RU2798069C2 - Improved cell culture medium - Google Patents
Improved cell culture medium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2798069C2 RU2798069C2 RU2018101201A RU2018101201A RU2798069C2 RU 2798069 C2 RU2798069 C2 RU 2798069C2 RU 2018101201 A RU2018101201 A RU 2018101201A RU 2018101201 A RU2018101201 A RU 2018101201A RU 2798069 C2 RU2798069 C2 RU 2798069C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- ions
- concentration
- cell
- cell culture
- Prior art date
Links
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 38
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 32
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 23
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 37
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 11
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 11
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 11
- -1 carbohydrate compound Chemical class 0.000 description 10
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 9
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 5
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 5
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 5
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 5
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004783 Serene Substances 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical class [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- RBMGJIZCEWRQES-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RBMGJIZCEWRQES-DKWTVANSSA-N 0.000 description 2
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940033655 asparagine monohydrate Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;hydrate Chemical compound O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000006391 Ion Pumps Human genes 0.000 description 1
- 108010083687 Ion Pumps Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100269369 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) AGE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 102000005393 Sodium-Potassium-Exchanging ATPase Human genes 0.000 description 1
- 108010006431 Sodium-Potassium-Exchanging ATPase Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012378 ammonium molybdate tetrahydrate Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- FIXLYHHVMHXSCP-UHFFFAOYSA-H azane;dihydroxy(dioxo)molybdenum;trioxomolybdenum;tetrahydrate Chemical compound N.N.N.N.N.N.O.O.O.O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O FIXLYHHVMHXSCP-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Chemical class 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000004688 heptahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000004687 hexahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021232 nutrient availability Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008180 pharmaceutical surfactant Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Это изобретение относится к широкой области биотехнологии, в частности, к культивированию клеток и их применению для продукции полипептидов в промышленном масштабе.This invention relates to the broad field of biotechnology, in particular to the cultivation of cells and their use for the production of polypeptides on an industrial scale.
Настоящим изобретением обеспечиваются среды для культивирования клеток, которые подходят для культивирования клеток с высокими жизнеспособностями клеток, предпочтительно клеток млекопитающих, подобных клеткам CHO, и которые характеризуются молярным отношением ионов натрия к ионам калия в них. Среды для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением позволяют достичь высоких продуктивностей полипептидов при использовании для продукции полипептида, в частности, посредством рекомбинантной экспрессии полипептидов в системах культивирования клеток млекопитающих, в частности, в промышленном масштабе.The present invention provides cell culture media which are suitable for culturing cells with high cell viability, preferably mammalian cells like CHO cells, and which have a molar ratio of sodium ions to potassium ions therein. The cell culture media of the present invention achieve high polypeptide productivity when used for polypeptide production, in particular through recombinant expression of polypeptides in mammalian cell culture systems, in particular on an industrial scale.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of the invention
Приготовление полипептидов с использованием рекомбинантной технологии превратилось в стандартную процедуру за последние два десятилетия. Обращение к рекомбинантным полипептидам посредством клонирования генов, кодирующих соответствующий полипептид, с последующей трансформацией подходящих для экспрессии хозяев геном, который должен быть экспрессирован, и конечной продукцией и очисткой полученного продукта в виде рекомбинантного полипептида обеспечило доступ к целому новому классу биологически создаваемых и продуцируемых терапевтических средств.The preparation of polypeptides using recombinant technology has become a standard procedure over the past two decades. Access to recombinant polypeptides by cloning the genes encoding the corresponding polypeptide, followed by transformation of suitable expression hosts with the gene to be expressed, and the final production and purification of the resulting product as a recombinant polypeptide, has provided access to a whole new class of biologically created and produced therapeutic agents.
Фармацевтически активные соединения готовились все в большем количестве в фармацевтической промышленности, используя технологию рекомбинантных ДНК, а затем процессы продуцирования, разработанные в области биотехнологии.Pharmaceutically active compounds have been prepared in increasing quantities in the pharmaceutical industry using recombinant DNA technology and then production processes developed in the field of biotechnology.
Такие биологические продукты включают моноклональные антитела, которые превратились в важные варианты лечения в различных областях медицины, включающих аутоиммунные заболевания, воспалительные нарушения, иммуносупрессию, онкологию или т.п.Such biological products include monoclonal antibodies, which have emerged as important treatment options in various fields of medicine, including autoimmune diseases, inflammatory disorders, immunosuppression, oncology, or the like.
Для разработки таких терапевтических средств биологического происхождения необходима продукция в промышленном масштабе, обеспечивающая таким образом доступ к большим количествам рекомбинантного пептида. Предпочтительными системами для экспрессии являются культуры клеток млекопитающих, которые лучше большинства эукариотических систем на основе клеток насекомых, дрожжей или т.п., или даже традиционных прокариотических экспрессионных систем.The development of such biologically derived therapeutics requires production on an industrial scale, thus providing access to large quantities of the recombinant peptide. Preferred systems for expression are mammalian cell cultures, which are superior to most eukaryotic systems based on insect cells, yeast or the like, or even conventional prokaryotic expression systems.
Однако культивирование клеток млекопитающих, особенно в промышленном масштабе, присоединяет огромные проблемы. Для производственного оборудования для культивирования клеток млекопитающих требуется тщательная оптимизация многих условий процесса.However, the cultivation of mammalian cells, especially on an industrial scale, poses enormous challenges. Mammalian cell culture production equipment requires careful optimization of many process conditions.
Одним из самых важных параметров процесса для контролирования всего процесса продуцирования является среда, в которой выращивают клетки и происходит продукция полипептидов. Подходящие среды для культивирования клеток должны обеспечить культуры клеток всеми необходимыми питательными веществами, что является особенно трудным, если в среды не добавлены компоненты животного происхождения, подобные сыворотке или белкам, например, факторы роста. One of the most important process parameters for controlling the entire production process is the environment in which cells are grown and polypeptides are produced. Suitable cell culture media should provide the cell cultures with all the necessary nutrients, which is especially difficult if the media do not contain animal-derived components like serum or proteins, such as growth factors.
В результате было разработано огромное множество различных сред для культивирования клеток. В некоторых случаях сосредоточились на общем составе, и были предложены среды с огромным множеством различных веществ (патент США № 5122469, EP 0481791, EP 0283942). В других случаях были предложены конкретные ингредиенты для улучшения культивирования клеток. Основными целями были улучшение или роста, или выживания клеток, или количества и качества рекомбинантно экспрессируемых полипептидов.As a result, a wide variety of cell culture media have been developed. In some cases, the focus has been on the overall composition, and media have been proposed with a huge variety of different substances (US patent No. 5122469, EP 0481791, EP 0283942). In other cases, specific ingredients have been proposed to improve cell culture. The main goals were to improve either growth or cell survival or the quantity and quality of recombinantly expressed polypeptides.
Характерными аспектами, рассматриваемыми в документах известного уровня техники, являются, среди прочего, вклад конкретных ионов, содержащихся в следовых количествах (например, WO 02/066603, EP 0872487, EP 1360314 A2), витаминов, таких как аскорбиновая кислота (например, патент США № 6838284), углеводов (EP 1543106) или содержания определенных аминокислот в сочетании с дополнительными особенностями (например, EP 0501435, патент США № 5830761, патент США № 7294484).Characteristic aspects discussed in documents of the prior art are, among others, the contribution of specific ions contained in trace amounts (for example, WO 02/066603, EP 0872487, EP 1360314 A2), vitamins, such as ascorbic acid (for example, US patent No. 6838284), carbohydrates (EP 1543106) or the content of certain amino acids in combination with additional features (for example, EP 0501435, US patent No. 5830761, US patent No. 7294484).
Основные ионы и их концентрации в средах для культивирования клеток в основном сохраняют постоянными и остаются не рассматриваемыми и неизменными. Во всех классических типах сред, таких как, например, DMEM, DMEM/F12, BME или RPMI 1640, используются относительно узкие и постоянные диапазоны концентраций основных ионов, в общем, и одновалентных катионов Na+ и K+, в частности. Это находится в соответствии с тем фактом, что ионный баланс основных ионов, в общем, и одновалентных катионов Na+ и K+, в частности, является довольно универсальным свойством почти всех клеток млекопитающих.The main ions and their concentrations in the cell culture media are generally kept constant and remain unconsidered and unchanged. In all classical media types, such as for example DMEM, DMEM/F12, BME or RPMI 1640, relatively narrow and constant concentration ranges of the main ions in general and of the monovalent cations Na + and K + in particular are used. This is in line with the fact that the ionic balance of base ions in general and monovalent cations Na + and K + in particular is a fairly universal property of almost all mammalian cells.
