RU2701375C1 - СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD - Google Patents
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD Download PDFInfo
- Publication number
- RU2701375C1 RU2701375C1 RU2019108704A RU2019108704A RU2701375C1 RU 2701375 C1 RU2701375 C1 RU 2701375C1 RU 2019108704 A RU2019108704 A RU 2019108704A RU 2019108704 A RU2019108704 A RU 2019108704A RU 2701375 C1 RU2701375 C1 RU 2701375C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mutation
- exon
- dpyd
- gene
- human genotype
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 101150116866 Dpyd gene Proteins 0.000 title claims description 20
- 102200072913 rs2297595 Human genes 0.000 title abstract description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims 1
- 101000902632 Homo sapiens Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 8
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102100022334 Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] Human genes 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010066455 Dihydrouracil Dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 description 5
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 229940053867 xeloda Drugs 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 208000034428 5-fluorouracil toxicity Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетики. Предложен способ определения генотипа человека по мутации с.496A>G в 6 экзоне гена DPYD, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM) и оптимизацией ПЦР с помощью применения адаптированного буфера для Taq-полимеразы состава Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность и специфичность способа определения генотипа человека по мутации с.496A>G в 6 экзоне гена DPYD. 1 ил., 3 пр.
Description
Предложенный способ относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетике, и может быть использован для определения генотипа человека по мутации с.496A>G (p.M166V, rs2297595) в 6 экзоне гена DPYD (ENST00000370192.7, RefSeq NM_000110) с отнесением исследуемого образца к гомозиготе по «дикому типу», гомозиготе или гетерозиготе по диагностируемому аллельному варианту.
Фармакогенетическое тестирование с целью прогноза развития токсических и побочных эффектов при проведении лекарственного лечения является одним из активно развивающихся направлений в ДНК-тестировании и постепенно занимает свое место во многих клинических рекомендациях по лечению злокачественных новообразований. Разработка и внедрение способа тестирования полиморфных вариантов в гене DPYD, одобренного FDA (Food and Drug Administration) и включенного в рекомендации ESMO (European Society of Clinical Oncology) для прогнозирования токсичности химиотерапии при лечении ряда злокачественных новообразований, является одним из приоритетных направлений в фармакогенетическом тестировании.
Ген DPYD кодирует фермент дигидропиримидиндегидрогеназу, функциональная недостаточность которой, приводит к развитию 5-фторурацил-ассоциированной токсичности (OMIM 274270) при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»). ДНК-диагностика, основанная на определении генотипа человека по мутациям и полиморфизмам в гене DPYD, необходима для прогнозирования развития осложнений, ассоциированных с приемом данных лекарственных препаратов, коррекции дозы и схемы проводимого лечения.
Широко распространен способ определения полиморфных вариантов и мутаций в гене DPYD с помощью секвенирования по Сэнгеру всей кодирующей последовательности гена DPYD (Kuilenburg, A. Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del(1)(p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum.Genet. - 2009. - V.125. - P. 589-590).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования.
Известен способ генотипирования полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на применении метода ПЦР c детекцией результатов в режиме реального времени (Real-time PCR) (Deenen, M. Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms and Haplotypes in DPYD and Toxicity and Efficacy of Capecitabine in Advanced Colorectal Cancer / Deenen, M., Tol J., Burylo A. et al. // Clin. Cancer Res. - V. 17. - P. 3455-3468).
Недостатки: высокая стоимость проведения исследования.
Известен способ определения полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на гибридизации на чипах с применением аллель-специфичных зондов (т.н. SNP-array) (Rosmarin, D. Genetic Markers of Toxicity From Capecitabine and Other Fluorouracil-Based Regimens: Investigation in the QUASAR2 Study, Systematic Review and Meta-Analysis / Dan R., Palles C., Church D. et al. // Journal of clinical oncology. - 2014. - V. 32).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.
Известен способ ДНК-тестирования мутаций в гене DPYD с помощью ПЦР с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов, т.н. ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) (Uzunkoy, A. Investigation of IVS14+1G>A polymorphism of DPYD gene in a group of Turkish patients with colorectal cancer / Uzunkoy, A., Dilmec F., Ozgonul A. et al. // Anticancer Res. - 2007. - V. 27. - P. 3899-3902).
Недостатки: трудоемкость, времязатратность.
