RU2799873C2

RU2799873C2 - Small molecule inhibitors of the phosphorylated bcl-2-associated death promoter (bad)

Info

Publication number: RU2799873C2
Application number: RU2019135562A
Authority: RU
Inventors: Питер Эдвард ЛОБИ; Виджей Кумар ПАНДЕЙ; Рангаппа КАНЧУГАРАКОППАЛ СУББЕГОВДА; Бассаппа САЛУНДИ; Мохан ЧАКРАБХАВИ ДХАНАНДЖАЯ; Шобит РАНГАППА; Шриниваса ВЕНКАТАЧАЛАИАХ
Original assignee: Нэшенел Юнивёрсити Оф Сингапур; Юнивёрсити Оф Майсур; Бангалор Юнивёрсити
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2023-07-13

Abstract

FIELD: pharmaceutical industry.

SUBSTANCE: invention relates to new compounds of general formula (I)

where each R¹ is independently OH, NR¹⁰R¹¹, with each of R¹⁰ and R¹¹ independently selected from C_1-6 alkyl; n is 1, 2 or 3; R^2a and R^2b together with the nitrogen atom to which they are attached form a piperazine substituted with one R⁶ substituent; each R⁶ is independently selected from phenyl which may be substituted with 1–2 substituents selected from halo, C_1-2 alkyl; R³ is phenyl, naphthyl, 5–6 membered heteroaryl containing 1 heteroatom selected from O, N and S, any of which is optionally substituted with one R⁷ substituent selected from halo, -O(C_1-4 alkyl), -C_1-4 haloalkyl or -C(O)NR⁸R⁹; each of R⁸ and R⁹ is independently selected from H or C_3-6 cycloalkyl; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

EFFECT: obtaining new compounds being the inhibitors of Bcl-2-associated death promoter (BAD) phosphorylation that have anti-apoptotic activity and are useful in the treatment of cancer, in particular, breast cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, or pancreatic cancer.

14 cl, 22 dwg, 2 tbl, 9 ex

Description

Настоящее изобретение относится к новым соединениям и, в частности, к соединениям, которые являются ингибиторами Bcl-2-ассоциированного промотора смерти (BAD) в раковых клетках, к соединениям для применения в лечении или предупреждении рака и к фармацевтическим композициям, содержащим данные соединения.The present invention relates to novel compounds, and in particular to compounds that are inhibitors of the Bcl-2 associated death promoter (BAD) in cancer cells, to compounds for use in the treatment or prevention of cancer, and to pharmaceutical compositions containing these compounds.

Апоптоз или программируемая смерть клеток представляет собой регуляторный механизм, повторно участвующий в уничтожении аутореактивных клеток иммунной системы, состарившихся клеток и клеток с невосстанавливаемым повреждением ДНК [1]. Апоптоз осуществляется двумя отличающимися механизмами у позвоночных - внешним и внутренним путем [2]. Внутренний путь активируется в условиях гипоксии, после серьезного повреждения генома, окислительного стресса или после истощения факторов роста [3]. Белки семейства BCL-2 играют ведущую роль в регуляции внутреннего апоптотического пути [4]. Более 20 членов семейства BCL-2 идентифицировано и широко подразделено на антиапоптотические, проапоптотические и только ВН3 белки. BCL-2, BCL-xL и BCL-w являются антиапоптотическими; BAK и ВАХ являются проапоптотическими; и BAD, BIM, PUMA, NOXA являются преобладающими проапоптотическими только ВН3 белками [5-7]. Таким образом, члены семейства BCL-2 выполняют как про-, так и антиапоптотические функции при равновесии, поддерживаемом между ними, и проапоптотические только ВН3 белки обычно репрессируются с обеспечением гомеостаза [8].Apoptosis or programmed cell death is a regulatory mechanism that is repeatedly involved in the destruction of autoreactive cells of the immune system, senescent cells, and cells with irreversible DNA damage [1]. Apoptosis is carried out by two different mechanisms in vertebrates - external and internal pathways [2]. The intrinsic pathway is activated under conditions of hypoxia, after severe damage to the genome, oxidative stress, or after depletion of growth factors [3]. Proteins of the BCL-2 family play a leading role in the regulation of the internal apoptotic pathway [4]. More than 20 members of the BCL-2 family have been identified and broadly subdivided into anti-apoptotic, pro-apoptotic, and only BH3 proteins. BCL-2, BCL-xL and BCL-w are anti-apoptotic; BAK and BAX are proapoptotic; and BAD, BIM, PUMA, NOXA are the predominant pro-apoptotic BH3-only proteins [5–7]. Thus, members of the BCL-2 family perform both pro- and anti-apoptotic functions in an equilibrium maintained between them, and only pro-apoptotic BH3 proteins are usually repressed to ensure homeostasis [8].

Супрессия апоптоза способствует ненадлежащему выживанию клеток и развитию и/или прогрессированию рака [9-11]. В большинстве злокачественных опухолей уровень экспрессии антиапоптотических белков повышается, приводя к развитию устойчивости к апоптозу. Bcl-2-ассоциированный промотор смерти (BAD) играет решающую роль в регуляции апоптоза посредством взаимодействия с Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w [12]. Человеческий BAD фосфорилируется в положении Ser75 (эквивалентный мышиный остаток представляет собой Ser112) МАР-киназой р44/42 и в положении Ser99 (эквивалентный мышиный остаток представляет собой Ser136) посредством AKT/p70S6K [13]. Оба сериновых остатка также фосфорилируются киназами семейства Pim, что предотвращает апоптоз [14]. Фосфорилирование BAD на уровне одного из данных остатков приводит к потере способности hBAD к гетеродимеридации с BCL-xL или BCL-2 [15]. Фосфорилированный белок BAD гетеродимеризован с белком 14-3-3 и секвестрирован в цитоплазме [16]. При инициировании апоптоза BAD подвергается дефосфорилированию и гетеродимеризуется с BCL-2, BCL-xL или BCL-w, что позволяет BAK и ВАХ стимулировать высвобождение цитохрома С в цитоплазму с последующей стимуляцией внутреннего апоптотического пути [17]. Также сообщалось, что BAD сохраняет другие белковые и функциональные взаимодействия в пределах клетки. Например, экспрессия BAD регулируется р53 и комплексами BAD с р53, что стимулирует апоптоз [18]. Bad демонстрирует транскрипционно повышающую регуляцию р53 и образует комплекс Bad/p53 в митохондриях, вызывая апоптоз [18]. Клинически, высокий уровень экспрессии BAD ассоциирован с высокими значениями шкалы Глисона при раке предстательной железы [15], и сообщалось, что фосфорилирование BAD предсказывает низкую общую выживаемость при раке яичника [19] и ассоциировано с устойчивостью к циспластину [19]. Кроме того, фосфорилированный BAD наблюдается в более чем 80% популяции CD44 позитивных опухолевых стволовых клеток (CSC - от англ. cancer stem cell) при раке молочной железы, и сообщалось, что фосфорилирование BAD является существенным для выживания CSC [20].Suppression of apoptosis contributes to improper cell survival and the development and/or progression of cancer [9–11]. In most malignant tumors, the level of expression of anti-apoptotic proteins is increased, leading to the development of resistance to apoptosis. The Bcl-2-associated death promoter (BAD) plays a crucial role in the regulation of apoptosis through interaction with Bcl-2, Bcl-xL, and Bcl-w [12]. Human BAD is phosphorylated at position Ser75 (equivalent mouse residue is Ser112) by MAP kinase p44/42 and at position Ser99 (equivalent mouse residue is Ser136) by AKT/p70S6K [13]. Both serine residues are also phosphorylated by kinases of the Pim family, which prevents apoptosis [14]. Phosphorylation of BAD at the level of one of these residues leads to the loss of the ability of hBAD to heterodimeridate with BCL-xL or BCL-2 [15]. The phosphorylated BAD protein is heterodimerized with the 14-3-3 protein and sequestered in the cytoplasm [16]. When apoptosis is initiated, BAD undergoes dephosphorylation and heterodimerizes with BCL-2, BCL-xL, or BCL-w, which allows BAK and BAX to stimulate the release of cytochrome C into the cytoplasm, followed by stimulation of the internal apoptotic pathway [17]. BAD has also been reported to conserve other protein and functional interactions within the cell. For example, BAD expression is regulated by p53 and BAD complexes with p53, which stimulates apoptosis [18]. Bad demonstrates transcriptionally upregulation of p53 and forms the Bad/p53 complex in mitochondria, inducing apoptosis [18]. Clinically, high BAD expression is associated with high Gleason scores in prostate cancer [15], and BAD phosphorylation has been reported to predict poor overall survival in ovarian cancer [19] and is associated with cisplastin resistance [19]. In addition, phosphorylated BAD is observed in over 80% of the CD44 positive cancer stem cell (CSC) population in breast cancer, and BAD phosphorylation has been reported to be essential for CSC survival [20].

Разработаны многочисленные низкомолекулярные модуляторы программируемой смерти клеток, нацеленные на белки семейства BCL-2, для терапевтического применения против разных злокачественных опухолей человека [21-23]. На сегодняшний день не сообщалось о низкомолекулярных модуляторах только ВНЗ белков, таких как BAD. Таким образом, существует необходимость в разработке лучших и эффективных соединений/терапий для контролирования рака посредством ингибирования фосфорилирования BAD, не влияя на происходящие ранее события.Numerous low molecular weight programmed cell death modulators targeting proteins of the BCL-2 family have been developed for therapeutic use against various human malignant tumors [21-23]. To date, no small molecular weight modulators of only BH3 proteins, such as BAD, have been reported. Thus, there is a need to develop better and more effective compounds/therapies to control cancer by inhibiting BAD phosphorylation without affecting pre-existing events.

В настоящем изобретении предложено соединение общей формулы (I):The present invention provides a compound of general formula (I):

где:Where:

каждый R¹ независимо представляет собой галогено, ОН, циано, нитро, NR¹⁰R¹¹, C(O)R¹⁰, C(O)OR¹⁰, C(O)NR¹⁰R¹¹, -S(O)_qNR¹⁰R¹¹, C_1-6 алкил, C_1-6 галогеналкил, -O(С_1-6 алкил), -O(С_1-6 галогеналкил), арил, гетероарил, -О-арил или -О-гетероарил,every R¹ independently represents halo, OH, cyano, nitro, NR¹⁰R^eleven, C(O)R¹⁰, C(O)OR¹⁰, C(O)NR¹⁰R^eleven, -S(O)_qNR¹⁰R^eleven, C_1-6 alkyl, C_1-6 haloalkyl, -O(C_1-6 alkyl), -O(C_1-6 haloalkyl), aryl, heteroaryl, -O-aryl or -O-heteroaryl,

гдеWhere

каждый из R¹⁰ и R¹¹ независимо выбран из Н или С_1-6 алкила, факультативно замещенного одним или более заместителями, выбранными из ОН, галогено, циано, NH₂, арила или гетероарила;each of R ¹⁰ and R ¹¹ is independently selected from H or C _1-6 alkyl optionally substituted with one or more substituents selected from OH, halo, cyano, NH ₂ , aryl, or heteroaryl;

алкильная и галогеналкильная группы R¹ факультативно замещены одним или более заместителями, выбранными из ОН, циано, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, арила, гетероарила, -О-арила или -О-гетероарил -O(C_1-6 алкила), факультативно замещенного арилом или -O(C_1-6 галогеналкилом);the R ¹ alkyl and haloalkyl groups are optionally substituted with one or more substituents selected from OH, cyano, -S(O) _p NR ⁴ R ⁵ , -C(O)NR ⁴ R ⁵ , aryl, heteroaryl, -O-aryl or -O-heteroaryl -O(C _1-6 alkyl) optionally substituted with aryl or -O(C _1-6 haloalkyl ohm);

арильная или гетероарильная группы R¹ факультативно замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, циано, нитро, -NR⁴R⁵, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, -C(O)R⁴, -C(O)OR⁴ или -C_1-6 алкила или -O(C_1-6 алкила), каждый из которых факультативно замещен одним или более заместителями, выбранными из ОН, галогено, арила, гетероарила, -O(С_1-6 алкила), O(C_1-6 галогеналкила), -О-арила или -О-гетероарила);aryl or heteroaryl R ¹ groups are optionally substituted with one or more substituents selected from halo, OH, cyano, nitro, -NR ⁴ R ⁵ , -S(O) _p NR 4 R 5 , -C(O)NR ⁴ R ⁵ , -C(O)R ⁴ , -C(O)OR ⁴ or -C _1-6 alkyl or -O(C _1-6 alkyl), each of which is optionally substituted with one or ^more substituents selected from OH, halo, aryl, heteroaryl, -O(C _1-6 alkyl ⁾ , O(C _1-6 haloalkyl), -O-aryl or -O-heteroaryl);

p равен 1 или 2;p is 1 or 2;

каждый из R⁴ и R⁵ независимо выбран из Н или C_1-4 алкила, или R⁴ и R⁵ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 3- или 8-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;each of R ⁴ and R ⁵ is independently selected from H or C _1-4 alkyl, or R ⁴ and R ⁵ together with the nitrogen atom to which they are attached, may form a 3- or 8-membered heterocyclic ring, optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N and S;

n равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5;n is 0, 1, 2, 3, 4, or 5;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой C_1-6 алкил, факультативно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, арила или гетероарила; илиeach of R ^2a and R ^2b is independently C _1-6 alkyl optionally substituted with one or more substituents selected from halo, OH, aryl, or heteroaryl; or

R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N или S и факультативно замещенных одним или более заместителями R⁶;R ^2a and R ^2b together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5- or 6-membered heterocyclic ring optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N or S and optionally substituted with one or more R ⁶ substituents;

каждый R⁶ независимо выбран из арила, гетероарила, -О-арила, -О-гетероарила, карбоциклила, гетероциклила, -О-карбоциклила, -О-гетероциклила, R¹², OR¹², C(O)R¹², C(O)OR¹¹, C(O)NR¹¹R¹², CN, OH,each R ⁶ is independently selected from aryl, heteroaryl, -O-aryl, -O-heteroaryl, carbocyclyl, heterocyclyl, -O-carbocyclyl, -O-heterocyclyl, R ¹² , OR ¹² , C(O)R ¹² , C(O)OR ¹¹ , C(O)NR ¹¹ R ¹² , CN, OH,

каждый из R¹¹ и R¹² независимо представляет собой Н или С_1-4 алкил, каждый из которых может быть замещен одной или более арильными или гетероарильными группами, где арильные и гетероарильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, циано, нитро, -NR⁴R⁵, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, -C(O)R⁴, -C(O)OR⁴ или -C_1-6 алкила или -O(C_1-6 алкила), каждый из которых факультативно замещен одним или более заместителями, выбранными из ОН, галогено, арила, гетероарила, -O(C_1-6 алкила), O(C_1-6 галогеналкила), -О-арила или -О-гетероарила);each of R ¹¹ and R ¹² independently represents H or C _1-4 alkyl, each of which may be substituted with one or more aryl or heteroaryl groups, where aryl and heteroaryl groups are substituted with one or more substituents selected from halo, OH, cyano, nitro, -NR ⁴ R ⁵ , -S(O) _p NR ⁴ R ⁵ , -C(O)NR ⁴ R ⁵ , -C(O) R ⁴ , -C(O)OR ⁴ or -C _1-6 alkyl or -O(C _1-6 alkyl), each optionally substituted with one or more substituents selected from OH, halo, aryl, heteroaryl, -O(C _1-6 alkyl), O(C _1-6 haloalkyl), -O-aryl or -O-heteroaryl);

где R⁴ и R⁵ представляют собой такие, как определено выше; или R¹¹ и R¹² могут объединяться с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членного гетероциклического кольца, содержащего один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из N, О и S, и факультативно замещенного C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом или галогеном;where R ⁴ and R ⁵ are as defined above; or R ¹¹ and R ¹² may combine with the nitrogen atom to which they are attached to form a 3-8 membered heterocyclic ring containing one or more additional heteroatoms selected from N, O and S and optionally substituted with C _1-4 alkyl, C _1-4 haloalkyl or halogen;

R³ представляет собой арил, гетероарил, карбоциклил или гетероциклил, любой из которых факультативно замещен одним или более заместителями R⁷, выбранными из галогено, -С_1-4 алкила, факультативно замещенного арилом, -O(C_1-4 алкила), факультативно замещенного арилом, - C_1-4 галогеналкила, -O(C_1-4 галогеналкила) или -C(O)NR⁸R⁹;R ³ is aryl, heteroaryl, carbocyclyl, or heterocyclyl, any of which is optionally substituted with one or more R ⁷ substituents selected from halo, -C _1-4 alkyl optionally substituted with aryl, -O(C _1-4 alkyl) optionally substituted with aryl, -C _1-4 haloalkyl, -O(C _1-4 haloalkyl), or - C(O)NR ⁸ R ⁹ ;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н, C_1-4 алкила или С_3-6 циклоалкила, или R⁸ и R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;each of R ⁸ and R ⁹ is independently selected from H, C _1-4 alkyl or C _3-6 cycloalkyl, or R ⁸ and R ⁹ together with the nitrogen atom to which they are attached, may form a 5- or 6-membered heterocyclic ring, optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N and S;

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, или их дейтерированный или тритированный вариант, включая все стереоизомеры.or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate thereof, or a deuterated or tritiated variant thereof, including all stereoisomers.

Соединения общей формулы (I) ингибируют сайт-специфичное фосфорилирование BAD, не оказывая влияния на действующую выше киназу, и, таким образом, являются полезными в стимулировании апоптоза во множестве клеток ракового происхождения.The compounds of general formula (I) inhibit the site-specific phosphorylation of BAD without affecting the upstream kinase and thus are useful in promoting apoptosis in a variety of cancer cells.

В настоящем описании изобретения, за исключением случаев, когда из контекста следует иное за счет ясно выраженного языка или необходимо подразумеваемого положения, слово «включает» или варианты, такие как «сдержит» или «содержащий», используется во включающем смысле, то есть для определения наличия указанных признаков, но не для исключения наличия или добавления дополнительных признаков в разных воплощениях изобретения.In the present description of the invention, except when the context implies otherwise due to express language or a necessary implied provision, the word "comprises" or options such as "contains" or "comprising" is used in the inclusive sense, that is, to determine the presence of these features, but not to exclude the presence or add additional features in different embodiments of the invention.

В настоящем описании изобретения термин «C_1-6 алкил» относится к полностью насыщенной неразветвленной или разветвленной углеводородной цепи, имеющей от 1 до 6 атомов углерода. Примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, трет-бутил, н-гексил.In the present description of the invention, the term "C _1-6 alkyl" refers to a fully saturated straight or branched hydrocarbon chain having from 1 to 6 carbon atoms. Examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, t-butyl, n-hexyl.

