RU2799430C1 - Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations - Google Patents
Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799430C1 RU2799430C1 RU2022131007A RU2022131007A RU2799430C1 RU 2799430 C1 RU2799430 C1 RU 2799430C1 RU 2022131007 A RU2022131007 A RU 2022131007A RU 2022131007 A RU2022131007 A RU 2022131007A RU 2799430 C1 RU2799430 C1 RU 2799430C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hcv
- insdseq
- insdqualifier
- cas
- crispr
- Prior art date
Links
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 105
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 241001112693 Lachnospiraceae Species 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 16
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 5
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 101100278473 Drosophila melanogaster PolZ1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 3
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 3
- 101100391171 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) for3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000028964 Congenital reticular ichthyosiform erythroderma Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 241001091615 Hepatitis C virus subtype 3a Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, а также к способам получения препаратов рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и к самим препаратам.The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a, as well as to methods for obtaining drugs ribonucleoprotein complex CRISPR-Cas and to the drugs themselves.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.EFFECT: invention allows in vitro detection of single copies of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а после проведения специфической амплификации фрагмента генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.The guide RNAs described in this application can be used to detect RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a after specific amplification of a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a. Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); nicking enzyme mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.The guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech next-generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases.
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.To solve the epidemiological problems of deciphering outbreaks of infectious diseases, identifying and identifying the pathogen, as well as detecting specific bacterial and viral genes, it is necessary to develop and introduce modern technologies of molecular epidemiology into the practice of surveillance and monitoring services. One of such technologies is the use of genetic editing elements of the CRISPR-Cas system. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unforeseen mutations. With in-depth studies in the field of application of the CRISPR-Cas system, it was found that it can be used for subtle diagnostic procedures in identifying the pathogen/s of infection in humans, as well as their genotyping.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов [J.S. Chen, E. Ma, L.B. Harrington et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-9, doi: 10.1126/science.aar6245].In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Cas12, after recognizing its target DNA target, begins to nonspecifically hydrolyze single-stranded DNA. This property of Cas12 can be used as an indicator of the presence of a specific target, such as the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a nucleic acid detection technology platform known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). The proposed platform combines the Cas12a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. For the first time, DETECTR technology was used to detect and genotype the human papillomavirus. DETECTR allowed differentiation of HPV16 and HPV18 in crude DNA extracts from cultured human cells and clinical specimens within 1 h. At the same time, DETECTR correctly (comparable to the results of PCR analysis) identified HPV16 in 25 and HPV18 in 23 out of 25 clinical samples [J.S. Chen, E. Ma, L.B. Harrington et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-9, doi: 10.1126/science.aar6245].
He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге [J.S. Gootenberg, О.О. Abudayyeh, J.W. Lee et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science 356(6336) (2017) 438-42, doi: 10.1126/science.aam9321].An equally important application of the CRISPR-Cas system is the identification of pathogens and the detection of specific bacterial genes using the SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) platform. The proposed platform combines the Cas13a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. The Cas13a complex binds and cleaves the pre-amplified target nucleic acid with high specificity. Using SHERLOCK, it was possible to correctly differentiate closely related Zika and Dengue virus strains [J.S. Gootenberg, O.O. Abudayyeh, J.W. Lee et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science 356(6336) (2017) 438-42, doi: 10.1126/science.aam9321].
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках [J.S. Gootenberg, О.О. Abudayyeh, M.J. Kellner et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science 360(6387) (2018) 439-44, doi: 10.1126/science.aaq0179].SHERLOCK has been improved (SHERLOCKv2) and allowed to detect up to 4 targets in one analysis. Multiplexing was achieved by combining several Cas13 nucleases and a Cas12 nuclease with specific fluorescent reporter complexes that allowed signal detection at different wavelengths. Quantitative detection was achieved by optimizing the concentrations of oligonucleotides used in the pre-amplification step so that input signal and signal intensity are closely correlated over a wide range of sample concentrations. Increased sensitivity was achieved by adding Csm6 to increase the intensity of fluorescent reporter cleavage. It is worth noting that SHERLOCKv2 is a portable analysis due to the fact that the detection of fluorescence readings in the proposed technology is replaced by visual detection on test strips [J.S. Gootenberg, O.O. Abudayyeh, M.J. Kellner et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science 360(6387) (2018) 439-44, doi: 10.1126/science.aaq0179].
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ [С. Myhrvold, С.А. Freije, J.S. Gootenberg et al., Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13, Science 360(6387) (2018) 444-8, doi: 10.1126/science.aas8836].Based on SHERLOCK, the HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) technology was developed, which eliminates the need for nucleic acid extraction and allows pathogens to be detected directly in patient biological samples (blood, serum or plasma samples, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials). At HUDSON, heat and chemical reduction inactivate nucleases present in high concentrations in patient biological samples, after which the viral particles are lysed, releasing nucleic acids into solution. HUDSON allows detection of Dengue virus within 2 hours with high sensitivity in samples of whole blood, serum and saliva of patients. In addition, HUDSON allows differentiation of four Dengue virus serotypes and identification of the 6 most common HIV reverse transcriptase mutations [C. Myhrvold, S.A. Freij, J.S. Gootenberg et al., Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13, Science 360(6387) (2018) 444-8, doi: 10.1126/science.aas8836].
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.In this regard, the task of developing new effective methods for detecting nucleic acids of pathogens of infectious diseases based on genetic technologies, such as CRISPR-Cas, is extremely urgent.
Из уровня техники известны научные статьи, описывающие обнаружение 5×109 копий РНК вируса гепатита С с помощью CRISPR-Cas12a без стадии предварительной амплификации [Nguyen, L.Т., Smith, В.М., & Jain, Р.K. (2020). Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection. Nature communications, 11(1), 4906. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-1]. Также известны решения, описывающие выявление 7,55×105 копий РНК вируса гепатита С с применением CRISPR-Cas12a и предварительной амплификации методом петлевой изотермической амплификации [Kham-Kjing, N., Ngo-Giang-Huong, N., Tragoolpua, K., Khamduang, W., & Hongjaisee, S. (2022). Highly Specific and Rapid Detection of Hepatitis С Virus Using RT-LAMP-Coupled CRISPR-Cas12 Assay. Diagnostics (Basel, Switzerland), 12(7), 1524. https://doi.org/10.3390/diagnostics12071524].Scientific articles are known in the art describing the detection of 5×10 9 copies of hepatitis C virus RNA by CRISPR-Cas12a without a pre-amplification step [Nguyen, L.T., Smith, B.M., & Jain, P.K. (2020). Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection. Nature communications, 11(1), 4906. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-1]. Solutions are also known that describe the detection of 7.55×10 5 copies of hepatitis C virus RNA using CRISPR-Cas12a and pre-amplification by loop isothermal amplification [Kham-Kjing, N., Ngo-Giang-Huong, N., Tragoolpua, K. , Khamduang, W., & Hongjaisee, S. (2022). Highly Specific and Rapid Detection of Hepatitis C Virus Using RT-LAMP-Coupled CRISPR-Cas12 Assay. Diagnostics (Basel, Switzerland), 12(7), 1524. https://doi.org/10.3390/diagnostics12071524].
