RU2795322C1 - Способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека - Google Patents
Способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795322C1 RU2795322C1 RU2022130158A RU2022130158A RU2795322C1 RU 2795322 C1 RU2795322 C1 RU 2795322C1 RU 2022130158 A RU2022130158 A RU 2022130158A RU 2022130158 A RU2022130158 A RU 2022130158A RU 2795322 C1 RU2795322 C1 RU 2795322C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactoferricin
- human
- antibodies
- monospecific antibodies
- serum albumin
- Prior art date
Links
- 101800004361 Lactoferricin-B Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- CFFMZOZGXDAXHP-HOKBLYKWSA-N lactoferricin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CFFMZOZGXDAXHP-HOKBLYKWSA-N 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 30
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000021244 human milk protein Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 6
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 11
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 11
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 10
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 10
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 10
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 5
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000798100 Bos taurus Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001098872 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003217 anti-cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001847 bifidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940072440 bovine lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 102000054226 human PCSK7 Human genes 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии. Предложен способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека. Производят кислотный гидролиз белков обезжиренного женского молока с помощью пепсина свиньи. Образующиеся пептиды отделяют осаждением трихлоруксусной кислотой и центрифугируют. Нейтрализуют депротеинизированный фильтрат и конъюгируют с бычьим сывороточным альбумином. После инкубации в реакционную смесь вносят боргидрид натрия. Реакцию останавливают ледяной уксусной кислотой. Проводят циклы иммунизации кроликов введением конъюгата БСА-лактоферрицин с полным адъювантом Фрейнда до формирования гипериммунного ответа. В полученных кроличьих сыворотках производят элиминацию балластных примесей для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека. Изобретение может быть использовано для получения антител для разработки тест-системы на лактоферрицин человека и направлено на упрощение и повышение точности определения лактоферрицина человека. 1 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для получения антител и разработки тест-системы на пептид лактоферрицин человека.
Структурный домен лактоферрина, ответственный за бактерицидные свойства, является расщепляемый пепсином фрагмент, названный лактоферрицином (Bellamy W., Takase М., Yamauchi K. [et al.] Identification of the bactericidal domain of lactoferrin // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1121, №1-2 - P. 130-136).
Пептид лактоферрицин (ЛФЦ) проявляет активность против всех протестированных бактерий (Е. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Listeria spp., Staphylococcus spp.) и эффективен даже против инфекций, вызываемых устойчивыми к антибиотикам Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae (Oda H., Wakabayashi H., Yamauchi K. [et al.]. Isolation of a bifidogenic peptide from the pepsin hydrolysate of bovine lactoferrin // Appl. Environ. Microbiol. - 2013. - Vol. 79(6): - P. 1843-1849). ЛФЦ человека, помимо антимикробной, противовирусной и противогрибковой активности обладает антиканцерогенной активностью (Перродэн Ж.П. Способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения / Патент на изобретение RU 2579661, 10.04.2016).
Образующиеся при пепсиновом гидролизе лактоферрина человека пептиды, после удаления непрореагировавших белков с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ), имеют молекулярную массу в диапазоне 2-5 кДа, и не обладают иммуногенными свойствами. По информации, содержащейся в базе данных UniProt ЛФЦ человека состоят из 48 аминокислотных остатка и имеют молекулярную массу 5345 Да (Серебряков А.А., Коханова А.В. Динамика лактоферрицина и альфа-фетопротеина в крови кроликов после различных вариантов повреждения печени // Крымском журнале экспериментальной и клинической медицины. - 2022. - Т. 12, №2. - С. 41-48).
Как правило, белки с низкой молекулярной массой и пептиды оказываются неимунногенными и плохо сорбируются на пластик, что затрудняет их скрининг и мониторинг в биологических жидкостях.
Вместе с тем, несмотря на полную информацию о строении этого важного антибактериального пептида до настоящего времени не существует иммунохимического способа определения лактоферрицина.
