RU2704326C1

RU2704326C1 - N-methoxybenzyl derivatives of daunorubicin having antiproliferative properties

Info

Publication number: RU2704326C1
Application number: RU2019121378A
Authority: RU
Inventors: Олег Иванович Артюшин; Александра Андреевна Моисеева; Валерий Кузьмич Брель; Лада Владимировна Аникина
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2019-10-28

Abstract

FIELD: chemistry.SUBSTANCE: invention relates to N-methoxybenzyl derivatives of daunorubicin of general formula I, where R=H, OCH.EFFECT: obtaining novel compounds having good antiproliferative properties with relatively low acute toxicity, which can be used in medicine for treating oncological diseases, in particular non-small-cell lung cancer, rhabdomyosarcoma, intestinal carcinoma, adenocarcinoma of the mammary gland.1 cl, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, конкретно к новым N-метоксибензильным производным даунорубицина формулы I, обладающим антипролиферативными свойствами,The invention relates to the field of pharmaceuticals and medicine, specifically to new N-methoxybenzyl derivatives of daunorubicin of the formula I having antiproliferative properties,

где R=Н (а), ОСН₃ (b),where R = H (a), OCH ₃ (b),

и их фармацевтически приемлемым солям.and their pharmaceutically acceptable salts.

Изобретение может быть использовано для лечения онкологических заболеваний, связанных с пролиферацией опухолевых клеток, в частности немелкоклеточного рака легкого, рабдомиосаркомы, карциномы кишечника, аденокарциномы молочной железы.The invention can be used to treat cancer associated with the proliferation of tumor cells, in particular non-small cell lung cancer, rhabdomyosarcoma, intestinal carcinoma, breast adenocarcinoma.

В настоящее время для лечения перечисленных заболеваний в медицинской практике широко применяется противоопухолевый препарат даунорубицин (II) [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2016, с. 999].Currently, the treatment of these diseases in medical practice is widely used antitumor drug daunorubicin (II) [Mashkovsky M.D. Medicines M .: New wave, 2016, p. 999].

Однако это соединение обладает высокой кардиотоксичностью, его применение в химиотерапии рака сопряжено с рядом побочных эффектов, присущих соединениям антрациклиновой структуры [Woodman R.J., Cysyk R.L., Kline I., Gang M., Venditti J.M. Cancer Chemother. Rep., 1975, 59 (4), 689-695; Thorn C.F., Oshiro C., Marsh S., Hernandez-Boussard Т., McLeod H., Klein Т.Е., Altman R.B. Pharmacogenetics & Genomics, 2011, 21 (7), 440-446].However, this compound has high cardiotoxicity, its use in cancer chemotherapy is associated with a number of side effects inherent in compounds of anthracycline structure [Woodman R.J., Cysyk R.L., Kline I., Gang M., Venditti J.M. Cancer Chemother. Rep., 1975, 59 (4), 689-695; Thorn C.F., Oshiro C., Marsh S., Hernandez-Boussard T., McLeod H., Klein T.E., Altman R.B. Pharmacogenetics & Genomics, 2011, 21 (7), 440-446].

Антипролиферативными свойствами обладает и целый ряд производных даунорубицина. Однако они так же, как и сам даунорубицин, проявляя антипролиферативную активность в субмикромолярных концентрациях, имеют высокую кардиотоксичность [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2016, с. 998-201; Olsufyeva T.N., Tevyashova A.N., Trestchalin I.D., Preobrazhenskaya M.N., Platt D., Klyosov A.A. Carbohydrate Research, 2003, 338 (13), 1359-1367].A number of daunorubicin derivatives also have antiproliferative properties. However, they, like daunorubicin itself, exhibiting antiproliferative activity in submicromolar concentrations, have high cardiotoxicity [Mashkovsky MD Medicines M .: New wave, 2016, p. 998-201; Olsufyeva T.N., Tevyashova A.N., Trestchalin I.D., Preobrazhenskaya M.N., Platt D., Klyosov A.A. Carbohydrate Research, 2003, 338 (13), 1359-1367].

Существует потребность в расширении арсенала противоопухолевых средств за счет соединений, проявляющих сильное антипролиферативное действие в отношении различных опухолевых образований и характеризующихся при этом низкой токсичностью.There is a need to expand the arsenal of antitumor agents due to compounds exhibiting a strong antiproliferative effect against various tumor formations and characterized by low toxicity.

Такой потребности удовлетворяют наиболее близкие к заявляемым соединениям N-пиперонильные производные даунорубицина IIIa и IIIb, обладающие высокой антипролиферативной активностью и относительно низкой острой токсичностью [Брель В.К., Артюшин О.И., Шарова Е.В., Генкина Г.К., Виноградова Н.М., Моисеева А.А., Клочков С.Г., Аникина Л.В. Патент РФ №2642068; Бюл. №3 (2018)].Such needs are met by the N-piperonyl derivatives of daunorubicin IIIa and IIIb closest to the claimed compounds, which have high antiproliferative activity and relatively low acute toxicity [Brel V.K., Artyushin O.I., Sharova E.V., Genkina G.K. , Vinogradova N.M., Moiseeva A.A., Klochkov S.G., Anikina L.V. RF patent No. 2642068; Bull. No. 3 (2018)].

Задачей настоящего изобретения является создание новых, более эффективных, производных даунорубицина, обладающих широким спектром антипролиферативных свойств при относительно низкой острой токсичности.The present invention is the creation of new, more effective, derivatives of daunorubicin, with a wide range of antiproliferative properties with relatively low acute toxicity.

Задача решается новыми N-метоксибензильными производными даунорубицина общей формулыThe problem is solved by new N-methoxybenzyl derivatives of daunorubicin of the general formula

где R=Н (Ia), ОСН₃ (Ib),where R = H (Ia), OCH ₃ (Ib),

и их фармацевтически приемлемыми солями.and their pharmaceutically acceptable salts.

Указанные соединения обладают высокой антипролиферативной активностью, существенно превосходящей активность ближайших структурных аналогов IIIa и IIIb, содержащих 1,3-бенздиоксолилметильную группу при атоме азота даунорубицина, и относительно низкой острой токсичностью, сравнимой с токсичностью замещенных даунорубицинов IIIa и IIIb.These compounds have high antiproliferative activity, significantly superior to the activity of the nearest structural analogues IIIa and IIIb containing a 1,3-benzodioxolylmethyl group at the daunorubicin nitrogen atom, and relatively low acute toxicity comparable to the toxicity of substituted daunorubicins IIIa and IIIb.

Заявляемые соединения формулы I, их физико-химические свойства и биологическая активность ранее не были известны.The inventive compounds of formula I, their physicochemical properties and biological activity were not previously known.

Соединения формулы I получали восстановительным алкилированием даунорубицина ароматическими альдегидами аналогично описанному в [Masquelier М., Tirzitis G., Peterson C.O., Palsson M., Amolins A., Plotniece M., Plotniece A., Makarova N., Vitols S.G. Eur. J. Med Chem., 2000, 35 (4), 429-438] по приведенной ниже схеме, используя в качестве исходных соединений даунорубицина гидрохлорид и соответствующие 2,4-ди- и 2,4,5-триметоксибензальдегиды, а в качестве восстановителя - цианоборгидрид натрия:Compounds of formula I were prepared by reductive alkylation of daunorubicin with aromatic aldehydes as described in [Masquelier M., Tirzitis G., Peterson C. O., Palsson M., Amolins A., Plotniece M., Plotniece A., Makarova N., Vitols S.G. Eur. J. Med Chem., 2000, 35 (4), 429-438] according to the scheme below, using daunorubicin hydrochloride and the corresponding 2,4-di- and 2,4,5-trimethoxybenzaldehydes as starting compounds, and as a reducing agent - sodium cyanoborohydride:

Реакцию проводили в среде водного ацетонитрила при комнатной температуре (20-25°С) и получали соединение Ia с выходом 36%, а соединение Ib с выходом 47%.The reaction was carried out in aqueous acetonitrile at room temperature (20-25 ° C) and compound Ia was obtained in 36% yield, and compound Ib in 47% yield.

Структура соединений Ia и Ib доказана данными спектроскопии ЯМР (¹Н и ¹³С), а индивидуальность и химическая чистота - данными элементного анализа.The structure of compounds Ia and Ib was proved by NMR spectroscopy ( ¹ H and ¹³ C), and the individuality and chemical purity by elemental analysis.

Исследование антипролиферативной активности заявляемых соединений показало наличие ингибирующего действия в отношении целого ряда опухолей мышечной ткани: рабдомиосаркомы (RD), карциномы кишечника (НСТ116), аденокарциномы молочной железы (MCF7) - и немелкоклеточного рака легкого (А549) (см. таблицу, в которой приведены IC₅₀ - концентрации соединений, вызывающие 50%-ное ингибирование роста популяции клеток).A study of the antiproliferative activity of the claimed compounds showed the presence of an inhibitory effect against a number of muscle tissue tumors: rhabdomyosarcoma (RD), intestinal carcinoma (HCT116), breast adenocarcinoma (MCF7) - and non-small cell lung cancer (A549) (see table, which shows IC ₅₀ - concentration of compounds causing 50% inhibition of cell population growth).

Анализ данных, приведенных в таблице, показывает, что заявляемые соединения существенно превосходят по величине антипролиферативного действия как ближайшие структурные аналоги, так и эталонный препарат - даунорубицин.Analysis of the data given in the table shows that the claimed compounds significantly exceed the nearest structural analogues and the reference preparation daunorubicin in terms of antiproliferative effect.