Одним из способов диагностики мутаций в гене DPYD является высокоэффективная жидкостная хроматография (Ezzeldin, H. Denaturing high performance liquid chromatography analysis of the DPYD gene in patients with lethal 5-fluorouracil toxicity / Ezzeldin, H., Johnson MR, Okamoto, Y. et al. // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 1. - P. 3021-3028).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.
Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по мутации с.496A>G в 6 экзоне гена DPYD, ответственного за развитие токсических побочных эффектов при назначении 5-фторурацила и его аналогов.
Задача решается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов, образующих короткий фрагмент ДНК, который включает фрагмент гена DPYD с искомым вариантом, и оптимизации ПЦР с помощью адаптированного оригинального буфера для Taq-полимеразы. Высокая специфичность заявляемого способа диагностики мутации с.496A>G достигается за счет оригинального дизайна олигонуклеотидов, позволяющих получить короткий целевой фрагмент гена.
Техническим результатом заявляемого изобретения является широкая доступность, высокая чувствительность и специфичность при низкой стоимости исследования. Реакционные смеси включают специфичные оригинальные последовательности олигонуклеотидов, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения специфичных оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей.
Технический результат достигается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов, оптимизации условий проведения ПЦР с использованием оригинального состава буфера для Taq-полимеразы, отработки технических условий для проведения HRM-анализа.
Последовательность специфичных оригинальных олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательностей олигонуклеотидов.
Копия перечня последовательностей олигонуклеотидов, представленная на машиночитаемом носителе, идентична перечню последовательностей в печатной форме.
Используются последовательности олигонуклеотидов:
SEQ ID NO 1; SEQ ID NO 2.
Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: дизайн олинуклеотидов, строго комплементарных целевой последовательности ДНК. Длина образуемого фрагмента ДНК составляет 106 пар нуклеотидов.
Состав буфера для Taq-полимеразы: Трис-HCl 67 mM, (NH
4
)
2
SO
4
166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7;
- Режим проведения ПЦР:
1 этап: денатурация при t=95°С в течение 5 мин
2 этап: 50 циклов ПЦР
- денатурация при t=95°С в течение 15 сек
- отжиг олигонуклеотидов при t=58°С в течение 15 сек
- элонгация при t=72°С в течение 40 сек
3 этап: элонгация при t=72° в течение 2 мин.
4 этап: плавление продуктов ПЦР при t=72°-95°C
5 этап: охлаждение и хранение при t=95°-12°C.
Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется как во время отжига олигонуклеотидов на каждом цикле ПЦР, так и при плавлении продуктов ПЦР с частотой 45 на 1°C.
Изобретение иллюстрируется фигурой, на которой представлено графическое изображение образцов ДНК с различными генотипами по мутации с.496A>G.
Изобретение иллюстрируется примерами 1, 2 и 3.
Пример 1.
Ф.И.О.: Пациент М.
Возраст: 1964 г.р.
Диагноз: Cr. сигмовидной кишки.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации с.496A>G (p.M166V (rs2297595)), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.
Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, герминальных мутаций в 6 экзоне гена DPYD не выявлено.
Пример 2.
Ф.И.О.: Пациент М.
Возраст: 1963 г.р.
Диагноз: Cr. толстой кишки.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации с.496A>G (p.M166V (rs2297595)), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.
Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, в 6 экзоне гена DPYD выявлена герминальная мутация с.496A>G (p.M166V (rs2297595)) в гетерозиготном состоянии.
Выявленная герминальная мутация с.496A>G в гене DPYD зарегистрирована в международных базах данных dbSNP и Ensembl.genome как высоко-патогенный клинически значимый вариант, ассоциированный с высоким риском развития токсичности при использовании 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»).
Пример 3.
Ф.И.О.: Пациент Р.
Возраст: 1955 г.р.
Диагноз: Cr. толстой кишки.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации с.496A>G (p.M166V (rs2297595)), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.
Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, в 6 экзоне гена DPYD выявлена герминальная мутация с.496A>G (p.M166V (rs2297595)) в гомозиготном состоянии.
Выявленная герминальная мутация с.496A>G в гене DPYD зарегистрирована в международных базах данных dbSNP и Ensembl.genome как высоко-патогенный клинически значимый вариант, ассоциированный с высоким риском развития токсичности при использовании 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»).
