RU2701792C1 - Способ лечения острой печеночной недостаточности - Google Patents
Способ лечения острой печеночной недостаточности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2701792C1 RU2701792C1 RU2018138281A RU2018138281A RU2701792C1 RU 2701792 C1 RU2701792 C1 RU 2701792C1 RU 2018138281 A RU2018138281 A RU 2018138281A RU 2018138281 A RU2018138281 A RU 2018138281A RU 2701792 C1 RU2701792 C1 RU 2701792C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liver
- cells
- resection
- rna
- hours
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 title abstract description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 title abstract 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 126
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 62
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 19
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 19
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 7
- 210000005161 hepatic lobe Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 claims description 5
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 64
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 26
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 63
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 25
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 25
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 25
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 8
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 206010053172 Fatal outcomes Diseases 0.000 description 7
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 7
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 6
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 4
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000001608 morphoregulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 208000002467 Acute-On-Chronic Liver Failure Diseases 0.000 description 1
- 108010033918 Alanine-glyoxylate transaminase Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- -1 AsAT Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010038669 Respiratory arrest Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 238000002615 hemofiltration Methods 0.000 description 1
- 230000001719 hemosorption Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M thiopental sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC([S-])=NC1=O AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pure & Applied Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Algebra (AREA)
- Computational Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mathematical Analysis (AREA)
- Mathematical Optimization (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Educational Administration (AREA)
- Educational Technology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической медицине. Не менее чем за 50-58 часов до выполнения хирургической операции из костного мозга донора выделяют мононуклеарную фракцию клеток костного мозга. Затем из полученной фракции выделяют суммарную РНК и вводят ее экспериментальному животному - крысе внутрибрюшинно или внутривенно в дозе 50-60 мкг/100 г веса экспериментального животного двукратно, сначала за 44-52 часа до выполнения операции, а затем через 3-4 часа после нее. Способ позволяет сократить сроки лечения или профилактики острой печеночной недостаточности при одновременном повышении эффективности, профилактике развития летальных исходов путем заблаговременного обеспечения у оперируемого пациента требуемого уровня активации митотической и пролиферативной активности клеток. 3 з.п. ф-лы, 1 табл, 4 ил.
Description
Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, а именно к гепатологии, хирургии печени, а также к трансплантологии, может быть использовано для лечения (коррекции), а также профилактики острой печеночной недостаточности (ОПН), развивающейся у пациентов после выполнения следующих операций:
- обширной (субтотальной, расширенной) резекции печени (до 60-70% общей массы печени в пределах здоровой ткани), когда оставшаяся малая часть здоровой паренхимы печени, не способна обеспечить поддержание печеночного гомеостаза в организме и предотвратить летальность от ОПН в раннем послеоперационном периоде;
- трансплантации доли печени донора с минимально допустимой массой реципиентам с нефункционирующей собственной печенью.
Клинические проявления ОПН, названные синдромом малого остатка функционирующей печени, развиваются остро уже к концу первых суток после операции резекции печени и наблюдаются у 13-25,8% пациентов, перенесших резекцию, причем показатель смертности у этой категории больных в раннем послеоперационном периоде достигает 7% [Котельникова Л.П., Будянская И.М. - Профилактика и лечение осложнений после резекции печени Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2012; - 171(3); - с. 67-71]. Выше изложенное, может наблюдаться и при трансплантации реципиенту доли печени минимально допустимой массы.
Развитие ОПН в раннем послеоперационном периоде после обширной резекции печени у пациента (или у реципиента после трансплантации минимально допустимой массы резецированной доли печени) связывают с резкой гиперфункцией сохранившихся клеток в малом остатке печени, которая ингибирует выполнение этими клетками других жизненно важных функций - обновление структур и пролиферацию клеток для быстрого восстановления исходных размеров (массы) печени и поддержания ею печеночного гомеостаза в организме.
Гистологически синдром малого остатка печени после ее обширной резекции проявляется в течение первых 30 часов усилением клеточного повреждения (апоптоз и/или некроз клеток [Panis Y., McMullan D.M., Emond J.C. Progressive necrosis after hepatectomy and the pathophysiology of liver failure after massive resection // Surgery. - 1997. - 121.-142-9.] и развитием временного блока митотической активности гепатоцитов при выходе их из Go - периода клеточного цикла, а также отсутствием экспрессии Ki-67 - маркера пролиферативной активности клеток, т.е. проявляется торможением пролиферативных процессов в оставшейся ткани печени в ответ на ее стрессорное повреждение [Ельчанинов А.В. Молекулярные и клеточные механизмы регенерации печени после субтотальной резекции в эксперименте. - Автореферат дисс. докт. мед. наук, - Москва. - 2017, - 41 с.]
Отмечено также, что отчетливые признаки пролиферативной активности клеток печени после субтотальной резекции (увеличение митотической и пролиферативной активности) появляются лишь через 48 часов после выполнения этой операции [Ельчанинов А.В., 2017, см. выше] и эта запоздалая, отодвинутая во времени, активация процессов восстановления исходной массы в малом остатке печени лежит в основе развития клиники тяжелой ОПН и летальных исходов у пациентов после субтотальной/расширенной резекции печени.
Выше изложенное, указывает на существующую в клинике настоятельную необходимость эффективного лечения ОПН и предотвращения летальных исходов в раннем послеоперационном периоде после обширной резекции печени за счет эффективной индукции в клетках малого остатка оперированной печени состояния ранней адаптивной готовности к быстрому и продуктивному наращиванию массы клеток для восстановления исходных размеров и функции печени путем ранней индукции в сохранившихся клетках этого органа высокого уровня пролиферативной и митотической активности. В настоящее время пока не предложены эффективные и доступные методы лечения ОПН и профилактики летальности как после обширной резекции печени, так и после трансплантации реципиенту доли печени минимально допустимого размера.