Анализ острой токсичности заявляемых соединений Ia и Ib показал, что их LD₅₀ (при внутрибрюшинном введении мышам) составляет 112,0 и 59,0 мг/кг соответственно, т.е. они относятся к умеренно (Ia) и мало (Ib) токсичным веществам по классификации токсичности Сидорова [Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. - В сб.: Токсикология новых промышленных химических веществ (вып. 13). М.: Медицина, 1973, 47-51], тогда как даунорубицин относится к высокотоксичным веществам: его LD₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам составляет 1,8 мг/кг [Woodman R.J., Cysyk R.L., Kline I., Gang М., Venditti J.M. Cancer Chemother. Rep., 1975, 59 (4), 689-695]. Таким образом, острая токсичность заявляемых соединений соответственно в 62 и 32 раза ниже острой токсичности широко применяемого препарата даунорубицина.An acute toxicity analysis of the claimed compounds Ia and Ib showed that their LD ₅₀ (with intraperitoneal administration to mice) is 112.0 and 59.0 mg / kg, respectively, i.e. they belong to moderately (Ia) and little (Ib) toxic substances according to Sidorov's toxicity classification [Sidorov K.K. On the classification of toxicity of poisons with parenteral routes of administration. - In collection: Toxicology of new industrial chemicals (issue 13). M .: Medicine, 1973, 47-51], while daunorubicin is a highly toxic substance: its LD ₅₀ when administered intraperitoneally to mice is 1.8 mg / kg [Woodman RJ, Cysyk RL, Kline I., Gang M., Venditti JM Cancer Chemother. Rep., 1975, 59 (4), 689-695]. Thus, the acute toxicity of the claimed compounds, respectively, 62 and 32 times lower than the acute toxicity of the widely used drug daunorubicin.

Сравнение заявляемых соединений Ia и Ib с ближайшими структурными аналогами, соединениями IIIa и IIIb, показывает, что соединение Ia более токсично, чем соединения IIIa и IIIb (правда, всего в 1,8 раза), а соединение Ib характеризуется чуть меньшей острой токсичностью, по сравнению с соединениями IIIa и IIIb. Однако по антипролиферативному действию заявляемые соединения Ia и Ib в 2, 5, 10, 220 и даже 1570 раз (в случае линии немелкоклеточного рака легкого А549) более эффективны, по сравнению с соединениями IIIa и IIIb, что позволяет заключить: новые N-метоксибензильные производные даунорубицина по изобретению обладают более высокими значениями химиотерапевтического индекса.Comparison of the claimed compounds Ia and Ib with the nearest structural analogues, compounds IIIa and IIIb, shows that compound Ia is more toxic than compounds IIIa and IIIb (only 1.8 times, however), and compound Ib is characterized by slightly less acute toxicity, compared with compounds IIIa and IIIb. However, according to the antiproliferative effect, the claimed compounds Ia and Ib are 2, 5, 10, 220 and even 1570 times (in the case of the non-small cell lung cancer line A549) more effective than compounds IIIa and IIIb, which allows us to conclude: new N-methoxybenzyl derivatives daunorubicin according to the invention have higher chemotherapeutic index values.

Сочетание широкого спектра эффективного антипролиферативного действия и относительно низкой острой токсичности заявляемых соединений свидетельствует о потенциальной возможности их использования для лечения онкологических заболеваний, связанных с пролиферацией опухолевых клеток.The combination of a wide spectrum of effective antiproliferative action and relatively low acute toxicity of the claimed compounds indicates the potential for their use in the treatment of cancer associated with the proliferation of tumor cells.

Технический результат настоящего изобретения состоит в создании новых умеренно и малотоксичных производных даунорубицина, существенно превосходящих по антипролиферативному действию ближайшие структурные аналоги и эталонный препарат даунорубицин.The technical result of the present invention is to create new moderately and low toxic derivatives of daunorubicin, significantly superior in antiproliferative effect to the nearest structural analogues and the reference preparation daunorubicin.

Для получения заявляемых соединений использовали следующие коммерческие реагенты и растворители: даунорубицин, 2,4-ди- и 2,4,5-триметоксибензальдегиды (Acros Organics), ацетонитрил, сульфат натрия (осушитель), силикагель для колоночной хроматографии, метанол, хлороформ (Acros Organics).The following commercial reagents and solvents were used to obtain the claimed compounds: daunorubicin, 2,4-di- and 2,4,5-trimethoxybenzaldehydes (Acros Organics), acetonitrile, sodium sulfate (desiccant), column chromatography silica gel, methanol, chloroform (Acros Organics).

Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными примерами и данными таблицы, которые не ограничивают объем заявляемого изобретения.The present invention is illustrated by the examples and table data, which do not limit the scope of the claimed invention.

Пример 1. Получение (9S-цис)-9-ацетил-7-{[3-(2,4-диметоксибензил)амино-2,3,6-тридезокси-алъфа-L-ликсогексопиранозил]окси}-7,8,9,10-тетрагидро-6,9,11-тригидрокси-4-метокси-5,12-нафтацендиона (Ia)Example 1. Obtaining (9S-cis) -9-acetyl-7 - {[3- (2,4-dimethoxybenzyl) amino-2,3,6-tridesoxy-alpha-L-lixoghexopyranosyl] oxy} -7.8, 9,10-tetrahydro-6,9,11-trihydroxy-4-methoxy-5,12-naphthacenedione (Ia)

В колбу, защищенную от света черной бумагой, помещают раствор 0,60 г (3,6 ммоль) 2,4-диметоксибензальдегида в смеси 6 мл CH₃CN и 2 мл воды, к нему прибавляют 0,1 г (0,18 ммоль) даунорубицина гидрохлорида и перемешивают 30 мин при ~20°С,. после чего прибавляют 0,034 г (0,53 ммоль) NaBH₃CN (содержание основного вещества не менее 98%) и перемешивают при той же температуре 2 ч. Реакционную смесь разлагают добавлением 15 мл воды и 15 мл CHCl₃, органический слой отделяют, водный экстрагируют CHCl₃ (3×15 мл). Объединенные органические экстракты промывают 30 мл воды, водный экстракт промывают CHCl₃ (2×15 мл), органические экстракты объединяют и сушат Na₂SO₄. Растворитель удаляют на роторном испарителе, остаток очищают хроматографией на силикагеле (колонка:

см, d 2 см). Сначала хлороформом элюируют избыток альдегида, затем смесью CHCl₃:МеОН=50:1,5 - целевой продукт ярко-красного цвета. После отгонки растворителей его сушат в вакууме над Р₂О₅ до постоянного веса. Получают 44 мг (36%) кристаллического соединения Ia, разлагающегося при нагревании до 200°С (до наступления плавления).In a flask protected from light by black paper, a solution of 0.60 g (3.6 mmol) of 2,4-dimethoxybenzaldehyde in a mixture of 6 ml of CH ₃ CN and 2 ml of water is placed, 0.1 g (0.18 mmol) of it are added. ) daunorubicin hydrochloride and stirred for 30 minutes at ~ 20 ° C. after which 0.034 g (0.53 mmol) of NaBH ₃ CN (content of the basic substance of not less than 98%) is added and stirred at the same temperature for 2 hours. The reaction mixture is decomposed by adding 15 ml of water and 15 ml of CHCl ₃ , the organic layer is separated, aqueous extracted with CHCl ₃ (3 × 15 ml). The combined organic extracts were washed with 30 ml of water, the aqueous extract was washed with CHCl ₃ (2 × 15 ml), the organic extracts were combined and dried with Na ₂ SO ₄ . The solvent was removed on a rotary evaporator, the residue was purified by silica gel chromatography (column:

cm, d 2 cm). First, excess aldehyde is eluted with chloroform, then with a mixture of CHCl ₃ : MeOH = 50: 1.5 — the target product is bright red. After distillation of the solvents, it is dried in vacuum over P ₂ O ₅ to constant weight. Obtain 44 mg (36%) of crystalline compound Ia, decomposing when heated to 200 ° C (before melting).

¹H ЯМР-спектр (CDCl₃, 400,13 МГц), δ, м.д.: 1,39 (д, 3H, ³J_HH=6,4 Гц, 5'-СН₃); 1,74-1,77 и 1,91-1,95 (два м, 1Н+1H, 2'-СН₂); 2,09 (дд, 1Н, ²J_HH=14,0 Гц, ³J_HH=4,0 Гц, 8-H_B); 2,37 (д, 1H, ²J_HH=14,0 Гц, 8-Н_А); 2,43 (с, 3H, 14-СН₃); 2,87 и 3,16 (два д, 1Н+1H, ²J_HH=16,0 Гц, 10-СН₂); 2,95 (уш. с, 1H, 3'-Н); 3,58 и 3,64 (два д, 1Н+1H, ²J_HH=14,4 Гц, N-CH₂); 3,74 (уш. с, 6Н, 4''-ОСН₃+6''-ОСН₃); 3,79 (уш. с, 1Н, 4'-Н); 4,05 (кв, 1H, ³J_HH=6,8 Гц, 5'-Н); 4,07 (с, 3H, 4-ОСН₃); 4,80 (уш. с, 1Н, NH); 5,25 (уш. с, 1Н, 7-Н); 5,50 (уш. с, 1Н, 1'-Н); 6,31 (д, 1Н, ³J_HH=7,8 Гц, 2''-Н); 6,35 (уш. с, 1H, 5''-Н); 7,01 (д, 1Н, ³J_HH=7.8 Гц, 3''-Н); 7,36 (д, 1Н, ³J_HH=8.0 Гц, 3-Н); 7,75 (т, 1Н, ³J_HH=8,0 Гц, 2-Н); 7,99 (д, 1Н, ³J_HH=8,0 Гц, 1-Н); 13,22 (уш. с, 1Н, 11-ОН); 13,87 (уш. с, 1H, 6-ОН). ¹³С ЯМР-спектр (CDCl₃, 100,61 МГц), δ, м.д.: 17,10 (5'-СН₃); 24,68 (14-СН₃); 27,80 (2'-С); 33,14 (8-С); 34,66 (10-С); 48,08 (N-CH₂); 54,97 (3'-С); 55,09 и 56,44 (4''-ОСН₃+6''-ОСН₃); 66,85 (4-ОСН₃); 68,01 (5'-С); 69,47 (7-С); 76,69 (9-С); 98,20 (1'-С); 101,34 (5''-С); 103,53 (уш. с, 2''-С+3''-С); 110,94 (5а-С); 111,07 (11а-С); 118,18 (1-С); 119,51 (2-С); 120,14 (10а-С); 120,65 (1''-С); 130,91 (4а-С); 134,23 (6а-С); 134,32 (12а-С); 135,43 (3-С); 155,62 (11-С); 156,28 (6-С); 158,05 (4-С); 159,55 и 160,77 (6''-С+4''-С); 186,36 (5-С); 186,62 (12-С); 211,95 (13-С). Вычислено для C₃₇H₄₁NO₁₃⋅0,5CHCl₃ (%): С 58,69; Н 5,45; N 1,83. Найдено (%): С 58,21; Н 5,64; N 1,84. ¹ H NMR spectrum (CDCl ₃ , 400.13 MHz), δ, ppm: 1.39 (d, 3H, ³ J _HH = 6.4 Hz, 5'-CH ₃ ); 1.74-1.77 and 1.91-1.95 (two m, 1H + 1H, 2'-CH ₂ ); 2.09 (dd, 1H, ² J _HH = 14.0 Hz, ³ J _HH = 4.0 Hz, 8-H _B ); 2.37 (d, 1H, ² J _HH = 14.0 Hz, 8-H _A ); 2.43 (s, 3H, 14-CH ₃ ); 2.87 and 3.16 (two d, 1H + 1H, ² J _HH = 16.0 Hz, 10-CH ₂ ); 2.95 (br s, 1H, 3'-H); 3.58 and 3.64 (two d, 1H + 1H, ² J _HH = 14.4 Hz, N-CH ₂ ); 3.74 (broad s, 6H, 4`` - OCH ₃ +6 '' - OCH ₃ ); 3.79 (br s, 1H, 4'-H); 4.05 (q, 1H, ³ J _HH = 6.8 Hz, 5'-H); 4.07 (s, 3H, 4-OCH ₃ ); 4.80 (br s, 1H, NH); 5.25 (br s, 1H, 7-H); 5.50 (br s, 1H, 1'-H); 6.31 (d, 1H, ³ J _HH = 7.8 Hz, 2 '' - H); 6.35 (br s, 1H, 5``-H); 7.01 (d, 1H, ³ J _HH = 7.8 Hz, 3 '' - H); 7.36 (d, 1H, ³ J _HH = 8.0 Hz, 3-H); 7.75 (t, 1H, ³ J _HH = 8.0 Hz, 2-H); 7.99 (d, 1H, ³ J _HH = 8.0 Hz, 1-H); 13.22 (br s, 1H, 11-OH); 13.87 (br s, 1H, 6-OH). ¹³ C NMR Spectrum (CDCl ₃ , 100.61 MHz), δ, ppm: 17.10 (5'-CH ₃ ); 24.68 (14-CH ₃ ); 27.80 (2'-C); 33.14 (8-C); 34.66 (10-C); 48.08 (N-CH ₂ ); 54.97 (3'-C); 55.09 and 56.44 (4 '' - OCH ₃ +6 '' - OCH ₃ ); 66.85 (4-OCH ₃ ); 68.01 (5'-C); 69.47 (7-C); 76.69 (9-C); 98.20 (1'-C); 101.34 (5``-C); 103.53 (broad s, 2 '' - C + 3 '' - C); 110.94 (5a-C); 111.07 (11a-C); 118.18 (1-C); 119.51 (2-C); 120.14 (10a-C); 120.65 (1``-C); 130.91 (4a-C); 134.23 (6a-C); 134.32 (12a-C); 135.43 (3-C); 155.62 (11-C); 156.28 (6-C); 158.05 (4-C); 159.55 and 160.77 (6``-C + 4 ''-C); 186.36 (5-C); 186.62 (12-C); 211.95 (13-C). Calculated for C ₃₇ H ₄₁ NO ₁₃ ⋅ 0.5 CHCl ₃ (%): C 58.69; H 5.45; N, 1.83. Found (%): C 58.21; H 5.64; N 1.84.

Пример 2. Получение (9S-цис)-9-ацетил-7-{[3-(2,4,5-триметоксибензил)амино-2,3,6-тридезокси-альфа-L-ликсогексопиранозил]окси}-7,8,9,10-тетрагидро-6,9,11-три-гидрокси-4-метокси-5,12-нафтацендиона (Ib)Example 2. Obtaining (9S-cis) -9-acetyl-7 - {[3- (2,4,5-trimethoxybenzyl) amino-2,3,6-tridesoxy-alpha-L-lyxohexopyranosyl] oxy} -7, 8,9,10-tetrahydro-6,9,11-tri-hydroxy-4-methoxy-5,12-naphthacenedione (Ib)

В колбу, защищенную от света черной бумагой, помещают раствор 0,65 г (3,6 ммоль) 2,4,5-триметоксибензальдегида в смеси 6 мл CH₃CN и 2 мл воды, к нему прибавляют 0,1 г (0,18 ммоль) даунорубицина гидрохлорида и перемешивают 30 мин при ~20°С, после чего прибавляют 0,034 г (0,53 ммоль) NaBH₃CN (содержание основного вещества не менее 98%) и перемешивают при той же температуре 2 ч. Реакционную смесь разлагают добавлением 15 мл воды и 15 мл CHCl₃, органический слой отделяют, водный экстрагируют CHCl₃ (3×15 мл). Объединенные органические экстракты промывают 30 мл воды, водный экстракт промывают CHCl₃ (2×15 мл), органические экстракты объединяют и сушат Na₂SO₄. Растворитель удаляют на роторном испарителе, остаток очищают хроматографией на силикагеле (колонка:

см, d 2 см). Сначала хлороформом элюируют избыток альдегида, затем смесью CHCl₃:МеОН=50:1,5 - целевой продукт ярко-красного цвета. После отгонки растворителей его сушат в вакууме над Р₂О₅ до постоянного веса. Получают 60 мг (47%) кристаллического соединения Ib, разлагающегося при нагревании до 200°С (до наступления плавления).In a flask protected from light by black paper, a solution of 0.65 g (3.6 mmol) of 2,4,5-trimethoxybenzaldehyde in a mixture of 6 ml of CH ₃ CN and 2 ml of water is placed, 0.1 g of it (0, 18 mmol) daunorubicin hydrochloride and stirred for 30 min at ~ 20 ° C, after which 0.034 g (0.53 mmol) of NaBH ₃ CN (content of the basic substance of at least 98%) was added and stirred at the same temperature for 2 hours. The reaction mixture was decomposed by adding 15 ml of water and 15 ml of CHCl ₃ , the organic layer was separated, the aqueous was extracted with CHCl ₃ (3 × 15 ml). The combined organic extracts were washed with 30 ml of water, the aqueous extract was washed with CHCl ₃ (2 × 15 ml), the organic extracts were combined and dried with Na ₂ SO ₄ . The solvent was removed on a rotary evaporator, the residue was purified by silica gel chromatography (column:

cm, d 2 cm). First, excess aldehyde is eluted with chloroform, then with a mixture of CHCl ₃ : MeOH = 50: 1.5 — the target product is bright red. After distillation of the solvents, it is dried in vacuum over P ₂ O ₅ to constant weight. Get 60 mg (47%) of crystalline compound Ib, decomposing when heated to 200 ° C (before melting).

¹Н ЯМР-спектр (CDCl₃, 400,13 МГц), δ, м.д.: 1,40 (д, 3H, ³J_HH=6,4 Гц, 5'-СН₃); 1,60-1,65 и 1,75-1,85 (два м, 1Н+1Н, 2'-СН₂); 2,09 (дд, 1H, ²J_HH=14,4 Гц, ³J_HH=4,0 Гц, 8-H_B); 2,36 (д, 1H, ²J_HH=15,2 Гц, 8-Н_А); 2,42 (с, 3H, 14-СН₃); 2,81 и 3,13 (два д, 1Н+1H, ²J_HH=16,8 Гц, 10-СН₂); 2,91-2,94 (м, 1H, 3'-Н); 3,61 и 3,69 (два д, 1Н+1H, ²J_HH=14,4 Гц, N-CH₂); 3,75, 3,76, 3,81 (три с, по 3H, 2''-ОСН₃+4''-ОСН₃+5"-ОСН₃); 3,70-3,76 (м, 2Н, 4'-Н+5'-Н); 4,07 (с, 3H, 4-ОСН₃); 4,69 (уш. с, 1Н, NH); 5,23 (уш. с, 1Н, 7-Н); 5,49 (уш. с, 1Н, 1'-Н); 6,44 и 6,71 (два с, по 1Н, 3''-Н+6''-Н); 7,37 (д, 1H, ³J_HH=8.0 Гц, 3-Н); 7,75 (т, 1Н, ³J_HH=8,0 Гц, 2-Н); 7,97 (д, 1Н, ³J_HH=8,0 Гц, 1-Н); 13,82 (уш. с, 2Н, 11-ОН+6-ОН). ¹³С ЯМР-спектр (CDCl₃, 100,61 МГц), δ, м.д.: 16,98 (5'-СН₃); 24,61 (14-СН₃); 30,07 (2'-С); 33,01 (8-С); 34,66 (10-С); 44,71 (N-CH₂); 51,53 (3'-С); 55,79, 55,93 и 56,35 (2''-ОСН₃ + 4''-ОСН₃+5''-ОСН₃); 66,34 (4-ОСН₃); 68,01 (5'-С); 69,70 (7-С); 76,64 (9-С); 97,06 (1'-С); 100,90 (3''-С); 110,89 (5а-С); 111,04 (11а-С); 113,87 (6''-С); 118,17 (1-С); 118,51 (2-С); 119,51 (1''-С); 120,49 (10а-С); 134,09 (6а-С); 135,15 (12а-С); 135,47 (3-С); 142,51 (4''-С); 148,66 (5''-С); 151,56 (2''-С); 155,54 (11-С); 156,18 (6-С); 160,74 (4-С); 186,24 (5-С); 186,62 (12-С); 211,68 (13-С). Вычислено для C₃₇H₄₁NO₁₃⋅0,3 CHCl₃ (%): С 60,82; Н 5,53; N 1,95. Найдено (%): С 60,44; Н 5,65; N 2,16. ¹ H NMR spectrum (CDCl ₃ , 400.13 MHz), δ, ppm: 1.40 (d, 3H, ³ J _HH = 6.4 Hz, 5'-CH ₃ ); 1.60-1.65 and 1.75-1.85 (two m, 1H + 1H, 2'-CH ₂ ); 2.09 (dd, 1H, ² J _HH = 14.4 Hz, ³ J _HH = 4.0 Hz, 8-H _B ); 2.36 (d, 1H, ² J _HH = 15.2 Hz, 8-H _A ); 2.42 (s, 3H, 14-CH ₃ ); 2.81 and 3.13 (two d, 1H + 1H, ² J _HH = 16.8 Hz, 10-CH ₂ ); 2.91-2.94 (m, 1H, 3'-H); 3.61 and 3.69 (two d, 1H + 1H, ² J _HH = 14.4 Hz, N-CH ₂ ); 3.75, 3.76, 3.81 (three s, 3H, 2`` - OCH ₃ +4 '' - OCH ₃ +5 "-OCH ₃ ); 3.70-3.76 (m, 2H , 4'-H + 5'-H); 4.07 (s, 3H, _4-OCH3); 4.69 (br s, 1H, NH);.. 5,23 (br s, 1H, 7- -H); 5.49 (broad s, 1H, 1'-H); 6.44 and 6.71 (two s, 1H, 3 '' - H + 6 '' - H); 7.37 (d, 1H, ³ J _HH = 8.0 Hz, 3-H); 7.75 (t, 1H, ³ J _HH = 8.0 Hz, 2-H); 7.97 (d, 1H, ³ J _HH = 8.0 Hz, 1-H); 13.82 (br s, 2H, 11-OH + 6-OH). ¹³ C NMR spectrum (CDCl ₃ , 100.61 MHz), δ, ppm .: 16.98 (5'-CH ₃ ); 24.61 (14-CH ₃ ); 30.07 (2'-C); 33.01 (8-C); 34.66 (10-C) ; 44.71 (N-CH ₂ ); 51.53 (3'-C); 55.79, 55.93 and 56.35 (2 '' - OCH ₃ + 4 '' - OCH ₃ + 5 '' -OCH ₃ ); 66.34 (4-OCH ₃ ); 68.01 (5'-C); 69.70 (7-C); 76.64 (9-C); 97.06 (1'- C); 100.90 (3 '' - C); 110.89 (5a-C); 111.04 (11a-C); 113.87 (6 '' - C); 118.17 (1-C ); 118.51 (2-C); 119.51 (1``-C); 120.49 (10a-C); 134.09 (6a-C); 135.15 (12a-C); 135 , 47 (3-C); 142.51 (4 '' - C); 148.66 (5 '' - C); 151.56 (2 '' - C); 155 54 (11-C); 156.18 (6-C); 160.74 (4-C); 186.24 (5-C); 186.62 (12-C); 211.68 (13- C) Calculated for C ₃₇ H ₄₁ NO ₁₃ ⋅ 0.3 CHCl ₃ (%): C 60.82; H 5.53; N 1.95. Found (%): C 60.44; H 5.65; N, 2.16.

Биологическая активность полученных соединенийThe biological activity of the compounds

Определение острой токсичностиAcute toxicity determination

Острую токсичность соединений Ia и Ib оценивали по экспресс-методу Прозоровского на беспородных белых мышах массой 22-24 г [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Фармакология и токсикология, 1978, 41 (4); 497-502] при внутрибрюшинном способе введения. Результаты определения острой токсичности приведены в таблице. LD₅₀ заявляемых соединений Ia и Ib составляет 112,0 (98-127) и 59,0 (41-85) мг/кг соответственно, что позволяет отнести соединение Ia к 4-му («Малотоксичные вещества»), а соединение Ib к 3-му классу веществ («Умеренно токсичные вещества») по классификации токсичности Сидорова [Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. - В сб.: Токсикология новых промышленных химических веществ (вып. 13). М.: Медицина, 1973, 47-51]. LD₅₀ даунорубицина при внутрибрюшинном введении мышам составляет 1,8 мг/кг [Woodman R.J., Cysyk R.L., Kline I., Gang М., Venditti J.M. Cancer Chemother. Rep., 1975, 59 (4), 689-695]. Это означает, что данное вещество относится ко 2-му классу («Высокотоксичные вещества») по классификации токсичности Сидорова.The acute toxicity of compounds Ia and Ib was evaluated using the Prozorovsky express method on outbred white mice weighing 22-24 g [Prozorovsky VB, Prozorovskaya MP, Demchenko VM Pharmacology and Toxicology, 1978, 41 (4); 497-502] with the intraperitoneal route of administration. The results of the determination of acute toxicity are shown in the table. The LD _{50 of the} claimed compounds Ia and Ib is 112.0 (98-127) and 59.0 (41-85) mg / kg, respectively, which allows attributing compound Ia to the 4th (“Low toxic substances”), and compound Ib to 3rd class of substances (“Moderately toxic substances”) according to Sidorov’s toxicity classification [K. Sidorov On the classification of toxicity of poisons with parenteral routes of administration. - In collection: Toxicology of new industrial chemicals (issue 13). M .: Medicine, 1973, 47-51]. The LD ₅₀ daunorubicin when administered intraperitoneally to mice is 1.8 mg / kg [Woodman RJ, Cysyk RL, Kline I., Gang M., Venditti JM Cancer Chemother. Rep., 1975, 59 (4), 689-695]. This means that this substance belongs to the 2nd class ("Highly toxic substances") according to Sidorov's toxicity classification.

