовательность ДНК, кодирующую гибридный белок β2-адренергический рецептор-эпитоп PGA 14, полученную в результате указанной выше ПЦР, с получением вектора pFastBacl-B2-PGA14tag.
Пример 2: Получение B1-Luc-, B2-Luc- и М2-Luc-продуцирующих клеток
Пример 2А: Получение B1-Luc-, B2-Luc- и М2-Luc-продуцирующих клеток НЕK 293
Клетки НЕK 293 растили в среде DMEM-F12 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки при 5% СO2 и 37°С. Указанные клетки НЕK 293 трансфицировали с помощью одной из плазмид pIRESneo-B1-Luc, pIRESneo-B2-Luc или pIRESneo-M2-Luc с использованием реагента трансфекции FuGENE6 (полученного из Roche Deutschland Holding GmbH, Гренцах-Вилен, Германия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Через 48 часов поле трансфекции начинали селекцию с помощью 0,8 мг/мл G418 (Gibco™ BRL, Invitrogen). Были выбраны стабильные клоны, экспрессирующие гибридный белок на высоком уровне.
Пример 2В: Получение клеточных экстрактов B1-Luc, B2-Luc и M2-Luc
Клетки НЕK293 (продуцирующие B1-LUC, B2-LUC или M2-LUC) растили в планшетах площадью 75 см2 до конфлюентного состояния, собирали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Клетки промывали путем центрифугирования в ФСБ. Полученные клетки лизировали с помощью лизирующего буфера (50 мМ Tris-HCl рН 7,5; 100 мМ NaCl; 10% глицерин; 1% тритон Х-100). Суспензию центрифугировали, супернатант отделяли от клеточных остатков и хранили при -80°С.
Пример 2С: Создание рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего гибридный белок B2-PGA14tag
Последовательность B2-PGA14tag, полученную из Примера 1D, переносили в бакмидную ДНК путем сайт-специфической рекомбинации в бактериях. Бакмиду затем использовали для создания полностью рекомбинантнго бакуловируса в клетках насекомых Sf9 в соответствии с протоколами изготовителя (руководством для экспрессионной системы Вас-to-Bac, Invitrogen).
Пример 2D: Создание гибридного белка B2-PGA14tag
Клетки насекомых High Five™ растили в суспензии в бессывороточной среде Express Five™ до достижения плотности 2×106 клеток/мл. Затем клетки инфицировали (трансфецировали) рекомбинантным бакуловирусом B2-PGA14tag (множественность заражения (multiplicity of infection, MOI) составляла 1). Через 72 часа после инфицирования клетки собирали и экстракт выделяли и хранили при -80С°, как описано в Примере 2В.
Сравнительный Пример 3: Анализ иммунопреципитации β2-аутоантител (β2-аАb)
Клеточный экстракт B2-Luc, полученный из Примера 2В, разводили в 20 раз буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl рН 7,5,100 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100,10% глицерин, 5 мг/мл БСА. 100 мкл разведенного экстракта (RLU примерно 107) смешивали с 10 мкл образца (проба сыворотки) и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Иммунные комплексы затем преципитировали путем добавления 10 мкл 10% суспензии белка А-сефарозы (POROS™, Life Technologies) в том же буфере в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Белок А-сефарозу преципитировали и промывали 3 раза 1 мл промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100). В конце эксперимента измеряли люциферазную активность преципитированных иммунных комплексов на люминометре Berthold (AutoLumat Plus LB 953) в течение 10 с.Результаты выражали как RLU для связавшихся молекул. В Таблице 1 показана активность для образцов pVaAb-положительной сыворотки и β2-аАb-отрицательной сыворотки.
Пример 4: Перекрестные анализы
Пример 4А: Перекрестный анализ для детектирования β2-аАb
Полистироловые пробирки, покрытые антителами PGA 14 (ICI immunochemical), инкубировали в течение ночи при 4°С с 200 мкл среды от клеток насекомых SF6, содержащей B2-PGA14tag. После иммобилизации B2-PGA14tag пробирки промывали два раза 1 мл буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10% глицерин. Затем каждую пробирку инкубировали в течение ночи при температуре 4С° со смесью, содержавшей 100 мкл того же буфера, 10 мг/мл БСА и 100 мкл образца (пробы сыворотки). Пробирки промывали два раза 1 мл того же буфера и инкубировали в течение ночи при температуре 4С° с 200 мкл B2-Luc, полученного, как описано выше в Примере 2В, разведенного в том же буфере вместе с БСА (люциферазная активность примерно 40×106 RLU). После инкубирования пробирки промывали четыре раза и активность люциферазы измеряли в люминометре Berthold (AutoLumat Plus LB 953) в течение 10 с. Результаты, показанные в таблице 1, выражали как RLU (относительные световые единицы) для связанных молекул и сравнивали с результатами, полученными от стандартного анализа из Примера 3.