Для лечения ОПН, и прежде всего для осуществления детоксикации организма, во второй половине прошлого века стали широко применять аппаратные эфферентные методы терапии: диализно-фильтрационные методы (гемодиализ, ультрафильтрация, гемофильтрация, гемодиафилътрация); выведение токсинов через естественные или искусственные полупроницаемые мембраны - перитонеальный диализ; сорбционные методы (гемосорбция, плазмаферез, плазмосорбция, осаждение токсинов на углях и искусственных смолах: гемо-, плазмосорбция; лимфологические методы лечения (лимфосорбция, лимфодиализ, лимфофильтрация, лимфаферез, эндолимфатическое введение лекарственных средств) [Чикотеев С.П., А.Н. Плеханов / Очерки хирургии печени и поджелудочной железы / монография // Иркутск. - 2002, - 259 с.].
В настоящее время в клинической практике стали дополнительно использовать молекулярные абсорбирующие рециркуляторные системы (MARS) и модули для сепарации и адсорбции фракционированной плазмы (FPSA) - системы Prometheus. [Stadlbauer V. et al. Effect of extracorporeal liver support by MARS and Prometheus on serum cytokines in acute-on-chronic liver failure // Critical Care. - 2006. - №6 (10). - p. 1-8.; Gonwa T.A. Should MARS and PROMETHEUS be Used in Patients with Liver Disease //Seminars in Dialysis. - 2014. - Vol. 27. - p. 228-231].
Однако, эти методы, как и все аппаратные эфферентные методы, сопровождаются удалением из плазмы больного не только токсических веществ, но и биологически активных факторов, регулирующих регенерацию и пролиферацию гепатоцитов в поврежденной печени. В результате частота летальных исходов после применения эфферентных методов снизилась незначительно, а эффективность применения этих методов при ОПН была признана недостаточной. Это обстоятельство послужило основанием для разработки новых биотехнологических методов интенсивной терапии ОПН после обширной резекции печени, основанных на применении экстрактов из ткани печени крыс с 70% резекцией или экстрактов из ткани печени неонатальных поросят [Гальперин Э.И., Дюжева Т.Г., Платонова Л.В. и др. Уменьшение повреждения печени при ее обширной резекции и токсическом поражении. // Анналы хирургической гепатологии. - 2008. - т. 13, №1. - с. 51-55]. Предложенные методы, несмотря на эффективность их применения в эксперименте, пока не получили одобрения для применения в клинике, т.к. при использовании экстрактов из нативных тканей животных всегда существует потенциальная опасность заражения пациента их кровяными инфекциями, а изготовление высокоэффективного медикаментозного препарата из экстракта животных тканей предполагает идентификацию химического переносчика биологических эффектов и выделение его из тканевого экстракта, чего авторами не было предпринято.
В последние годы стал известен новый биотехнологический способ лечения ОПН после субтотальной резекции печени, который осуществляется путем имплантации в остаток печени сразу после резекции клеточно-инженерных конструкций, состоящих из со-культивированных аллогенных клеток печени и аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) в составе биополимерного гетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля (БГКГ). Этот метод индуцирует восстановительные процессы в остатке печени путем усиления в нем митотической и пролиферативной активности клеток [Shagidulin М., Onishchenko N., Krasheninnikov М. et al., Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure//Medimond. International Proceedings. - 2010, p. 83-86; Шагидулин М.Ю., Онищенко H.A., Крашенинников M.E. и др. Выживание клеток печени, иммобилизированных на 3-D матриксах при моделировании печеночной недостаточности // Вестник трансплантологии и искусственных органов, - 2011, т. XIII, №3. с. 59-66].
Несмотря на эффективность применения - предложенный метод не лишен технических и организационных недостатков, затрудняющих его применение, особенно в клинике, так как нет регламентирующих документов, позволяющих использование клеточного материала в клинической практике. Кроме того, этот метод, предусматривает выделение, краткосрочное сохранение и последующее применение аллогенных клеток печени из заранее заготовленной донорской печени, а также заблаговременное выделение и длительное культивирование (в течение 3-4 недель) ММСК КМ пациента, для наращивания клеточной массы и последующей их трансплантации в печень.
Известен и другой биотехнологический способ индукции восстановительных процессов в поврежденной печени, который, однако, был предназначен для лечения хронической печеночной недостаточности (ХПН), когда в печени уже сформированы все признаки ее хронического повреждения. Способ обеспечивает постепенное (в течение нескольких месяцев) восстановление структуры и функции поврежденных клеток, а также восстановление гистологических характеристик ткани печени, которое достигается за счет многократного (по крайней мере, трехкратного) парентерального введения в организм суммарной РНК (общей РНК), выделенной из предварительно культивированных в течение 3-4-х недель ММСК КМ здорового донора (RU 2655761, C1; RU 2650209, C1; RU 2655528, С1). В результате применения суммарной РНК, выделенной из ММСК КМ, а не самих ММСК КМ, этот способ позволяет избежать развития известных опасных осложнений, связанных с применением стволовых/прогениторных клеток костного мозга (малигнизация и мутация клеток); кроме того, предложенный способ позволяет использовать только биологически активный комплекс этих клеток, содержащий в себе все типы РНК (в том числе все типы регуляторных белок - не кодирующих микро-РНК), что позволяет осуществлять непосредственный перенос регенерационной информации клеткам хронически поврежденного органа - печени, индуцируя в них процесс эффективной репаративной регенерации.