Более подробно, основным свойством клеток млекопитающих является трансмембранный градиент ионов натрия и калия с высокой концентрацией ионов калия внутри клетки и высокой концентрацией ионов натрия вне клетки. Натрий-калиевый насос является одним из основных ионных насосов клеточной мембраны, который является электрогенным и вносит вклад в установление и сохранение соответствующего трансмембранного градиента ионов натрия и калия (Kaplan, Membrane cation transport and the control of proliferation of mammalian cells. Annu Rev Physiol.; 40: 19-41 (1978)). Насос использует приблизительно 30% энергии клеток и является одним из основных процессов потребления энергии клеток. С электрохимическим градиентом ионов натрия сопряжены многие основные биохимические процессы, такие как, например, Na+/Ca+ обмен или перенос аминокислот в клетки. Поэтому концентрации ионов натрия и калия вне клетки являются параметрами первостепенной важности, которые влияют на трансмембранный градиент этих ионов и базисное состояние клетки.In more detail, the main property of mammalian cells is a transmembrane gradient of sodium and potassium ions with a high concentration of potassium ions inside the cell and a high concentration of sodium ions outside the cell. The sodium-potassium pump is one of the main ion pumps of the cell membrane, which is electrogenic and contributes to the establishment and maintenance of an appropriate transmembrane gradient of sodium and potassium ions (Kaplan, Membrane cation transport and the control of proliferation of mammalian cells. Annu Rev Physiol.; 40:19-41 (1978)). The pump uses approximately 30% of the energy of the cells and is one of the main energy consumption processes of the cells. Many basic biochemical processes are associated with the electrochemical gradient of sodium ions, such as, for example, Na + /Ca + exchange or transfer of amino acids into cells. Therefore, the concentrations of sodium and potassium ions outside the cell are paramount parameters that affect the transmembrane gradient of these ions and the basic state of the cell.
В соответствии с типичной концентрацией ионов натрия внутри и вне характерной клетки млекопитающего (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (1994)) обычно выбирают концентрации натрия, составляющие приблизительно 145 мМ, вместе с концентрациями ионов калия, составляющими приблизительно 5 мМ. Для большинства типов сред это приводит к отношению ионов натрия к ионам калия, которое находится в диапазоне приблизительно 20-30 (см. таблицу 1 ниже и, например, патент США № 5135866).In accordance with typical sodium ion concentrations inside and outside a typical mammalian cell (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (1994)) sodium concentrations of approximately 145 mM are typically selected along with potassium ion concentrations of approximately 5 mM. For most media types, this results in a ratio of sodium ions to potassium ions that is in the range of about 20-30 (see Table 1 below and, for example, US Pat. No. 5,135,866).
Лишь в немногих документах известного уровня техники описываются среды для культивирования клеток, подходящие для культивирования клеток млекопитающих или продукции рекомбинантных белков, с упоминанием конкретных отношений ионов натрия к ионам калия. В этих документах предлагаются составы сред с удельно высокими отношениями в высокой области - приблизительно 30,7 в патенте США с № 5232848 или в диапазоне от приблизительно 25 до 35, достигая таким образом даже более высоких значений (EP 0283942, EP 0389786). В случае других сред, таких как HAM F12 или среды для культивирования клеток животных с определенным составом, предложенные в заявке на патент США № 2008/0261259, также рекомендуются, в частности, более высокие значения (например, от 27,9 до 57,5 в заявке на патент США № 2008/0261259). Лишь в очень незначительном числе документов описываются среды с отношением ионов натрия к ионам калия, составляющим меньше 20, например, 11,5-30 (патент США № 7294484), или отношением, составляющим приблизительно 15 (патент США № 6180401). В этих документах, тем не менее, используются отношения, превышающие 10, а также не приписано особое преимущество изменению этого параметра на значения, упоминаемые здесь.Few prior art documents describe cell culture media suitable for culturing mammalian cells or producing recombinant proteins, mentioning specific ratios of sodium ions to potassium ions. These documents suggest media compositions with high specific ratios in the high region of about 30.7 in US Pat. No. 5,232,848, or in the range of about 25 to 35, thus reaching even higher values (EP 0283942, EP 0389786). In the case of other media such as HAM F12 or specially formulated animal cell culture media as proposed in US Patent Application No. 2008/0261259, particularly higher values are also recommended (e.g. in US Patent Application No. 2008/0261259). Very few documents describe media with a ratio of sodium ions to potassium ions of less than 20, such as 11.5-30 (US Pat. No. 7,294,484) or a ratio of about 15 (US Pat. No. 6,180,401). In these documents, however, ratios greater than 10 are used, and no particular advantage is attributed to changing this parameter to the values mentioned here.
Помимо эффектов, связанных с ионным балансом между конкретными ионами, также должен учитываться вклад основных ионов в общую осмотическую концентрацию среды. Большинство общепринятых сред, таких как, например, DMEM, MEM альфа или среда Фишера, характеризуется большим количеством хлорида натрия.In addition to the effects associated with the ion balance between specific ions, the contribution of the main ions to the total osmotic concentration of the medium must also be taken into account. Most conventional media, such as DMEM, MEM alpha or Fischer's medium, for example, are characterized by a large amount of sodium chloride.
В WO 02/101019 рассматривается высокое содержание глюкозы в среде в сочетании с использованием высокой осмотической концентрации. Высокая концентрация глюкозы, составляющая приблизительно 2-40 г/л, была достигнута посредством уменьшения или даже полного исключения таких реагентов, как хлорид натрия, с сохранением таким образом осмотической концентрации на установленном уровне.WO 02/101019 discusses a high glucose content in the medium in combination with the use of a high osmotic concentration. A high glucose concentration of approximately 2-40 g/l has been achieved by reducing or even completely eliminating reagents such as sodium chloride, thus maintaining the osmotic concentration at the set level.
Принимая во внимание вышеуказанные проблемы и существующие недостатки, продолжает существовать потребность в области промышленной биотехнологии в улучшенных средах для культивирования клеток, которые позволяют продуцировать рекомбинантные полипептиды в промышленном масштабе.In view of the above problems and existing shortcomings, there continues to be a need in the field of industrial biotechnology for improved media for culturing cells that allow the production of recombinant polypeptides on an industrial scale.
Краткое изложение сущности настоящего изобретенияBrief summary of the present invention
Настоящим изобретением обеспечиваются среды для культивирования клеток с уменьшенным отношением Na+/K+, т.е. отношением Na+/K+, меньшим значения, равного приблизительно 10. Этого достигают посредством уменьшения количества суммарных ионов натрия и увеличения общего содержания ионов калия. Было установлено, что при таком низком отношении проявляется несколько положительных эффектов, в частности, увеличенная жизнеспособность, рост и продуктивность клеток млекопитающих.The present invention provides cell culture media with a reduced Na + /K + ratio, ie. a Na + /K + ratio less than about 10. This is achieved by reducing the amount of total sodium ions and increasing the total content of potassium ions. This low ratio has been found to exhibit several positive effects, in particular increased viability, growth and productivity of mammalian cells.
Таким образом, настоящим изобретением обеспечивается среда для культивирования клеток, оптимизированная для выращивания клеток млекопитающих, а также для продуцирования полипептидов, которая характеризуется отношением ионов натрия к ионам калия, которые измеряют как молярное содержание, составляющим от приблизительно 10 к 1 до приблизительно 1 к 1, альтернативно от приблизительно 8 к 1 до приблизительно 6 к 1. Воплощение этого признака может включать концентрации ионов натрия в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 90 мМ, а ионов калия в диапазоне от приблизительно 8 до приблизительно 12 мМ.Thus, the present invention provides a cell culture medium optimized for the growth of mammalian cells as well as for the production of polypeptides, which is characterized by a ratio of sodium ions to potassium ions, measured as a molar content, of from about 10 to 1 to about 1 to 1, alternatively, about 8 to 1 to about 6 to 1. An embodiment of this feature may include concentrations of sodium ions in the range of about 50 to about 90 mM and potassium ions in the range of about 8 to about 12 mM.
В другом аспекте оптимизация среды для культивирования включает выбор общего содержания аминокислот, находящегося между приблизительно 40 мМ и приблизительно 100 мМ, альтернативно между приблизительно 50 мМ и приблизительно 100 мМ. Этот признак может сочетаться с очень низким молярным отношением общей концентрации ионов к общей концентрации аминокислот, составляющим от приблизительно 1,9 до приблизительно 4. In another aspect, optimizing the culture medium includes selecting a total amino acid content between about 40 mM and about 100 mM, alternatively between about 50 mM and about 100 mM. This feature can be combined with a very low total ion to total amino acid molar ratio of about 1.9 to about 4.
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ, в котором среду для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением используют для культивирования клеток млекопитающих для продуцирования желаемого рекомбинантного полипептида. Способ включает культивирование клеток млекопитающих в среде в соответствии с настоящим изобретением и экспрессию рекомбинантного полипептида.In a further aspect, the present invention provides a method in which the cell culture medium of the present invention is used for culturing mammalian cells to produce the desired recombinant polypeptide. The method includes culturing mammalian cells in a medium according to the present invention and expressing the recombinant polypeptide.
Некоторые воплощения этого способа включают условия культивирования, при которых температуру и/или pH среды меняют по крайней один раз во время культивирования. В качестве дополнительного варианта осуществляют подпитку с использованием периодического процесса подпитки. Some embodiments of this method include culture conditions under which the temperature and/or pH of the medium is changed at least once during culture. As an additional option, make-up is carried out using a periodic make-up process.
Желаемые, являющиеся полипептидами продукты включают гликозилированные полипептиды и, в частности, антитела и фрагменты антител.Desired polypeptide products include glycosylated polypeptides and in particular antibodies and antibody fragments.
Клетки млекопитающих, используемые в способе настоящего изобретения, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток CHO, клеток HEK и клеток SP2/0.The mammalian cells used in the method of the present invention are preferably selected from the group consisting of CHO cells, HEK cells and SP2/0 cells.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения среды для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, в котором различные компоненты смешивают друг с другом. В частности, концентрация хлорида натрия, добавляемого в состав среды, может находиться в диапазоне от приблизительно 7 до приблизительно 15 мМ. Концентрация хлорида калия, добавляемого в состав среды, может находиться в диапазоне от приблизительно 8 до приблизительно 12 мМ.In a further aspect, the present invention relates to a method for preparing a cell culture medium according to the present invention, in which the various components are mixed with each other. In particular, the concentration of sodium chloride added to the medium may range from about 7 to about 15 mM. The concentration of potassium chloride added to the medium may range from about 8 to about 12 mM.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Настоящее изобретение будет лучше понято, исходя из следующих примеров и фигур. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.The present invention will be better understood from the following examples and figures. However, these examples are not intended to limit the scope of the present invention.
На фиг.1 показана плотность жизнеспособных клеток mAb1-продуцирующего клона клеток CHO в зависимости от времени культивирования в культурах во встряхиваемых колбах (см. пример 1), используя среды с уменьшенным отношением Na+/K+, как описано в настоящем изобретении. Кроме того, отображен эффект постоянной температуры в сравнении с изменением температуры.Figure 1 shows the viable cell density of a mAb1-producing CHO cell clone as a function of culture time in shake flask cultures (see Example 1) using reduced Na + /K + ratio media as described in the present invention. In addition, the effect of a constant temperature versus a change in temperature is displayed.
На фиг.2 показаны жизнеспособность mAb1-продуцирующего клона клеток CHO (см. пример 1) при использовании среды с уменьшенным отношением Na+/K+ и эффект постоянной температуры в сравнении с изменением температуры в день 3.Figure 2 shows the viability of a mAb1-producing clone of CHO cells (see example 1) using reduced Na + /K + ratio medium and the effect of constant temperature compared to temperature change on
На фиг.3 показан титр продукта в зависимости от времени культивирования для культур во встряхиваемых колбах mAb1-продуцирующего клона клеток CHO с изменением температуры и без такого изменения (см. пример 1). Клетки культивировали в среде с уменьшенным отношением Na+/K+ в соответствии с настоящим изобретением. Figure 3 shows the product titer versus culture time for shake flask cultures of a mAb1-producing CHO cell clone with and without temperature change (see example 1). The cells were cultured in a reduced Na + /K + ratio medium according to the present invention.
На фиг.4 показана концентрация лактата во время культивирования в mAb2-продуцирующем клоне (см. пример 2). Клетки культивировали в среде с уменьшенным отношением Na+/K+ в соответствии с настоящим изобретением. Figure 4 shows the concentration of lactate during cultivation in mAb2-producing clone (see example 2). The cells were cultured in a reduced Na + /K + ratio medium according to the present invention.
На фиг.5 показана плотность жизнеспособных клеток в зависимости от времени культивирования в биореакторе на 300 л с клоном клеток CHO. Условия культивирования включали стадию изменения температуры (в день 5) и два изменения pH вследствие регуляции pH в зависимости от заданного значения и мертвой зоны (см. также пример 2). Клетки культивировали в среде с уменьшенным отношением Na+/K+ в соответствии с настоящим изобретением. Figure 5 shows viable cell density versus culture time in a 300 L bioreactor with a CHO cell clone. The culture conditions included a temperature change step (on day 5) and two pH changes due to pH regulation depending on the setpoint and dead zone (see also example 2). The cells were cultured in a reduced Na + /K + ratio medium according to the present invention.
На фиг.6 показан титр продукта в зависимости от времени культивирования в биореакторе на 300 л с клоном клеток CHO. В способе сочетаются изменение температуры с двумя изменениями pH (см. также фиг.5 и пример 2). Клетки культивировали в среде с уменьшенным отношением Na+/K+ в соответствии с настоящим изобретением. Figure 6 shows the product titer versus culture time in a 300 L bioreactor with a CHO cell clone. The method combines a temperature change with two pH changes (see also FIG. 5 and Example 2). The cells were cultured in a reduced Na + /K + ratio medium according to the present invention.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Среды для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением используют для выращивания клеток млекопитающих, предпочтительно клеток CHO, клеток HEK и клеток SP2/0, и для продуцирования рекомбинантных полипептидов, используя такие клетки. Клетки CHO являются особенно предпочтительными. Термин «среда для культивирования клеток» относится к водному раствору питательных веществ, который может использоваться для выращивания клеток в течение длительного периода времени. Как правило, среды для культивирования клеток включают следующие компоненты: источник энергии, которым будет обычно углеводное соединение, предпочтительно глюкоза, аминокислоты, предпочтительно базисное множество аминокислот, включающее все незаменимые аминокислоты, витамины и/или другие органические соединения, которые требуются в низких концентрациях, свободные жирные кислоты и неорганические соединения, включающие микроэлементы, неорганические соли, буферные соединения и нуклеозиды и основания.The cell culture media of the present invention are used to grow mammalian cells, preferably CHO cells, HEK cells and SP2/0 cells, and to produce recombinant polypeptides using such cells. CHO cells are particularly preferred. The term "cell culture medium" refers to an aqueous solution of nutrients that can be used to grow cells for a long period of time. In general, cell culture media comprise the following components: an energy source, which will usually be a carbohydrate compound, preferably glucose, amino acids, preferably a basic set of amino acids, including all essential amino acids, vitamins and/or other organic compounds that are required at low concentrations, free fatty acids and inorganic compounds including trace elements, inorganic salts, buffer compounds and nucleosides and bases.
Среда для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в различных способах культивирования клеток. Культивирование клеток может осуществляться в адгезионной культуре, например, в монослойной культуре, или предпочтительно в суспензионной культуре.The cell culture medium according to the present invention can be used in various cell culture methods. Cell culture can be carried out in an adherent culture, for example in a monolayer culture, or preferably in a suspension culture.
Использование сред для культивирования клеток в области фармацевтической промышленности, например, для продуцирования терапевтически активных рекомбинантных полипептидов, не дает, как правило, возможность использовать какой-либо материал биологического происхождения вследствие проблем, связанных с безопасностью и загрязнением. Поэтому средой для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением является предпочтительно среда, не содержащая сыворотку и/или белки. Термин «среда, не содержащая сыворотку и/или белки» означает среду с полностью определенным химическим составом, не содержащую добавок из являющего животным источника, вроде гидролизатов тканей, например, фетальной бычьей сыворотки или т.п. Кроме того, в культуру клеток в соответствии с настоящим изобретением также предпочтительно не добавляют белки, особенно факторы роста, вроде инсулина, трансферрина или т.п. Предпочтительно среду для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением также не дополняют источником гидролизованного белка, вроде соевого, пшеничного или рисового пептона или дрожжевого гидролизата или т.п.The use of cell culture media in the pharmaceutical industry, for example for the production of therapeutically active recombinant polypeptides, generally does not allow the use of any material of biological origin due to safety and contamination concerns. Therefore, the cell culture medium according to the present invention is preferably a serum-free and/or protein-free medium. The term "serum and/or protein free medium" means a fully chemically defined medium that does not contain additives from an animal source such as tissue hydrolysates, eg fetal bovine serum or the like. In addition, proteins, especially growth factors such as insulin, transferrin or the like, are also preferably not added to the cell culture according to the present invention. Preferably, the cell culture medium according to the present invention is also not supplemented with a hydrolyzed protein source such as soybean, wheat or rice peptone or yeast hydrolysate or the like.
Осмотическую концентрацию и pH сред доводят до значений, которые делают возможным рост клеток, например, при значениях, находящихся между приблизительно pH 6,8 и приблизительно pH 7,2. Осмотическая концентрация сред в начале культивирования, как правило, находиться между приблизительно 280 и приблизительно 365 миллиосмоль, но она может постепенно увеличиваться во время культивирования и добавления подаваемых растворов до значений, составляющих менее чем или приблизительно 600 миллиосмоль/кг. Предпочтительно, когда среды в соответствии с настоящим изобретением имеют исходную осмотическую концентрацию, находящуюся между приблизительно 285 и приблизительно 365 миллиосмоль/кг.The osmotic concentration and the pH of the media are adjusted to values that allow cell growth, for example between about pH 6.8 and about pH 7.2. The osmotic concentration of the media at the beginning of the culture is typically between about 280 and about 365 milliosmoles, but it can gradually increase during culture and addition of feed solutions to values of less than or about 600 milliosmoles/kg. Preferably, media according to the present invention have an initial osmotic concentration between about 285 and about 365 milliosmoles/kg.
Температуру культуры клеток выбирают в диапазоне, в котором клетки являются жизнеспособными и растут. Типичная температура для культивирования клеток находится в диапазоне от приблизительно 30ºС до приблизительно 38ºС. Например, клетки в начале выращивают при температурах, составляющих от приблизительно 36 до приблизительно 37ºС, которые являются оптимальными для клеток CHO. Однако точное значение температуры можно подогнать к потребностям клеток, а также изменять во время культивирования для допуска оптимальной жизнеспособности, роста или продукции. The temperature of the cell culture is chosen in the range in which the cells are viable and grow. A typical cell culture temperature ranges from about 30°C to about 38°C. For example, cells are initially grown at temperatures ranging from about 36 to about 37° C., which are optimal for CHO cells. However, the exact temperature can be adjusted to suit the needs of the cells, as well as changed during culture to allow optimal viability, growth or production.
Первый аспект настоящего изобретения связан с ионным балансом между ионами натрия и калия в культуре клеток. В настоящем изобретении описывается молярное отношение ионов натрия к ионам калия, которое находится между приблизительно 10 к 1 и приблизительно 1 к 1. В дальнейших воплощениях настоящего изобретения отношение выбирают между приблизительно 9 к 1 и приблизительно 5 к 1. Альтернативно, отношение находится между приблизительно 8 к 1 и приблизительно 6 к 1.The first aspect of the present invention relates to the ion balance between sodium and potassium ions in cell culture. The present invention describes a molar ratio of sodium ions to potassium ions that is between about 10 to 1 and about 1 to 1. In further embodiments of the present invention, the ratio is chosen between about 9 to 1 and about 5 to 1. Alternatively, the ratio is between about 8 to 1 and approximately 6 to 1.
Концентрацию ионов натрия и калия и соответствующее отношение определяют здесь через их молярное содержание. Концентрацию ионов натрия и калия определяют посредством расчета общего количества этих ионов в среде для роста, после добавления и растворения соответствующих солей в растворе среды.The concentration of sodium and potassium ions and the corresponding ratio are defined here in terms of their molar content. The concentration of sodium and potassium ions is determined by calculating the total amount of these ions in the growth medium, after adding and dissolving the corresponding salts in the medium solution.
Для достижения необходимой концентрации натрия обычно в среду добавляют различные соли. Обычно используемыми натриевыми солями являются, например, NaCl, соли одно- или двухосновного фосфата натрия, карбонат натрия, цитрат натрия, ионы в следовых количествах, такие как, например, селенит натрия, но без ограничения этими примерами. Также основание гидроксид натрия (NaOH), которое добавляют в среды для доведения pH, вносит вклад в общее содержание ионов натрия. Термин «ион» в связи с этим относится к диссоциированному состоянию. Расчет молярного содержания ионов, таким образом, означает учет валентности ионов. 1 мМ хлорид натрия (NaCl), добавленный в среду, будет, следовательно, давать концентрацию ионов натрия, равную 1 мМ, в то время как 1 мМ двухосновный фосфат натрия (Na2HPO4) будет соответственно давать концентрацию ионов натрия, равную 2 мМ. В соответствии с настоящим изобретением концентрация ионов натрия, используемая в средах, находится между приблизительно 50 и 90 мМ. Альтернативно, выбирают концентрацию ионов натрия, которая составляет от приблизительно 65 до приблизительно 85 мМ.To achieve the required sodium concentration, various salts are usually added to the medium. Commonly used sodium salts are, for example, NaCl, mono- or dibasic sodium phosphate salts, sodium carbonate, sodium citrate, trace ions such as, for example, sodium selenite, but not limited to these examples. Also, the base sodium hydroxide (NaOH), which is added to pH-adjusting media, contributes to the total sodium ion content. The term "ion" in this connection refers to the dissociated state. Calculating the molar content of ions thus means taking into account the valency of the ions. 1 mM sodium chloride (NaCl) added to the medium will therefore give a sodium ion concentration of 1 mM, while 1 mM dibasic sodium phosphate (Na 2 HPO 4 ) will correspondingly give a sodium ion concentration of 2 mM . In accordance with the present invention, the concentration of sodium ions used in the media is between approximately 50 and 90 mm. Alternatively, a sodium ion concentration is chosen that is from about 65 to about 85 mM.
Калиевой солью, которую используют для сред, является, как правило, KCl, но она также включает, например, K2SO4 или первичный кислый фосфат калия (KH2PO4). Калиевая соль не ограничивается этими конкретными примерами. Альтернативно, концентрация ионов калия, используемая в средах, находится между приблизительно 8 и приблизительно 12 мМ, или составляет приблизительно 10,7 мМ. The potassium salt that is used for media is generally KCl, but it also includes, for example, K 2 SO 4 or potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ). The potassium salt is not limited to these specific examples. Alternatively, the potassium ion concentration used in the media is between about 8 and about 12 mM, or about 10.7 mM.
В таблице 1 представлены примеры сред, которые традиционно используются для выращивания клеток млекопитающих. Эти классические среды, такие как DMEM, DMEM/F12, BGJ и другие, характеризуются очень высоким отношением ионов Na/K. Среды в соответствии с настоящим изобретением характеризуются очень низким отношением Na/K, составляющим менее чем приблизительно 10 к 1 (см. таблицу 2). Среды в соответствии с настоящим изобретением подходят для культивирования CHO и других клеток млекопитающих и демонстрируют увеличенный рост клеток и/или делают возможной улучшенную продукцию полипептидов. Два примера таких сред представлены в таблице 3, в которой отражен состав двух сред в качестве примеров, и каким образом можно достичь низкого отношения Na/K. Синергетические эффекты между низким отношением ионов натрия к ионам калия и другими особенностями сред оказывают как раз дополнительный положительный эффект на рост клеток и продукцию рекомбинантных полипептидов.Table 1 provides examples of media that are traditionally used to grow mammalian cells. These classical media such as DMEM, DMEM/F12, BGJ and others are characterized by a very high ratio of Na/K ions. Environments in accordance with the present invention are characterized by a very low Na/K ratio of less than about 10 to 1 (see table 2). The media of the present invention are suitable for culturing CHO and other mammalian cells and exhibit increased cell growth and/or allow for improved production of polypeptides. Two examples of such media are presented in Table 3, which shows the composition of the two media as examples, and how a low Na/K ratio can be achieved. The synergistic effects between the low ratio of sodium ions to potassium ions and other features of the media have just an additional positive effect on cell growth and production of recombinant polypeptides.
Помимо специфической концентрации ионов натрия и калия и их специфического отношения, среды настоящего изобретения также характеризуются очень низкой концентрацией хлорида натрия (NaCl), который добавляют в смесь компонентов сред. Предпочтительно, когда используют концентрации, составляющие от приблизительно 7 до приблизительно 15 мМ. Такое низкое количество хлорида натрия является необычным. В некоторых воплощениях настоящего изобретения концентрация хлорида натрия (в мМ) даже ниже концентрации (в мМ) соответствующей калиевой соли, которую добавляют. Кроме того, в средах в соответствии с настоящим изобретением часто выявляется низкое общее содержание хлорид-иона. Как показано при помощи примеров таблицы 2, это приводит к исходным концентрациям хлорида, находящимся между приблизительно 36 и 46 мМ. Обычно неорганические соли, такие как NaCl или CaCl2, вносят вклад в это значение, но также компоненты сред, такие как хлорид холина, или аминокислоты, такие как, например, гидрохлорид L-гистидина или гидрохлорид L-лизина, могут прибавлять к общей концентрации.In addition to the specific concentration of sodium and potassium ions and their specific ratio, the media of the present invention are also characterized by a very low concentration of sodium chloride (NaCl), which is added to the mixture of media components. Preferably, concentrations of about 7 to about 15 mM are used. Such a low amount of sodium chloride is unusual. In some embodiments of the present invention, the concentration of sodium chloride (in mm) is even lower than the concentration (in mm) of the corresponding potassium salt that is added. In addition, the media according to the present invention often exhibit low total chloride ion content. As shown by the examples in Table 2, this results in initial chloride concentrations between approximately 36 and 46 mM. Usually inorganic salts such as NaCl or CaCl 2 contribute to this value, but also media components such as choline chloride or amino acids such as, for example, L-histidine hydrochloride or L-lysine hydrochloride can add to the total concentration. .
Дальнейшим преимуществом составов сред в соответствии с настоящим изобретением является сочетание низкого молярного отношения Na/K с исходной концентрацией аминокислот, находящейся в диапазоне от приблизительно 40 мМ, альтернативно приблизительно 50 мМ, до приблизительно 100 мМ. В классических средах используются относительно низкие концентрации аминокислот и/или высокие отношения Na/K. Сочетание обоих признаков может дать дополнительные эффекты, которые являются положительными для роста клеток и продукции полипептидов.A further advantage of the media formulations of the present invention is the combination of a low Na/K molar ratio with an initial amino acid concentration ranging from about 40 mM, alternatively about 50 mM, to about 100 mM. Classic media use relatively low amino acid concentrations and/or high Na/K ratios. The combination of both traits can provide additional effects that are positive for cell growth and polypeptide production.
В таблице 2 представлены различные воплощения этих параметров в соответствии с настоящим изобретением. Помимо общего содержания аминокислот в подходящих средах в соответствии с настоящим изобретением, оптимизированных для выращивания клеток, они предпочтительно содержат исходные концентрации аминокислот в соответствии со следующими диапазонами в них.Table 2 presents various embodiments of these parameters in accordance with the present invention. In addition to the total amino acid content of suitable media according to the present invention optimized for cell growth, they preferably contain initial amino acid concentrations according to the following ranges therein.
Среды настоящего изобретения, дополнительно определенные аминокислотами, как описано в вышеприведенной таблице, могут с выгодой использоваться в улучшенных способах культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением. The media of the present invention, further defined by the amino acids as described in the above table, can be used to advantage in the improved cell culture methods of the present invention.
В особенно предпочтительном варианте осуществления среды в соответствии с настоящим изобретением оптимизированы в отношении продукции и предпочтительно содержат исходные концентрации аминокислот в соответствии со следующими диапазонами.In a particularly preferred embodiment, the media in accordance with the present invention are optimized for production and preferably contain initial amino acid concentrations in accordance with the following ranges.
Среды для продукции, содержащие аминокислоты, как описано в вышеприведенной таблице, могут с выгодой использоваться в улучшенных способах культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением. Production media containing amino acids as described in the above table can be used to advantage in the improved cell culture methods of the present invention.
В дальнейшем аспекте настоящего изобретения, помимо специфического отношения ионов натрия к ионам калия, важным также является общий баланс между общими концентрациями ионов (вносящих вклад в общую ионную силу среды) и аминокислот в среде. На соотношение между общей концентрацией ионов и концентрацией аминокислот в питательной среде для роста влияют, главным образом, основные неорганические соли, такие как, например, хлорид натрия, хлорид калия, двууглекислый натрий и другие, которые являются основными ингредиентами большинства типов сред для культивирования клеток животных. Также соли ионов в следовых количествах, аминокислоты или витамины (например, сернокислая медь, L-аргинина гидрохлорид, L-гистидина гидрохлорид, хлорид холина, пантотенат D-кальция и другие) вносят вклад в это значение. Для клеток может быть полезным также регулирование концентраций этих ионов. Поэтому общая концентрация ионов здесь определяется как сумма всех основных органических и неорганических солей, добавляемых в среду, которые являются ионизируемыми в водном растворе среды, плюс основание NaOH и кислота HCl. Элементы в следовых количествах не включаются. Таким образом, 1 мМ каждого из NaCl, NaOH или органических солей, таких как лизина-HCl или хлорид холина, даст концентрацию ионов, составляющую 2 мМ. 1 мМ MgCl2 добавит, соответственно, 3 мМ ионов, в то время как 1 мМ органической соли тринатрия цитрата добавит 4 мМ.In a further aspect of the present invention, in addition to the specific ratio of sodium ions to potassium ions, the overall balance between the total concentrations of ions (contributing to the total ionic strength of the medium) and amino acids in the medium is also important. The ratio between the total ion concentration and the amino acid concentration in the growth medium is mainly influenced by basic inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, sodium bicarbonate and others, which are the main ingredients of most types of animal cell culture media. . Also ion salts in trace amounts, amino acids or vitamins (eg copper sulphate, L-arginine hydrochloride, L-histidine hydrochloride, choline chloride, D-calcium pantothenate, and others) contribute to this value. Cells may also benefit from regulating the concentrations of these ions. Therefore, the total ion concentration is here defined as the sum of all the basic organic and inorganic salts added to the medium that are ionizable in an aqueous solution of the medium, plus NaOH base and HCl acid. Elements in trace amounts are not included. Thus, 1 mM each of NaCl, NaOH, or organic salts such as lysine-HCl or choline chloride will give an ion concentration of 2 mM. 1 mM MgCl 2 will add 3 mM ions, respectively, while 1 mM trisodium citrate organic salt will add 4 mM.
В соответствии с настоящим изобретением молярное соотношение между ионами и аминокислотами выбирают так, чтобы оно находилось между приблизительно 1,9 и 4. В некоторых воплощениях выбирают соотношение, находящемся в диапазоне от приблизительно 2,0 до 3,9. Эти очень низкие соотношения не только достигаются за счет относительно высокого содержания аминокислот, но также за счет относительно низкого молярного содержания ионов в среде. Содержание ионов в среде, как правило, составляет менее 250 мМ. Например, выбирают значения, находящиеся между приблизительно 150 и 220 мМ или альтернативно между приблизительно 170 и 200 мМ.In accordance with the present invention, the molar ratio between ions and amino acids is chosen to be between about 1.9 and 4. In some embodiments, the ratio is chosen to be in the range from about 2.0 to 3.9. These very low ratios are not only achieved due to the relatively high content of amino acids, but also due to the relatively low molar content of ions in the medium. The content of ions in the medium, as a rule, is less than 250 mm. For example, values between about 150 and 220 mM are chosen, or alternatively between about 170 and 200 mM.
Таким образом, описанные конкретные особенности сред оказывают значительные эффекты на клеточный метаболизм и физиологию, хотя в то же самое время они также оказывают влияние на общие параметры, такие как осмотическая концентрация, или, например, доступность питательных веществ. Баланс различных особенностей сред приводит, таким образом, к уникальным свойствам, которые приводят к неожиданным синергетическим эффектам по отношению к клеткам.Thus, the specific media features described have significant effects on cellular metabolism and physiology, although at the same time they also affect general parameters such as osmotic concentration, or, for example, nutrient availability. The balance of different features of the media thus leads to unique properties that lead to unexpected synergistic effects with respect to cells.
Среды с низким отношением Na/K, как правило, подходят для выращивания различных клеток млекопитающих и производства рекомбинантных полипептидов/белков при продукции в большом масштабе. Как здесь используются, полипептиды и белки относятся к рекомбинантным полипептидам, которые экспрессируются соответствующей клеткой млекопитающего после трансфекции клеткой ДНК-конструкцией или конструкциями, кодирующей представляющий интерес продукт. Любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке-хозяине, можно продуцировать в соответствии с настоящим изобретением. После продукции полипептида(ов) с помощью способа настоящего изобретения он является либо экстраклеточно секретированным, связанным с клетками, либо остается в клетках, в зависимости от конкретного продукта и используемой линии клеток. Являющийся полипептидом продукт можно извлечь из супернатанта культуры сразу же или после лизиса клеток с помощью стандартных процедур. Также осуществляют дальнейшее выделение и очистку с помощью стандартных методов, известных квалифицированному специалисту. Полипептид настоящего изобретения можно также включить в фармацевтическую композицию.Low Na/K environments are generally suitable for growing a variety of mammalian cells and producing recombinant polypeptides/proteins in large scale production. As used herein, polypeptides and proteins refer to recombinant polypeptides that are expressed by an appropriate mammalian cell after the cell has been transfected with a DNA construct or constructs encoding a product of interest. Any polypeptide that can be expressed in a host cell can be produced in accordance with the present invention. After production of the polypeptide(s) by the method of the present invention, it is either extracellularly secreted, bound to the cells, or remains in the cells, depending on the specific product and cell line used. The polypeptide product can be recovered from the culture supernatant immediately or after cell lysis using standard procedures. Further isolation and purification is also carried out using standard methods known to the skilled person. The polypeptide of the present invention can also be included in a pharmaceutical composition.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу продуцирования рекомбинантного полипептида, включающему культивирование клеток млекопитающих в среде в соответствии с настоящим изобретением, причем условия культивирования включают по крайней мере одно изменение температуры и/или по крайней мере одно изменение pH.Another aspect of the present invention relates to a method for producing a recombinant polypeptide, comprising culturing mammalian cells in a medium in accordance with the present invention, and the cultivation conditions include at least one change in temperature and/or at least one change in pH.
Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения полезным может быть изменение температуры в ходе культивирования, и оно включает одно или более изменений температуры, которые инициируют в определенные моменты времени. Изменение/сдвиг температуры не относится к спонтанным флуктуациям температуры, а относится к изменениям температуры, составляющим по крайней мере 1ºС или альтернативно на по крайней мере 2ºС, которые являются умышленными, и при этом вторую температуру сохраняют в течение по крайней мере одного дня. Изменение/сдвиг можно обеспечить посредством изменения заданного значения температуры культуры. Выбор времени зависит от либо состояния наращивания культуры, заранее заданного числа дней после начала культивирования, либо метаболических потребностей клеток. Таким образом, температуру можно изменить в период от приблизительно 1 до 10 дней после начала культивирования. Предпочтительно изменение температуры осуществляют во время фазы роста клетку или к концу этой фазы. В зависимости от объема сосуда для культивирования изменение может происходить быстро или более медленно и длиться несколько часов. В одном примере такое изменение температуры осуществляют во время фазы роста культуры, когда плотность достигает приблизительно 40% - приблизительно 90% от максимальной плотности. В одном примере первая температура находится между приблизительно 33 и приблизительно 38ºС, тогда как в других примерах первая температура находится между приблизительно 36 и приблизительно 38ºС. Вторая температура находится между приблизительно 30 и приблизительно 37ºС, или альтернативно между приблизительно 32 и приблизительно 34ºС.Accordingly, in another aspect of the present invention, a change in temperature during culturing may be useful and includes one or more temperature changes that are triggered at certain points in time. Temperature change/shift does not refer to spontaneous temperature fluctuations, but refers to temperature changes of at least 1°C, or alternatively of at least 2°C, which are intentional and the second temperature is maintained for at least one day. The change/shift can be provided by changing the crop temperature setpoint. The choice of time depends on either the condition of the growth of the culture, the predetermined number of days after the start of the culture, or the metabolic requirements of the cells. Thus, the temperature can be changed from about 1 to 10 days after the start of culture. Preferably, the temperature change is carried out during the growth phase of the cell or towards the end of this phase. Depending on the volume of the culture vessel, the change may be rapid or slower and last for several hours. In one example, such a temperature change is carried out during the growth phase of the culture, when the density reaches about 40% - about 90% of the maximum density. In one example, the first temperature is between about 33 and about 38°C, while in other examples the first temperature is between about 36 and about 38°C. The second temperature is between about 30 and about 37°C, or alternatively between about 32 and about 34°C.
В другом аспекте настоящего изобретения полезным может быть изменение pH в ходе культивирования в результате включения одного или более изменений pH. В дальнейших аспектах настоящего изобретения изменения температуры могут также сочетаться с одним или более изменениями pH. Несмотря на то, что первый pH (например, pH, равный 7,0) выбирают так, что он был подходящим для быстрого наращивания клеток, полезным является изменение pH культуры после достижения определенной плотности клеток. Это изменение или сдвиг pH осуществляют посредством изменения заданного значения pH в биореакторе/сосуде для культивирования или определения заданного значения pH в сочетании с мертвой зоной. Изменение pH не относится к небольшим флуктуациям pH, а скорее оно относится к умышленному изменению. Второе значение pH (например, 6,8) выбирают для уменьшения гибели клеток и допуска высоких клеточно-специфических скоростей продукции полипептидов соответствующего качества. Второй pH может сохраняться до конца культивирования, или могут быть введены дополнительные изменения pH. В одном воплощении полезным может быть изменение pH на по крайней мере 0,2. В одном варианте осуществления выбирают первый pH, который находится в диапазоне от 6,8 до 7,5. В другом варианте осуществления выбирают первый pH, который находится в диапазоне от 6,8 до 7,2. Второе значение pH, которое достигается после изменения pH, может находиться в диапазоне от 6,0 до 7,5, или альтернативно от 6,5 до 6,8.In another aspect of the present invention, it may be useful to change the pH during cultivation by incorporating one or more pH changes. In further aspects of the present invention, temperature changes may also be combined with one or more pH changes. While the first pH (eg, pH 7.0) is chosen to be suitable for rapid cell expansion, it is useful to change the pH of the culture after a certain cell density has been reached. This pH change or shift is accomplished by changing the pH setpoint in the bioreactor/culture vessel or by determining the pH setpoint in combination with a dead zone. pH change does not refer to small fluctuations in pH, but rather it refers to a deliberate change. The second pH value (eg, 6.8) is chosen to reduce cell death and allow for high cell-specific production rates of appropriate quality polypeptides. The second pH may be maintained until the end of the culture, or additional pH changes may be introduced. In one embodiment, a pH change of at least 0.2 may be beneficial. In one embodiment, a first pH is selected that is in the range of 6.8 to 7.5. In another embodiment, a first pH is selected that is in the range of 6.8 to 7.2. The second pH value that is reached after the pH change may be in the range of 6.0 to 7.5, or alternatively 6.5 to 6.8.
Среда для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в различных способах культивирования клеток. Культивирование клеток может осуществляться в адгезионной культуре, например, в монослойной культуре, или предпочтительно в суспензионной культуре.The cell culture medium according to the present invention can be used in various cell culture methods. Cell culture can be carried out in an adherent culture, for example in a monolayer culture, or preferably in a suspension culture.
Культивирование клеток в большом масштабе может использоваться, например, в различных ферментационных способах, широко известных в промышленной биотехнологии. Способы непрерывного или периодического культивирования клеток могут использоваться с использованием сред для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением. Могут также использоваться другие известные технологии с использованием реакторов, например, перфузионные технологии. Способы периодического культивирования являются одним предпочтительным вариантом.Cell culture on a large scale can be used, for example, in various fermentation methods widely known in industrial biotechnology. Continuous or batch cell culture methods can be used using the cell culture media of the present invention. Other known reactor technologies may also be used, such as perfusion technologies. Batch culture methods are one preferred option.
Культура клеток одного производственного цикла включает подпитываемую культуру или простую периодическую культуру. Термин «подпитываемая культура» относится к культуре клеток, в случае которой в начале в сосуд для культивирования подаются клетки млекопитающих и среда для культивирования клеток, и в культуру непрерывно или по отдельности подаются дополнительные культуральные питательные вещества во время процесса культивирования с периодическим сбором клеток и/или продукта или без него до завершения культивирования. Термин «простое периодическое культивирование» относится к процедуре, в которой все компоненты для культивирования клеток, включающие клетки млекопитающих и среду для культивирования клеток, подаются в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования.The cell culture of one production run includes fed-batch culture or simple batch culture. The term "fed culture" refers to a cell culture in which, at the beginning, mammalian cells and cell culture medium are supplied to the culture vessel, and additional culture nutrients are continuously or individually fed to the culture during the culture process with periodic collection of cells and/ or product or without it until completion of cultivation. The term "simple batch culture" refers to a procedure in which all components for cell culture, including mammalian cells and cell culture medium, are fed into the culture vessel at the beginning of the culture process.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения подпитку культур осуществляют в способе периодического культивирования с подпиткой. Такая подпитка для восстановления компонентов и питательных веществ сред, истощенных в средах во время процесса культивирования, полезна клеткам. Обычно подаваемые растворы включают аминокислоты, по крайней мере один углевод в качестве источника энергии, микроэлементы, витамины или специфические ионы. Подаваемые растворы добавляют в зависимости от потребностей клеток, что либо основывается на заранее заданном графике, который был определен для конкретной линии клеток или клона клеток и продукта, либо определяется во время процесса культивирования. Особенно предпочтительным является использование концентрированных подаваемых растворов во избежание большого увеличения объема и разведения сред. В некоторых вариантах осуществления полезным может быть также наличие по крайней мере двух различных подаваемых растворов. Это позволяет независимо вводить дозы двух или более различных групп питательных веществ и компонентов в клетки, а, следовательно, лучше регулировать условия подпитки, касающиеся оптимальной подачи определенных питательных веществ.According to one preferred embodiment of the present invention, the cultures are fed in a fed-batch process. Such feeding to restore media components and nutrients depleted in the media during the culture process is beneficial to the cells. Commonly supplied solutions include amino acids, at least one carbohydrate as an energy source, micronutrients, vitamins, or specific ions. The feed solutions are added depending on the needs of the cells, which is either based on a predetermined schedule that has been determined for a particular cell line or cell clone and product, or determined during the cultivation process. It is particularly preferred to use concentrated feed solutions to avoid large volume expansion and dilution of the media. In some embodiments, it may also be useful to have at least two different feed solutions. This allows the doses of two or more different groups of nutrients and components to be administered independently to the cells, and therefore better control of feeding conditions regarding the optimal supply of certain nutrients.
В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения одним из двух подаваемых растворов, добавляемых в среду для культивирования клеток, является подпитка, включающая дипептид цистин и аминокислоту тирозин. Предпочтительно подпитка содержит дипептид цистин и аминокислоту тирозин в соответствующих концентрациях, находящихся в диапазоне от приблизительно 6,5 г/л до приблизительно 8,0 г/л и в диапазоне от приблизительно 9 г/л до приблизительно 11 г/л, в водном растворе при основном pH, превышающем 10. В конкретном варианте осуществления концентрированная подпитка включает дипептид цистин и аминокислоту тирозин в соответствующих концентрациях, составляющих 10,06 г/л L-тирозина и 7,25 г/л цистина, при pH, превышающем 10.In a further embodiment of the present invention, one of the two feed solutions added to the cell culture medium is a feed comprising cystine dipeptide and tyrosine amino acid. Preferably, the feed contains cystine dipeptide and tyrosine amino acid at appropriate concentrations ranging from about 6.5 g/l to about 8.0 g/l and in the range from about 9 g/l to about 11 g/l, in an aqueous solution. at a base pH greater than 10. In a specific embodiment, the concentrated feed comprises cystine dipeptide and the amino acid tyrosine at respective concentrations of 10.06 g/l L-tyrosine and 7.25 g/l cystine at a pH greater than 10.
Подаваемую среду, включающую цистин и тирозин, описанную выше, можно добавлять либо на основе определенного потребления соответствующих аминокислот, либо в соответствии с заданным графиком, например, в количестве приблизительно 0,2 - приблизительно 0,8 вес.% от исходного веса среды для культивирования клеток в день, предпочтительно приблизительно 0,4 вес.% от исходного веса среды для культивирования клеток в день.The feed medium comprising cystine and tyrosine described above may be added either based on specific consumption of the respective amino acids or according to a predetermined schedule, for example, in an amount of about 0.2 to about 0.8 wt.% of the initial weight of the culture medium. cells per day, preferably about 0.4 wt.% of the initial weight of the cell culture medium per day.
В некоторых примерах другой подаваемый раствор содержит все остальные кислоты, которые также присутствуют в основной среде, за исключением тирозина и цистина. В некоторых примерах этот дополнительный подаваемый раствор может состоять из конкретных выбранных компонентов, таких как, например, аминокислоты или углеводы. В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эта концентрированная подаваемая среда предпочтительно содержит выбранные аминокислоты в соответствии со следующими диапазонами концентраций.In some examples, the other feed solution contains all other acids that are also present in the basic medium, except for tyrosine and cystine. In some examples, this additional feed solution may consist of specific selected components, such as, for example, amino acids or carbohydrates. In a further preferred embodiment of the present invention, this concentrated feed preferably contains selected amino acids according to the following concentration ranges.
Концентрация (ммоль/л) Supply medium
Concentration (mmol/l)
Предпочтительно в эту концентрированную подаваемую среду добавляют также углеводы, такие как глюкоза, при этом предпочтительные концентрации находятся между приблизительно 1200 и приблизительно 1400 ммоль/л, или альтернативно между приблизительно 1300 и приблизительно 1395 ммоль/л.Preferably, carbohydrates such as glucose are also added to this concentrated feed medium, with preferred concentrations being between about 1200 and about 1400 mmol/l, or alternatively between about 1300 and about 1395 mmol/l.
Подаваемую среду, только что описанную, предпочтительно включающую углевод, такой как глюкоза, можно добавлять либо на основе определенного потребления соответствующих аминокислот, либо в соответствии с заданным графиком, например, в количестве приблизительно 1 - приблизительно 4 вес.% от исходного веса среды для культивирования клеток в день, предпочтительно приблизительно 2 вес.% от исходного веса среды для культивирования клеток в день.The feed medium as just described, preferably comprising a carbohydrate such as glucose, can be added either based on specific consumption of the appropriate amino acids or according to a predetermined schedule, for example, in an amount of about 1 to about 4 wt.% of the initial weight of the culture medium. cells per day, preferably about 2 wt.% of the original weight of the cell culture medium per day.
Клетки, культивируемые в среде для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, включают клетки млекопитающих и не млекопитающих. Клетки не млекопитающих включают клетки насекомых или т.п. Однако предпочтительными являются клетки млекопитающих. Термины «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» могут использоваться здесь взаимозаменяемо.Cells cultured in the cell culture medium of the present invention include mammalian and non-mammalian cells. Non-mammalian cells include insect cells or the like. However, mammalian cells are preferred. The terms "cell", "cell line", and "cell culture" may be used interchangeably herein.
Примеры клеток млекопитающих включают ретинобласты человека; клетки карциномы шейки матки человека, линию клеток почки человеческого эмбриона, клетки легкого человека, клетки печени человека, клетки PER.C6 (линию клеток, происходящих из ретинобластов человека), линию клеток гепатомы человека и линии клеток человека, такие как AGE1.HN; линию CV1 клеток почки обезьяны, трансформированную SV40; клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зеленой мартышки, клетки яичника китайского хомячка/-DHFR, клетки почки детеныша хомячка; клетки Сертоли мыши; клетки опухоли молочной железы мыши, клетки почки собак; клетки печени крыс линии Буффало; клетки TRI; клетки MRC 5; клетки FS4; клетки CHO являются предпочтительной линией клеток для осуществления на практике настоящего изобретения.Examples of mammalian cells include human retinoblasts; human cervical carcinoma cells, a human embryonic kidney cell line, human lung cells, human liver cells, PER.C6 cells (a cell line derived from human retinoblasts), a human hepatoma cell line, and human cell lines such as AGE1.HN; monkey kidney cell line CV1 transformed with SV40; monkey kidney cells, African green monkey kidney cells, Chinese hamster ovary/-DHFR cells, baby hamster kidney cells; mouse Sertoli cells; mouse mammary tumor cells, dog kidney cells; liver cells of Buffalo rats; TRI cells;
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эти клетки могут быть различными линиями клеток CHO, такими как CHO K1 дикого типа, CHO dhfr- (Dux1) или CHO dhfr- (DG44), а также клетками HEK, клетками Sp2/0. Эти клетки, как правило, трансфецируют одной или несколькими ДНК-конструкциями, которые кодируют представляющий интерес полипептид(ы). Любой полипептид, который может экспрессироваться в этих клетках-хозяевах, можно продуцировать в соответствии с настоящим изобретением.In one preferred embodiment of the present invention, these cells can be various CHO cell lines such as wild-type CHO K1, CHO dhfr- (Dux1) or CHO dhfr- (DG44), as well as HEK cells, Sp2/0 cells. These cells are typically transfected with one or more DNA constructs that encode the polypeptide(s) of interest. Any polypeptide that can be expressed in these host cells can be produced in accordance with the present invention.
Другой класс клеток, которые могут использоваться со средами для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, включает гибридомные клетки, которые обычно используются для продуцирования моноклональных или поликлональных антител.Another class of cells that can be used with the cell culture media of the present invention includes hybridoma cells, which are commonly used to produce monoclonal or polyclonal antibodies.
Полипептиды, которые можно продуцировать благодаря культурам клеток и средам для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, не ограничиваются. Полипептиды могут быть рекомбинантными или не рекомбинантными. Используемый здесь термин «полипептид» включает молекулы, составленные из цепи более чем двух аминокислот, соединенных пептидными связями; молекулы, содержащие две или более таких цепей; молекулы, включающие одну или более таких цепей, которая(ые) является дополнительно модифицированной, например, в результате гликозилирования. Термин «полипептид», как предполагается, включает белки.The polypeptides that can be produced by the cell cultures and cell culture media of the present invention are not limited. The polypeptides may be recombinant or non-recombinant. The term "polypeptide" as used herein includes molecules made up of a chain of more than two amino acids linked by peptide bonds; molecules containing two or more such chains; molecules comprising one or more of these chains, which(s) is further modified, for example, as a result of glycosylation. The term "polypeptide" is intended to include proteins.
Предпочтительным классом полипептидов, продуцируемых с использованием культур клеток и сред для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, являются рекомбинантные антитела.A preferred class of polypeptides produced using cell cultures and cell culture media according to the present invention are recombinant antibodies.
Термин «антитело» используется в самом широком значении и, в частности, охватывает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), нанотела, модифицированные антитела, субъединицы антител, производные антител, искусственные антитела, комбинации антител с белками и фрагменты антител, достаточно длинные, чтобы проявлять желаемую биологическую активность. Моноклональные антитела, как здесь используются, могут быть антителами человека.The term "antibody" is used in its broadest sense and specifically includes monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies, polyspecific antibodies (e.g., bispecific antibodies), nanobodies, modified antibodies, antibody subunits, antibody derivatives, artificial antibodies, combinations of antibodies with proteins, and antibody fragments long enough to exhibit the desired biological activity. Monoclonal antibodies as used herein may be human antibodies.
Однако, используя культуры клеток и среды для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, можно также продуцировать полипептиды, отличные от антител, например, полипептиды вроде трансмембранных белков, рецепторов, гормонов, факторов роста, протеаз, белков коагуляции и препятствующих коагуляции белков, ингибиторных белков, интерлейкинов, факторов переноса, гибридных белков и т.п.However, using cell cultures and cell culture media according to the present invention, it is also possible to produce polypeptides other than antibodies, for example, polypeptides such as transmembrane proteins, receptors, hormones, growth factors, proteases, coagulation proteins and anti-coagulation proteins, , interleukins, transfer factors, fusion proteins, and the like.
Продукты, полученные благодаря таким способам культивирования клеток, могут использоваться для приготовления фармацевтических препаратов. Термин «фармацевтический препарат» означает композицию, подходящую для введения млекопитающему, особенно человеку, или адаптированную к нему. Кроме того, белок(и) в соответствии с настоящим изобретением можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, накопители, носители, разбавители и наполнители.The products resulting from such cell culture methods can be used for the preparation of pharmaceutical preparations. The term "pharmaceutical preparation" means a composition suitable for administration to a mammal, especially a human, or adapted to it. In addition, the protein(s) of the present invention may be administered along with other components of biologically active agents, such as pharmaceutically acceptable surfactants, accumulators, carriers, diluents, and excipients.
В таблице 1 суммированы составы имеющихся в продаже сред и дополнительных сред для культивирования клеток известного уровня техники: значения основываются на опубликованных значениях; добавки, такие как NaOH, не включены, таким образом, в эти значения. Таким образом, концентрация натрия или отношение натрия к калию является довольно заниженной и даже более того, кроме значений настоящего изобретения.Table 1 summarizes the compositions of commercially available media and additional prior art cell culture media: values based on published values; additives such as NaOH are therefore not included in these values. Thus, the concentration of sodium or the ratio of sodium to potassium is quite low and even more so, apart from the values of the present invention.
(мМ)Na+
(mm)
(мМ)NaCl
(mm)
(мМ)K+
(mm)
(мМ)Cl-
(mm)
(мМ)Total ion concentration
(mm)
(мМ)Total concentration of amino acids
(mm)
Среды А/ВWO 02/101019
A/B environments
В таблице 2 приведены составы сред для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением, характеризующиеся очень низким отношением ионов натрия к ионам калия.Table 2 shows the compositions of cell culture media according to the present invention, characterized by a very low ratio of sodium ions to potassium ions.
(мМ)Na+
(mm)
(мМ)NaCl
(mm)
(мМ)K+
(mm)
(мМ)Cl-
(mm)
(мМ)Total ion concentration
(mm)
(мМ)Total concentration of amino acids
(mm)
В таблице 3 приведены составы примеров для сред с определенным химическим составом для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением. Отдельные компоненты этих сред для культивирования клеток доступны из стандартных коммерческих источников.Table 3 lists the compositions of examples for media with a certain chemical composition for culturing cells in accordance with the present invention. The individual components of these cell culture media are available from standard commercial sources.
Конечная концентрация (мг/л)Wednesday 1
Final concentration (mg/l)
Конечная концентрация (мг/л)
Final concentration (mg/l)
Конечная концентрация (мг/л)
Final concentration (mg/l)
Конечная концентрация (мг/л)
Final concentration (mg/l)
Конечная концентрация (мг/л)
Final concentration (mg/l)
Конечная концентрация (мг/л)
Final concentration (mg/l)
ПримерыExamples
В описываемых ниже примерах используются среды 1 и 2 с определенным химическим составом для культивирования клеток, имеющие состав, детализированный в таблице 3 выше. Отдельные компоненты этих сред для культивирования клеток доступны из стандартных коммерческих источников.The examples described below use chemically defined
В таблице 4 ниже представлен состав концентрированной подаваемой среды, содержащей L-тирозин и цистин. Подаваемую среду можно добавлять либо на основе определенного потребления соответствующих аминокислот, либо в соответствии с заданным графиком, например, в количестве приблизительно 0,4 вес.% в день.Table 4 below shows the composition of the concentrated feed medium containing L-tyrosine and cystine. The feed medium can be added either based on a specific intake of the appropriate amino acids, or according to a predetermined schedule, for example, in an amount of about 0.4 wt.% per day.
В таблице 5 ниже представлен состав приведенной в качестве примера, концентрированной подаваемой среды. Подаваемую среду можно добавлять либо на основе определенного потребления аминокислот, либо в соответствии с заданным графиком, например, в количестве приблизительно 2 вес.% в день.Table 5 below shows the composition of an exemplary concentrated feed medium. The feed medium can be added either based on a specific amino acid intake or according to a predetermined schedule, for example, in an amount of about 2 wt.% per day.
В случае экспериментов примеров используют родительскую линию клеток CHO, полученную из линии dhfr (+) CHO-K1 клеток ATCC CCL-61 (Kao et. al., Genetics, 1967, 55, 513-524; Kao et. al., PNAS, 1968, 60, 1275-1281; Puck et al., J. Exp. Med., 1958, 108, 945-959) в результате адаптации к условиям не содержащих сыворотку, не содержащих белков сред. Трансфицировали две аликвоты этой родительской линии клеток для экспрессии двух различных моноклональных антител mAB1 и mAB2, соответственно.For example experiments, the parental CHO cell line derived from the dhfr (+) CHO-K1 ATCC CCL-61 cell line (Kao et. al., Genetics, 1967, 55, 513-524; Kao et. al., PNAS, 1968, 60, 1275-1281; Puck et al., J. Exp. Med., 1958, 108, 945-959) as a result of adaptation to serum-free, protein-free media. Two aliquots of this parental cell line were transfected to express two different mAB1 and mAB2 monoclonal antibodies, respectively.
Пример 1Example 1
В примере 1 в содержащие среду 1 культуры в двух встряхиваемых колбах инокулируют параллельно mAb1-продуцирующий клон CHO. Культуры во встряхиваемых колбах инкубируют в термостате с углекислым газом при 37ºС. В день 3 одну колбу переносят в термостат с углекислым газом с установкой на 33ºС. В обе встряхиваемые колбы сходным образом подают два раствора в качестве подпитки. Подпитку добавляют в соответствии с заданным графиком, с добавлением 0,4% первого подаваемого раствора (таблица 2) и 2% второго подаваемого раствора (таблица 3) в день, начиная со дня 5 и продолжая до конца культивирования.In Example 1, cultures containing medium 1 in two shake flasks were inoculated in parallel with a mAb1-producing clone of CHO. Cultures in shake flasks are incubated in a carbon dioxide incubator at 37°C. On
Изменение температуры до 33ºС позволяет дольше сохранить плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособность культуры с течением времени (фиг.1 и 2) и достичь более высокого титра продукта (фиг.3), по сравнению с культурой, которую сохраняют при 37ºС в течение всего эксперимента. Этот пример демонстрирует пользу осуществления сдвига температуры до 33ºС во время процесса продуцирования с использованием культуры клеток на основе линии клеток CHO.Changing the temperature to 33°C allows longer viable cell density and culture viability over time (FIGS. 1 and 2) and a higher product titer (FIG. 3) compared to a culture kept at 37°C throughout the experiment. This example demonstrates the benefit of implementing a temperature shift of up to 33°C during the production process using a cell culture based on the CHO cell line.
Пример 2Example 2
В этом эксперименте в биореактор на 300 л, содержащий среду 2, инокулируют mAb2-продуцирующий клон CHO. В день 5 температуру биореактора сдвигают с 36,5ºС на 33ºС. Заданное значение pH равно 6,90, а мертвая зона составляет 0,10. В результате, культивирование начинают при pH 7,00, pH снижается до 6,80 между днями 2 и 4, а затем он постепенно возвращается к 7,00 вследствие потребления молочной кислоты клетками (фиг.4). Изменение до pH 6,80 позволяет уменьшить добавление основания по сравнению со сценарием с постоянным pH 7,00. Возвращение к pH 7,00 позволяет уменьшить концентрацию CO2 в среде по сравнению со сценарием, в котором pH остается на значении, равном 6,80, после первого изменения. В этом способе, в котором сочетаются изменения температуры и pH, достигают высокой плотности жизнеспособных клеток, и минимизируется уменьшение плотности жизнеспособных клеток с течением времени (фиг.5), позволяя достичь в день 14 высокого титра (фиг.6) продукта соответствующего качества. Подпитку применяют так же, как в примере 1.In this experiment, a 300 L
Claims (10)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32783610P | 2010-04-26 | 2010-04-26 | |
| US61/327,836 | 2010-04-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012150346A Division RU2644651C2 (en) | 2010-04-26 | 2011-04-25 | Medium for cells cultivation |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018101201A RU2018101201A (en) | 2019-02-21 |
| RU2018101201A3 RU2018101201A3 (en) | 2021-05-27 |
| RU2798069C2 true RU2798069C2 (en) | 2023-06-14 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006026445A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of polypeptides |
| US20060148074A1 (en) * | 1996-08-30 | 2006-07-06 | Invitrogen Corporation | Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof |
| RU2380412C2 (en) * | 1999-09-28 | 2010-01-27 | Бакстер Акциенгезелльшафт | Medium that does not contain proteins and serums, and method of mammal cell cultivation in such medium |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060148074A1 (en) * | 1996-08-30 | 2006-07-06 | Invitrogen Corporation | Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof |
| RU2380412C2 (en) * | 1999-09-28 | 2010-01-27 | Бакстер Акциенгезелльшафт | Medium that does not contain proteins and serums, and method of mammal cell cultivation in such medium |
| WO2006026445A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of polypeptides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TRUMMER E. ET AL. Process parameter shifting: Part II. Biphasic cultivation : A tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 94, no. 6, 2006, pp. 1045 - 1052. YOON S.K. ET AL. Biphasic culture strategy for enhancing volumetric erythropoietin productivity of Chinese hamster ovary cells. ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY vol. 39, no. 3, 2006, pр. 362 - 365. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2644651C2 (en) | Medium for cells cultivation | |
| US8765413B2 (en) | Cell cultivation process | |
| US9243224B2 (en) | Cell culture medium | |
| RU2798069C2 (en) | Improved cell culture medium |