Кроме того, известны научные статьи, в которых описана разработка и получение направляющих РНК CRISPR-Cas13 для терапии инфекций, вызванных вирусом гепатита С [Ashraf, M.U., Salman, H.M., Khalid, M.F., Khan, M., Anwar, S., Afzal, S., Idrees, M., & Chaudhary, S.U. (2021). CRISPR-Cas13a mediated targeting of hepatitis С virus internal-ribosomal entry site (IRES) as an effective antiviral strategy. Biomedicine & pharmacotherapy=Biomedecine & pharmacotherapie, 136, 111239. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111239].In addition, scientific articles are known that describe the development and production of CRISPR-Cas13 guide RNAs for the treatment of infections caused by the hepatitis C virus [Ashraf, M.U., Salman, H.M., Khalid, M.F., Khan, M., Anwar, S., Afzal , S., Idrees, M., & Chaudhary, S.U. (2021). CRISPR-Cas13a mediated targeting of hepatitis C virus internal-ribosomal entry site (IRES) as an effective antiviral strategy. Biomedicine & pharmacotherapy=Biomedecine & pharmacotherapie, 136, 111239. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111239].
Из уровня техники известны: мультиплексная диагностика на основе эффекторной системы CRISPR [Заявка на патент на изобретение RU 2020124203, дата подачи 20.12.2018]; РНК-проводник St10 для использования в высокоспецифической системе нуклеаз Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) и применение указанного РНК-проводника и белка StCas9 для подавления экспрессии вируса гепатита В в клетке-хозяине и для элиминации вирусной ДНК из клетки-хозяина [патент RU 2694396, дата приоритета 14.12.2018, дата регистрации 12.07.2019]; новые ферменты CRISPR и системы [патент RU 2771826, дата приоритета по заявке 2018101732 от 17.06.2016, опубликовано 12.05.2022]. Из перечисленных выше материалов ни один нельзя отнести к ближайшим аналогам настоящего изобретения в виду того, что направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, предназначены для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.The following are known from the prior art: multiplex diagnostics based on the CRISPR effector system [Application for a patent for an invention RU 2020124203, filing date 12/20/2018]; Conductor RNA St10 for use in the highly specific Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 (StCas9) nuclease system and the use of the specified guide RNA and StCas9 protein to suppress hepatitis B virus expression in the host cell and to eliminate viral DNA from the host cell [patent RU 2694396 , priority date 12/14/2018, registration date 07/12/2019]; new CRISPR enzymes and systems [patent RU 2771826, priority date on application 2018101732 dated 06/17/2016, published 05/12/2022]. Of the materials listed above, none can be attributed to the closest analogues of the present invention in view of the fact that the guide RNAs described in this application are intended for the development of highly sensitive and high-tech diagnostic systems of a new generation based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases.
Ближайшими аналогами заявляемого решения являются изобретения по патентам RU 2782700 (дата приоритета 27.12.2021), RU 2782951 (дата приоритета 27.12.2021), заявка на патент №2021139116 (дата подачи 27.12.2021), направленные на получение направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления ДНК вируса гепатита В на основе CRISPR технологий. Однако, для расширения спектра подобных диагностических систем и совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний и эпидемиологического надзора необходимо разрабатывать новые методы для выявления нуклеиновых кислот вирусов, вызывающих инфекционные заболевания человека.The closest analogues of the claimed solution are inventions under patents RU 2782700 (priority date 12/27/2021), RU 2782951 (priority date 12/27/2021), patent application No. highly sensitive and high-tech diagnostic systems of a new generation for the detection of hepatitis B virus DNA based on CRISPR technologies. However, in order to expand the range of such diagnostic systems and improve methods for diagnosing infectious diseases and epidemiological surveillance, it is necessary to develop new methods for detecting the nucleic acids of viruses that cause human infectious diseases.
Исходя из вышеизложенного, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, in vitro.Based on the foregoing, a technical problem arises, which consists in the need to develop and obtain guide RNAs to detect single copies of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a in vitro.
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR-Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости и генов, кодирующих экзотоксины, бактериальных патогенов.The proposed technology is promising for a variety of applications, including DNA/RNA quantification, fast multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, such as detection of sample contamination with nucleic acids. CRISPR-Cas based technology is a feature rich, error tolerant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis, including infectious diseases, and genotyping of infectious agents and detection of antibiotic resistance genes and exotoxin-coding genes of bacterial pathogens.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:The application of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:
• высокая чувствительность;• high sensitivity;
• возможность проведения диагностики у постели больного;• the possibility of carrying out diagnostics at the patient's bedside;
• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;• the possibility of carrying out diagnostics in the field without the use of specialized high-tech equipment;
• скорость и простота анализа;• speed and simplicity of analysis;
• сниженная стоимость анализа;• reduced cost of analysis;
• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;• no need to equip the diagnostic laboratory with expensive equipment;
• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.• no need to isolate the nucleic acids of the pathogen.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а в биологических образцах.The invention relates to new tools - guide RNA, which can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a in biological samples.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.The technical objective of the proposed invention is the development of new tools - guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems with Cas12 proteins, for example, LbCpf1 from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а до единичных копий в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а до 5 раз. Также предложенное изобретение позволяет увеличить выход продукта реакции, получив желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК, и обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.When implementing the present invention, according to the set of essential features given in the claims, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a up to single copies in one reaction. EFFECT: increased efficiency of detection of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a up to 5 times. The proposed invention also makes it possible to increase the yield of the reaction product by obtaining the desired concentration of the final preparation of the guide RNA, and ensures the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA.
Технический результат достигается за счет:The technical result is achieved due to:
• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.• development of guide RNA molecules that can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultra-sensitive detection of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a RNA, where these guide RNAs are selected from the sequences of SEQ ID NO: 1-5, are able to bind to highly conserved target sites genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a, contain an RNA hairpin, which is recognized by RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, ensuring the detection of single copies of RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a.
• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеаз LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU №2707542, дата приоритетат 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а в ультра низких концентрациях (единичные копии).• the use of RNA-directed DNA endonucleases LbCpf1 from Lachnospiraceae, obtained according to the method developed by the authors earlier (Patent RU No. 2707542, priority date 03/28/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RPCs) of the CRISPR-Cas system suitable for detecting hepatitis virus RNA C genotypes 1b and 3a in ultra low concentrations (single copies).
• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-11, для предварительной амплификации фрагмента генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.• development of a set of specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6-11 for preliminary amplification of a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a.
• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.• optimization of conditions for preliminary amplification of a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a.
• определения условий проведения ультрачувствительной детекции РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а и установления последовательности стадий метода.• determining the conditions for ultrasensitive detection of hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a and establishing the sequence of the method steps.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:The guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-guided DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
• SEQ ID NO: 1;• SEQ ID NO: 1;
• SEQ ID NO: 2;• SEQ ID NO: 2;
• SEQ ID NO: 3;• SEQ ID NO: 3;
• SEQ ID NO: 4;• SEQ ID NO: 4;
• SEQ ID NO: 5;• SEQ ID NO: 5;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,• or at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 identical to any of them %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%,
• или комплементарной любой из них,• or complementary to any of them,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.• or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:Specific oligonucleotides for pre-amplification of a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a according to the present invention correspond to a highly conserved region of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
• SEQ ID NO: 6;• SEQ ID NO: 6;
• SEQ ID NO: 7;• SEQ ID NO: 7;
• SEQ ID NO: 8;• SEQ ID NO: 8;
• SEQ ID NO: 9;• SEQ ID NO: 9;
• SEQ ID NO: 10;• SEQ ID NO: 10;
• SEQ ID NO: 11;• SEQ ID NO: 11;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,• or at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 identical to any of them %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%,
• или комплементарной любой из них,• or complementary to any of them,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.• or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а в ультранизких концентрациях (единичные копии).According to the proposed invention, ribonucleoprotein complexes (RPCs) are obtained, consisting of at least one guide RNA and an RNA-guided DNA nuclease of the CRISPR-Cas LbCpf1 system from Lachnospiraceae, suitable for use in detecting hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations ( single copies).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.PKK preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-5 combined with a CRISPR-Cas system protein (LbCpf1 from Lachnospiraceae) or freeze-dried PKK.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с инструкцией по применению.The resulting guide RNAs can be used as part of a kit for detecting hepatitis C virus genotypes 1b and 3a RNA with instructions for use.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативного фрагмента генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-11. При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.The kit may further include components for pre-amplifying a highly conserved genome fragment of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NOs: 6-11. At the same time, at least one guide RNA in the kit can be complexed with a protein of the CRISPR-Cas system (LbCpf1 from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas предусматривает:The method for obtaining the preparation of the ribonucleoprotein complex CRISPR-Cas involves:
(i) синтез направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5,(i) synthesizing a guide RNA of SEQ ID NOs: 1-5,
(ii) объединение Cas-белка семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, в комплекс с по меньшей мере одной направляющей РНК, полученной на стадии (i), и при необходимости(ii) combining a Cas protein of the CRISPR-Cas LbCpf1 family from Lachnospiraceae, complexing with at least one guide RNA obtained in step (i), and optionally
(iii) лиофильную сушку рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, полученного на стадии (ii),(iii) freeze-drying the CRISPR-Cas ribonucleoprotein complex obtained in step (ii),
с получением, таким образом, препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.thus obtaining a CRISPR-Cas ribonucleoprotein complex preparation.
В предложенном способе синтез направляющих РНК может быть проведен методом in vitro транскрипции с последующим переосаждением продуктов реакции in vitro транскрипции из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта.In the proposed method, guide RNA synthesis can be carried out by in vitro transcription followed by reprecipitation of in vitro transcription reaction products from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 mM and an equal volume of isopropyl alcohol.
Также предложенный способ предусматривает непосредственно перед объединением с Cas-белком прогрев направляющей РНК при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры, что обеспечивает формирование корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК.Also, the proposed method provides for direct heating of the guide RNA at 90°C for 5 minutes immediately before combining with the Cas protein and allows it to slowly cool to room temperature, which ensures the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA.
Предложен препарат рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, который может быть получен раскрытым в настоящей заявке способом. Препарат содержит Cas-белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae в комплексе с по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5.A preparation of the CRISPR-Cas ribonucleoprotein complex is proposed for detecting hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a, which can be obtained by the method disclosed in this application. The preparation contains Cas-protein of the CRISPR-Cas LbCpf1 family from Lachnospiraceae in complex with at least one guide RNA with SEQ ID NO: 1-5.
Препарат может быть представлен как в жидкой форме - раствора указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas, так и в виде лиофилизата лиофильно высушенного порошка указанного рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas.The drug can be presented both in liquid form - a solution of the specified CRISPR-Cas ribonucleoprotein complex, and in the form of a lyophilisate of freeze-dried powder of the specified CRISPR-Cas ribonucleoprotein complex.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус гепатита С генотипов 1b и 3а. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.The proposed technology makes it possible to determine single copies of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a in patient biological samples taken from fluid and/or tissue suspected to contain hepatitis C virus of genotypes 1b and 3a. The biological sample may be a sample of blood, serum or blood plasma, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, hematopoietic tissues, and other biological materials from a patient that can be used to test for the presence of HCV RNA genotypes 1b and 3a.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента HCV 1b генома вируса гепатита С (размером 226 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов 555_for_1 score 12 и 555_1_rev score 10 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:Fig. 1. Visualization of the amplified HCV 1b fragment of the hepatitis C virus genome (226 bp in size) after preliminary amplification using oligonucleotides 555_for_1 score 12 and 555_1_rev score 10 by agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×106 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;1 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 6 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×105 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;2 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 5 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×104 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;3 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 4 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2300 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;4 - The product obtained during the amplification of 2300 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 230 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;5 - The product obtained during the amplification of 230 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 23 копии модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;6 - The product obtained during the amplification of 23 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3 копии модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;7 - The product obtained during the amplification of 2.3 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b;8 - negative control, not containing the model matrix pGEM-T-HCV 1b;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (
Фиг. 2. Визуализация амплифицированного фрагмента HCV 3а_1 генома вируса гепатита С (размером 210 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов HCV3a for2 и HCV3a rev2 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:Fig. 2. Visualization of the amplified HCV 3a_1 fragment of the hepatitis C virus genome (210 bp) after preliminary amplification using the HCV3a for2 and HCV3a rev2 oligonucleotides by agarose gel electrophoresis, where the numbers 1-8 indicate:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×106 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;1 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 6 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×105 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;2 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 5 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×104 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;3 The product obtained during the amplification of 2.3×10 4 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2300 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;4 - The product obtained during the amplification of 2300 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 230 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;5 - The product obtained during the amplification of 230 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 23 копии модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;6 - The product obtained during the amplification of 23 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3 копии модельной матрицы pGEM-T-HCV 3a_1;7 - The product obtained during the amplification of 2.3 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_1;8 - negative control, not containing the model matrix pGEM-T-HCV 3a_1;
M - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (
Фиг. 3. Визуализация амплифицированного фрагмента HCV 3а_2 генома вируса гепатита С (размером 405 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов HCV3a for3 и HCV3a rev3 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:Fig. 3. Visualization of the amplified HCV 3a_2 fragment of the hepatitis C virus genome (405 bp) after preliminary amplification using the HCV3a for3 and HCV3a rev3 oligonucleotides using agarose gel electrophoresis, where the numbers 1-8 indicate:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×106 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;1 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 6 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×105 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;2 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 5 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3×104 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;3 - The product obtained during the amplification of 2.3×10 4 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2300 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;4 - The product obtained during the amplification of 2300 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 230 копий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;5 - The product obtained during the amplification of 230 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 23 копии модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;6 - The product obtained during the amplification of 23 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,3 копии модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;7 - The product obtained during the amplification of 2.3 copies of the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2;8 - negative control, not containing the model matrix pGEM-T-HCV 3a_2;
M - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени HCV 1b генома вируса гепатита С, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HCV 1b №147 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HCV 1b №147, где:Fig. 4. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified HCV 1b target of the hepatitis C virus genome treated with a ribonucleoportein complex containing HCV 1b crRNA #147 guide RNA and LbCpf1 protein, on which the detection of the pGEM-T-HCV 1b model template is visualized by means of a graph. ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA crRNA HCV 1b No. 147, where:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;- fluorescence time is indicated horizontally, in minutes;
- на кривых 1-8 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:- curves 1-8 show the number of nucleic acid copies per reaction, namely:
1 - 2300000 копий/реакция;1 - 2300000 copies/reaction;
2 - 230000 копий/реакция;2 - 230,000 copies/reaction;
3 - 23000 копий/реакция;3 - 23,000 copies/reaction;
4 - 2300 копий/реакция;4 - 2300 copies/reaction;
5 - 230 копий/реакция;5 - 230 copies/reaction;
6 - 23 копий/реакция;6 - 23 copies/reaction;
7 - 2,3 копий/реакция;7 - 2.3 copies/reaction;
8 - mQ (отрицательный контроль).8 - mQ (negative control).
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени HCV 1b генома вируса гепатита С, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HCV 1b №179 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HCV 1b №179, где:Fig. 5. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified HCV 1b target of the hepatitis C virus genome treated with a ribonucleoportein complex containing HCV 1b crRNA #179 guide RNA and LbCpf1 protein, on which the detection of the pGEM-T-HCV 1b model template is visualized by means of a graph. ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA crRNA HCV 1b No. 179, where:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;- fluorescence time is indicated horizontally, in minutes;
- на кривых 9-16 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:- curves 9-16 show the number of nucleic acid copies per reaction, namely:
9 - 2300000 копий/реакция;9 - 2300000 copies/reaction;
10 - 230000 копий/реакция;10 - 230,000 copies/reaction;
11 - 23000 копий/реакция;11 - 23,000 copies/reaction;
12 - 2300 копий/реакция;12 - 2300 copies/reaction;
13 - 230 копий/реакция;13 - 230 copies/reaction;
14 - 23 копий/реакция;14 - 23 copies/reaction;
15 - 2,3 копий/реакция;15 - 2.3 copies/reaction;
16 - mQ (отрицательный контроль).16 - mQ (negative control).
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени HCV 1b генома вируса гепатита С, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HCV 1b №184 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pGEM-T-HCV 1b с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HCV 1b №184, где:Fig. 6. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified HCV 1b target of the hepatitis C virus genome treated with a ribonucleoportein complex containing HCV 1b crRNA #184 guide RNA and LbCpf1 protein, on which the detection of the pGEM-T-HCV 1b model template is visualized by means of a graph. ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA crRNA HCV 1b No. 184, where:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;- fluorescence time is indicated horizontally, in minutes;
- на кривых 17-24 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:- curves 17-24 show the number of nucleic acid copies per reaction, namely:
17 - 2300000 копий/реакция;17 - 2300000 copies/reaction;
18 - 230000 копий/реакция;18 - 230,000 copies/reaction;
19 - 23000 копий/реакция;19 - 23,000 copies/reaction;
20 - 2300 копий/реакция;20 - 2300 copies/reaction;
21 - 230 копий/реакция;21 - 230 copies/reaction;
22 - 23 копий/реакция;22 - 23 copies/reaction;
23 - 2,3 копий/реакция;23 - 2.3 copies/reaction;
24 - mQ (отрицательный контроль).24 - mQ (negative control).
Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени HCV 3а_1 генома вируса гепатита С, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HCV 3а №3223 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HCV 3а №3223, где:Fig. 7. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified HCV 3a_1 target of the hepatitis C virus genome treated with a ribonucleoportein complex containing HCV crRNA 3a #3223 guide RNA and LbCpf1 protein, on which the detection of the pGEM-T-HCV 3a_1 model template was visualized by means of a graph using ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA crRNA HCV 3a No. 3223, where:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;- fluorescence time is indicated horizontally, in minutes;
- на кривых 25-32 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:- curves 25-32 show the number of nucleic acid copies per reaction, namely:
25 - 2300000 копий/реакция;25 - 2300000 copies/reaction;
26 - 230000 копий/реакция;26 - 230,000 copies/reaction;
27 - 23000 копий/реакция;27 - 23,000 copies/reaction;
28 - 2300 копий/реакция;28 - 2300 copies/reaction;
29 - 230 копий/реакция;29 - 230 copies/reaction;
30 - 23 копий/реакция;30 - 23 copies/reaction;
31 - 2,3 копий/реакция;31 - 2.3 copies/reaction;
32 - mQ (отрицательный контроль).32 - mQ (negative control).
Фиг. 8. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени HCV 3а_2 генома вируса гепатита С, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HCV 3а №4683 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pGEM-T-HCV 3а_2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HCV 3а №4683, где:Fig. 8. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified HCV 3a_2 target of the hepatitis C virus genome treated with a ribonucleoportein complex containing HCV crRNA 3a no. ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA crRNA HCV 3a No. 4683, where:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;- fluorescence time is indicated horizontally, in minutes;
- на кривых 33-40 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:- curves 33-40 show the number of nucleic acid copies per reaction, namely:
33 - 2300000 копий/реакция;33 - 2300000 copies/reaction;
34 - 230000 копий/реакция;34 - 230,000 copies/reaction;
35 - 23000 копий/реакция;35 - 23,000 copies/reaction;
36 - 2300 копий/реакция;36 - 2300 copies/reaction;
37 - 230 копий/реакция; 38 - 23 копий/реакция;37 - 230 copies/reaction; 38 - 23 copies/reaction;
39 - 2,3 копий/реакция;39 - 2.3 copies/reaction;
40 - mQ (отрицательный контроль).40 - mQ (negative control).