Однако известный способ, предполагающий использование суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающих в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности, не лишен, недостатков, препятствующих его широкому и эффективному использованию для лечения ОПН после обширной резекции печени (или трансплантации доли печени минимально допустимого размера).
Прежде всего, указанный выше известный способ относится к лечению ХПН, вызванной хроническим токсическим повреждением печени. К недостаткам относится также сложность и длительность сроков получения ММСК КМ из костного мозга (из мононуклеарной фракции) сначала путем краткосрочного культивирования (3-4 суток) для выделения этих клеток из мононуклеарной фракции клеток костного мозга, а затем путем длительного культивирования ММСК КМ в течение 3-4 недель для наращивания клеточной массы с применением дорогостоящих сред и последующего получения из клеточной массы биотехнологического продукта - суммарной РНК, что существенно повышает себестоимость метода. Мононуклеарная фракция клеток костного мозга содержит 3 типа ядросодержащих клеток: гемопоэтические клетки (преобладающий тип клеток в костном мозге), стромальные клетки (в костном мозге их содержится менее 0,5-1,5%) и клетки сосудистого происхождения (менее 0,5-1,0%).
Кроме того, предложенная схема использования суммарной РНК оказалась непригодной для лечения ОПН, т.к. применение суммарной РНК по известной схеме обеспечивает лишь постепенную (в течение нескольких месяцев) инволюцию и устранение признаков деструкции паренхиматозных и непаренхиматозных структур ткани печени, сформировавшихся в процессе ее длительного хронического токсического повреждения, тогда как для успешного лечения ОПН в клинике после субтотальной резекции уже в первые часы послеоперационного периода необходимо обеспечить устранение индуцированного стрессом апоптоза и некроза клеток печени, раннего и опасного ингибирования митотической и пролиферативной активности клеток в остатке печени, а также требуется уже в первые сутки достигнуть раннего и максимально ускоренного темпа наращивания дополнительных количеств здоровых клеток в остатке здоровой ткани печени для быстрого преодоления дефицита ткани печени (ее критической массы) после операции, ускоренного восстановления печеночного гомеостаза и предотвращения гибели пациента.
Техническая проблема заключается в разработке эффективного, обладающего низкой себестоимостью, доступного способа лечения и профилактики ОПН, развивающейся после хирургической операции, в результате которой формируется критический дефицит функционирующей ткани печени.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого способа, заключается в:
- сокращении сроков лечения/профилактики ОПН при одновременном повышении их эффективности, профилактике развития летальных исходов путем заблаговременного обеспечения у оперируемого пациента требуемого уровня активации митотической и пролиферативной активности клеток в оставшейся или трансплантированной части печени в раннем послеоперационном периоде за счет осуществления предоперационного и раннего послеоперационного применения препарата суммарной РНК в оригинальных дозах и в строго выверенные, биологически значимые временные интервалы;
- снижении себестоимости лечебной или профилактической процедур, их упрощении за счет получения клеточного материала (без длительного двухэтапного культивирования) для выделения суммарной РНК из здорового костного мозга (аутогенного или аллогенного) за счет использования не ММСК КМ, а гемопоэтической мононуклеарной фракции клеток костного мозга (КМ).
Разработанная нами схема применения суммарной РНК позволяет устранить развитие периода ингибирования (блокирования) митотической и пролиферативной активности клеток печени в первые сутки после субтотальной резекции печени, оптимизировать темп ускоренного преодоления критической массы функционирующего остатка печени и тем самым предотвратить летальность после обширной резекции печени (или после трансплантации минимально допустимой массы печени) путем создания условий для максимально ранней пред- и -послеоперационной адаптивной перестройки в малом остатке здоровой печени, способной уже в первые - вторые сутки после операции затормозить процессы клеточного стрессорного повреждения и обеспечить высокий темп митотической и пролиферативной активности сохранившихся жизнеспособных клеток в малом остатке печени.
В предлагаемом нами способе лечения ОПН, исходным материалом для получения суммарной РНК служит некультивируемая фракция гемопоэтических мононуклеарных клеток КМ (аутологичных или аллогенных) здорового донора, причем в качестве донора мононуклеарных клеток КМ (при резекции печени) может стать сам пациент, но только до резекции у него печени, так как операция обширной резекции уже в ранний период (первые сутки) ингибирует регенераторные процессы как в печени, так и в КМ.
Следует также отметить, что применение фракции мононуклеарных клеток КМ, основным компонентом которых являются клетки гемопоэтического ряда, для индукции регенераторных процессов как в печени, как и в других органах, остается перспективным направлением регенерационной медицины, т.к. КМ, будучи центральным органом иммуногенеза и системы крови в здоровом организме, проявляет универсальные регуляторные свойства, поскольку его клетки относятся к быстро реагирующим и быстро развивающимся клеткам.
Кроме того, КМ содержит постоянно самообновляющийся пул стволовых/прогениторных клеток, которые способны продуцировать цитокины, факторы роста, и паракринно образующиеся тканеспецифические факторы, оказывающие регуляторное воздействие на клетки различных паренхиматозных органов, в том числе печени.
Именно поэтому клетки КМ продолжают использовать для индукции процессов регенерации. Однако внедрение в клиническую практику клеточных технологий, основанных на применении клеток КМ, и прежде всего, фракции мононуклеарных клеток для лечения заболеваний печени, продолжает уже длительное время оставаться на стадии пилотных исследований из-за их недостаточной эффективности в организме реципиента после трансплантации, а также из-за опасности развития таких нежелательных осложнений как «реакция трансплантат против хозяина», которая развивается при использовании аллогенных мононуклеарных клеток костного мозга, поскольку их основным компонентом являются клетки гемопоэтического ряда.
Для исключения опасности возникновения нежелательных осложнений при использовании клеток костного мозга в предложенном нами способе лечения ОПН применяются не гемопоэтические клетки КМ, входящие в состав мононуклеарных клеток костного мозга, а выделенный из них комплекс биологически активных компонентов, включающий в себя все типы РНК, в том числе все типы регуляторных микро РНК с высокой проникающей способностью, способных осуществить быстрый перенос содержащейся в них «регенерационной и сигнальной информации» клеткам поврежденного органа (печени), и тем самым ускоренно активизировать в них восстановительные процессы.
Суммарная РНК, выделенная из клеток лимфоидной ткани - т.е. из клеток, входящих в состав мононуклеарной фракции клеток КМ, тимуса, селезенки и циркулирующих в крови лимфоцитов, не обладает иммуногенной активностью, но в отличие от тканевых (тканеспецифичных) РНК обладает способностью регулировать рост и развитие клеток в тканях различного гистотипа [Бабаева А.Г., Тишевская Н.В., Геворкян Н.М. / О мофогенетических свойствах РНК лимфоидных и стволовых клеток при восстановительных процессах//Москва,2016, ФГБНУ НИИМЧ, 269 с.]
Причем «адресный» перенос регенерационной информации в поврежденный орган, по - видимому, осуществляют содержащиеся в суммарной РНК многочисленные микроРНК, в том числе микроРНК, качественно одинаковые с микроРНК, экспрессирующимися в поврежденном (или неадекватно функционирующем) органе.
Таким образом, достоинствами предлагаемого способа лечения/профилактики ОПН после обширной резекции печени (или после трансплантации минимально допустимой массы резецированной доли печени), позволяющем обеспечить клиническую доступность метода и по существу достигнуть выраженного и надежного лечебного эффекта является:
- отказ от использования ММСК КМ для получения суммарной РНК и использование для этих целей суммарной мононуклеарной фракции клеток костного мозга, что позволяет исключить необходимость длительного и дорогостоящего культивирования клеток, а также существенно снизить себестоимость метода и сократить период подготовки клеток для выделения РНК;
- заблаговременное предоперационное (за 44-52 часа до операции) и раннее послеоперационное (через 3-4 часа после операции) введение общей РНК, выделенной из мононуклеарных клеток костного мозга здорового донора, что позволяет уже в предоперационном периоде и в раннем послеоперационном периоде затормозить деструктивные процессы и активировать адаптационные процессы в ткани печени, и тем самым обеспечить максимально раннюю регенерационную поддержку печени, а также в максимально короткие сроки преодолеть критическую массу остатка печени после обширной резекции, устранить возможность летальных исходов;
- возможность при необходимости проводить повторные парентеральные введения препарата суммарной РНК до полного восстановления показателей массы и функции резецированной или трансплантированной печени.
- возможность обеспечить раннюю компенсаторную поддержку процессам пролиферации клеток не только в печени, но и адаптационную поддержку других органов (почки, легкие), относящихся к единой системе детоксикации организма и участвующих в поддержании печеночного гомеостаза, а также в снижении опасности возникновения летальных исходов;
- возможность обеспечения безопасности проведения регенерационной терапии препаратом суммарной РНК из мононуклеарной фракции клеток КМ, т.к. введенная РЖ, являясь химическим веществом, не может индуцировать «реакцию трансплантат против хозяина», а так же утратить свою регуляторную активность;
- возможность проводить эффективную регенерационную терапию различных органов и систем в организме, т.к. суммарная РНК, выделенная из мононуклеарной фракции клеток КМ здорового донора сохраняет универсальность регуляторных свойств этих клеток, и будучи биохимическим препаратом, с высокой проникающей активностью обладает более выраженным регуляторным воздействием, чем сами мононуклеарные клетки, функция которых проявляется в зависимости от состояния иммунной системы в организме.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Для коррекции, а также профилактики острой печеночной недостаточности в эксперименте после хирургической операции, в результате которой формируется критический дефицит функционирующей ткани печени, (далее хирургической операции) не менее чем за 50-58 часов до выполнения хирургической операции из костного мозга донора выделяют мононуклеарную фракцию клеток КМ. Затем из полученной фракции выделяют суммарную РНК. Последнюю вводят экспериментальному животному - крысе внутрибрюшинно или внутривенно в дозе 50-60 мкг/100 г веса экспериментального животного двукратно: сначала за 44-52 часа до выполнения операции, а затем через 3-4 часа после нее.
Хирургической операцией может быть обширная резекция печени.
Хирургической операцией может также быть трансплантация доли/сегмента печени с минимально допустимой массой.
При этом введение суммарной РНК, может быть выполнено у пациента и реципиента с сохранением не адекватно функционирующей печени, а также у реципиента после удаления собственной печени.
Предлагаемый способ обеспечивает адаптивную перестройку метаболизма в предоперационном периоде, торможение процессов клеточного апоптоза и некроза, вызванного операционным стрессом, а также усиление послеоперационной активации морфорегуляторной активности собственных клеток костного мозга и клеток печени, как экспериментального животного, так и пациента в клинике.
Способ осуществляется следующим образом.
Для лечения ОПН после обширной резекции печени (или после трансплантации минимально допустимой массы доли печени) применяют не аутологичные или аллогенные мононуклеарные клетки КМ, а биологически активный комплекс, выделенный из мононуклеарных клеток КМ, либо здорового аллогенного донора, либо пациента (аутологичного донора) до резекции печени.