Иммунохимический метод регистрации антимикробных пептидов, основанный на реакции антиген-антитело, имеет большое преимущество над спектрофотометрическим и другими методами регистрации результата измерения, к числу которых относятся универсальность, избирательность, специфичность, высокая чувствительность (Фримель X. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - 472 с.; Чехонин В.П., Дмитриева Т.Е., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. - 2000. - М.: Медицина - 416 с.).
В тоже время давно отработана технологии конъюгации низкомолекулярных лигандов с макромолекулярными носителями для получения иммуногенных комбинаций. Чтобы перевести неиммуногенные молекулы пептидов в иммуногенное состояние можно агрегировать их в частицы большего размера или присоединить к соответствующему носителю. Предпочтительнее пользоваться вторым способом (Фримель X. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - 472 с.).
Например, известен способом конъюгирования антибактериальных пептидов путем их иммобилизация на нерастворимых носителях, изготовленных из полистироловых, полипропиленовых, полиамидных, целлюлозных, агарозных, полиакриламидных, декстрановых или виниловых полимерных материалов (Блондэлле Сильви Э. (US) и соавт. Антибактериальные пептиды // Патент РФ №2468033 от 10.07.2007).
Однако как оказалось, способы приготовления коньюгатов на основе нерастворимых полимеров не позволяет получать на кроликах антитела к неиммуногенному пептиду лактоферрицину.
Для получения растворимых комплексов белковых носителей с неиммуногенными пептидами чаще всего применяются гетерогенные белки: бычий сывороточный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), тиреоглобулин или овальбумин. Например, известен способы иммобилизации путем ковалентного конъюгирования пептида с гемоцианином лимфы улитки (Ширакава Камон. Специфически очищенные антитела против пресепсина // Патент РФ №2739607 от 25.08.2015).
Однако самым надежным и наиболее часто используемым носителем для пептидов является бычий сывороточный альбумин (БСА) (Heisch R.D., Hufner М. Highly specific antibodies to triiodthyronine. - Acta biol. Med. Germ., 1972. - Vol. 28. - P. 861-864.).
Для получения конъюгатов различных гаптенов с БСА часто применяются методы диазотирования или реакции взаимодействия альдегидной группы с аминогруппой БСА (Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М., 1985, с. 14-25; Костянко М.В., Глушков А.Н. Способ получения конъюгата гаптен-белок / Патент на изобретение RU 2141114, 16.02.1998). Однако данные методы конъюгации не подходят для пептида типа лактоферрицина, несущего значительный положительный заряд.
В связи с отсутствием в литературе иммуноферментного метода выявления лактоферрицин в качестве прототипа использована наша статья по определению лактоферрицина в сыворотке крови и других биологических жидкостях спектрофотометрическим способом (Серебряков А.А., Коханов А.В., Луцева О.А., Таспенова Г.К., Мулдашева Н.Р. Лактоферрин и лактоферрицин в моче и фекалиях у больных с ургентной урологической и хирургической патологией // Современные проблемы науки и образования. - 2021. - №4. (Электронный журнал); URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=27717).
Изобретение направлено на упрощение и повышение точности определения лактоферрицина человека.