Claims (1)
- Способ определения генотипа человека по мутации с.496A>G в 6 экзоне гена DPYD, включающий проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией результатов с помощью метода анализа кривых плавления (HRM), отличающийся использованием специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов SEQ ID NO 1 и SEQ ID 2 и оптимизацией ПЦР с помощью применения адаптированного буфера для Taq-полимеразы состава: Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019108704A RU2701375C1 (ru) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019108704A RU2701375C1 (ru) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2701375C1 true RU2701375C1 (ru) | 2019-09-26 |
Family
ID=68063214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019108704A RU2701375C1 (ru) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2701375C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2335541C1 (ru) * | 2007-04-17 | 2008-10-10 | Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) | Способ определения мутаций гена mtrnr1 при острой нейросенсорной тугоухости, вызванной применением антибиотиков из группы аминогликозидов |
| WO2010067208A2 (en) * | 2008-12-11 | 2010-06-17 | Moritz Eidens | Genotyping dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency |
| US20110311972A1 (en) * | 2006-06-23 | 2011-12-22 | Myriad Genetics, Incorporated | Dpyd gene variants and use thereof |
-
2019
- 2019-03-26 RU RU2019108704A patent/RU2701375C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110311972A1 (en) * | 2006-06-23 | 2011-12-22 | Myriad Genetics, Incorporated | Dpyd gene variants and use thereof |
| RU2335541C1 (ru) * | 2007-04-17 | 2008-10-10 | Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) | Способ определения мутаций гена mtrnr1 при острой нейросенсорной тугоухости, вызванной применением антибиотиков из группы аминогликозидов |
| WO2010067208A2 (en) * | 2008-12-11 | 2010-06-17 | Moritz Eidens | Genotyping dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gajecka et al. | Localization of a gene for keratoconus to a 5.6-Mb interval on 13q32 | |
| Sullivan et al. | Prevalence of disease-causing mutations in families with autosomal dominant retinitis pigmentosa: a screen of known genes in 200 families | |
| CN102203296B (zh) | 年龄相关的黄斑变性中的遗传多态性 | |
| EP3507384B1 (en) | Methods and composition for the prediction of the activity of enzastaurin | |
| Saarela et al. | PRKCA and multiple sclerosis: association in two independent populations | |
| US20090017452A1 (en) | Methods and compositions relating to the pharmacogenetics of different gene variants | |
| RU2701375C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ c.496AG B 6 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD | |
| RU2709645C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ с.1236GA В 11 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD | |
| AU2012326089A1 (en) | Codon signature for neuromyelitis optica | |
| JP6053681B2 (ja) | イヌの緑内障を診断する方法及びキット | |
| RU2709710C1 (ru) | Способ определения генотипа человека по мутации ivs14+1ga b 14 интроне гена dpyd | |
| JP2010502205A (ja) | Ｇｔｐシクロヒドロラーゼ１遺伝子（ｇｃｈ１）中の疼痛保護的ハプロタイプの診断のためのｓｎｐの使用 | |
| RU2729360C9 (ru) | Способ анализа герминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 с использованием мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) | |
| RU2730880C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПА ЧЕЛОВЕКА ПО МУТАЦИИ с.2194 G>A В 18 ЭКЗОНЕ ГЕНА DPYD | |
| Isman et al. | PAX9 polymorphisms and susceptibility with sporadic tooth agenesis in Turkish populations: a case-control study | |
| US20050255498A1 (en) | APOC1 genetic markers associated with age of onset of Alzheimer's Disease | |
| US20060166219A1 (en) | NTRK1 genetic markers associated with progression of Alzheimer's disease | |
| CA2542629A1 (en) | Ntrk1 genetic markers associated with age of onset of alzheimer's disease | |
| RU2703805C1 (ru) | Способ определения генотипа человека по полиморфизму ugt1a1*6/*28 в промотерной области гена ugt1a1 | |
| WO2003057920A1 (en) | Drug response marker in beta-1 adrenergic receptor gene | |
| KR101167945B1 (ko) | Ａｔｇ16ｌ1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법 | |
| US20050250122A1 (en) | APOA4 genetic markers associated with progression of Alzheimer's disease | |
| US20090247475A1 (en) | Methods and compositions relating to pharmacogenetics of different gene variants in the context of irinotecan-based therapies | |
| KR20250118434A (ko) | 알츠하이머병 발병 위험도 예측을 위한 레이 복잡도 지연 회상 점수 저하와 관련이 있는 단일염기다형성 마커 및 이의 용도 | |
| KR101167942B1 (ko) | Ａｌｇ12 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법 |