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней HCV 1b, HCV 3а_1 и HCV 3а_2 генома вируса гепатита С, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA HCV 1b №147, crRNA HCV 1b №179, crRNA HCV 1b №184, crRNA HCV 3a №3223 и crRNA HCV 3a №4683, где посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы вируса гепатита С с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, при этом:Fig. 9. Fluorescence values at the end point (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of HCV 1b, HCV 3a_1 and HCV 3a_2 of the hepatitis C virus genome treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA HCV 1b crRNA 1b No. 147, HCV 1b crRNA No. 179 , crRNA HCV 1b No. 184, crRNA HCV 3a No. 3223 and crRNA HCV 3a No. 4683, where the graph visualizes the detection of a model hepatitis C virus template using LbCpf1 ribonucleoprotein complexes from Lachnospiraceae, while:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указано количество копий модельной матрицы в реакции;- the number of copies of the model matrix in the reaction is indicated horizontally;
- столбцом
- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса гепатита С с использованием crRNA HCV 1b №179;- the column visualizes the efficiency of detection of single copies of the model matrix of the hepatitis C virus using crRNA HCV 1b No. 179;
- столбцом
- столбцом
- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса гепатита С с использованием crRNA HCV 3а №4683.- the column visualizes the efficiency of detection of single copies of the model matrix of the hepatitis C virus using crRNA HCV 3a No. 4683.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной с клинических образцов мишени HCV 1b генома вируса гепатита С, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA HCV 1b №147, crRNA HCV 1b №179 и crRNA HCV 1b №184, где посредством графика визуализировано выявление РНК вируса гепатита С с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae на ограниченной панели клинических образцов, при этом:Fig. 10. Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified HCV 1b target HCV genome clinical specimens treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA HCV 1b crRNA #147, HCV crRNA 1b #179, and HCV crRNA 1b No. 184, where the graph visualizes the detection of hepatitis C virus RNA using LbCpf1 ribonucleoprotein complexes from Lachnospiraceae in a limited panel of clinical samples, while:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указаны идентификаторы образца;- the sample identifiers are indicated horizontally;
- столбцом
- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса гепатита С, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HCV 1b №179;- the column shows the efficiency of detecting hepatitis C virus RNA contained in the preparations isolated from clinical samples using crRNA HCV 1b No. 179;
- столбцом
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней HCV 3а_1 и HCV 3а_2 генома вируса гепатита С, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA HCV 3а №3223 и crRNA HCV 3а №4683, где посредством графика визуализировано выявление РНК вируса гепатита С с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae на ограниченной панели клинических образцов, при этом:Fig. 11. Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for HCV genome HCV 3a_1 and HCV 3a_2 targets pre-amplified from clinical specimens treated with ribonucleoportein complexes containing HCV crRNA 3a no. 3223 and HCV crRNA 3a no. 4683 guide RNAs , where the graph visualizes the detection of hepatitis C virus RNA using LbCpf1 ribonucleoprotein complexes from Lachnospiraceae in a limited panel of clinical specimens, while:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;- the values of the normalized fluorescent signal generated by the dye are indicated along the vertical;
- по горизонтали указаны идентификаторы образца;- the sample identifiers are indicated horizontally;
- столбцом
- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса гепатита С, содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HCV 3а №4683.- the column shows the efficiency of detecting hepatitis C virus RNA contained in the preparations isolated from clinical samples using crRNA HCV 3a No. 4683.
Примеры осуществления изобретенияEXAMPLES OF CARRYING OUT THE INVENTION
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ГЕПАТИТА С ГЕНОТИПОВ 1В И 3А ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНКEXAMPLE 1: SELECTION OF TARGET SEQUENCES IN THE GENOME OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPES 1B AND 3A TO GENERATE GUIDE RNA
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса гепатита С генотипов 1b и 3а для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1). Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативные участки генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.To select target sequences in the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a to create guide RNAs, modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and programs that are in the public domain, including Benchling (https://www.benchling.com/molecular- biology/). A list of regions in the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a was compiled with a theoretically calculated probability of their splitting in highly conserved regions (Table 1). Guide RNAs specifically recognizing highly conserved regions of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a are represented by unique sequences of SEQ ID NOs: 1-5.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С ГЕНОТИПОВ 1В И 3А МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИEXAMPLE 2: PREPARATION OF MATERIAL FOR DETECTING HEPATITIS C VIRUS RNA GENOTYPES 1B AND 3A BY THE PRE-AMPLIFICATION METHOD
Подготовку материала для обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельных матриц, содержащих фрагменты генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а биологического образца, использовали плазмидные ДНК:Preparation of material for the detection of RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a was carried out by the method of preliminary amplification. As model matrices containing fragments of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a of a biological sample, plasmid DNA was used:
1) pGEM-T-HCV 1b, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса гепатита С генотипа 1b (размером 226 п.о.), и1) pGEM-T-HCV 1b containing a fragment of the genome of hepatitis C virus genotype 1b (226 bp in size), and
2) pGEM-T-HCV 3а_1, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса гепатита С генотипов 3а (размером 210 п.о.), и2) pGEM-T-HCV 3a_1 containing a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 3a (210 bp in size), and
3) pGEM-T-HCV 3а_2, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса гепатита С генотипов 3а (размером 405 п.о.).3) pGEM-T-HCV 3a_2 containing a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 3a (405 bp in size).
Предварительную амплификацию участков, соответствующих фрагментам генома вируса гепатита С, проводили с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 для получения фрагмента HCV 1b, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 для получения фрагмента HCV 3а_1 и SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 для получения фрагмента HCV 3а_2, приведенных в Таблице 2.Pre-amplification of regions corresponding to fragments of the hepatitis C virus genome was carried out using specific oligonucleotides with SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 to obtain a fragment of HCV 1b, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 to obtain a fragment of HCV 3a_1 and SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 to obtain the HCV 3a_2 fragment shown in Table 2.
Продукты, кодирующие фрагменты HCV 1b, HCV 3а_1 и HCV 3а_2 генома вируса гепатита С, получали в реакции изотермической амплификации с использованием специфических олигонуклеотидов 555_for_1 score 12 и 555_1_rev score 10, HCV3a for2 и HCV3a rev2, HCV3a for3 и HCV3a rev3 соответственно (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента HCV 1b составлял 226 пар нуклеотидов, HCV 3а_1 - 210 пар нуклеотидов, HCV 3а_2 - 405 пар нуклеотидов (Таблица 3).Products encoding fragments of HCV 1b, HCV 3a_1 and HCV 3a_2 of the hepatitis C virus genome were obtained in an isothermal amplification reaction using specific oligonucleotides 555_for_1 score 12 and 555_1_rev score 10, HCV3a for2 and HCV3a rev2, HCV3a for3 and HCV3a rev3, respectively (GenTerra, Russia). ). The size of the amplified fragment of HCV 1b was 226 bp, HCV 3a_1 - 210 bp, HCV 3a_2 - 405 bp (Table 3).