Пример 4В: Предел чувствительности анализа для детектирования β2-аАb в человеческой сыворотке
Каждые 3 образца β2-аАb-положительной и β2-аАb-отрицательной сыворотки разводили в смеси, содержащей 20 мМ Tris-HCl, рН7,5, 50 мМ NaCl, 10% глицерин, 10 мг/мл БСА.
Анализ проводили, как описано в Примере 4А. Фоновый сигнал получали с использованием только буфера.
Пример 4С: Восстановление частоты сердечных сокращений по результатам оценки β2-аАb в человеческой сыворотке
Каждый из трех образцов человеческой β2-аАb-положительной сыворотки (Р1-Р3) смешивали в отношении 1:1 с образцами β2-аАb-отрицательной сыворотки (K1-K3) и анализировали, как описано в Примере 4А (Таблица 3).
Пример 4D: Непосредственное нанесение антигена на пластиковую поверхность
Три образца человеческой β2-аАb-положительной сыворотки и три образца β2-аАb-отрицательной сыворотки анализировали так же, как описано в Примере 4А, за исключением того, что гибридный комплекс β2-PGA14tag из Примера 2D инкубировали с полистироловыми пробирками без непосредственного покрытия (ICI immunochemical intelligence GmbH, Берлин) до начала детектирования. Контроли анализировали точно так же, как описано в Примере 4А (Таблица 4).
Пример 4Е: Специфичное детектирование
Три образца человеческой β2-аАb-положительной сыворотки и три образца β2-аАb-отрицательной сыворотки анализировали, как описано в Примере 4А, за исключением того, что вместо экстракта B2-Luc из Примера 2В в анализе использовали кроличьи античеловеческие антитела IgG в разведении 1:500, связанные с пероксидазой хрена (ПХ) (DIANOVA, Гамбург, Германия) (Таблица 5).
Пример 4F: Предел обнаружения антител против β2.
Известное количество антител против β2 (sc-569, Santa Cruz, Калифорния, США) разводили в буфере (20 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10% глицерин, 10 мг/мл БСА), как показано в таблице, и анализировали, как описано в Примере 4А.
Пример 4G: Гетерореактивность
Три образца β2-аАb-положительной сыворотки анализировали, как описано в Примере 4А. β2-аАb-кроссреактивность выявляли путем инкубации с 200 мл разведенного экстракта β2-Luc, разведенного экстракта B1-Luc или разведенного экстракта M2-Luc из Примера 2В (люциферазная активность для β1 и β2 - 40×106 RLU (относительных световых единиц, люциферазная активность для М2 - 0,5×106 RLU) в буфере с БСА при температуре 4°С в течение ночи (Таблица 7).
Пример 5: Клиническая значимость уровня β2-аАb у людей
В Таблице 8 показаны средние значения (и стандартное отклонение) массы тела (ожирение и риск развития диабета) и возраста пациентов (людей), от которых была получена сыворотка, содержащая β2-аАb.
Claims (30)
1. Способ детектирования в исследуемом образце присутствия и/или свойств связывания анализируемых антител, способных реагировать с одной или более антигенными молекулами, где указанный способ включает:
(a) обеспечение одной или более первых антигенных молекул, с которыми могут взаимодействовать анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, причем указанная первая антигенная молекула выбрана из семейства сердечных рецепторов (CRF); и
(b) обеспечение одной или более вторых антигенных молекул, с которыми могут взаимодействовать анализируемые антитела, если они присутствуют в указанном образце, причем указанная вторая антигенная молекула выбрана из CRF; и
(c) одновременное или последовательное приведение указанных первых антигенных молекул, обеспеченных на этапе (a), и указанных вторых антигенных молекул, обеспеченных на этапе (b), в контакт с исследуемым образцом, обеспечивающее возможность взаимодействия анализируемых антител, если они присутствуют в указанном образце, с указанными антигенными молекулами с образованием комплексов, содержащих [первую антигенную молекулу]-[анализируемое антитело]-[вторую антигенную молекулу]; и
(d1) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (c) средства иммобилизации, с помощью которого указанную первую антигенную молекулу, представленную в указанных комплексах, образованных на этапе (c), соответственно, способную образовывать указанные комплексы на этапе (c), можно иммобилизировать на твердой подложке до, или одновременно с, или после этапа (c); и/или
(d2) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (c) второго средства мечения, в результате чего происходит мечение указанной первой антигенной молекулы, присутствующей в указанных комплексах, образованных на этапе (c), соответственно, способной образовывать указанные комплексы на этапе (c), указанным вторым средством мечения до, или одновременно с, или после этапа (c); и
(e) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (c) первого средства мечения, в результате чего происходит мечение указанной второй антигенной молекулы, присутствующей в указанных комплексах, образованных на этапе (c), соответственно, способной образовывать указанные комплексы на этапе (c), указанным первым средством мечения до, или одновременно с, или после этапа (c); и
(g) детектирование присутствия комплексов, образованных во время или после этапа (c), с получением показателя присутствия анализируемых антител в указанном образце.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий:
(f) обеспечение до, или одновременно с, или после этапа (c) одного или более модуляторов, способных взаимодействовать с комплексами, образующимися на этапе (c), и/или способных препятствовать образованию указанных комплексов в соответствии с этапом (c), и до, или одновременно с, или после этапа (c) одновременное или последовательное приведение указанных одного или более модуляторов в контакт с указанным образцом, указанными одной или более первыми антигенными молекулами и/или указанными одной или более вторыми антигенными молекулами или одновременное или последовательное приведение указанных одного или более модуляторов в контакт с указанными комплексами, образующимися во время или после этапа (c).
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные первые антигенные молекулы и указанные вторые антигенные молекулы идентичны.
4. Способ по одному или более из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанные первые антигенные молекулы и/или указанные вторые антигенные молекулы заключают в мембранное окружение.
5. Способ по одному или более из пп. 1-4, где указанное анализируемое антитело, детектируемое в указанном образце, представляет собой эндогенное аутоантитело или моноклональное антитело.
6. Способ по одному или более из пп. 1-5, отличающийся тем, что одно или более из указанных средств, выбранных из группы, состоящей из указанного первого средства мечения, указанного второго средства мечения, указанного средства иммобилизации и указанных модуляторов, обеспечивают до приведения в контакт указанных антигенных молекул и указанных анализируемых антител.
7. Набор, применимый для осуществления способа по одному или более из пп. 1-6, содержащий
(a) одну или более первых антигенных молекул, выбранных из семейства сердечных рецепторов, определенных в одном или более из пп. 1-2;
(b) одну или более вторых антигенных молекул, выбранных из семейства сердечных рецепторов, определенных в одном или более из пп. 1-2;
(c1) средство иммобилизации, определенное в п. 1, и/или
(c2) второе средство мечения, определенное в п. 1, и
(d) первое средство мечения, определенное в п. 1.
8. Набор по п. 7, отличающийся тем, что
(a) указанные первые антигенные молекулы мечены вторым средством мечения; и
(b) указанные вторые антигенные молекулы мечены первым средством мечения.
9. Набор по п. 7, отличающийся тем, что
(a) указанные первые антигенные молекулы иммобилизированы на твердой подложке; и
(b) указанные вторые антигенные молекулы мечены первым средством мечения.
10. Применение способа по одному или более из пп. 1-6 для диагностики присутствия или начала заболевания, связанного с семейством сердечных рецепторов.
11. Применение способа по одному или более из пп. 1-6 для идентификации фармацевтически эффективного соединения для лечения и/или профилактики заболевания, связанного с семейством сердечных рецепторов.
12. Применение набора по одному или более из пп. 7-9 для диагностики присутствия или начала заболевания, связанного с семейством сердечных рецепторов.