Поставленная в изобретении цель достигается тем, что с помощью фермента пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг производят кислотный гидролиз белков обезжиренного женского молока в течение 4-6 часов при 37°С, образующиеся при гидролизе пептиды, отделяют от непрореагировавших белков молока осаждением 10% трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин, после нейтрализации депротеинизированного фильтрата его конъюгируют с бычьим сывороточным альбумином из расчета 2-3 мг белка фильтрата на 100 мг бычьего сывороточного альбумина в 0,1 н NaOH, после трехчасовой инкубации при комнатной температуре в реакционную смесь вносят 20 мг восстановителя боргидрида натрия и через 30 минут реакцию останавливают ледяной уксусной кислотой, доводя рН до значений 7,2-7,4, проводят циклы иммунизации кроликов троекратным еженедельным внутримышечным введением конъюгата БСА-лактоферрицин с полным адъювантом Фрейнда в течении 28-35 дней до формирования у кроликов гипериммунного ответа, в полученных кроличьих сыворотках производят элиминацию балластных примесей путем добавления к 10 мл сыворотки 200 мг лиофилизированной плазмы человека и 50 мг коммерческого бычьего сывороточного альбумина для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
Источником для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека служит обезжиренное женское молоко. Для получения из молочного белка пептидной фракции раствор закисляют соляной кислотой до рН 2,0, вносят раствор пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг (Sigma, США) и полученную смесь выдерживали в термостате в течение 4 часов при 37°С. За это время в инкубационной среде накапливался пептиды, имеющие молекулярную массу ниже 4 кДа, которые отделяют от непрореагировавших белковых компонентов, путем прибавления 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, с последующим центрифугирования при 5000 g в течение 10 мин. Депротеинизированный фильтрат, содержащие лактоферрицин нейтрализуют гидрокарбонатом натрия до рН 7,6-7,8 и после центрифугирования при 5000 g в течение 20 мин хранят до следующего этапа получения конъюгата БСА-ЛФЦ в морозильной камере при -20°С. Концентрация пептида лактоферрицина в полученных препаратах обезжиренного женского молока, рассчитанная спектрофотометрически по методу Скоупс (Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. - 358 с.) на волнах длиной 260 и 280 нм, составляет 2-3 мг/мл.
Наличие у пептида лактоферрицина положительно заряженных групп позволяет получать иммунные комплексы с бычьим сывороточным альбумином только за счет адсорбции без использования дополнительных спейсерных функциональных групп. Для получение конъюгатов БСА-лактоферрицин к 0,1 грамму БСА, растворенного в 1 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия, добавляют 1 мл препарате лактоферрицина, содержащего 2-3 мг пептида. После трехчасового перемешивания при комнатной температуре в раствор вносят 20 мг восстановителя боргидрида натрия и через 30 минут реакцию останавливают ледяной уксусной кислотой, доводя рН до значений 7,2-7,4. После центрифугирования при 5000 g в течение 20 мин конъюгаты БСА-лактоферрицин хранят до следующего этапа иммунизации в морозильной камере при -20°С.По данным спектрофотометрии в полученном конъюгате на 1 моль БСА приходится 40-60 моль лактоферрицина.
Для получения антисывороток к пептиду лактоферрицину человека проводят иммунизацию кроликов породы шиншилла массой 3-4 кг по схеме разработанной Калашниковым [Калашников В.В. Раково-эмбриональные белки человека: Дис. … д-ра. мед. наук. - М., 1986]. В качестве антигена использовались полученные на предыдущих этапах конъюгаты БСА-лактоферрицин.
Полученным конъюгатом БСА-лактоферрицин иммунизировали кроликов по следующей схеме:
а) 10 мг конъюгата, растворенного в 5 мл физиологического раствора, тщательно суспендировали с 1 мл полного адъюванта Фрейнда и вводили кроликам подкожно в 6-8 мест;
б) через неделю 10 мг препарата, растворенного в 5 мл физиологического раствора, суспендировали с 1 мл неполного адъюванта Фрейнда и вводили кроликам подкожно в 6-8 мест;
в) после недельного перерыва повторяли процедуру иммунизации кроликов тем же препаратом повторяя условия, описанные в пункте б);
в) через неделю после последней инъекции кроликов проводили пробный забор крови из краевой вены ушной раковины.
При невысоком титре антител к конъюгату БСА-лактоферрицин через 2,5-3 месяца животные иммунизировались повторно путем однократной подкожной инъекции 2-3 мл конъюгата содержащего 8-10 нг белка.