Комплекс содержит суммарную не иммуногенную РНК здорового организма, в состав которой входят все РНК, в том числе все типы регуляторных РНК (прежде всего микро РНК), обеспечивающие перенос «регенерационной и сигнальной информации» клеткам КМ и клеткам поврежденной печени пациента для ускоренного преодоления в его организме критической массы печени после обширной резекции.
Суммарная РНК не обладает иммуногенной активностью и поэтому может быть использована также в организме реципиента после трансплантации донорской печени.
Выполнение способа начинают с заблаговременного получения мононуклеарной фракции клеток из аспирата КМ животного (за 50-58 часов до выполнения резекции печени). Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых и бедренных костей крысы-донора получали клетки КМ путем аспирации их шприцом с иглой 18G, содержащим среду для забора (0.5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0.25 мг/л гентамицина).
Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов и тромбоцитов (114 мМ NH4CL, 7,5 тМ KHCO3,100 мкМ EDTA) в течение 3 минут и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClonegold», USA), инсулин 0.4 мкМ, 0.25 мг/л гентамицина.
Выделенные клетки представляли собой мононуклеарную фракцию, преимущественно гемопоэтических клеток КМ, суммарный выход которых колебался от 0,8-1.5×10 клеток. Далее приступали к выделению суммарной РНК из полученных мононуклеарных клеток КМ по методике Extract RNA, разработанной фирмой «ЕВРОГЕН» (Россия). К полученной фракции мононуклеарных клеток добавляли реагент Extract RNA из расчета 1 мл реагента на 1×106 клеток (в камере Горяева предварительно подсчитывали количество клеток), инкубировали смесь 15 минут периодически пипетируя) и центру фугировали при 13400 об/мин 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переносили в новую пробирку и приступали к разделению фаз. Для этого добавляли 0.2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента Extract RNA, инкубировали смесь в течение 5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая образец; затем образец центруфугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре.
В ходе центруфугирования происходило разделение смесей на три фазы: нижнюю-органическую фенол - хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК находится в верхней водной фазе, которую аккуратно собирали и переносили в чистую пробирку.
Затем приступали к непосредственному выделению РНК. Для этого в водную фазу добавляли 0.5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента (Extract RNA). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно, по стенке пробирки, добавляли 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного ранее. Полученный образец центрифугировали на максимальной скорости (13400 об/мин) в течение 5 минут. Удаляли этанол пипеткой и осадок, выделенной РНК, растворяли в 1 мл воды и определяли концентрацию РНК в 100 мкл образца на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Из каждых 4-6 млн исходно использованных мононуклеарных клеток КМ в 1 мл определялось 380-500 мкг РНК. Далее из этого концентрированного раствора РНК готовили рабочие растворы РНК, требуемой концентрации для введения в организм оперированного животного с целью превентивного лечения ОПН. Суммарная РНК, выделенная из мононуклеарных клеток КМ, представляет собой биотехнологический продукт высокой степени очистки, который вводят парентерально (внутрибрюшинно или внутривенно).
Для экспериментального животного - (крысы) рабочий раствор РНК содержал 76-100 мкг РНК/мл (к 1.0 мл концентрированного раствора РНК добавляли 4 мл дистиллированной воды). Введение РНК осуществляют в дозе 50-60 мкг на 100 г веса животного двукратно: за 44-52 часа до выполнения хирургической операции и через 3-4 часа после выполнения операции обширной резекции печени (или трансплантации реципиенту доли печени минимально допустимой массы) внутрибрюшинно или внутримышечно, т.е. крысе массой 400 г двукратно вводят по 200-240 мкг общей РНК в виде 2.0-2.4 мл рабочего раствора РНК при содержании в нем 100 мкг РНК/мл или 2.6-3.15 мл рабочего раствора РНК при содержании в нем 76 мкг РНК/мл по указанной выше схеме.
Приводим пример осуществления предлагаемого способа лечения ОПН после обширной резекции печени.
Эффективность предлагаемого способа превентивного лечения ОПН в результате возникновения малого остатка печени в организме после обширной резекции печени (или после трансплантации минимально допустимой массы резецированной доли печени) - изучали на модели субтотальной резекции печени. Для этого у крыс, наркотизированных ингаляционно диэтиловым эфиром, с соблюдением правил асептики и антисептики вскрывали брюшную полость, выводили печень в рану и последовательно накладывали лигатуры на основания серединной, левой боковой и правой верхней долей печени, после чего их удаляли (всего 70-75% общей массы печени). Операцию проводили всегда в утренние часы (в период с 10 до 12 часов), когда суточный ритм митотической активности клеток печени минимален, с соблюдением биоэтических принципов гуманного использования животных в соответствии с «Биоэтической концепцией трех R» (replacement, reduction, refinement), которая является общепринятым мировым стандартом.
Затем всех оперированных животных (n=35) разделили на две группы: 1 группа (n=15)-контроль без применения специальной терапии; и 2 группа (п=20) опытная, которая включала две подгруппы: с внутрибрюшинным введением РНК в дозе 50 мкг/100 г веса животного (подгруппа 2.1, n=10); и с внутривенным введением РНК в дозе 60 мкг/100 веса животного (подгруппа 2.2, n=10), причем РНК вводили двукратно - за 44-52 часа до выполнения операции обширной резекции печени и через 3-4 часа после завершения операции моделирования субтотальной резекции печени. Результаты экспериментов оценивали в 2-х группах животных, выживших после выполнения им обширной резекции печени (70-75%). Всего из 35 крыс, у которых моделировали ОПН, погибло 10 животных в течение 5-ти первых суток после резекции печени, (общая летальность составила 21%). Однако все животные, погибшие после субтотальной резекции, относились к контрольной группе (без профилактической терапии, n=15) и внутри этой группы летальность составила 66.6%. У выживших животных в контрольной и опытной группах функциональное состояние печени исследовали в динамике параллельно с оценкой степени развития восстановительных процессов печени в течение первых 28-ти суток после выполнения субтотальной резекции печени. Для этого, с соблюдением биоэтических принципов гуманного использования животных, животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения раствора тиопентала натрия в дозировке, вызывающей остановку дыхания, и проводили исследования крови, а так же морфологическое исследование оперированной печени через 24 ч, 48 ч, 72 ч, на 5, 7, 10, 14, 18, 21 и 28-е сутки после выполнения субтотальной резекции. Для оценки состояния восстановительных процессов в резецированной печени использовали биохимические, гистологические и иммуногистохимические методы, а так же проводили взвешивание печени (контроль восстановления массы печени) в динамике наблюдения. Так как результаты исследований в подгруппах 2.1 и 2.2 достоверно не различались между собой они были объединены в общую группу 2.
Биохимеческими методами исследовали кровь на содержание аланин - аминотрансферазы (АлАТ), аспарагин - аминотрансферазы (АсАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Для этого у крысы забрали 28-32 мкл крови, капали на специальные тест-полоски Reflotron™, которые сразу же устанавливали в биохимический анализатор Reflotron™, («Roche», Швейцария) (Принцип измерения - рефлексионная фотометрия, точность измерения - ±0,5%, воспроизводимость - <=0.2%, линейность: ±0,05%).
Затем вскрывали брюшную полость, эксплантировали печень и взвешивали ее. Для гистологического исследования печени извлекали фрагмент оставшейся доли печени, разрезали его на кусочки размерами 3×4×5 мм и помещали в раствор Буэна (через 24 часа раствор Буэна меняли на 70% этанол) для фиксации. После завершения фиксации кусочки промывали в проточной воде в течение 3 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм наклеивали влажным способом на стекла с поли-L-лизиновым покрытием («Thermo», США). Затем препараты высушивали в течение 48 ч в термостате при 37°С, депарафинировали, регидратировали и окрашивали срезы гематоксилином и эозином. В гистологических препаратах срезов ткани печени в 30 полях зрения определяли количество митотически делящихся клеток (в 
- промилле), а так же рассчитывали митотический индекс (МИ). Выраженность пролиферативной активности гепатоцитов печени оценивали так же иммуногистохимически с помощью антител Ki-67, являющихся маркерами ядерного антигена пролиферирующих клеток, и рассчитывали пролиферативный индекс (ПИ). Достоверность различия исследуемых показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью параметрического критерия t-Стьюдента при p<0.05.
Приводим результаты сравнительного изучения эффективности применения суммарной РНК, выделенной из фракции мононуклеарных клеток аллогенного КМ крыс, полученного предоперационно для профилактики летальных исходов при ОПН после обширной (70-75%) резекции печени.
В таблице представлены результаты сравнительного исследования содержания цитолитических ферментов печени в сыворотке крови крыс после субтотальной резекции в контрольной группе (без профилактической терапии) и в опытной группе, в которой вводили суммарную РНК из мононуклеарных клеток КМ по указанной схеме.
В таблице представлены результаты исследования АсАТ, АлАТ и ЩФ в сыворотке крови крыс после моделирования обширной резекции печени в контрольной группе (введение физиологического раствора) (n=15) и в опытной группе (n=20) (введение РНК по предлагаемой схеме).
Из таблицы видно, что в контроле показатели цитолиза (АлАТ, АсАТ и ЩФ) у выживших животных резко и неуклонно нарастали в течение первых 5 суток, затем стабилизировались и начиная с 10-14 суток возникала отчетливая тенденция их нормализации. В опытной группе показатели цитолиза нарастали лишь в течение 1 и 2-х суток; к 3-м суткам намечалась отчетливая тенденция к снижению цитолитической активности, а на 5-е сутки снижение цитолитической активности становилось для всех исследованных печеночных ферментов АлАТ, АсАТ и ЩФ - достоверным. В результате в опытной группе нормализация в крови исследуемых показателей наступала к 7-10 суткам, тогда как в контрольной группе только к 18-м суткам.
Исследование митотическое активности гепатоцитов из резецированной печени позволило установить ее активацию через 48 часов и в 1-ой контрольной группе и во 2-опытной группе по сравнению с исходным уровнем: исходный уровень митотической активности, оцениваемый до резекции печени по митотическому индексу (МИ), составил 0,2-0,3 промилле - - (1-2 митоза на 30 полей зрения), тогда как в 1 (контрольной) группе МИ через 48 час после субтотальной резекции составил 5,181 (на 7334 клетки определялось 38 митозов), а во второй опытной группе с введением РНК из мононуклеарной фракции клеток КМ на этом же сроке МИ составил 23,45 (на 9678 клеток определялось 227 митозов), т.е. во второй группе МИ был приблизительно в 5 раз выше, чем в первой контрольной группе. Приведенные изменения митотической активности гепатоцитов в печени крыс 1 и 2 групп через 48 часов после резекции печени были установлены на основании подсчета митотически делящихся гепатоцитов в 30 полях зрения, однако уже в каждом поле зрения гистологических препаратов во 2 - опытной (введение РНК по схеме) группе выявлялось существенно большее количество митотически делящихся гепатоцитов. На рис. 1а и б представлен гистологический препарат печени крысы из контрольной группы через 48 часов после резекции 70-75% массы печени и двукратного введения физиологического раствора; препарат окрашен гематоксилином и эозином; а - увеличение 200; б - увеличение 400. Стрелка указывает, что в поле зрения выявлен только. один митотически делящийся гепатоцит. На рис. 2 представлен гистологический препарат печени крысы из опытной группы через 48 часов после субтотальной резекции печени и двукратного внутривенного введения препарата суммарной РНК в дозе 50 мкг/100 г веса животного по предложенной схеме. Препарат окрашен гематоксилином и эозином; а - увеличение 200; б - увеличение 400. Стрелки указывают на многочисленные митотически делящиеся гепатоциты, находящиеся в разных фазах клеточного цикла и все они в одном поле зрения. Кроме того мы установили, что в опытной группе высокий уровень митотической активности гепатоцитов сохраняется в течение 7 последующих суток, тогда как в контроле митотическая активность гепатоцитов в течение 14 суток после субтотальной резекции печени остается на достоверно более низком уровне, чем в опытной группе. Эти данные представлены на рис. 3, который отражает динамику сравнительного изучения митотической активности гепатоцитов (митотического индекса) в 1 и 2 группах опытов в течение 28 суток после субтотальной резекции печени. Достоверное и длительное (в течение 14 суток) сохранение более высокого уровня митотической и пролиферативной активность клеток в остатке резецированной печени в опытной группе по сравнению с контролем, ускоряет также темп индукции восстановительных процессов в ней, что находит отражение в ускоренном восстановлении исходной массы печени после резекции у животных 2 группы. На рис. 4 представлена динамика восстановления массы печени после резекции в двух группах опытов: в 1 - контрольной (двукратное введение физиологического раствора) и во 2 - опытной (двукратное введение РНК по схеме). Из рисунка 4 видно, что уже на 3 сутки во 2 группе намечается тенденция к увеличению массы печени после резекции, а на 5, 7, 10, 14 и 18 сутки уже отчетливо выявляются достоверные различия в восстановлении массы печени в 1 и 2 группах: во 2 группе темп восстановления массы печени (темп преодоления критической массы) в течение первых 10 суток был существенно на более высоком уровне, чем в контроле, в результате чего уже на 7-10 сутки после резекции масса печени во 2 группе практически не отличалась от исходных значений. В 1-контрольной группе восстановление массы печени происходило в более медленном темпе, особенно в первые две недели после резекции, в результате масса печени только к 18-20 суткам приближалась к исходным значениям и полностью восстанавливалась лишь на 22-24 сутки наблюдения. Нами отмечено также, что более высокий темп восстановления массы печени во 2 группе коррелировал с более высоким темпом восстановления функциональных показателей печени (АлАТ, АсАТ, ЩФ) в этой группе (см. таблицу).
В совокупности полученные результаты позволяют заключить, что двукратное введение РНК в дозе 50-60 мкг/100 грамм веса животного по указанной схеме позволяет эффективно лечить ОПН: в более быстром темпе нормализовать показатели функции печени и исключить возникновение летальных исходов после субтотальной резекции за счет более высокого темпа пролиферативной активности клеток печени, позволяющей в более короткие сроки превысить критические значения массы печени, и достигнуть адекватных значений функционирующей массы печени, способной обеспечить ускоренное восстановление печеночного гомеостаза в организме. Введение суммарной РНК донора реципиенту, получившему при трансплантации долю печени минимально допустимого размера, этот способ индукции восстановительных процессов в трансплантате может явиться патогенетическим средством коррекции массы трансплантата без опасения индукции иммунной гистонесовместимости, т.к. сумарная РНК видонеспецифична, но обладает выраженной морфорегуляторной активностью именно для тех органов (в данном примере печени), для которых в организме после резекции оказывается сниженным уровень нормального (не измененного) тканеспецифического антигена.
Таким образом, выделение и применение суммарной РНК из мононуклеарной фракции клеток КМ у пациента с исходно не нарушенным гомеостазом в организме или у практически здорового донора в соответствии с предлагаемым способом лечения ОПН поле обширной (субтотальной) резекции печени будет способствовать ранней и ускоренной восстановительной регенерации печени как после обширной резекции, так и у реципиента после трансплантации доли печени минимально допустимого объема, и позволит ускоренно нормализовать печеночный гомеостаз в организме, а также избежать летальных осложнений. Препарат суммарной РНК не несет в своей структуре малигнезирующих и мутационных свойств, не способен индуцировать «реакцию трансплантат против хозяина», не обладает иммуногенной активностью и пригоден для многократного применения.
Предлагаемый способ позволяет ускоренно преодолеть критический дефицит массы оставшейся печени и индуцировать максимально быстрый темп восстановления адекватной массы функционирующей печени, достаточной для восстановления печеночного гомеостаза и профилактики летальных исходов.
Claims (4)
1. Способ лечения острой печеночной недостаточности в эксперименте после хирургической операции, в результате которой формируется критический дефицит функционирующей ткани печени, - хирургической операции, отличающийся тем, что не менее чем за 50-58 часов до выполнения хирургической операции из костного мозга донора выделяют мононуклеарную фракцию клеток костного мозга, затем из полученной фракции выделяют суммарную РНК и вводят ее экспериментальному животному - крысе внутрибрюшинно или внутривенно в дозе 50-60 мкг/100 г веса экспериментального животного двукратно, сначала за 44-52 часа до выполнения операции, а затем через 3-4 часа после нее.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хирургической операцией является обширная резекция печени.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хирургической операцией является трансплантация доли печени с минимально допустимой массой и удаление печени у реципиента.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хирургической операцией является трансплантация доли печени с минимально допустимой массой и сохранение нефункционирующей печени у реципиента.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018138281A RU2701792C1 (ru) | 2018-10-30 | 2018-10-30 | Способ лечения острой печеночной недостаточности |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018138281A RU2701792C1 (ru) | 2018-10-30 | 2018-10-30 | Способ лечения острой печеночной недостаточности |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2701792C1 true RU2701792C1 (ru) | 2019-10-01 |
Family
ID=68170933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018138281A RU2701792C1 (ru) | 2018-10-30 | 2018-10-30 | Способ лечения острой печеночной недостаточности |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2701792C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744846C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2021-03-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ лечения острой печёночной недостаточности |
| RU2822653C1 (ru) * | 2023-08-18 | 2024-07-11 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы городская клиническая больница имени С.П. Боткина департамента здравоохранения города Москвы (ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ) | Способ регенеративной клеточной терапии для лечения гепатоцеллюлярной недостаточности при циррозе печени |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2650209C1 (ru) * | 2017-08-08 | 2018-04-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ коррекции печеночной недостаточности в эксперименте |
-
2018
- 2018-10-30 RU RU2018138281A patent/RU2701792C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2650209C1 (ru) * | 2017-08-08 | 2018-04-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ коррекции печеночной недостаточности в эксперименте |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HAGA H. et al. Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Improve Survival from Lethal Hepatic Failure in Mice. Stem Cells Transl Med. 2017 Apr; 6(4): 1262-1272. * |
| КОЖЕВНИКОВ Ю. А. и др. Эффективность клеточной трансплантации при лечении печеночной недостаточности в эксперименте, Сибирский научный медицинский журнал, 2007, 2, 34-37. ЧЕРНУХ A.M. и др. Особенности течения экспериментального цирроза печени под влиянием печеночной РНК. Бюлл. экспер. биологии и медицины, 1970, N10, с. 12-15. * |
| КОЖЕВНИКОВ Ю. А. и др. Эффективность клеточной трансплантации при лечении печеночной недостаточности в эксперименте, Сибирский научный медицинский журнал, 2007, 2, 34-37. ЧЕРНУХ A.M. и др. Особенности течения экспериментального цирроза печени под влиянием печеночной РНК. Бюлл. экспер. биологии и медицины, 1970, N10, с. 12-15. HAGA H. et al. Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Improve Survival from Lethal Hepatic Failure in Mice. Stem Cells Transl Med. 2017 Apr; 6(4): 1262-1272. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744846C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2021-03-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Способ лечения острой печёночной недостаточности |
| RU2822653C1 (ru) * | 2023-08-18 | 2024-07-11 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы городская клиническая больница имени С.П. Боткина департамента здравоохранения города Москвы (ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ) | Способ регенеративной клеточной терапии для лечения гепатоцеллюлярной недостаточности при циррозе печени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xia et al. | AdMSC-derived exosomes alleviate acute lung injury via transferring mitochondrial component to improve homeostasis of alveolar macrophages | |
| ES2608974T3 (es) | Composiciones de células madre mesenquimales purificadas | |
| KR100617648B1 (ko) | 혈장 또는 혈청을 함유하는 아벨리노 각막 이영양증 치료용약학 조성물 | |
| Ding et al. | The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients | |
| GB2593712A (en) | Viral infections - treatment with convalescent plasma /serum | |
| AU2012309586B2 (en) | Pharmaceutical composition and manufacturing method therefor | |
| US20030149011A1 (en) | Methods and reagents for extracorporeal immunomodulatory therapy | |
| Beetler et al. | Reconstituted extracellular vesicles from human platelets decrease viral myocarditis in mice | |
| IE44378B1 (en) | Extracts of the haemopoietic system | |
| CN111184716A (zh) | 普乐沙福在制备预防或治疗gsdmd蛋白相关疾病药物中的应用 | |
| RU2701792C1 (ru) | Способ лечения острой печеночной недостаточности | |
| EP2216033B1 (en) | Methods of treating disease by transplantation of allogeneic or xenogeneic organs or tissues | |
| US20210154235A1 (en) | Stromal stem cell therapeutics and methods of use | |
| RU2450052C2 (ru) | Способ получения бета-клеток поджелудочных желез кроликов и композиция для стимуляции выработки собственного инсулина у пациента | |
| EP4198043A1 (en) | Method for producing an antigen corresponding to the inactivated sars-cov-2 virus, antigen corresponding to the inactivated sars-cov-2 virus, antigenic composition, kits, and uses thereof | |
| RU2650209C1 (ru) | Способ коррекции печеночной недостаточности в эксперименте | |
| JPH10167982A (ja) | 劇症肝炎疾患治療剤 | |
| RU2739996C1 (ru) | Способ коррекции хронической печёночной недостаточности | |
| RU2744846C1 (ru) | Способ лечения острой печёночной недостаточности | |
| CN114599379A (zh) | 一种用于预防或治疗脓毒症的药物组合物、试剂盒及其应用和治疗方法 | |
| Jiang et al. | TNF-α Mediated the Disruption of Hepatic Tight Junction Expression in Blood–Biliary Barrier of Colitis via Downregulating PI3K/AKT Signaling Pathway | |
| RU2655761C1 (ru) | Применение суммарной рибонуклеиновой кислоты (РНК) из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга млекопитающего в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности | |
| US20140309167A1 (en) | Combination of active ingredients for the treatment of acute kidney injury | |
| CN110898080B (zh) | 鲎血浆在促生长发育中的应用 | |
| EP0142109B1 (en) | Macromolecules extracted from cultured mesenchymal cells for the treatment of degenerative diseases |