Амплификации для получения фрагментов генома вируса гепатита С проводилась при температуре 37°С в течение 60 минут.Amplification to obtain fragments of the hepatitis C virus genome was carried out at a temperature of 37°C for 60 minutes.
В ходе подготовки материала для обнаружения РНК вируса гепатита С методом предварительной амплификации проводили титрование модельных матриц pGEM-T-HCV 1b, pGEM-T-HCV 3а_1 и pGEM-T-HCV 3а_2 путем приготовления серийных разведений (Таблица 4).During the preparation of the material for the detection of hepatitis C virus RNA by the pre-amplification method, the model matrices pGEM-T-HCV 1b, pGEM-T-HCV 3a_1 and pGEM-T-HCV 3a_2 were titrated by preparing serial dilutions (Table 4).
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг. 1-3).To assess the efficiency of pre-amplification, the resulting fragments of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a were visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1-3).
Подготовленный описанным способом материал использовали для экспериментов по выявлению РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК crRNA HCV 1b №147, crRNA HCV 1b №179, crRNA HCV 1b №184, crRNA HCV 3a №3223 и crRNA HCV 3a №4683, без предварительной очистки.The material prepared by the described method was used for experiments on the detection of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a using LbCpf1 ribonucleoprotein complexes from Lachnospiraceae containing guide RNAs crRNA HCV 1b No. 147, crRNA HCV 1b No. 179, crRNA HCV 1b No. 184, crRNA HCV 3a No. 3223 and crRNA HCV 3a #4683, without pre-purification.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С ГЕНОТИПОВ 1В И 3АEXAMPLE 3: PRODUCTION OF GUIDE RNA AND CREATION OF RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES FOR DETECTION OF HEPATITIS C VIRUS RNA GENOTYPES 1B AND 3A
Для получения направляющих РНК для обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а был разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 5. Получение направляющих РНК проводили в несколько этапов:To obtain guide RNAs for the detection of RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a, a set of specific oligonucleotides was developed, shown in Table 5. The preparation of guide RNAs was carried out in several stages:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 5), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;1. obtaining a PCR product using a set of specific oligonucleotides (Table 5) encoding a guide RNA capable of binding to a target highly conserved region of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a, containing a hairpin RNA that is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а;2. purification of a PCR product encoding a guide RNA specific for a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а;3. synthesis of a guide RNA specific to a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.4. Purification of guide RNA specific to a fragment of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HCV 1b №147, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HCV 1b 147 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HCV 1b №147, составлял 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding HCV 1b crRNA guide RNA No. 147 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and HCV 1b crRNA 147 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding HCV 1b no. 147 crRNA was 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HCV 1b №179, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HCV 1b 179 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HCV 1b №179, составлял 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding HCV 1b no. 179 crRNA guide RNA was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and HCV 1b 179 crRNA (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding HCV 1b crRNA No. 179 was 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HCV 1b №184, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HCV 1b 184 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HCV 1b №184, составлял 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding HCV 1b crRNA guide RNA No. 184 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and HCV 1b 184 crRNA (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding HCV 1b crRNA No. 184 was 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HCV 3а №3223, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HCV 3а 3223 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HCV 3а №3223, составлял 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding HCV crRNA 3a no. 3223 guide RNA was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and HCV 3a crRNA 3223 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding HCV crRNA 3a No. 3223 was 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HCV 3а №4683, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HCV 3а 4683 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HCV 3а №4683, составлял 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding HCV crRNA 3а no. 4683 guide RNA was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and HCV 3a crRNA 4683 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding HCV crRNA 3a No. 4683 was 62 bp.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:Amplification temperature profile for obtaining PCR products encoding guide RNAs:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1. denaturation: 95°C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации:2. 35 amplification cycles:
95°С - 15 сек,95°С - 15 sec,
55°С - 45 сек,55°С - 45 sec,
72°С - 30 сек;72°C - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72°C for 5 minutes.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагментам генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.PCR products encoding guide RNAs specific for fragments of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a were visualized using agarose gel electrophoresis.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагментам генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, проводили с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагментам генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, использовали в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.Purification of PCR products encoding guide RNAs specific for genome fragments of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a was performed using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding guide RNAs specific for fragments of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a were used as a template for the synthesis of guide RNAs.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагментам генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, осуществляли методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждали из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.Synthesis of guide RNAs specific to fragments of the genome of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a was carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. The reaction products of in vitro transcription were reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 mM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer's protocol introduced by the authors allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С. Anders, M. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-51.The creation of a finished ribonucleoprotein complex containing a protein of the CRISPR-Cas LbCpf1 family from Lachnospiraceae and guide RNA was carried out by the authors according to a standard protocol with some modifications [C. Anders, M. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-51.
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревали при 90°С в течение 5 минут и позволяли медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.Immediately before combining with the Cas protein, the guide RNA preparation (250 ng) was heated at 90°C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). Such heating is necessary for the formation of the correct hairpin conformation contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial preparations of Cas proteins skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а.To form the finished ribonucleoprotein complex, 250 ng of the LbCpf1 Cas protein from Lachnospiraceae and the prepared guide RNA were mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for detection of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a.