Термин «C_1-4 алкил» имеет похожее значение, но относится к алкильным группам с 1-4 атомами углерода.The term "C _1-4 alkyl" has a similar meaning, but refers to alkyl groups with 1-4 carbon atoms.

Термин «C_1-6 галогеналкил» относится к C_1-6 алкильной группе, как определено выше, в которой один или более атомов водорода заменены атомами галогена. Галогеналкильные группы могут иметь любое число заместителей - атомов галогена от 1 до полного замещения атомами галогена. Примеры включают хлорметил, трифторметил, 1-бромэтил, 1,1,2,2-тетрафторэтил и т.д.The term "C _1-6 haloalkyl" refers to a C _1-6 alkyl group, as defined above, in which one or more hydrogen atoms have been replaced by halogen atoms. Haloalkyl groups can have any number of substituents - halogen atoms from 1 to complete substitution with halogen atoms. Examples include chloromethyl, trifluoromethyl, 1-bromoethyl, 1,1,2,2-tetrafluoroethyl, etc.

Термин «карбоциклил» относится к неароматическому углеводородному кольцу, имеющему от 3 до 7 атомов углерода и факультативно содержащему одну или более углерод-углеродных двойных связей. Примеры включают C_3-7 циклоалкильные группы, такие как следующие группы: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил, и циклоалкенильные группы, такие как циклогексенил.The term "carbocyclyl" refers to a non-aromatic hydrocarbon ring having 3 to 7 carbon atoms and optionally containing one or more carbon-carbon double bonds. Examples include C _3-7 cycloalkyl groups such as the following groups: cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl, and cycloalkenyl groups such as cyclohexenyl.

Термин «гетероциклил» относится к неароматическому кольцу, имеющему от 5 до 7 атомов углерода и по меньшей мере один кольцевой гетероатом, выбранный из N, О и S. Примеры включают пиперазинил, пиперидинил, морфолинил, пирролидинил и имидазолинил.The term "heterocyclyl" refers to a non-aromatic ring having 5 to 7 carbon atoms and at least one ring heteroatom selected from N, O, and S. Examples include piperazinyl, piperidinyl, morpholinyl, pyrrolidinyl, and imidazolinyl.

В настоящем описании изобретения термин «галогено» относится к фтор-, хлор-, бром- или йод-.In the present description of the invention, the term "halo" refers to fluorine, chlorine, bromine or iodine.

Термин «арил» в контексте настоящего описания изобретения относится к кольцевой системе с ароматическим характером, имеющей от 5 до 14 кольцевых атомов углерода, если не указано иное, и содержащей вплоть до трех колец. Когда арильная группа содержит более одного кольца, не все кольца должны быть полностью ароматическими по характеру. Примеры ароматических группировок представляют собой бензол, нафталин, индан и инден.The term "aryl" in the context of the present description of the invention refers to a ring system with an aromatic character, having from 5 to 14 ring carbon atoms, unless otherwise indicated, and containing up to three rings. When an aryl group contains more than one ring, not all rings need be fully aromatic in character. Examples of aromatic groups are benzene, naphthalene, indane and indene.

Термин «гетероарил» в контексте описания изобретения относится к кольцевой системе с ароматическим характером, имеющей от 5 до 14 кольцевых атомов (если не указано иное), по меньшей мере один из которых представляет собой гетероатом, выбранный из N, О и S, и содержащей вплоть до трех колец. Когда гетероарильная группа содержит более одного кольца, не все кольца должны быть полностью ароматическими по характеру. Примеры гетероарильных групп включают пиридин, пиримидин, индол, изоиндол, бензофуран, бензимидазол, бензоксазол, бензизоксазол и индолен.The term "heteroaryl" in the context of the description of the invention refers to a ring system with an aromatic character, having from 5 to 14 ring atoms (unless otherwise indicated), at least one of which is a heteroatom selected from N, O and S, and containing up to three rings. When a heteroaryl group contains more than one ring, not all of the rings need be wholly aromatic in character. Examples of heteroaryl groups include pyridine, pyrimidine, indole, isoindole, benzofuran, benzimidazole, benzoxazole, benzisoxazole and indolene.

В соединениях общей формулы (I) n надлежащим образом равен 2 или 3, например, 2. По меньшей мере одна R¹ группа может представлять собой ОН. В данном случае ОН группа надлежащим образом находится в положении, расположенном рядом с -CH(R³)NR^2aR^2b группой.In compounds of general formula (I), n is suitably 2 or 3, for example 2. At least one R ¹ group may be OH. In this case, the OH group is suitably located adjacent to the -CH(R ³ )NR ^2a R ^2b group.

Надлежащим образом, соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IA):Suitably, a compound of general formula (I) is a compound of general formula (IA):

где R¹, R^2a, R^2b и R³ представляют собой такие, как определено выше, и m равен 0, 1, 2, 3 или 4.where R ¹ , R ^2a , R ^2b and R ³ are as defined above and m is 0, 1, 2, 3 or 4.

Надлежащим образом, в соединении общей формулы (I) и (IA):Suitably, in a compound of general formula (I) and (IA):

каждый R¹ независимо представляет собой галогено, C_1-6 алкил, C_1-6 галогеналкил, арил или гетероарил, где арильная или гетероарильная группы факультативно замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, циано, нитро, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, - C_1-6 алкила, факультативно замещенного арилом, - C_1-6 галогеналкила, -O(C_1-6 алкила), факультативно замещенного арилом, или -O(C_1-6 галогеналкила);each R ¹ is independently halo, C _1-6 alkyl, C _1-6 haloalkyl, aryl, or heteroaryl, wherein the aryl or heteroaryl groups are optionally substituted with one or more substituents selected from halo, OH, cyano, nitro, -S(O) _p NR ⁴ R ⁵ , -C(O)NR ⁴ R ⁵ , -C _1-6 alkyl optionally substituted aryl, -C _1-6 haloalkyl, -O(C _1-6 alkyl) optionally substituted with aryl, or -O(C _1-6 haloalkyl);

р равен 0, 1 или 2;p is 0, 1 or 2;

каждый из R⁴ и R⁵ независимо выбран из Н или C_1-4 алкила, или R⁴ и R⁵вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;each of R ⁴ and R ⁵ is independently selected from H or C _1-4 alkyl, or R ⁴ and R ⁵ together with the nitrogen atom to which they are attached, may form a 5- or 6-membered heterocyclic ring, optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N and S;

Каждый из R^2a и R^2b независимо представляют собой C_1-6 алкил, факультативно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, арила или гетероарила; илиR ^2a and R ^2b are each independently C _1-6 alkyl optionally substituted with one or more substituents selected from halo, OH, aryl, or heteroaryl; or

R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N или S, и факультативно замещенное одним или более заместителями R⁶;R ^2a and R ^2b together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5- or 6-membered heterocyclic ring optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N or S and optionally substituted with one or more R ⁶ substituents;

каждый R⁶ независимо выбран из арила, гетероарила, -О-арила, -О-гетероарила или C_1-4 алкила, замещенного одной или более арильными или гетероарильными группами, где арильная и гетероарильная группы замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, алкила, C_1-4 галогеналкила, -O(C_1-4 алкила) или -O(C_1-4 галогеналкила);each R ⁶ is independently selected from aryl, heteroaryl, -O-aryl, -O-heteroaryl, or C _1-4 alkyl substituted with one or more aryl or heteroaryl groups, wherein the aryl and heteroaryl groups are substituted with one or more substituents selected from halo, alkyl, C _1-4 haloalkyl, -O(C _1-4 alkyl) or -O(C _1-4 haloalkyl);

R³ представляет собой арил, гетероарил, карбоциклил или гетероциклил, любой из которых факультативно замещен одним или более заместителями R⁷, выбранными из галогено, -C_1-4 алкила, факультативно замещенного арилом, -O(C_1-4 алкила), факультативно замещенного арилом, - C_1-4 галогеналкила, -O(C_1-4 галогеналкила) или -C(O)NR⁸R⁹;R ³ is aryl, heteroaryl, carbocyclyl, or heterocyclyl, any of which is optionally substituted with one or more R ⁷ substituents selected from halo, -C _1-4 alkyl optionally substituted with aryl, -O(C _1-4 alkyl) optionally substituted with aryl, -C _1-4 haloalkyl, -O(C _1-4 haloalkyl), or - C(O)NR ⁸ R ⁹ ;

каждый R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н, C_1-4 алкила или С_3-6 циклоалкила, или R⁸ и R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;each R ⁸ and R ⁹ is independently selected from H, C _1-4 alkyl or C _3-6 cycloalkyl, or R ⁸ and R ⁹ together with the nitrogen atom to which they are attached, may form a 5- or 6-membered heterocyclic ring, optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N and S;

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, или их дейтерированный или тритированный вариант, включая все стереоизомеры.or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate thereof, or a deuterated or tritiated variant thereof, including all stereoisomers.

В некоторых подходящих соединениях общей формулы (IA) m равен 0, таким образом, что группа R¹ отсутствует.In certain suitable compounds of general formula (IA), m is 0, such that there is no R ¹ group.

В других подходящих соединениях m равен 1 или 2, но чаще 1.In other suitable compounds, m is 1 or 2, but more often 1.

В некоторых случаях R¹ надлежащим образом представляет собой галогено, в частности, хлор- или фтор-; или в качестве альтернативы, R¹ представляет собой арильную или гетероарильную группу, факультативно замещенную, как описано выше. Чаще R¹ представляет собой, хлор-, фтор- или арил, факультативно замещенный, как описано выше.In some cases, R ¹ is suitably halo, in particular chloro or fluoro; or alternatively, R ¹ is an aryl or heteroaryl group optionally substituted as described above. More often, R ¹ is chloro, fluoro, or aryl, optionally substituted as described above.

Когда R¹ представляет собой арильную или гетероарильную группу, он соответствующим образом находиться в 4-ом положении фенильного кольца (где атом углерода, замещенный ОН-группой, обозначается положением 1).When R ¹ is an aryl or heteroaryl group, it is suitably located at the 4th position of the phenyl ring (wherein the carbon atom substituted by the OH group is denoted by position 1).

Подходящие заместители для арильных или гетероарильных групп R¹ включают галогено, ОН, циано, нитро, -SO₂NH₂, -C(O)NR⁴R⁵, -C_1-4 алкил, факультативно замещенный арилом, -С_1-4 галогеналкил, -O(C_1-4 алкил), факультативно замещенный арилом, или -O(C_1-4 галогеналкил), где R⁴ и R⁵ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперидиновое или пирролидиновое кольцо.Suitable substituents for aryl or heteroaryl R ¹ groups include halo, OH, cyano, nitro, -SO ₂ NH ₂ , -C(O)NR ⁴ R ⁵ , -C _1-4 alkyl optionally substituted with aryl, -C _1-4 haloalkyl, -O(C _1-4 alkyl) optionally substituted with aryl, or -O(C _1-4 haloalkyl ), where R ⁴ and R ⁵ together with the nitrogen atom to which they are attached, form a piperidine or pyrrolidine ring.

Более подходящие заместители для арильных или гетероарильных групп R¹ включают хлор-, фтор-, метил, этил, этил, трифторметил, бензил, метокси, этокси, бензилокси, трифторметокси и пиперидин-1-карбонил.More suitable substituents for aryl or heteroaryl groups R ¹ include chloro-, fluoro-, methyl, ethyl, ethyl, trifluoromethyl, benzyl, methoxy, ethoxy, benzyloxy, trifluoromethoxy and piperidine-1-carbonyl.

В некоторых подходящих соединениях по изобретению R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N или S, и факультативно замещенное одним или более заместителями R⁶, где R⁶ представляет собой такой, как определено выше.In certain suitable compounds of the invention, R ^2a and R ^2b , together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 5- or 6-membered heterocyclic ring, optionally containing one or more additional heteroatoms selected from O, N, or S, and optionally substituted with one or more R ⁶ substituents, where R ⁶ is as defined above.

Более подходящим образом, R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно замещенное одним или более заместителями R⁶.More suitably, R ^2a and R ^2b , together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 6-membered heterocyclic ring optionally substituted with one or more R ⁶ substituents.

Еще более подходящим образом, 6-членное кольцо, образованное R^2a и R^2b, представляет собой пиперидиновое или пиперазиновое кольцо, наиболее подходящим образом пиперазиновое кольцо. Когда R^2a и R^2b образуют пиперазиновое кольцо, оно факультативно может быть замещено одним или более заместителями R⁶, как определено выше, но подходящим образом замещено единственным заместителем R⁶ в 4-ом положении пиперазина таким образом, что соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IB):Even more suitably, the 6-membered ring formed by R ^2a and R ^2b is a piperidine or piperazine ring, most suitably a piperazine ring. When R ^2a and R ^2b form a piperazine ring, it may optionally be substituted with one or more R ⁶ substituents as defined above, but suitably substituted with a single R ⁶ substituent at the 4th position of the piperazine such that the compound of general formula (I) is a compound of general formula (IB):

где R¹, n, R³ и R⁶ представляют собой такие, как определено для общих формул (I) и (IA).where R ¹ , n, R ³ and R ⁶ are as defined for the general formulas (I) and (IA).

Особенно подходящие заместители R⁶ включают арил, гетероарил, -О-арил, -О-гетероарил или метил, замещенный одной или двумя арильными или гетероарильными группами; где арильные и гетероарильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, метила, этила, трифторметила, метокси, этокси или трифторметокси.Particularly suitable R ⁶ substituents include aryl, heteroaryl, -O-aryl, -O-heteroaryl or methyl substituted with one or two aryl or heteroaryl groups; where the aryl and heteroaryl groups are substituted with one or more substituents selected from halo, methyl, ethyl, trifluoromethyl, methoxy, ethoxy or trifluoromethoxy.

Еще более подходящие заместители R⁶ включают фенил, гетероарил, -О-фенил, -О-гетероарил, бензил, -СН(фенил)₂, -СН₂-гетероарил и -СН(гетероарил)₂, где гетероарильная группа выбрана из пиридинила, индолила, изоиндолила, бензоксазолила и бензизоксазолила, и где любая из приведенных выше групп R⁶ может быть заменена, как описано выше, но более подходящим образом одним или более заместителями, выбранными из галогено, метила, этила и трифторметила.Even more suitable R ⁶ substituents include phenyl, heteroaryl, -O-phenyl, -O-heteroaryl, benzyl, -CH(phenyl) ₂ , -CH ₂ -heteroaryl and -CH(heteroaryl) ₂ , wherein the heteroaryl group is selected from pyridinyl, indolyl, isoindolyl, benzoxazolyl and benzisoxazolyl, and where any of the above R ⁶ groups may be substituted, as described above, but more suitably with one or more substituents selected from halo, methyl, ethyl and trifluoromethyl.

В более подходящих соединениях общей формулы (I) и (IA) R³ представляет собой арил или гетероарил, факультативно замещенный одним или более заместителями R⁷, как описано выше.In more suitable compounds of general formula (I) and (IA), R ³ is aryl or heteroaryl optionally substituted with one or more R ⁷ substituents as described above.

Наиболее подходящим образом, R³ представляет собой фенил, факультативно замещенный одним или более заместителями R⁷, таким образом, что соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IC):Most suitably, R ³ is phenyl optionally substituted with one or more R ⁷ substituents, such that a compound of general formula (I) is a compound of general formula (IC):

где R¹, n, R^2a, R^2b и R⁷ представляют собой такие, как определено для общей формулы (I) или (IA), и z равен 0-5.where R ¹ , n, R ^2a , R ^2b and R ⁷ are as defined for the general formula (I) or (IA), and z is 0-5.

Более подходящим образом, z равен 0, 1, 2 или 3, наиболее подходящим образом 0, 1 или 2.More suitably, z is 0, 1, 2, or 3, most suitably 0, 1, or 2.

R⁷ представляет собой такой, как определено выше, но в некоторых подходящих соединениях R⁷ отсутствует (то есть z равен 0), или R⁷ представляет собой галогено, -C_1-4 алкил, бензил, -O(C_1-4 алкил) бензилокси, -С_1-4 галогеналкил, -O(C_1-4 галогеналкил) или -C(O)NR⁸R⁹, где R⁸ и R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперидинильное кольцо или где R⁸ представляет собой Н и R⁹ представляет собой С_3-7 циклоалкил.R ⁷ is as defined above, but in some suitable compounds R ⁷ is absent (i.e. z is 0), or R ⁷ is halo, -C _1-4 alkyl, benzyl, -O(C _1-4 alkyl) benzyloxy, -C _1-4 haloalkyl, -O(C _1-4 haloalkyl) or -C(O)NR ⁸ R ⁹ where R ⁸ and R ⁹ together with the nitrogen atom to which they are attached, form a piperidinyl ring, or wherein R ⁸ is H and R ⁹ is C _3-7 cycloalkyl.

Более подходящим образом, R⁷ отсутствует или каждый R⁷ независимо представляет собой галогено, особенно хлор- или фтор-, метил, этил, бензил, метокси, этокси, бензилокси, -С(O)-пиперидинил или -C(O)NH-C_3-7 циклоалкил.More suitably, R ⁷ is absent or each R ⁷ is independently halo, especially chloro or fluoro, methyl, ethyl, benzyl, methoxy, ethoxy, benzyloxy, -C(O)-piperidinyl or -C(O)NH-C _3-7 cycloalkyl.

Некоторые особенно подходящие соединения по изобретению представляют собой соединения общей формулы (ID):Some particularly suitable compounds of the invention are compounds of the general formula (ID):

где R¹, n, R⁶, R⁷ и z представляют собой такие, как определено выше для общих формул (I), (IA), (IB) и (IC).where R ¹ , n, R ⁶ , R ⁷ and z are as defined above for the general formulas (I), (IA), (IB) and (IC).