Определение антипролиферативных свойствDetermination of antiproliferative properties

Антипролиферативные свойства заявляемых соединений Ia и Ib были определены по МТТ-тесту [Mather J.P., Roberts Р.Е. Introduction to cell and tissue culture. Theory and technique.New York: Plenum Press, 1998, pp. 75-194]. Культуры клеток человека A549 (ATCC® CCL-185™), RD (АТСС® CC-136™) и HCT116 (ATCC® CCL-247™) выращивали в среде DMEM (НЛП «ПанЭко»), а клеток MCF7 (ATCC® НТВ-22™) - в среде ЕМЕМ (НЛП «ПанЭко»). В ростовую среду добавляли эмбриональную телячью сыворотку (HyClone®, Thermo Scientific) до концентрации 10%, L-глутамин (НЛП «ПанЭко») до концентрации 2 ммоль/л, гентамицин (ОАО «Биохимик») в качестве антибиотика до концентрации 1% и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха. Клетки сеяли в 96-луночный планшет (CELLTREAT™) в количестве 1×10⁴клеток/200 мкл и культивировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂. После 24 ч инкубации к культурам клеток добавляли растворы тестируемых соединений различных концентраций (от 100 до 0,0012 мкмоль/л) и далее клетки культивировали в тех же условиях в течение 72 ч. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. Все соединения растворяли в ДМСО (PANREAC QUIMICA S.L.U). Конечная концентрация ДМСО в лунке не превышала 0,1% и не была токсична для клеток. В контрольные лунки добавляли растворитель в количестве 0,1%. После инкубации в каждую лунку добавляли 20 мкл раствора 5 мг МТТ [бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия] (Sigma-Aldrich) в 1 мл ДМСО и дополнительно инкубировали в течение 2 ч. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Victor³, PerkinElmer) определяли оптическую плотность при 530 нм, за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм. Значение концентрации, вызывающее 50%-ное ингибирование роста популяции клеток (IC₅₀), оценивали на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 9.0. Результаты определения концентраций заявляемых соединений, вызывающих 50%-ное ингибирование роста популяции клеток, приведены в таблице. Как видно из таблицы, соединения общей формулы I обладают расширенным спектром антипролиферативных свойств как в отношении опухолей мышечной ткани: рабдомиосаркомы (RD), карциномы кишечника (НСТ116), аденокарциномы молочной железы (MCF7), так и в отношении немелкоклеточного рака легкого (А549), и, следовательно, могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний, связанных с пролиферацией опухолевых клеток.Antiproliferative properties of the claimed compounds Ia and Ib were determined by the MTT test [Mather JP, Roberts P.E. Introduction to cell and tissue culture. Theory and technique. New York: Plenum Press, 1998, pp. 75-194]. Human cell cultures A549 (ATCC® CCL-185 ™), RD (ATCC® CC-136 ™), and HCT116 (ATCC® CCL-247 ™) were grown in DMEM (PanEco NLP), and MCF7 cells (ATCC® NTV) -22 ™) - in the EMEM environment (NLP "PanEco"). Embryonic calf serum (HyClone®, Thermo Scientific) was added to the growth medium to a concentration of 10%, L-glutamine (NLP PanEco) to a concentration of 2 mmol / L, gentamicin (OJSC Biochemist) as an antibiotic to a concentration of 1% and incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ and 95% air. Cells were seeded in a 96-well plate (CELLTREAT ™) in an amount of 1 × 10 ⁴ cells / 200 μl and cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO ₂ . After 24 h of incubation, solutions of test compounds of various concentrations (from 100 to 0.0012 μmol / L) were added to the cell cultures, and then the cells were cultured under the same conditions for 72 h. For each concentration, experiments were performed in triplicate. All compounds were dissolved in DMSO (PANREAC QUIMICA SLU). The final concentration of DMSO in the well did not exceed 0.1% and was not toxic to the cells. 0.1% solvent was added to the control wells. After incubation, 20 μl of a solution of 5 mg MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium] bromide (Sigma-Aldrich) in 1 ml DMSO was added to each well and further incubated for 2 hours Next, the medium was removed from the plates and 100 μl of DMSO was added to each well to dissolve the formed formazan crystals. Using a tablet analyzer (Victor ³ , PerkinElmer), the optical density was determined at 530 nm, minus the measured background absorption at 620 nm. The concentration value causing 50% inhibition of cell population growth (IC ₅₀ ) was estimated on the basis of dose-dependent curves using OriginPro 9.0 software. The results of determining the concentrations of the claimed compounds that cause 50% inhibition of cell population growth are shown in the table. As can be seen from the table, the compounds of general formula I have an extended spectrum of antiproliferative properties both in relation to muscle tissue tumors: rhabdomyosarcoma (RD), intestinal carcinoma (HCT116), breast adenocarcinoma (MCF7), and non-small cell lung cancer (A549), and, therefore, can be used to treat cancer related to the proliferation of tumor cells.

Claims

1. N-Methoxybenzyl derivatives of daunorubicin of the general formula

where R = H, OCH ₃ ,

and their pharmaceutically acceptable salts.

2. Compounds according to claim 1, having antiproliferative properties and relatively low acute toxicity.