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С ГЕНОТИПОВ 1В И 3А С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫEXAMPLE 4: DETECTION OF SINGLE COPIES OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPES 1B AND 3A WITH CRISPR/CAS RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES ON THE EXAMPLE OF A MODEL MATRIX
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, использовали в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 was used as a template for the detection of RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a using CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Для обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:To detect hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a using CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes, a reaction mixture was prepared containing the following components:
• 10× буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 M NaCl);• 10x buffer (100 mM TrisHCl pH 8.0, 1 M NaCl);
• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);• 50 mM MgCl2 (final concentration in
• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA HCV 1b №147, crRNA HCV 1b №179, crRNA HCV 1b №184, crRNA HCV 3a №3223 и crRNA HCV 3a №4683);• 250 ng ribonucleoprotein complex (LbCpf1 from Lachnospiraceae and guide RNA HCV 1b crRNA #147, HCV crRNA 1b #179, HCV crRNA 1b #184, HCV crRNA 3a #3223 and HCV crRNA 3a #4683);
• 10 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);• 10 pmol fluorescent probe (6FAM-TTATT-BHQ1);
• Мишень (предварительно амплифицированные фрагменты генома вируса гепатита С генотипов 1b и 3а);• Target (preliminarily amplified fragments of the hepatitis C virus genome genotypes 1b and 3a);
• вода mQ.• mQ water.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:The reaction mixtures containing all the necessary components were placed in a
30-60 циклов:30-60 cycles:
37°С-35 сек,37°C-35 sec,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.37°C - 25 sec, fluorescence imaging.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельных матриц - плазмидной ДНК pGEM-T-HCV 1b, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса гепатита С генотипа 1b размером 226 п.о., плазмидной ДНК pGEM-T-HCV 3а_1, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса гепатита С генотипов 3а размером 210 п.о., и плазмидной ДНК pGEM-T-HCV 3а 2, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса гепатита С генотипов 3а размером 405 п.о.First of all, experiments were carried out to detect single copies of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a using CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae, using model templates as a target - plasmid DNA pGEM-T-HCV 1b, containing a fragment of the genome of hepatitis C virus genotype 1b with a size of 226 bp, plasmid DNA pGEM-T-HCV 3a_1, containing a fragment of the genome of hepatitis C virus genotype 3a with a size of 210 bp, and plasmid DNA pGEM- T-
Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять единичные копии РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных мишеней HCV 1b, HCV 3а_1 и HCV 3а_2 вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA HCV 1b №147, crRNA HCV 1b №179, crRNA HCV 1b №184, crRNA HCV 3a №3223 и crRNA HCV 3a №4683 и белок LbCpf1, на Фиг. 4, Фиг. 5, Фиг. 6, Фиг. 7 и Фиг. 8, соответственно. Отметим, что в среднем уже на 13-ом цикле анализа (13 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (2,3 копий/реакция) РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 18-ому циклу (18 минут анализа) в 10 и более раз.CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes have been shown to be able to detect single copies of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a RNA. Typical results of the analysis are shown on examples of real-time fluorescence profiles for pre-amplified targets of HCV 1b, HCV 3a_1 and HCV 3a_2 of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a, treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA HCV 1b crRNA 1b No. 147, HCV 1b crRNA No. 179, HCV 1b crRNA #184, HCV 3a crRNA #3223 and HCV 3a crRNA #4683 and LbCpf1 protein, FIG. 4, FIG. 5, Fig. 6, FIG. 7 and FIG. 8, respectively. It should be noted that, on average, already at the 13th cycle of analysis (13 minutes), the value of the signal obtained during the detection of single copies (2.3 copies/reaction) of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence control sample that does not contain a target) by at least five times, and by the 18th cycle (18 minutes of analysis) by 10 or more times.
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, содержащегося в составе модельных матриц, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNAHCV 1b №179 > crRNAHCV 1b №184 > crRNA HCV 3a №3223 > crRNA HCV 1b №147 > crRNA HCV 3a №4683 (Фиг. 9).In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of hepatitis C virus RNA of genotypes 1b and 3a contained in model matrices was evaluated using various guide RNAs. It has been shown that CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and guide RNAs detect single copies of HCV genotypes 1b and 3a RNA with different efficiency, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: crRNAHCV 1b #179 > crRNAHCV 1b #184 > crRNA HCV 3a #3223 > crRNA HCV 1b #147 > crRNA HCV 3a #4683 (Fig. 9).
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С ГЕНОТИПОВ 1В И 3А С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВEXAMPLE 5: RNA DETECTION OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPES 1B AND 3A USING CRISPR/CAS RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES IN A LIMITED PANEL OF CLINICAL SPECIMENS
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (20 шт.), содержащих вируса гепатита С генотипов 1b и 3а (ранее подтверждено генотипированием).The developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (20 pcs.) containing hepatitis C virus genotypes 1b and 3a (previously confirmed by genotyping).
Для обнаружения единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas была проведена предварительная амплификация фрагментов генома вируса гепатита С. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 20 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты РНК.To detect single copies of hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a using CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes, preliminary amplification of fragments of the hepatitis C virus genome was carried out. Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) according to the manufacturer's instructions, RNA preparations were isolated.
Синтез кДНК фрагментов генома вируса гепатита С проводили методом обратной транскрипции с использованием специфических олигонуклеотидов 555_for_1 score 12 с SEQ ID NO: 6, HCV3a rev2 с SEQ ID NO: 9 и HCV3a rev3 с SEQ ID NO: 11 (Таблица 2) и обратной транскриптазы Superscript™ II (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 42°C. Продукты, кодирующие фрагменты генома вируса гепатита С, получали в реакции изотермической амплификации с использованием специфических олигонуклеотидов 555_for_1 score 12 и 555_1_rev score 10, HCV3a for2 и HCV3a rev2, HCV3a for3 и HCV3a rev3 соответственно (ГенТерра, Россия). Полученные продукты визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.Synthesis of cDNA fragments of the hepatitis C virus genome was performed by reverse transcription using specific oligonucleotides 555_for_1 score 12 with SEQ ID NO: 6, HCV3a rev2 with SEQ ID NO: 9 and HCV3a rev3 with SEQ ID NO: 11 (Table 2) and reverse transcriptase Superscript ™ II (Thermo Fisher Scientific, USA) at 42°C. Products encoding fragments of the hepatitis C virus genome were obtained in an isothermal amplification reaction using specific oligonucleotides 555_for_1 score 12 and 555_1_rev score 10, HCV3a for2 and HCV3a rev2, HCV3a for3 and HCV3a rev3, respectively (GenTerra, Russia). The resulting products were visualized by agarose gel electrophoresis.
Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The material obtained in this way was used as a template for the detection of single copies of hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a using CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Обнаружение единичных копий РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 4.Detection of single copies of hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a using CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes was carried out as described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять вирус гепатита С генотипов 1b и 3а в препаратах РНК, выделенных из клинических образцов. При этом в среднем уже на 13 цикле (13 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) более чем в 5 раз, а к 18 циклу (18 минут) анализа - более чем в 10 раз (Таблица 6).In the course of the analysis, it was shown that CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes have the ability to detect hepatitis C virus genotypes 1b and 3a in RNA preparations isolated from clinical samples. At the same time, on average, already at the 13th cycle (13 minutes) of the analysis, the signal value exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample that did not contain the target) by more than 5 times, and by the 18th cycle (18 minutes) of the analysis - more than 10 times. times (Table 6).
Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней HCV 1b, HCV 3а_1 и HCV 3а_2 вируса гепатита С генотипов 1b и 3а (20 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA HCV 1b №147, crRNA HCV 1b №179, crRNA HCV 1b №184, crRNA HCV 3a №3223 и crRNA HCV 3a №4683 и белок LbCpf1, на Фиг. 10 и Фиг. 11.Typical assay results are shown using endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for HCV 1b, HCV 3a_1 and HCV 3a_2 genotypes 1b and 3a pre-amplified targets (20 independent clinical samples) treated with ribonucleoportein complexes containing HCV 1b crRNA #147, HCV 1b crRNA #179, HCV 1b crRNA #184, HCV 3a crRNA #3223 and HCV 3a crRNA #4683 guide RNAs and LbCpf1 protein, FIG. 10 and FIG. eleven.