При высоком качестве сыворотки забор крови из краевой вены уха кролика проводился строго через 7 дней после последней инъекции, при этом у кролика однократно отбиралось 50-100 мл крови. Забор крови повторяли через 2-3 дня и продолжали в таком режиме в течение 15-20 дней.
Все полученные кроличьи сыворотки, после проверки на наличие антител к лактоферрицину, дополнительно подвергали процедуре элиминацию балластных примесей путем добавления к 10 мл кроличьей сыворотки 200 мг лиофилизированной плазмы человека и 50 мг коммерческого бычьего сывороточного альбумина.
Через два часа полученные кроличьи сыворотки центрифугировали и полноту истощения проверяли иммунодиффузионным методом с сывороткой и плазмой крови доноров и сывороткой крови коров.
После чего определяли преципитирующая способность полученных кроличьи сывороток с лактоферрицину в специфических реакциях иммунодиффузионного анализа. При этом, если полученная кроличья сыворотка давала единственную линию преципитации с пептидом лактоферрицином (ЛФЦ), она считалась моноспецифической.
Пример 2.
Источником лактоферрицина для получения комплекса этого пептида с БСА служили препараты чистого белка лактоферрина человека, предоставленные для исследования профессором Николаевым А.А. (кафедра химии Астраханского ГМУ). Для получения из лактоферрина пептидной фракции 200 мг лиофилизированного белка ЛФ растворяли в 1 мл воды, полученный раствор закисляли соляной кислотой до рН 2,0, вносили раствор пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг (Sigma, США) и полученную смесь выдерживали в термостате в течение 4 часов при 37°С.
Все дальнейшие этапы получения препарата лактоферрицина из очищенного лактоферрина человека, получения конъюгата БСА-лактоферрицин, иммунизации кроликов, получения гипериммунных кроличьих сывороток, процедуры элиминацию из сывороток балластных примесей до получения моноспецифических кроличьих антител к лактоферрицину человека аналогичны примеру 1.
При этом, если полученная кроличья сыворотка давала единственную линию преципитации с пептидом лактоферрицином (ЛФЦ) и не реагировала с антителами к лактоферрину (ЛФ) и какими либо другими веществами, она считалась моноспецифической и полученные антитела использовалась для конструирования тест-системы на лактоферрицин.
Проверка качества тест-системы на лактоферрицин человека с помощью моноспецифических антител к лактоферрицину человека методом иммунодиффузионного анализа. Этот вариант иммунохимического анализа позволяет изучать различные антигены в составе сложных смесей без их очистки и выделения из сыворотки крови или другой биологической жидкости. Метод обладает достаточно высокой чувствительностью и позволяет исключить ошибки связанные с применением недостаточно истощенных антисывороток.
Результаты сопоставления двух моноспецифических тест-систем на лактоферрин и лактоферрицин человека методом двойной радиальной диффузии в агаре по Ouchterloni [Фримель X. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - 472 с.] в формате штампа «семерка» представлены на фиг. 1.
При этом в центральную лунку штампа семерка в агаровом геле вносят моноспецифические антитела к лактоферрицину человека, а в центральные верхнюю и нижнюю лунки вносят образцы очищенного препарата лактоферрицина. Для сопоставления в боковые лунки штампа семерка вносят тест-антиген и тест-сыворотку на лактоферрин из набора кафедры химии Астраханского ГМУ.
1 - препарат очищенного пептида лактоферрицина;
2 - антисыворотка против пептида лактоферрицина;
3 - препарат очищенного лактоферрина, предоставленный профессором Николаевым А.А. (кафедра химии Астраханского ГМУ);
4 - антисыворотка против лактоферрина человека из набора кафедры химии Астраханского ГМУ.
Полученный результат свидетельствует об отсутствии перекрестной реакции между антителами к лактоферрин человека и антителами к лактоферрицин человека.
Пример 3.
Этапы получения препарата лактоферрицина из очищенного лактоферрина человека, получения конъюгата БСА-лактоферрицин, иммунизации кроликов, получения гипериммунных кроличьих антисывороток, процедуры их истощения и формирования моноспецифических антисывороток к лактоферрицину человека аналогичны примеру 2.