Иллюстративные соединения общей формулы (I) включают следующие соединения:Exemplary compounds of general formula (I) include the following compounds:

2-((2-хлорфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 1);2-((2-chlorophenyl)(4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 1);

2-((4-хлорфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 2);2-((4-chlorophenyl)(4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 2);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 3);2-((4-(benzyloxy)-3-fluorophenyl)(4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 3);

(4-((2-гидроксифенил)(4-(4-Метоксифенил)пиперазинил)метил)фенил)(пиперидин-1-ил)метанон (Соединение 4);(4-((2-hydroxyphenyl)(4-(4-Methoxyphenyl)piperazinyl)methyl)phenyl)(piperidin-1-yl)methanone (Compound 4);

3-((5-хлор-2-гидроксифенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 5);3-((5-chloro-2-hydroxyphenyl)(4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 5);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)-4-хлорфенол Соединение 6);2-((4-(benzyloxy)-3-fluorophenyl)(4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)-4-chlorophenol Compound 6);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(6-фторбензо[d]изоксазол-3-ил)пиперидин-1-ил)метил)фенол (Соединение 7);2-((4-(benzyloxy)-3-fluorophenyl)(4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)methyl)phenol (Compound 7);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(о-толил)метил)фенол (Соединение 8);2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(o-tolyl)methyl)phenol (Compound 8);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)бензамид (Соединение 9, NPB);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)benzamide (Compound 9, NPB);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метилфенол (Соединение 10);2-((4-(benzyloxy)-3-fluorophenyl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methylphenol (Compound 10);

2-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(фенил)метил)фенол (Соединение 11);2-((4-((4-chlorophenyl)(phenyl)methyl)piperazin-1-yl)(phenyl)methyl)phenol (Compound 11);

2-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(п-толил)метил)фенол (Соединение 12);2-((4-((4-chlorophenyl)(phenyl)methyl)piperazin-1-yl)(p-tolyl)methyl)phenol (Compound 12);

2-((4-хлорфенил)(4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 13);2-((4-chlorophenyl)(4-((4-chlorophenyl)(phenyl)methyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 13);

2-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(4-этилфенил)метил)фенол (Соединение 14);2-((4-((4-chlorophenyl)(phenyl)methyl)piperazin-1-yl)(4-ethylphenyl)methyl)phenol (Compound 14);

(4-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)фенил)(пиперидин-1-ил)метанон (Соединение 15);(4-((4-((4-chlorophenyl)(phenyl)methyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)phenyl)(piperidin-1-yl)methanone (Compound 15);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-[1,1'-бифенил-3-ил)метил)бензамид (Соединение 16);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-[1,1'-biphenyl-3-yl)methyl)benzamide (Compound 16);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-2'-метил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 17);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-2'-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 17);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-метил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 18);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-3'-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 18);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-метил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 19);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-4'-methyl-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 19);

3-((2'-хлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 20);3-((2'-chloro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 20);

3-((3'-хлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-цикпопентилбензамид (Соединение 21);3-((3'-chloro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 21);

3-((4'-хлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 22);3-((4'-chloro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 22);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4'-этил-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 23);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4'-ethyl-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 23);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-(пиперидин-1-карбонил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 24);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-4'-(piperidine-1-carbonyl)-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 24);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-метокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 25);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-4'-methoxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 25);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2'-этил-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 26);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2'-ethyl-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 26);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2'-фтор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 27);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2'-fluoro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 27);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(3'-фтор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 28);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(3'-fluoro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 28);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4'-фтор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил-3-ил)метил)бензамид (Соединение 29);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4'-fluoro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl-3-yl)methyl)benzamide (Compound 29);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-нитро-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 30);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-3'-nitro-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 30);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-сульфамоил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 31);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-3'-sulfamoyl-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 31);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-2'-(трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 32);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-2'-(trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 32);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 33);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-3'-trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 33);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-(трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 34);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-hydroxy-4'-(trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-3-yl)methyl)benzamide (Compound 34);

3-((2'-циано-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-цикпопентилбензамид (Соединение 35);3-((2'-cyano-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 35);

3-((3'-циано-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-цикпопентилбензамид (Соединение 36)3-((3'-cyano-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 36)

3-((4'-циано-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 37);3-((4'-cyano-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 37);

3-((2'-хлор-4-гидрокси-4'-(трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 38);3-((2'-chloro-4-hydroxy-4'-(trifluoromethyl)-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 38);

N-циклопентил-3-((2',4'-дихлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)бензамид (Соединение 39);N-cyclopentyl-3-((2',4'-dichloro-4-hydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)benzamide (Compound 39);

3-((4'-хлор-2',4-дигидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 40);3-((4'-chloro-2',4-dihydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 40);

3-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 41, NCK1);3-((4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 41, NCK1);

2-((4-хлорфенил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 42, NCK2);2-((4-chlorophenyl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 42, NCK2);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(3-метоксифенил)метил)фенол (Соединение 43, NCK3);2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(3-methoxyphenyl)methyl)phenol (Compound 43, NCK3);

1-(5-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)тиофен-2-ил)этанон (Соединение 44, NCK4);1-(5-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)thiophen-2-yl)ethanone (Compound 44, NCK4);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(нафталин-1-ил)метил)фенол (Соединение 45, NCK5);2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(naphthalen-1-yl)methyl)phenol (Compound 45, NCK5);

5-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)фуран-2-карбальдегид (Соединение 46, NCK6);5-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)furan-2-carbaldehyde (Compound 46, NCK6);

2-((4-(5,6-дихлорциклогекса-1,5-диен-1-ил)пиперазин-1-ил)(2-фтор-3-метилпиридин-4-ил)метил)фенол (Соединение 47, NCK7);2-((4-(5,6-dichlorocyclohexa-1,5-dien-1-yl)piperazin-1-yl)(2-fluoro-3-methylpyridin-4-yl)methyl)phenol (Compound 47, NCK7);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(трифторметил)фенил)метил)фенол (Соединение 48, NCK8);2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-(trifluoromethyl)phenyl)methyl)phenol (Compound 48, NCK8);

2-((6-хлор-5-метилпиридин-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 49, NCK9);2-((6-chloro-5-methylpyridin-3-yl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 49, NCK9);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(пиридин-3-ил)метил)фенол (Соединение 50, NCK10);2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(pyridin-3-yl)methyl)phenol (Compound 50, NCK10);

1-(5-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)тиофен-2-ил)этанон (Соединение 51, NCK14);1-(5-((4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)thiophen-2-yl)ethanone (Compound 51, NCK14);

3-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(диэтиламино)-2-гидроксифенил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 52, NCK16);3-((4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-(diethylamino)-2-hydroxyphenyl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 52, NCK16);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(диэтиламино)-2-гидроксифенил)метил)бензамид (Соединение 53, NCK18);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-(diethylamino)-2-hydroxyphenyl)methyl)benzamide (Compound 53, NCK18);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидрокси-4,6-диметоксифенил)метил)бензамид (Соединение 54, NCK19);N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)methyl)benzamide (Compound 54, NCK19);

2-((4-хлорфенил)(4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 55, NCK20);2-((4-chlorophenyl)(4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 55, NCK20);

2-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(6-метилпиридин-3-ил)метил)фенол (Соединение 56, NCK21);2-((4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)(6-methylpyridin-3-yl)methyl)phenol (Compound 56, NCK21);

2-(о-толил(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 57, SG1);2-(o-tolyl(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 57, SG1);

2-((4-(п-толил)пиперазин-1-ил)(4-(трифторметил)фенил)метил)фенол (Соединение 58, SG2);2-((4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)(4-(trifluoromethyl)phenyl)methyl)phenol (Compound 58, SG2);

N-циклопентил-4-((2-гидроксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)бензамид (Соединение 59, SG3);N-cyclopentyl-4-((2-hydroxyphenyl)(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)benzamide (Compound 59, SG3);

2-((4-хлорфенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 60, SG4);2-((4-chlorophenyl)(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 60, SG4);

2-((3-метоксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 61, SG5);2-((3-methoxyphenyl)(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 61, SG5);

5-((2-гидроксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фуран-2-карбальдегид (Соединение 62, SG6); и5-((2-hydroxyphenyl)(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)furan-2-carbaldehyde (Compound 62, SG6); And

2-((6-метилпиридин-3-ил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 63, SG7).2-((6-methylpyridin-3-yl)(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 63, SG7).

Соединения общей формулы (I) могут быть получены в результате взаимодействия альдегида общей формулы (II):Compounds of general formula (I) can be obtained by reacting an aldehyde of general formula (II):

где R¹ и n представляют собой такие, как определено для общей формулы (I); с соединением общей формулы (III):where R ¹ and n are as defined for the general formula (I); with a compound of general formula (III):

где R^2a и R^2b представляют собой такие, как определено для общей формулы (I);where R ^2a and R ^2b are as defined for the general formula (I);

и бороновой кислотой общей формулы (IV):and boronic acid of general formula (IV):

где R³ представляет собой такой, как определено для общей формулы (I).where R ³ is as defined for the general formula (I).

Реакция представляет собой реакцию Петасиса, которая представляет собой 3-х компонентную реакцию Петасиса-Бороно-Манниха, в которой используются бороновые кислоты общей формулы (IV) в качестве возможных нуклеофильных соединений для взаимодействия с производным салицилальдегида общей формулы (II) с амином общей формулы (III) с образованием новой углерод-углеродной связи. Реакция Петасиса протекает через образование иминиевых соединений, которые взаимодействуют с бороновой кислотой с образованием третичных аминов.The reaction is a Petasis reaction, which is a 3-component Petasis-Borono-Mannich reaction that uses boronic acids of general formula (IV) as possible nucleophilic compounds to react with a salicylaldehyde derivative of general formula (II) with an amine of general formula (III) to form a new carbon-carbon bond. The Petasis reaction proceeds through the formation of iminium compounds, which react with boronic acid to form tertiary amines.

Подходящие реакционные растворители включают органические растворители, например, циклические простые эфиры, такие как диоксан.Suitable reaction solvents include organic solvents such as cyclic ethers such as dioxane.

Подходящим образом, способ включает:Suitably, the method includes:

i. взаимодействие соединения общей формулы (II) с соединением общей формулы (III) с образованием смеси, содержащей иминиевые соединения в качестве промежуточного соединения;i. reacting a compound of general formula (II) with a compound of general formula (III) to form a mixture containing iminium compounds as an intermediate;

ii. взаимодействие продукта стадии (i) с соединением общей формулы (IV).ii. reaction of the product of step (i) with a compound of general formula (IV).

Подходящим образом стадию (ii) проводят при повышенной температуре, например при 50-100°С, например, при температуре кипения растворителя. Когда растворитель представляет собой диоксан, она составляет примерно от 85 до 95°С, обычно примерно 90°С.Suitably, step (ii) is carried out at an elevated temperature, eg 50-100° C., eg the boiling point of the solvent. When the solvent is dioxane, it is from about 85 to 95°C, usually about 90°C.

Продукт может быть экстрагирован во второй растворитель, такой как этилацетат, высушен и очищен с использованием стандартных способов, таких как описано ниже в примерах.The product can be extracted into a second solvent such as ethyl acetate, dried and purified using standard methods such as those described in the examples below.

Соединения общих формул (II), (III) и (IV) известны и имеются в продаже или могут быть получены с использованием известных способов.Compounds of general formulas (II), (III) and (IV) are known and commercially available or can be obtained using known methods.

Соединения общей формулы (I) могут быть также получены из других соединений общей формулы (I). Например, соединение общей формулы (I), в котором R¹ факультативно представляет собой замещенный арил или гетероарил, может быть получено из соединений общей формулы (I), в которых R¹ представляет собой галогено, в результате взаимодействия с соединением общей формулы (V):Compounds of general formula (I) can also be obtained from other compounds of general formula (I). For example, a compound of general formula (I) in which R ¹ is optionally substituted aryl or heteroaryl can be prepared from compounds of general formula (I) in which R ¹ is halo by reaction with a compound of general formula (V):

где R^1a представляет собой арил или гетероарил, факультативно замещенный, как определено для общей формулы (I).where R ^1a is aryl or heteroaryl optionally substituted as defined for general formula (I).

Реакцию можно проводить, используя реакцию сочетания Сузуки над палладиевым катализатором.The reaction can be carried out using a Suzuki coupling reaction over a palladium catalyst.

Соединения общей формулы (V) известны и имеются в продаже или могут быть получены с использованием известных способов.Compounds of general formula (V) are known and commercially available or can be obtained using known methods.

Способы получения соединений общей формулы (I) представляют еще один аспект настоящего изобретения.Methods for the preparation of compounds of general formula (I) represent another aspect of the present invention.

Соединения общей формулы (I) способны ингибировать/осуществлять понижающую регуляцию/подавлять белок - Bcl-2-ассоциированный промотор смерти (BAD), в частности, ингибировать/осуществлять понижающую регуляцию/подавлять фосфорилирование белка - Bcl-2-ассоциированного промотора смерти (BAD) в раковой клетке. Ингибирование/понижающая регуляция/подавление BAD происходит без воздействия на расположенную выше Ser/Thr киназу, называемую Akt/протеинкиназой В (PKB - от англ. protein kinase В). Таким образом, соединения общей формулы (I) предпочтительно ингибируют/осуществляют понижающую регуляцию/подавляют фосфорилирование BAD.The compounds of general formula (I) are capable of inhibiting/downregulating/suppressing the Bcl-2-associated death promoter (BAD) protein, in particular, inhibiting/downregulating/suppressing the phosphorylation of the Bcl-2-associated death promoter (BAD) protein in a cancer cell. The inhibition/down regulation/suppression of BAD occurs without affecting the upstream Ser/Thr kinase called Akt/protein kinase B (PKB). Thus, the compounds of general formula (I) preferably inhibit/downregulate/suppress the phosphorylation of BAD.

Ингибирование/понижающая регуляция BAD осуществляется соединением общей формулы (I), занимающим гидрофобную бороздку в пределах поверхности белок-белкового контакта Bcl-2/BAD. Кроме того, соединение общей формулы (I) занимает дополнительный гидрофобный боковой карман в пределах поверхности контакта, образованной боковыми цепями Leu-97, Trp-144 и Phe-198 человеческого белка с дихлорфенильной группировкой.The inhibition/down regulation of BAD is accomplished by a compound of general formula (I) occupying a hydrophobic groove within the Bcl-2/BAD protein-protein contact surface. In addition, the compound of general formula (I) occupies an additional hydrophobic side pocket within the contact surface formed by the side chains of the Leu-97, Trp-144 and Phe-198 human protein with a dichlorophenyl moiety.

Соединения формулы (I) представляют собой сильные ингибиторы/ понижающие регуляторы BAD в раковых клетках, в частности, в раковых клетках молочной железы, раковых клетках эндометрия, раковых клетках яичника, раковых клетках печени, раковых клетках толстой кишки, раковых клетках предстательной железы и раковых клетках поджелудочной железы, и индуцируют апоптоз за счет понижающей регуляции/ингибирования фосфорилирования BAD. Указанные соединения усиливают цитотоксичность раковых клеток и осуществляют мишень-специфичную понижающую регуляцию/ингибирование фосфорилирования BAD, не оказывая влияния на киназы, действующие выше.The compounds of formula (I) are potent inhibitors/down-regulators of BAD in cancer cells, in particular breast cancer cells, endometrial cancer cells, ovarian cancer cells, liver cancer cells, colon cancer cells, prostate cancer cells and pancreatic cancer cells, and induce apoptosis by down-regulating/inhibiting BAD phosphorylation. These compounds enhance the cytotoxicity of cancer cells and carry out target-specific down-regulation/inhibition of BAD phosphorylation without affecting the kinases acting above.

Осуществляли скрининг соединений общей формулы (I) в отношении их противораковой активности против клеток MCF7, и было обнаружено, что NPB (Соединение 9) является наиболее сильным соединением. Затем NPB оценивали в отношении панели нормальных иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы (MCF10A и MCF12A), нормальных гепатоцитов (LO2), клеток карциномы молочной железы (ВТ549, MDA-MB-231, MCF7, T47D, ВТ474), раковых клеток эндометрия (Ishikawa, Есс1, RL95-2, AN3), раковых клеток яичника (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2, Ovca433), раковых клеток печени (Нер3В, Н2Р, Н2М), раковых клеток толстой кишки (НСТ116, DLD-1, Сасо-2), раковых клеток предстательной железы (РС3, LNCaP, DU145) и раковых клеток поджелудочной железы (AsPC-1, ВхРС-3). NPB значимо усиливал апоптоз во всех анализируемых линиях раковых клеток и NPB не демонстрировал существенной активности в отношении нормальных гепатоцитов и иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы. Используя наивный байесовский классификатор, модифицированный по Лапласу, NPB подвергают электронному анализу, который предполагает человеческую мишень NPB в виде белка BAD.Compounds of general formula (I) were screened for their anti-cancer activity against MCF7 cells and NPB (Compound 9) was found to be the most potent compound. NPB was then assessed against a panel of normal immortalized breast epithelial cells (MCF10A and MCF12A), normal hepatocytes (LO2), breast carcinoma cells (BT549, MDA-MB-231, MCF7, T47D, BT474), endometrial cancer cells (Ishikawa, Ecc1, RL95-2, AN3), ovarian cancer cells (SK-OV-3 , OVCAR-2, Caov-3, HEY C2, Ovca433), liver cancer cells (Hep3B, H2P, H2M), colon cancer cells (HCT116, DLD-1, Caco-2), prostate cancer cells (PC3, LNCaP, DU145), and pancreatic cancer cells (AsPC-1, BxPC-3). NPB significantly increased apoptosis in all cancer cell lines analyzed and NPB showed no significant activity against normal hepatocytes and immortalized breast epithelial cells. Using a Laplace-modified Naive Bayes classifier, NPB is subjected to electron analysis, which assumes the human target of NPB is the BAD protein.

Было обнаружено, что NPB индуцировал апоптотическую смерть клеток у целого ряда клеток карциномы, но не оказывал цитотоксического действия на нормальные (иммортализованные) эпителиальные клетки.It was found that NPB induced apoptotic cell death in a variety of carcinoma cells, but had no cytotoxic effect on normal (immortalized) epithelial cells.

Отличительными признаками клеток, подлежащих апоптозу, являются экстернализация фосфатидилсерина, активация каспазы и фрагментация геномной ДНК. В одном воплощении NPB демонстрирует апоптоз в отношении клеток MCF7 с использованием окрашивания FITC-аннексином-V и йодидом пропидия. Окрашивание FITC-аннексином-V подтверждает потерю целостности мембраны, и окрашивание PI (от англ. propidium iodide - йодид пропидия) подтверждает поздние события апоптоза, и данные результаты коррелируют с активностью каспазы 3/7.The hallmarks of cells undergoing apoptosis are phosphatidylserine externalization, caspase activation, and genomic DNA fragmentation. In one embodiment, NPB shows apoptosis against MCF7 cells using FITC-Annexin-V and propidium iodide staining. FITC-annexin-V staining confirms loss of membrane integrity and PI (propidium iodide) staining confirms late apoptosis events, and these results correlate with caspase 3/7 activity.

Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложено соединение общей формулы (I) для применения в медицине.Thus, in yet another aspect of the invention, a compound of general formula (I) is provided for use in medicine.

Соединения общей формулы (I) являются особенно полезными в лечении рака, подходящим образом, рака, при котором имеет место фосфорилирование BAD.The compounds of general formula (I) are particularly useful in the treatment of cancer, suitably cancer in which BAD is phosphorylated.

В еще одном аспекте, таким образом, предложено соединение общей формулы (I) для применения в лечении рака.In another aspect, therefore, there is provided a compound of general formula (I) for use in the treatment of cancer.

Кроме того, предложено применение соединения общей формулы (I) в получении агента для лечения рака.In addition, the proposed use of the compounds of General formula (I) in the production of an agent for the treatment of cancer.

Также предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения общей формулы (I).Also provided is a method for treating cancer, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of a compound of general formula (I).

Данные соединения особенно полезны для лечения рака, при котором происходит фосфорилирование BAD, и, например, рак может представлять собой рак молочной железы, рак эндометрия, рак яичника, рак печени, рак толстой кишки, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы, или другие виды рака эпителиального происхождения, при которых фосфорилирован BAD.These compounds are particularly useful in the treatment of cancer in which BAD is phosphorylated, and for example, the cancer may be breast cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, or pancreatic cancer, or other cancers of epithelial origin in which BAD is phosphorylated.

Соединения общей формулы (I) подходящим образом вводят в фармацевтической композиции, и, вследствие этого, в еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение общей формулы (I) и фармацевтически приемлемый эксципиент.Compounds of general formula (I) are suitably administered in a pharmaceutical composition, and therefore, in yet another aspect of the invention, a pharmaceutical composition is provided comprising a compound of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable excipient.

Фармацевтически приемлемый эксципиент может представлять собой адъювант, разбавитель, носитель, гранулирующий агент, связывающий агент, смазывающий агент, разрыхлитель, подсластитель, вещество, обеспечивающее скольжение, антиадгезив, средство, снижающее статический заряд, поверхностно-активное вещество, антиоксидант, камедь, покрывающий агент, краситель, корригент, покрывающий агент, мягчитель, консервант, суспендирующий агент, эмульгатор, растительный целлюлозный материал, агент, обеспечивающий сферонизацию, другое широко известное фармацевтически приемлемый эксципиент или любую комбинацию эксципиентов.A pharmaceutically acceptable excipient may be an adjuvant, diluent, carrier, granulating agent, binding agent, lubricant, disintegrant, sweetener, glidant, anti-adhesive, antistatic agent, surfactant, antioxidant, gum, coating agent, coloring agent, flavoring agent, coating agent, emollient, preservative, suspending agent, emulsifier, vegetable cellulosic material, spheronizing agent, other commonly known pharmaceutically acceptable excipient, or any combination of excipients.

В другом воплощении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена для внутрибрюшинного введения, введения через воротную вену печени, внутривенного введения, внутрисуставного введения, введения через дуоденальную артерию поджелудочной железы или внутримышечного введения или их любой комбинации.In another embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention is formulated for intraperitoneal administration, administration through the hepatic portal vein, intravenous administration, intra-articular administration, administration through the pancreatic duodenal artery, or intramuscular administration, or any combination thereof.

Теперь изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры и на графические материалы, в которых:The invention will now be described in more detail with reference to examples and drawings in which:

На Фиг. 1(a) и 1(b) изображены ¹Н-ЯМР (Ядерный магнитный резонанс) и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 1.On FIG. 1(a) and 1(b) show ¹ H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance) and ¹³ C-NMR spectra of Compound 1.

На Фиг. 2 изображены ¹³С-ЯМР спектры Соединения 2.On FIG. 2 shows ¹³ C-NMR spectra of Compound 2.

На Фиг. 3(a) и 3(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 3.On FIG. 3(a) and 3(b) show ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra of Compound 3.

На Фиг. 4(a) и 4(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 4.On FIG. 4(a) and 4(b) show ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra of Compound 4.

На Фиг. 5(a) и 5(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 5.On FIG. 5(a) and 5(b) show ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra of Compound 5.

На Фиг. 6 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения 6.On FIG. 6 shows ¹ H-NMR spectra of Compound 6.

На Фиг. 7(a) и 7(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 7.On FIG. 7(a) and 7(b) show ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR spectra of Compound 7.

На Фиг. 8 изображены ¹³С-ЯМР спектры Соединения 8.On FIG. 8 shows ¹³ C-NMR spectra of Compound 8.

На Фиг. 9(a) и 9(b) изображены ¹Н-ЯМР и ЖХМС (жидкостная хроматография и масс-спектрометрия) спектры Соединения 9.On FIG. 9(a) and 9(b) show ¹ H-NMR and LCMS (liquid chromatography and mass spectrometry) spectra of Compound 9.

На Фиг. 10 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения 10.On FIG. 10 shows ¹ H-NMR spectra of Compound 10.

На Фиг. 11: Значения IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования) NPB в целом ряде клеточных линий карциномы.On FIG. 11: IC ₅₀ values (half-maximal inhibition concentration) of NPB across a range of carcinoma cell lines.

На Фиг. 12: NPB подавляет жизнеспособность клеток и стимулирует апоптоз в клеточных линиях карциномы.On FIG. 12: NPB suppresses cell viability and stimulates apoptosis in carcinoma cell lines.

Эффект NPB (5 мкМ), оказываемый на жизнеспособность клеток карциномы, включая линии клеток карциномы молочной железы, эндометрия, яичника, печени, толстой кишки, предстательной железы и поджелудочной железы. (А) Жизнеспособность клеток (В) активности каспазы 3/7 и (С) цитотоксичность оценивали, используя набор для анализа ApoTox-Glo™ Triplex, как описано в методике. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента с использованием GraphPad Prism5. В столбце представлено среднее трех определений; столбцы, плюс/минус SD (от англ. standard deviation - стандартное отклонение). **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05. Примечание: RFU (от англ. relative fluorescence unit), относительная единица флуоресценции; RLU (от англ. relative luminescence unit), относительная единица люминесценции. #; нетрансформированные, иммортализованные эпителиальные клетки; МВ-231, MDA-MB-231.Effect of NPB (5 μM) on carcinoma cell viability, including breast, endometrial, ovarian, liver, colon, prostate, and pancreatic carcinoma cell lines. (A) Cell viability (B) caspase 3/7 activity and (C) cytotoxicity was assessed using the ApoTox-Glo™ Triplex assay kit as described in the methodology. Statistical significance was assessed by unpaired two-tailed Student's t-test using GraphPad Prism5. The column represents the average of three determinations; columns, plus/minus SD (from the English standard deviation - standard deviation). **P less than 0.001, *P less than 0.05. Note: RFU (relative fluorescence unit), relative fluorescence unit; RLU (from the English relative luminescence unit), the relative unit of luminescence. #; untransformed, immortalized epithelial cells; MB-231, MDA-MB-231.

Фиг. 13: NPB стимулирует апоптотическую смерть клеток в клетках MCF7.Fig. 13: NPB stimulates apoptotic cell death in MCF7 cells.

(А) Апоптотическая смерть клеток MCF7, измеряемая после обработки 10 мкМ NPB с использованием анализа проточная цитометрия. Окрашивание Аннексином V-FITC показано на оси X, и окрашивание PI - на оси Y. Нижний левый квадрант представляет живые клетки, нижний правый квадрант представляет апоптотические клетки на ранней стадии, верхний левый квадрант представляет некротические клетки, и верхний правый квадрант демонстрирует апоптотические клетки на поздней стадии. Получение данных по Аннексину V и PI представляли в виде процента (%) в каждом квадранте. (В) Анализ клеточного цикла клеток MCF7, оцениваемого после обработки 10 мкМ NPB с использованием анализа проточная цитометрия. (С) Жизнеспособность клеток образовавшихся колоний, образованных клеткой MCF7 после воздействия NPB или ДМСО (диметилсульфоксид), культивируемых 14 суток в 3D Матригеле, используя анализ жизнеспособности AlamarBlue®. Визуализация посредством микроскопии (ниже) окрашенных кальцеином AM (ацетооксиметиловый эфир кальцеина) колоний, образованных клетками MCF7, после воздействия NPB или ДМСО, культивируемых в 3D Матригеле. (D) Жизнеспособность клеток в колониях, образованных клеткой MCF7, после воздействия NPB или ДМСО, культивируемых к мягком агаре с использованием анализа жизнеспособности AlamarBlue®. (Е) Окрашивание кристаллическим фиолетовым очаговых колоний, образованных клетками MCF7 после воздействия NPB или ДМСО. Все анализы проводили, как описано в методологии. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента с использованием GraphPad PrismS. В столбце представлено среднее трех определений; столбцы, ±SD. **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05.(A) Apoptotic death of MCF7 cells measured after treatment with 10 μM NPB using flow cytometry analysis. Annexin V-FITC staining is shown on the x-axis and PI staining on the y-axis. The lower left quadrant represents living cells, the lower right quadrant represents early stage apoptotic cells, the upper left quadrant represents necrotic cells, and the upper right quadrant shows late stage apoptotic cells. Data acquisition for Annexin V and PI were presented as a percentage (%) in each quadrant. (B) Cell cycle analysis of MCF7 cells assessed after treatment with 10 μM NPB using flow cytometry analysis. (C) Viability of colony-forming cells formed by an MCF7 cell after exposure to NPB or DMSO (dimethyl sulfoxide) cultured for 14 days in 3D Matrigel using the AlamarBlue® viability assay. Visualization by microscopy (below) of calcein-stained AM (acetooxymethyl ester of calcein) colonies formed by MCF7 cells after exposure to NPB or DMSO cultured in 3D Matrigel. (D) Cell viability in MCF7 cell colonies after exposure to NPB or DMSO cultured on soft agar using the AlamarBlue® viability assay. (E) Crystal violet staining of focal colonies formed by MCF7 cells after exposure to NPB or DMSO. All analyzes were performed as described in the methodology. Statistical significance was assessed by unpaired two-tailed Student's t-test using GraphPad PrismS. The column represents the average of three determinations; columns, ±SD. **P less than 0.001, *P less than 0.05.

Фиг. 14: Химическая информатика и анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR - от англ. surface plasmon resonance) предсказывает взаимодействие соединения NPB с белком BAD.Fig. Figure 14: Chemical informatics and surface plasmon resonance (SPR) analysis predicts the interaction of an NPB compound with the BAD protein.

(А) Сенсограммы, полученные посредством анализа SPR NPB с белковой субъединицей BAD. Белковую субъединицу BAD иммобилизировали на поверхности сенсорного чипа СМ5. Раствор NPB в разных концентрациях (20-100 мкМ) инъецировали с получением конечных ответов связывания (RU), записываемых в виде функции времени (сек). Результаты анализировали, используя BIA evaluation 3.1. (В) Анализ на основе вестерн-блоттинга (WB - от англ. Western blot) использовали для оценки уровня фосфорилирования Ser99 BAD в клетках MCF7 после обработки NPB. (Ниже) Рассчитывали IC₅₀ NPB, исходя из зависимости доза-ответ, в отношении фосфорилирования BAD (Ser99), BAD и β-АКТИНА, как, например, показано выше, посредством применения программного обеспечения ImageJ от NIH, США (http://imagej.nih.gov/ij/). (С) WB анализ использовали для оценки уровня множества белков, участвующих выше BAD, в клетках MCF7 после обработки NPB. (D) WB анализ использовали для оценки уровня множества белков, участвующих в выживании клеток и пролиферации клеток в клетках MCF7 после обработки NPB. Для WB анализа растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в методике. β-АКТИН (АСТВ) использовали в качестве входного контроля для клеточного лизата. Размеры выявляемых полос белка в кДа показаны с левой стороны.(A) Sensograms obtained by SPR analysis of NPB with the BAD protein subunit. The BAD protein subunit was immobilized on the surface of the CM5 sensor chip. A solution of NPB at various concentrations (20-100 μM) was injected to obtain final binding responses (RU) recorded as a function of time (sec). The results were analyzed using BIA evaluation 3.1. (B) Western blot analysis (WB) was used to assess the level of Ser99 BAD phosphorylation in MCF7 cells after NPB treatment. (Below) The IC ₅₀ NPB was calculated from dose-response for BAD (Ser99), BAD and β-ACTIN phosphorylation as for example shown above using ImageJ software from NIH, USA (http://imagej.nih.gov/ij/). (C) WB analysis was used to assess the level of multiple proteins involved upstream of BAD in MCF7 cells after NPB treatment. (D) WB analysis was used to assess the level of multiple proteins involved in cell survival and cell proliferation in MCF7 cells after NPB treatment. For WB analysis, soluble whole cell extracts were run on SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate) and immunoblotting was performed as described in the method. β-ACTIN (ASTV) was used as an input control for the cell lysate. The sizes of the detectable protein bands in kDa are shown on the left side.

Фиг. 15: NPB специфично ингибирует фосфорилирование BAD (на уровне Ser99) в линиях клеток карциномы, независимо от AKT сигнализации.Fig. 15: NPB specifically inhibits BAD phosphorylation (at the level of Ser99) in carcinoma cell lines, independent of AKT signaling.

(A) WB анализ использовали для оценки уровней фосфорилированного человеческого BAD (в положении Ser75 и Ser99) и белка BAD в целом ряде линий клеток карциномы, включая рак молочной железы, яичника, эндометрия, гепатоцеллюлярный рак, рак толстой кишки и предстательной железы, после обработки NPB (5 мкМ). Общий BAD использовали в качестве входного контроля для клеточного лизата. (В) WB анализ использовали для оценки уровней pBAD (Ser99) и pAKT (Ser473), AKT и BAD в клетках MCF7, Caov-3, Ishikawa и AsPC-1. 5 мкМ каждого ингибитора AKT (IV) и NPB использовали для обработки клеток. Истощение экспрессии AKT достигалось с использованием временной трансфекции короткой РНК, образующей шпильки, (кш)-РНК (1&2), направленной на транскрипт AKT, как описано в методике. β-АКТИН использовали в качестве входного контроля для клеточного лизата. Для WB анализа, растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в материалах и методах. Размеры выявляемых полос белка в кДа показаны с левой стороны. Примечание: #; линия нетрансформированных иммортализованных клеток.(A) WB analysis was used to assess the levels of phosphorylated human BAD (at position Ser75 and Ser99) and BAD protein in a range of carcinoma cell lines, including breast, ovarian, endometrial, hepatocellular, colon, and prostate cancers after treatment with NPB (5 μM). Total BAD was used as an input control for the cell lysate. (B) WB analysis was used to assess the levels of pBAD (Ser99) and pAKT (Ser473), AKT and BAD in MCF7, Caov-3, Ishikawa and AsPC-1 cells. 5 μM of each AKT (IV) and NPB inhibitor was used to treat cells. Depletion of AKT expression was achieved using transient transfection of short hairpin RNA (sh)-RNA (1&2) directed to the AKT transcript as described in the methodology. β-ACTIN was used as an input control for the cell lysate. For WB analysis, soluble whole cell extracts were run on SDS-PAGE and immunoblotted as described in Materials and Methods. The sizes of the detectable protein bands in kDa are shown on the left side. Note: #; a line of untransformed immortalized cells.

Фиг. 16: миРНК (малые интерферирующие РНК)-опосредованное истощение экспрессии BAD предотвращает эффект NPB в линиях клеток карциномы.Fig. 16: siRNA (small interfering RNA)-mediated depletion of BAD expression prevents the effect of NPB in carcinoma cell lines.

(A) WB анализ использовали для оценки уровней активности pBAD (Ser99) и белка BAD в клетках MCF7, ВТ474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 и DLD-1 после обработки 5 мкМ NPB. Истощения экспрессии BAD достигали, используя временную трансфекцию малой интерферирующей (ми)-РНК, направленной на транскрипт BAD. Растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в материалах и методах. β-АКТИН использовали в качестве входного контроля. Эффекты NPB (5μ мкМ) в клетках MCF7, ВТ474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 и DLD-1. (В) Жизнеспособность клеток и (С) активности каспазы 3/7 оценивали, используя набор для анализа ApoTox-Glo™ Triplex. Все анализы проводили, как описано в методике. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (Р меньше 0,05 считали значимым) с использованием GraphPad Prism5. В столбце представлено среднее трех определений; столбцы, плюс/минус SD. **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05. Примечание RFU, относительная единица флуоресценции; RLU, относительная единица люминесценции.(A) WB analysis was used to evaluate pBAD (Ser99) and BAD protein activity levels in MCF7, BT474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 and DLD-1 cells after treatment with 5 μM NPB. Depletion of BAD expression was achieved using transient transfection of small interfering (mi)-RNA directed to the BAD transcript. Soluble whole cell extracts were run on SDS-PAGE and immunoblotted as described in Materials and Methods. β-ACTIN was used as input control. Effects of NPB (5μ µM) in MCF7, BT474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 and DLD-1 cells. (B) Cell viability and (C) caspase 3/7 activity was assessed using the ApoTox-Glo™ Triplex assay kit. All analyzes were performed as described in the methodology. Statistical significance was assessed by unpaired two-tailed Student's t-test (P less than 0.05 was considered significant) using GraphPad Prism5. The column represents the average of three determinations; columns, plus/minus SD. **P less than 0.001, *P less than 0.05. Note RFU, relative fluorescence unit; RLU, relative unit of luminescence.

Пример 17: NPB ингибирует фосфорилирование Ser99 BAD при карциноме молочной железы и ингибирует опухолевый ростExample 17 NPB Inhibits Ser99 BAD Phosphorylation in Breast Carcinoma and Inhibits Tumor Growth

(А) Измерение объема опухоли у самок мышей BALB/c-nu, как описано в материалах и методах. Животных (n равен 5 для каждой группы) обрабатывали носителем, 5 мг/кг NPB или 20 мг/кг NPB, и регистрировали относительную опухолевую нагрузку. Массу животных измеряли ежедневно на всем протяжении эксперимента. (В) Опухоли удаляли после реализации схемы обработки NPB и взвешивали. Репрезентативные резецированные опухоли показаны с правой стороны. (С) WB опухолевой ткани для определения уровней p-BAD (Ser99) и BAD. Растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в методике. β-АКТИН использовали в качестве входного контроля. Размеры полос выявляемого белка в кДа показаны с левой стороны. (D) Гистологические анализы окрашивания фосфо-BAD, BAD, Ki67 и TUNEL. Осуществляли иммуномечение срезов опухолевых тканей поликлональным антителом козы против pBAD (Ser 136) (Santa Cruz Biotechnology), мышиным моноклональным антителом против BAD (Santa Cruz Biotechnology) и антителом против Ki67 (Abcam, ab15580) и окрашивание гематоксилином. Апоптотическое фрагментирование ДНК выявляли, используя набор для выявления апоптоза TUNEL(Gen Script USA Inc.), как описано в методике. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (Р меньше 0,05 считали значимым) с использованием GraphPad PrismS. Точка представляет среднее трех экспериментов; столбцы, плюс/минус SD. **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05.(A) Measurement of tumor volume in female BALB/c-nu mice as described in Materials and Methods. Animals (n equal to 5 for each group) were treated with vehicle, 5 mg/kg NPB or 20 mg/kg NPB, and the relative tumor burden was recorded. The weight of the animals was measured daily throughout the experiment. (B) Tumors were removed after implementing the NPB treatment regimen and weighed. Representative resected tumors are shown on the right side. (C) WB of tumor tissue to determine p-BAD (Ser99) and BAD levels. Soluble whole cell extracts were run on SDS-PAGE and immunoblotted as described in the methodology. β-ACTIN was used as input control. The band sizes of the detectable protein in kDa are shown on the left side. (D) Histological analyzes of phospho-BAD, BAD, Ki67 and TUNEL staining. Tumor tissue sections were immunolabeled with goat polyclonal antibody against pBAD (Ser 136) (Santa Cruz Biotechnology), mouse monoclonal antibody against BAD (Santa Cruz Biotechnology), and anti-Ki67 antibody (Abcam, ab15580) and stained with hematoxylin. Apoptotic DNA fragmentation was detected using the TUNEL Apoptosis Detection Kit (Gen Script USA Inc.) as described in the methodology. Statistical significance was assessed by unpaired two-tailed Student's t-test (P less than 0.05 was considered significant) using GraphPad PrismS. The dot represents the mean of three experiments; columns, plus/minus SD. **P less than 0.001, *P less than 0.05.

Фиг. 18:Fig. 18:

(А) Анализ на основе вестерн блоттинга использовали для оценки уровня фосфорилирования Ser99 BAD pBAD, BAD, pAKT и AKT в клетках MCF7 после увеличивающегося периода обработки NPB (10 мкМ). Растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в методике. Размеры полос выявляемого белка в кДа показаны с левой стороны. (Б) Киназы и фосфорилированные субстраты выявляли, используя панель для вестерн блоттинга (набор Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array. Клетки MCF7 обрабатывали NPB (10 мкМ) или ДМСО на протяжении 12 ч при 37°С перед получением клеточного лизата. Среднюю плотность пикселей анализировали, используя программное обеспечение ImageJ, и она представлена ниже.(A) Western blot analysis was used to assess the level of Ser99 BAD pBAD, BAD, pAKT and AKT phosphorylation in MCF7 cells after an increasing period of NPB treatment (10 μM). Soluble whole cell extracts were run on SDS-PAGE and immunoblotted as described in the methodology. The band sizes of the detectable protein in kDa are shown on the left side. (B) Kinases and phosphorylated substrates were detected using a Western blotting panel (Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array. MCF7 cells were treated with NPB (10 μM) or DMSO for 12 h at 37°C before cell lysate preparation. Average pixel density was analyzed using ImageJ software and is shown below.

На Фиг. 19 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения NCK5.On FIG. 19 shows ¹ H-NMR spectra of Compound NCK5.

На Фиг. 20 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения NCK16.On FIG. 20 shows ¹ H-NMR spectra of Compound NCK16.

На Фиг. 21 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения NCK18.On FIG. 21 shows ¹ H-NMR spectra of Compound NCK18.

На Фиг. 22А, 22Б, 22В, 22Г и 22Д: значения IC₅₀ структурных аналогов NPB в линиях клеток карциномы.On FIG. 22A, 22B, 22C, 22D and 22E: IC ₅₀ values of NPB structural analogs in carcinoma cell lines.

Примечание: NV (от англ. no value), отсутствует значениеNote: NV (from English no value), no value

Материалы, используемые для того, чтобы получить Примеры настоящего раскрытияMaterials used to obtain Examples of this disclosure

Клеточная культура и реагентыCell culture and reagents

Линии иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы человека, MCF10A и MCF12A, и линию иммортализованных гепатоцеллюлярных эпителиальных клеток, LO2, получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС - от англ. American Type Culture Collection, Rockville, MD) и культивировали в соответствии с инструкциями по наращиванию АТСС. Клеточные линии МС, MCF7, T47D, ВТ474, ВТ549 и MDA-MB-231 (обозначаемая МВ-231); линии клеток карциномы эндометрия, Ishikawa, ЕСС1, RL95-2 и AN3; линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы, Нер3В, Н2Р и Н2М; линии клеток карциномы толстой кишки, НСТ116, DLD-1 и Сасо-2; и линии клеток карциномы предстательной железы, РС3, LNCaP, DU145, получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Rockville, MD). Линии клеток карциномы яичника, SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2 и Ovca433 получали из лаборатории Dr Ruby Huang Онкологического института Сингапура, Национальный университет Сингапура (NUS - от англ. National University of Singapore). Лини клеток карциномы поджелудочной железы получали из лаборатории проф. Н. Phillip Koeffler Онкологического института Сингапура, Национальный университет Сингапура (NUS). Все лини клеток карциномы культивировали в соответствии с инструкциями по наращиванию АТСС. Ингибитор AKT IV приобретали в Calbiochem (San Diego, СА, США). «Стеле» (кш)-РНК-BAD, направленную на BAD (кшРНК-BAD1, 5'-GCUCCGCACCAUGAGUGACGAGUUU-3' и кшРНК-BAD2, 5'AAACUCGUCACUCAUCCUCCGGAGC3'), приобретали в Life Technologies (Сингапур). кшРНК, направленную на AKT (кшРНК- AKT1, 5'-CCGGCGCGTGACCATGAACGAGTTTCTCGAGAAACTCGTTCATGGTCACGCGTTTTTG-3' и кшРНК2-AKT, 5'-CCGGGGACTACCTGCACTCGGAGAACTCGAGTTCTCCGAGTGCAGGTAGTCCTTTTTG-3'), приобретали у Life Technologies (Сингапур) и клонировали в вектор PLKO.1 (Sigma, Сингапур). Клетки временно трансфицировали 20 нМ кшРНК (AKT или BAD) или универсальным отрицательным контролем (Invitrogen, Carlsbad, СА, США) с использованием FuGENE HD (Promega) в течение 24 ч и проводили дальнейшие анализы. Коммерческие наборы для определения аланинтрансаминазы (ALT - от англ. Alanine transaminase), аспартатаминотрансферазы (AST - от англ. aspartate transaminase), лактатдегидрогеназы (LDH - от англ. lactate dehydrogenase), креатинкиназы (CK - от англ. creatine kinase), азота мочевины крови (BUN - от англ. blood urea nitrogen) приобретали у AGAPPE Diagnostics Ltd, Kerala, Индия.The immortalized human breast epithelial cell lines, MCF10A and MCF12A, and the immortalized hepatocellular epithelial cell line, LO2, were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and cultured according to the ATCC extension instructions. Cell lines MS, MCF7, T47D, BT474, BT549 and MDA-MB-231 (denoted MB-231); endometrial carcinoma cell lines, Ishikawa, ECC1, RL95-2 and AN3; hepatocellular carcinoma cell lines, Hep3B, H2P and H2M; colon carcinoma cell lines, HCT116, DLD-1 and Caco-2; and prostate carcinoma cell lines, PC3, LNCaP, DU145, were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). The ovarian carcinoma cell lines, SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY C2 and Ovca433, were obtained from the laboratory of Dr Ruby Huang, Singapore Cancer Institute, National University of Singapore (NUS). Pancreatic carcinoma cell lines were obtained from the laboratory of Prof. N. Phillip Koeffler Cancer Institute of Singapore, National University of Singapore (NUS). All carcinoma cell lines were cultured according to ATCC growth instructions. The AKT IV inhibitor was purchased from Calbiochem (San Diego, CA, USA). Stele (sh)-RNA-BAD directed to BAD (shRNA-BAD1, 5'-GCUCCGCACCAUGAGUGACGAGUUU-3' and shRNA-BAD2, 5'AAACUCGUCACUCAUCCUCCGGAGC3') was purchased from Life Technologies (Singapore). shRNA directed to AKT (shRNA-AKT1, 5'-CCGGCGCGTGACCATGAACGAGTTTCTCGAGAAACTCGTTCATGGTCACGCGTTTTTG-3' and shRNA2-AKT, 5'-CCGGGACTACCTGCACTCGGAGAACTCGAGTTCTCCGAGTGCAGGTAGTCCTTTTTG-3') were purchased from Life Technologies (Singapore) and cloned into vector PLKO.1 (Sigma, Singapore). Cells were transiently transfected with 20 nM shRNA (AKT or BAD) or universal negative control (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) using FuGENE HD (Promega) for 24 h and further analyses. Commercial kits for the determination of alanine transaminase (ALT - from English Alanine transaminase), aspartate aminotransferase (AST - from English aspartate transaminase), lactate dehydrogenase (LDH - from English lactate dehydrogenase), creatine kinase (CK - from English creatine kinase), blood urea nitrogen (BUN - from English blood urea nitrogen) were purchased from AG APPE Diagnostics Ltd, Kerala, India.

Пример 1Example 1

Синтез и характеристика соединений Формулы ISynthesis and characterization of compounds of Formula I

Общий синтез Соединения Формулы IGeneral Synthesis of a Compound of Formula I

Пиперазины (0,8 ммоль) и салицилальдегид (0,8 ммоль) отбирали в RBF (от англ. round bottom flask - круглодонная колба) и перемешивали в течение примерно 10 минут, используя диоксан в качестве растворителя. Спустя примерно 10 минут, арилбороновую кислоту (0,8 ммоль) добавляли к смеси и нагревали с обратным холодильником при непрерывном перемешивании на протяжении примерно 8 часов с использованием Диоксана в качестве растворителя на электроплитке, поддерживаемой при примерно 90°С. Спустя примерно 8 часов, в реакционную смесь добавляли этилацетат и воду, и слой этилацетата отделяли, используя разделительную воронку, и сушили над безводным сульфатом натрия. Этилацетат выпаривали с получением продукта. Желательный продукт - фенольное соединение получают посредством разделения с использованием колоночной хроматографии.Piperazines (0.8 mmol) and salicylaldehyde (0.8 mmol) were collected in RBF (round bottom flask) and stirred for about 10 minutes using dioxane as a solvent. After about 10 minutes, arylboronic acid (0.8 mmol) was added to the mixture and heated under reflux with continuous stirring for about 8 hours using Dioxane as a solvent on a hot plate maintained at about 90°C. After about 8 hours, ethyl acetate and water were added to the reaction mixture, and the ethyl acetate layer was separated using a separating funnel and dried over anhydrous sodium sulfate. The ethyl acetate was evaporated to give the product. The desired product, a phenolic compound, is obtained by separation using column chromatography.

Специфичные реагенты, используемые для получения Соединений 1-15 и 41-63, предложены ниже в Таблице 1.The specific reagents used to prepare Compounds 1-15 and 41-63 are provided in Table 1 below.

Соединения, показанные в Таблице 2, получали в результате взаимодействия бромида NPB (см. столбец 1 Таблицы 2) с бороновой кислотой, используя реакцию сочетания Сузуки, катализируемую палладием, как показано на Схеме 1.Compounds shown in Table 2 were prepared by reacting NPB bromide (see column 1 of Table 2) with boronic acid using a palladium catalyzed Suzuki coupling reaction as shown in Scheme 1.

Характеристика Соединения 1:Characteristic of Compound 1:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 3.691(s, 3Н), 5.303(s, 1Н, С-Н), 1.184-3.691 (m, 8Н-протоны пиперазина), 7.597-7.615(d, 1Н, J=7.2 Гц), 7.341-7.323(d, 1Н, J=7.2 Гц), 7.060-7.189(m, 4H-ArH), 6.555-6.815(m,5H-ArH), 6.956-6.974, (d, 1H, J=7.2 Гц) 11.85(s, 1H-OH brd пик);¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.854, 55.521, 69.50, 114.45, 117.17, 118.44, 119.547, 122.05, 127.78, 128.83, 129.01, 129.19, 129.84, 129.93, 133.89, 145.11, 156.60; Температура плавления 120-124°С. (Фиг. 1) ¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) δ: 3.691(s, 3H), 5.303(s, 1H, C-H), 1.184-3.691 (m, 8H-piperazine protons), 7.597-7.615(d, 1H, J=7.2 Hz), 7.341-7.323(d, 1 H, J=7.2 Hz), 7.060-7.189(m, 4H-ArH), 6.555-6.815(m,5H-ArH), 6.956-6.974, (d, 1H, J=7.2 Hz) 11.85(s, 1H-OH brd peak); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 50.854, 55.521, 69.50, 114.45, 117.17, 118.44, 119.547, 122.05, 127.78, 128.83, 129.01, 129.19, 129.8 4, 129.93, 133.89, 145.11, 156.60; Melting point 120-124°C. (Fig. 1)

Характеристика Соединения 2:Feature Compound 2:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ:2.539-3.065(m, 8Н), 3.674(s, 3Н), 4.359(s, 1Н), 6.651 (m, 1Н), 6.740-6.804(m, 5Н), 6.855-6.872(d, 1Н, J=6.8 Гц), 7.086(m, 1Н), 7.165(m, 2Н), 7.280(m, 1Н), 7.361 (m, 1Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.74, 51.76, 55.52, 75.86, 114.49, 117.24, 118.43, 119.62, 124.41, 126.58, 128.28, 128.54, 128.92, 129.20, 130.28, 134.66, 141.63, 145.07, 154, 156.18; Температура плавления 85-89°С. (Фиг. 2) ¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) δ: 2.539-3.065(m, 8H), 3.674(s, 3H), 4.359(s, 1H), 6.651 (m, 1H), 6.740-6.804(m, 5H), 6.855-6.872(d, 1H, J=6.8 Hz), 7.086(m, 1H), 7.165(m, 2H), 7.280(m, 1H), 7.361(m, 1H); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 50.74, 51.76, 55.52, 75.86, 114.49, 117.24, 118.43, 119.62, 124.41, 126.58, 128.28, 128.54, 128.92, 1 29.20, 130.28, 134.66, 141.63, 145.07, 154, 156.18; Melting point 85-89°C. (Fig. 2)

Характеристика Соединения 3:Feature Compound 3:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.194-3.079(m, 8H), 3.689(s, 3Н), 4.336(s, 1Н), 5.041 (s, 2Н), 6.672-6.702(m, 1Н), 6.781-6.819(m, 5Н), 6.863-6.867(m, 2Н), 7.026-7.082(m, 2Н), 7.196(m, 1Н), 7.279-7.348(m, 5Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.770, 55.52, 71.26, 75.36, 114.46, 115.46, 117.16, 118.42, 119.54, 124.82, 127.34, 128.14, 128.62, 128.76, 129.14, 145.04, 156.14; Температура плавления 72-76°С. (Фиг. 3) ¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) δ: 1.194-3.079(m, 8H), 3.689(s, 3H), 4.336(s, 1H), 5.041 (s, 2H), 6.672-6.702(m, 1H), 6.781-6.819(m, 5H), 6.8 63-6.867(m, 2H), 7.026-7.082(m, 2H), 7.196(m, 1H), 7.279-7.348(m, 5H); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 50.770, 55.52, 71.26, 75.36, 114.46, 115.46, 117.16, 118.42, 119.54, 124.82, 127.34, 128.14, 128.62, 128.76, 129.14, 145.04, 156.14; Melting point 72-76°C. (Fig. 3)

Характеристика Соединения 4:Feature of Compound 4:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.183-2.469(m, 10H), 2.557-3.684(m, 8Н), 3.684(s, 3Н), 4.412(s, 1Н), 6.631(m, 2Н), 6.745-6.813(m, 4Н), 7.059-7.095(m, 1Н), 7.191-7.216(m, 1Н), 7.261-7.269(m, 2Н), 7.351-7.409(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 24.51, 26.525, 29.68, 43.60, 48.73, 50.71, 51.80, 55.51, 76.04, 114.45, 117.134, 118.366, 119.198, 119.52, 124.75, 126.74, 127.50, 128.04, 128.50, 128.79, 129.29, 136.18, 141.02, 145, 154, 156.2, 169.79(С=O); Температура плавления 78-82°С. (Фиг. 4) ¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) δ: 1.183-2.469(m, 10H), 2.557-3.684(m, 8H), 3.684(s, 3H), 4.412(s, 1H), 6.631(m, 2H), 6.745-6.813(m, 4H), 7. 059-7.095(m, 1H), 7.191-7.216(m, 1H), 7.261-7.269(m, 2H), 7.351-7.409(m, 2H); ¹³ С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 24.51, 26.525, 29.68, 43.60, 48.73, 50.71, 51.80, 55.51, 76.04, 114.45, 117.134, 118.366, 119.198, 119.52, 124.75, 126.74, 127.50, 128.04, 128.50, 128.79, 129.29, 136.18, 141.02, 145, 154, 156.2, 169.79(С=O); Melting point 78-82°C. (Fig. 4)

Характеристика Соединения 5:Feature Compound 5:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.186-1.650(m, 8Н), 1.978-3.633(m, 8Н), 3.689(s, 3Н), 4.298-4.345(m, 1Н), 4.421 (s, 1Н), 5.979-5.992(s, 1Н) 6.736-6.803(m, 5Н), 6.860(m, 1Н), 7.192(s, 1Н), 7.737(s, 1Н), 7.304-7.339(m, 1Н), 7.540-7.557(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 23.79, 33.18, 50.67, 51.83, 55.51, 67.06, 75.06, 114.46, 118.45, 118.58, 124.02, 126.11, 126.42, 128.72, 128.87, 129.39, 139.39, 144.89, 154.19, 154.95, 166.68; Температура плавления 102-106°С. (Фиг. 5) ¹ Н ЯМР (CDCl ₃ , 400 МГц) δ: 1.186-1.650(m, 8Н), 1.978-3.633(m, 8Н), 3.689(s, 3Н), 4.298-4.345(m, 1Н), 4.421 (s, 1Н), 5.979-5.992(s, 1Н) 6.736-6.803(m, 5Н), 6.860(m, 1Н), 7.192(s, 1Н), 7.737(s, 1Н), 7.304-7.339(m, 1Н), 7.540-7.557(m, 2Н); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 23.79, 33.18, 50.67, 51.83, 55.51, 67.06, 75.06, 114.46, 118.45, 118.58, 124.02, 126.11, 126.42, 128. 72, 128.87, 129.39, 139.39, 144.89, 154.19, 154.95, 166.68; Melting point 102-106°C. (Fig. 5)

Характеристика Соединения 6:Feature Compound 6:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.179-3.620(m, 8Н), 3.676(s, 3Н), 4.261 (s, 1Н), 5.029(s, 2Н), 6.716-6.791 (m, 5Н), 6.823(m, 1Н), 6.862-6.882(m, 1Н), 6.973-7.015(m, 2Н), 7.110-7.139(m, 1Н), 7.243-7.258(m, 2Н), 7.280-7.317(m, 1Н), 7.331-7.350(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.70, 51.59, 55.52, 71.27, 74.93, 114.48, 115.52, 118.58, 123.97, 124.39, 126.3, 127.3, 128.2, 128.8, 132.1, 136.27, 144.96, 146.74, 154.19, 154.93; Температура плавления 60-64°С. (Фиг. 6) ¹ Н ЯМР (CDCl ₃ , 400 МГц) δ: 1.179-3.620(m, 8Н), 3.676(s, 3Н), 4.261 (s, 1Н), 5.029(s, 2Н), 6.716-6.791 (m, 5Н), 6.823(m, 1Н), 6.862-6.882(m, 1Н), 6.973-7.015(m, 2Н), 7.110-7.139(m, 1Н), 7.243-7.258(m, 2Н), 7.280-7.317(m, 1Н), 7.331-7.350(m, 2Н); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 50.70, 51.59, 55.52, 71.27, 74.93, 114.48, 115.52, 118.58, 123.97, 124.39, 126.3, 127.3, 128.2, 128.8 , 132.1, 136.27, 144.96, 146.74, 154.19, 154.93; Melting point 60-64°C. (Fig. 6)