Эффективность выявления вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, содержащегося в составе препаратов РНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, оцененная по соотношению значений сигнала к значению «шума» при детекции, можно представить в следующем порядке по убыванию: crRNA HCV 3а №3223 > crRNA HCV 1b №184 > crRNA HCV 1b №179 > crRNA HCV 3a №4683 > crRNA HCV 1b №147 (Таблица 6).Efficiency of detecting hepatitis C virus genotypes 1b and 3a contained in RNA preparations isolated from clinical samples using various guide RNAs in CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae, estimated by the ratio of signal values to the value of "noise" » when detected, can be presented in the following descending order: crRNA HCV 3a No. 3223 > crRNA HCV 1b No. 184 > crRNA HCV 1b No. 179 > crRNA HCV 3a No. 4683 > crRNA HCV 1b No. 147 (Table 6).
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3а, и способны обнаруживать его препаратах РНК, выделенных из клинических образцов, после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.Thus, the developed guide RNAs allow ultrasensitive detection of single copies of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a RNA, and are able to detect it in RNA preparations isolated from clinical samples after preliminary amplification in the CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Способ получения <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Getting method
препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для preparation of the ribonucleoprotein complex CRISPR-Cas and a preparation for
выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких detection of hepatitis C virus RNA genotypes 1b and 3a in ultralow
концентрациях" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0" concentrations" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0"
productionDate="2022-11-28">productionDate="2022-11-28">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>EN</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-11-28</FilingDate> <FilingDate>2022-11-28</FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии <ApplicantName languageCode="en">Central Research Institute of Epidemiology
Роспотребнадзора</ApplicantName>Rospotrebnadzor</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin> <ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения препарата <InventionTitle languageCode="en">Method of obtaining the drug
рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления ribonucleoprotein complex CRISPR-Cas and a preparation for the detection
РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких RNA of hepatitis C virus genotypes 1b and 3a in ultralow
концентрациях</InventionTitle>concentrations</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>11</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>11</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV </INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatttggatcaacccgctcaatg</INSDSeq <INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatttggatcaacccgctcaatg</INSDSeq
_sequence>_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatggcgtgcccccgcgagactg</INSDSeq <INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatggcgtgcccccgcgagactg</INSDSeq
_sequence>_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatgcgacccaacactactcggc</INSDSeq <INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatgcgacccaacactactcggc</INSDSeq
_sequence>_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatccctagacgctcgctccttt</INSDSeq <INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatccctagacgctcgctccttt</INSDSeq
_sequence>_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatcggttggtgtcggcgggaac</INSDSeq <INSDSeq_sequence>aatttctactaagtgtagatcggttggtgtcggcgggaac</INSDSeq
_sequence>_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggacc</INSDSeq_seque <INSDSeq_sequence>gcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggacc</INSDSeq_seque
nce>nce>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cactcgcaagcaccctatcaggcagtaccacaag</INSDSeq_seque <INSDSeq_sequence>cactcgcaagcaccctatcaggcagtaccacaag</INSDSeq_seque
nce>nce>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggaggtaaaggagcgagcgtctagggtaaagg</INSDSeq_sequenc <INSDSeq_sequence>ggaggtaaaggagcgagcgtctagggtaaagg</INSDSeq_sequenc
e>e>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgatggtggttggaattggagttgtggtgtc</INSDSeq_sequenc <INSDSeq_sequence>atgatggtggttggaattggagttgtggtgtc</INSDSeq_sequenc
e>e>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"> <SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>33</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>33</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctccatactccaatcccaggagatacttgatcg</INSDSeq_sequen <INSDSeq_sequence>ctccatactccaatcccaggagatacttgatcg</INSDSeq_sequence
ce>ce>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"> <SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HCV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gacacgctgtgataaatgtcgttcccgccgac</INSDSeq_sequenc <INSDSeq_sequence>gacacgctgtgataaatgtcgttcccgccgac</INSDSeq_sequenc
e>e>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (9)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2799430C1 true RU2799430C1 (en) | 2023-07-05 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2743861C1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-03-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations |
| RU2747820C1 (en) * | 2020-11-30 | 2021-05-14 | Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations |
| RU2782700C1 (en) * | 2021-12-27 | 2022-11-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2743861C1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-03-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations |
| RU2747820C1 (en) * | 2020-11-30 | 2021-05-14 | Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations |
| RU2782700C1 (en) * | 2021-12-27 | 2022-11-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations |
| RU2782951C1 (en) * | 2021-12-27 | 2022-11-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method for detecting the dna of the hepatitis b virus at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NGUYEN, L.Т., et al. Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic aci detection. Nature communications, 2020, v.11, no.1, 4906, p.1-13. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-1. CHEN X. et al., A CRISPR-Cas 12b-Based Platform for Ultrasensitive, Rapid, and Highly Specific Detection of Hepatitis В Virus Genotypes В and С in Clinical Application, Front Bioeng Biotechnol, 2021, v.9, Atricle 743322, p.1-10. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2745637C1 (en) | Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations | |
| RU2799430C1 (en) | Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations | |
| RU2800421C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting hepatitis c virus rna genotypes 1b and 3a at ultra-low concentrations | |
| RU2800420C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802079C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802781C1 (en) | Method of obtaining a preparation of the ribonucleoprotein complex crispr-cas12 and a preparation for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations | |
| RU2802783C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations in ultra-low concentrations | |
| RU2764023C1 (en) | CRISPR-Cas 12 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764024C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR / Cas14 AND A PREPARATION FOR DETECTING THE RNA OF THE SARS-CoV-2 VIRUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764022C1 (en) | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD | |
| RU2764015C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE CRISPR/Cas 12 RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764020C1 (en) | CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764021C1 (en) | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD | |
| RU2720769C1 (en) | Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex of crispr / cas and a preparation for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations | |
| RU2782700C1 (en) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations | |
| RU2747819C1 (en) | Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations | |
| RU2782951C1 (en) | Method for detecting the dna of the hepatitis b virus at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2782739C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING A PREPARATION OF A RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND A PREPARATION FOR DETECTING THE exoU GENE ENCODING AN EXOTOXIN OF THE THIRD TYPE SECRETION SYSTEM, PSEUDOMONAS AERUGINOSA | |
| RU2820307C1 (en) | METHOD FOR PREPARING PREPARATION OF RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND PREPARATION FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2720767C1 (en) | Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2720768C1 (en) | Crispr-cas system for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations | |
| RU2747820C1 (en) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations | |
| RU2791879C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations | |
| RU2747880C1 (en) | Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2839484C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING PREPARATION OF RIBONUCLEOPROTEIN CRISPR-Cas COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-NDM-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS |