RU2704449C2 - СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS14 - Google Patents
СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS14 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2704449C2 RU2704449C2 RU2017144336A RU2017144336A RU2704449C2 RU 2704449 C2 RU2704449 C2 RU 2704449C2 RU 2017144336 A RU2017144336 A RU 2017144336A RU 2017144336 A RU2017144336 A RU 2017144336A RU 2704449 C2 RU2704449 C2 RU 2704449C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rickettsia
- raoultii
- dns14
- genotype
- strain
- Prior art date
Links
- 241001506408 Rickettsia raoultii Species 0.000 title claims abstract description 31
- 208000034712 Rickettsia Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 206010061495 Rickettsiosis Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 241000606651 Rickettsiales Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 abstract description 29
- 208000031726 Spotted Fever Group Rickettsiosis Diseases 0.000 abstract description 8
- 201000004284 spotted fever Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000033220 Rickettsial disease Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 101150106096 gltA gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241001480824 Dermacentor Species 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001495400 Rickettsia slovaca Species 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000119571 Dermacentor silvarum Species 0.000 description 2
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 101150042350 gltA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 101150031431 opa gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000189107 spotted fever group Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000252254 Catostomidae Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100462378 Danio rerio otpb gene Proteins 0.000 description 1
- 241001372352 Dermacentor nuttalli Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010037855 Rash erythematous Diseases 0.000 description 1
- 241001468105 Rickettsia montanensis Species 0.000 description 1
- 241000606714 Rickettsia sp. Species 0.000 description 1
- 241000606683 Rickettsiaceae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000035056 Tick-Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к применению штамма Rickettsia raoultii «Шайман» генотипа DnSH, депонированного во Всероссийском музее риккетсиозных культур ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» МЗ России под номером 149, для разработки препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого Rickettsia raoultii генотип DnS14. Штамм может быть использован для идентификации риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на основании генотипических и фенотипических признаков и получения диагностических препаратов. 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм риккетсий «Шайман» является представителем вида Rickettsia raoultii, генотипа DnS14, изолированным на территории РФ. На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales, семейству Rickettsiaceae, роду Rickettsia, виду Rickettsia raoultii. Штамм «Шайман» при сравнения нуклеотидных последовательностей гена gltA и гена отрА имеет 99,9% и 100% гомологии соответственно с Rickettsia raoultii sp. DnS14 strain DnS14, описанному без изоляции штамма по образцу ДНК риккетсий из клещей Dermacentor nuttalli Рыдкиной с соавторами (Rydkina Е., Roux V., Fetisova N., Rudakov N., Gafarova M., Tarasevich I. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union. Emerg.Infect.Dis., 1999. - 5. - P. 811-814). Штамм «Шайман» культивируется в культуре клеток Vero и Нер-2.
Штамм R. raoultii генотипа DnS14 "Шайман" выделен в 2000 году из имаго клещей Dermacentor silvarum, собранных с растительности в республике Бурятия.
Штамм "Шайман" хранится во Всероссийском музее риккетсиозных культур ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» МЗ России под инвентарным номером 149 от 26.11.2002 г. Штамм "Шайман" также депонирован в коллекцию штаммов de 
des Rickettsies (CSUR), WHO-Collaborative Centre for Rickettsioses, Borrelioses and Tick-borne Infections, Marseille, France, под номером CSUR R8.
В 1999 году в клещах, собранных на территории России, с использованием амплификации и секвенирования rrs (16S rRNA), gltA и отрА генов были идентифицированы три новых, тесно генетически близких генотипа риккетсий: RpA4, DnS14 и DnS28 (Rydkina Е., Roux V., Fetisova N., Rudakov N., Gafarova M., Tarasevich I. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union. Emerg.Infect.Dis., 1999. - 5. - P. 811-814). В 2008 году эти генотипы описаны как принадлежащие к одному новому виду риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) (Rickettsia raoultii sp. nov. (Mediannikov О., Matsumoto K., Samoylenko I., Drancourt M., Roux V., Rydkina E. Rickettsia raoultii sp. nov., a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia // Intern. J. Syst. Evol. Microbiol, 2008. - V.58. - P. 1635-1639).