Характеристика Соединения 7:Feature Compound 7:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 2.648-3.820 (m, 8Н) 4.245(s, 1Н), 5.009(s, 1Н), 5.651 (s, 2Н), 7.276(s, 1Н), 7.436-7.485(m, 3Н), 7.606-7.682(m, 3Н), 7.797(m, 2Н), 7.876-7.954(m, 5Н), 8.185(s, 1Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 30.972, 50.76, 67.60, 71.79, 75.85, 98.16, 100.9, 104.9, 113.16, 115.97, 117.65, 119.96, 122.84, 125.4, 127.8, 128.6, 129.1, 129.6, 133.2, 136.8, 157.06, 160.87, 164.51, 165.86; Температура плавления 58-62°С. (Фиг. 7) ¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) δ: 2.648-3.820 (m, 8H) 4.245(s, 1H), 5.009(s, 1H), 5.651 (s, 2H), 7.276(s, 1H), 7.436-7.485(m, 3H), 7.606-7.6 82(m, 3H), 7.797(m, 2H), 7.876-7.954(m, 5H), 8.185(s, 1H); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 30.972, 50.76, 67.60, 71.79, 75.85, 98.16, 100.9, 104.9, 113.16, 115.97, 117.65, 119.96, 122.84, 125. 4, 127.8, 128.6, 129.1, 129.6, 133.2, 136.8, 157.06, 160.87, 164.51, 165.86; Melting point 58-62°C. (Fig. 7)

Характеристика Соединения 8:Feature of Compound 8:

¹Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ: 2.479(s, 3Н), 4.927(s, 1Н), 2.260-3.063(m, 8Н), 6.533-6.551 (d, 1Н, J=7.2 МГц), 6.631-6.692(m, 2Н), 6.739-6.758(d, 1Н, J=7.6 МГц), 6.789-6.809(d, 1Н, J=8 Гц), 6.864(m, 3Н), 7.092-7.183(m, 1Н), 7.281-7.297(m, 1Н), 7.537-7.552(d, 1Н, J=6 Гц); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 20.92, 51.16, 51.42, 73.44, 116.07, 116.96, 117.14, 118.716, 119.27, 119.83, 124.965, 125.24, 126.445, 127.12, 127.545, 128.266, 128.729, 129.260, 130.869, 134.072, 138.171, 150.600, 156.443 Температура плавления 108-112°С. (Фиг. 8) ¹ Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ: 2.479(s, 3Н), 4.927(s, 1Н), 2.260-3.063(m, 8Н), 6.533-6.551 (d, 1Н, J=7.2 МГц), 6.631-6.692(m, 2Н), 6.739-6.758(d, 1Н, J=7.6 МГц), 6.789-6.809(d, 1Н, J=8 Гц), 6.864(m, 3Н), 7.092-7.183(m, 1Н), 7.281-7.297(m, 1Н), 7.537-7.552(d, 1Н, J=6 Гц); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 20.92, 51.16, 51.42, 73.44, 116.07, 116.96, 117.14, 118.716, 119.27, 119.83, 124.965, 125.24, 126.445 , 127.12, 127.545, 128.266, 128.729, 129.260, 130.869, 134.072, 138.171, 150.600, 156.443 (Fig. 8)

Характеристика Соединения 9 (NPB):Compound 9 Feature (NPB):

¹Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ: 1.183-1.647(m, 8Н), 2.019-3.067(m, 8Н), 4.509(s, 1Н), 4.312-4.327(m, 1Н, NH), 5.965(s, 1Н), 6.668(m, 1Н), 6.801-6.896(m, 3Н), 7.073-7.190(m, 3Н), 7.305(m, 1Н), 7.527-7.542(m, 2Н), 7.770(s, 1Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 23.78, 33.18, 51.22, 51.78, 76.10, 117.14, 118.59, 119.67, 124.69, 124.98, 126.22, 127.53, 128.85, 129.29, 131.08, 134.08, 135.53, 140.28, 150.5, 156.1, 166.73; m/z (М+2,526.2,527.2) Температура плавления 174-178°С. (Фиг. 9) ¹ H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.183-1.647(m, 8H), 2.019-3.067(m, 8H), 4.509(s, 1H), 4.312-4.327(m, 1H, NH), 5.965(s, 1H), 6.668(m, 1H), 6. 801-6.896(m, 3H), 7.073-7.190(m, 3H), 7.305(m, 1H), 7.527-7.542(m, 2H), 7.770(s, 1H); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 23.78, 33.18, 51.22, 51.78, 76.10, 117.14, 118.59, 119.67, 124.69, 124.98, 126.22, 127.53, 128.85, 12 9.29, 131.08, 134.08, 135.53, 140.28, 150.5, 156.1, 166.73; m/z (M+2.526.2.527.2) Melting point 174-178°C. (Fig. 9)

Характеристика Соединения 10:Feature Compound 10:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.183-3.074(m, 8Н), 4.361 (s, 1Н), 5.034(s, 2Н), 6.658-6.694(t, 1Н, J=7,2 Гц), 6.768(m, 1Н), 6.856-6.873(m, 3Н), 7.023(m, 1Н), 7.055-7.094(m, 3Н), 7.164(m, 1Н), 7.231 (m, 1Н), 7.266(m, 1Н), 7.304(m, 1Н), 7.322-7.355(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 51.264, 71.260, 75.434, 117.15, 118.6, 119.6, 124.8, 124.9, 127.3, 127.5, 128.1, 128.6, 128.8, 129.18, 150.5, 156.09; Температура плавления 75-80°С. (Фиг. 10) ¹ Н ЯМР (CDCl ₃ , 400 МГц) δ: 1.183-3.074(m, 8Н), 4.361 (s, 1Н), 5.034(s, 2Н), 6.658-6.694(t, 1Н, J=7,2 Гц), 6.768(m, 1Н), 6.856-6.873(m, 3Н), 7.023(m, 1Н), 7.055-7.094(m, 3Н), 7.164(m, 1Н), 7.231 (m, 1Н), 7.266(m, 1Н), 7.304(m, 1Н), 7.322-7.355(m, 2Н); ¹³ C NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 51.264, 71.260, 75.434, 117.15, 118.6, 119.6, 124.8, 124.9, 127.3, 127.5, 128.1, 128.6, 128.8, 129.18 , 150.5, 156.09; Melting point 75-80°C. (Fig. 10)

Пример 2Example 2

Соединение формулы I снижает жизнеспособность клеток целого ряда клеток карциномыCompound of formula I reduces cell viability of a range of carcinoma cells

Анализ онкогенностиOncogenicity analysis

Исходно авторы изобретения исследовали эффект недавно синтезированных низкомолекулярных соединений в отношении клеток MCF7 (ER+ МС клетки) с использованием анализа жизнеспособности клеток AlamarBlue®. Среди ряда новых низкомолекулярных соединений, NPB идентифицировали как эффективное низкомолекулярное соединение, уменьшающее жизнеспособность клеток MCF7, по сравнению с клетками, обработанными носителем (ДМСО). Среди данных соединений Соединение 9 N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)бензамид (NPB) идентифицируют как наиболее сильное антипролиферативное соединение с IC₅₀ 6,5 мкМ. Далее авторы изобретения определяли ингибирующую концентрацию 50% (IC₅₀) NPB в широком диапазоне линий клеток карциномы, включая линии клеток карциномы, происходящие из ER-карциномы молочной железы (ВТ549, MDA-MB-231), ER+ карциномы молочной железы (MCF7, T47D и ВТ474), карциномы эндометрия (Ishikawa, ЕСС-1, RL95-2 и AN3), яичника (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2 и OVCA433), гепатоцеллюлярной карциномы (Нер3В, Н2Р и Н2М), карциномы толстой кишки (НСТ116, DLD-1 и Сасо-2), предстательной железы (РС3, LNCaP и DU145) и поджелудочной железы (AsPC-1, ВхРС-3). В качестве контролей - нормальных клеток авторы изобретения также включали иммортализованные эпителиальные клетки молочной железы (MCF10A и MCF12A), и иммортализованные гепатоциты (LO2) в панели клеточных линий. Значения IC₅₀ для NPB в линиях клеток карциномы приведены в таблице на Фиг. 11.Initially, the inventors investigated the effect of newly synthesized small molecule compounds on MCF7 cells (ER+ MC cells) using the AlamarBlue® cell viability assay. Among a number of new small molecular weight compounds, NPB was identified as an effective small molecule compound that reduces the viability of MCF7 cells compared to cells treated with vehicle (DMSO). Among these compounds, Compound 9 N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)benzamide (NPB) is identified as the most potent antiproliferative compound with an IC ₅₀ of 6.5 μM. Далее авторы изобретения определяли ингибирующую концентрацию 50% (IC ₅₀ ) NPB в широком диапазоне линий клеток карциномы, включая линии клеток карциномы, происходящие из ER-карциномы молочной железы (ВТ549, MDA-MB-231), ER+ карциномы молочной железы (MCF7, T47D и ВТ474), карциномы эндометрия (Ishikawa, ЕСС-1, RL95-2 и AN3), яичника (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2 и OVCA433), гепатоцеллюлярной карциномы (Нер3В, Н2Р и Н2М), карциномы толстой кишки (НСТ116, DLD-1 и Сасо-2), предстательной железы (РС3, LNCaP и DU145) и поджелудочной железы (AsPC-1, ВхРС-3). As controls, normal cells, the inventors also included immortalized mammary epithelial cells (MCF10A and MCF12A), and immortalized hepatocytes (LO2) in a panel of cell lines. IC ₅₀ values for NPB in carcinoma cell lines are tabulated in FIG. eleven.

Пример 3Example 3

NPB вызывает апоптотическую смерть клеток в целом ряду линий клеток карциномыNPB induces apoptotic cell death in a range of carcinoma cell lines

Кроме того, NPB оценивают в отношении нескольких клеточных линий ракового происхождения для определения эффекта, оказываемого на жизнеспособность цельных клеток, апоптоз и цитотоксичность, используя набор для анализа ApoTox-Glo™ Triplex, Promega (Сингапур), в соответствии с инструкциями производителя (Фиг. 12). Кратко, клетки засевают в черные непрозрачные 96-луночные планшеты (Corning®, Сингапур). После инкубации клеток в течение ночи среду меняют на указанную концентрацию NPB. После примерно 48 часов инкубации реагент для определения жизнеспособности/цитотоксичности, содержащий как субстрат GF-AFC, так и субстрат бис-AAF-R110, добавляют к клеткам, как предложено поставщиком. После примерно 45 минут инкубации при примерно 37°С флуоресценцию регистрируют в условиях возбуждения при 400 нм/ испускания при 505 нм в случае жизнеспособности и в условиях возбуждения при 485 нм / испускания при 520 нм в случае цитотоксичности, используя микропланшет-ридер Tecan для флуоресценции (Tecan, Сингапур). К клеткам дополнительно добавляют реагент Caspase-Glo 3/7 и, спустя примерно 25 минут инкубации при комнатной температуре, регистрируют люминесценцию, используя микропланшет-ридер Tecan. Количество жизнеспособных, цитотоксических и апоптотических клеток измеряют в трехкратной повторности.In addition, NPB was assessed against several cancer-derived cell lines to determine the effect on whole cell viability, apoptosis and cytotoxicity using the ApoTox-Glo™ Triplex Assay Kit, Promega (Singapore) according to the manufacturer's instructions (FIG. 12). Briefly, cells are seeded in black opaque 96-well plates (Corning®, Singapore). After incubating the cells overnight, the medium is changed to the indicated concentration of NPB. After approximately 48 hours of incubation, a viability/cytotoxicity reagent containing both GF-AFC substrate and bis-AAF-R110 substrate is added to the cells as suggested by the supplier. After about 45 minutes of incubation at about 37° C., fluorescence is recorded under excitation at 400 nm/emission at 505 nm in case of viability and under conditions of excitation at 485 nm/emission at 520 nm in case of cytotoxicity using a Tecan fluorescence microplate reader (Tecan, Singapore). Caspase-Glo 3/7 reagent was added to the cells and, after about 25 minutes of incubation at room temperature, luminescence was recorded using a Tecan microplate reader. The number of viable, cytotoxic and apoptotic cells is measured in triplicate.

Анализ апоптоза на основе Аннексина V и йодида пропидия (Аннексин V-PI)Apoptosis Assay Based on Annexin V and Propidium Iodide (Annexin V-PI)

Воздействие на фосфатидилсерин и смерть клеток оценивают посредством анализа FACS (от англ. Fluorescence-activated cell sorting - Сортировка клеток с активированной флуоресценцией) с использованием набора для окрашивания Annexin-V-FLUOS (Life Technologies, Сингапур) и PI-окрашенных клеток. Кратко, 1×10⁵ клеток MCF/лунка (190 мкл/лунка) засевают в 6-луночные планшеты и инкубируют с разными концентрациями NPB в течение примерно 24 часов, и образцы, обработанные ДМСО, используют в качестве контроля. Затем клетки промывают Аннексин V-связывающим буфером (10 мМ HEPES (от англ. 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)/NaOH, рН 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂), окрашивают Аннексином V FITC в течение примерно 30 мин при комнатной температуре в темноте, затем снова промывают и ресуспендируют в Аннексин V -связывающем буфере, содержащем PI. Образцы сразу же анализируют на клеточном сортере BD FACSAria (BD Biosciences, San Jose, СА).The effect on phosphatidylserine and cell death is assessed by FACS (Fluorescence-activated cell sorting) analysis using the Annexin-V-FLUOS staining kit (Life Technologies, Singapore) and PI-stained cells. Briefly, 1×10 ⁵ MCF cells/well (190 μl/well) are plated in 6-well plates and incubated with different concentrations of NPB for about 24 hours, and samples treated with DMSO are used as controls. Cells are then washed with Annexin V-binding buffer (10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl ₂ ), stained with Annexin V FITC for approximately 30 min at room temperature in the dark, then washed again and resuspended in Annexin V-binding buffer containing PI. Samples are immediately analyzed on a BD FACSAria cell sorter (BD Biosciences, San Jose, CA).

Потеря целостности мембраны и транслокация фосфатидилсерина к внешнему листку плазматической мембраны представляют собой ранние события апоптоза, которые могут быть выявлены с использованием окрашивания FITC-конъюгированным аннексином-V и йодидом пропидия. Отмечено, что NPB вызывает апоптоз в клетках MCF7, используя FITC-аннексин V и йодид пропидия. При обработке NPB увеличение уровня как ранних (PI негативных, FITC-Аннексин V позитивных), так и поздних апоптотических клеток (PI позитивных, FITC-Аннексин V позитивных) наблюдают дозозависимым образом, как показано на Фиг. 13А.Loss of membrane integrity and translocation of phosphatidylserine to the outer leaflet of the plasma membrane are early events of apoptosis that can be detected using FITC-conjugated annexin-V and propidium iodide staining. NPB has been shown to induce apoptosis in MCF7 cells using FITC-annexin V and propidium iodide. When treated with NPB, an increase in the level of both early (PI negative, FITC-Annexin V positive) and late apoptotic cells (PI positive, FITC-Annexin V positive) is observed in a dose-dependent manner, as shown in FIG. 13A.

Пример 4Example 4

Молекулярное взаимодействие NPB с рекомбинантным белком BADMolecular interaction of NPB with the recombinant BAD protein

Для обеспечения молекулярного взаимодействия наиболее перспективного кандидата, аффинности связывания NPB с BAD, авторы изобретения проводили измерения плазмонного поверхностного резонанса (SPR) с иммобилизованной субъединицей BAD, используя NPB в качестве аналита. Авторам изобретения известно, что BAD может связываться с субъединицей BAD in vitro. Вследствие этого, авторы изобретения анализировали данное взаимодействие, используя систему BIAcore. Рекомбинантный BAD иммобилизировали на сенсорном чипе СМ5. Для определения кривых ассоциации и диссоциации разные концентрации NPB отдельно инъецировали на поверхность сенсорного чипа, покрытого BAD. Наложенные сенсограммы, показанные на Фиг. 14, совместно анализировали. Демонстрировали прямое связывание BAD с NPB (Фиг. 14А). Расчет кинетических параметров для взаимодействия NPB и BAD выявил константу скорости ассоциации (1,4±0,4)×10³ М^-1сек^-1 и константу скорости диссоциации (5,4±0,38)×10³ сек^-1 аффинности связывания, что давало константы равновесия диссоциации (Kd) 37,12 мкМ. Данные кинетические параметры демонстрируют подтверждение аффинности в отношении взаимодействия BAD со структурой NPB.To ensure the molecular interaction of the most promising candidate, the binding affinity of NPB to BAD, the inventors performed plasmon surface resonance (SPR) measurements with the immobilized BAD subunit using NPB as the analyte. The inventors know that BAD can bind to the BAD subunit in vitro. As a consequence, the inventors analyzed this interaction using the BIAcore system. Recombinant BAD was immobilized on a CM5 sensor chip. To determine the association and dissociation curves, different concentrations of NPB were separately injected onto the surface of the BAD-coated sensor chip. The superimposed sensorgrams shown in FIG. 14 were jointly analyzed. Demonstrated direct binding of BAD to NPB (Fig. 14A). The calculation of the kinetic parameters for the interaction of NPB and BAD revealed an association rate constant of (1.4±0.4)×10 ³ M ^-1 sec ^-1 and a dissociation rate constant of (5.4±0.38)×10 ³ sec ^-1 binding affinity, which gave dissociation equilibrium constants (Kd) of 37.12 μM. These kinetic parameters demonstrate confirmation of affinity for the interaction of BAD with the NPB structure.