Если концентрация специфических антител к ЛФЦ в кроличьих антисыворотках не превышает 10% от общего количества сывороточных гамма-глобулинов, то такие кролисьи сыворотки нельзя использовать для активации полистирольных планшетов и для приготовления коньюгатов с ферментами. В этом случае включают этап выделения из кроличьей сыворотки фракции моноспецифического иммуноглобулина IgG к лактоферрицину с помощью комбинации общепринятых биохимических методов высаливания и хроматографии на Сефадексе G-150.
Однако наилучшие результаты для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека дает применения иммуносорбционных методов.
Для выделения специфических антител из поликлональных кроличьих сывороток мы использовали иммуносорбенты, приготовленные на основе сефарозы 4 В, активированной бромцианом ("Sigma", США). К этому носителю химически привязываются очищенные лактоферрицин.
Перед связыванием 10 г сефарозы на 20 мин замачивают в 500 мл 1 мМ раствора HCI, затем промывают 2 л того же раствора на стеклянном фильтре. К активированному таким образом гелю прибавляют раствор лактоферрицина в 0,1 М карбонатном буфере с рН 8,3, содержащем 0,5 М NaCl (из расчета 5-10 мг пептида лактоферрицина на 1 мл геля). Полученная смесь инкубируется в течение 2 ч при комнатной температуре, с перемешиванием на роторной мешалке (магнитная мешалка может разрушить структуру геля). Затем иммуносорбент промывается 4 л того же буфера, оставшиеся несвязанными активные группы носителя блокируются обработкой 1М раствором глицина (2 ч). Избыток глицина отмывается попеременным промыванием 0,1 М карбонатным буфером с рН 8,3 и 0,1 М Na-фосфатным буфером с рН 4 (оба буфера содержат 0,5 М NaCl). Последняя промывка - карбонатным буфером.
Приготовленный таким образом иммуносорбент помещается в небольшую колонку (обычно бывает достаточно слоя сорбента объемом 3-5 мл), через которую пропускается 10-20 мл моноспецифической антисыворотки. Извлечение антител проводится в режиме медленной рециркуляции при скорости потока 10 мл/ч. Как показывают результаты иммунодиффузионного анализа, для полного извлечения антител указанный объем сыворотки должен быть пропущен не менее 3-5 раз через колонку с иммуносорбентом. После этого колонка промывается тем же карбонатным буфером до достижения оптической плотности элюата <0,02 (оптическую плотность регистрируют с помощью проточного фотометра, например Uvicord-S фирмы "LKB", Швеция). Адсорбированные антитела элюируются 0,2 М глициновым буфером с рН 2,2 с немедленной нейтрализацией элюата насыщенным раствором ТРИС. После диализа против дистиллированной воды антитела концентрируются ультрафильтрацией через мембрану ХМ-100А (Amicon) и лиофилизуются. Сухой препарат антител хранится при 4°С.
Пример 4.
Этапы получения препарата лактоферрицина из очищенного лактоферрина человека, получения конъюгата БСА-лактоферрицин, иммунизации кроликов, получения гипериммунных кроличьих антисывороток, процедуры их истощения и формирования моноспецифических антисывороток к лактоферрицину человека аналогичны примеру 2.
Для характеристики препарата антител к лактоферрицину человека их оценивают по двум параметрам:
• как антигены с помощью антисыворотки к иммуноглобулинам кролика;
• как антитела с помощью стандартной тест-системы на лактоферрицин.
Такой подход позволяет, с одной стороны, определить концентрацию иммуноглобулинов, а с другой - установить, какую долю в общем количестве иммуноглобулинов составляют специфические преципитирующие антитела. При этом расчеты проводятся с использованием следующих констант:
• минимальной концентрации иммуноглобулинов, выявляемой с помощью антисыворотки к иммуноглобулинам кролика ("антитела как антигены") методом двойной иммунодиффузии по Ouchterlony, составляющей 10 мкг/мл;
• минимальной концентрации антител, выявляемой с помощью стандартной тест-системы к изучаемому антигену ("антитела как антитела"), составляющей 80 мкг/мл.
Умножив на 10 то максимальное разведение антител, которое еще дает реакцию преципитации с антисывороткой к иммуноглобулинам кролика, можно получить общую концентрацию иммуноглобулинов в анализируемом растворе. Эту величину следует сравнить с расчетной концентрацией Преципитирующих специфических антител, которая получается при умножении на 80 максимального разведения антител, реагирующих как антитела в стандартной тест-системе для лактоферрицина. Близкие значения этих величин свидетельствуют о высоком качестве полученного препарата антител.
Внедрение данного способа определения лактоферрицина превосходит спектрофотометрический способ определения этого пептида по чуствительности, позволяет повысить точность и упростить процедуру определения концентрации неиммуногенного антибактериального пептида лактоферрицина.
Предлагаемый способ получения моноспецифических кроличьих антител к лактоферрицину человека может быть использован в качестве инструмента для количественного определения концентрации пептид лактоферрицина в биологических жидкостях любым иммунохимическим методом анализа (ИДА, ИФА, ИХА и т.д.).
Claims (1)
- Способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека, заключающийся в том, что с помощью фермента пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг производят кислотный гидролиз белков обезжиренного женского молока в течение 4-6 часов при 37°С, образующиеся при гидролизе пептиды отделяют от непрореагировавших белков молока осаждением 10% трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин, после нейтрализации депротеинизированного фильтрата его конъюгируют с бычьим сывороточным альбумином из расчета 2-3 мг белка фильтрата на 100 мг бычьего сывороточного альбумина в 0,1 н NaOH, после трехчасовой инкубации при комнатной температуре в реакционную смесь вносят 20 мг восстановителя боргидрида натрия и через 30 минут реакцию останавливают ледяной уксусной кислотой, доводя рН до значений 7,2-7,4, проводят циклы иммунизации кроликов троекратным еженедельным внутримышечным введением конъюгата БСА-лактоферрицин с полным адъювантом Фрейнда в течение 28-35 дней до формирования у кроликов гипериммунного ответа, в полученных кроличьих сыворотках производят элиминацию балластных примесей путем добавления к 10 мл сыворотки 200 мг лиофилизированной плазмы человека и 50 мг коммерческого бычьего сывороточного альбумина для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2795322C1 true RU2795322C1 (ru) | 2023-05-02 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2823997C1 (ru) * | 2023-04-05 | 2024-07-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Способ дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2468033C2 (ru) * | 2006-07-10 | 2012-11-27 | Пба3 БиоМед ГмбХ | Антибактериальные пептиды |
| RU2579661C2 (ru) * | 2009-01-28 | 2016-04-10 | Жан-Поль ПЕРРОДЭН | Способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2468033C2 (ru) * | 2006-07-10 | 2012-11-27 | Пба3 БиоМед ГмбХ | Антибактериальные пептиды |
| RU2579661C2 (ru) * | 2009-01-28 | 2016-04-10 | Жан-Поль ПЕРРОДЭН | Способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СЕРЕБРЯКОВ А. А., и др. Лактоферрин и лактоферрицин в моче и фекалиях у больных с ургентной урологической и хирургической патологией. Современные проблемы науки и образования. 2021, no.5, найдено в Интернет [17.02.2023] https://science-education.ru/ru/article/view?id=31082. SHIMAZAKI, K., et al. Monoclonal Antibody against Bovine Lactoferricin and Its Epitopic Site. The Journal of Veterinary Medical Science, 1996, v.58, no.12, p.1227-1229. doi:10.1292/jvms.58.12_1227. KUWATA H. et al. Bactericidal Domain of Lactoferrin: Detection, Quantitation, and Characterization of Lactoferricin in Serum by SELDI Affinity Mass Spectrometry. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 1998, v.245, p.764-773. BELLAMY, W., et al. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology, 1992, v.1121, no.1-2, p.130-136. doi:10.1016/0167-4838(92)90346-f. WAKABAYASHI, H., et al. Lactoferricin Derived From Milk Prote * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2823997C1 (ru) * | 2023-04-05 | 2024-07-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Способ дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни |
| RU2823995C1 (ru) * | 2023-04-05 | 2024-07-31 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Способ диагностики бактериальной абдоминальной хирургической инфекции при аппендиците |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2944721B2 (ja) | エンドトキシンの測定剤 | |
| USRE39138E1 (en) | Monoclonal antibody specific for advanced glycosylation endproducts in biological samples | |
| Tizard | Macrophage-cytophilic antibodies and the functions of macrophage-bound immunoglobulins | |
| KR20070094950A (ko) | 3,4-ｄｇｅ에서 유래하는 ａｇｅ에 특이적으로 반응하는항체 | |
| JP2006284567A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ感染の診断方法及び診断キット | |
| WO1993019373A1 (en) | Broadly reactive opsonic antibodies that react with common staphylococcal antigens | |
| JP6232618B2 (ja) | ヒト汗中に含まれる新規ヒスタミン遊離物質 | |
| KR100756117B1 (ko) | 모노클로날 항체, 하이브리도마, 면역분석 방법 및 진단킷트 | |
| RU2795322C1 (ru) | Способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека | |
| Conway-Jacobs et al. | Extrinsic Cotton effect and immunological properties of the p-azobenzenearsonate hapten attached to a helical amino acid copolymer | |
| Klasen et al. | Development of a screening system for detection of somatic mutations. I. Enzyme immunoassay for detection of antibodies against specific hemoglobin determinants | |
| FR2709492A1 (fr) | Méthode d'immunodosage spécifique de la glutathion peroxydase plasmatique humaine, kit pour sa mise en Óoeuvre, oligopeptides et anticorps spécifiques de la méthode . | |
| WO1998024885A1 (en) | Helicobacter pylori antigen having an apparent molecular weight of 16±2 kda, a specific antibody, and its use for the detection of said antigen | |
| RU2622005C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АНТИТЕЛ-IgG К ДЕСМОГЛЕИНУ 3 ТИПА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ПУЗЫРЧАТКОЙ | |
| RU2127883C1 (ru) | Способ экспресс-диагностики дифтерийной инфекции | |
| JP3445038B2 (ja) | 精神的ストレス性障害関連抗原の測定法 | |
| Murozuka et al. | Bovine Albumin‐Like Protein in Commercial Human Albumin for Clinical Use | |
| Nolte et al. | Immunogenicity of Staphylococcus aureus delta-toxin | |
| RU2499605C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ СЕКРЕТОРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ЧЕЛОВЕКА - SIgA | |
| US20030158391A1 (en) | Anitbodies and method for producing same, the use thereof and immunisation cocktails, immunoassays-sets and peptides | |
| JP3073501B2 (ja) | Ｃ―反応性タンパクの修飾形態による免疫複合体の結合 | |
| RU2281511C1 (ru) | Поликлональное антитело, специфически реагирующее с прионным протеином в ткани мозга млекопитающих, и диагностический реагент на его основе | |
| Carlsson et al. | IMMUNOCHEMISTRY OF SALMONELLA O‐ANTIGENS: Characterization of the Antibody Response to Tyvelose 13 Mannose 1 Bovine Serum Albumin Representative of Salmonella O‐Antigen 9 | |
| JPS61178661A (ja) | エンテロトキシンの定量法 | |
| JP3687718B2 (ja) | ジチロシンポリクローナル抗体とその製造方法並びにこれに用いる抗原及びその製造方法 |