R. raoultii широко распространена в клещах преимущественно рода Dermacentor в России и Казахстане, а также в различных странах Евразии и Северной Африки (Рудаков Н.В, Шпынов С.Н, Самойленко И.Е, Оберт А.С. Клещевой риккетсиоз и риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в России. Омск: ИЦ «Омский научный вестник», 2011. - 232 с; Parola Р, Rovery С., Rolain J.M., Brouqui Р., Davoust В., and Raoult D. Rickettsia slovaca and R. raoultii in tick-borne rickettsioses // Emerg. Infect. Dis, 2009. - 15 (7). - P. 1105-1108).
Получены данные о роли этого нового вида риккетсий в возникновении синдрома TIBOLA (от англ. "tick-borne lymphadenopathy" - лимфаденопатия после присасывания клеща) или DEBONEL (Dermacentor-borne necrosis erythema and lymphadenopathy) (Ibarra V., Portillo A., Santibanez S., Blanco J.R., Perez-Martinez L., Marquez J. DEBONEL/TIBOLA: is Rickettsia slovaca the only etiological agent? // Ann. N.Y. Acad. Sci, 2005. - 1063. - P. 346-348), в том числе генотипа DnS14 (Mediannikov О., Matsumoto K. Samoylenko I., Drancourt M., Roux V., Rydkina E. Rickettsia raoultii sp. nov, a spotted fever group rickettsia associated with Dermacentor ticks in Europe and Russia // Intern. J. Syst. Evol. Microbiol, 2008. - V. 58. - P. 1635-1639; Parola P., Rovery C., Rolain J.M., Brouqui P., Davoust B., and Raoult D. Rickettsia slovaca and R. raoultii in tick-bome rickettsioses // Emerg. Infect. Dis, 2009. - 15 (7). - P. 1105-1108;.
В Китае описано два случая инфекции, связанной с R. raoultii (Jia N., Zheng Y.-C., Ma 1., Huo Q.-B., Ni X.-B., Jiang B.-G., Chu Y.-L., Jiang R.-R., Jiang J.-F., Cao W.-C. Human infections with Rickettsia raoultii, China // Emer. Inf. Dis., 2014. - 20 (5). - P. 866-868), при отсутствии классической клиники клещевого риккетсиоза или синдрома TIBOLA, с преобладанием местных проявлений на месте присасывания клеща в виде болезненной эритематозной сыпи.
Заболеваемость риккетсиозом, вызываемым R. raoultii, в настоящее время в России не регистрируется, поскольку диагностические препараты для верификации данного заболевания в РФ не выпускаются. Диагноз риккетсиоза, ассоциированного с R. raoultii, может быть поставлен только при лабораторном обследовании с использованием тест-систем на основе производственных штаммов вида R. raoultii.
Задача изобретения - оригинальный штамм вида Rickettsia raoultii DnS14, который может быть использован для разработки и изготовления диагностических препаратов (наборов реагентов).
Технический результат - использование штамма Rickettsia raoultii «Шайман» в качестве производственного штамма при разработке и изготовлении препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого R. raoultii. Заявляемый штамм обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как: генетическая идентичность типовому штамму R. raoultii, способность активно размножаться на культуре клеток Vero Е6, Нер-2 и накапливать производственную биомассу в процессе культивирования, что позволяет использовать его для серийного (коммерческого) выпуска диагностических препаратов (наборов реагентов). Использование штамма Rickettsia raoultii «Шайман» в качестве продуцента диагностических препаратов позволяет оптимизировать лабораторную диагностику риккетсиозов.
Генотипические характеристики.
Выделенный штамм R. raoultii «Шайман» характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Типичны для риккетсий, но чаще встречаются кокковидные и палочковидные формы (типы а и b по классификации П.Ф. Здродовского). Грамотрицательны.
Культуралъные свойства.
1. Успешно пассируются в культурах клеток Vero и Нер-2 с накоплением до 10-15 риккетсий в поле зрения, с локализацией как в цитоплазме, так и в ядрах клеток.
2. Успешно пассируется в организме иксодовых клещей рода Dermacentor, характеризуется высоким уровнем вертикальной передачи. При моделировании естественного цикла метаморфоза в первом поколении переносчиков (F1) уровень трансовариальной передачи риккетсий составил 98%, уровень трансфазовой передачи - 100%. Средний уровень накопления риккетсий в голодных личинках - 10, после кровопитания личинок на сосунках белых мышей - 55 микробных клеток в поле зрения (тотальные мазки исследованы в МФА с поликлональными антителами к риккетсиям группы КПЛ). Средний уровень накопления риккетсий в голодных нимфах составил - 8, после кровопитания нимф 50 микробных клеток в поле зрения. Штвмм изолирован с использованием клещевой экспериментальной модели и высушен из имаго второго поколения естественно инфицированной линии клещей D. silvarum.
Антигенные свойства. Антигенные детерминанты R. raoultii выявляются методом флюоресцирующих антител с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки люминесцирующими, сухими (Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед», г. Пермь). Антигенные свойства соответствуют риккетсиям группы КПЛ по данным МФА с поликлональными антителами к риккетсиям группы КПЛ.
Определена нуклеотидная последовательность гена ОтрА, кодирующего 190 - kD белок наружной мембраны риккетсий, получена последовательность нуклеотидов длиной 454 п. о.:
При идентификации в GenBank данная последовательность нуклеотидов имела 100% гомологии с Rickettsia DnS14 strain DnS14, депонированной в GenBank под номером АН009130.2.
Определена нуклеотидная последовательность гена цитрат синтазы (gltA) длиной 762 пары оснований штамма «Шайман», которая имела 99,9% гомологии с последовательностью гена цитрат синтазы Rickettsia sp. DnS14 strain DnS14, депонированной в GenBank под номером AF120028:
На основании морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный штамм относен к роду Rickettsia виду Rickettsia raoultii, генотипу DnS14.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Идентификация на основании генотипических признаков.
Экстракция ДНК
Экстракцию риккетсиальной ДНК из пробы культур клеток осуществляют, применяя QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) и протеиназу К в концентрации 2,0 мг/мл (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) в соответствии с протоколом QIAamp Tissue Kit.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенс-реакция.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенс-реакцию выполняют, применяя праймеры, специфичные для Rickettsiae, используют две пары праймеров, амплифицирующие gltA ген, кодирующий цитрат синтетазу: CSld (ATGACTAATGGCAATAATAA) и CS535r (GAATATTTATAAGACAT-TGC), CS409d (CCTATGGCTATTATGCTTGC) и RP1258n (ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA), а также праймеры 190.70 (ATGGCGAATATTTCTCCAAAA), 190.180 (GCAGCGATAATGCTGAGTA) и 190.701 (GTTCCGTTAATGGCAGCATCT), амплифицирующие ompA ген, кодирующий белок наружной мембраны (Roux, V., et al., 1997; Fournier, P-E., et al., 1998).
Однораундовую ПЦР выполняют в термоциклере Peltier модель РТС-200 (Mj Research, Inc, Watertown, MA). Реакцию амплификации выполняют в объеме 25 мкл, в присутствии 5 пкМ каждого праймера и 1 ед. Taq-полимеразы, 2,5 мкл смеси дезоксинуклеотидов трифосфатов (2% dATP, 2% dCTP, 2% dTTP, 2% dGTP в стерильной воде), 1 мкл 25 mM раствора MgCl2, 2,5 мкл 10х реакционного буфера (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.). Профиль амплификации включает начальную денатурацию в течение 15 минут при 95°С, 39 циклов амплификации (денатурация при 94°С-60 с, отжиг праймеров при 54°С - 30 с, элонгация при 72°С - 60 с) и финальную элонгацию в течение 5 минут при 72°С. Каждая постановка ПЦР включает отрицательный контроль (дистиллированная вода) и положительный контроль (ДНК R. montanensis).
Пурификацию ПЦР-продукта проводят, применяя QIAquick PCR Purification Kit (Germany) в соответствии с протоколом.
Секвенс-реакцию с ПЦР-продуктами выполняют, применяя d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosistems, Warrington, UK). Секвенирование выполняют на ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems) автоматическом секвенаторе. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей для сравнения степени гомологии с последовательностями Банка данных GenBank проводят с помощью программы BLAST в режиме прямого доступа.
Пример 2. Культивирование риккетсий и идентификация на основании фенотипических (культуральных и антигенных) свойств.
2.1. Культивирование риккетсий с использованием экспериментальной клещевой модели.
Культивирование и изучение уровня трансовариальной и трансфазовой передачи проводят с использованием экспериментальной клещевой модели (Тагильцев А.А., Тарасевич Л.Н., Богданов И.И., Якименко В.В. Изучение членистоногих убежищного комплекса в природных очагах трансмиссивных вирусных инфекций: Руководство по работе в полевых и лабораторных условиях, - Томск, 1990) в сочетании с методами выявления и изучения риккетсий. Кормление пары естественно инфицированных имаго клещей (самка и самец) проводят на взрослых лабораторных животных (морские свинки или белые мыши). Появившееся потомство содержат в серийных кормлениях-линьках «личинка-нимфа-имаго». Для определения наличия риккетсий в потомстве образцы появившихся личинок и нимф исследуют методом флюоресцирующих антител с поликлональными антителами как в голодном состоянии, так и после напитывания.
2.2. Культивирование риккетсий с использованием перевиваемых культур клеток.
Версенизация и выращивание клеточных культур.
Для работы культуры клеток Vero Е6 и Нер-2 подвергают версенизации по стандартной методике Соловьева В.Д., Бектемирова Т.А. (1972 г.), в матрац добавляют раствор Версена до конечной концентрации 0,25% и раствор трипсина также до концентрации 0,25%. На флакон с культуральной поверхностью 25 см достаточно 0,5 мл раствора. Его равномерно распределяют по слою клеток покачиванием флакона, выдерживают при 37°С до тех пор, пока все клетки не отделятся от ростовой поверхности (проверяют под инвертированным микроскопом), энергично постукивают по стенке флакона; отделившиеся клетки ресуспендируют в ростовой среде (4,5 мл на флакон с ростовой поверхностью 25 см2), которая останавливает действие трипсина. Суспензию пипетируют, чтобы раздробить агрегаты клеток, разводят суспензию клеток ростовой средой Игла MEM с двойным набором аминокислот до нужной концентрации, основываясь на подсчете клеток: 150 тыс. в 1 мл. К общему объему добавляют эмбриональную сыворотку до концентрации 5%. Рассевают полученную клеточную суспензию в культуральные флаконы или пробирки, плотно закрывают и помещают в термостат при 37°С. Когда монослой почти сформирован (1-2 дня) заменяют ростовую среду поддерживающей средой. Культуры клеток обычно перевивают каждые 5-7 дней.
Заражение культур клеток.
Клеточную культуру во флаконе заражают 50%-ой суспензией, приготовленной из лиофильно высушенных штаммов, в объеме 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками центрифугируют при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки) в объеме 1,5 мл на флакон (Raoult D., 2000). Флаконы с зараженными клетками инкубируют в углекислотном термостате при температуре 37°С в течение 8-14 суток, в зависимости от культуры клеток. После чего флаконы подвергают замораживанию при температуре минус 20°С, затем размораживают при комнатной температуре, для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После размораживания, материал в объеме 0,5 мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике при температуре минус 20°С. Степень накопления риккетсий и отсутствие посторонней микрофлоры определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому - Гимза.
Полученные образцы кроме того исследуют методом флюоресцирующих антител по стандартной методике, используюя иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы КПЛ, антитела люминесцирующие сухие (НПО «Биомед). Изучение морфологических и тинкториальных свойств, проводят по методу Здродовского (Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М., 1972).
2.3 Изучение антигенных свойств.
Антигенные детерминанты Rickettsia raoultii генотипа DnS14 в клещах и на культуре клеток выявляют методом флюоресцирующих антител с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ, люминесцирующими, сухими (НПО «Биомед»).
Пример 3. Приготовление корпускулярного антигена.
После завершения культивирования культуру зараженных клеток замораживают в низкотемпературном холодильнике при минус 20°С, а потом размораживают для разрушения клеток и максимального выхода из них риккетсий. Материал центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Супернатант используют для нанесения корпускулярного антигена на стекла и проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции для исследования сывороток крови больных после присасывания иксодовых клещей.
Пример 4. Приготовление цельнорастворимых антигенов
Для приготовления антигена зараженные культуры клеток подвергают центрифугированию при 6000 оборотах в минуту в течение 60 минут, далее удаляют супернатант, а из полученной взвеси делают мазки, которые окрашивают по Романовскому - Гимза.
После микроскопического контроля во взвесь зараженных клеток 0,5%. Фенол (0,5 мл цельного фенола плюс 99,5 мл забуференного физиологического раствора рН 7,0) из расчета 2 мл фенола на 1 мл клеточной взвеси. После встряхивания в шейкере пробирки с зараженной клеточной взвесью помещают в рефрижератор на 3-4 дня для осаждения посторонних белковых примесей.
После этого клеточную взвесь подвергают многократной эфирной обработке по Craigie (1945 г.). При первой эфирной обработке к материалу добавляют 1,5-2 объема наркозного эфира и после встряхивания оставляют при комнатной температуре до следующего дня в темном месте. Затем водную фазу отделяют, и второй раз обрабатывают эфиром (равный объем эфира в отношении водной фазы), встряхивают и оставляют на 2 часа, затем водную фазу вновь отделяют и в третий раз обрабатывают эфиром (1/2 объема эфира по отношению к объему водной фазы) таким же образом.
При образовании среднего тканевого слоя после третьей обработки делают еще одну эфирную обработку с таким же соотношением эфира и водной фазы. После окончания эфирной обработки производят отгонку эфира под небольшим вакуумом. Пробирки с антигеном оставляют в течение суток в холодильнике при температуре 6+2°С для испарения эфира. Полученные серии антигенов испытывают в реакции связывания комплемента (РСК) на антикомплементарность, специфичность, чувствительность и определяют титр. Также антигены стандартизуют по уровню аминного азота методом формольного титрования (%) и белка с помощью биуретовой реакции (%). После испытания антигены разливают в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивают. Высушенный антиген хранят при температуре минус 20°С.
Таким образом, по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей гена gltA и гена отрА штамм имеет 99,9% и 100% гомологии соответственно с Rickettsia raoultii генотип DnS14 (strain DnS14), активно размножается на культурах клеток Vero Е6 и Нер-2, что позволяет в процессе культивирования накапливать производственную биомассу. С учетом этого, он может быть использован в качестве производственного штамма при разработке и изготовлении препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого Rickettsia raoultii генотипа DnS14.