13. Применение набора по одному или более из пп. 7-9 для идентификации фармацевтически эффективного соединения для лечения и/или профилактики заболевания, связанного с семейством сердечных рецепторов.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102014226663.7 | 2014-12-19 | ||
| DE102014226663.7A DE102014226663A1 (de) | 2014-12-19 | 2014-12-19 | Brückenassays zum Nachweis von Antikörpern gegen Mitglieder der kardialen Rezeptorfamilie |
| PCT/EP2015/080732 WO2016097400A1 (en) | 2014-12-19 | 2015-12-21 | Methods for the detection of antibodies against members of the cardiac receptor family |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017116436A3 RU2017116436A3 (ru) | 2019-01-21 |
| RU2017116436A RU2017116436A (ru) | 2019-01-21 |
| RU2707071C2 true RU2707071C2 (ru) | 2019-11-22 |
Family
ID=55069847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017116436A RU2707071C2 (ru) | 2014-12-19 | 2015-12-21 | Способы детектирования антител против членов семейства сердечных рецепторов |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20180143213A1 (ru) |
| EP (1) | EP3234615A1 (ru) |
| CN (1) | CN107407684A (ru) |
| DE (1) | DE102014226663A1 (ru) |
| RU (1) | RU2707071C2 (ru) |
| WO (1) | WO2016097400A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3243078A1 (en) | 2015-01-09 | 2017-11-15 | Atonomics A/S | A universal assay for determining the quantity of tnf inhibitory drugs and their corresponding anti-drug-antibodies |
| JP2019522199A (ja) * | 2016-07-08 | 2019-08-08 | アトノミックス アクティーゼルスカブ | 試料中の治療用モノクローナル抗体及びそれらの対応する抗薬物抗体の量を確定するためのユニバーサルアッセイ |
| EP4261131B1 (en) | 2022-04-14 | 2025-07-23 | Airbus Operations GmbH | Lavatory door system for a vehicle |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011132077A2 (en) * | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Hellenic Pasteur Institute | Diagnostic assay |
| EP2631653A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-28 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| JP5266459B2 (ja) | 2006-02-15 | 2013-08-21 | 国立大学法人三重大学 | 診断用組換えプロテオリポソームの作製法 |
-
2014
- 2014-12-19 DE DE102014226663.7A patent/DE102014226663A1/de not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-12-21 RU RU2017116436A patent/RU2707071C2/ru active
- 2015-12-21 CN CN201580068565.6A patent/CN107407684A/zh active Pending
- 2015-12-21 US US15/536,610 patent/US20180143213A1/en not_active Abandoned
- 2015-12-21 WO PCT/EP2015/080732 patent/WO2016097400A1/en not_active Ceased
- 2015-12-21 EP EP15820130.1A patent/EP3234615A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011132077A2 (en) * | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Hellenic Pasteur Institute | Diagnostic assay |
| EP2631653A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-28 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BUVALL L. et al. Antibodies against the beta1-adrenergic receptor induce progressive development of cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol. 2007 May; 42(5):1001-7. Epub 2007 Feb 15. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017116436A3 (ru) | 2019-01-21 |
| RU2017116436A (ru) | 2019-01-21 |
| CN107407684A (zh) | 2017-11-28 |
| WO2016097400A1 (en) | 2016-06-23 |
| DE102014226663A1 (de) | 2016-06-23 |
| EP3234615A1 (en) | 2017-10-25 |
| US20180143213A1 (en) | 2018-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6183809B2 (ja) | ペリオスチンの特定領域に結合する抗体及びこれを用いたペリオスチンの測定方法 | |
| WO2013132338A2 (en) | Competitive immunoassay for calprotectin | |
| US20170276675A1 (en) | Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family | |
| WO2020048340A1 (zh) | 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒 | |
| JP2023017986A (ja) | 自己抗体の直接イムノアッセイ測定法 | |
| RU2707071C2 (ru) | Способы детектирования антител против членов семейства сердечных рецепторов | |
| KR101794403B1 (ko) | 쇼그렌증후군 특이적 항체반응 검사를 이용한 쇼그렌증후군 진단방법 | |
| JP6797427B2 (ja) | 被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法 | |
| US20090029388A1 (en) | Detection of Antibodies | |
| WO2011052486A1 (en) | Immunological assay and immunological assay kit | |
| CN113260864A (zh) | 用于诊断极急性组织损伤的体液的硒结合蛋白1检测 | |
| JP2020519895A (ja) | 多発性硬化症の進行を検出する、サブタイプ分類する、および／または評価するための、診断用バイオマーカー | |
| JP6873460B2 (ja) | 被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法 | |
| CN120349419B (zh) | 可溶性生长刺激表达基因2蛋白抗体、检测试剂盒及其应用 | |
| US20250208131A1 (en) | Diagnosis of Congenital Heart Block | |
| JP5750646B2 (ja) | Ｓｃｃａ２濃度測定によるアレルギー疾患の検査方法 | |
| HK40089501A (zh) | 半乳糖凝集素-3的免疫测定 | |
| JPWO2006103813A1 (ja) | 核内受容体に対する結合物質の検出方法 |