Анализ на основе поверхностного плазмонного резонансаAnalysis based on surface plasmon resonance

Молекулярные взаимодействия анализировали на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы BIAcore-2000 (BIAcore АВ, Uppsala, Швеция). Человеческий рекомбинантный белок BAD (кат. № MBS143012, MyBiosource, США) иммобилизировали на сенсорном чипе, как описано в протоколе производителя. Для исследования взаимодействия BAD с NPB разные концентрации NPB (20-100 мкМ) в подвижном буфере (HBS-EP, рН 7,4, BIAcore АВ) инъецировали на поверхность сенсорного чипа с иммобилизированным BAD со скоростью потока 15 мкп/мин в соответствии с указаниями производителя. NPB давали взаимодействовать с субъединицей BAD в течение 2 мин в случае ассоциации и диссоциации, соответственно, после чего сенсорный чип регенерировали посредством инъецирования 1 М NaCl на протяжении 2 мин перед следующей инъекцией. Используя пробный выпуск программного обеспечения BIA 4.1 (BIAcore АВ), кинетические параметры представляли собой такие, как константы скорости ассоциации и диссоциации (ka и kd), константы равновесия диссоциации (Kd) с использованием модели связывания 1:1 с массопереносом. Полученные сенсограммы накладывались с использованием пробного выпуска программного обеспечения BIA.Molecular interactions were analyzed based on surface plasmon resonance using a BIAcore-2000 system (BIAcore AB, Uppsala, Sweden). The human recombinant BAD protein (cat. no. MBS143012, MyBiosource, USA) was immobilized on a sensor chip as described in the manufacturer's protocol. To study the interaction of BAD with NPB, different concentrations of NPB (20-100 µM) in a running buffer (HBS-EP, pH 7.4, BIAcore AB) were injected onto the surface of the sensor chip with immobilized BAD at a flow rate of 15 µp/min according to the manufacturer's instructions. NPB was allowed to interact with the BAD subunit for 2 min in case of association and dissociation, respectively, after which the sensor chip was regenerated by injecting 1 M NaCl for 2 min before the next injection. Using a trial release of BIA 4.1 software (BIAcore AB), kinetic parameters were such as association and dissociation rate constants (ka and kd), dissociation equilibrium constants (Kd) using a mass transfer 1:1 binding model. The obtained sensograms were superimposed using a trial release of the BIA software.

Пример 5Example 5

Воздействие NPB на фосфорилирование ВАР является специфичным в отношении Ser99 (человека)The effect of NPB on BAP phosphorylation is specific to Ser99 (human)

Фосфорилирование hBAD на уровне остатков Ser-75 (остаток серина 112 мышиного BAD) и Ser-99 (остаток серина 136 мышиного BAD) являются ключевыми в регулировании активности семейства BCL-2 антиапоптотических белков [15]. Форсфорилирование hBAD или в положении Ser-75, или Ser99 (или в положении соответствующих остатков в мышином Bad) приводит к потери способности hBAD к гетеродимеризации с BCL-xL или BCL-2 [15]. Для дополнительного подтверждения предсказанной мишени, авторы изобретения сначала проанализировали воздействие NPB на фосфорилирование hBAD в положении Ser99 посредством анализа вестерн-блоттинг. Обработка клеток MCF7 NPB приводила к дозозависимому снижению уровня фосфорилирования Ser99 hBAD без значимого изменения в общем белке hBAD (Фиг. 14Б). Рассчитанная ЕС₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация) для ингибирования фосфорилирования Ser99 BAD под действием NPB составляла 0,41 плюс/минус 0,21 мкМ.Phosphorylation of hBAD at the level of Ser-75 (mouse BAD serine 112) and Ser-99 (murine BAD serine 136) are key in regulating the activity of the BCL-2 family of antiapoptotic proteins [15]. Forsphorylation of hBAD either at position Ser-75 or Ser99 (or at the position of the corresponding residues in murine Bad) leads to the loss of hBAD's ability to heterodimerize with BCL-xL or BCL-2 [15]. To further confirm the predicted target, the inventors first analyzed the effect of NPB on hBAD phosphorylation at position Ser99 by Western blot analysis. Treatment of cells with MCF7 NPB resulted in a dose-dependent decrease in Ser99 hBAD phosphorylation without significant change in total hBAD protein (FIG. 14B). The calculated EC ₅₀ (half maximum effective concentration) for inhibition of Ser99 BAD phosphorylation by NPB was 0.41 plus/minus 0.21 μM.

Далее авторы изобретения анализировали воздействие NPB на фосфорилирование hBAD в обоих положениях Ser75 и Ser99 посредством анализа вестерн-блоттинг у 25 линий клеток карциномы, происходящих от семи разных типов рака. Наблюдалось, что NPB главным образом ингибирует фосфорилирование BAD в сайте Ser99 во всех анализируемых линиях клеток карциномы; однако, NPB не демонстрировал воздействия на фосфорилирование hBAD в сайте Ser75 в тех же клетках, указывая на то, что NPB специфично ингибирует фосфорилирование в положении Ser99 hBAD (Фиг. 15).Next, the inventors analyzed the effect of NPB on hBAD phosphorylation at both Ser75 and Ser99 positions by Western blot analysis in 25 carcinoma cell lines derived from seven different types of cancer. NPB was observed to primarily inhibit BAD phosphorylation at the Ser99 site in all carcinoma cell lines analyzed; however, NPB showed no effect on hBAD phosphorylation at the Ser75 site in the same cells, indicating that NPB specifically inhibits phosphorylation at the Ser99 position of hBAD (FIG. 15).

миРНК (малые интерферирующие РНК)-опосредованное истощение экспрессии BAD отменяет эффект NPB в линиях клеток карциномыmiRNA (small interfering RNA)-mediated depletion of BAD expression abolishes the effect of NPB in carcinoma cell lines

Для подтверждения функциональной специфичности NPB, направленной на белок BAD, авторы изобретения дополнительно исследовали эффект воздействия NPB после миРНК-опосредованного истощения экспрессии BAD у 6 линий клеток карциномы (MCF7, ВТ474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 и DLD-1). Временная трансфекция разных клеток карциномы миРНК, направленной на транскрипт BAD, снижала уровень экспрессии BAD и также снижала уровни фосфор-Ser99 BAD, по сравнению с их контрольными клетками (трансфицированными рандомизированными олигонуклеотидами), как наблюдалось посредством анализа вестерн-блоттинг (Фиг. 16А). Жизнеспособность клеток, равно как и апоптоз, значимо не менялись при миРНК-опосредованном истощении BAD, как сообщалось ранее [26]. Как описано выше, NPB обработка линий контрольных трансфицированных клеток карциномы снижала уровень фосфорилирования BAD (Ser99), по сравнению с клетками, обработанными носителем. Одновременно, воздействие NPB на те же линии клеток карциномы снижало жизнеспособность клеток и повышало активность каспазы 3/7, по сравнению с клетками, подвергающимися воздействию носителя. Напротив, NPB не влиял на жизнеспособность клеток, равно как и на активность каспазы 3/7 в линиях клеток карциномы с истощенной экспрессией BAD (Фиг. 16В и С).To confirm the functional specificity of NPB directed to the BAD protein, the inventors further investigated the effect of NPB exposure after miRNA-mediated depletion of BAD expression in 6 carcinoma cell lines (MCF7, BT474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 and DLD-1). Transient transfection of different carcinoma cells with siRNA directed to the BAD transcript reduced BAD expression levels and also reduced phosphorus-Ser99 BAD levels compared to their control cells (transfected with randomized oligonucleotides) as observed by Western blot analysis (Fig. 16A). Cell viability, as well as apoptosis, did not change significantly during miRNA-mediated BAD depletion, as previously reported [26]. As described above, NPB treatment of control transfected carcinoma cell lines reduced the level of BAD (Ser99) phosphorylation compared to vehicle-treated cells. Simultaneously, exposure of the same carcinoma cell lines to NPB reduced cell viability and increased caspase 3/7 activity compared to vehicle-exposed cells. In contrast, NPB did not affect cell viability, nor did it affect caspase 3/7 activity in BAD-depleted carcinoma cell lines (FIGS. 16B and C).

Пример 6Example 6

NPB ингибирует фосфорилирование BAD, независимо от AKT сигнализации в линиях клеток карциномыNPB Inhibits BAD Phosphorylation Independent of AKT Signaling in Carcinoma Cell Lines

Расположенная выше Ser/Thr киназа AKT регулирует фосфорилирование hBAD в положении Ser99 [13]. Авторы изобретения, таким образом, определяли то, ингибирует ли NPB фосфорилирование hBAD (Ser99) посредством модуляции активности AKT (на что указывает фосфорилирование Ser473) с использованием анализа вестерн-блоттинг. Авторы изобретения не наблюдали изменения в уровнях pAKT или уровнях общего белка AKT после воздействия 10 мкМ NPB на четыре разные линии клеток карциномы (MCF7, Caov-3, Ishikawa и AsPC-1). Однако, все NPB-обработанные линии клеток карциномы (MCF7, Caov-3, Ishikawa и AsPC-1) демонстрировали ингибирование фосфорилирования BAD в сайте Ser99 и отсутствие изменения в уровне общего белка BAD (Фиг. 15В). Кроме того, авторы изобретения исследовали фосфорилирование BAD после истощения AKT, используя две независимые короткие РНК, образующие шпильки, нацеленные на экспрессию AKT, или ингибирование активности AKT под действием ингибитора AKT IV в качестве положительного контроля в разных линиях клеток карциномы. Авторы изобретения наблюдали, что истощенная экспрессия AKT в линиях клеток карциномы была ассоциирована с сопутствующим снижением уровней pAKT (Ser474) и pBAD (Ser99), по сравнению с контрольными клетками; что указывает на то, что фосфорилирование Ser99 BAD зависит от AKT во всех анализируемых линиях клеток ракового происхождения и как ранее опубликовано другими [13, 15, 27-29]. Таким образом, NPB специфично ингибирует фосфорилирование BAD в положении Ser99, не оказывая влияния на активность расположенной выше киназы (AKT) [29]. Данные результаты согласуются с электронным целевым прогнозированием и связыванием NPB с BAD, наблюдаемым посредством SPR. Следовательно, NPB специфично ингибирует фосфорилирование BAD в положении Ser99, независимо от расположенной выше киназы (AKT).The upstream Ser/Thr AKT kinase regulates hBAD phosphorylation at the Ser99 position [13]. The inventors thus determined whether NPB inhibits hBAD (Ser99) phosphorylation by modulating AKT activity (as indicated by Ser473 phosphorylation) using Western blot analysis. The inventors did not observe changes in pAKT levels or total AKT protein levels after exposure to 10 μM NPB in four different carcinoma cell lines (MCF7, Caov-3, Ishikawa and AsPC-1). However, all NPB-treated carcinoma cell lines (MCF7, Caov-3, Ishikawa, and AsPC-1) showed inhibition of BAD phosphorylation at the Ser99 site and no change in total BAD protein level (FIG. 15B). In addition, the inventors investigated BAD phosphorylation after AKT depletion using two independent short hairpin RNAs targeting AKT expression or inhibition of AKT activity by an AKT IV inhibitor as a positive control in different carcinoma cell lines. The inventors observed that depleted AKT expression in carcinoma cell lines was associated with a concomitant decrease in pAKT (Ser474) and pBAD (Ser99) levels compared to control cells; indicating that Ser99 BAD phosphorylation is AKT dependent in all cancer cell lines analyzed and as previously published by others [13, 15, 27-29]. Thus, NPB specifically inhibits BAD phosphorylation at the Ser99 position without affecting the activity of the upstream kinase (AKT) [29]. These results are consistent with e-target prediction and the association of NPB with BAD observed by SPR. Therefore, NPB specifically inhibits BAD phosphorylation at the Ser99 position, independent of the upstream kinase (AKT).

Пример 7:Example 7:

Самкам мышей BALB/c-nu 5-6-недельного возраста подкожно имплантировали пеллеты с 17β-эстрадиолом (Американское инновационное исследование) в количестве 0,72 мг/пеллет с 60-суточным высвобождением в заднюю часть шеи, спустя трое суток, после того, как мышам подкожно инъецировали 100 мкл клеточной суспензии (1×10⁷ клеток) в правый бок. Рост опухоли отслеживали посредством измерения размера опухоли, используя калиперы. Примерно 12 суток после имплантации мышей случайным образом распределяли и делили на три группы (в каждой группе, n равен 8), в соответствии с обработками вводили 200 мкл NPB (растворенного в 5% ДМСО, 50% ПЭГ (полиэтиленгликоль) 400 и 45% воды, рН 5,0) посредством внутрибрюшинной инъекции каждые сутки на протяжении семи суток. Первую группу мышей обрабатывали носителем, вторую - дозой NPB 5 мг/кг и третью - дозой NPB 20 мг/кг. Массу животного и объемы опухоли измеряли ежедневно. После завершения опухоли удаляли, фотографировали, взвешивали и фиксировали или хранили в жидком азоте для дальнейшего анализа. Гистологический анализ проводили, как описано ранее (30-32).Female BALB/c-nu mice 5-6 weeks of age were subcutaneously implanted with 17β-estradiol pellets (American Innovation Study) at 0.72 mg/pellets with a 60-day release in the back of the neck, three days later, after the mice were injected subcutaneously with 100 μl of cell suspension (1×10 ⁷ cells) in the right side Tumor growth was monitored by measuring tumor size using calipers. Approximately 12 days after implantation, mice were randomized and divided into three groups (in each group, n is 8), according to the treatments, 200 μl of NPB (dissolved in 5% DMSO, 50% PEG (polyethylene glycol) 400 and 45% water, pH 5.0) were administered via intraperitoneal injection every day for seven days. The first group of mice were treated with vehicle, the second with 5 mg/kg NPB, and the third with 20 mg/kg NPB. Animal weight and tumor volumes were measured daily. After completion, the tumors were removed, photographed, weighed and fixed or stored in liquid nitrogen for further analysis. Histological analysis was performed as previously described (30-32).

Авторы изобретения исследовали in vivo эффективность NPB в ксенотрансплантате (MCF7) МС. Мышам с преформированными опухолями (объем примерно 150 см³), сгруппированным случайным образом, внутрибрюшинно инъецировали носитель или NPB в количестве 5 мг/кг или 20 мг/кг. Значимое уменьшение объема опухоли наблюдали у мышей, обработанных NPB, в сравнении с их аналогами, обработанными носителем (Фиг. 17А). На протяжении данного периода отсутствовало значимое различие в массе животных среди групп (Фиг. 17А, ниже). Однако масса опухоли NPB-обработанных животных уменьшалась, по сравнению с мышами, обработанными носителем, и дозозависимым образом (Фиг. 17В). Кроме того, авторы изобретения анализировали воздействие NPB на уровни фосфорилирования Ser99 hBAD в опухолевой ткани с использованием анализа WB (Фиг. 17С). Обработка NPB значимо ингибировала фосфорилирование BAD (в положении Ser99) в опухоли, по сравнению с контрольными образцами. Никакого изменения в общих уровнях белка BAD не наблюдалось у NPB-обработанных опухолей и опухолей, обработанных контролем.The inventors investigated the in vivo efficacy of NPB in xenograft (MCF7) MS. Mice with preformed tumors (volume about 150 cm ³ ), randomly grouped, were intraperitoneally injected with vehicle or NPB at 5 mg/kg or 20 mg/kg. A significant reduction in tumor volume was observed in NPB-treated mice compared to their vehicle-treated counterparts (FIG. 17A). During this period, there was no significant difference in the weight of the animals among the groups (Fig. 17A, below). However, tumor mass in NPB-treated animals decreased, compared to vehicle-treated mice, in a dose-dependent manner (FIG. 17B). In addition, the inventors analyzed the effect of NPB on Ser99 hBAD phosphorylation levels in tumor tissue using a WB assay (FIG. 17C). NPB treatment significantly inhibited BAD (at Ser99) phosphorylation in the tumor compared to controls. No change in total BAD protein levels was observed in NPB-treated and control-treated tumors.

Гистологические анализы образцов опухоли, резецированных у животных, обработанных NPB, демонстрировали значимо сниженный уровень p-BAD (Ser99), в сравнении с опухолями, обработанными носителем (Фиг. 17D), тогда как значимое различие в белке BAD между данными группами отсутствовало. Животные, обработанные NPB, демонстрировали значимо сниженный процент Ki67 позитивных клеток в опухолях и значимо повышенную TUNEL позитивность, по сравнению с животными, обработанными носителем (Фиг. 17D).Histological analyzes of tumor samples resected from NPB-treated animals showed a significantly reduced level of p-BAD (Ser99) compared to vehicle-treated tumors (Fig. 17D), while there was no significant difference in BAD protein between these groups. NPB-treated animals showed a significantly reduced percentage of Ki67 positive cells in tumors and significantly increased TUNEL positivity compared to vehicle-treated animals (FIG. 17D).

Пример 8:Example 8:

Для выявления факультативности того, что NPB снижает уровень фосфорилирования Ser99 hBAD посредством модуляции киназной активности, авторы изобретения оценивали воздействие NPB на разные киназы с использованием набора Human Phospho-Kinase Antibody Array из R&D Systems. Значимых изменений в киназной активности или фосфорилированных субстратах не наблюдали в клетках MCF7, подвергающихся воздействию NPB, в сравнении с клетками, подвергающимися воздействию ДМСО, несмотря на ингибирование фосфорилирования Ser99 hBAD под действием NPB в том же экстракте (Фиг. 18).To determine whether NPB reduces hBAD Ser99 phosphorylation by modulating kinase activity, the inventors evaluated the effects of NPB on various kinases using the Human Phospho-Kinase Antibody Array from R&D Systems. Significant changes in kinase activity or phosphorylated substrates were not observed in NPB-exposed MCF7 cells compared to DMSO-exposed cells, despite inhibition of hBAD Ser99 phosphorylation by NPB in the same extract (FIG. 18).

Пример 9:Example 9:

Авторы изобретения также генерировали дополнительные аналоги NPB (Фиг. 19, 20, 21) в соответствии с заявленной химической матрицей и которые могут демонстрировать фармакокинетические профили лучше, чем у NPB. Их структура и эффективность in vitro, как определено IC₅₀, показаны на Фиг. 22.The inventors have also generated additional NPB analogs (FIGS. 19, 20, 21) in accordance with the claimed chemical matrix and which can show pharmacokinetic profiles better than NPB. Their structure and in vitro potency as determined by IC ₅₀ are shown in FIG. 22.

СсылкиLinks

1. Rakesh KS, Jagadish S, Vinayaka AC, Hemshekhar M, Paul M, Thushara RM, Sundaram MS, Swaroop TR, Mohan CD and Sadashiva MP. A New Ibuprofen Derivative Inhibits Platelet Aggregation and ROS Mediated Platelet Apoptosis. PloS one. 2014; 9(9):e107182.1. Rakesh KS, Jagadish S, Vinayaka AC, Hemshekhar M, Paul M, Thushara RM, Sundaram MS, Swaroop TR, Mohan CD and Sadashiva MP. A New Ibuprofen Derivative Inhibits Platelet Aggregation and ROS Mediated Platelet Apoptosis. PloS one. 2014; 9(9):e107182.

2. Krautwald S, Ziegler E, Rolver L, Linkermann A, Keyser KA, Steen P, Wollert KC, Korf-Klingebiel M and Kunzendorf U. Effective blockage of both the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis in mice by TAT-crmA. The Journal of biological chemistry. 2010; 285(26): 19997-20005.2. Krautwald S, Ziegler E, Rolver L, Linkermann A, Keyser KA, Steen P, Wollert KC, Korf-Klingebiel M and Kunzendorf U. Effective blockage of both the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis in mice by TAT-crmA. The Journal of Biological Chemistry. 2010; 285(26): 19997-20005.

3. Riedl SJ and Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5(11):897-907.3. Riedl SJ and Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5(11):897-907.

4. Hardwick JM and Soane L. Multiple functions of BCL-2 family proteins. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2013; 5(2).4. Hardwick JM and Soane L. Multiple functions of BCL-2 family proteins. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2013; 5(2).

5. Czabotar PE and Lessene G. Bcl-2 family proteins as therapeutic targets. Current pharmaceutical design. 2010; 16(28):3132-3148.5. Czabotar PE and Lessene G. Bcl-2 family proteins as therapeutic targets. current pharmaceutical design. 2010; 16(28):3132-3148.

6. Anilkumar U and Prehn JH. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins in acute neural injury. Frontiers in cellular neuroscience. 2014; 8:281.6. Anilkumar U and Prehn JH. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins in acute neural injury. Frontiers in cellular neuroscience. 2014; 8:281.

7. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K. and Walter P. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science; 2008. Classic textbook now in its 5th Edition. 2010.7. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K. and Walter P. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science; 2008. Classic textbook now in its 5th Edition. 2010.

8. Hutt KJ. The role of ВН3-only proteins in apoptosis within the ovary. Reproduction (Cambridge, England). 2015; 149(2):R81-r89.8. Hutt KJ. The role of BH3-only proteins in apoptosis within the ovary. Reproduction (Cambridge, England). 2015; 149(2):R81-r89.

9. Ambrosini G, Adida С and Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nature medicine. 1997; 3(8):917-921.9. Ambrosini G, Adida C and Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. nature medicine. 1997; 3(8):917-921.

10. Keerthy HK, Mohan CD, Siveen KS, Fuchs JE, Rangappa S, Sundaram MS, Li F, Girish KS, Sethi G and Bender A. Novel synthetic biscoumarins target tumor necrosis factor-a in hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 2014; 289(46):31879-31890.10. Keerthy HK, Mohan CD, Siveen KS, Fuchs JE, Rangappa S, Sundaram MS, Li F, Girish KS, Sethi G and Bender A. Novel synthetic biscoumarins target tumor necrosis factor-a in hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 2014; 289(46):31879-31890.

11. Smith AJ, Karpova Y, D'Agostino R, Jr., Willingham M and Kulik G. Expression of the Bcl-2 protein BAD promotes prostate cancer growth. PloS one. 2009; 4(7):e6224.11. Smith AJ, Karpova Y, D'Agostino R, Jr., Willingham M and Kulik G. Expression of the Bcl-2 protein BAD promotes prostate cancer growth. PloS one. 2009; 4(7):e6224.

12. Doerflinger M, Glab JA and Puthalakath H. ВН3-only proteins: A 20-year stock-take. The FEBS journal. 2015.12. Doerflinger M, Glab JA and Puthalakath H. BH3-only proteins: A 20-year stock-take. The FEBS journal. 2015.

13. Hayakawa J, Ohmichi M, Kurachi H, Kanda Y, Hisamoto K, Nishio Y, Adachi K, Tasaka K, Kanzaki T and Murata Y. Inhibition of BAD phosphorylation either at serine 112 via extracellular signal-regulated protein kinase cascade or at serine 136 via Akt cascade sensitizes human ovarian cancer cells to cisplatin. Cancer research. 2000; 60(21):5988-5994.13. Hayakawa J, Ohmichi M, Kurachi H, Kanda Y, Hisamoto K, Nishio Y, Adachi K, Tasaka K, Kanzaki T and Murata Y. Inhibition of BAD phosphorylation either at serine 112 via extracellular signal-regulated protein kinase cascade or at serine 136 via Akt cascade sensitizes human ovarian cancer cells to cisplatin. cancer research. 2000; 60(21):5988-5994.

14. Macdonald A, Campbell DG, Toth R, McLauchlan H, Hastie CJ and Arthur JS. Pirn kinases phosphorylate multiple sites on Bad and promote 14-3-3 binding and dissociation from Bcl-XL. BMC cell biology. 2006; 7:1.14. Macdonald A, Campbell DG, Toth R, McLauchlan H, Hastie CJ and Arthur JS. Pirn kinases phosphorylate multiple sites on Bad and promote 14-3-3 binding and dissociation from Bcl-XL. BMC cell biology. 2006; 7:1.

15. Fang X, Yu S, Eder A, Mao M, Bast RC, Jr., Boyd D and Mills GB. Regulation of BAD phosphorylation at serine 112 by the Ras-mitogen-activated protein kinase pathway. Oncogene. 1999; 18(48):6635-6640.15. Fang X, Yu S, Eder A, Mao M, Bast RC, Jr., Boyd D and Mills GB. Regulation of BAD phosphorylation at serine 112 by the Ras-mitogen-activated protein kinase pathway. Oncogene. 1999; 18(48):6635-6640.

16. Masters SC, Yang H, Datta SR, Greenberg ME and Fu H. 14-3-3 inhibits Bad-induced cell death through interaction with serine-136. Molecular pharmacology. 2001; 60(6):1325-1331.16. Masters SC, Yang H, Datta SR, Greenberg ME and Fu H. 14-3-3 inhibits Bad-induced cell death through interaction with serine-136. Molecular pharmacology. 2001; 60(6):1325-1331.

17. Harada H, Becknell B, Wilm M, Mann M, Huang LJ-s, Taylor SS, Scott JD and Korsmeyer SJ. Phosphorylation and inactivation of BAD by mitochondria-anchored protein kinase A. Molecular cell. 1999; 3(4):413-422.17. Harada H, Becknell B, Wilm M, Mann M, Huang LJ-s, Taylor SS, Scott JD and Korsmeyer SJ. Phosphorylation and inactivation of BAD by mitochondria-anchored protein kinase A. Molecular cell. 1999; 3(4):413-422.

18. Jiang P, Du W, Heese K and Wu M. The Bad guy cooperates with good cop p53: Bad is transcriptionally up-regulated by p53 and forms a Bad/p53 complex at the mitochondria to induce apoptosis. Molecular and cellular biology. 2006; 26(23):9071-9082.18. Jiang P, Du W, Heese K and Wu M. The Bad guy cooperates with good cop p53: Bad is transcriptionally up-regulated by p53 and forms a Bad/p53 complex at the mitochondria to induce apoptosis. Molecular and cellular biology. 2006; 26(23):9071-9082.

19. Marchion DC, Cottrill HM, Xiong Y, Chen N, Bicaku E, Fulp WJ, Bansal N, Chon HS, Stickles XB, Kamath SG, Hakam A, Li L, Su D, Moreno C, Judson PL, Berchuck A, et al. BAD phosphorylation determines ovarian cancer chemosensitivity and patient survival. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011; 17(19):6356-6366.19. Marchion DC, Cottrill HM, Xiong Y, Chen N, Bicaku E, Fulp WJ, Bansal N, Chon HS, Stickles XB, Kamath SG, Hakam A, Li L, Su D, Moreno C, Judson PL, Berchuck A, et al. BAD phosphorylation determines ovarian cancer chemosensitivity and patient survival. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011; 17(19):6356-6366.

20. Sastry KSR, Al-Muftah MA, Li P, Al-Kowari MK, Wang E, Ismail Chouchane A, Kizhakayil D, Kulik G, Marincola FM, Haoudi A and Chouchane L. Targeting proapoptotic protein BAD inhibits survival and self-renewal of cancer stem cells. Cell death and differentiation. 2014; 21(12): 1936-1949.20. Sastry KSR, Al-Muftah MA, Li P, Al-Kowari MK, Wang E, Ismail Chouchane A, Kizhakayil D, Kulik G, Marincola FM, Haoudi A and Chouchane L. Targeting proapoptotic protein BAD inhibits survival and self-renewal of cancer stem cells. Cell death and differentiation. 2014; 21(12): 1936-1949.

21. Anderson MA, Huang D and Roberts A. Targeting BCL2 for the treatment of lymphoid malignancies. Seminars in hematology. 2014; 51(3):219-227.21. Anderson MA, Huang D and Roberts A. Targeting BCL2 for the treatment of lymphoid malignancies. Seminars in hematology. 2014; 51(3):219-227.

22. Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, Armstrong RC, Augeri DJ, Belli BA, Bruncko M, Deckwerth TL, Dinges J and Hajduk PJ. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature. 2005; 435(7042):677-681.22. Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, Armstrong RC, Augeri DJ, Belli BA, Bruncko M, Deckwerth TL, Dinges J and Hajduk PJ. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumors. Nature. 2005; 435(7042):677-681.

23. Keerthy HK, Garg M, Mohan CD, Madan V, Kanojia D, Shobith R, Nanjundaswamy S, Mason DJ, Bender A and Rangappa KS. Synthesis and characterization of novel 2-amino-chromene-nitriles that target Bcl-2 in acute myeloid leukemia cell lines. PloS one. 2014; 9(9):e107118.23. Keerthy HK, Garg M, Mohan CD, Madan V, Kanojia D, Shobith R, Nanjundaswamy S, Mason DJ, Bender A and Rangappa KS. Synthesis and characterization of novel 2-amino-chromene-nitriles that target Bcl-2 in acute myeloid leukemia cell lines. PloS one. 2014; 9(9):e107118.

24. Bruncko M, Oost TK, Belli BA, Ding H, Joseph MK, Kunzer A, Martineau D, McClellan WJ, Mitten M, Ng SC, Nimmer PM, Oltersdorf T, Park CM, Petros AM, Shoemaker AR, Song X, et al. Studies leading to potent, dual inhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL. Journal of medicinal chemistry. 2007; 50(4):641-662.24. Bruncko M, Oost TK, Belli BA, Ding H, Joseph MK, Kunzer A, Martineau D, McClellan WJ, Mitten M, Ng SC, Nimmer PM, Oltersdorf T, Park CM, Petros AM, Shoemaker AR, Song X, et al. Studies leading to potent, dual inhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL. Journal of medicinal chemistry. 2007; 50(4):641-662.

25. Petros AM, Nettesheim DG, Wang Y, Olejniczak ET, Meadows RP, Mack J, Swift K, Matayoshi ED, Zhang H, Thompson CB and Fesik SW. Rationale for Bcl-xL/Bad peptide complex formation from structure, mutagenesis, and biophysical studies. Protein science: a publication of the Protein Society. 2000; 9(12):2528-2534.25. Petros AM, Nettesheim DG, Wang Y, Olejniczak ET, Meadows RP, Mack J, Swift K, Matayoshi ED, Zhang H, Thompson CB and Fesik SW. Rationale for Bcl-xL/Bad peptide complex formation from structure, mutagenesis, and biophysical studies. Protein science: a publication of the Protein Society. 2000; 9(12):2528-2534.

26. Boisvert-Adamo K and Aplin AE. Mutant B-RAF mediates resistance to anoikis via Bad and Bim. Oncogene. 2008; 27(23):3301-3312.26. Boisvert-Adamo K and Aplin AE. Mutant B-RAF mediates resistance to anoikis via Bad and Bim. Oncogene. 2008; 27(23):3301-3312.

27. Seow HF, Yip WK, Loh HW, Ithnin H, Por P and Rohaizak M. Immunohistochemical detection of phospho-Akt, phospho-BAD, HER2 and oestrogen receptors alpha and beta in Malaysian breast cancer patients. Pathology oncology research: POR. 2010; 16(2):239-248.27. Seow HF, Yip WK, Loh HW, Ithnin H, Por P and Rohaizak M. Immunohistochemical detection of phospho-Akt, phospho-BAD, HER2 and oestrogen receptors alpha and beta in Malaysian breast cancer patients. Pathology oncology research: POR. 2010; 16(2):239-248.

28. Kanamori Y, Kigawa J, Itamochi H, Shimada M, Takahashi M, Kamazawa S, Sato S, Akeshima R and Terakawa N. Correlation between loss of PTEN expression and Akt phosphorylation in endometrial carcinoma. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2001; 7(4):892-895.28. Kanamori Y, Kigawa J, Itamochi H, Shimada M, Takahashi M, Kamazawa S, Sato S, Akeshima R and Terakawa N. Correlation between loss of PTEN expression and Akt phosphorylation in endometrial carcinoma. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2001; 7(4):892-895.

29. Datta SR, Brunet A and Greenberg ME. Cellular survival: a play in three Akts. Genes & development. 1999; 13(22):2905-2927.29. Datta SR, Brunet A and Greenberg ME. Cellular survival: a play in three Akts. Genes & Development. 1999; 13(22):2905-2927.

30. Pandey V, Wu ZS, Zhang M, Li R, Zhang J, Zhu T, et al. Trefoil factor 3 promotes metastatic seeding and predicts poor survival outcome of patients with mammary carcinoma. Breast Cancer Res. 2014;16(5):429.30. Pandey V, Wu ZS, Zhang M, Li R, Zhang J, Zhu T, et al. Trefoil factor 3 promotes metastatic seeding and predicts poor survival outcome of patients with mammary carcinoma. Breast Cancer Res. 2014;16(5):429.

31. Wang XN, Wang SJ, Pandey V, Chen P, Li Q, Wu ZS, et al. Trefoil factor 3 as a novel biomarker to distinguish between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Medicine (Baltimore). 2015;94(20):e860.31 Wang XN, Wang SJ, Pandey V, Chen P, Li Q, Wu ZS, et al. Trefoil factor 3 as a novel biomarker to distinguish between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Medicine (Baltimore). 2015;94(20):e860.

32. You M, Chen Y, Chong Q, Wu M, Pandey V, Chen R, et al. Trefoil factor 3 mediation of oncogenicity and chemoresistance in hepatocellular carcinoma is AKT-BCL-2 dependent. Oncotarget. 2017.32 You M, Chen Y, Chong Q, Wu M, Pandey V, Chen R, et al. Trefoil factor 3 mediation of oncogenicity and chemoresistance in hepatocellular carcinoma is AKT-BCL-2 dependent. oncotarget. 2017.

Claims

1. Compound of general formula (I):

Where:

each R ¹ is independently OH, NR ¹⁰ R ¹¹ ,

wherein

each of R ¹⁰ and R ¹¹ is independently selected from C _1-6 alkyl;

n is 1, 2 or 3;

R ^2a and R ^2b together with the nitrogen atom to which they are attached form a piperazine substituted with one R ⁶ substituent;

each R ⁶ is independently selected from phenyl which may be substituted with 1-2 substituents selected from halo, C _1-2 alkyl;

R ³ is phenyl, naphthyl, 5-6 membered heteroaryl containing 1 heteroatom selected from O, N and S, any of which is optionally substituted with one R ⁷ substituent selected from halo, -O(C _1-4 alkyl), -C _1-4 haloalkyl, or -C(O)NR ⁸ R ⁹ ;

each of R ⁸ and R ⁹ is independently selected from H or C _3-6 cycloalkyl;

or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

2. Compound of general formula (IA):

Where:

each R ¹ is independently —O(C _1-6 alkyl);

m is 2;

each R ⁸ and R ⁹ is independently selected from H or C _3-6 cycloalkyl;

or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

3. A compound according to claim 1, wherein n is 1 or 2 and at least one R ¹ group is OH.

4. A compound according to claim 1 or 2, wherein R ^2a and R ^2b together with the nitrogen atom to which they are attached form a piperazine substituted with one R ⁶ substituent at the 4th position of the piperazine, such that the compound of general formula (I) is a compound of general formula (IB):

where R ¹ , R ³ and R ⁶ are as defined in paragraph 2, and n is 2.

5. Connection according to any one of paragraphs. 1-3 in which R ³ is phenyl optionally substituted with one R ⁷ substituent such that the compound of general formula (I) is a compound of general formula (IC):

where R ¹ , n, R ^2a , R ^2b and R ⁷ are as defined for the general formula (I), and z is 0-1.

6. A compound according to claim 5 wherein R ⁷ is -C(O)NR ⁸ R ⁹ , where R ⁸ is H and R ⁹ is C _3-6 cycloalkyl.

7. Connection according to any one of paragraphs. 1-5, which is a compound of general formula (ID):

where R ¹ , n, R ⁶ , R ⁷ and z are as defined above.

8. The compound according to claim 1, selected from the following compounds:

3-((4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxyphenyl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 41, NCK1);

2-((4-chlorophenyl)(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 42, NCK2);

2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(3-methoxyphenyl)methyl)phenol (Compound 43, NCK3);

2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(naphthalen-1-yl)methyl)phenol (Compound 45, NCK5);

2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-(trifluoromethyl)phenyl)methyl)phenol (Compound 48, NCK8);

2-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(pyridin-3-yl)methyl)phenol (Compound 50, NCK10);

3-((4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-(diethylamino)-2-hydroxyphenyl)methyl)-N-cyclopentylbenzamide (Compound 52, NCK16);

N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(4-(diethylamino)-2-hydroxyphenyl)methyl)benzamide (Compound 53, NCK18);

2-((4-chlorophenyl)(4-(4-chlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 55, NCK20);

2-(o-tolyl(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)phenol (Compound 57, SG1);

2-((4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)(4-(trifluoromethyl)phenyl)methyl)phenol (Compound 58, SG2); And

N-cyclopentyl-4-((2-hydroxyphenyl)(4-(p-tolyl)piperazin-1-yl)methyl)benzamide (Compound 59, SG3); or their pharmaceutically acceptable salt.

9. The compound of claim 2 which is N-cyclopentyl-3-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)methyl)benzamide (Compound 54, NCK19).

10. A method of obtaining a compound according to any one of paragraphs. 1-9, which includes one of two things:

i. interaction of an aldehyde of general formula (II):

where R ¹ is as defined in paragraph 1 or 2, and n is as defined in paragraph 1;

with a compound of general formula (III):

where R ^2a and R ^2b are as defined in paragraph 1;

and boronic acid of general formula (IV):

where R ³ is as defined in paragraph 1; or

ii. reaction of a compound of general formula (I), in which R ¹ is halo, with a compound of general formula (V):

where R ^1a represents aryl or heteroaryl, optionally substituted, as defined for R ¹ in paragraph 1 or 2;

by a Suzuki coupling reaction in the presence of a palladium catalyst to give a compound of general formula (I) wherein R ¹ is R ^1a .

11. The use of a compound according to any one of paragraphs. 1-9 for the treatment of cancer in which BAD is phosphorylated.

12. The use of a compound according to any one of paragraphs. 1-9 in the preparation of a cancer treatment agent in which BAD is phosphorylated.

13. A method of treating cancer in which BAD is phosphorylated, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of a compound according to any one of paragraphs. 1-9.

14. Application or method according to any one of paragraphs. 11-13, wherein the cancer in which BAD is phosphorylated is breast cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, or pancreatic cancer or any other cancer of epithelial origin in which BAD is phosphorylated.