Claims (1)
- Применение штамма Rickettsia raoultii «Шайман» генотипа DnS14, депонированного во Всероссийском музее риккетсиозных культур ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» МЗ России под номером 149, для разработки препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого Rickettsia raoultii генотипа DnS14.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144336A RU2704449C2 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS14 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144336A RU2704449C2 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS14 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017144336A3 RU2017144336A3 (ru) | 2019-06-18 |
| RU2017144336A RU2017144336A (ru) | 2019-06-18 |
| RU2704449C2 true RU2704449C2 (ru) | 2019-10-28 |
Family
ID=66947361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017144336A RU2704449C2 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS14 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2704449C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2616287C1 (ru) * | 2015-12-07 | 2017-04-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS28 |
-
2017
- 2017-12-18 RU RU2017144336A patent/RU2704449C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2616287C1 (ru) * | 2015-12-07 | 2017-04-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS28 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| САМОЙЛЕНКО И.Е., Изучение адаптации Rickettsia raoultii к основным переносчикам - клещам рода Dermacentor с использованием экспериментальных методов, Сибирский медицинский журнал (Иркутск), том 120, N5, 2013, с.59-61, найдено в интернет 24.05.2019, адрес сайта www.smj.ismu.baikal.ru/index.php/osn/issue/archive. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017144336A3 (ru) | 2019-06-18 |
| RU2017144336A (ru) | 2019-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mirelman et al. | Changes in isoenzyme patterns of a cloned culture of nonpathogenic Entamoeba histolytica during axenization | |
| Kosoy et al. | Identification of Bartonella infections in febrile human patients from Thailand and their potential animal reservoirs | |
| Ebert et al. | Development, life cycle, ultrastructure and phylogenetic position of Pasteuria ramosa Metchnikoff 1888: rediscovery of an obligate endoparasite of Daphnia magna Straus | |
| Kosoy et al. | Bartonella melophagi in blood of domestic sheep (Ovis aries) and sheep keds (Melophagus ovinus) from the southwestern US: cultures, genetic characterization, and ecological connections | |
| US5869335A (en) | Method of growing rickettsiae in Ixodes scapularis tick cell culture and preparing antigens and vaccines of rickettsiae | |
| RU2654586C2 (ru) | Рекомбинационная кассета, содержащая гены EP153R и EP364R штамма Congo (КК-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм ΔСongoCD2v вируса африканской чумы свиней | |
| Kalender et al. | Identification of Chlamydophila abortus infection in aborting ewes and goats in Eastern Turkey | |
| Homberger et al. | Detection of rodent coronaviruses in tissues and cell cultures by using polymerase chain reaction | |
| Al-Mariri | Isolation of Brucella melitensis strains from Syrian bovine milk samples. | |
| RU2606254C1 (ru) | Штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum, рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота | |
| Hassanzadeh et al. | Molecular characterization of Ornithobacterium rhinotracheale isolated from broiler chicken flocks in Iran | |
| RU2616287C1 (ru) | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS28 | |
| RU2704449C2 (ru) | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA RAOULTII ГЕНОТИПА DnS14 | |
| RU2560422C2 (ru) | Средство для получения препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого rickettsia slovaca | |
| CN108707589B (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒SMU-Z6/1a/SC/2016分离株及其应用 | |
| RU2770815C1 (ru) | Штамм "Тюмень/2019" вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота | |
| ØIE et al. | Detection ofAeromonas salmonicidaby polymerase chain reaction in Atlantic salmon vaccinated against furunculosis | |
| RU2354691C1 (ru) | Штамм риккетсий генотипа "candidatus rickettsia tarasevichiae" - кандидат в новый вид, используемый для идентификации риккетсий и получения диагностических препаратов | |
| RU2723410C2 (ru) | Средство для получения препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого rickettsia sibirica subsp. sibirica | |
| CN103993072A (zh) | 一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重pcr检测试剂盒及其方法 | |
| Intarapuk et al. | Identification of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar by PCR assay of fecal specimens obtained from Thai/Myanmar border region | |
| RU2560581C2 (ru) | СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA SIBIRICA subsp. SIBIRICA BJ-90 | |
| RU2728342C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ выявления пестивируса Н крупного рогатого скота | |
| CN101205528A (zh) | 一种螺原体菌株及其应用 | |
| Sae-Chew et al. | Generation of protoplasts provides a powerful experimental research tool for biological and pathogenicity studies of Pythium insidiosum |